ES2529572T3

ES2529572T3 - Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes

Info

Publication number: ES2529572T3
Application number: ES05733657.0T
Authority: ES
Inventors: Surinder Pal Singh; Stanley Suresh Robert; Susan Irene Ellis Blackburn; Xue-Rong Zhou; James Robertson Petrie; Allan Graham Green; Peter David Nichols
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2015-02-23
Anticipated expiration: 2025-04-22
Also published as: US20130296589A1; US10781463B2; US20110015415A1; US20150087849A1; US8853432B2; US8106226B2; CN103451246B; US11597953B2; US20200392547A1; US7807849B2; US9963723B2; DK1756280T3; CN102559364A; US8575377B2; CN102559364B; CN103451246A; US9458410B2; US8288572B2; US20180282771A1; US20170058304A1

Abstract

Una célula vegetal recombinante que sintetiza EPA, que comprende más de un polinucleótido heterólogo, en donde dichos polinucleótidos codifican: a) una Δ6 desaturasa, una Δ6 elongasa y una Δ5 desaturasa; o b) una Δ5/Δ6 desaturasa bifuncional 5 y una Δ6 elongasa; en donde los más de un polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula, en donde las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, y en donde la síntesis de EPA requiere la acción secuencial de dichas enzimas.

Description

Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para sintetizar ácidos poliinsaturados de cadena larga, especialmente ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, en células de planta recombinantes. También se proporcionan células de planta o plantas recombinantes que producen ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Además, la presente invención se refiere a un grupo de nuevas enzimas que posee actividad desaturasa o elongasa que puede usarse en métodos de síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

Antecedentes de la invención

El o los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) omega-3 son hoy ampliamente conocidos como compuestos importantes para la salud humana y animal. Estos ácidos grasos pueden obtenerse de fuentes de la dieta o por conversión de ácidos grasos linoleico (LA, omega-6) o α-linolénico (ALA, omega-3), considerándose ambos como ácidos grasos esenciales en la dieta humana. Aunque los seres humanos y muchos otros animales vertebrados son capaces de convertir LA o ALA, obtenidos de fuentes de planta, en LC-PUFA, llevan a cabo esta conversión a una velocidad muy baja. Además, las sociedades más modernas tienen dietas desequilibradas en las que al menos 90 % de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) consisten en ácidos grasos omega-6, en lugar de la proporción 4:1 o menor para ácidos grasos omega-6:omega-3 que se considera ideal (Trautwein, 2001). La fuente de la dieta inmediata de LC-PUFA tal como ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) y ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6) para los seres humanos es mayoritariamente de pescado o aceite de pescado. Los profesionales sanitarios han recomendado por lo tanto la inclusión regular de pescado que contiene niveles significativos de LC-PUFA en la dieta humana. De forma creciente, los aceites LC-PUFA derivados de pescado se están incorporando en productos alimenticios y en fórmulas infantiles. Sin embargo, debido a una disminución en los sectores pesqueros globales y nacionales, se necesitan fuentes alternativas de estos aceites beneficiosos que potencian la salud.

La inclusión de LC-PUFA omega-3 tal como EPA y DHA en la dieta humana se ha ligado a numerosos beneficios relacionados con la salud. Éstos incluyen la prevención o reducción de enfermedad cardiaca coronaria, hipertensión, diabetes de tipo 2, enfermedad renal, artritis reumatoide, colitis ulcerosa y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y la ayuda en el desarrollo cerebral y el crecimiento (Simopoulos, 2000). Más recientemente, varios estudios también han indicado que PUFA omega-3 puede ser beneficioso en la nutrición y desarrollo infantil y frente a varios trastornos mentales tales como esquizofrenia, trastorno hiperactivo con déficit de atención y enfermedad de Alzheimer.

Las plantas superiores, a diferencia de los animales, carecen de la capacidad de sintetizar ácidos grasos poliinsaturados con longitudes de cadena mayores de 18 carbonos. En particular, las plantas cultivadas y hortícolas junto con otras angiospermas no tienen las enzimas necesarias para sintetizar los ácidos grasos omega-3 con cadenas más largas tales como EPA, DPA y DHA que derivan de ALA. Un objetivo importante en la biotecnología de plantas es por lo tanto la preparación por ingeniería de plantas cultivadas, particularmente cultivos oleaginosos, que producen cantidades sustanciales de LC-PUFA, proporcionando así una fuente alternativa de estos compuestos.

Rutas de síntesis de LC-PUFA

La biosíntesis de LC-PUFA a partir de ácidos grasos linoleico y α-linolénico en organismos tales como microalgas, musgos y hongos puede ocurrir por una serie de desaturaciones y reacciones de elongación alternantes dependientes de oxígeno como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. En una ruta (Figura 1, II), las reacciones de desaturación están catalizadas por �6, �5, y �4 desaturasas, cada una de las cuales añade un enlace doble adicional a la cadena de carbono del ácido graso, mientras cada una de las reacciones de �6y �5 elongasa añade una unidad de dos carbonos para aumentar la longitud de la cadena. La conversión de ALA a DHA en estos organismos requiere por lo tanto tres desaturaciones y dos elongaciones. Los genes que codifican las enzimas requeridas para la producción de DHA en esta ruta aeróbica se han clonado de varios microorganismos y plantas inferiores incluyendo microalgas, musgos, hongos. Los genes que codifican algunas de las enzimas incluyendo una que cataliza la quinta etapa, la �5 elongasa, se han aislado de animales vertebrados incluyendo mamíferos (revisado en Sayanova y Napier, 2004). Sin embargo, la �5 elongasa aislada de células humanas no es específica para la reacción EPA a DPA, teniendo una especificidad amplia para los sustratos ácido graso (Leonard et al., 2002).

Se ha mostrado que existen rutas alternativas para dos secciones de la ruta ALA a DHA en algunos grupos de organismos. La conversión de ALA a ETA puede llevarse a cabo por una combinación de una �9 elongasa y una �8 desaturasa (la denominada ruta �8 desaturación, véase la Figura 1, IV) en determinados protistas y traustoquitridos, como se pone de manifiesto por los genes aislados que codifican dichas enzimas (Wallis y Browse, 1999; Qi et al., 2002). En mamíferos, la ruta denominada "Sprecher" convierte DPA en DHA por tres reacciones, independiente de una �4 desaturasa (Sprecher et al., 1995).

Además de estos sistemas desaturasa/elongasa, EPA y DHA también pueden sintetizarse mediante una ruta anaeróbica en varios organismos tales como Shewanella, Mortiella y Schizhochytrium (Abbadi et al., 2001). Los operones que codifican estos complejos de enzima poliquétido sintasa (PKS) se han clonado de algunas bacterias (Morita et al., 2000; Metz et al., 2001; Tanaka et al., 1999; Yazawa, 1996; Yu et al., 2000; WO 00/42195). El operón EPA PKS aislado de Shewanella spp se ha expresado en Synechococcus permitiéndole sintetizar EPA (Takeyama et al., 1997). Los genes que codifican estas enzimas se organizan en operones relativamente grandes, y no se ha informado de su expresión en plantas transgénicas. Por lo tanto, está por ver si el sistema anaeróbico semejante a PKS es una alternativa posible a la desaturasa/elongasa aeróbica más clásica para la síntesis transgénica de LC-PUFA.

Desaturasas

Las enzimas desaturasas que se ha mostrado que participan en la biosíntesis de LC-PUFA pertenecen todas al grupo denominado desaturasas "front-end" (“extremo-frontal”) que se caracterizan por la presencia de un dominio citocromo b5 en el extremo N de cada proteína. El dominio cyt b5 actúa presumiblemente como un receptor de electrones requerido para la desaturación (Napier et al., 1999; Sperling y Heinz, 2001).

La enzima �5 desaturasa cataliza la desaturación adicional de C20 LC-PUFA dando lugar a ácido araquidónico (ARA, 20:4ω6) y EPA (20:5ω3). Los genes que codifican esta enzima se han aislado de varios organismos, incluyendo algas (Thraustochytrium sp. Qiu et al., 2001), hongos (M. alpine, Pythium irregulare, Michaelson et al., 1998; Hong et al., 2002), Caenorhabditis elegans y mamíferos. Un gen que codifica una �5-/�6-desaturasa bifuncional también se ha identificado en el pez cebra (Hasting et al., 2001). El gen que codifica esta enzima podría representar una forma ancestral de la "desaturasa de extremo frontal " ("front-end") que posteriormente se duplicó y desarrolló distintas funciones. La última etapa de desaturación para producir DHA está catalizada por una �4 desaturasa y se ha aislado un gen que codifica esta enzima de la especie de protista de agua dulce Euglena gracilis y la especie marina Thraustochytrium sp. (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003).

Elongasas

También se han aislado varios genes que codifican enzimas de elongación de PUFA (Sayanova y Napier, 2004). Los miembros de esta familia de genes no estaban relacionados con los genes de elongasa presentes en plantas superiores, tales como FAE1 de Arabidopsis, que están implicados en la extensión de ácidos grasos saturados y monoinsaturados. Un ejemplo del último es ácido erúcico (22:1) en Brassicas. En algunas especies de protistas, LC-PUFA se sintetizan por elongación de ácido linoleico o ácido α-linolénico con una unidad C2, antes de la desaturación con �8 desaturasa (Figura 1 parte IV; ruta "desaturación �8"). Las actividades �6 desaturasa y �6 elongasa no se detectaron en estas especies. En lugar de esto, se esperaría una actividad A9-elongasa en dichos organismos, y apoyando esto, se ha aislado recientemente un gen C18 �9-elongasa de Isochrysis galbana (Qi et al., 2002).

Producción por ingeniería de LC-PUFA

Los cultivos oleaginosos transgénicos que se prepararon por ingeniería para producir LC-PUFA principal por inserción de estos genes se han sugerido como una fuente sostenible de ácidos grasos nutricionalmente importantes. Sin embargo, el requerimiento para la expresión y actividad coordinada de cinco enzimas nuevas codificadas por genes de fuentes posiblemente diversas ha hecho que este objetivo sea difícil de conseguir y la proposición permanece hasta ahora como una especulación.

La ruta biosintética dependiente de oxígeno de LC-PUFA para formar EPA (Figura 1) se ha constituido con éxito en levaduras por la co-expresión de una �6-elongasa con �6y �5 ácido graso desaturasas, lo que resulta en una acumulación pequeña pero significativa de ARA y EPA a partir de ácidos linoleico y α-linolénico suministrados exógenamente (Beaudoin et al., 2000; Zank et al., 2000). Esto demostró la capacidad de los genes que pertenecen a la ruta de síntesis de LC-PUFA de funcionar en organismos heterólogos. Sin embargo, la eficiencia para producir EPA fue muy baja. Por ejemplo, tres genes obtenidos de C. elegans, Borago officinalis y Mortierella alpina se expresaron en levadura (Beaudoin et al., 2000). Cuando se suministró a las levaduras transformadas 18:2ω-3 (LA) ó 18:3ω-3 (ALA), hubo una ligera producción de 20:4ω-6 ó 20:5ω-3, con eficiencias de conversión de 0,65 % y 0,3 %, respectivamente. Otros trabajadores obtuvieron de manera similar una eficiencia muy baja en la producción de EPA usando genes que expresan dos desaturasas y una elongasa en levaduras (Domergue et al., 2003a; Zank et al., 2002). Por lo tanto, todavía existe una necesidad de mejorar la eficiencia en la producción de EPA en organismos tales como levaduras, por no hablar de la producción del C22 PUFA que requiere el suministro de etapas enzimáticas adicionales.

Se ha hecho algún progreso en la misión de introducir la ruta biosintética aeróbica de LC-PUFA en plantas superiores incluyendo cultivos oleaginosos (revisado por Sayanova y Napier, 2004; Drexler et al., 2003; Abbadi et al., 2001). Se expresó un gen que codifica una �6-ácido graso desaturasa aislado de borraja (Borago officinalis) en tabaco transgénico y Arabidopsis, lo que resultó en la producción de GLA (18:3ω6) y SDA (18:4ω3), los precursores directos de LC-PUFA, en las plantas transgénicas (Sayanova et al., 1997; 1999). Sin embargo, esto sólo proporciona una primera etapa única.

Domergue et al. (2003a) usaron una combinación de tres genes, que codifican �6-y �5 ácido graso desaturasas y una �6-elongasa tanto en levadura como en linaza transgénico. Los genes desaturasa se obtuvieron de la diatomea Phaeodactylum tricornutum y el gen de elongasa del musgo Physcomitrella patens. Se obtuvieron rendimientos bajos de elongación para ácidos grasos �6 producidos endógenamente en células de levadura (es decir, combinando la primera y segunda etapa enzimática), y el producto principal C20 PUFA formado fue 20:2�11,14 , representando una reacción secundaria no deseada. Domergue et al. (2003a) también afirman, sin datos presentados, que la combinación de los tres genes se expresó en linaza transgénico con ARA y EPA producidos consecuentemente, pero esta producción fue ineficiente. Comentaron que el mismo problema que el que se había observado en levadura existió en las semillas de plantas superiores y que es necesario sortear el "cuello de botella" para la producción de LC-PUFA en cultivos oleaginosos.

WO 2004/071467 (DuPont) informó de la expresión de varias desaturasas y elongasas en células de soja pero no mostró la síntesis de DHA en plantas regeneradas o en semillas.

Abbadi et al. (2004) describieron intentos para expresar combinaciones de desaturasas y elongasas en linaza transgénico, pero sólo se consiguieron niveles bajos de EPA. Abbadi et al. (2004) indicaron que sus niveles bajos de producción de EPA también se debieron a un "cuello de botella" desconocido.

Qi et al. (2004) consiguieron síntesis en hojas pero no informaron sobre resultados en semillas. Éste es un asunto importante ya que la naturaleza de la síntesis de LC-PUFA puede variar entre hojas y semillas. En particular, las semillas oleaginosas almacenan lípido en semillas en su mayor parte como TAG mientras las hojas sintetizan el lípido en su mayor parte como fosfatidil lípidos. Además, Qi et al. (2004) sólo produjeron AA y EPA.

Como resultado, existe una necesidad de métodos adicionales para producir poliinsaturados de cadena larga, particularmente EPA, DPA y DHA, en células recombinantes.

Resumen de la invención

La invención se refiere a una célula vegetal recombinante que sintetiza EPA, que comprende más de un polinucleótido heterólogo, en el que dichos polinucleótidos codifican:

a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa;

en el que los más de un polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula, en el que las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, y en el que la síntesis de EPA requiere la acción secuencial de dichas enzimas.

En una realización, las enzimas codificadas por los polinucleótidos comprenden además al menos una �5 elongasa que cataliza la conversión de EPA en DPA en la célula.

Los presentes inventores son los primeros en identificar una enzima que tiene mayor actividad �5 elongasa que actividad �6 elongasa. Como resultado, esta enzima proporciona un medio eficiente para producir DPA en una célula recombinante ya que la �5 elongación de EPA se ve favorecida sobre la �6 elongación de SDA. Así, en una realización, la �5 elongasa es relativamente específica, esto es, cuando la �5 elongasa también tiene actividad �6 elongasa la elongasa es más eficiente sintetizando DPA a partir de EPA de lo que es sintetizando ETA a partir de SDA.

En otra realización, la �5 elongasa comprende

i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2,

ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, idéntica a SEQ ID NO:2, o

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

En otra realización, la �5 elongasa puede purificarse de algas.

En otra realización, las enzimas codificadas por los polinucleótidos comprenden además al menos una �9 elongasa.

Los presentes inventores son los primeros en identificar una enzima que tiene tanto actividad �9 elongasa como actividad �6 elongasa. Cuando se expresa en una célula con una �6 desaturasa y una �8 desaturasa esta enzima puede usar las dos rutas disponibles para producir ETA a partir de ALA, DGLA a partir de LA, o ambas (véase la Figura 1), incrementando así la eficiencia de la producción de ETA y/o DGLA. Así, en una realización, la �9 elongasa también tiene actividad �6 elongasa. Preferiblemente, la �9 elongasa es más eficiente para sintetizar ETrA

a partir de ALA de lo que es para sintetizar ETA a partir de SDA. Además, en otra realización la �9 elongasa es capaz de elongar SDA a ETA, GLA a DGLA, o ambas, en una célula de levadura. En una realización más, la �9 elongasa comprende

i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, idéntica a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, o

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). Preferiblemente, la �9 elongasa puede purificarse de algas u hongos. Es muy conocido en la técnica que cuanto mayor es el número de transgenes en un organismo, mayor es la

probabilidad de que esté comprometido al menos un parámetro de aptitud del organismo, tal como nivel de expresión de al menos uno de los transgenes, velocidad de crecimiento, producción de aceite, capacidad reproductora etc. De acuerdo con esto, es deseable minimizar el número de transgenes en una célula recombinante. Para este fin, los presentes inventores han considerado numerosas estrategias para producir LC-PUFA en una célula lo que evitará la necesidad de un gen para cada etapa en la ruta relevante.

Así, en otra realización, al menos una de las enzimas es una �5/�6 desaturasa bifuncional o una �5/�6 elongasa bifuncional. La �5/�6 desaturasa bifuncional puede producirse naturalmente por una especie de pez de agua dulce. En una realización particular, la �5/�6 desaturasa bifuncional comprende

i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:15, ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, idéntica a SEQ ID NO: 15, o

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). Preferiblemente, la �5/�6 desaturasa bifuncional se produce naturalmente por una especie de pez de agua dulce. Preferiblemente, la �5/�6 elongasa bifuncional comprende i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 14, ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más

preferiblemente al menos 90 %, idéntica a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 14, o iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En otra realización, al menos una de las enzimas es una �5 desaturasa. En una realización más, las enzimas codificadas por los polinucleótidos comprenden además al menos una �8

desaturasa. En otra realización, la célula vegetal es capaz de sintetizar ácido docosahexaenoico (DHA). Preferiblemente, las enzimas son una cualquiera de las combinaciones siguientes; i) una �5/�6 desaturasa bifuncional, una �5/�6 elongasa bifuncional, y una �4 desaturasa, ii) una �5/�6 desaturasa bifuncional, una �5 elongasa, una �6 elongasa, y una �4 desaturasa, o iii) una �5 desaturasa, una �6 desaturasa, una �5/�6 elongasa bifuncional, y una �4 desaturasa. En otra realización, la célula vegetal es capaz de sintetizar DHA y el o los polinucleótidos introducidos codifican

cinco enzimas en el que las enzimas son de las combinaciones siguientes; i) una �4 desaturasa, una �5 desaturasa, una �6 desaturasa, una �5 elongasa y una �6 elongasa. En otra realización, la célula vegetal es capaz de sintetizar ácido docosapentaenoico (DPA). Preferiblemente, las enzimas son una cualquiera de las combinaciones siguientes; i) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �5/�6 elongasa bifuncional, ii) una �5/�6 desaturasa bifuncional, una �5 elongasa, y una �6 elongasa, o

iii) una �5 desaturasa, una �6 desaturasa, y una �5/�6 elongasa bifuncional.

En una realización más, la célula vegetal es capaz de sintetizar DPA y el o los polinucleótidos introducidos codifican cuatro enzimas en el que las enzimas son de las combinaciones siguientes; i) una �5 desaturasa, una �6 desaturasa, una �5 elongasa y una �6 elongasa. Según la invención, la célula vegetal sintetiza ácido eicosapentaenoico (EPA). Preferiblemente, el o los polinucleótidos introducidos codifican una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �5/�6

elongasa bifuncional. En otra realización, los polinucleótidos introducidos codifican tres enzimas en el que las enzimas son; i) una �5 desaturasa, una �6 desaturasa, y una �6 elongasa. Hasta la fecha la evidencia sugiere que las desaturasas expresadas en al menos algunas células recombinantes,

particularmente levadura, tienen una actividad relativamente baja. Sin embargo, los presentes inventores han identificado que esto puede ser función de la capacidad de la desaturasa para usar acil-CoA como un sustrato en la síntesis de LC-PUFA. A este respecto, también se ha determinado que la desaturasa de origen vertebrado son particularmente útiles para la producción de LC-PUFA en células de planta recombinantes o semillas. Así, según la invención, la célula vegetal recombinante comprende

i) al menos una desaturasa que es capaz de actuar en un sustrato acil-CoA, y opcionalmente ii) al menos una �5 elongasa cataliza la conversión de EPA en DPA en la célula, iii) al menos una desaturasa de un vertebrado o una desaturasa variante de ésta, o iv) cualquier combinación de i) con, ii) o iii). En una realización particular, la �5 elongasa comprende i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2, ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:2, o iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). La desaturasa capaz de actuar en un sustrato acil-CoA o de un vertebrado puede ser una �5 desaturasa, una �6

desaturasa, o ambas. En una realización particular, la desaturasa comprende i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22, ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22,

o iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). Preferiblemente, la al menos una desaturasa se produce naturalmente por un vertebrado. Preferiblemente, dicha célula es capaz de producir dicho LC-PUFA a partir de ácido linoleico (LA), ácido α-linolénico

(ALA) producidos endógenamente, o ambos. Más preferiblemente, la proporción de ALA a LA producidos

endógenamente es al menos 1:1 o al menos 2:1. Según la invención, la célula es una célula vegetal, una célula vegetal de una angiosperma, una célula vegetal oleaginosa, o una célula en una semilla. Preferiblemente, al menos un promotor es un promotor específico de semilla.

En otra descripción, la célula es de un microorganismo unicelular. En una realización más, la célula recombinante produce un LC-PUFA que se incorpora en triacilgliceroles en dicha

célula. Más preferiblemente, al menos 50 % del LC-PUFA que se produce en dicha célula se incorpora en triacilgliceroles. En otra realización, al menos la región codificadora de proteína de uno, dos o más de los polinucleótidos se obtiene

de un gen de alga. Preferiblemente, el gen de alga es del género Pavlova tal como de la especie Pavlova salina. En otro aspecto, una célula vegetal recombinante de la invención es capaz de producir DHA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, ARA, SDA, ETA, EPA, o cualquier combinación o mezcla de éstos, en el que dicha célula recombinante se obtiene de una célula que no es capaz de sintetizar DHA.

En un aspecto más, la célula vegetal recombinante de la invención es capaz de producir DPA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, ARA, SDA, ETA, EPA, o cualquier combinación o mezcla de éstos, en el que dicha célula recombinante se obtiene de una célula que no es capaz de sintetizar DPA.

En un aspecto adicional más, la célula vegetal recombinante de la invención es capaz de producir EPA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, ARA, SDA, ETA, o cualquier combinación o mezcla de éstos, en el que dicha célula recombinante se obtiene de una célula que no es capaz de sintetizar EPA.

En otro aspecto, la célula vegetal recombinante de la invención es capaz de producir DPA a partir de LA, ALA, EPA,

o cualquier combinación o mezcla de éstos, en el que la célula vegetal es de una angiosperma.

En una realización, la célula vegetal también es capaz de producir DHA.

En una realización, la célula es capaz de convertir DGLA en ARA.

En otra realización, la célula comprende además un polinucleótido que codifica una �5 desaturasa, en el que el polinucleótido que codifica la �5 desaturasa está unido de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dicho polinucleótido en la célula, y en el que la célula es capaz de producir ARA.

En una realización particular, la célula carece de actividad ω3 desaturasa y no es capaz de producir ALA. Dichas células pueden ser naturales, o producirse reduciendo la actividad ω3 desaturasa de la célula usando técnicas muy conocidas en la técnica.

La célula es una célula vegetal.

En una realización más, una célula recombinante de la invención también posee la enzima requerida para realizar la ruta "Sprecher" de convertir EPA en DHA. Estas enzimas pueden ser nativas en la célula o producirse recombinantemente. Dichas enzimas incluyen al menos una �7 elongasa, �6 desaturasa y enzimas requeridas para la β-oxidación peroxisomal de ácido tetracosahexaenoico para producir DHA.

Los presentes inventores también han identificado un grupo de nuevas desaturasas y elongasas. Como resultado, aspectos adicionales de la invención se refieren a estas enzimas, así como homólogos/variantes/derivados de éstas.

El polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende además al menos otra secuencia polipeptídica.

El al menos un otro polipéptido puede ser un polipéptido que aumenta la estabilidad de un polipéptido de la presente invención, o un polipéptido que asiste en la purificación de la proteína de fusión.

También se proporcionan polinucleótidos aislados, que, entre otros, codifican polipéptidos de la invención.

En un aspecto más, la especificación describe un vector que comprende o codifica un polinucleótido descrito en la presente memoria. Preferiblemente, el polinucleótido está unido de manera operativa a un promotor específico de semilla.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula vegetal recombinante que comprende un polinucleótido aislado como se describe en la presente memoria

La presente invención proporciona un método para producir una célula vegetal recombinante que sintetiza uno o más LC-PUFA(s), comprendiendo el método introducir en la célula más de un polinucleótido heterólogo, en el que dicho polinucleótido codifica:

a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa;

en el que el más de un polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula,

en el que dicho uno o más LC-PUFA comprenden EPA,

en el que las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar en un sustrato acil-CoA, y en el que la síntesis de EPA requiere la acción secuencial de dichas enzimas.

Naturalmente, se apreciará que cada una de las realizaciones descritas en la presente memoria en relación con las células de planta recombinantes de la invención se aplicará igualmente a métodos para la producción de dichas células.

En un aspecto más, la presente invención proporciona una célula vegetal producida por un método de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende al menos una célula recombinante según la invención.

Preferiblemente, la planta es una angiosperma. Más preferiblemente, la planta es una planta oleaginosa.

En una realización más, la planta transgénica, o parte de ésta incluyendo una semilla transgénica, no comprende un transgén que codifica una enzima que convierte preferentemente un ω6 LC-PUFA en un ω3 LC-PUFA.

En una realización adicional más, la planta transgénica, o parte de ésta incluyendo una semilla transgénica, comprende un transgén que codifica una �8 desaturasa y/o una �9 elongasa.

También se describe en la presente memoria un método para producir una semilla oleaginosa, comprendiendo el método

i) crecer una planta oleaginosa transgénica según la invención en condiciones adecuadas, y

ii) recoger la semilla de la planta.

En un aspecto más, la invención proporciona una parte de la planta transgénica de la invención, en el que dicha parte comprende un nivel incrementado de LC-PUFA en su ácido graso respecto a la parte correspondiente de una planta isogénica no transformada.

Preferiblemente, dicha parte de planta se selecciona de, pero no está limitado a, el grupo que consiste en: una semilla, hoja, tallo, flor, polen, raíces u órgano de almacenamiento especializado (tal como un tubérculo).

Anteriormente, no se ha mostrado que LC-PUFA pueda producirse en semillas de planta, ni que estos LC-PUFA puedan incorporarse en aceites de planta tal como triacilglicerol.

Así, en otro aspecto la presente invención proporciona una semilla transgénica que comprende un LC-PUFA en el que;

el LC-PUFA se selecciona del grupo que consiste en:

i) EPA,

ii) EPA y DPA, y

iii) EPA, DHA, y DPA.

Preferiblemente, el LC-PUFA es EPA, DHA, y DPA.

Preferiblemente, la semilla se obtiene de una semilla isogénica no transgénica que produce LA y/o ALA. Más preferiblemente, la semilla isogénica no transgénica comprende una mayor concentración de ALA que de LA en sus ácidos grasos. Incluso más preferiblemente, la semilla isogénica no transgénica comprende al menos aproximadamente 13 % ALA o al menos aproximadamente 27 % ALA o al menos aproximadamente 50 % ALA en su ácido graso.

Preferiblemente, el ácido graso total en el aceite de la semilla comprende al menos 9 % ácidos grasos C20.

Preferiblemente, la semilla se obtiene de una planta oleaginosa. Más preferiblemente, la planta oleaginosa es canola (Brassica napus), maíz (Zea mays), girasol (Helianthus annuus), soja (Glycine max), sorgo (Sorghum bicolor), lino (Linum usitatissimum), azúcar (Saccharum officinarum), remolacha (Beta vulgaris), algodón (Gossypium hirsutum), cacahuete (Arachis hypogaea), amapola (Papaver somniferum), mostaza (Sinapis alba), ricino (Ricinus communis), sésamo (Sesamum indicum), o alazor (Carthamus tinctorius).

Se prefiere que la semilla tenga una velocidad de germinación que es sustancialmente la misma que la de la semilla isogénica no transgénica.

Se prefiere además que el tiempo de germinación de la semilla sea sustancialmente el mismo que el de la semilla isogénica no transgénica.

Preferiblemente, al menos 25 %, o al menos 50 %, o al menos 75 % de los LC-PUFA en la semilla forman parte de triacilgliceroles.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que las semillas transgénicas producidas usando los métodos de la invención tienen niveles de ALA y LA que son sustancialmente los mismos que los de una semilla isogénica no transgénica. Como resultado, se prefiere que la semilla transgénica tenga niveles de ALA y LA que son sustancialmente los mismos que los de una semilla isogénica no transgénica. Además, fue sorprendente encontrar que los niveles de ácidos grasos monoinsaturados estaban disminuidos en las semillas transgénicas producidas usando los métodos de la invención. De acuerdo con esto, en una realización más preferida, la semilla transgénica

tiene niveles disminuidos de ácidos grasos monoinsaturados cuando se compara con una semilla isogénica no transgénica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una semilla transgénica según la invención, comprendiendo el método

i) introducir en una célula vegetal uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican:

a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa;

en el que el uno o más polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la semilla, y en el que las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, produciendo de esta manera una célula recombinante,

ii) cultivar dicha célula recombinante para producir una planta, y

iii) recuperar la semilla de la planta así producida.

También se describe en la presente memoria un método para producir una semilla transgénica que comprende cultivar una planta transgénica que produce la semilla transgénica de la invención, y recoger dicha semilla transgénica de la planta.

También se describe en la presente memoria un extracto de la planta transgénica de la invención, o una parte de planta de la invención, o una semilla de la invención, en el que dicho extracto comprende un nivel incrementado de LC-PUFA en su ácido graso respecto a un extracto correspondiente de una planta isogénica no transformada.

Preferiblemente, el extracto es aceite sustancialmente purificado que comprende al menos 50 % triacilgliceroles.

También se proporciona un método para producir un LC-PUFA, comprendiendo el método cultivar, en condiciones adecuadas, una célula vegetal recombinante según la invención, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para producir uno o más LC-PUFA, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, comprendiendo el método cultivar, en condiciones adecuadas, una planta transgénica de la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir aceite que comprende al menos un LC-PUFA, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, que comprende obtener la planta transgénica de la invención, o la parte de planta de la invención, o la semilla de la invención, y extraer aceite de dicha planta, parte de planta o semilla.

Preferiblemente, dicho aceite se extrae de la semilla machacando dicha semilla.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una célula vegetal de la invención, o parte de ésta que comprende LC-PUFA, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, y un vehículo adecuado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende la planta transgénica de la invención, o la parte de planta de la invención, o la semilla de la invención, que comprende LC-PUFA, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, y un vehículo adecuado.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un producto alimenticio que comprende una célula vegetal de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición de la invención.

También se describe en la presente memoria un método para preparar un producto alimenticio, comprendiendo el método mezclar una célula vegetal de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición de la invención, con un vehículo adecuado. Preferiblemente, el producto alimenticio es para consumo por un mamífero o un pez.

También se describe en la presente memoria un método para incrementar los niveles de un LC-PUFA en un organismo, comprendiendo el método administrar al organismo una célula vegetal de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición de la invención.

Preferiblemente, la ruta de administración es oral.

Preferiblemente, el organismo es un vertebrado. Más preferiblemente, el vertebrado es un ser humano, pez, animal de compañía o ganado.

En un aspecto más, la presente invención proporciona una célula vegetal de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición de la invención, para tratar o prevenir una afección que se beneficiaría de un LC-PUFA.

Preferiblemente, la afección es una arritmia, angioplastia, inflamación, asma, psoriasis, osteoporosis, piedras renales, SIDA, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esquizofrenia, cáncer, síndrome de alcohol fetal, trastorno de déficit de atención con hiperactividad, fibrosis quística, fenilcetonuria, depresión unipolar, hostilidad agresiva, adrenoleucodistrofia, enfermedad cardiaca coronaria, hipertensión, diabetes, obesidad, enfermedad de Alzheimer, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, restenosis después de angioplastia, eccema, presión sanguínea alta, agregación plaquetaria, hemorragia gastrointestinal, endometriosis, síndrome premenstrual, encefalomielitis miálgica, fatiga crónica después de infecciones virales o enfermedad ocular.

Aunque el proporcionar al sujeto cualquier cantidad de LC-PUFA será beneficioso para el sujeto, se prefiere administrar una cantidad efectiva para tratar la afección.

En otro aspecto, se describe en la presente memoria el uso de una célula de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición de la invención, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una afección que se beneficiaría de un LC-PUFA.

La �6 elongasa de Caenorhabditis elegans se ha expresado anteriormente en levaduras y se ha mostrado que convierte ácido octadecatetraenoico en ácido eicosatetraenoico. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que esta enzima también posee actividad �5 elongasa, siendo capaz de convertir ácido eicosapentaenoico en ácido docosapentaenoico.

También se describe en la presente memoria un método para producir un LC-PUFA no ramificado que comprende 22 átomos de carbono, comprendiendo el método incubar un LC-PUFA no ramificado de 20 átomos de carbono con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:14,

ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 14, y

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii),

en el que el polipéptido también tiene actividad �6 elongasa.

Preferiblemente, el LC-PUFA no ramificado que comprende 22 átomos de carbono es DPA, y el LC-PUFA no ramificado de 20 átomos de carbono es EPA.

Preferiblemente, el método se realiza en una célula vegetal recombinante que produce el polipéptido y EPA.

Como será evidente, los rasgos y características preferidas de un aspecto de la invención son aplicables a muchos otros aspectos de la invención.

A lo largo de esta especificación, la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento, número o etapa indicado, o grupo de elementos, números o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número o etapa, o grupo de elementos, números o etapas.

La invención se describe de aquí en adelante mediante los Ejemplos siguientes no limitativos y con referencia a las figuras adjuntas.

Descripción breve de los dibujos adjuntos

Figura 1. Rutas posibles de la síntesis de ω3y ω6 LC-PUFA. Los sectores marcados I, II, III, y IV corresponden a las rutas ω6(�6), ω3(�6), ω6(�8), y ω3(�), respectivamente. Los compuestos en los sectores I y III son compuestos ω6, mientras aquellos en los sectores II y IV son compuestos ω3. "Des" se refiere a etapas de desaturasa en la ruta catalizadas por desaturasas como se indica, mientras "Elo" se refiere a etapas de elongasa catalizadas por elongasas como se indica. La flecha engrosada indica la etapa �5 elongasa. Las flechas discontinuas indican las etapas en la ruta "Sprecher" que opera en células de mamífero para la producción de DHA a partir de DPA.

Figura 2. Distribución de LC-PUFA en clases de microalgas. Chlorophyceae y Prasinophyceae se describen como "algas verdes", Eustigmatophyceae como "algas verde amarillentas", Rhodophyceae como "algas rojas", y Bacillariophyceae y Prymnesiophyceae como diatomeas y algas marrón dorado.

Figura 3. Construcción genética para la expresión de los genes de la biosíntesis de LC-PUFA en células de planta.

Figura 4. PILEUP de enzimas desaturasa. d8-atg -Pavlova salina �8 desaturasa; euglena -AAD45877 (�8 desaturasa, Euglena gracilis); rhizopus -AAP83964 (�6 desaturasa, Rhizopus sp. NK030037); mucor -BAB69055 (�6 desaturasa, Mucor circinelloides); mortierella -AAL73948 (�6 desaturasa, Mortierella isabellina); malpina -BAA85588 (�6 desaturasa, Mortierella alpina); physcomitrella -CAA11032 (�6 acil-lípido desaturasa, Physcomitrella patens); ceratadon -CAB94992 (�6 ácido graso acetilenasa, Ceratodon purpureus).

Figura 5. Transferencia Southern de productos de PCR, hibridados con sondas Elo1 o Elo2.

Figura 6. PILEUP de enzimas elongasa.

Figura 7. Construcciones de transgén usadas para expresar genes que codifican enzimas biosintéticas de LC-PUFA en Arabidopsis. La "construcción EPA" pSSP-5/6D.6E (también denominada pZebdesatCeloPWvec8 en el Ejemplo 5) (Figura 7A) contenía la �5/�6-desaturasa de función dual de pez cebra (D5/D6Des) y la �6-elongate de nematodo (D6Elo) ambas dirigidas por el promotor napin truncado (Fp1), y el gen marcador seleccionable de resistencia a higromicina (hph) dirigido por el promotor CaMV-35S (35SP). La "construcción DHA" pXZP355 (Figura 7B) comprendía los genes de �4-desaturasa (D4Des) y �5-elongasa (D5Elo) de Pavlova salina ambos dirigidos por el promotor napin truncado (Fp1), y el gen marcador seleccionable de resistencia a kanamicina (nptII) dirigido por el promotor de nopalina sintasa (NosP). Todos los genes estaban flanqueados en el extremo 3' por el terminador de nopalina sintasa (NosT).

Figura 8. A. Cromatograma de gas (GLC) que muestra el perfil de ácidos grasos para Arabidopsis thaliana línea DO11 que porta las construcciones génicas EPA y DHA. B. Espectros de masas para EPA y DHA obtenidos de Arabidopsis thaliana línea DO11.

Figura 9. Autorradiogramas de hibridaciones sobre mancha realizadas en condiciones de astringencia baja o astringencia alta, como se describe en el Ejemplo 12, con ADN de varias especies de microalgas indicadas en la parte superior, usando sondas radiomarcadas que consisten en regiones codificadores del gen de LC-PUFA de P. salina como se indica a la derecha.

Figura 10. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de �6-y �8-desaturasas de plantas superiores. Las secuencias de aminoácidos de �6-desaturasas de E. plantagineum (Ep1D6Des) (SEQ ID NO:64), E. gentianoides (EgeD6Des, número de registro AY055117) (SEQ ID NO:65), E. pitardii (EpiD6Des, AY055118) (SEQ ID NO:66), Borago officinalis (BofD6Des, U79010) (SEQ ID NO:67) y �8-desaturasas de B. officinalis (BofD8Des, AF133728) (SEQ ID NO:68), Helianthus annus (HanD8Des, S68358) (SEQ ID NO:69), y Arabidopsis thaliana (AtD8DesA, AAC62885.1; y AtD8DesB, CAB71088.1) (SEQ ID NO:70 y SEQ ID NO:71 respectivamente) se alinearon por PILEUP (GCG, Wisconsin, EEUU). HBI, HBII, HBIII son tres cajas de histidina conservadas. F1 y R1 son las regiones correspondientes para los cebadores degenerados EpD6Des-F1 y EpD6Des-R1 usados para amplificar el ADNc. También se indica el dominio N-terminal de citocromo b5 con resto HPGG conservado.

Figura 11. Enzimas EplD6Des variantes aisladas y actividades enzimáticas representativas. EplD6Des con citocromo b5, cajas de histidina I, II, y III se muestran como b5, HBI, HBII, HBIII respectivamente. Las variantes aisladas se muestran en el panel A en el formato: aminoácido de tipo salvaje -número de la posición -aminoácido variante. Los diamantes vacíos indican mutantes con una reducción significativa de la actividad enzimática, mientras los diamantes llenos indican las variantes sin efecto significativo en la actividad de la enzima. El panel B muestra la comparación de la producción de GLA y SDA en hojas de tabaco transgénicas de dos variantes con la de la enzima de tipo salvaje.

Figura 12. Rutas alternativas para la síntesis del ω3 LC-PUFA SDA (18:4), EPA (20:5) y DHA (22:6) a partir de ALA (18:3). Las desaturasas, elongasas y aciltransferasas se muestran como flechas llenas, abiertas y discontinuas respectivamente. La elongación de la cadena ocurre sólo en sustratos acil-CoA, mientras la desaturación puede ocurrir tanto en sustratos acil-PC [A y B] como acil-CoA [C]. La preferencia de sustrato acil-PC o acil-CoA de la etapa final de �4-desaturasa no se ha determinado todavía. Las rutas que implican acil-PC desaturasas requieren el traslado mediado por aciltransferasa de grupos acilo entre los sustratos PC y CoA. Los paneles A y B muestran las variantes de la "ruta �6" y la "ruta �8" de la ruta acil-PC desaturasa respectivamente. El panel C muestra la ruta expresada en el estudio actual en la que las actividades acil-CoA �6y �5 desaturasa estaban codificadas por la �6/�5 desaturasa de función dual del pez cebra. La síntesis de ω6 LC-PUFA tal como ARA (20:4) ocurre por el mismo conjunto de reacciones pero comenzando con LA (18:2) como el sustrato inicial.

Figura 13. Velocidades de crecimiento de Synechococcus 7002 a 22 °C, 25 °C, 30 °C.

Figura 14. Niveles de ácido linoleico y linolénico de Synechococcus 7002 a varias temperaturas de crecimiento.

Clave para el listado de secuencias

SEQ ID NO:1 -�8 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:2 -�5 elongasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:3 -�9 elongasa de Pavlova salina.

5 SEQ ID NO:4 -�4 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:5 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �8 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:6 -ADNc de longitud completa que codifica �8 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:7 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �5 elongasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:8 -ADNc de longitud completa que codifica �5 elongasa de Pavlova salina.

10 SEQ ID NO:9 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �9 elongasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:10 -ADNc de longitud completa que codifica �9 elongasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:11 -ADNc parcial que codifica la parte N-terminal de �4 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:12 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �4 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:13 -ADNc de longitud completa que codifica �4 desaturasa de Pavlova salina.

15 SEQ ID NO:14 -�5/�6 elongasa bifuncional de Caenorhabditis elegans. SEQ ID NO:15 -�5/�6 desaturasa bifuncional de Danio rerio (pez cebra). SEQ ID NO:16 -�5 desaturasa de seres humanos (Registro Genbank No: AAF29378). SEQ ID NO:17 -�5 desaturasa de Pythium irregulare (Registro Genbank No: AAL13311). SEQ ID NO:18 -�5 desaturasa de Thraustochytrium sp. (Registro Genbank No: AAM09687).

20 SEQ ID NO:19 -�5 desaturasa de Mortierella alpina (Registro Genbank No: 074212). SEQ ID NO:20 -�5 desaturasa de Caenorhabditis elegans (Registro Genbank No: T43319). SEQ ID NO:21 -�6 desaturasa de seres humanos (Registro Genbank No: AAD20018). SEQ ID NO:22 -�6 desaturasa de ratón (Registro Genbank No: NP_062673). SEQ ID NO:23 -�6 desaturasa de Pythium irregulare (Registro Genbank No: AAL13310).

25 SEQ ID NO:24 -�6 desaturasa de Borago officinalis (Registro Genbank No: AAD01410). SEQ ID NO:25 -�6 desaturasa de Anemone leveillei (Registro Genbank No: AAQ10731). SEQ ID NO:26 -�6 desaturasa de Ceratodon purpureus (Registro Genbank No: CAB94993). SEQ ID NO:27 -�6 desaturasa de Physcomitrella patens (Registro Genbank No: CAA11033). SEQ ID NO:28 -�6 desaturasa de Mortierella alpina (Registro Genbank No: BAC82361).

30 SEQ ID NO:29 -�6 desaturasa de Caenorhabditis elegans (Registro Genbank No: AAC15586). SEQ ID NO:30 -�5 elongasa de seres humanos (Registro Genbank No: NP_068586). SEQ ID NO:31 -�6 elongasa de Physcomitrella patens (Registro Genbank No: AAL84174). SEQ ID NO:32 -�6 elongasa de Mortierella alpina (Registro Genbank No: AAF70417). SEQ ID NO:33 -�4 desaturasa de Thraustochytrium sp. (Registro Genbank No: AAM09688).

35 SEQ ID NO:34 -�4 desaturasa de Euglena gracilis (Registro Genbank No: AAQ19605). SEQ ID NO:35 -�9 elongasa de Isochrysis galbana (Registro Genbank No: AAL37626). SEQ ID NO:36 -�8 desaturasa de Euglena gracilis (Registro Genbank No: AAD45877).

SEQ ID NO:37 -ADNc que codifica �5/�6 elongasa bifuncional de Caenorhabditis elegans. SEQ ID NO:38 -ADNc que codifica �5/�6 desaturasa bifuncional de Danio rerio (pez cebra). SEQ ID NO's:39 a 42, 46, 47, 50, 51, 53, 54, 56, 57, 81, 82, 83, 84 y 87 -Cebadores oligonucleotídicos. SEQ ID NO's:43 a 45, 48, 49 y 52 -Restos conservados de varias desaturasas/elongasas. SEQ ID NO:55 -ADNc parcial que codifica elongasa semejante a FAE de Pavlova salina. SEQ ID NO:58 -ADNc de longitud completa que codifica �5 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:59 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �5 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO:60 -�5 desaturasa de Pavlova salina. SEQ ID NO's 61 y 62 -Fragmentos de �6 desaturasa de Echium pitardii. SEQ ID NO:63 -ADNc que codifica marco de lectura abierto de �6 desaturasa de Echium plantagineum. SEQ ID NO:64 -�6 desaturasa de Echium plantagineum. SEQ ID NO:65 -�6 desaturasa de Echium gentianoides (Registro Genbank No: AY055117). SEQ ID NO:66 -�6 desaturasa de Echium pitardii (Registro Genbank No: AY055118). SEQ ID NO:67 -�6 desaturasa de Borago officinalis (Registro Genbank No: U79010). SEQ ID NO:68 -�8 desaturasa de Borago officinalis (Registro Genbank No: AF133728). SEQ ID NO:69 -�8 desaturasa de Helianthus annus (Registro Genbank No: S68358). SEQ ID NO:70 -�8 desaturasaA de Arabiposis thaliana (Registro Genbank No: AAC62885.1). SEQ ID NO:71 -�8 desaturasaB de Arabiposis thaliana (Registro Genbank No: CAB71088.1). SEQ ID NO:72 y 73 -Restos conservados de �6y �8 desaturasas. SEQ ID NO:74 -�6 elongasa de Thraustochytrium sp. (Registro Genbank No: AX951565). SEQ ID NO:75 -�9 elongasa de Danio rerio (Registro Genbank No: NM_199532). SEQ ID NO:76 -�9 elongasa de Pavlova lutheri. SEQ ID NO:77 -�5 elongasa de Danio rerio (Registro Genbank No: AF532782). SEQ ID NO:78 -�5 elongasa de Pavlova lutheri. SEQ ID NO:79 -Secuencia génica parcial de Heterocapsa niei que codifica una elongasa. SEQ ID NO:80 -Proteína codificada por SEQ ID NO:79, la presencia de codón de parada sugiere un intrón en SEQ

ID NO:79.

SEQ ID NO:85 -�9 elongasa de Pavlova salina, codificada por un codón de inicio alternativo en la posición 31 de SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:86 -�9 elongasa de Pavlova salina, codificada por un codón de inicio alternativo en la posición 85 de

SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:88 -Secuencia de aminoácidos de elongasa parcial de Melosira sp. SEQ ID NO:89 -Secuencia de ADNc que codifica una elongasa parcial de Melosira sp.

Descripción detallada

Técnicas Generales y Definiciones

A no ser que se defina específicamente otra cosa, debe entenderse que todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, biología de plantas, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, síntesis de ácidos grasos, y bioquímica).

A no ser que se indique otra cosa, el ácido nucleico recombinante, proteína recombinante, cultivo celular, y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, muy conocidos para los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican en la bibliografía en fuentes tales como , J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el momento), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el momento), y se incorporan en la presente memoria por referencia.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "ácido graso poliinsaturado de cadena larga", "LC-PUFA" o "ácido graso poliinsaturado C20+" se refieren a un ácido graso que comprende al menos 20 átomos de carbono en su cadena de carbono y al menos tres enlaces dobles carbono-carbono. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "ácido graso poliinsaturado de cadena muy larga", "VLC-PUFA" o "ácido graso poliinsaturado C22+" se refiere a un ácido graso que comprende al menos 22 átomos de carbono en su cadena de carbono y al menos tres enlaces dobles carbono-carbono. Habitualmente, el número de átomos de carbono en la cadena de carbono de los ácidos grasos se refiere a una cadena de carbono no ramificada. Si la cadena de carbono es ramificada, el número de átomos de carbono excluye aquellos en los grupos laterales. En una realización, el ácido graso poliinsaturado de cadena larga es un ácido graso ω3, esto es, que tiene una desaturación (enlace doble carbono-carbono) en el tercer enlace carbono-carbono desde el extremo metilo del ácido graso. En otra realización, el ácido graso poliinsaturado de cadena larga es un ácido graso ω6, esto es, que tiene una desaturación (enlace doble carbono-carbono) en el sexto enlace carbono-carbono desde el extremo metilo del ácido graso. En una realización adicional, el ácido graso poliinsaturado de cadena larga se selecciona del grupo que consiste en; ácido araquidónico (ARA, 20:4�5,8,11,14; ω6), ácido eicosatetraenoico (ETA, 20:4�8,11,14,17, ω3) ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5�5,8,11,14,17; ω3), ácido docosapentaenoico (DPA, 22:5�7,10,13,16,19, ω3), o ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6�4,7,10,13,16,19, ω3). El LC-PUFA también puede ser ácido dihomo-γ-linoleico (DGLA) o ácido eicosatrienoico (ETrA, 20:3�11,14,17, ω3). Será fácilmente aparente que el LC-PUFA que se produce según la invención puede ser una mezcla de cualquiera o todos los anteriores y puede incluir otro LC-PUFA o derivados de cualquiera de estos LC-PUFA. En una realización preferida, el ácido graso ω3 es EPA, DPA, o DHA, o incluso más preferiblemente DPA o DHA.

Además, tal y como se usan en la presente memoria los términos "ácido graso poliinsaturado de cadena larga" o "ácido graso poliinsaturado de cadena muy larga" se refieren al ácido graso que está en un estado libre (no esterificado) o en una forma esterificada como parte de un triglicérido, diacilglicérido, monoacilglicérido, unido a acil-CoA u otra forma unida. El ácido graso puede estar esterificado como un fosfolípido tal como formas fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol. Así, el LC-PUFA puede estar presente como una mezcla de formas en el lípido de una célula o un aceite purificado o lípido extraído de células, tejidos u organismos. En realizaciones preferidas, la invención proporciona aceite que comprende al menos 75 % ó 85 % triacilgliceroles, con el resto presente como otras formas de lípido tales como las mencionadas, con al menos dichos triacilgliceroles comprendiendo el LC-PUFA. El aceite puede purificarse o tratarse adicionalmente, por ejemplo por hidrólisis con una base fuerte para liberar el ácido graso libre, o por fraccionamiento, destilación o semejantes.

Tal y como se usa en la presente memoria, las abreviaturas "LC-PUFA" y "VLC-PUFA" pueden referirse a un único tipo de ácido graso, o a múltiples tipos de ácidos grasos. Por ejemplo, una planta transgénica de la invención que produce LC-PUFA puede producir EPA, DPA y DHA.

Las proteínas desaturasa y elongasa y los genes que las codifican que pueden usarse en la invención son cualquiera de aquellas conocidas en la técnica u homólogos o derivados de éstas. Los ejemplos de dichos genes y los tamaños de las proteínas codificadas se listan en la Tabla 1. Las enzimas desaturasas que se ha mostrado que participan en la biosíntesis LC-PUFA todas pertenecen al grupo denominado desaturasas "de extremo frontal " que se caracterizan por la presencia de un dominio semejante a citocromo b5 en el extremo N de cada proteína.

TABLA 1. Genes clonados implicados en la biosíntesis de LC-PUFA.

Enzima: Tipo de organismo Especie Nos. de Registro Tamaño de la proteína (aa's) Referencias

�4-desaturasa: Algas Euglena gracilis AY278558 541 Meyer et al., 2003


: Pavlova lutherii AY332747 445 Tonon et al., 2003


: Thraustochytrium sp. AF489589 519 Qiu et al., 2001


: Thraustochytrium aureum AF391543-5 515 (NCBI)

�5-desaturasa: Mamíferos Homo sapiens AF199596 444 Cho et al., 1999b Leonard et al., 2000b

: Nematodos Caenorhabditis elegans AF11440, NM_06935 0 447 Michaelson et al., 1998b; Watts y Browse, 1999b

: Hongos Mortierella alpina AF067654 446 Michaelson et al., 1998a; Knutzon et al., 1998


: Pythium irregulare AF419297 456 Hong et al., 2002a


: Dictyostelium discoideum AB022097 467 Saito et al., 2000


: Saprolegnia diclina 470 WO02081668

: Diatomeas Phaeodactylum tricornutum AY082392 469 Domergue et al., 2002

: Algas Thraustochytrium sp AF489588 439 Qiu et al., 2001


: Thraustochytrium aureum 439 WO02081668


: Isochrysis galbana 442 WO02081668

: Musgo Marchantia polymorpha AY583465 484 Kajikawa et al., 2004

�6-desaturasa: Mamíferos Homo sapiens NM_013402 444 Cho et al., 1999a; Leonard et al., 2000


: Mus musculus NM_019699 444 Cho et al., 1999a

: Nematodos Caenorhabditis elegans Z70271 443 Napier et al., 1998

: Plantas Borago officinales U79010 448 Sayanova et al., 1997


: Echium AY055117 AY055118 Garcia-Maroto et al., 2002


: Primula vialii AY234127 453 Sayanova et al., 2003


: Anemone leveillei AF536525 446 Whitney et al., 2003

: Musgos Ceratodon purpureus AJ250735 520 Sperling et al., 2000


: Marchantia polymorpha AY583463 481 Kajikawa et al., 2004


: Physcomitrella patens Girke et al., 1998

: Hongos Mortierella alpina AF110510 AB020032 457 Huang et al., 1999; Sakuradani et al., 1999


: Pythium irregulare AF419296 459 Hong et al., 2002a


: Mucor circinelloides AB052086 467 NCBI*


: Rhizopus sp. AY320288 458 Zhang et al., 2004


: Saprolegnia diclina 453 WO02081668

: Diatomeas Phaeodactylum tricornutum AY082393 477 Domergue et al., 2002

: Bacterias Synechocystis L11421 359 Reddy et al., 1993

: Algas Thraustochytrium aureum 456 WO02081668

�5/�6 desaturasa bifuncional: Peces Danio rerio AF309556 444 Hastings et al., 2001

C20 �8-desaturasa: Algas Euglena gracilis AF139720 419 Wallis y Browse, 1999

: Plantas Borago officinales AF133728

�6-elongasa: Nematodos Caenorhabditis elegans NM_069288 288 Beaudoin et al., 2000

: Musgos Physcomitrella AF428243 290 Zank et al., 2002


: patens


: Marchantia polymorpha AY583464 290 Kajikawa et al., 2004

: Hongos Mortierella alpina AF206662 318 Parker-Barnes et al., 2000

: Algas Pavlova lutheri** 501 WO 03078639


: Thraustochytrium AX951565 271 WO 03093482


: Thraustochytrium sp** AX214454 271 WO 0159128

PUFA-elongasa: Mamíferos Homo sapiens AF231981 299 Leonard et al., 2000b; Leonard et al., 2002


: Rattus norvegicus AB071985 299 Inagaki et al., 2002


: Rattus norvegicus** AB071986 267 Inagaki et al., 2002


: Mus musculus AF170907 279 Tvrdik et al., 2000


: Mus musculus AF170908 292 Tvrdik et al., 2000

: Peces Danio rerio AF532782 291 (282) Agaba et al., 2004


: Danio rerio** NM_199532 266 Lo et al., 2003

: Gusano Caenorhabditis elegans Z68749 309 Abbott et al 1998 Beaudoin et al 2000

: Algas Thraustochytrium aureum** AX464802 272 WO 0208401-A2


: Pavlova lutheri** ? WO 03078639

�9-elongasa: Algas Isochrysis galbana AF390174 263 Qi et al., 2002

* htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ** Función no probada/no demostrada

El dominio semejante a citocromo b5 actúa presumiblemente como un receptor de electrones requerido para la desaturación (Napier et al., 1999; Sperling y Heinz, 2001).

La actividad de cualquiera de las elongasas o desaturasas para uso en la invención puede ensayarse expresando un gen que codifica la enzima en una célula tal como, por ejemplo, una célula de levadura o una célula vegetal, y

determinando si la célula tiene una capacidad incrementada de producir LC-PUFA comparado con una célula comparable en la que la enzima no se expresa.

A no ser que se afirme lo contrario, las realizaciones de la presente invención que se refieren a células, plantas, semillas, etc, y a métodos para la producción de éstas, y que se refieren al menos a "dos enzimas" (o al menos "tres enzimas" etc) de la lista que se proporciona significa que los polinucleótidos codifican al menos dos enzimas "diferentes" de la lista proporcionada y no dos marcos de lectura abiertos idénticos (o muy similares con sólo unas pocas diferencias de manera que no alteran sustancialmente la actividad de la enzima codificada) que codifican esencialmente la misma enzima.

Tal y como se usa en la presente memoria, a no ser que se afirme lo contrario, el término "sustancialmente el mismo", o variaciones de éste, significa que dos muestras que se están analizando, por ejemplo dos semillas de diferentes fuentes, son sustancialmente la misma si sólo varían aproximadamente +/-10 % en el rasgo que se está investigando.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "una enzima que convierte preferentemente un ω6 LC-PUFA en un ω3 LC-PUFA" significa que la enzima es más eficiente realizando dicha conversión lo que es realizando una reacción de desaturación indicada en las rutas II o III de la Figura 1.

Aunque determinadas enzimas se describen específicamente en la presente memoria como "bifuncionales", la ausencia de dicho término no implica necesariamente que una enzima particular no posee una actividad distinta de la que se define específicamente.

Desaturasas

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�5/�6 desaturasa bifuncional" o "�5/�6 desaturasa" es al menos capaz de i) convertir ácido α-linolénico en ácido octadecatetraenoico, y ii) convertir ácido eicosatetraenoico en ácido eicosapentaenoico. Esto es, una �5/�6 desaturasa bifuncional es tanto una �5 desaturasa como una �6 desaturasa, y las �5/�6 desaturasas bifuncionales pueden considerarse una sub-clase de cada una de éstas. Un gen que codifica una �5-/�6-desaturasa bifuncional se ha identificado en el pez cebra (Hasting et al., 2001). El gen que codifica esta enzima podría representar una forma ancestral de la "desaturasa de extremo frontal " que posteriormente se duplicó y las copias desarrollaron distintas funciones �5-y �6-desaturasa. En una realización, la �5/�6 desaturasa bifuncional se produce naturalmente por una especie de pez de agua dulce. En una realización particular, la �5/�6 desaturasa bifuncional comprende

i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:15,

ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO: 15, o

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�5 desaturasa" es al menos capaz de convertir ácido eicosatetraenoico en ácido eicosapentaenoico. En una realización, la enzima �5 desaturasa cataliza la desaturación de C20 LC-PUFA, convirtiendo DGLA en ácido araquidónico (ARA, 20:4ω6) y ETA en EPA (20:5ω3). Los genes que codifican esta enzima se han aislado de varios organismos, incluyendo algas (Thraustochytrium sp. Qiu et al., 2001), hongos (M. alpine, Pythium irregulare, P. tricornutum, Dictyostelium), Caenorhabditis elegans y mamíferos (Tabla 1). En otra realización, la �5 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:60, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:60, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �5 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:60, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:60, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �5 desaturasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �5 desaturasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�6 desaturasa" es al menos capaz de convertir ácido α-linolénico en ácido octadecatetraenoico. En una realización, la enzima �6 desaturasa cataliza la desaturación de C18 LC-PUFA, convirtiendo LA en GLA y ALA en SDA. En otra realización, la �6 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �6 desaturasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:64 SEQ

ID NO:65, SEQ ID NO:66 o SEQ ID NO:67. En una realización adicional, la �6 desaturasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �6 desaturasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�4 desaturasa" es al menos capaz de convertir ácido docosapentaenoico en ácido docosahexaenoico. La etapa de desaturación para producir DHA a partir de DPA está catalizada por una �4 desaturasa en organismos distintos de mamíferos, y un gen que codifica esta enzima se ha aislado de la especie de protista de agua dulce Euglena gracilis y la especie marina Thraustochytrium sp. (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003). En una realización, la �4 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:34, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:34, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �4 desaturasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �4 desaturasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�8 desaturasa" es al menos capaz de convertir 20:3�11,14,17ω3 en ácido eicosatetraenoico. En una realización, la �8 desaturasa es relativamente específica para sustratos �8. Esto es, tiene una actividad mayor desaturando sustratos �8 que otros sustratos, en particular sustratos desaturados �6. En una realización preferida, la �8 desaturasa tiene poca o ninguna actividad �6 desaturasa cuando se expresa en células de levadura. En otra realización, la �8 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 o SEQ ID NO:71, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 o SEQ ID NO:71, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �8 desaturasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:1, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:1, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

Tal y como se usa en la presente memoria, una "ω3 desaturasa" es al menos capaz de convertir LA en ALA y/o GLA en SDA y/o ARA en EPA. Los ejemplos de ω3 desaturasa incluyen los descritos por Pereira et al. (2004), Horiguchi et al. (1998), Berberich et al. (1998) y Spychalla et al. (1997). En una realización, una célula de la invención es una célula vegetal que carece de actividad ω3 desaturasa. Dichas células pueden producirse usando tecnología de inactivación génica muy conocida en la técnica. Estas células pueden usarse para producir específicamente grandes cantidades de ω6 LC-PUFA tal como DGLA.

Elongasas

La evidencia bioquímica sugiere que la elongación de ácidos grasos consiste en 4 etapas: condensación, reducción, deshidratación y una segunda reducción. En el contexto de esta invención, una "elongasa" se refiere al polipéptido que cataliza la etapa de condensación en presencia de los demás miembros del complejo de elongación, en condiciones fisiológicas adecuadas. Se ha mostrado que sólo se requiere la expresión heteróloga u homóloga en una célula del componente de condensación ("elongasa") del complejo proteico de elongación para la elongación de la cadena acilo respectiva. Así, la elongasa introducida es capaz de reclutar con éxito las actividades de reducción y deshidratación del huésped transgénico para llevar a cabo las elongaciones de acilo con éxito. Se piensa que la especificidad de la reacción de elongación respecto a la longitud de la cadena y el grado de desaturación de los sustratos ácido graso reside en el componente de condensación. También se piensa que este componente es limitante de la velocidad en la reacción de elongación.

Hasta ahora se han identificado dos grupos de enzimas de condensación. El primero está implicado en la extensión de ácidos grasos saturados y monoinsaturados (C18-22) tales como, por ejemplo, el gen FAE1 de Arabidopsis. Un ejemplo de un producto formado es ácido erúcico (22:1) en Brassicas. Este grupo se designa enzimas semejantes a FAE y no parece que tengan un papel en la biosíntesis de LC-PUFA. La otra clase identificada de elongasas de ácidos grasos, designada la familia ELO de elongasas, se denominan como los genes ELO cuyas actividades se requieren para la síntesis de los ácidos grasos de cadena muy larga de esfingolípidos en levaduras. Se ha mostrado que los paralogos aparentes de las elongasas de tipo ELO aislados de los organismos que sintetizan LC-PUFA como algas, musgos, hongos y nematodos están implicados en la elongación y síntesis de LC-PUFA. También se han aislado varios genes que codifican dichas enzimas de elongación PUFA (Tabla 1). Dichos genes no están relacionados en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos con los genes de elongasa semejantes a FAE presentes en las plantas superiores.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�5/�6 elongasa bifuncional" o "�5/�6 elongasa" es al menos capaz de i) convertir ácido octadecatetraenoic en ácido eicosatetraenoico, y ii) convertir ácido eicosapentaenoico en ácido docosapentaenoico. Esto es, una �5/�6 elongasa bifuncional es tanto una �5 elongasa como una �6 elongasa, y las �5/�6 elongasas bifuncionales pueden considerarse una sub-clase de cada una de éstas. En una realización, la �5/�6 elongasa bifuncional es capaz de catalizar la elongación de EPA para formar DPA en una célula vegetal tal como, por ejemplo, una célula vegetal superior, cuando se proporciona a esta célula una fuente de EPA. El EPA puede proporcionarse exógenamente o preferiblemente endógenamente. Un gen que codifica dicha elongasa se ha aislado de un invertebrado, C. elegans (Beaudoin et al., 2000) aunque no se conocía anteriormente que catalizara la etapa de �5-elongación. En una realización, la �5/�6 elongasa bifuncional comprende (i) una secuencia de

aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:14, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:14, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�5 elongasa" es al menos capaz de convertir ácido eicosapentaenoico en ácido docosapentaenoico. En una realización la �5 elongasa es de una fuente de no vertebrado tal como, por ejemplo, una fuente de alga o fúngica. Dichas elongasas pueden tener ventajas en términos de la especificidad de las reacciones de elongación llevadas a cabo (por ejemplo, la �5 elongasa proporcionada como SEQ ID NO:2). En una realización preferida, la �5 elongasa es relativamente específica para sustratos C20 sobre sustratos C22. Por ejemplo, puede tener al menos una actividad 10 veces menor frente a sustratos C22 (elongados a ácidos grasos C24) respecto a la actividad frente a un sustrato C20 correspondiente cuando se expresa en células de levadura. Se prefiere que la actividad cuando se usa sustratos C20 �5 desaturados sea alta, tal como por ejemplo, proporcionando una eficiencia para la conversión de 20:5ω3 en 22:5ω3 de al menos 7 % cuando se expresa en células de levadura. En otra realización, la �5 elongasa es relativamente específica para sustratos �5 desaturados sobre sustratos �6 desaturados. Por ejemplo, puede tener al menos una actividad 10 veces menor frente a sustratos C18 �6 desaturados respecto a sustratos C20 �5 desaturados cuando se expresa en células de levadura. En una realización más, la �5 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:77 o SEQ ID NO:78, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:77 o SEQ ID NO:78, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En otra realización, la �5 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:2, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �5 elongasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �5 elongasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�6 elongasa" es al menos capaz de convertir ácido octadecatetraenoico en ácido eicosatetraenoico. En una realización, la �6 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 o SEQ ID NO:88, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 o SEQ ID NO:88, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En otra realización, la �6 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 or SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 o SEQ ID NO:88, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86 o SEQ ID NO:88, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �6 elongasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �6 elongasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos.

En algunas especies de protistas, LC-PUFA se sintetizan por elongación de ácido linoleico o ácido α-linolénico con una unidad C2, antes de la desaturación con �8 desaturasa (Figura 1 parte IV; ruta "desaturación �8"). Las actividades �6 desaturasa y �6 elongasa no se detectaron en estas especies. En lugar de esto, se esperaría una actividad �9-elongasa en dichos organismos, y apoyando esto, se ha aislado recientemente un gen C18 �9elongasa de Isochrysis galbana (Qi et al., 2002). Tal y como se usa en la presente memoria, una "�9 elongasa" es al

11,14,17

menos capaz de convertir ácido α-linolénico en 20:3�ω3. En una realización, la �9 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En otra realización, la �9 elongasa comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la �9 elongasa está codificada por la región codificadora de proteína de uno de los genes de �9 elongasa listados en la Tabla 1 o gen sustancialmente idéntico de éstos. En otra realización, la �9 elongasa también tiene actividad �6 elongasa. La elongasa en esta realización es capaz de convertir SDA en ETA y/o GLA en DGLA (actividad �6 elongasa) además de convertir ALA en ETrA (�9 elongasa). En una realización preferida, dicha elongasa es de una fuente de alga o fúngica tal como, por ejemplo, el género Pavlova.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "�4 elongasa" es al menos capaz de convertir ácido docosahexaenoico en 24:6�6,9,12,15,18,21ω3.

Células

Las células adecuadas de la invención incluyen cualquier célula vegetal que pueda transformarse con un polinucleótido que codifique un polipéptido/enzima descrito en la presente memoria, y que es capaz de esta manera de ser usada para producir LC-PUFA. Las células de planta huésped en las que se introducen el o los polinucleótidos pueden ser bien células no transformadas o células que ya se han transformado con al menos una molécula de ácido nucleico. Dicha molécula de ácido nucleico puede estar relacionada con la síntesis de LC-PUFA,

o no relacionada. Las células huésped de la presente invención pueden ser capaces de producir endógenamente (es decir, naturalmente) proteínas de la presente invención o pueden ser capaces de producir dichas proteínas sólo después de haber sido transformadas con al menos una molécula de ácido nucleico.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula con una capacidad aumentada de sintetizar un ácido graso poliinsaturado de cadena larga" es un término relativo en el que la célula recombinante de la invención se compara con la célula nativa, con la célula recombinante produciendo más ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, o una mayor concentración de LC-PUFA tal como EPA, DPA o DHA (respecto a otros ácidos grasos), que la célula nativa.

Las células de planta huésped de la presente invención pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una proteína descrita en la presente memoria. En una realización preferida, las células de planta son células de semilla.

Hasta la fecha la evidencia sugiere que algunas desaturasas expresadas heterólogamente en levaduras tienen una actividad relativamente baja en combinación con algunas elongasas. Sin embargo, los presentes inventores han identificado que esto puede aliviarse proporcionando una desaturasa con la capacidad de usar una forma acil-CoA del ácido graso como un sustrato en la síntesis de LC-PUFA, y se piensa que esto es ventajoso también en células recombinantes distintas de levaduras. A este respecto, también se ha determinado que las desaturasas de origen vertebrado son particularmente útiles para la producción de LC-PUFA. Así, en realizaciones de la invención, (i) al menos una de las desaturasas es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, y opcionalmente, (ii) al menos una de las enzimas es una �5 elongasa que cataliza la conversión de EPA en DPA en la célula, (iii) al menos una desaturasa es de vertebrado o es una variante de ésta, o (iv) una combinación de (i) con ii) o iii).

Según la invención, la célula huésped es una célula vegetal, tal como las descritas con mayor detalle en la presente memoria.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "célula progenitora de una semilla" es una célula que se divide y/o diferencia en una célula de una semilla transgénica de la invención, y/o una célula que se divide y/o diferencia en una planta transgénica que produce una semilla transgénica de la invención.

Niveles de LC-PUFA producido

Los niveles del LC-PUFA que se producen en la célula vegetal recombinante son importantes. Los niveles pueden expresarse como una composición (en porcentaje) del ácido graso total que es un LC-PUFA particular o un grupo de LC-PUFA relacionados, por ejemplo, el ω3 LC-PUFA o el ω6 LC-PUFA, o el C22+ PUFA, u otro que puede determinarse por métodos conocidos en la técnica. El nivel también puede expresarse como un contenido en LC-PUFA, tal como por ejemplo el porcentaje de LC-PUFA en el peso seco del material que comprende las células recombinantes, por ejemplo el porcentaje del peso seco de la semilla que es LC-PUFA. Se apreciará que el LC-PUFA que se produce en una semilla oleaginosa puede ser considerablemente mayor en términos de contenido de LC-PUFA que en un vegetal o un grano que no se crece para la producción de aceite, aunque ambos pueden tener composiciones similares de LC-PUFA, y ambos pueden usarse como fuentes de LC-PUFA para consumo humano o animal.

Los niveles de LC-PUFA pueden determinarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el lípido total puede extraerse de las células, tejidos u organismos y el ácido graso convertirse en ésteres de metilo antes del análisis por cromatografía de gases (GC). Dichas técnicas se describen en el Ejemplo 1. La posición del pico en el cromatograma puede usarse para identificar cada ácido graso particular, y el área bajo cada pico integrarse para determinar la cantidad. Tal y como se usa en la presente memoria, a no ser que se afirme lo contrario, el porcentaje de ácido graso particular en una muestra se determina como el área bajo el pico para ese ácido graso como un porcentaje del área total para ácidos grasos en el cromatograma. Esto corresponde esencialmente a un porcentaje en peso (p/p). La identidad de los ácidos grasos puede confirmarse por GC-MS, como se describe en el Ejemplo 1.

En otras realizaciones, el ácido graso total de la célula recombinante puede comprender al menos 1,5 % EPA, preferiblemente al menos 2,1 % EPA, y más preferiblemente al menos 2,5 %, al menos 3,1 %, al menos 4 % o al menos 5,1 % EPA.

En realizaciones adicionales, cuando la célula recombinante es una célula vegetal y se produce DPA, el ácido graso total en la célula puede comprender al menos 0,1 % DPA, preferiblemente al menos 0,13 % o al menos 0,15 % y más preferiblemente al menos 0,5 % o al menos 1 % DPA.

En realizaciones adicionales, el ácido graso total de la célula puede comprender al menos 2 % C20 LC-PUFA, preferiblemente al menos 3 % o al menos 4 % C20 LC-PUFA, más preferiblemente al menos 4,7 % o al menos 7,9 % C20 LC-PUFA y lo más preferiblemente al menos 10,2 % C20 LC-PUFA.

En realizaciones adicionales, el ácido graso total de la célula puede comprender al menos 2,5 % C20 ω3 LC-PUFA, preferiblemente al menos 4,1 % o más preferiblemente al menos 5 % C20 ω3 LC-PUFA.

En otras realizaciones, en las que tanto EPA como DPA se sintetizan en una célula, el nivel de EPA alcanzado es al menos 1,5 %, al menos 2,1 % o al menos 2,5 % y el nivel de DPA al menos 0,13 %, al menos 0,5 % o al menos 1,0 %.

En cada una de estas realizaciones, la célula recombinante es una célula vegetal. En una realización preferida, la célula es una célula de una angiosperma (planta superior). En una realización preferida más, la célula es una célula en una semilla tal como, por ejemplo, una semilla oleaginosa o un grano o cereal.

El nivel de producción de LC-PUFA en la célula recombinante también puede expresarse como una proporción de conversión, es decir, la cantidad del LC-PUFA formado como un porcentaje de uno o más sustrato PUFA o LC-PUFA. Respecto a EPA, por ejemplo, esto puede expresarse como la proporción del nivel de EPA (como un porcentaje en el ácido graso total) respecto al nivel de un ácido graso sustrato (ALA, SDA, ETA o ETrA). En una realización preferida, la eficiencia de la conversión es para ALA a EPA. En realizaciones particulares, la proporción de conversión para la producción de EPA en una célula recombinante puede ser al menos 0,5 %, al menos 1 %, o al menos 2 %. En otra realización, la eficiencia de la conversión para ALA en EPA es al menos 14,6 %. En realizaciones adicionales, la proporción de conversión para la producción de DPA a partir de EPA en una célula recombinante es al menos 5 %, al menos 7 %, o al menos 10 %. En otras realizaciones, los ácidos grasos ω3 totales producidos que son productos de �6 desaturación (es decir, aguas abajo de 18:3ω3 (ALA), calculados como la suma de los porcentajes para 18:4ω3 (SDA), 20:4ω3 (ETA), 20:5ω3 (EPA) y 22:5ω3 (DPA)) es al menos 4,2 %. En una realización particular, la eficiencia de la conversión de ALA en productos ω3 a través de una etapa de �6 desaturación y/o una etapa de �9 elongación en una célula recombinante, preferiblemente una célula vegetal, más preferiblemente una célula de semilla, es al menos 22 % o al menos 24 %. Dicho de otra manera, en esta realización la proporción de productos derivados de ALA en ALA (productos:ALA) en la célula es al menos 1:3.6.

El contenido del LC-PUFA en la célula recombinante puede maximizarse si la célula parental usada para la introducción de los genes se elige de tal manera que el nivel de sustrato ácido graso que se produce o proporciona exógenamente es óptimo. En realizaciones particulares, la célula produce ALA endógenamente a niveles de al menos 30 %, al menos 50 %, o al menos 66 % del ácido graso total. El nivel de LC-PUFA también puede maximizarse creciendo o incubando las células en condiciones óptimas, por ejemplo a una temperatura ligeramente más baja que la temperatura estándar para esa célula, lo que se piensa que favorece la acumulación de ácido graso poliinsaturado.

Existen ventajas en maximizar la producción de un LC-PUFA deseado mientras se minimiza el grado de reacciones secundarias. En una realización particular, hay poco o nada de ETrA detectado (menos de 0,1 %) mientras el nivel de EPA es al menos 2,1 %.

En las plantas transgénicas de la invención, en una realización, al menos una parte de planta sintetiza EPA, en el que el ácido graso total de la parte de planta comprende al menos 1,5 %, al menos 2,1 %, o al menos 2,5 % EPA.

En otra realización, al menos una parte de planta sintetiza DPA, en el que el ácido graso total de la parte de planta comprende al menos 0,1 %, al menos 0,13 %, o al menos 0,5 % DPA.

En una realización más, al menos una parte de planta sintetiza DHA.

En otra realización, al menos una parte de planta sintetiza DHA, en el que el ácido graso total de la parte de planta comprende al menos 0,1 %, al menos 0,2 %, o al menos 0,5 % DHA.

En otra realización, al menos una parte de planta sintetiza al menos un ω3 C20 LC-PUFA, en el que el ácido graso total de la parte de planta comprende al menos 2,5 %, o al menos 4,1 % ω3 C20 LC-PUFA.

En otra realización más, al menos una parte de planta sintetiza EPA, en el que la eficiencia de la conversión de ALA en EPA en la parte de planta es al menos 2 % o al menos 14,6 %.

En una realización más, al menos una parte de planta sintetiza ácidos grasos poliinsaturados ω3 que son productos de �6-desaturación de ALA y/o los productos de �9 elongación de ALA, en el que la eficiencia de la conversión de ALA en dichos productos en la parte de la planta es al menos 22 % o al menos 24 %.

En otra realización más, al menos una parte de planta sintetiza DPA a partir de EPA, en el que la eficiencia de la conversión de EPA en DPA en la parte de planta es al menos 5 % o al menos 7 %.

Respecto a las semillas transgénicas de la invención, en una realización EPA se sintetiza en la semilla y el ácido graso total de la semilla comprende al menos 1,5 %, al menos 2,1 %, o al menos 2,5 % EPA.

En otra realización, DPA se sintetiza en la semilla y el ácido graso total de la semilla comprende al menos 0,1 %, al menos 0,13 %, o al menos 0,5 % DPA.

En una realización más, DHA se sintetiza en la semilla.

En otra realización, DHA se sintetiza en la semilla y el ácido graso total de la semilla comprende al menos 0,1 %, al menos 0,2 %, o al menos 0,5 % DHA.

En todavía una realización más, al menos un ω3 C20 LC-PUFA se sintetiza en la semilla y el ácido graso total de la semilla comprende al menos 2,5 %, o al menos 4,1 % ω3 C20 LC-PUFA.

En una realización más, EPA se sintetiza en la semilla y la eficiencia de la conversión de ALA en EPA en la semilla

es al menos 2 % o al menos 14,6 %. En otra realización, los ácidos grasos poliinsaturados ω3 que son productos de �6-desaturación de ALA y/o los productos de �9 elongación de ALA, se sintetizan en la semilla, y la eficiencia de la conversión de ALA en dichos productos en la semilla es al menos 22 % o al menos 24 %.

En una realización más, DPA se sintetiza a partir de EPA en la semilla y la eficiencia de la conversión de EPA en

DPA en la semilla es al menos 5 % o al menos 7 %. Respecto a los extractos descritos en la presente memoria, en una realización, el contenido de ácido graso total del extracto comprende al menos 1,5 %, al menos 2,1 %, o al menos 2,5 % EPA.

En otra realización, el contenido de ácido graso total del extracto comprende al menos 0,1 %, al menos 0,13 %, o al menos 0,5 % DPA.

En una realización más, el extracto comprende DHA. En otra realización, el contenido de ácido graso total del extracto comprende al menos 0,1 %, al menos 0,2 %, o al menos 0,5 % DHA.

En otra realización, el contenido de ácido graso total del extracto comprende al menos 2,5 %, o al menos 4,1 % ω3

C20 LC-PUFA. En todavía una realización más, el extracto comprende ARA, EPA, DPA, DHA, o cualquier mezcla de éstos en los triacilgliceroles.

Respecto a los métodos de la invención para producir un LC-PUFA, en una realización, la célula vegetal comprende al menos un C20 LC-PUFA, y el ácido graso total de la célula comprende al menos 2 %, al menos 4,7 %, o al menos 7,9 % C20 LC-PUFA.

En otra realización, la célula vegetal comprende al menos un ω3 C20 LC-PUFA y el ácido graso total de la célula

comprende al menos 2,5 %, o al menos 4,1 % ω3 C20 LC-PUFA. En una realización más, la célula vegetal comprende ácidos grasos poliinsaturados ω3 que son los productos de �6desaturación de ALA y/o los productos de �9 elongación de ALA, y la eficiencia de la conversión de ALA en dichos productos en la célula es al menos 22 % o al menos 24 %.

En otra realización más, la célula vegetal comprende DPA, y el ácido graso total de la célula comprende al menos

0,1 %, al menos 0,13 %, o al menos 0,5 % DPA. En una realización más, la célula vegetal comprende DPA, y la eficiencia de la conversión de EPA en DPA en la célula es al menos 5 % o al menos 7 %.

En otra realización, la célula vegetal comprende EPA, y en el que el ácido graso total de la célula comprende al

menos 1,5 %, al menos 2,1 %, o al menos 2,5 % EPA. En una realización más, la célula vegetal comprende EPA, y la eficiencia de la conversión de ALA en EPA en la célula es al menos 2 % o al menos 14,6 %.

Polipéptidos

En un aspecto, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:1, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii), en el que el polipéptido tiene actividad �8 desaturasa. Preferiblemente, la �8 desaturasa no tiene también actividad �6 desaturasa. En otro aspecto, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado

seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:2,

ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a SEQ ID NO:2, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii), en el que el polipéptido tiene actividad �5 elongasa y/o �6 elongasa. Preferiblemente, el polipéptido tiene actividad �5 elongasa y �6 elongasa, y en el que el polipéptido es más eficiente

sintetizando DPA a partir de EPA de lo que es sintetizando ETA a partir de SDA. Más preferiblemente, el polipéptido puede purificarse de algas. Además, cuando se expresa en células de levadura, es más eficiente elongando C20 LC-PUFA que C22 LC-PUFA.

En otro aspecto, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado

seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86,

ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 % idéntica a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii),

en el que el polipéptido tiene actividad �9 elongasa y/o �6 elongasa. Preferiblemente, el polipéptido tiene actividad �9 elongasa y �6 elongasa. Preferiblemente, el polipéptido es más eficiente para sintetizar ETrA a partir de ALA de lo que es para sintetizar ETA a partir de SDA. Además, se prefiere que el polipéptido pueda purificarse de algas u hongos.

En otro aspecto más, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:4, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a SEQ ID NO:4, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii),

en el que el polipéptido tiene actividad �4 desaturasa. En otro aspecto más, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado seleccionado del grupo que consiste en:

i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:60, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 55 % idéntica a SEQ ID NO:60, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii), en el que el polipéptido tiene actividad �5 desaturasa. En otro aspecto más, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado

seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:64, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:64, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii), en el que el polipéptido tiene actividad �6 desaturasa. En otro aspecto más, también se describe en la presente memoria un polipéptido sustancialmente purificado

seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID NO:88, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 76 % idéntica a SEQ ID NO:88, y iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii), en el que el polipéptido tiene actividad �6 elongasa.

Preferiblemente, en relación con uno cualquiera de los aspectos anteriores, se prefiere que el polipéptido pueda aislarse de una especie seleccionada del grupo que consiste en Pavlova y Melosira.

Por "polipéptido sustancialmente purificado" queremos decir un polipéptido que se ha separado al menos parcialmente de los lípidos, ácidos nucleicos, otros polipéptidos, y otras moléculas contaminantes con las que está asociado en su estado nativo. Preferiblemente, el polipéptido sustancialmente purificado carece al menos de 60 %, preferiblemente carece al menos de 75 %, y lo más preferiblemente carece al menos de 90 % de otros componentes con los que está asociado naturalmente. Además, el término "polipéptido" se usa indistintamente en la presente memoria con el término "proteína".

El % de identidad de un polipéptido se determina por análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de hueco=5, y una penalización por extensión de hueco=0,3. A no ser que se afirme otra cosa, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 15 aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 50 aminoácidos, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Incluso más preferiblemente, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 100 aminoácidos y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos.

Respecto a los polipéptidos/enzimas definidos, se apreciará que los valores de % de identidad más altos que los proporcionados anteriormente englobarán realizaciones preferidas. Así, cuando es aplicable, a la luz de los valores de % identidad mínimos, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 76 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 91 %, más preferiblemente al menos 92 %, más preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente al menos 94 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 %, más preferiblemente al menos 99,1 %, más preferiblemente al menos 99,2 %, más preferiblemente al menos 99,3 %, más preferiblemente al menos 99,4 %, más preferiblemente al menos 99,5 %, más preferiblemente al menos 99,6 %, más preferiblemente al menos 99,7 %, más preferiblemente al menos 99,8 %, e incluso más preferiblemente al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nominada relevante.

En una realización más, también se describen en la presente memoria polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los descritos específicamente en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, con referencia a un polipéptido el término "sustancialmente idéntico" significa la deleción, inserción y/o sustitución de uno

o unos pocos (por ejemplo, 2, 3, ó 4) aminoácidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fragmento biológicamente activo" se refiere a una parte del polipéptido/enzima definido que todavía mantiene actividad desaturasa o elongasa (la que sea relevante). Dichos fragmentos biológicamente activos pueden determinarse fácilmente por deleciones seriadas de la proteína de longitud completa, y ensayo de la actividad del fragmento resultante.

Los mutantes/variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos/enzimas definidos en la presente memoria pueden prepararse introduciendo cambios apropiados en los nucleótidos en un ácido nucleico que codifica el polipéptido, o por síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dichos mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos. Puede hacerse una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que el producto de proteína final posea las características deseadas.

En el diseño de mutantes de la secuencia de aminoácidos, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la o las características que se quieren modificar. Los sitios para la mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, (1) sustituyendo en primer lugar con elecciones de aminoácidos conservativas y después con selecciones más radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (2) delecionando el residuo diana, o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio localizado.

Las deleciones en la secuencia de aminoácidos varían generalmente de aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferiblemente aproximadamente 1 a 10 residuos y normalmente aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de polipéptido eliminado y un residuo diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen sitios identificados como el o los sitios activos o de unión. Otros sitios de interés son aquellos en los que son idénticos los residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, especialmente aquellos que se encuentren en una secuencia de al menos tres sitios idénticamente conservados diferentes, se sustituyen preferiblemente de una manera relativamente conservativa. Dichas sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2.

Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no naturales o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en los polipéptidos de la presente invención. Dichos aminoácidos incluyen, pero no están

limitados a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, tbutilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales

5 como β-metil aminoácidos, Cα-metil aminoácidos, Nα-metil aminoácidos, y análogos de aminoácidos en general.

También se describen en la presente memoria polipéptidos que se modifican diferencialmente durante o después de la síntesis, por ejemplo, por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Estas modificaciones pueden servir para incrementar la estabilidad y/o

10 bioactividad del polipéptido.

TABLA 2. Ejemplo de sustituciones

Residuo Original: Ejemplo de sustituciones

Ala (A): val; leu; ile; gly

Arg (R): lys

Asn (N): gln; his

Asp (D): glu

Cys (C): ser

Gln (Q): asn; his

Glu (E): asp

Gly (G): pro, ala

His (H): asn; gln

Ile (I): leu; val; ala

Leu (L): ile; val; met; ala; phe

Lys (K): arg

Met (M): leu; phe

Phe (F): leu; val; ala

Pro (P): gly

Ser (S): thr

Thr (T): ser

Trp (W): tyr

Tyr (Y): trp; phe

Val (V): ile; leu; met; phe, ala

Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden producirse de varias maneras, incluyendo producción y recuperación de proteínas naturales, producción y recuperación de proteínas recombinantes, y síntesis química de

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las proteínas. En una realización, se produce un polipéptido aislado cultivando una célula capaz de expresar el polipéptido en condiciones efectivas para producir el polipéptido, y recuperando el polipéptido. Una célula preferida para cultivar es una célula vegetal recombinante de la presente invención. Las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no están limitadas a, medios efectivos, condiciones de biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. Un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir un polipéptido de la presente invención. Dicho medio comprende normalmente un medio acuoso que tiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas, apropiados. Las células de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces con agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación, y placas petri. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Dichas condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica.

Polinucleótidos

En un aspecto, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6; ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria; iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 50 % idéntica a SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6; y iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta. En otro aspecto, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una

secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8; ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria; iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 51 % idéntica a SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8; y iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta. En otro aspecto más, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una

secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10; ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria; iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 51 % idéntica a SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10; y iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta. En una realización preferida, la secuencia que codifica el polipéptido descrito en la presente memoria son los

nucleótidos 31 a 915 de SEQ ID NO:9 o los nucleótidos 85 a 915 de SEQ ID NO:9.

En un aspecto más, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13; ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria; iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 70 % idéntica a SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13; y iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta. En otro aspecto, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una

secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:58 o SEQ ID NO:59; ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria; iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 55 % idéntica a SEQ ID NO:58 o SEQ ID NO:59; y iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta.

En otro aspecto, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:63;

ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria;

iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:63; y

iv) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a iii) en condiciones de astringencia alta.

i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:89;

ii) una secuencia que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria;

iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 76 % idéntica a SEQ ID NO:89; y

Los presentes inventores también son los primeros en aislar un polinucleótido que codifica una elongasa de ácido graso semejante a una ceto-acil sintasa a partir de una planta no superior.

De acuerdo con esto, también se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:55;

ii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 40 % idéntica a SEQ ID NO:55; y

iii) una secuencia que hibrida con i) o ii) en condiciones de astringencia alta.

Por un "polinucleótido aislado", incluyendo ADN, ARN, o una combinación de éstos, monocatenario o bicatenario, en la orientación con sentido o antisentido o una combinación de ambas, ARNds u otra, queremos decir un polinucleótido que está al menos parcialmente separado de las secuencias de polinucleótido con las que está asociado o ligado en su estado nativo. Preferiblemente, el polinucleótido aislado carece al menos de 60 %, preferiblemente carece al menos de 75 %, y lo más preferiblemente carece al menos de 90 % de otros componentes con los que está asociado naturalmente. Además, el término "polinucleótido" se usa indistintamente en la presente memoria con el término "molécula de ácido nucleico".

El % de identidad de un polinucleótido se determina por análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de hueco=5, y una penalización por extensión de hueco=0,3. A no ser que se afirme otra cosa, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 45 nucleótidos, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 150 nucleótidos, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferiblemente, la secuencia de búsqueda tiene una longitud de al menos 300 nucleótidos, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos.

Respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que los valores de % de identidad más altos que los proporcionados anteriormente englobarán realizaciones preferidas. Así, cuando es aplicable, a la luz de los valores de % identidad mínimos, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de nucleótidos que es al menos 60 %, más preferiblemente al menos 65 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 76 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 91 %, más preferiblemente al menos 92 %, más preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente al menos 94 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 %, más preferiblemente al menos 99,1 %, más preferiblemente al menos 99,2 %, más preferiblemente al menos 99,3 %, más preferiblemente al menos 99,4 %, más preferiblemente al menos 99,5 %, más preferiblemente al menos 99,6 %, más preferiblemente al menos 99,7 %, más preferiblemente al menos 99,8 %, e incluso más preferiblemente al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nominada relevante.

En una realización más, también se describen en la presente memoria polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los descritos específicamente en la presente memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, con referencia a un polinucleótido el término "sustancialmente idéntico" significa la sustitución de uno o unos pocos (por ejemplo, 2, 3, ó 4) nucleótidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido. Además, este término incluye la adición o deleción de nucleótidos que resulta en el incremento o

disminución del tamaño de la proteína nativa codificada por uno o unos pocos (por ejemplo, 2, 3, ó 4) aminoácidos mientras se mantiene al menos una actividad de la proteína nativa codificada por el polinucleótido.

Los oligonucleótidos como se describen en la presente memoria pueden ser ARN, ADN, o derivados de uno de éstos. El tamaño mínimo de dichos oligonucleótidos es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre un oligonucleótido y una secuencia complementaria en una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, más preferiblemente al menos 18 nucleótidos, más preferiblemente al menos 19 nucleótidos, más preferiblemente al menos 20 nucleótidos, incluso más preferiblemente al menos 25 nucleótidos. Esto incluye oligonucleótidos que pueden usarse, por ejemplo, como sondas para identificar moléculas de ácido nucleico, o cebadores para producir moléculas de ácido nucleico. Los oligonucleótidos como se describen en la presente memoria usados como una sonda se conjugan normalmente con un marcador tal como un radioisótopo, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente.

Los polinucleótidos y oligonucleótidos como se describen en la presente memoria incluyen aquellos que hibridan en condiciones astringentes con una secuencia proporcionada como SEQ ID NO's: 5 a 13. Tal y como se usan en la presente memoria, condiciones astringentes son aquellas que (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo, 0,015 M NaCl/0,0015 M citrato de sodio/0,1 % NaDodSO4 a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, 50 % (vol/vol) formamida con 0,1 % albúmina de suero bovino, 0,1 % Ficoll, 0,1 % polivinilpirrolidona, 50 mM tampón fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM NaCl, 75 mM citrato de sodio a 42 °C; o (3) emplean 50 % formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1 % pirofosfato de sodio, solución 5 x Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), 0,1 % SDS y 10 % sulfato de dextrano a 42 °C en 0,2 x SSC y 0,1 % SDS.

Los polinucleótidos como se describe en la presente memoria pueden poseer, cuando se comparan con moléculas naturales, una o más mutaciones que son deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótidos. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, realizando mutagénesis dirigida a sitio en el ácido nucleico).

También se describen ácidos nucleicos antisentido y/o catalíticos (tales como ribozimas) que hibridan con un polinucleótido descrito en la presente memoria, y por lo tanto inhiben la producción de una proteína codificada. Además, se describen moléculas de ARNds, particularmente moléculas de ARNds pequeñas con una región bicatenaria de aproximadamente 21 nucleótidos, que puede usarse en interferencia de ARN para inhibir la producción de un polipéptido de la invención en una célula. Dichas moléculas inhibidoras pueden usarse para alterar los tipos de ácidos grasos producidos por una célula, tal como una célula animal, musgo, o célula de alga. La producción de dichos ácidos nucleicos antisentido, catalíticos y moléculas de ARNds está dentro de la capacidad del experto en la técnica (véase, por ejemplo, G. Hartmann y S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999); Haseloff y Gerlach, 1988; Perriman et al., 1992; Shippy et al., 1999; Waterhouse et al. (1998); Smith et al. (2000); WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, y WO 01/34815).

Construcciones Génicas y Vectores

Una realización descrita en la presente memoria incluye un vector recombinante, que incluye al menos una molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido/enzima definido en la presente memoria, insertada en cualquier vector capaz de administrar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped. Dicho vector contiene secuencias de ácido nucleico heterólogas, esto es secuencias de ácido nucleico que no se encuentran naturalmente adyacentes a las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria y que se obtienen preferiblemente de una especie distinta de la especie de la que se obtienen la o las moléculas de ácido nucleico. El vector puede ser ARN o ADN, bien procariota o eucariota, y normalmente es un virus o un plásmido.

Un tipo de vector recombinante comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención unida de manera operativa a un vector de expresión. Como se ha indicado anteriormente, la expresión unida de manera operativa se refiere a la inserción de una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión de una manera tal que la molécula es capaz de expresarse cuando se transforma en una célula huésped. Tal y como se usa en la presente memoria, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula huésped y efectuar la expresión de una molécula de ácido nucleico especificada. Preferiblemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse en la célula huésped. Los vectores de expresión pueden ser bien procariotas o eucariotas, y son normalmente virus o plásmidos. Los vectores de expresión incluyen cualesquiera vectores que funcionan (es decir, dirigen la expresión génica) en células de planta recombinantes de la presente invención. Los vectores de expresión preferidos pueden dirigir la expresión génica en células de levadura, de animales o plantas.

En particular, los vectores de expresión como se describe en la presente memoria contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencia de control de la traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En particular, las moléculas recombinantes incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que

controlan el inicio, elongación, y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tal como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. Los expertos en la técnica conocen varias de dichas secuencias de control de la transcripción.

Otra realización de la presente invención incluye una célula vegetal recombinante que comprende una célula huésped transformada con una o más moléculas recombinantes como se describe en la presente memoria. La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula puede conseguirse por cualquier método por el que una molécula de ácido nucleico puede insertarse en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no están limitadas a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecerse en un tejido, órgano o un organismo multicelular. Las moléculas de ácido nucleico transformadas pueden permanecer extracromosómicamente o pueden integrarse en uno o más sitios en un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de tal manera que se retiene su capacidad de ser expresadas.

Plantas Transgénicas y Partes de Éstas

El término "planta" tal y como se usa en la presente memoria como un nombre se refiere a plantas completas, pero usado como un adjetivo se refiere a cualquier sustancia que está presente en, se obtiene de, deriva de, o está relacionada con una planta, tal como por ejemplo, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores), células únicas (por ejemplo, polen), semillas, células de planta y semejantes. Las plantas proporcionadas por o contempladas para uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En realizaciones preferidas, las plantas de la presente invención son plantas cultivadas (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada, o guisante), u otras legumbres. Las plantas pueden crecerse para la producción de raíces, tubérculos, hojas, tallos, flores o frutos comestibles. Las plantas pueden ser verduras o plantas ornamentales. Las plantas de la invención pueden ser: maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), lino (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cerale), sorgo (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Tritium aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Lopmoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Anana comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia senensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), ficus (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifer indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia intergrifolia), almendro (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), avenas, o cebada.

En una realización, la planta es una planta oleaginosa, preferiblemente una planta cultivada oleaginosa. Tal y como se usa en la presente memoria, una "planta oleaginosa" es una especie de planta usada para la producción comercial de aceites a partir de las semillas de la planta. La planta oleaginosa puede ser colza oleaginosa (tal como canola), maíz, girasol, soja, sorgo, lino (linaza) o remolacha azucarera. Además, la planta oleaginosa puede ser otra Brassicas, algodón, cacahuete, amapola, mostaza, ricino, sésamo, alazor, o plantas que producen nueces. La planta puede producir altos niveles de aceite en su fruto, tal como olivo, aceite de palma o coco. Las plantas hortícolas a las que puede aplicarse la presente invención son lechuga, endivia, o crucíferas vegetales incluyendo col, brécol, o coliflor. La presente invención puede aplicarse en tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, tomate, o pimiento.

Cuando se desea la producción de ω3 LC-PUFA es preferible que la especie de planta que se va a transformar tenga una proporción endógena de ALA a LA que es al menos 1:1, más preferiblemente al menos 2:1. Los ejemplos incluyen la mayor parte, si no todas, de las semillas oleaginosas tal como linaza. Esto maximiza la cantidad de sustrato ALA disponible para la producción de SDA, ETA, ETrA, EPA, DPA y DHA.

Las plantas producidas usando los métodos de la invención pueden ser ya transgénicas, y/o transformadas con genes adicionales a los descritos con detalle en la presente memoria. En una realización, las plantas transgénicas de la invención también producen una ω3 desaturasa recombinante. La presencia de una ω3 desaturasa recombinante incrementa la proporción de ALA a LA en las plantas lo que, como se ha indicado en el párrafo anterior, maximiza la producción de LC-PUFA tal como SDA, ETA, ETrA, EPA, DPA y DHA.

Las plantas de grano que proporcionan semillas de interés incluyen plantas oleaginosas y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tal como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen goma de guar, garrofín, fenogreco, soja, alubias, caupí, soja verde, alubia lima, haba, lentejas, garbanzo, etc.

El término "extracto o parte de ésta" se refiere a cualquier parte de la planta. "Parte" se refiere generalmente a un tejido u órgano específico tal como una semilla o raíz, mientras un "extracto" implica normalmente la disrupción de las paredes celulares y posiblemente la purificación parcial del material resultante. Naturalmente, el "extracto o parte de ésta" comprenderá al menos un LC-PUFA. Los extractos pueden prepararse usando técnicas estándar de la técnica.

Las plantas transgénicas, como se definen en el contexto de la presente invención, incluyen plantas y su progenie que se han modificado genéticamente usando técnicas recombinantes. Esto sería generalmente para causar o aumentar la producción de al menos una proteína/enzima definida en la presente memoria en la planta u órgano de la planta deseado. Las partes de planta transgénicas incluyen todas las partes y células de dichas plantas tal como, por ejemplo, tejidos cultivados, callos, protoplastos. Las plantas transformadas contienen material genético que no contenían antes de la transformación. El material genético preferiblemente se integra de manera estable en el genoma de la planta. El material genético introducido puede comprender secuencias que aparecen naturalmente en la misma especie pero en un orden reorganizado o en una organización diferente de elementos, por ejemplo una secuencia antisentido. Dichas plantas están incluidas en la presente memoria en "plantas transgénicas". Una "planta no transgénica" es una que no se ha modificado genéticamente con la introducción de material genético por técnicas de ADN recombinante. En una realización preferida, las plantas transgénicas son homocigotas para cada uno y todos los genes que se han introducido (transgén) de manera que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado.

Existen varias técnicas para introducir material genético extraño en una célula vegetal. Dichas técnicas incluyen aceleración del material genético recubierto en micropartículas directamente en las células (véase, por ejemplo, US

4.945.050 y US 5.141.131). Las plantas pueden transformarse usando tecnología de Agrobacterium (véase, por ejemplo, US 5.177.010, US 5.104.310, US 5.004.863, US 5.159.135). La tecnología de electroporación también se ha usado para transformar plantas (véase, por ejemplo, WO 87/06614, US 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 y WO 93/21335). Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, también puede variar el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños. Dicho tejido incluirá pero no estará limitado a tejido embrionario, tejido de callo de tipo I y II, hipocotilo, meristemo, y semejantes. Casi todos los tejidos de planta pueden transformarse durante el desarrollo y/o diferenciación usando técnicas apropiadas descritas en la presente memoria.

Se han descrito varios vectores adecuados para la transfección estable de células de planta o para el establecimiento de plantas transgénicas, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Normalmente, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de planta clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras en 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión de plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el medioambiente o el desarrollo, o específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.

Los ejemplos de promotores de plantas incluyen, pero no están limitados a subunidad pequeña de ribulosa-1,6bifosfato carboxilasa, promotor de beta-conglicinina, promotor de faseolina, promotores de glutenina de alto peso molecular (HMW-GS), promotores del gen biosintético de almidón, promotor de ADH, promotores de choque por calor y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener determinados elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficiencia de la transcripción. Los potenciadores típicos incluyen pero no están limitados a Adh-intrón 1 y Adh-intrón 6.

Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica continua en todos los tipos de células y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión génica en tipos de células o tejidos específicos, tales como las hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napin, ACP, globulina y semejantes) y estos promotores también pueden usarse. Los promotores también pueden ser activos durante un determinado estadio del desarrollo de la planta así como activo en tejidos y órganos de la planta. Los ejemplos de dichos promotores incluyen pero no están limitados a promotores específicos de polen, específicos de embrión, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de raíz, específicos de endosperma de semilla y semejantes.

En una realización particularmente preferida, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los que tiene lugar la biosíntesis de lípido y aceite, particularmente en células de semilla tales como células de endospermo y células del embrión en desarrollo. Los promotores que son adecuados son el promotor de gen napin de colza oleaginosa (US 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (Baumlein et al., 1991), el promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) o el promotor de legumina B4 (Baumlein et al., 1992), y promotores que dan lugar a la expresión específica de semilla en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y semejantes. Los promotores importantes que son adecuados son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordeina de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo, el gen de secalina de centeno). Otros promotores incluyen los descritos por Broun et al. (1998) y US 20030159173.

En determinadas circunstancias puede ser deseable usar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como: estímulos físicos (genes de

choque por calor); luz (RUBP carboxilasa); hormona (Em); metabolitos; y estrés. Pueden usarse otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas.

Además de promotores de plantas, pueden usarse promotores de varias fuentes eficientemente en células de planta para expresar genes extraños. Por ejemplo, pueden usarse los promotores de origen bacteriano, tal como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa; promotores de origen viral, tal como el virus de mosaico de coliflor (35S y 19S) y semejantes.

Será evidente que las plantas transgénicas adaptadas para la producción de LC-PUFA como se describe en la presente memoria, en particular DHA, pueden comerse directamente o usarse como una fuente para la extracción de ácidos grasos esenciales, de los que DHA sería un constituyente.

Tal y como se usa en la presente memoria, "germinación" se refiere a la emergencia de la punta de la raíz de la cubierta de la semilla después de imbibición. "Velocidad de germinación" se refiere al porcentaje de semillas en una población que han germinado en un periodo de tiempo, por ejemplo 7 ó 10 días, después de la imbibición. Una población de semillas puede evaluarse diariamente durante varios días para determinar el porcentaje de germinación con el tiempo.

Respecto a las semillas de la presente invención, tal y como se usa en la presente memoria el término "velocidad de germinación que es sustancialmente la misma" significa que la velocidad de germinación de las semillas transgénicas es al menos 60 %, más preferiblemente al menos 80 %, e incluso más preferiblemente al menos 90 %, la de las semillas isogénicas no transgénicas. Las velocidades de germinación pueden calcularse usando técnicas conocidas en la técnica.

Respecto adicionalmente a las semillas de la presente invención, tal y como se usa en la presente memoria el término "esquema de tiempo de germinación de la semilla es sustancialmente el mismo" significa que el esquema de tiempo de germinación de las semillas transgénicas es al menos 60 %, más preferiblemente al menos 80 %, e incluso más preferiblemente al menos 90 %, el de las semillas isogénicas no transgénicas. El esquema de tiempo de germinación puede calcularse usando técnicas conocidas en la técnica.

Los presentes inventores han descubierto que al menos en algunas circunstancias la producción de LC-PUFA en células de planta recombinantes se aumenta cuando las células son homocigotas para el transgén. Como resultado, se prefiere que la célula vegetal recombinante, preferiblemente la planta transgénica, sea homocigota para al menos un gen de desaturasa y/o elongasa. En una realización, las células/planta son homocigotas para la �6/�5 desaturasa del pez cebra y/o la elongasa de C. elegans.

Productos alimenticios

La presente invención incluye composiciones que pueden usarse como productos alimenticios. Para los propósitos de la presente invención, "productos alimenticios " incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano

o animal (incluyendo para consumo entérico y/o parenteral) que cuando se introduce en el cuerpo (a) sirven para nutrir o construir tejidos o suministran energía; y/o (b) mantienen, restauran o soportan un estado nutricional o función metabólica adecuada. Los productos alimenticios de la invención incluyen composiciones nutricionales para bebés y/o niños pequeños.

Los productos alimenticios de la invención comprenden, una célula de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, o una composición junto con un o unos vehículos adecuados. El término "vehículo" se usa en su sentido más amplio para englobar cualquier componente que puede tener o no valor nutricional. Como apreciará el experto en la técnica, el vehículo debe ser adecuado para uso (o usarse en una concentración suficientemente baja) en un producto alimenticio tal que no tenga efecto perjudicial en un organismo que consume el producto alimenticio.

La composición puede estar bien en forma sólida o líquida. Además, la composición puede incluir macronutrientes, vitaminas, y/o minerales comestibles en cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de estos ingredientes variará dependiendo de si la composición se pretende para uso con individuos normales o para uso con individuos que tienen necesidades especiales, tales como individuos que padecen trastornos metabólicos y semejantes.

Los ejemplos de vehículos adecuados con valor nutricional incluyen, pero no están limitados a, macronutrientes tales como grasas, carbohidratos y proteínas comestibles. Los ejemplos de dichas grasas comestibles incluyen, pero no están limitadas a, aceite de coco, aceite de borraja, aceite fúngico, aceite de grosella negra, aceite de soja, y monoy diglicéridos. Los ejemplos de dichos carbohidratos incluyen (pero no están limitados a): glucosa, lactosa comestible, y almidón hidrolizado. Además, los ejemplos de proteínas que pueden utilizarse en la composición nutricional de la invención incluyen (pero no están limitadas a) proteínas de soja, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de la leche, o los hidrolizados de estas proteínas.

Respecto a vitaminas y minerales, puede añadirse lo siguiente a las composiciones de productos alimenticios de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, selenio, yodo, y Vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. También pueden añadirse otras de estas vitaminas y minerales.

Los componentes utilizados en las composiciones de productos alimenticios de la presente invención pueden ser de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se quiere decir un material que se ha preparado por purificación de un material natural o por síntesis de novo.

Una composición de productos alimenticios de la presente invención también puede añadirse a alimento incluso cuando no se requiere la suplementación de la dieta. Por ejemplo, la composición puede añadirse a alimento de cualquier tipo, incluyendo (pero no limitado a): margarina, mantequilla modificada, quesos, leche yogurt, chocolate, caramelos, aperitivos, aceites de ensalada, aceites de cocinar, grasas de cocina, carnes, pescado y bebidas.

Además, el LC-PUFA producido según la presente invención o las células huésped transformadas para contener y expresar los genes objeto también pueden usarse como suplementos de alimento para animales para alterar la composición de ácidos grasos de los tejidos o leche del animal a una más deseable para el consumo humano o animal. Los ejemplos de dichos animales incluyen ovejas, ganado, caballos y semejantes.

Además, los productos alimenticios de la invención pueden usarse en acuicultura para incrementar los niveles de LC-PUFA en peces para consumo humano o animal.

En mamíferos, la denominada ruta "Sprecher" convierte DPA en DHA por tres reacciones, independiente de una �7 elongasa, �4 desaturasa, y una etapa de beta-oxidación (Sprecher et al., 1995) (Figura 1). Así, en productos alimenticios para consumo por mamíferos, por ejemplo formulaciones para el consumo por niños humanos, puede ser sólo necesario proporcionar DPA producido usando los métodos de la invención ya que el sujeto mamífero será capaz de cubrir sus necesidades nutricionales para DHA usando la ruta "Sprecher" para convertir DPA en DHA. Como resultado, en una realización de la presente invención, un producto alimenticio descrito en la presente memoria para consumo por mamíferos al menos comprende DPA, en el que al menos una reacción enzimática en la producción de DPA se realizó por una enzima recombinante en una célula.

Composiciones

La presente invención también engloba composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas, que comprenden la planta transgénica de la invención, o la parte de planta de la invención, o la semilla de la invención, que comprende LC-PUFA, en el que dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, y un vehículo adecuado.

Dicha composición farmacéutica puede comprender un vehículo, adyuvante o transportador estándar, muy conocido, no tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como una emulsión agua/aceite. La composición puede estar bien en forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un comprimido, cápsula, líquido o polvo ingerible, inyectable, o pomada o crema tópica. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, y semejantes. Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saporíferos y agentes perfumantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden comprender agentes de suspensión tales como isostearil alcoholes etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y goma de tragacanto o mezclas de estas sustancias.

Las formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas pueden prepararse usando técnicas muy conocidas en la técnica, por ejemplo, formación de comprimidos con bases de comprimidos convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes disgregantes tales como almidón de patata o ácido algínico, y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las cápsulas pueden prepararse incorporando estos excipientes en una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el o los LC-PUFA relevantes.

Para administración intravenosa, pueden usarse formulaciones comerciales.

Una dosificación típica de un ácido graso particular es de 0,1 mg a 20 g, tomados de una a cinco veces al día (hasta 100 g diariamente) y está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1, 2, 5, ó 10 g diariamente (tomados en una o múltiples dosis). Como se conoce en la técnica, es deseable un mínimo de aproximadamente 300 mg/día de LC-PUFA. Sin embargo, se apreciará que cualquier cantidad de LC-PUFA será beneficiosa para el sujeto.

Las rutas posibles de administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, por ejemplo, entérica (por ejemplo, oral y rectal) y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida puede administrarse

oralmente o rectalmente. Además, una mezcla homógenea puede dispersarse completamente en agua, mezclarse en condiciones estériles con diluyentes, conservantes, tampones o propelentes fisiológicamente aceptables para formar un pulverizador o inhalante.

La dosificación de la composición que se va a administrar al paciente puede determinarla un experto en la técnica y depende de varios factores tales como el peso del paciente, edad del paciente, salud global del paciente, historial pasado del paciente, estado inmune del paciente, etc.

Además, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para propósitos cosméticos. Puede añadirse a composiciones cosméticas pre-existentes de manera que se forma una mezcla o puede usarse una célula producida según la invención objeto como el único ingrediente "activo" en una composición cosmética.

Usos Médicos, Veterinarios, Agrícolas y en Acuicultura

La presente invención también incluye el tratamiento de varios trastornos por el uso de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria. En particular, las composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar restenosis después de angioplastia. Además, los síntomas de inflamación, artritis reumatoide, asma y psoriasis también pueden tratarse con las composiciones (incluyendo productos alimenticios) de la invención. La evidencia también indica que LC-PUFA puede estar implicado en el metabolismo del calcio; así, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de piedras renales o en el tracto urinario.

Además, las composiciones de la presente invención también pueden usarse en el tratamiento del cáncer. Se ha mostrado que las células malignas tienen composiciones alteradas de ácidos grasos. Se ha mostrado que la adición de ácidos grasos ralentiza su crecimiento, causa la muerte celular e incrementa su susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos. Además, las composiciones de la presente invención también pueden ser útiles para tratar la caquexia asociada con el cáncer.

Las composiciones de la presente invención también pueden usarse para tratar diabetes ya que se ha demostrado un metabolismo y composición alterados de ácidos grasos en animales diabéticos.

Además, las composiciones de la presente invención, que comprenden LC-PUFA producido bien directamente o indirectamente a través del uso de las células de la invención, también pueden usarse en el tratamiento de eccema y en la reducción de la presión sanguínea. Además, las composiciones de la presente invención pueden usarse para inhibir la agregación plaquetaria, para inducir vasodilatación, para reducir los niveles de colesterol, para inhibir la proliferación de tejido de músculo liso y fibroso en la pared de los vasos, para reducir o para prevenir la hemorragia gastrointestinal y otros efectos secundarios de los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (US 4.666.701), para prevenir o para tratar endometriosis y síndrome premenstrual (US 4.758.592), y para tratar encefalomielitis miálgica y fatiga crónica después de infecciones virales (US 5.116.871).

Los usos adicionales de las composiciones de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, uso en el tratamiento o prevención de arritmias cardiacas, angioplastia, SIDA, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, esquizofrenia, síndrome de alcohol fetal, trastorno de déficit de atención con hiperactividad, fibrosis quística, fenilcetonuria, depresión unipolar, hostilidad agresiva, adrenoleucodistrofia, enfermedad cardiaca coronaria, hipertensión, obesidad, enfermedad de Alzheimer, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa o una enfermedad ocular, así como para el mantenimiento de la salud general.

Además, las composiciones farmacéuticas y nutricionales descritas anteriormente pueden utilizarse en conexión con animales (es decir, domésticos o no domésticos, incluyendo mamíferos, pájaros, reptiles, lagartos, etc.), así como seres humanos, ya que los animales experimentan muchas de las mismas necesidades y afecciones de los seres humanos. Por ejemplo, el aceite o ácidos grasos de la presente invención pueden utilizarse en suplementos de alimentos de animales, sustitutos de alimentos de animales, vitaminas para animales o en pomadas tópicas para animales.

Las composiciones tales como productos alimenticios de la invención también pueden usarse en acuicultura para incrementar los niveles de LC-PUFA en peces para consumo humano o animal.

Cualquier cantidad de LC-PUFA será beneficiosa para el sujeto. Sin embargo, se prefiere que se administre al sujeto una "cantidad efectiva para tratar" la afección de interés. Dichas dosificaciones para tratar efectivamente una afección que se beneficiaría de la administración de un LC-PUFA son conocidas para los expertos en la técnica. Como un ejemplo, una dosis de al menos 300 mg/día de LC-PUFA durante al menos unas pocas semanas, más preferiblemente más tiempo sería adecuada en muchas circunstancias.

Anticuerpos

También se describen en la presente memoria anticuerpos monoclonales y/o policlonales que se unen específicamente al menos a un polipéptido de la invención o un fragmento de éste. Así, la presente invención

describe además un proceso para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales frente a polipéptidos descritos en la presente memoria.

El término "se une específicamente" se refiere a la capacidad del anticuerpo se unirse al menos a una proteína pero no a otras proteínas presentes en una célula recombinante, particularmente una célula vegetal recombinante, de la invención.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a una región de una proteína de la invención a la que se une el anticuerpo. Un epítopo puede administrarse a un animal para generar anticuerpos frente al epítopo, sin embargo, los anticuerpos descritos en la presente memoria preferiblemente se unen específicamente a la región del epítopo en el contexto de la proteína completa.

Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico. El suero del animal inmunizado se recoge y trata según procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales contiene anticuerpos frente a otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse por cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales son conocidas en la técnica. Con el fin de que puedan prepararse dichos anticuerpos, también se describen polipéptidos o fragmentos de éstos haptenizados con otro polipéptido para uso como inmunógenos en animales o seres humanos.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a polipéptidos también pueden ser producidos fácilmente por un experto en la técnica. La metodología general para preparar anticuerpos monoclonales por hibridomas es muy conocida. Pueden crearse líneas celulares productoras de anticuerpos inmortales por fusión celular, y también por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos pueden cribarse para varias propiedades; es decir, para isotipo y afinidad de epítopo.

Una técnica alternativa implica el cribado de bibliotecas de exposición en fago en la que, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una gran variedad de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Esta técnica es muy conocida en la técnica.

Para los propósitos de esta invención, el término "anticuerpo", a no ser que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que retienen su actividad de unión para un antígeno diana. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2 , así como anticuerpos de cadena única (scFv). Además, los anticuerpos y fragmentos de éstos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, como se describe en EP-A-239400.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden unirse a un soporte sólido y/o empaquetarse en kits en un contenedor adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones adecuados y semejantes.

Preferiblemente, los anticuerpos descritos en la presente memoria se marcan de manera detectable. Los marcajes detectables a modo de ejemplo que permiten la medida directa de la unión del anticuerpo incluyen radiomarcadores, fluoróforos, agentes de tinción, lechos magnéticos, agentes quimioluminiscentes, partículas coloidales, y semejantes. Los ejemplos de marcadores que permiten la medida indirecta de la unión incluyen enzimas en el que el sustrato puede proporcionar un producto coloreado o fluorescente. Los marcadores detectables a modo de ejemplo adicionales incluyen enzimas unidas covalentemente capaces de proporcionar una señal de producto detectable después de la adición del sustrato adecuado. Los ejemplos de enzimas adecuadas para uso en conjugados incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, malato deshidrogenasa y semejantes. Cuando no están disponibles comercialmente, dichos conjugados anticuerpo-enzima se producen fácilmente por técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Los marcadores detectables a modo de ejemplo adicionales incluyen biotina, que se une con alta afinidad a avidina o estreptavidina; fluorocromos (por ejemplo, ficobiliproteínas, ficoeritrina y aloficocianinas; fluoresceína y rojo Texas), que pueden usarse con un separador celular activado por fluorescencia; haptenos; y semejantes. Preferiblemente, el marcador detectable permite la medida directa en un luminómetro de placa, por ejemplo, biotina. Dichos anticuerpos marcados pueden usarse en técnicas conocidas en la técnica para detectar proteínas de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y Métodos

Cultivo de Pavlova salina

Los aislados de Pavlova salina incluyendo la cepa CS-49 de CSIRO Collection of Living Microalgae se cultivaron en condiciones de cultivo estándar (http://www.marine.csiro.au/microalgae). Un cultivo madre de la Colección se subcultivó y se aumentó de escala en una dilución de 1 en 10 durante transferencias consecutivas en matraces Erlenmeyer de 1 L en 10 L de bidones de policarbonato. El medio de cultivo fue f/2, una modificación del medio f de Guillard y Ryther (1962) que contenía nutrientes con mitad de contenido, con una temperatura de crecimiento de 20±1 °C. Otras condiciones de cultivo incluyeron una intensidad de luz de 100 µmoles. fotones PAR.m-2 .s -1 , fotoperiodo de 12:12 horas luz:oscuridad, y burbujeo con 1 % CO2 en aire a una velocidad de 200 mL.L-1.min-.

Cultivo de levaduras y alimentación con ácidos grasos precursores

Se introdujeron plásmidos en levaduras por choque de calor y los transformantes se seleccionaron en placas con medio mínimo de levadura (YMM) que contenían 2 % rafinosa como la única fuente de carbono. Se establecieron cultivos de inóculo clonales en YMM líquido con 2 % rafinosa como la única fuente de carbono. Los cultivos experimentales se inocularon a partir de éstos, en YMM + 1 % NP-40, hasta una DO600 inicial de ~ 0,3. Los cultivos se crecieron a 30 °C con agitación (~ 60 rpm) hasta que la DO600 fue aproximadamente 1,0. En este punto se añadió galactosa hasta una concentración final de 2 % y se añadieron ácidos grasos precursores a una concentración final de 0,5mM. Los cultivos se incubaron a 20 °C con agitación durante 48 horas más antes de recoger por centrifugación. Los sedimentos celulares se lavaron con 1 % NP-40, 0,5 % NP-40 y agua para eliminar todos los ácidos grasos no incorporados de la superficie de las células.

Análisis por cromatografía de gases (GC) de ácidos grasos

Preparación de los ácidos grasos

Se formaron ésteres metilo de ácido graso (FAME) por transesterificación del sedimento de levadura centrifugado o semillas de Arabidopsis calentando con MeOH-CHCl3-HCl (10:1:1, v/v/v) a 90-100 °C durante 2 h en un tubo de ensayo de vidrio equipado con una tapa de rosca revestida con Teflón. Se extrajeron los FAME en hexanodiclorometano (4:1, v/v) y se analizaron por GC y GC-MS.

Cromatografía capilar gas-líquido (GC)

Se analizaron los FAME con cromatógrafo de gas Hewlett Packard (HP) 5890 GC o Agilent 6890 equipado con inyectores automáticos en serie HP 7673A ó 6980 respectivamente y un detector de ionización por llama (FID). Las temperaturas del inyector y detector fueron 290 °C y 310 °C respectivamente. Las muestras de FAME se inyectaron a 50 °C en una columna capilar de sílice fusionada con metil silicona entrecruzada no polar (HP-5; 50 m x 0,32 mm d.i.; 0,17 µm de espesor de película.). Después de 1 min, la temperatura del horno se elevó hasta 210 °C a 30 °C min-1, después hasta una temperatura final de 280 °C a 3 °C min-1 donde se mantuvo durante 5 min. El helio fue el gas vehicular con una presión en la cabeza de la columna de 65 KPa y la purga abierta 2 min después de la inyección. La identificación de los picos se basó en la comparación de los datos de tiempo de retención relativo con FAME estándar con confirmación usando espectrometría de masas. Para la cuantificación se usó software Empower (Waters) o Chemstation (Agilent) para integrar las áreas de los picos.

Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)

GC-MS se llevó a cabo en una trampa de iones Finnigan GCQ Plus GC-MS equipada con inyección en columna ajustada a 4 °C. Las muestras se inyectaron usando un auto muestreador AS2000 en un hueco de retención unido a una columna de fase ligada HP-5 Ultra 2 (50 m x 0,32 mm d.i. x 0,17 µm espesor de la película). La temperatura inicial de 45 °C se mantuvo durante 1 min, seguido de programa de temperatura a 30 °C.min-1 hasta 140 °C, después a 3 °C.min-1 hasta 310 °C donde se mantuvo durante 12 min. Se usó helio como el gas vehicular. Las condiciones de operación del espectrómetro de masas fueron: energía de impacto de electrones 70 eV; corriente de emisión 250 µamp, línea de transferencia 310 °C; temperatura de la fuente 240 °C; velocidad de escaneo 0,8 escaneos.s -1 e intervalo de masa 40-650 Dalton. Los espectros de masas se adquirieron y procesaron con software Xcalibur™.

Construcción de la biblioteca de ADNc de P. salina

El ARNm, para la construcción de una biblioteca de ADNc, se aisló de células de P. salina usando el método siguiente. Se convirtieron en polvo 2 g (peso húmedo) de células de P. salina usando un mortero y pilón en nitrógeno líquido y se esparció lentamente en un vaso de precipitados que contenía 22 ml de tampón de extracción que se agitaba constantemente. A esto, se añadieron 5 % polivinilpirrolidona insoluble, 90mM 2-mercaptoetanol, y 10mM ditioteitol y la mezcla se agitó durante 10 minutos más antes de ser transferida a un tubo Corex™. Se añadieron 18,4 ml de 3M acetato de amonio y se mezcló bien. La muestra se centrifugó a 6.000xg durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y el ácido nucleico se precipitó por la adición de 0,1 volumen de 3M NaAc (pH 5,2) y 0,5 volúmenes de isopropanol frío. Después de 1 hora de incubación a -20 °C, la muestra se centrifugó a 6.000xg durante 30 minutos en un rotor oscilante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de agua y se extrajo con fenol/cloroformo. La capa acuosa se transfirió a un tubo nuevo y los ácidos nucleicos se precipitaron otra vez por la adición de 0,1 volumen 3M NaAc (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol enfriado en hielo. El sedimento se resuspendió en agua, se determinó la concentración de ácido nucleico y el ARNm se aisló usando el sistema Oligotex mRNA (Qiagen).

Se sintetizó ADNc de primera cadena usando un cebador oligo-dT suministrado por el kit de síntesis ZAP-cDNA (Stratagene -cat # 200400) y la transcriptasa inversa SuperscriptIII (Invitrogen). El ADNc de doble cadena se ligó a adaptadores EcoRI/XhoI y a partir de esto se construyó una biblioteca usando el kit de síntesis ZAP-cDNA como se describe en el manual de instrucciones adjunto (Stratagene -cat # 200400). La titulación de la biblioteca primaria fue 2,5 x 105 unidades formadoras de placa (pfu)/ ml y la de la biblioteca amplificada fue 2,5 x 109 pfu/ ml. El tamaño

medio del inserto de los insertos de ADNc en la biblioteca fue 1,3 kilobases y el porcentaje de recombinantes en la biblioteca fue 74 %.

Ejemplo 2. Microalgas y Contenidos de Ácido Graso Poliinsaturado de Éstas

Colección CSIRO de Microalgas Vivas

CSIRO estableció y mantuvo una Colección de Microalgas Vivas (CLM) que contiene más de 800 cepas de 140 géneros que representan la mayor parte de las clases de microalgas marinas y algunas de agua dulce (lista de cepas con descarga disponible en http://www.marine.csiro.au). También se mantuvieron cepas micro-heterotróficas seleccionadas.

Esta colección es la colección de cultivo de microalgas mayor y más diversa en Australia. El CLM se centró en aislados de aguas australianas -más del 80 % de las cepas se aislaron de diversas localidades y zonas climáticas, del norte de Australia tropical hasta el Territorio Antártico Australiano, de medioambientes oceánicos, costeros, de estuario, intermarea y de agua dulce. Además, se ha puesto énfasis en la representación de diferentes poblaciones de una única especie, habitualmente por más de una cepa. Todas las cepas en la colección de cultivo fueron unialgal y la mayor parte fueron clonales. Un subconjunto de cepas fue axénico. Otra colección es la Colección NIES (National Institute for Environmental Studies, Environment Agency) mantenida en Japón.

Se sabe que las microalgas son cosmopolitas a nivel de especie morfológico, habiéndose mostrado una endemicidad muy baja. Sin embargo, este cosmopolitanismo morfológico puede ocultar una plétora de diversidad a nivel intra-específico. Ha habido varios estudios de diversidad genética en diferentes microalgas usando estrategias tales como intercruzamiento, isozimas, velocidades de crecimiento y un rango de técnicas moleculares. La diversidad identificada por estos estudios varía de escalas regionales y globales amplias (Chinain et al., 1997) hasta entre y en las poblaciones (Gallagher, 1980; Medlin et al., 1996; Bolch et al., 1999a,b). La variación a nivel intraespecífico, entre microalgas indistinguibles morfológicamente, habitualmente sólo puede identificarse usando cepas aisladas del medioambiente y cultivadas en el laboratorio.

Es esencial tener genotipos identificables y estables en colecciones de cultivos. Aunque hay casos registrados de cambio o pérdida de características particulares en cultivos a largo plazo (Coleman, 1977), en general, el cultivo garantiza la continuidad y estabilidad genética de una cepa particular. Las estrategias de criopreservación también podrían usarse para limitar el potencial de deriva genética.

Microalgas y su uso en acuicultura

Debido a su composición química/nutricional incluyendo PUFA, las microalgas se utilizan en acuicultura como alimentos vivos para varios organismos marinos. Dichas microalgas deben tener un tamaño apropiado para la ingestión y deben digerirse fácilmente. Deben tener velocidades de crecimiento rápidas, ser susceptibles de cultivo en masa, y también ser estables en cultivo frente a fluctuaciones en temperatura, luz y nutrientes como puede ocurrir en sistemas de criadero. Las cepas que cumplen con estos atributos y que se usan ampliamente en acuicultura incluyen cepas del hemisferio norte tales como Isochrysis sp. (T.ISO) CS-177, Pavlova lutheri CS-182, Chaetoceros calcitrans CS-178, C. muelleri CS-176, Skeletonema costatum CS-181, Thalassiosira pseudonana CS-173, Tetraselmis suecica CS-187 y Nannochloropsis oculata CS-189. Las cepas australianas usadas incluyen Pavlova pinguis CS-375, Skeletonema sp. CS-252, Nannochloropsis sp. CS-246, Rhodomonas salina CS-24 y Navicula jeffreyi CS-46. La evaluación bioquímica de más de 50 cepas de microalgas usadas (o con uso potencial) en acuicultura descubrió que las células crecidas hasta la fase de crecimiento logarítmica tardía contenían normalmente 30 a 40 % proteína, 10 a 20 % lípido y 5 a 15 % carbohidrato (Brown et al., 1997).

Composición de lípidos incluyendo contenido de PUFA de microalgas

Existe un interés considerable en microalgas que contienen un alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) nutricionalmente importantes, en particular EPA [ácido eicosapentaenoico, 20:5(ω3)] y DHA [ácido docosahexaenoico, 22:6(ω3)] ya que éstos son esenciales para la salud tanto de los seres humanos como de animales en acuicultura. Aunque estos PUFA están disponibles de aceites de pescado, las microalgas son los productores primarios de EPA y DHA.

Se hizo un perfil de la composición de lípidos de un rango de microalgas (46 cepas) y particularmente la proporción y contenido de PUFA importantes en los lípidos de microalgas. La composición de PUFA C18-C22 de las cepas de microalgas de diferentes clases de algas varió considerablemente a lo largo del rango de clases de algas fototróficas (Tabla 3, Figura 2, véase también Dunstan et. al., 1994, Volkman et al., 1989; Mansour et al., 1999a). Las diatomeas y eustigmatofitos eran ricos en EPA y produjeron pequeñas cantidades del PUFA menos común, ARA [ácido araquidónico, 20:4(ω6)] con cantidades despreciables de DHA. Además, las diatomeas fabricaron C16 PUFA inusuales tales como 16:4(ω1) y 16:3(ω4). Por el contrario, los dinoflagelados tuvieron concentraciones altas de DHA y proporciones moderadas a altas de EPA y PUFA C18 precursor [18:5(ω3) y 18:4(ω3) SDA, ácido estearidónico]. Los primnesiofitos también contenían EPA y DHA, siendo EPA el PUFA dominante. Los criptomonadas fueron una fuente rica en el PUFA C18 18:3(ω3) (ALA ácido α-linolénico) y SDA, así como EPA y DHA. Las algas verdes (por ejemplo, Clorofitos tales como Dunaliella spp. y Chlorella spp.) fueron relativamente

deficientes en ambos PUFA C20 y C22, aunque algunas especies tuvieron cantidades pequeñas de EPA (hasta 3 %) y normalmente contenían ALA y 18:2(ω6) abundantes, y también fueron capaces de fabricar 16:4(ω3). La significancia bioquímica y nutricional de PUFA C16 no comunes [por ejemplo, 16:4(ω3), 16:4(ω1), 16:3(ω4)] y PUFA C18 (por ejemplo, 18:5(ω3) y STA] no está clara. Sin embargo, existe un interés actual en PUFA C18 tal como SDA que ahora se reconoce de manera creciente que son precursores de los EPA y DHA beneficiosos, a diferencia de ALA que sólo tiene una conversión limitada a EPA y DHA.

Se aislaron nuevas cepas de traustoquitridos australianos. Cuando se examinaron, estos traustoquitridos mostraron una gran diversidad morfológica desde células únicas a agrupaciones de células, formas reticuladas complejas y estadios móviles. Los truastoquitridos son un grupo de organismos de célula única que producen tanto un contenido alto de aceite como LC-PUFA. Se pensó inicialmente que eran hongos primitivos, aunque más recientemente se les ha asignado la subclase Thraustochytridae (Chromista, Heterokonta), que les alinea más de cerca con otras algas heterokontes (por ejemplo, diatomeas y algas marrones). En cultivo, los traustoquitridos pueden conseguir un rendimiento de biomasa considerablemente mayor (>20 g/L) que otras microalgas. Además, los traustoquitridos pueden crecerse en fermentadores con una fuente de carbono orgánica y, por lo tanto, representan una fuente altamente atractiva, renovable y sin contaminantes de aceites omega-3.

TABLA 3. Distribución de PUFA y LC-PUFA seleccionados en microalgas y otros grupos, y áreas de aplicación.

Grupo: Género / Especie PUFA Aplicación

Eustigmatofitos: Nannochloropsis EPA Acuicultura

Diatomeas: Chaetoceros

Dinoflagelados: Crypthecodinium cohnii DHA Acuicultura, suplementos

Traustoquitridos: Schizochytrium de salud, fórmula infantil

Algas rojas: Phorphyridium ARA Acuicultura, fórmula infantil

Traustoquitridos: especie no descrita Industria farmacéutica

Hongos: Mortiella (precursor de prostaglandinas)

Algas verde azuladas: Spirulina GLA suplementos de salud

Abreviaturas: ácido γ-linolénico, GLA, 18:3ω6; 20:5ω3, ácido eicosapentaenoico, EPA, 20:5ω3; ácido docosahexaenoico, DHA, 22:6ω3; ácido araquidónico, ARA, 20:4ω6.

Los perfiles de ácidos grasos representativos para traustoquitridos australianos seleccionados se muestran en la Tabla 4. La cepa O fue particularmente atractiva ya que contenía muy altos niveles de DHA (61 %). Otros PUFA estuvieron presentes a menos de 5 % cada uno. Los traustoquitridos que contenían alto DHA también contenían frecuentemente altas proporciones de 22:5ω6, ácido docosapentaenoico (DPA), como se observó para las cepas A, C y H. DPA sólo fue un componente menor en la cepa O en las condiciones de cultivo empleadas, haciendo que esta cepa sea particularmente interesante. La cepa A contenía tanto DHA (28 %) como EPA (16 %) como el LC-PUFA principal. Las cepas C y H se diferenciaron de las demás cepas estando también presente ARA (10-13 %) como un LC-PUFA principal. Varios de los demás LC-PUFA estaban presentes en los traustoquitridos incluyendo DPA(3) y 22:4ω6 y otros componentes.

TABLA 4. Composición de ácidos grasos (% del total) de cepas de traustoquitrido.

Ácido graso 16:0 20:4ω6 ARA: A 18,0 Composición en porcentaje Cepa C H 16,4 13,5 4,0 10,5 O 22,1 13,4 0,7

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Ácido graso: Composición en porcentaje

Cepa

A: C H O

20:5ω3 EPA: 15,8 7,7 5,2 4,1

22:5ω6 DPA(6): 16,6 9,3 12,7 3,4

22:6ω3 DHA: 28,2 21,6 19,2 61,0

Los aislados de microalgas y traustoquitrido en el CLM que pueden usarse para el aislamiento de genes implicados en la síntesis de LC-PUFA son de los géneros o especies comos sigue:

Clase Bacillariophyceae (Diatomeas)

Attheya septentrionalis, Aulacoseira sp., Chaetoceros affinis, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros calcitrans f. pumilum, Chaetoceros cf. mitra, Chaetoceros cf. peruvianus, Chaetoceros cf. radians, Chaetoceros didymus, Chaetoceros difficile, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros muelleri, Chaetoceros simplex, Chaetoceros socialis, Chaetoceros sp., Chaetoceros cf. minus, Chaetoceros cf. tenuissimus, Coscinodiscus wailesii, otras Coscinodiscus spp., Dactyliosolen fragilissimus, Detonula pumila, Ditylum brightwellii, Eucampia zodiacus, Extubocellulus spinifera, Lauderia annulata, Leptocylindrus danicus, Melosira moniliformis, Melosira sp., Minidiscus trioculatus, Minutocellus polymorphus, Odontella aurita, Odontella mobiliensis, Odontella regia, Odontella rhombus, Odontella sp., Papiliocellulus simplex, Planktosphaerium sp., Proboscia alata, Rhizosolenia imbricata, Rhizosolenia setigera, Rhizosolenia sp., Skeletonema costatum, Skeletonema pseudocostatum, Skeletonema sp., Skeletonema tropicum, otras Skeletonema spp., Stephanopyxis turris, Streptotheca sp., Streptotheca tamesis, Streptotheca spp., Striatella sp.,Thalassiosira delicatula, Thalassiosira eccentrica, Thalassiosira mediterranea, Thalassiosira oceanica, Thalassiosira oestrupii, Thalassiosira profunda, Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, Thalassiosira stellaris, otras Thalassiosira spp., Achnanthes cf. amoena, Amphiprora cf.alata, Amphiprora hyalina, Amphora spp., Asterionella glacialis, Asterionellopsis glacialis, Biddulphia sp., Cocconeis sp., Cylindrotheca closterium, Cylindrotheca fusiformis, Delphineis sp., Diploneis sp., Entomoneis sp., Fallacia carpentariae, Grammatophora oceanica, Haslea ostrearia, Licmophora sp., Manguinea sp., Navicula cf. jeffreyi, Navicula jeffreyi, otras Navicula spp., Nitzschia cf. bilobata, Nitzschia cf. constricta, Nitzschia cf. cylindrus , Nitzschia cf. frustulum, Nitzschia cf paleacea, Nitzschia closterium, Nitzschia fraudulenta, Nitzschia frustulum, Nitzschia sp., Phaeodactylum tricornutum, Pleurosigma delicatulum, otras Pleurosigma spp., Pseudonitzschia australis, Pseudonitzschia delicatissima, Pseudonitzschia fraudulenta, Pseudonitzschia pseudodelicatissima, Pseudonitzschia pungens, Pseudonitzschia sp., Pseudostaurosira shiloi, Thalassionema nitzschioides,o Thalassiothrix heteromorpha.

Clase Chrysophyceae

Chrysolepidomonas cf. marina, Hibberdia spp., Ochromonas danica, Pelagococcus subviridis, Phaeoplaca spp., Synura shagnicola u otras Chrysophyte spp.

Clase Cryptophyceae

Chroomonas placoidea, Chroomonas sp., Geminigera cryophila, Hemiselmis simplex, Hemiselmis sp., Rhodomonas baltica, Rhodomonas maculata, Rhodomonas salina, Rhodomonas sp. u otras Cryptomonad spp.

Clase Dinophyceae (Dinoflagelados)

Alexandrium affine, Alexandrium catenella, Alexandrium margalefi, Alexandrium minutum, Alexandrium protogonyaulax, Alexandrium tamarense, Amphidinium carterae, Amphidinium cf britannicum, Amphidinium klebsii, Amphidinium sp., Amphidinium steinii, Amylax tricantha, Cryptothecodinium cohnii, Ensiculifera sp., Fragilidium spp., Gambierdiscus toxicus, Gymnodinium catenatum, Gymnodinium galathaneum, Gymnodinium galatheanum, Gymnodinium nolleri, Gymnodinium sanguineum, u otras Gymnodinium spp., Gyrodinium pulchellum, u otras Gyrodinium spp., Heterocapsa niei, Heterocapsa rotundata, Katodinium cf. rotundatum, Kryptoperidinium foliaceum, Peridinium balticum, Prorocentrum gracile, Prorocentrum mexicanum, Prorocentrum micans, Protoceratium reticulatum, Pyrodinium bahamense, Scrippsiella cf. precaria, u otras Scrippsiella spp. Symbiodinium microadriaticum,o Woloszynskia sp.

Clase Euglenophyceae

Euglena gracilis.

Clase Prasinophyceae

Pycnococcus sp., Mantoniella squamata, Micromonas pusilla, Nephroselmis minuta, Nephroselmis pyriformes, Nephroselmis rotunda, Nephroselmis spp., u otras Prasinophyte spp., Pseudoscourfieldia marina, Pycnococcus provasolii, Pyramimonas cordata, Pyramimonas gelidicola, Pyramimonas grossii, Pyramimonas oltmansii, Pyramimonas propulsa, otras Pyramimonas spp., Tetraselmis antarctica, Tetraselmis chuii, Tetraselmis sp., Tetraselmis suecica, u otras Tetraselmis spp.

Clase Prymnesiophyceae

Chrysochromulina acantha, Chrysochromulina apheles, Chrysochromulina brevifilum, Chrysochromulina camella, Chrysochromulina hirta, Chrysochromulina kappa, Chrysochromulina minor, Chrysochromulina pienaar, Chrysochromulina simplex, Chrysochromulina sp., Chrysochromulina spinifera, Chrysochromulina strobilus, y otras Chrysophyte spp., Chrysotila lamellosa, Cricosphaera carterae, Crystallolithus hyalinus, Diacronema vlkianum, Dicrateria inornata, Dicrateria sp., Emiliania huxleyi, Gephyrocapsa oceanica, Imantonia rotunda, y otras Isochrysis spp., Ochrosphaera neapolitana, Pavlova cf. pinguis, Pavlova gyrans, Pavlova lutheri, Pavlova pinguis, Pavlova salina, Pavlova sp., Phaeocystis cf. pouchetii, Phaeocystis globosa, Phaeocystis pouchetii, otras Phaeocystis spp., Pleurochrysis aff. carterae, Prymnesium parvum, Prymnesium patelliferum, otras Prymnesium spp., o Pseudoisochrysis paradoxa.

Clase Raphidophyceae

Chattonella antiqua, otras Chattonella spp., Fibrocapsa japonica, otras Fibrocapsa spp., Heterosigma akashiwo, Heterosigma carterae, u otras Heterosigma spp.

Clase Thraustochytridae

Schizochytrium spp., Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum, u otras Thraustochytrium spp.

Clase Eustigmatophytae como una fuente de genes para la producción de EPA:

Eustigmatos vischeri, Monodus subterraneus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Vischeria helvetica, Vischeria punctata, Chloridella neglecta, Chloridella simplex, Chlorobotrys regularis, Ellipsoidon parvum, Ellipsoidon solitare, Eustigmatos magnus, Eustigmatos polyphem, Goniochloris sculpta, Monodus subterraneus, Monodus unipapilla, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis granulata, Nannochloropsis limnetica, Pseudocharaciopsis, ovalis, Pseudocharaciopsis texensis, Pseudostaurastrum limneticum,o Vischeria stellata

Ejemplo 3. Aislamiento de �5/6 Desaturasa de Pez Cebra y Caracterización Funcional en Levaduras

Al igual que las microalgas, algunos otros organismos tienen la capacidad de sintetizar LC-PUFA a partir de precursores tales como ácido α-linolénico (18:3, ALA) (véase la Figura 1) y algunos de los genes responsables para dicha síntesis se han aislado (véase Sayanova y Napier, 2004). Los genes implicados en la biosíntesis de omega-3 C20+PUFA se han clonado de varios organismos incluyendo algas, hongos, musgos, plantas, nematodos y mamíferos. Tomando como base la comprensión actual de los genes implicados en la síntesis de omega-3 C20 +PUFA, la síntesis de EPA en plantas requeriría la transferencia de genes que codifican al menos dos desaturasas y una PUFA elongasa. La síntesis de DHA a partir de EPA en plantas requeriría la transferencia adicional de una desaturasa más y una elongasa más (Sayanova y Napier, 2004). Estas enzimas son: para la síntesis de EPA, se requieren las actividades secuenciales de una �6 desaturasa, �6 elongasa y una �5 desaturasa. Tomando como base una ruta alternativa operativa en algunas algas, EPA también puede sintetizarse por las actividades secuenciales de una �9 elongasa, una �8 desaturasa y una �5 desaturasa (Wallis y Browse, 1999; Qi et al., 2002). Para la conversión adicional de EPA en DHA en plantas, se requerirá una transferencia adicional de una �5 elongasa y �4 desaturasa (Sayanova y Napier, 2004).

Hastings et al. (2001) aislaron un gen que codifica una �5/�6 desaturasa bifuncional de pez cebra (Danio rerio)y mostraron que, cuando se expresa en levaduras, la desaturasa fue capaz de catalizar la síntesis tanto de ácidos grasos �6 (GLA y SDA) como �5 (20:4 y EPA). La desaturasa fue por lo tanto capaz de actuar en ambos sustratos ω6y ω3.

Aislamiento de la �5/�6 desaturasa de pez cebra

Se extrajo ARN usando el sistema RNAeasy según las instrucciones de los fabricantes (Qiagen) a partir de hígados recién diseccionados de pez cebra. Tomando como base la secuencia publicada (Hastings et al. 2001), se diseñaron cebadores, con sentido, 5'-CCCAAGCTTACTATGGGTGGCGGAGGACAGC-3' (SEQ ID NO:39) y antisentido 5'-CCGCTGGAGTTATTTGTTGAGATACGC-3' (SEQ ID NO:40) en los extremos 5' y 3' del �5/6 ORF de pez cebra y se usaron en una PCR de transcripción inversa en una etapa (RT-PCR, Promega) con el ARN extraído y usando condiciones de tampón como recomienda el fabricante. Se obtuvo un único amplicón con un tamaño de 1.335pb, se ligó en pGEM-T easy (Promega) y la secuencia se confirmó como idéntica a la publicada.

Se escindió un fragmento que contiene la región codificadora completa (SEQ ID NO:38) y se ligó en el vector lanzadera de levaduras pYES2 (Invitrogen). El vector pYES2 portaba el gen URA3, que permitió la selección para los transformantes de levadura tomando como base la prototrofía de uracilo. La región codificadora insertada estaba bajo el control del promotor inducible GAL1 y señal de poliadenilación de pYES2. El plásmido resultante se designó pYES2-zf�5/6, para la introducción y expresión en levaduras (Saccharomyces cerevisiae).

Expresión de �5/�6 desaturasa de pez cebra en levaduras

La construcción génica pYES2-zf�5/6 se introdujo en la cepa de levaduras S288. La levadura fue un buen huésped para analizar el potencial heterólogo de los genes de la biosíntesis de LC-PUFA incluyendo desaturasas y elongasas por varias razones. Se transformó fácilmente. No sintetizaba ningún LC-PUFA por sí misma y, por lo tanto, cualquier PUFA nuevo fabricado era fácilmente detectable sin problemas de fondo. Además, las células de levadura incorporaban fácilmente ácidos grasos del medio de crecimiento en lípidos celulares, permitiendo de esta manera la presentación de los precursores apropiados a las células transformadas que contenían los genes que codificaban las nuevas enzimas, permitiendo la confirmación de sus actividades enzimáticas.

Análisis bioquímicos

Las células de levadura transformadas con pYES2-zf�5/6 se crecieron en medio YMM y se indujeron por la adición de galactosa. Los ácidos grasos 18:3ω3 (ALA, 0,5 mM) ó 20:4ω3 (ETA, 0,5 mM) se añadieron al medio como se ha descrito anteriormente. Después de 48 horas de incubación, las células se recogieron y los análisis se ácidos grasos se realizaron por cromatografía gas-líquida (GC) capilar como se describe en el Ejemplo 1. El análisis mostró que 18:4ω3 (1,9 % de ácido graso total) se formó a partir de 18:3ω3 y 20:5ω3 (0,24 % de ácidos grasos) a partir de 20:4ω3, demostrando actividad �6 desaturasa y actividad �5 desaturasa, respectivamente. Estos datos se resumen en la Tabla 5 y confirman los resultados de Hastings et al (2001).

Ejemplo 4. Aislamiento de Elongasa de C. elegans y Caracterización Funcional en Levaduras

Clonación del gen de elongasa de C. elegans

Beaudoin et al., aislaron un gen que codifica una elongasa de ácidos graso de tipo ELO del nematodo Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al., 2000) y este gen se aisló como sigue. Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos que tenían las secuencias 5'-GCGGGTACCATGGCTCAGCATCCGCTC-3' (SEQ ID NO:41) (orientación con sentido) y 5'-GCGGGATCCTTAGTTGTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO:42) (orientación antisentido) y se sintetizaron, tomando como base los extremos 5' y 3' de la región codificadora de la elongasa. Estos cebadores se usaron en una reacción de PCR para amplificar la región codificadora de 867 pares de bases de una biblioteca de genes de estadio mixto de C.elegans N2, usando una temperatura de hibridación de 58 °C y un tiempo de extensión de 1 minuto. La amplificación por PCR se realizó durante 30 ciclos. El producto de la amplificación se insertó en el vector pGEM™ T-easy (Promega) y se confirmó la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:37). Un fragmento EcoRI/BamHI incluyendo la región codificadora completa se escindió e insertó en los sitios EcoRI/BglII de pSEC-TRP (Stratagene), generando pSEC-Ceelo, para la introducción y expresión en levaduras. pSEC-TRP contiene el gen TRP1, que permitió la selección de transformantes en levaduras por prototrofía de triptófano, y el promotor GAL1 para la expresión del gen quimérico de una manera inducible en presencia de galactosa en el medio de crecimiento.

TABLA 5. Actividades enzimáticas en levaduras y Arabidopsis

Clon: PUFA Precursor PUFA Sintetizado % (de Actividad observada

FA total)

pYES2-zf�5/6: 18:3ω3 18:4ω3 1,9 �6 desaturasa

pYES2-zf�5/6: 20:4ω3 20:5ω3 0,24 �5 desaturasa

pYES2zf�5/6, pSEC-Ceelo 18:3ω3: 18:4ω3 0,82 �6 desaturasa

20:3□ω3: 0,20 �9 elongasa

20:4□ω3: 0,02 �6 elongasa

NO

41

Clon pYES2-ps�8 pYES2-ps�8: PUFA Precursor PUFA Sintetizado 18:3ω3 18:4ω3 20:3ω3 20:4ω3 % (de FA total) -0,12 Actividad observada �6 desaturasa �8 desaturasa

pYES2-psELO1 pYES2-psELO1 pYES2-psELO1 pYES2-psELO1 pYES2-psELO1: 18:2ω6 18:3ω3 20:3ω3 20:4ω3 20:5ω3 20:2ω6 22:3ω3 22:4ω3 22:5ω3 ----0,82 �5 elongasa

pYES-psELO2 pYES-psELO2 pYES-psELO2 pYES-psELO2 pYES-psELO2: 18:2ω6 18:3ω3 20:3ω3 20:4ω3 20:5ω3 20:2ω6 20:3ω3 22:3ω3 22:4ω3 22:5ω3 0,12 0,20 --- �9 elongasa �9 elongasa

Arabidopsis + zf�5/6 -y Ceelo -(planta #1) --------TR, traza, no determinado con exactitud.: 18:3ω6 18:4ω3 20:4ω6 20:5ω3 20:3ω6 20:4ω3 20:2ω6 20:3ω3 22:4ω6 22:5ω3 22:3ω6 0,32 1,1 1,1 2,1 1,1 0,40 3,2 TR 0,06 0,13 0,03 �5/6 desaturasa, �5/6/9 elongasa

Caracterización funcional del gen de elongasa de C. elegans en levaduras

La cepa de levadura S288 se transformó, usando el método descrito en el Ejemplo 1, con ambos vectores pYES2zf�5/6 y pSEC-Ceelo simultáneamente y se seleccionaron los dobles transformantes en medio YMM que carecía de triptófano y uracilo. Los transformantes crecieron bien tanto en medio mínimo como enriquecido, a diferencia de los transformantes de la cepa S288 que portaban pSEC-Ceelo solo, en ausencia de pYES2-zf�5/6, que crecieron muy poco. Los dobles transformantes se crecieron en medio YMM y se indujeron por la adición de galactosa. El ácido graso 18:3ω3 (ALA, 0,5 mM) se añadió al medio y, después de 48 horas de incubación, las células se recogieron y se realizó el análisis de los ácidos grasos por cromatografía capilar gas-líquida (GC) como se describe en el Ejemplo

1. El análisis mostró que se formaron 18:4ω3 (0,82 % de ácido graso total) y 20:3ω3 (0,20 %) a partir de 18:3ω3, y 20:4ω3 (0,02 % de ácidos grasos) a partir de cualquiera de éstos, demostrando la acción concertada de una actividad elongasa además de la actividad �6 desaturasa y actividad �5 desaturasa de la desaturasa de pez cebra (Tabla 5). La acción concertada de un gen de �5/6 desaturasa bifuncional y un gen de elongasa no se ha informado anteriormente. En particular, el uso de una enzima bifuncional, si muestra las mismas actividades en células de planta, reduciría el número de genes que sería necesario introducir y expresar. Esto tampoco se ha informado anteriormente.

Ejemplo 5. Expresión Coordinada de Ácido Graso Desaturasa y Elongasa en Plantas

Construcción genética para co-expresión de la �6/�5 desaturasa de pez cebra y elongasa de C. elegans en células de planta

Beaudoin et al., (2000) mostraron que la proteína �6 elongasa de C. elegans, cuando se expresa en levaduras, podría elongar los ácidos grasos C18 �6 desaturados GLA y SDA, es decir, que tenía actividad �6 elongasa en sustratos C18. También mostraron que la proteína no tiene actividad �5 elongasa en un sustrato C20 en levaduras. Ensayamos, por lo tanto, si esta elongasa sería capaz de elongar los ácidos grasos �6 desaturados GLA y SDA en semilla de Arabidopsis. Se ha mostrado que las semillas de Arabidopsis thaliana contienen ácidos grasos tanto omega-6 (18:2, LA) como omega-3 (18:3, ALA) (Singh et al, 2001). La presencia de 18:3 en particular hace que la semilla de Arabidopsis sea un sistema excelente para estudiar la expresión de genes que podrían dar lugar a la síntesis de omega-3 C20+PUFA como EPA y DHA.

El ensayo para la actividad elongasa en Arabidopsis requirió la expresión coordinada de una �6 desaturasa en la semilla para formar en primer lugar GLA o SDA. Elegimos expresar el gen de elongasa en conjunción con el gen de desaturasa de pez cebra descrito anteriormente. No había informes previos de la expresión de los genes de la �6/A5 desaturasa de pez cebra y la elongasa de C .elegans en células de plantas, bien individualmente o conjuntamente.

La co-expresión específica de semilla de los genes de �6/A5 desaturasa de pez cebra y elongasa de C. elegans se consiguió poniendo los genes independientemente bajo el control de un fragmento promotor -309 napin, designado Fp1 (Stalberg et al., 1993). Para la transformación de plantas, los genes se insertaron en el vector binario pWvec8 que comprendía un gen de resistencia a higromicina potenciado como marcador seleccionable (Wang et al., 1997). Para conseguir esto, la región codificadora de la elongasa de C. elegans del Ejemplo 4 se insertó como un fragmento de extremos romos entre el fragmento Fp1 y Nos 3' poliadenilación/terminador en el vector binario pWvec8, formando pCeloPWvec8. La región codificadora de �5/�6 desaturasa de pez cebra del Ejemplo 3 se insertó inicialmente como un fragmento de extremos romos entre las secuencias Fp1 y Nos 3' terminadoras y este casete de expresión se ensambló entre los sitios de clonación HindIII y ApaI del vector de clonación pBluescript (Stratagene). Posteriormente, el vector completo que contenía el casete de expresión de desaturasa se insertó en el sitio HindIII de pCeloPWvec8, formando pZebdesatCeloPWvec8. La construcción, mostrada esquemáticamente en la Figura 3, se introdujo en la cepa de Agrobacterium AGLI (Valvekens et al., 1988) por electroporación antes de la transformación en Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia. La construcción también se designó la construcción "DO", y las plantas obtenidas por transformación con esta construcción se indicaron con el prefijo "DO".

Transformación de plantas y análisis

La transformación de plantas se realizó usando el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998). Las semillas (semillas T1) de las plantas tratadas (plantas T0) se plaquearon en medio selectivo de higromicina (20 mg/l) y las plantas transformadas se seleccionaron y transfirieron a tierra para establecer plantas T1. Se recuperó una planta resistente a higromicina de un primer cribado y se estableció en tierra. El experimento de transformación se repitió y se recuperaron 24 plantas transgénicas T1 más confirmadas y se establecieron en tierra. Se esperaba que la mayor parte de estas plantas T1 fueran heterocigotas para los transgenes introducidos.

Se recogieron semillas T2 de las 25 plantas transgénicas en la madurez y se analizaron para composición de ácidos grasos. Como se resume en la Tabla 6, las semillas de Arabidopsis (ecotipo Columbia) no transformada contenían cantidades significativas tanto de ω6 como ω3, precursores de ácidos grasos C18 LA y ALA pero no contenían ningún �6-desaturado C18 (18:3ω6 ó 18:4ω3), ω6-desaturado C20 PUFA o ω3-desaturado C20 PUFA. Por el contrario, los ácidos grasos del aceite de las semillas de las plantas transformadas que comprenden las construcciones génicas de �5/�6 desaturasa de pez cebra y elongasa de C. elegans contenían 18:3ω6, 18:4ω3y una serie completa de ω6

TABLA 6. Composición de ácidos grasos en semillas transgénicas (% de ácido graso total en aceite de semilla).

Ácido graso

Número de planta: GLA SDA ARA EPA DGLA ETA EDA ETrA DPA

18:3ω6: 18:4ω3 20:4ω6 20:5ω3 20:3ω6 20:4ω3 20:2ω6 20:3ω3 22:4ω6 22:5ω3 22:3ω6

Wt: - - - - - - - - - - -

DO1: 0,32 1,10 1,10 2,10 1,10 0,40 3,20 TR 0,06 0,13 0,03

DO2: 0,20 0,70 0,60 1,20 0,80 0,40 1,60 - 0,10 TR -

DO3: 0,20 0,50 0,40 0,80 0,60 0,30 1,90 - TR TR -

DO4: 0,30 0,90 0,80 1,30 1,10 0,50 1,90 - - 0,10 -

DO5: 0,10 0,50 0,20 0,40 0,40 - 0,30 - TR TR -

DO6: 0,30 1,00 1,00 1,70 1,20 0,50 2,50 - 0,10 0,10 -

DO7: 0,10 0,40 0,40 0,70 0,70 0,30 1,60 - TR TR -

DO8: 0,30 1,20 1,10 2,10 1,40 0,60 2,80 - 0,10 0,10 -

DO9: 0,30 1,30 0,90 2,20 1,30 0,60 3,10 - 0,10 0,10 -

DO10: 0,10 0,40 0,30 0,70 0,50 0,30 0,10 - TR TR -

DO11: 0,30 1,00 1,40 2,30 1,50 0,60 3,20 - 0,10 0,20 -

DO12: 0,40 1,40 1,10 1,90 1,20 0,60 2,30 - 0,10 0,10 -

DO13: 0,20 0,60 0,60 0,90 0,80 0,40 0,40 - TR 0,10 -

DO14: 0,30 1,00 0,70 1,70 1,10 0,60 2,50 - TR TR -

DO15: 0,30 1,30 1,00 2,30 1,50 0,60 2,60 - 0,10 0,10 -

Ácido graso

Número de planta: GLA SDA ARA EPA DGLA ETA EDA ETrA DPA

DO17: 0,20 0,40 0,40 0,70 0,70 0,30 1,80 - TR TR -

DO18: 0,20 0,60 0,50 0,90 0,80 0,40 1,70 - TR TR -

DO19: 0,20 0,40 0,40 0,80 0,70 0,30 2,00 - TR 0,10 -

DO20: 0,30 1,00 0,50 0,90 0,70 0,30 1,60 - TR TR -

DO21: 0,30 1,20 0,90 2,00 1,30 0,60 2,50 - - 0,10 -

DO22: 0,30 0,90 0,70 1,20 1,00 0,40 0,30 - TR TR -

DO23: - - - - 0,10 0,10 1,80 - - - -

DO24: 0,30 1,10 0,70 1,50 1,10 0,50 2,90 - TR 0,10 -

DO25: 0,10 0,50 0,30 0,70 0,50 0,20 1,60 - TR 0,10 -

Wt = Arabidopsis sin transformar (Columbia). TR indica menos de 0,05 %. El guión (-) indica no detectado.

45 5

y ω3-C20 PUFA. Ésto resultó de la acción secuencial de las enzimas desaturasa y elongasa en los precursores C18 respectivos. De forma lo más importante e inesperada, la semilla transgénica contenía ambos 20:5ω3 (EPA), alcanzando al menos 2,3 % del ácido graso total en el aceite de la semilla, y 22:5ω3 (DPA), alcanzando al menos 0,2 % de este omega-3 LC-PUFA en el ácido graso del aceite de la semilla. Los ácidos grasos C20 totales producidos en el aceite de la semilla transgénica alcanzaron al menos 9,0 %. Los ácidos grasos ω3 totales producidos que fueron un producto de �6 desaturación (es decir, aguas abajo de 18:3ω3 (ALA), calculado como la suma de los porcentajes para 18:4ω3 (SDA), 20:4ω3 (ETA), 20:5ω3 (EPA) y 22:5w3 (DPA)) alcanzaron al menos 4,2 %. Estos niveles representan una eficiencia de conversión de ALA, que está presente en aceite se semilla de las plantas de Arabidopsis de tipo salvaje usadas para la transformación a un nivel de aproximadamente 13-15 %, en productos ω3 a través de una etapa de �6 desaturación de al menos 28 %. Dicho de otra manera, la proporción de productos ALA a ALA (productos:ALA) en el aceite de la semilla fue al menos 1:3,6. De manera significativa aquí, Arabidopsis tiene una cantidad relativamente baja de ALA en su aceite se semilla comparado con algunos cultivos oleaginosos comerciales.

Las líneas T2 descritas anteriormente incluyeron líneas que eran homocigotas para los transgenes así como heterocigotas. Para distinguir homocigotas y heterocigotas para líneas que expresan los transgenes a los niveles más altos, se establecieron plantas T2 a partir de la semilla T2 para las 5 líneas que contenían los niveles más altos de EPA, usando la selección en medio MS que contenía higromicina (15mg/L) para determinar la presencia de los transgenes. Por ejemplo, la semilla T2 se usó de la planta T1 designada DO11, que contenía 2,3 % EPA y mostrando una proporción de segregación 3:1 de progenie resistente a susceptible en el medio de higromicina, indicando que DO11 contenía los transgenes en un único locus genético. Se identificaron las líneas homocigotas. Por ejemplo, la progenie T2 de la planta DO11-5 era homocigota como se muestra por la resistencia uniforme a higromicina en su progenie T3. Otras plantas T2 fueron heterocigotas para el marcador higromicina.

Se analizaron los perfiles de ácidos grasos de lotes de semillas T3 de DO11-5 y otra progenie T2 de DO11 y los datos se presentan en la Tabla 7. Como se esperaba, los contenidos de EPA reflejaron segregación de la construcción DO. Los niveles de EPA en los ácidos grasos del aceite de semilla obtenido de las líneas T3 estaban en tres grupos: despreciable (nulo para la construcción DO), en el intervalo 1,6-2,3 % (heterocigotos para la construcción DO) y alcanzando al menos 3,1 % (homocigotos para la construcción DO). Los niveles obtenidos fueron mayores en homocigotos que en heterocigotos, indicando un efecto de dosificación génica. La semilla T3 de la planta DO11-5 sintetizó un total de 9,6 % nuevos ω3y ω6 PUFA, incluyendo 3,2 % EPA, 1,6 % ARA, 0,1 % DPA, 0,6 % SDA y 1,8 % GLA (Tabla 7). Este nivel de síntesis de EPA en semilla fue cuatro veces mayor que el nivel de 0,8 % conseguido anteriormente en linaza

TABLA 7. Composición de ácidos grasos en semillas transgénicas (% de ácido graso total en aceite de semilla).

Ácido graso Tipo DO 11-5 DO 11-6 DO11-7 DO11-8 DO11-10 DO11-11 DO11-12 DO11-13 DO11-16 DO11-18 DO11-19 DO11-20 DO11-21 salvaje

14:0: 0,3 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

15:0: 0,0 0,0 0,2 0,2 0,2 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1

16:1ω7: 0,5 0,4 0,6 0,7 0,6 0,5 0,4 0,6 0,5 0,6 0,4 0,4 0,7 0,5

16:0: 8,1 7,1 7,9 7,8 7,6 7,0 7,1 7,8 7,7 7,6 6,8 6,7 7,6 7,3

17:1ω8: 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,1

17:0: 0,3 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,0 0,1

18:3ω6: GLA 0,0 0,6 0,0 0,0 0,0 0,3 0,3 0,0 0,4 0,0 0,2 0,3 0,0 0,4

18:4ω3: SDA 0,0 1,8 0,0 0,0 0,0 1,0 1,1 0,0 1,3 0,0 0,7 1,1 0,0 1,2

18:2ω6: LA 26,6 25,8 29,8 28,6 28,8 25,6 25,4 28,6 25,6 29,0 25,7 25,2 29,4 27,3

18:1ω9: 17,9 18,7 15,6 19,6 18,2 22,0 18,6 18,6 20,4 15,5 20,1 19,8 16,6 14,8

18:1ω7/ 18:3ω3: ALA 16,0 11,5 15,3 14,7 15,9 10,6 11,6 14,5 11,1 16,0 13,7 13,6 14,8 13,1

18:0: 3,4 4,2 2,9 2,7 2,8 3,5 3,9 2,8 3,9 2,9 3,3 3,4 2,9 3,7

19:0: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,1

20:4ω6: ARA 0,0 1,6 0,0 0,0 0,0 0,9 0,9 0,0 1,3 0,0 0,4 0,8 0,0 1,3

20:5ω3: EPA 0,0 3,2 0,0 0,1 0,0 1,6 2,1 0,0 2,1 0,0 1,1 1,8 0,0 2,3

20:3ω6: DGLA 0,0 1,9 0,0 0,0 0,0 1,2 1,5 0,0 1,4 0,0 0,7 1,0 0,0 1,5

20:4ω3: ETA 0,0 0,4 0,0 0,0 0,0 0,4 0,6 0,0 0,2 0,0 0,3 0,4 0,0 0,5

20:2ω6: 0,0 3,4 0,2 0,1 0,2 2,2 3,1 0,1 2,4 0,2 1,7 2,1 0,1 2,8

47 48 5

Ácido graso: Tipo DO 11-5 DO 11-6 DO11-7 DO11-8 DO11-10 DO11-11 DO11-12 DO11-13 DO11-16 DO11-18 DO11-19 DO11-20 DO11-21

salvaje

20:1ω9/ ω11: 17,4 10,9 17,8 18,1 17,3 14,8 12,5 18,2 13,2 18,0 15,4 14,0 18,6 12,4

20:1ω7: 1,9 2,7 2,2 1,9 2,2 2,2 2,3 2,0 2,0 2,3 2,2 2,2 2,3 2,7

20:0: 1,8 1,8 2,1 1,8 2,0 2,0 2,0 2,0 1,9 2,2 2,0 2,0 2,3 2,1

22:4ω6: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1

22:5ω3: DPA 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,0 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,2

22:1ω11/ ω13: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

22:1ω9: 1,3 0,8 1,9 1,7 1,7 1,5 1,1 1,7 1,1 2,0 1,6 1,4 2,1 1,5

22:1ω7: 0,0 0,0 0,2 0,1 0,2 0,1 0,0 0,1 0,0 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2

22:0: 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,4 0,4

24:1ω9: 0,6 0,4 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,3

24:1ω7: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

24:0: 0,0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3

Tipo salvaje aquí se refiere a Arabidopsis thaliana sin transformar, ecotipo Columbia

(Abbadi et al., 2004). Considerando también que el nivel de precursor ALA para la síntesis de EPA en semilla de Arabidopsis fue menor de un tercio del presente en linaza, parecía que la ruta LC-PUFA como se ha descrito anteriormente que incluía una desaturasa que era capaz de usar un sustrato acil-CoA, estaba operando con una eficiencia significativamente mayor que la ruta desaturasa dependiente de acil-PC expresada en linaza.

Las eficiencias relativas de las etapas enzimáticas individuales codificadas por la construcción EPA pueden evaluarse examinando el porcentaje de conversión de ácidos graso sustrato a ácidos grasos productos (incluyendo derivados posteriores) en DO11-5. La �5/�6 desaturasa de pez cebra presentó una fuerte �5 desaturación, con 89 % de 20:4ω3 siendo convertido a EPA y DPA, y 45 % de 20:3ω6 siendo convertido a ARA, consistente con la preferencia informada anteriormente de esta enzima para sustratos ω3 PUFA sobre ω6 PUFA (Hastings et al., 2001). En comparación, la �6-desaturación ocurrió a niveles significativamente menores, con 32 % de ALA y 14 % de LA siendo convertidos a PUFA �6-desaturado. Dado que estudios previos en levaduras mostraron que esta enzima tiene realmente una actividad �6-desaturasa mayor que actividad �5-desaturasa, los niveles menores conseguidos de �6-desaturación en semillas de Arabidopsis podrían reflejar una disponibilidad limitada de sustratos ALA y LA en el combinado acil-CoA (Singh et al., en prensa). La �6-elongasa operaba de una manera altamente eficiente, con 86 % de GLA y 67 % de SDA siendo elongados, lo que sugiere que esta enzima puede tener una ligera preferencia para elongación de sustrato ω6-PUFA.

La capacidad de germinación de la semilla T2 (segregante) y T3 (población homocigota) se evaluó en medio MS y en tierra. La semilla de las líneas que contienen EPA y DPA DO11 y DO11-5 mostró el mismo esquema de tiempo y frecuencia de germinación que la semilla de tipo salvaje, y las plantas T2 y T3 no tienen ningunas características morfológicas anormales aparentes. Las velocidades de crecimiento de las plantas in vitro o en tierra y las cantidades de semilla obtenida de las plantas tampoco se vieron afectadas. Incluyendo la germinación de la semilla T1 de la que se obtuvo la planta DO11, la germinación normal de la semilla de la línea DO11 se observó así durante tres generaciones. Además, también se observaron velocidades normales de germinación y esquema de tiempo para las demás semillas que contenían EPA y DPA. Esta característica fue tanto importante como no predecible, ya que las plantas superiores no producen de forma natural EPA o DPA y su semilla por lo tanto no ha contenido nunca anteriormente estos LC-PUFA. La germinación requiere el catabolismo de aceites de la semilla almacenados y el uso para el crecimiento y como un suministro de energía. Las velocidades de germinación normales observadas mostraron que la semilla de la planta era capaz de llevar a cabo estos procesos usando EPA y DPA, y que estos compuestos no eran tóxicos.

Se ha informado que una �4 desaturasa codificada por un gen aislado de Thraustochytrium spp y expresado en hojas de Brassica juncea era capaz de convertir DPA suministrado exógenamente en DHA (Qiu et al., 2001). DPA producido en la semilla de la planta descrita en la presente memoria puede servir como un precursor para la producción de DHA. Esta conversión de DPA en DHA puede conseguirse en células de planta por la introducción de un gen de �4 desaturasa en las células de planta que producen DPA (Ejemplo 11).

Discusión

La presencia de 22:5ω3 en el aceite se semilla de Arabidopsis implicó que el gen de elongasa de C. elegans no sólo tenía actividad �6 elongasa, sino también actividad �5 elongasa en células de planta. Este resultado fue muy sorprendente dado que se había demostrado que el gen carecía de actividad �5 elongasa en levadura. Además, esto demostró que sólo dos genes podrían usarse para la síntesis de DPA a partir de ALA en células de planta. La síntesis de DPA en una planta superior no se ha informado anteriormente. Además, fue llamativa la eficiencia de la conversión de ALA en sus productos ω3 en semilla, incluyendo EPA, DPA o ambos, de al menos 28 %.

La síntesis de LC-PUFA tal como EPA y DHA en células tales como células de planta por la ruta de �6 desaturación requirió la acción secuencial de PUFA desaturasas y elongasas. Las desaturasas requeridas en una ruta tenían actividad �6, �5y �4 desaturante, en ese orden, y las elongasas PUFA requeridas tenían actividad de elongación sobre sustratos �6y �5. Esta ruta convencional opera en algas, musgos, hongos, diatomeas, nematodos y algunos peces de agua dulce (Sayanova y Napier, 2004). Las PUFA desaturasas de algas, hongos, musgos y gusanos son selectivas para la desaturación de ácidos grasos esterificados en la posición sn-2 de fosfatidilcolina (PC) mientras las PUFA elongasas actúan sobre ácidos grasos en la forma de sustratos acil-CoA representados en el combinado acil-CoA de tejidos. Por el contrario, se ha mostrado que las �6 desaturasas de vertebrados son capaces de desaturar sustratos acil-CoA (Domergue et al., 2003a).

Los intentos para reconstituir las rutas LC-PUFA en células de planta y otras células tienen que tener en cuenta los diferentes sitios de acción y requerimientos de sustrato de las enzimas desaturasas y elongasa. Por ejemplo, las PUFA elongasas están unidas a membrana, y quizá incluso proteínas integrales de membrana, que usan acil-CoA que están presentes como un combinado claro en el retículo endoplásmico (ER). Este combinado de acil-CoA está fisiológicamente separado del componente PC del ER, sin embargo para que un ácido graso PUFA sea desaturado y elongado secuencialmente tiene que transferirse entre combinados de PC y acil-CoA en el ER. Por lo tanto, los intentos de los que se ha informado anteriormente de constituir biosíntesis de LC-PUFA en levadura usando desaturasas y elongasa de plantas inferiores y superiores, hongos y gusanos, han sido, como mucho, ineficientes. Además, las rutas constituidas han dado lugar sólo a la síntesis de C20 PUFA tales como ARA y EPA. No hay

ningún informe previo de la síntesis de C22 PUFA tales como DPA y DHA en levadura (Beaudoin et al., 2000, Domergue et al., 2003a).

La estrategia descrita anteriormente de usar una desaturasa de vertebrados, en este ejemplo una �5/�6 desaturasa de pez cebra, con una �6 PUFA elongasa de C. elegans tenía la ventaja de que tanto la desaturasa como la elongasa tienen actividad en sustratos acil-CoA en el combinado acil-CoA. Esto puede explicar por qué esta estrategia fue más eficiente en la síntesis de LC-PUFA. Además, usando una desaturasa bifuncional que presenta actividades �5/�6 desaturasa duales permitió la síntesis de EPA por la acción de sólo 2 genes en lugar de los 3 genes usados por los demás investigadores (Beaudoin et al., 2000, Domergue et al., 2003a). El uso de una �5/�6 elongasa bifuncional en células de planta también permitió la formación de DPA a partir de ALA por la inserción de sólo tres genes (una elongasa y dos desaturasas) o, como se ejemplifica, de sólo dos genes (elongasa bifuncional y desaturasa bifuncional). Ambos de estos aspectos fueron sorprendentes e inesperados.

La evidencia bioquímica sugiere que la elongación de ácidos grasos consiste en 4 etapas: condensación, reducción, deshidratación y una segunda reducción. Hasta ahora se han identificado dos grupos de enzimas de condensación. El primero está implicado en la síntesis de ácidos grasos saturados y monoinsaturados (C18-22). Éstos son las enzimas semejantes a FAE y no parece que tengan un papel en la biosíntesis de LC-PUFA. La otra clase de elongasas identificada pertenecen a la familia ELO de elongasas que se denominan como la familia de genes ELO cuyas actividades se requieren para la síntesis de los ácidos grasos de cadena muy larga de esfingolípidos en levaduras. Se ha mostrado que los paralogos aparentes de las elongasas de tipo ELO aislados de los organismos que sintetizan LC-PUFA como algas, musgos, hongos y nematodos están implicados en la elongación y síntesis de LC-PUFA. Se ha mostrado que sólo se requiere la expresión del componente de condensación de la elongasa para la elongación de la cadena acilo respectiva. Así, el componente de condensación de la elongasa introducido es capaz de reclutar con éxito las actividades de reducción y deshidratación del huésped transgénico para llevar a cabo las elongaciones de acilo con éxito. Hasta ahora, se han demostrado elongaciones exitosas de PUFA C16 y C18 en levadura por la expresión heteróloga de elongasas de tipo ELO. A este respecto, la elongasa de C. elegans usada como se ha descrito anteriormente fue incapaz de elongar C20 PUFA cuando se expresó en levadura (Beaudoin et al, 2000). Nuestra demostración de que la elongasa de C. elegans, cuando se expresa en plantas, fue capaz de elongar el ácido graso C20:5 EPA como se pone de manifiesto por la producción de DPA en semilla de Arabidopsis fue un resultado nuevo e inesperado. Una explicación a por qué la elongasa de C. elegans fue capaz de elongar C20 PUFA en plantas, pro no en levadura, podría residir en su capacidad de interaccionar con éxito con los demás componentes de la maquinaria de elongación de las plantas para unirse y actuar sobre sustratos C20.

Este ejemplo mostró que una elongasa de tipo ELO de un organismo no vertebrado fue capaz de elongar C20 PUFA en células de planta. Leonard et al. (2002) informaron que un gen de elongasa de tipo ELO aislado de seres humanos, cuando se expresó en levadura, fue capaz de elongar EPA a DPA pero de una manera no selectiva.

Ejemplo 6. Aislamiento de un Gen de �8 Desaturasa de P. salina y Caracterización Funcional en Levadura

Las microalgas son los únicos organismos que se ha informado que contienen �8 desaturasas, además de las �8 desaturasas de esfingolípido en plantas superiores que no están implicadas en la biosíntesis de LC-PUFA. Un gen que codifica una �8 desaturasa se ha aislado de Euglena gracilis (Wallis y Browse, 1999). La existencia de una �8 desaturasa en Isochrysis galbana puede presumirse porque contiene una �9 elongasa (Qi et al., 2002), cuyo producto, 20:3n-3, es el precursor de una �8 desaturasa (véase la Figura 1). Los perfiles de ácido graso de microalgas solo, sin embargo, no proporcionan una base suficiente para identificar qué microalgas contendrán genes de �8 desaturasa ya que múltiples rutas pueden operar para producir el LC-PUFA.

Aislamiento de un fragmento de gen de �8 desaturasa

Un alineamiento de secuencias de aminoácidos de �6 desaturasa con las de los números de registro Genbank siguientes, AF465283, AF007561, AAC15586 identificó los bloques de secuencia de aminoácido consenso DHPGGS (SEQ ID NO:43), WWKDKHN (SEQ ID NO:44) y QIEHHLF (SEQ ID NO:45) correspondientes a las posiciones de aminoácidos 204-210 y 394-400, respectivamente, de AF465283. DHPGSS correspondió al bloque de "dominio citocromo b5" que se ha identificado anteriormente (Mitchell y Martin, 1995). WWKDKHN fue un bloque consenso que no se había identificado anteriormente o usado para diseñar cebadores degenerados para el aislamiento de genes desaturasa. El bloque QIEHHLF, o variantes de éste, correspondió a un resto que contenía histidina requerido que estaba conservado en desaturasas. Se había identificado y usado antes como la "tercera caja His" para diseñar oligonucleótidos degenerados para el aislamiento de genes desaturasa (Michaelson et al., 1998). Esta combinación de bloques no se había usado anteriormente para aislar genes desaturasa.

Tomando como base el segundo y tercer bloques de aminoácidos conservados, se sintetizaron los cebadores degenerados 5'-TGGTGGAARCAYAARCAYAAY-3' (SEQ ID NO:46) y 5'-GCGAGGGATCCAAGGRAANARRTGRTGYTC-3' (SEQ ID NO:47). El ADN genómico de P. salina se aisló usando el sistema DNAeasy (Qiagen). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 20µL usando 20pmoles de cada cebador, 200ng de ADN genómico de P. salina y ADN polimerasa Hotstar Taq (Qiagen) con componentes de tampón y nucleótidos como se especifica. Las condiciones de ciclado fueron: 1 ciclo de 95 °C durante 15 minutos; 5 ciclos de 95 °C 1min; 38 °C, 1min; 72 °C, 1min; seguido de 35 ciclos de 95 °C, 35 seg; 52 °C,

30 seg; 72 °C, 1min; y finalizando con 1 ciclo de 72 °C, 10min. Se generó un amplicón de 515 pares de bases, se ligó en pGEM-T easy (Promega), se secuenció y se usó como una sonda para cribar una biblioteca de ADNc de P. salina.

Aislamiento de un ADNc que codifica una �8 desaturasa de P. salina

Se construyó una biblioteca de ADNc de P. salina en bacteriófago λ usando el Kit de Síntesis Zap-cDNA (Stratagene) (véase el Ejemplo 1). La biblioteca se plaqueó a una concentración de ~50.000 placas por placa y se tomaron transferencias con membrana Hybond N+ y se trataron usando métodos estándar (Ausubel et al., 1988, supra). El fragmento de desaturasa de 515pb, generado por PCR, se radio-marcó con 32P-dCTP y se usó para ensayar las transferencias en las condiciones de astringencia alta siguientes: Hibridación de toda la noche a 65 °C en 6X SSC con agitación, un lavado de 5 minutos con 2x SSC/0,1 % SDS seguido de dos lavados de 10 minutos con 0,2x SSC/0,1 % SDS.

Se cribaron quince placas de biblioteca primaria (150mm) para hibridación con el fragmento de 515pb marcado. Se identificaron cuarenta placas con hibridación fuerte y diez de éstas se llevaron a un cribado secundario. Los plásmidos de cinco placas secundarias que hibridaron con la sonda de 515pb se escindieron con ExAssist Helper phage según el protocolo del proveedor (Stratagene). Las secuencias de nucleótidos de los insertos se obtuvieron usando el kit ABI Prism Big Dye Terminator (PE Applied Biosystems). Las secuencias de nucleótidos fueron idénticas cuando se superpusieron, indicando que los cinco insertos eran del mismo gen. Se mostró que uno de los cinco insertos contenía la región codificadora completa, que se muestra más adelante que es de un gen de �8 desaturasa. Esta secuencia se proporciona como SEQ ID NO:6.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa (SEQ ID NO:1) reveló que el ADNc aislado codificaba una posible �6o �8 desaturasa, tomando como base el análisis BLAST. Estos dos tipos de desaturasas son muy similares a nivel de aminoácidos y por lo tanto no fue posible predecir sólo por la secuencia qué actividad estaba codificada. El grado máximo de identidad entre la desaturasa de P. salina y otras desaturasas (BLASTX) fue 27-30 %, mientras el análisis usando el programa GAP que permite las inserciones de "huecos" en el alineamiento mostró que la identidad global máxima de aminoácidos sobre las regiones codificadoras completas de la desaturasa de P. salina y AAD45877 de Euglena gracilis fue 45 %. Un diagrama de Pileup de otras secuencias similares a la desaturasa de Pavlova salina se proporciona en la Figura 4.

La región codificadora completa de este clon, contenida en un fragmento EcoRI/XhoI, se insertó en pYES2 (Invitrogen), generando pYES2-ps�8, para la introducción y caracterización funcional en levadura. Las células de la cepa de levadura S288 se transformaron con pYES2-ps�8 como se describe en el Ejemplo 1, y los transformantes se seleccionaron en medio sin uracilo. Las células de levadura que contienen pYES2-ps�8 se crecieron en cultivo y se indujeron con galactosa. Después de la adición de 18:3ω3 ó 20:3ω3 (0,5 mM) al medio de cultivo y 48 horas de cultivo adicional a 30 °C, los ácidos grasos en lípidos celulares se analizaron como se describe en el Ejemplo 1. Cuando 18:3ω3(�9, 12, 15) se añadió al medio, no se detectó 18:4ω3(�6, 9, 12, 15). Sin embargo, cuando 20:3ω3 (�11,14,17) se añadió al medio, se detectó la presencia de 20:4ω3(�8,11,14,17) en el lípido celular de los transformantes de levadura (0,12 %). Se concluyó que el transgén codificaba un polipéptido que tenía actividad �8 pero no �6 desaturasa en células de levadura.

El aislamiento de un gen que codifica una �8 ácido graso desaturasa que no tiene también actividad �6 desaturasa no se ha informado anteriormente. El único gen del que se ha informado anteriormente que codifica una �8 desaturasa que se aisló (de Euglena gracilis) fue capaz de catalizar la desaturación de ambos 18:3ω3 y 20:3ω3 (Wallis y Browse, 1999). Además, la expresión de un gen que codifica una �8 desaturasa no se ha informado anteriormente en plantas superiores.

Como se muestra en la Figura 1, la expresión de una �8 desaturasa en concierto con una �9 elongasa (por ejemplo, el gen que codifica ELO2 -véase más adelante) y una �5 desaturasa (por ejemplo, el gen �5/�6 de pez cebra o un equivalente de P. salina u otra microalga) causaría la síntesis de EPA en plantas.

Además de proporcionar una ruta alternativa para la producción de EPA en células, la estrategia de usar una �9 elongasa en combinación con la �8 desaturasa puede proporcionar una ventaja en que la elongación, que ocurre sobre los ácidos grasos acoplados a CoA, precede la desaturación, que ocurre sobre los ácidos grasos acoplados a PC, asegurando de esta manera la disponibilidad del C20 PUFA recién elongado en PC para desaturaciones posteriores por �8y �5 desaturasas, dando lugar posiblemente a una síntesis más eficiente de EPA. Esto es, el orden de las reacciones -una elongación seguida de dos desaturaciones -reducirá el número de cambios que ligan sustrato necesarios. La especificidad incrementada proporcionada por la �8 desaturasa de P. salina es una ventaja adicional.

Ejemplo 7. Aislamiento de Elongasas de Ácido Graso ELO1 y ELO2 de P.salina

Las elongasas de PUFA de tipo ELO de organismos tales como nematodos, hongos y musgos se han identificado tomando como base EST o estrategias de secuenciación del genoma. Un gen que codifica una �9 elongasa con actividad sobre 18:3ω3 (ALA) se aisló de Isochrysis galbana usando una estrategia de PCR con cebadores degenerados, y mostró que tiene actividad en células de levadura a las que se suministró 18:2ω6 (LA) ó 18:3ω3

(ALA) exógenos, formando ácidos grasos C20 20:2ω6 y 20:3ω3 respectivamente. La región codificadora del gen IgASE1 codificó una proteína de 263 aminoácidos con un peso molecular predicho de aproximadamente 30kDa y con homología limitada (hasta 27 % de identidad) con otras proteínas que elongan.

Aislamiento de fragmentos de gen elongasa de P. salina

Tomando como base alineamientos de secuencias de aminoácidos múltiples para ácido graso elongasas se identificaron los bloques de aminoácidos consenso FLHXYH (SEQ ID NO:48) y MYXYYF (SEQ ID NO:49) y se sintetizaron los cebadores degenerados correspondientes 5'-CAGGATCCTTYYTNCATNNNTAYCA-3' (SEQ ID NO:50) (con sentido) y 5'-GATCTAGARAARTARTANNNRTACAT-3' (SEQ ID NO:51) (antisentido). Los cebadores diseñados para el resto FLHXYH o su uso en combinación con el cebador MYXYYF no se han descrito anteriormente. Estos cebadores se usaron en reacciones de amplificación por PCR en volúmenes de reacción de 20µL con 20pmoles de cada cebador, 200ng de ADN genómico de P. salina y ADN polimerasa Hotstar Taq (Qiagen) con componentes de tampón y nucleótidos como se especifica por el proveedor. Las reacciones se ciclaron como sigue: 1 ciclo de 95 °C durante 15 minutos, 5 ciclos de 95 °C, 1min, 38 °C, 1min, 72 °C, 1min, 35 ciclos de 95 °C, 35 seg, 52 °C, 30 seg, 72 °C, 1min, 1 ciclo de 72 °C, 10min. Se generaron fragmentos de aproximadamente 150pb y se ligaron en pGEM-Teasy para análisis de secuencia.

De los 35 clones aislados, dos clones tenían secuencia de nucleótidos o aminoácidos con similitud con elongasas conocidas. Éstos se designaron Elo1 y Elo2. Ambos fragmentos génicos se radio-marcaron con 32P-dCTP y se usaron para ensayar la biblioteca de ADNc de P. salina en las condiciones de astringencia alta siguientes: hibridación de toda la noche a 65 °C en 6X SSC con agitación, un lavado de 5 minutos con 2x SSC/0,1 % SDS seguido de dos lavados de 10 minutos con 0,2x SSC/0,1 % SDS. Se cribaron diez placas de biblioteca primaria (150mm) usando las sondas Elo1 o Elo2. Elo1 hibridó fuertemente con varias placas en cada placa, mientras Elo2 hibridó con sólo tres placas en las diez placas cribadas. Todas las placas que hibridaron con Elo1 se tomaron de una única placa y se llevaron a un cribado secundario, mientras las tres placas que hibridaron con Elo2 se llevaron a un cribado secundario. Cada placa secundaria se usó como un molde de PCR usando los cebadores directos e inversos que flanquean el sitio de clonación múltiple en el fagémido pBluescript y los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel 1 % TAE. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a una membrana Hybond N+ y la membrana se hibridó toda la noche con sondas Elo1 y Elo2 marcadas con 32P. Seis de las placas secundarias Elo1 amplificadas y una de las placas secundarias Elo2 amplificada hibridaron con la sonda Elo 1/2 (Figura 5).

Se identificaron dos clases de secuencias semejantes a elongasa en la biblioteca de ADNc de P. salina tomando como base su hibridación con las sondas Elo1 y Elo2. Los fagémidos que hibridaron fuertemente con cualquier fragmento marcado se escindieron con ExAssist Helper phage (Stratagene), y se secuenciaron usando el kit ABI Prism Big Dye Terminator (PE Applied Biosystems). Se mostró que todos los 5 insertos que hibridaron con la sonda Elo1 eran del mismo gen. De manera similar, la secuenciación de ADN de los 2 insertos que hibridaron con la sonda Elo2 mostró que eran del mismo gen. La secuencia de ADNc del clon Elo1 se proporciona como SEQ ID NO:8, y la proteína codificada como SEQ ID NO:2, mientras la secuencia de ADNc del clon Elo2 se proporciona como SEQ ID NO:10, y las proteínas codificadas como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 y SEQ ID NO:86 usando tres posibles metioninas de inicio).

Se realizó una comparación de Elo1 y Elo2 y otras elongasas de PUFA conocidas de la base de datos usando el software PILEUP (NCBI), y se muestra en la Figura 6.

El ADNc de Elo1 tuvo una longitud de 1.234 nucleótidos y tuvo un marco de lectura abierto que codificaba una proteína de 302 residuos de aminoácidos. Según el análisis PILEUP, Elo1 se agrupaba con otras secuencias de tipo Elo asociadas con la elongación de PUFA incluyendo ácidos grasos �6 desaturados (Figura 6). La proteína Elo1 mostró el mayor grado de identidad (33 %) con una elongasa del musgo, P. patens (No. de Registro AF428243) a lo largo de las regiones codificadoras completas. La proteína Elo1 también presentó restos de aminoácidos conservados encontrados en todas las demás elongasas de tipo Elo.

El ADNc de Elo2 tuvo una longitud de 1.246 nucleótidos y tuvo un marco de lectura abierto que codificaba una proteína de 304 residuos de aminoácidos. Según el análisis PILEUP, Elo2 se agrupaba con otras secuencias de tipo Elo asociadas con la elongación de PUFA, incluyendo aquellas con actividad sobre PUFA �6o �9 (Figura 6). Elo2 estaba en la misma sub-rama que la �9 elongasa aislada de Isochrysis galbana (AX571775). Elo2 presentó 31 % de identidad con el gen de Isochrysis a lo largo de su región codificadora completa. El ORF de Elo2 también presentó un resto de aminoácidos conservado encontrado en todas las demás elongasas de tipo Elo.

Ejemplo 8. Caracterización Funcional de Ácido Graso �5 Elongasa en Células de Levadura y Planta

Levadura

La región codificadora completa del gen Elo1 de P. salina se ligó en pYES2, generando pYES2-psELO1, para caracterización en levadura. Esta construcción genética se introdujo en cepas de levadura y se ensayó para actividad por crecimiento en medios que contenían ácidos grasos exógenos como se lista en la Tabla 8. Las células de levadura que contenían pYES2-psELO1 fueron capaces de convertir 20:5ω3 en 22:5ω3, confirmando actividad

�5 elongasa en sustrato C20. La proporción de conversión de 7 % indicó actividad alta para este sustrato. Las mismas células de levadura convirtieron 18:4ω3(�6,9,12,15) en 20:4ω3 y 18:3ω6(�6,9,12) en 20:3ω6, demostrando que la elongasa también tenía actividad �6 elongasa en células de levadura, pero a proporciones de conversión aproximadamente 10 veces menores (Tabla 8). Esto indicó que el gen Elo1 codifica una �5 elongasa específica o selectiva en células de levadura. Esto representa el primer informe de una �5 elongasa específica, concretamente una enzima que tiene una mayor actividad �5 elongasa cuando se compara con la actividad �6 elongasa. Esta molécula es también la primera �5 elongasa aislada de una fuente de algas. Esta enzima es crítica en la conversión de EPA en DPA (Figura 1).

Plantas

La �5 elongasa, Elo1 aislada de Pavlova se expresa en plantas para confirmar su capacidad de funcionar en plantas. En primer lugar, se hace una construcción de expresión de planta para la expresión constitutiva de Elo1. Para este propósito, la secuencia de Elo1 se pone bajo el control del promotor 35S en el vector binario de plantas pBI121 (Clontech). Esta construcción se introduce en Arabidopsis usando el método de inmersión floral descrito anteriormente. El análisis de los lípidos de las hojas se usa para determinar la especificidad de ácidos grasos elongados por la secuencia Elo1. En otra estrategia, la co expresión de la construcción Elo1 con la construcción �5/�6 desaturasa de pez cebra/elongasa de C.elegans y la �4 desaturasa aislada de Pavlova, resulta en la síntesis de DHA a partir de ALA en semilla de Arabidopsis, demostrando el uso de la �5 elongasa en la producción de DHA en células. En una estrategia adicional, el gen Elo1 puede co-expresarse con los genes de �6-desaturasa y �5 desaturasa, o un gen de �6/A5 desaturasa bifuncional, para producir DPA a partir de ALA en células, particularmente células de planta. En una estrategia alternativa, los genes de �5 elongasa y �4 elongasa se usan en combinación con los genes PKS de Shewanella que producen EPA (Takeyama et al., 1997), en plantas, para la síntesis de DHA.

TABLA 8. Conversión de ácidos grasos en células de levadura transformadas con construcciones genéticas que expresan Elo1 o Elo2.

Clon: Precursor de ácido graso/ (% de FA total) Ácido graso formado/ (% de FA total) Proporción de conversión (%)

pYES2-psELO1: 20:5n-3 / 3 % 22:5n-3 / 0,21 % 7 %

pYES2-psELO1: 18:4n-3 / 16,9 % 20:4n-3 / 0,15 % 0,89 %

pYES2-psELO1: 18:3n-6 / 19,8 % 20:3n-6 / 0,14 % 0,71 %

pYES2-psELO2: 20:5n-3 / 2,3 % 22:5n-3 / tr -

pYES2-psELO2: 18:4n-3 / 32,5 % 20:4n-3 / 0,38 % 1,2 %

pYES2-psELO2: 18:3n-6 / 12,9 % 20:3n-6 / 0,08 % 0,62 %

pYES2-psELO2: 18:2n-6 / 30,3 % 20:2n-6 / 0,12 % 0,40 %

pYES2-psELO2: 18:3n-3 / 42,9 % 18:3n-3 / 0,20 % 0,47 %

tr: cantidades traza (<0,02 %) detectadas.

Ejemplo 9. Caracterización Funcional de Ácido Graso �9 Elongasa en Células de Levadura y Planta

Expresión en células de levadura

La región codificadora completa del gen Elo2 de P. salina que codifica una proteína de 304 aminoácidos (SEQ ID NO:3) se ligó en pYES2, generando pYES2-psELO2, para caracterización en levadura. Esta construcción genética se introdujo en cepas de levadura y se ensayó para actividad por crecimiento en medios que contenían ácidos grasos exógenos. Las células de levadura que contienen pYES2-psELO2 fueron capaces de convertir 18:2ω6 en 20:2ω6 (0,12 % de ácidos grasos totales) y 18:3ω3 en 20:3ω3 (0,20 %), confirmando actividad �9 elongasa sobre sustratos C18 (Tabla 8). Estas células también fueron capaces de convertir 18:3ω6 en 20:3ω6 y 18:4ω3 en 20:4ω3, confirmando actividad �6 elongasa sobre sustratos C18 en levadura. Sin embargo, como los sustratos 18:3ω6y 18:4ω3 también tienen una desaturación en la posición �9, podría ser que la enzima Elo2 sea específica para ácidos grasos �9-desaturados, independientemente de si también tienen una �6 desaturación. Las células fueron capaces

de convertir 20:5ω3 en el producto DPA 22:5. Éste es el primer informe de una �9 elongasa que también tiene actividad �6 elongasa de una fuente de no vertebrado, en particular de una fuente de hongo o alga.

Como la región codificadora contenía tres posibles codones de inicio ATG correspondientes a aminoácidos de metionina (Met) en las posiciones 1, 11 (SEQ ID NO:85) y 29 (SEQ ID NO:86) de SEQ ID NO:3, se ensayó la posibilidad de que los polipéptidos que empiezan en las posiciones de aminoácidos 11 ó 29 también fueran activos. Usando cebadores oligonucleotídicos 5' (con sentido) correspondientes a las secuencias de nucleótidos de estas regiones, se llevó a cabo la amplificación por PCR de las regiones codificadoras, y los productos resultantes se digirieron con EcoRI. Los fragmentos se clonaron en pYES2 para formar pYES2-psELO2-11 y pYES2-psELO2-29. Se muestra que ambos plásmidos codifican enzimas �9-elongasa activas en levadura. Los tres polipéptidos también pueden expresarse en Synechococcus u otras células tales como células de planta para demostrar actividad.

Expresión en células de planta

El gen de �9 elongasa, Elo2, aislado de Pavlova se expresó en plantas para confirmar su capacidad de funcionar en plantas. En primer lugar, se hace una construcción de expresión de planta para la expresión constitutiva de Elo2. Para este propósito, la secuencia codificadora de Elo2 desde la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO:3 se puso bajo el control del promotor 35S en el vector binario de planta pBI121 (Clontech). Esta construcción se introduce en Arabidopsis usando el método de inmersión floral descrito anteriormente. El análisis de los lípidos de las hojas indica la especificidad de ácidos grasos que son elongados por la secuencia Elo2.

Co-expresión de los genes de �9 elongasa y �8-desaturasa en células transformadas

La �8-desaturasa y �9-elongasa de P. salina se clonaron en un único vector binario, cada una bajo el control del promotor constitutivo 35S y terminador nos. En esta construcción génica, se cortó pBI121 que contiene la secuencia

�8-desaturasa con HindIII y ClaI (con extremos romos) para liberar un fragmento que contiene el promotor 35S y el gen de �8-desaturasa, que se ligó en el vector pXZP143/�9-elongasa cortado con HindIII + SacI (con extremos romos) para resultar en el intermedio pJRP013. Este intermedio se abrió con HindIII y se ligó con un vector binario pWvec8/�9-elongasa (también abierto con HindIII) para resultar en la construcción pJRP014, que contiene ambos genes entre los extremos izquierdo y derecho de T-ADN, junto con un gen marcador seleccionable de higromicina adecuado para la transformación de plantas.

Esta construcción de doble gen se usó para transformar tabaco usando una técnica de transformación mediada por Agrobacterium estándar. Después de la introducción de la construcción en la cepa de Agrobacterium AGL1, se usó una única colonia transformada para inocular 20 mL de medio LB y se incubó con agitación durante 48 horas a 28 °C. Las células se sedimentaron (1.000 g durante 10 minutos), el sobrenadante se desechó, y el sedimento se resuspendió en 20 mL de medio MS estéril. Esta etapa se repitió antes de añadir 10 ml de esta solución de Agrobacterium a hojas de tabaco recién cortadas (cuadrados de 1 cm) del cultivar W38. Después de un mezclado suave, se dejaron los trozos de hoja de tabaco y solución de Agrobacterium permanecer a temperatura ambiente durante 10 min. Los trozos de hoja se transfirieron a placas MS, se sellaron, y se incubaron (co-cultivo) durante 2 días a 24 °C. Las células transformadas se seleccionaron en medio que contenía higromicina, y se regeneraron brotes. Estos brotes se cortaron y se transfirieron a macetas con medio de enraizamiento MS para el crecimiento de la raíz, y eventualmente se transfirieron a tierra. Los lípidos tanto de la hoja como semilla de estas plantas se analizaron para la presencia de ácidos grasos 20:2ω6, 20:3ω6, 20:3ω3 y 20:4ω3, demostrando la co-expresión de los dos genes.

Discusión

La evidencia bioquímica sugiere que la elongación de ácidos grasos consiste en 4 etapas: condensación, reducción, deshidratación y una segunda reducción, y la reacción está catalizada por un complejo de cuatro proteínas, la primera de las cuales cataliza la etapa de condensación y se denomina comúnmente la elongasa. Hasta ahora hay 2 grupos identificados de enzimas de condensación. El primero está implicado en la síntesis de ácidos grasos saturados y monoinsaturados (C18-22). Éstos son las enzimas semejantes a FAE y no juegan ningún papel en la biosíntesis de LC-PUFA. La otra clase de elongasas identificada pertenecen a la familia ELO de elongasas que se denominan como la familia de genes ELO cuyas actividades se requieren para la síntesis de los ácidos grasos muy LC de esfingolípidos en levadura. Se ha mostrado que los paralogos aparentes de las elongasas de tipo ELO aislados de los organismos que sintetizan LC-PUFA como algas, musgos, hongos y nematodos están implicados en la elongación y síntesis de LC-PUFA. Se ha mostrado que sólo se requiere la expresión del componente de condensación de la elongasa para la elongación de la cadena acilo respectiva. Así, el componente de condensación de la elongasa introducido es capaz de reclutar con éxito las actividades de reducción y deshidratación del huésped transgénico para llevar a cabo las elongaciones de acilo con éxito. Esto también fue cierto para la �9-elongasa de P. salina.

Ejemplo 10. Aislamiento de un Gen que Codifica una �4-desaturasa de P. salina

La etapa final en la ruta aeróbica de la síntesis de DHA en organismos distintos de vertebrados, tales como microorganismos, plantas inferiores incluyendo algas, musgos, hongos, y posiblemente animales inferiores, está catalizada por una �4-desaturasa que introduce un enlace doble en la cadena de carbono del ácido graso en la

posición �4. Los genes que codifican dicha enzima se han aislado de las algas Euglena y Pavlova y de Thraustochytrium, usando diferentes estrategias. Por ejemplo, los genes de �4-desaturasa de Pavlova lutheri y Euglena gracilis se aislaron por secuenciación aleatoria de EST clonados (estrategia EST, Meyer et al., 2003; Tonon et al., 2003), y un gen de �4-desaturasa de Thraustochytrium sp. ATCC21685 se aisló por RT-PCR usando cebadores correspondientes a un dominio de citocromo b5 HPGG y la región de caja de histidina III (Qiu et al., 2001). Los genes de �4-desaturasa clonados codificaron desaturasas de extremo frontal cuyos miembros se caracterizan por la presencia de un dominio semejante a citocromo b5 N terminal (Napier et al., 1999; Sayanova y Napier, 2004).

Aislamiento de un fragmento génico de un gen de �4-desaturasa de P. salina

La comparación de �4-desaturasas de musgo y microalga conocidas reveló varios restos conservados incluyendo un resto HPGG (SEQ ID NO:52) en un dominio semejante a citocromo b5 y tres restos de caja de histidina que se presume que se requieren para la actividad. Se diseñaron nuevos cebadores degenerados de PCR PavD4Des-F3 (5'-AGCACGACGSSARCCACGGCG-3') (SEQ ID NO:53) y PavD4Des-R3 (5'-GTGGTGCAYCABCACGTGCT-3') (SEQ ID NO:54) correspondientes a la secuencia de aminoácidos conservada de la caja de histidina I y complementarios a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la caja de histidina II, respectivamente, para amplificar la región correspondiente de los genes de desaturasa de P. salina , particularmente un gen de �4-desaturasa. El uso de cebadores de PCR degenerados correspondientes a las regiones de caja de histidina I y caja de histidina II de �4-desaturasa no se ha informado anteriormente.

Las reacciones de amplificación por PCR usando estos cebadores se llevaron a cabo usando ADNc de primera cadena de P. salina como molde con ciclado de 95 °C, 5min durante 1 ciclo, 94 °C 30 seg, 57 °C 30 seg, 72 °C 30 seg durante 35 ciclos, y 72 °C 5 min durante 1 ciclo. Los productos de PCR se clonaron en vectores pGEM-T-easy (Promega), y se determinaron las secuencias de nucleótidos con un secuenciador automático ABI3730 usando un cebador inverso del vector pGEM-Teasy. Entre los 14 clones secuenciados, tres clones mostraron homología con genes de �4-desaturasa. Dos de estos tres clones están truncados en un extremo de cebador. La secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc del tercero, clon 1803, se proporciona como SEQ ID NO: 11.

La secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:11 se usó para buscar en la base de datos de secuencia de proteína NCBI usando el software BLASTX. Los resultados indicaron que esta secuencia era homóloga a �4desaturasas conocidas. La secuencia de aminoácidos del fragmento génico de P. salina mostró 65 %, 49 %, 46 % y 46 % de identidad con la de �4-desaturasas de P. lutheri, Thraustochytrium sp. ATCC21685, Thraustochytrium aureum y Euglena gracilis, respectivamente.

Aislamiento de un de �4-desaturasa de longitud completa

El inserto del clon 1803 se escindió, y se usó como sonda para aislar ADNc de longitud completa correspondientes al posible fragmento génico de �4-desaturasa. Aproximadamente 750.000 pfu de la biblioteca de ADNc de P. salina se cribaron a astringencia alta. La hibridación se realizó a 60 °C toda la noche y el lavado se hizo con 2xSSC/0,1 %SDS 30min a 65 °C y con 0,2xSSC/0,1 %SDS 30min a 65 °C. Dieciocho clones que hibridaban se aislaron y el cribado secundario con seis clones se realizó en las mismas condiciones de hibridación. Se aislaron placas únicas del cribado secundario de estos seis clones. Los plásmidos de cinco placas únicas se escindieron y se determinaron las secuencias de nucleótidos de los insertos con un secuenciador automático ABI 3730 con cebadores inversos y directos del vector. Los resultados de la secuenciación mostraron que cuatro clones contenían cada uno ADNc de

�4-desaturasa de aproximadamente 1,7kb de longitud, cada uno con la misma secuencia codificadora y cada uno aparentemente de longitud completa. Se diferenciaban ligeramente en la longitud de los UTR 5' y 3' aunque contenían regiones codificadoras de proteína idénticas. La secuencia de ADNc del ADNc más largo de �4desaturasa de P. salina se proporciona como SEQ ID NO: 13, y la proteína codificada como SEQ ID NO:4.

El ADNc de longitud completa tenía una longitud de 1.687 nucleótidos y tenía una región codificadora que codificaba 447 aminoácidos. La �4-desaturasa de Pavlova salina mostró todos los restos conservados típicos de 'desaturasas de extremo frontal' incluyendo el dominio semejante a citocromo b5 N-terminal y tres restos ricos en histidina conservados. La comparación de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos con otros genes de �4-desaturasa mostró que el mayor grado de homología fue para la �4-desaturasa de P. lutheri (No. de Registro AY332747), que fue 69,4 % idéntica en la secuencia de nucleótidos sobre la región codificadora de la proteína, y 67,2 % idéntica en la secuencia de aminoácidos.

Demostración de actividad enzimática del de �4-desaturasa de Pavlova salina

Un fragmento de ADN que incluía la región codificadora de ADNc de �4-desaturasa de Pavlova salina se escindió como un fragmento de ADNc EcoRI-SalI y se insertó en el vector de expresión de levadura pYES2 usando los sitios EcoRI y XhoI. El plásmido resultante se transformó en células de levadura. Los transformantes se crecieron en medio YMM y el gen se indujo por la adición de galactosa, en presencia de ácidos grasos ω6y ω3 añadidos (exógenos) con el fin de demostrar actividad enzimática y el rango de sustratos sobre el que podría actuar el gen expresado. Los ácidos grasos 22:5ω3 (DPA, 1,0mM), 20:4n-3 (ETA, 1,0mM), 22:4ω6 (DTAG, 1,0 mM) y 20:4ω6 (ARA, 1,0mM) se añadieron cada uno separadamente al medio. Después de 72 horas de incubación, las células se

recogieron y los análisis de ácidos grasos se realizaron por cromatografía gas-líquida (GC) capilar como se describe en el Ejemplo 1. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9. Alimentación de PUFA en levadura que muestra la actividad del gen delta-4 desaturasa.

Ácido graso exógeno añadido al medio de crecimiento

Composición de ácidos grasos

(% de ácido graso total): 22:4ω6 22:5ω3

14:0: 0,63 0,35

15:0: 0,06 0,06

16:1ω7c: 43,45 40,52

16:1ω5: 0,20 0,13

16:0: 18,06 15,42

17:1ω8: 0,08 0,09

17:0: 0,08 -

18:1ω9: 26,73 30,07

18:1ω7 (principal) y 18:3ω3: 1,43 1,61

18:1ω5c: 0,02 tr

18:0: 7,25 8,87

20:5ω3: 0,40 0,62

20:1ω9/ ω11: 0,03 tr

20:0: 0,08 0,09

22:5ω6: 0,03 0,00

22:6ω3: - 0,04

22:4ω6: 0,97 -

22:5ω3: 0,00 1,66

22:0: 0,06 0,06

24:1ω7: 0,31 0,37

24:0: 0,12 0,04

Suma: 100,00 % 100,00 %

Ejemplo 11. Expresión del Gen de �4-desaturasa de P. salina en Células de Planta y Producción de DHA

Esto mostró que el gen clonado codificaba una �4-desaturasa que fue capaz de desaturar tanto C22:4ω6 (3,0 % conversión en 22:5ω6) como C22:5ω3 (2,4 % conversión en 22:6ω3) en la posición �4. La enzima no mostró ninguna actividad de �5 desaturación cuando los transformantes de levadura se alimentaron con C20:3ω6o C20:4ω3.

Para demostrar la actividad del gen de �4-desaturasa en células de planta, la región codificadora puede expresarse bien separadamente para permitir la conversión de DPA en DHA, o en el contexto de otros genes de síntesis de LC-PUFA tal como, por ejemplo, un gen de �5-elongasa para la conversión de EPA en DHA. Para la expresión como un gen separado, la región codificadora de �4-desaturasa puede escindirse como un fragmento BamHI-SalIe insertarse entre un promotor específico de semilla y una secuencia de poliadenilación/terminación de la transcripción, tal como, por ejemplo, en el vector pGNAP (Lee et al., 1998), de manera que se expresa bajo el control del promotor específico de semilla. El casete de expresión puede insertarse en un vector binario e introducirse en células de planta. El material de planta usado para la transformación puede ser bien plantas no transformadas o plantas transformadas que contienen una construcción que expresaba el gen de �5/�6-desaturasa dual de pez cebra y el gen de elongasa de C. elegans cada uno bajo el control de un promotor específico de semilla (Ejemplo 5). Arabidopsis transgénicos que contienen la última, construcción génica dual produjeron con éxito EPA y DPA en semillas, y la combinación con el gen �4-desaturasa permitiría la conversión del DPA en DHA en las células de planta, como se demuestra más adelante.

Para demostrar co-expresión de un gen de �5-elongasa con el gen de �4-desaturasa en células recombinantes, particularmente células de planta, y permitir la producción de DHA, los genes de �4-desaturasa y �5-elongasa de P. salina (Ejemplo 8) se combinaron en un vector binario como sigue. Ambas regiones codificadoras se pusieron bajo el control de promotores específicos de semilla (napin) y terminadores nos3', y la construcción de vector binario tenía un gen de resistencia a kanamicina como un marcador seleccionable para la selección en células de planta. La región codificadora del gen de �5-elongasa se escindió de su clon de ADNc como un fragmento PstI-SacII yse insertó en un plásmido intermedio (pXZP143) entre el promotor y el terminador, resultando en el plásmido pXZP144. La región codificadora del gen de �4-desaturasa se escindió de su clon de ADNc como un fragmento BamHI-SalIy se insertó en el plásmido pXZP143 entre el promotor y el terminador de la transcripción nos 3', resultando en el plásmido pXZP150. Estos dos casetes de expresión se combinaron en un vector insertando el fragmento HindIII-ApaI de pXZP144 (que contiene promotor-Elo1-nos3') entre los sitios StuIy ApaI de pXZP150, resultando en el plásmido pXZP191. El fragmento HindIII-StuI de pXZP191 que contiene ambos casetes de expresión se clonó en el vector binario pXZP330, un derivado de pBI121, resultando en el vector de expresión en plantas pXZP355. Este vector se muestra esquemáticamente en la Figura 7.

Transformación de plantas

Los genes de �5-elongasa y �4-desaturasa en pXZP355 se introdujeron por el método de transformación por inmersión floral mediado por Agrobacterium en las plantas de Arabidopsis designadas DO11 (Ejemplo 5) que ya eran transgénicas para los genes de �5/�6 desaturasa bifuncional de pez cebra y �5/�6 elongasa bifuncional de C. elegans. Como estos transgenes estaban ligados con un gen de resistencia a higromicina como un gen marcador seleccionable, la transformación secundaria con pXZP355 usó una selección de resistencia a kanamicina, distinguiendo así los dos conjuntos de transgenes. Se obtienen cinco plantas transgénicas, designadas plantas "DW". Como las plantas DO11 se segregaron para los genes de �5/�6 desaturasa bifuncional de pez cebra y �5/�6 elongasa bifuncional de C. elegans, se esperaba que algunas de las plantas transformadas fueran heterocigotas para estos genes, mientras se esperaba que otras fueran homocigotas. La semilla (semilla T2) de las cinco plantas transformadas se analizaron y mostraron que contenían hasta al menos 0,1 % DPA y hasta al menos 0,5 % DHA en los aceites de la semilla. Los datos se presentan para dos líneas en la Tabla 10. El análisis, por espectrometría de masas (GC-MS), de los ácidos grasos en los picos identificados como EPA y DHA del análisis GC probó que eran de hecho EPA y DHA (Figura 8).

El análisis de ácidos grasos del aceite de semilla T2 demostró que se había producido una conversión significativa de EPA en DHA en las líneas DW2 y DW5, teniendo 0,2 % y 0,5 % DHA, respectivamente. El examen de las eficiencias enzimáticas en la planta DW5 que contiene el mayor nivel de DHA mostró que 17 % del EPA producido en su semilla se elongó a DPA por la �5-elongasa de P. salina, y más del 80 % de este DPA se convirtió en DHA por la �4-desaturasa de P. salina. Como los genes de �5-elongasa y �4-desaturasa se segregaban en la semilla T2, los datos de composición de ácidos grasos representaron un promedio de genotipos combinados nulos, heterocigoto y homocigoto para estos genes. Se espera que los niveles de DHA en las líneas de progenie de DW5 serán mayores en semilla que es uniformemente homocigota para estos genes.

TABLA 10. Composición de ácidos grasos (% de ácidos grasos totales) de aceites de semilla de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) y derivados que portan construcciones génicas de EPA y DHA -síntesis de EPA, DPA y DHA en 5

semillas transgénicas.

Tipo salvaje: Construcción DO11 + DHA

Ácido graso

Columbia: DW2 DW5

Ácidos grasos habituales: Total Total TAG PL

16:0: 7,2 6,7 6,1 5,5 12,5

18:0: 2,9 3,8 4,4 4,3 4,5

18:1�: 9 20,0 20,6 16,6 18,9 13,7

18:2�: 9,12 (LA) 27,5 26,0 25,9 25,5 33,1

18:3�: 9,12,15 (ALA) 15,1 13,2 15,0 13,6 15,1

20:0: 2,2 2,1 1,8 1,9 0,6

20:1�: 11 19,8 14,8 10,5 10,5 3,2

20:1�: 13 2,2 3,0 4,2 4,8 1,4

20:2�: 11,14 0,1 1,7 3,5 3,8 3,7

22:1�: 13 1,5 1,4 1,0 0,3 0,4

Otros menores: 1,5 2,9 2,7 2,4 3,8

Total: 100,0 96,0 91,7 91,5 92,0

Nuevo ω6-PUFA

18:3�: 6,9,12 (GLA) 0 0,2 0,4 0,4 0,2

20:3�: 8,11,14 0 0,8 1,5 1,5 1,7

20:4�: 5,8,11,14 (ARA) 0 0,4 1,0 1,1 1,2

22:4�: 7,10,13,16 0 0 0 0 0,2

22:5�: 4,7,10,13,16 0 0 0,1 0,1 0,1

Total: 0 1,4 3,0 3,1 3,4

Nuevo ω3-PUFA

18:4�: 6,9,12,15 (SDA) 0 0,7 1,5 1,6 0,5

20:4�: 8,11,14,17 0 0,5 0,8 0,7 0,9

20:5�: 5,8,11,14,17 (EPA) 0 1,1 2,4 2,5 2,3

22:5�: 7,10,13,16,19 (DPA) 0 0,1 0,1 0,2 0,7

22:6�: 4,7,10,13,16,19 (DHA) 0 0,2 0,5 0,4 0,2

Ácido graso: Tipo salvaje Columbia DW2 Construcción DO11 + DHA DW5

Total Ácidos grasos totales: 0 100,0 2,6 100,0 5,3 100,0 5,4 100,0 4,6 100,0

MUFAa Total C18-PUFA b Total: 41,3 42,6 36,8 39,2 28,1 40,9 29,7 39,1 17,3 48,2

Nuevo PUFAc Total: 0 4,0 8,3 8,5 8,0

13)

a Total de 18:1�9 y LC-MUFA derivado (=18:1�9 + 20:1�11 + 22:1�

b 18:2 + 18:3

c Total de todos los PUFA nuevos ω6y ω3

La germinación de 50 semillas T2 de cada uno de DW2 y DW5 en medio que contenía higromicina mostró que la planta DW5 T1 era homocigota (50/50) para los genes de �5/�6 desaturasa bifuncional y �5/�6 elongasa bifuncional, mientras la semilla DW2 se segregaba en una proporción 3:1 (resistente: susceptible) para estos genes y DW2 era por lo tanto heterocigota. Esto fue consistente con los mayores niveles de EPA observados en las semillas DW5 comparado con las semillas DW2, y explicó el nivel incrementado de DHA producido en las semillas homocigotas para estos transgenes. Esto demuestra adicionalmente la conveniencia de semillas que son homocigotas para el rasgo.

También observamos las consecuencias de la síntesis de LC-PUFA en el perfil de ácidos grasos total en estas semillas. Aunque observamos acumulación de nuevos PUFA ω6y ω3 (es decir, productos de �6-desaturación) a niveles de más de 8 % en semillas DW5, estas semillas tenían niveles de los ácidos grasos precursores LA y ALA que eran casi iguales que en las semillas de tipo salvaje. En lugar de deplecionar LA y ALA, los niveles de ácido graso monoinsaturado C18:1�9 y sus derivados elongados (20:1�11 y 22:1�13) se redujeron significativamente. Así, parecía que la conversión de C18-PUFA en LC-PUFA resultaba en la conversión incrementada de 18:1 en LA y ALA, y una reducción correspondiente en 18:1 disponible para la elongación.

El vector de expresión de plantas pXZP355 que contiene los genes de �4-desaturasa y �5-elongasa también se usó para introducir los genes en plantas de la línea homocigota DO11-5, y se obtuvieron 20 plantas transgénicas T1. Los niveles de DHA y DPA en semillas T2 de estas plantas fueron similares a los observados en las semillas de DW5. También se observaron reducciones en los niveles de ácidos grasos monoinsaturados en estas semillas.

El fraccionamiento de los lípidos totales de las semillas de las semillas DW5 reveló que estaban comprendidos por 89 % TAG y 11 % lípidos polares (compuestos en su mayor parte por fosfolípidos). Además, el análisis de ácidos grasos de la fracción TAG de las semillas DW5 mostró que los recién sintetizados EPA y DHA estaban siendo incorporados en el aceite de la semilla y que la proporción de EPA y DHA en la composición de ácidos grasos de los lípidos totales de las semillas reflejaba esencialmente el de la fracción TAG (Tabla 10).

Ejemplo 12. Aislamiento de Genes Homólogos de Otras Fuentes

Los homólogos de los genes de desaturasa y elongasa tales como los genes de P. salina descritos en la presente memoria pueden detectarse fácilmente en otras microalgas u otras fuentes por hibridación con sondas marcadas derivadas de los genes, particularmente con partes o todas las regiones codificadoras, por ejemplo por métodos de hibridación por transferencia Southern o hibridación en mancha. Los genes homólogos pueden aislarse de bibliotecas genómicas o de ADNc de dichos organismos, o por amplificación por PCR usando cebadores correspondientes a regiones conservadas. De manera similar, los homólogos de desaturasas de vertebrados con alta afinidad para Acil-CoA y/o desaturasas bifuncionales de peces de agua dulce pueden aislarse por medios similares usando sondas para la �5/�6 desaturasa de pez cebra.

Hibridaciones Sobre Mancha

El ADN genómico de seis especies de microalgas se aisló usando un kit DNAeasy (Qiagen) usando las instrucciones del proveedor, y se usó en análisis de hibridación sobre mancha para la identificación de genes homólogos

implicados en la síntesis de LC-PUFA en estas especies. Esto también permitió la evaluación de la divergencia de las secuencias de dichos genes comparado con los aislados de Pavlova salina. Las especies de microalgas examinadas en este análisis fueron de los géneros Melosira, Rhodomonas, Heterosigma, Nannochloropsis, Heterocapsa y Tetraselmis. Se identificaron según Hasle, G. R. y Syvertsen, E. E. 1996 Dinoflagellates. En: Tomas,

C. R.(ed.) Identifying Marine Phytoplankton. Academic Press, San Diego, CA. p 531-532. Estas microalgas se incluyeron en el análisis tomando como base la presencia de EPA, DHA, o ambos cuando se cultivan in vitro (Ejemplo 2).

El ADN genómico (aproximadamente 100µg) aislado de cada una de las microalgas se depositó en tiras de membrana Hybond N+ (Amersham). Después de secar al aire, cada tira de membrana se puso en una capa de papel de filtro 3MM saturado con 0,4 M NaOH durante 20 min, para la desnaturalización del ADN, y se lavó brevemente en solución 2x SSC. Las tiras de membrana se secaron al aire y el ADN se entrecruzó a las membranas bajo luz UV. Las sondas marcadas con nucleótidos 32P y que consistían en las regiones codificadoras sin las regiones no traducidas de varios genes derivados de Pavlova, incluyendo las �8, �5y �4 desaturasas y �9y �5 elongasas, se prepararon e hibridaron con cada tira de membrana/ADN sobre mancha. Las membranas se hibridaron con cada sonda toda la noche en tampón que contenía 50 mM Tris-HCl, pH7,5, 1M NaCl, 50 % formamida, 10x solución de Denhardt, 10 % sulfato de dextrano, 1 %SDS, 0,1 % pirofosfato de sodio, y 0,1 mg/ml ADN de esperma de arenque, a 42 °C, se lavaron tres veces en una solución que contenía 2x SSC, 0,5 % SDS a 50 °C durante 15 min cada uno (lavado de astringencia baja en este experimento) o un lavado de astringencia alta en 0,2x SSC, 0,5 % SDS a 65 °C durante 20 minutos cada uno.

Es muy conocido que la astringencia de las condiciones de lavado empleadas en transferencia de ADN/hibridaciones puede revelar información útil respecto a la relación entre secuencias de genes. Así, las hibridaciones mantenidas cuando se someten a un lavado con astringencia alta indican un nivel alto de relación entre las secuencias (por ejemplo, 80 % o más de identidad de nucleótidos sobre al menos 100-200 nucleótidos), mientras las hibridaciones mantenidas sólo durante lavados con astringencia baja indican un grado relativamente menor de conservación de ADN entre genes (por ejemplo, 60 % o más de identidad de nucleótidos sobre al menos 200 nucleótidos).

Las transferencias sobre mancha hibridadas se expusieron a película de rayos X BioMax (Kodak), y los autorradiogramas se muestran en la Figura 9. Los autorradiogramas revelan la presencia de homólogos de los genes LC-PUFA de P. salina en estas especies, y revelan además un rango de homologías basado en los diferentes niveles de hibridación observados en condiciones de astringencia alta y baja. Parecía que algunas de las especies de microalgas examinadas tenían genes de LC-PUFA que se podían diferenciar sustancialmente de los genes de P. salina, mientras otros estaban más relacionados en secuencia. Por ejemplo, resultó que los genes de Tetraselmis sp eran muy similares a las �4-y �5-desaturasas y la �5 elongasa de Pavlova salina tomando como base la fuerza de las hibridaciones. Por el contrario, resultó que todos los genes de LC-PUFA identificados en Melosira sp tenían grados menores de similitud con los genes de P. salina.

Aislamiento de un gen LC-PUFA elongasa de Heterocapsa sp.

Las Heterocapsa spp. tales como Heterocapsa niei en la colección CSIRO (Ejemplo 2) son dinoflagelados que se identificaron como productores de LC-PUFA incluyendo EPA y DHA. Para ejemplificar el aislamiento de los genes de síntesis de LC-PUFA de estos dinoflagelados, se purificó el ADN de células de una cepa de Heterocapsa niei aislada originalmente en Port Hacking, NSW, Australia en 1977. El ADN se aisló usando un kit DNAeasy (Qiagen) usando las instrucciones del proveedor. Tomando como base alineamientos publicados de secuencias de aminoácidos múltiples para elongasas de ácidos grasos (Qi et al., 2002; Parker-Barnes et al., 2000), se identificaron los bloques de aminoácidos consenso FLHXYH (SEQ ID NO:48) y MYXYYF (SEQ ID NO:49) y se sintetizaron los cebadores degenerados correspondientes que codificaban estas secuencias 5'-CAGGATCCTTYYTNCATNNNTAYCA-3' (SEQ ID NO:50) (con sentido) o complementarios a estas secuencias 5'-GATCTAGARAARTARTANNNRTACAT-3' (SEQ ID NO:51) (antisentido). Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo en volúmenes de reacción de 20µL con 20pmoles de cada cebador, 200ng de ADN genómico de Heterocapsa sp. y ADN polimerasa Hotstar Taq (Qiagen) con componentes de tampón y nucleótidos como se especifica por el proveedor. Las reacciones se ciclaron como sigue: 1 ciclo de 95 °C durante 15 minutos, 5 ciclos de 95 °C, 1min, 38 °C, 1min, 72 °C, 1min, 35 ciclos de 95 °C, 35 seg, 52 °C, 30 seg, 72 °C, 1min, 1 ciclo de 72 °C, 10min. Se generaron fragmentos de aproximadamente 350pb y se ligaron en pGEM-Teasy para análisis de secuencia.

De los ocho clones aislados, dos clones idénticos tenían secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificados con similitud con regiones de elongasas conocidas. Éstos se designaron Het350Elo, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se proporcionan como SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO:80 respectivamente. El análisis BLAST y la presencia de un codón de parada en marco sugirió la presencia de un intrón entre aproximadamente las posiciones 33 y 211.

Las mejores concordancias con la secuencia de aminoácidos fueron secuencias de elongasa de animales, véase por ejemplo Meyer et al. (2004), indicando que la secuencia de gen de Heterocapsa aislado estaba implicada probablemente en la elongación de sustratos ácido graso C 18 y C20.

Los clones de longitud completa de la elongasa pueden aislarse fácilmente por cribado de una biblioteca de ADNc de Heterocapsa o por técnicas RACE 5'-y 3', muy conocidas en la técnica.

Construcción de una biblioteca de ADNc de Melosira sp. y secuenciación de EST

El ARNm, para la construcción de una biblioteca de ADNc, se aisló de células de Melosira sp. usando el método siguiente. Se convirtieron en polvo 2 g (peso húmedo) de células de Melosira sp. usando un mortero y pilón en nitrógeno líquido y se esparció lentamente en un vaso de precipitados que contenía 22 ml de tampón de extracción que se agitaba constantemente. A esto, se añadieron 5 % polivinilpirrolidona insoluble, 90mM 2-mercaptoetanol, y 10mM ditioteitol y la mezcla se agitó durante 10 minutos más antes de ser transferida a un tubo Corex™. Se añadieron 18,4 ml de 3M acetato de amonio y se mezcló bien. La muestra se centrifugó a 6.000xg durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y el ácido nucleico se precipitó por la adición de 0,1 volumen de 3M NaAc (pH 5,2) y 0,5 volúmenes de isopropanol frío. Después de 1 hora de incubación a -20 °C, la muestra se centrifugó a 6.000xg durante 30 minutos en un rotor oscilante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de agua y se extrajo con fenol/cloroformo. La capa acuosa se transfirió a un tubo nuevo y los ácidos nucleicos se precipitaron otra vez por la adición de 0,1 volumen 3M NaAc (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol enfriado en hielo. El sedimento se resuspendió en agua, se determinó la concentración de ácido nucleico y el ARNm se aisló usando el sistema Oligotex mRNA (Qiagen).

Se sintetizó ADNc de primera cadena usando un conector-cebador oligo(dT) suministrado por el kit de síntesis ZAPcDNA (Stratagene -cat # 200400) y la transcriptasa inversa SuperscriptIII (Invitrogen). El ADNc de doble cadena se ligó a adaptadores EcoRI y a partir de esto se construyó una biblioteca usando el kit de síntesis ZAP-cDNA descrito en el manual de instrucciones adjunto (Stratagene -cat # 200400). Se obtuvo una biblioteca primaria de 1,4 x 106 unidades formadoras de placa (pfu). El tamaño medio del inserto de los insertos de ADNc en la biblioteca fue 0,9 kilobases tomando como base 47 placas aleatorias y el porcentaje de recombinantes en la biblioteca fue 99 %.

Se realizó una secuenciación de nucleótidos de único paso de 8.684 etiquetas de secuencia expresada (ESTs) con el cebador SK (5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3') (SEQ ID NO:87) usando el sistema ABI BigDye. Las secuencias de 6.750 EST fueron más largas de 400 nucleótidos, mostrando que los insertos tenían al menos ese tamaño. Se identificaron EST que mostraban homología con varias ácido graso desaturasas y una PUFA elongasa por análisis BlastX.

La secuencia de aminoácidos (parcial) (SEQ ID NO:88) codificada por el clon de ADNc Mm301461 mostró 75 % de identidad con la ácido graso elongasa 1 de Thalassiosira pseudonana (No. de Registro AY591337). La secuencia de nucleótidos del clon EST Mm301461 se proporciona como SEQ ID NO:89. El alto grado de identidad de una elongasa conocida hace que sea muy probable que Mm301461 codifique una ácido graso elongasa de Melosira. Las técnicas RACE pueden utilizarse fácilmente para aislar el clon de longitud completa que codifica la elongasa.

Ejemplo 13. Aislamiento de fragmento génico de elongasa semejante a FAE de P. salina

Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios de la biblioteca de ADNc de P. salina por una estrategia EST. En una ronda inicial de secuenciación, se secuenciaron 73 clones. Un clon, designado 11.B1, se identificó como que codificaba una proteína (secuencia parcial) que tenían similitud de secuencia con ácido graso elongasas semejantes a beta ceto-acil sintasa conocida, tomando como base un análisis BLASTX. La secuencia de nucleótidos de 11.B1 desde el extremo 3' se proporciona como (SEQ ID NO:55).

Estas elongasas de planta son diferentes de la elongasa de la clase ELO en que se sabe que están implicadas en la elongación de ácidos grasos C16 a C18 y también en la elongación de ácidos grasos saturados y monoinsaturados de cadena muy larga. El clon 11.B1, representa el primer gen aislado que no es de planta superior en esta clase.

Ejemplo 14. Aislamiento de un Gen que Codifica una �5-Desaturasa de P. salina

Aislamiento fe un fragmento génico de un gen de �5-desaturasa de P. salina

Con el fin de aislar un gen de �5-desaturasa de P. salina, se diseñaron oligonucleótidos para una región conservada de desaturasas. Se prepararon oligonucleótidos designados d5A y d5B mostrados más adelante correspondientes a una secuencia corta de ADN de un gen de �5-desaturasa de Pavlova lutheri. Oligo d5A: 5'-TGGGTTGAGTACTCGGCCAACCACACGACCAACTGCGCGCCCTCGTGGTGGT GCGACTGGTGGATGTCTTACCTCAACTACCAGATCGAGCATCATCTGT-3' (nucleótidos 115-214 de la solicitud de patente internacional publicada como WO03078639-A2, Figura 4a) (SEQ ID NO:56) y oligo d5B: 5'-ATAGTGCAGCCCGTGCTTCTCGAAGAGCGCCTTGACGCGCGGCGCGATCGTC GGGTGGCGGAATTGCGGCATGGACGGGAACAGATGATGCTCGATCTGG-3' (correspondiente al complemento de los nucleótidos 195-294 de WO03078639-A2, Figura 4a) (SEQ ID NO:57). Estos oligonucleótidos se hibridaron y extendieron en una reacción de PCR. El producto de PCR se insertó en el vector pGEM-T Easy y se confirmó la secuencia de nucleótidos.

El fragmento clonado se marcó y se usó como una sonda de hibridación para el cribado de una biblioteca de ADNc de Pavlova salina en condiciones de astringencia moderadamente altas, hibridando a 55 °C toda la noche con una solución de hibridación SSC y lavando las transferencias a 60 °C con 2x SSC/0,1 % SDS tres veces cada una durante 10 minutos. A partir del cribado de aproximadamente 500.000 placas, se aislaron 60 placas que proporcionaron al menos una señal débil de hibridación. Entre 13 clones que se secuenciaron, un clon designado p1918 contenía un ADNc de longitud parcial que codificaba una secuencia de aminoácidos con homología con genes de �5-desaturasa conocidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos era 53 % idéntica a los residuos de aminoácidos 210-430 de la región C-terminal de un gen de �5-desaturasa de Thraustochytrium (No. de Registro AF489588).

Aislamiento de un de �5-desaturasa de longitud completa

La secuencia de longitud parcial en p1918 se usó para diseñar una pareja de cebadores específicos de secuencia, que se usaron en cribado por PCR de las 60 placas aisladas mencionadas anteriormente. Diecinueve de las 60 fueron positivas, teniendo la misma secuencia de ADNc o similar. Uno de los clones que mostró una señal fuerte de hibridación usando la secuencia de longitud parcial como una sonda se usó para determinar la secuencia de longitud completa proporcionada como SEQ ID NO:58, y la secuencia de aminoácidos (longitud de 425 aminoácidos) codificada por ésta se proporciona como SEQ ID NO:60.

La secuencia de aminoácidos se usó para buscar en la base de datos de secuencia de proteína NCBI usando el software BLASTX. Los resultados indicaron que esta secuencia era homóloga a �5-desaturasas conocidas. La secuencia de aminoácidos de la proteína de P. salina mostró 81 % de identidad con una secuencia de P. lutheri de actividad indefinida en WO03/078639-A2, y 50 % de identidad con una �5-desaturasa de Thraustochytrium (No. de Registro AF489588). La �5-desaturasa de Pavlova salina mostró todos los restos conservados típicos de 'desaturasas de extremo frontal' incluyendo el dominio semejante a citocromo b5 N-terminal y tres restos ricos en histidina conservados.

Co-expresión de los genes de �9 elongasa, �8-desaturasa y �5-desaturasa en células transformadas (comparativo)

La co-expresión del gen de �5-desaturasa junto con el gen de �9 elongasa (Elo2, Ejemplo 7) y el gen de �8desaturasa (Ejemplo 6) se consiguió en células como sigue. Se construyó el vector de expresión de planta pXZP354 que contenía los tres genes, cada uno de P. salina, y cada uno expresado a partir del promotor napin específico de semilla. La región codificadora de �8-desaturasa de P. salina del clon de ADNc (anterior) se insertó en primer lugar como un fragmento BamHI-NcoI en pXZP143 entre el promotor napin específico de semilla y el terminador Nos, resultando en el plásmido pXZP146. El gen de �9-elongasa de P. salina se insertó asimismo, como un fragmento PstI-XhoI a partir de su clon de ADNc, en pXZP143 resultando en el plásmido pXZP143-Elo2. El gen de �5desaturasa de P. salina también se insertó, como un fragmento PstI-BssHII a partir de su clon de ADNc, en pXZP143, resultando en el plásmido pXZP147. Después, el fragmento HindIII-ApaI que contenía el casete de expresión de �9-elongasa de pXZP143-Elo2 se insertó en pXZP146 aguas abajo del casete de expresión de �8desaturasa, resultando en el plásmido pXZP148. El fragmento HindIII-ApaI que contenía el casete de expresión de �5-desaturasa de pXZP147 se insertó en pXZP148 aguas abajo de los casetes de expresión de �8-desaturasa y

�9-elongasa, resultando en el plásmido pXZP149. Después, como una etapa final, el fragmento HindIII-ApaI que contenía los tres genes de pXZP149 se insertó en un derivado del vector binario pART27, que contenía un marcador de selección de gen de resistencia a higromicina, resultando en el plásmido de expresión de planta pXZP354.

El plásmido pXZP354 se introdujo en Arabidopsis por el método de inmersión floral mediado por Agrobacterium, bien en la presencia simultánea o la ausencia del plásmido de expresión pXZP355 (Ejemplo 11) que contenía los genes de �5-elongasa y �4-desaturasa de P. salina. La co-transformación de los vectores pudo conseguirse ya que contenían genes marcadores seleccionables diferentes. En el último caso, las plantas transgénicas (designadas plantas "DR") se seleccionaron usando higromicina como agente selectivo, mientras en el primer caso, las plantas (plantas "DU") se seleccionaron tanto con higromicina como kanamicina.

Se obtuvieron veintiuna plantas DR (plantas T1). El análisis de los ácidos graso del aceite de la semilla de semillas T2 de diez de estas plantas mostró la presencia de niveles bajos de 20:2ω (EDA), 20:3ω6 (DGLA) y 20:4ω6 (ARA), incluyendo hasta 0,4 % ARA. El análisis de ácidos grasos del aceite de semillas de semillas T2 de siete plantas DU mostró niveles similares de estos ácidos grasos. A partir de las proporciones relativas de estos ácidos grasos, se concluyó que los genes de �5-desaturasa y �8-desaturasa estaban funcionando eficientemente en semillas transformadas con pXZP354 pero que la actividad del gen de �9 elongasa era subóptima. Es probable que el acortamiento de la región codificadora en el extremo N-terminal, para iniciar la traducción en la posición de aminoácidos 11 ó 29 de SEQ ID NO:3 (Ejemplo 9) (véase SEQ ID NO's 85 y 86) mejorará el nivel de actividad del gen de �9 elongasa. La expresión de uno o dos de los genes de promotores específicos de semilla distintos del promotor napin, de manera que no todos se expresan a partir del promotor napin, también se espera que mejore el nivel de expresión del gen de �9 elongasa.

Ejemplo 15. Aislamiento de un Gen que Codifica una �6-desaturasa de Echium plantagineum

Algunas especies de plantas tales como onagra común (Oenothera biennis), borraja común (Borago officinalis), grosella negra (Ribes nigrum), y algunas especies de Echium que pertenecen a la familia Boragenacae contienen los ácidos grasos C18 ω6-y ω3-desaturados, ácido γ-linolénico (18:3ω6, GLA) y ácido estearidónico (18:4ω3, SDA) en los lípidos de sus hojas y TAG de semillas (Guil-Guerrero et al., 2000). GLA y SDA son reconocidos como ácidos grasos beneficiosos en la nutrición humana. La primera etapa en la síntesis de LC-PUFA es una �6-desaturación. GLA se sintetiza por una �6-desaturasa que introduce un enlace doble en la posición �6 de LA. La misma enzima también es capaz de introducir un enlace doble en la posición �6 de ALA, produciendo SDA. Los genes de �6desaturasa se han clonado a partir de miembros de Boraginacae, como borraja (Sayanova et al., 1997) y dos especies de Echium (Garcia-Maroto et al., 2002).

Echium plantagineum es una nativa invernal anual de la Europa Mediterránea y África del Norte. Su aceite de semilla no es habitual ya que tiene una proporción única de ácidos grasos ω3y ω6 y contiene grandes cantidades de GLA (9,2 %) y SDA (12,9 %) (Guil-Guerrero et al., 2000), lo que sugiere la presencia de actividad �6-desaturasa implicada en la desaturación de ácidos grasos tanto ω3 como ω6 en las semillas de esta planta.

Clonación del gen EplD6Des de E. platangineum

Se usaron cebadores degenerados con sitios de restricción XbaIo SacI integrados correspondientes a las secuencias de aminoácidos N-y C-terminal MANAIKKY (SEQ ID NO: 61) y EALNTHG (SEQ ID NO: 62) de �6desaturasas conocidas de Echium pitardii y Echium gentianoides (Garcia-Maroto et al., 2002) para la amplificación por RT-PCR de secuencias de �6-desaturasa de E. platangineum usando una ADN polimerasa correctora de errores Pfu Turbo® (Stratagene). El producto de amplificación de PCR de 1,35kb se insertó en pBluescript SK(+) en los sitios XbaIy SacI para generar el plásmido pXZP106. Se determinó la secuencia de nucleótidos del inserto (SEQ ID NO:63). Comprendía un marco de lectura abierto que codificaba un polipéptido de 438 residuos de aminoácidos (SEQ ID NO:64) que tenía un alto grado de homología con otras �6-y �8-desaturasas señaladas de E. gentianoides (SEQ ID NO:65), E. pitardii (SEQ ID NO:66), Borago officinalis (SEQ ID NO:67 y 68), Helianthus annuus (SEQ ID NO:69) y Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:70 y SEQ ID NO:71) (Figura 10). Tiene un dominio citocromo b5 en el extremo N, incluyendo el resto HPGG (SEQ ID NO:72) en la región de unión hemo, como se ha informado para otras �6-y �8-desaturasas (Sayanova et al. 1997; Napier et al. 1999). Además, la �6 desaturasa de E. plantagineum contiene tres cajas de histidina conservadas, incluyendo la tercera caja de histidina que contiene la firma de resto QXXHH (SEQ ID NO:73) presente en la mayoría de las desaturasas 'de extremo frontal' (Figura 10) (Napier et al., 1999). El análisis de grupos incluyendo miembros representativos de �6y �8 desaturasas mostró un agrupamiento claro del gen clonado con otras �6 desaturasas especialmente las de especies de Echium.

Expresión heteróloga del gen de �6-desaturasa de E. plantagineum en levadura

Los experimentos de expresión en levadura se llevaron a cabo para confirmar que el gen clonado de E. platangineum codificaba una enzima �6-desaturasa. El fragmento génico se insertó como un fragmento XbaI-SacI en los sitios SmaI-SacI del vector de expresión de levadura pSOS (Stratagene) que contiene el promotor constitutivo ADH1, resultando en el plásmido pXZP271. Éste se transformó en la cepa de levadura S288Cα por un método de choque con calor y las colonias transformantes se seleccionaron plaqueando en placas con medio mínimo. Para el análisis de la actividad enzimática, se crecieron 2mL de cultivos clonales de levadura hasta una D.O.600 de 1,0 en medio mínimo de levadura en presencia de 0,1 % NP-40 a 30 °C con agitación. Los ácidos grasos precursores libres, bien ácido linoleico o linolénico como preparaciones madre 25mM en etanol, se añadieron de manera que la concentración final de ácido graso fue 0,5mM. Los cultivos se transfirieron a 20 °C y se crecieron durante 2-3 días con agitación. Las células de levadura se recogieron por centrifugación repetida y se lavaron en primer lugar con 0,1 % NP-40, después 0,05 %NP-40 y finalmente con agua. Los ácidos grasos se extrajeron y se analizaron. Las identidades de los picos de ácidos grasos se confirmaron por GC-MS.

Las células de levadura transgénicas que expresan el EplD6Des de Echium fueron capaces de convertir LA y ALA en GLA y SDA, respectivamente. Aproximadamente 2,9 % de LA se convirtió en GLA y 2,3 % de ALA se convirtió en SDA, confirmando la actividad �6-desaturasa codificada por el gen clonado.

Expresión funcional del gen de �6-desaturasa de E. platangineum en tabaco transgénico

Con el fin de demostrar que el gen EplD6Des podría conferir la síntesis de ácidos grasos �6 desaturados en plantas transgénicas, el gen se expresó en plantas de tabaco. Para hacer esto, el fragmento génico se escindió de pXZP106 como un fragmento XbaI-SacI y se clonó en el vector de expresión de planta pBI121 (Clonetech) en los sitios XbaIy SacI bajo el control de un promotor constitutivo 35S CaMV, para generar el plásmido de expresión de planta pXZP341. Éste se introdujo en Agrobacterium tumefaciens AGL1, y se usó para la transformación de tejido de planta de tabaco W38, por selección con kanamicina.

El análisis de hibridación por transferencia Northern de plantas transformadas se llevó a cabo para detectar la expresión del gen introducido, y los ácidos grasos totales presentes en los lípidos de las hojas de tabaco W38 de tipo salvaje y plantas de tabaco transformadas se analizó como se ha descrito anteriormente. Las plantas no transformadas contenían cantidades apreciables de LA (21 % de ácidos grasos totales) y ALA (37 % de ácidos grasos totales) en los lípidos de las hojas. Como se esperaba, no se detectó GLA ni SDA, productos de �6desaturación, en la hoja no transformada. Además, las plantas de tabaco transgénicas transformadas con el vector pBI121 tenían una composición similar de ácidos grasos en las hojas que las plantas W38 no transformadas. Por el contrario, las hojas de plantas de tabaco transformadas que expresaban el gen EplD6Des mostraron la presencia de

picos adicionales con tiempos de retención correspondientes a GLA y SDA. La identidad de los picos de GLA y SDA se confirmó por GC-MS. De forma importante, los ácidos grasos de las hojas de las plantas que expresaban el gen EplD6Des contenían de forma consistente aproximadamente una concentración dos veces mayor de GLA que de SDA incluso cuando los ácidos grasos �6-desaturados totales representaban hasta 30 % de los ácidos grasos totales en los lípidos de sus hojas (Tabla 11).

TABLA 11. Composición de ácidos grasos en lípidos de hojas de tabaco transgénico (%).

Productos �6-desaturados

Planta: 16:0 18:0 18:1 18:2 GLA 18:3 SDA

totales

W38: 21,78 5,50 2,44 21,21 - 37,62 - -

ET27-1: 20,33 1,98 1,25 10,23 10,22 41,10 6,35 16,57

ET27-2: 18,03 1,79 1,58 14,42 1,47 53,85 0,48 1,95

ET27-4: 19,87 1,90 1,35 7,60 20,68 29,38 9,38 30,07

ET27-5: 15,43 2,38 3,24 11,00 0,84 49,60 0,51 1,35

ET27-6: 19,85 2,05 1,35 11,12 4,54 50,45 2,19 6,73

ET27-8: 19,87 2,86 2,55 11,71 17,02 27,76 7,76 24,78

ET27-11: 17,78 3,40 2,24 12,62 1,11 51,56 0,21 1,32

ET27-12: 16,84 2,16 1,75 13,49 2,71 50,80 1,15 3,86

El análisis Northern de múltiples líneas de tabaco transgénico independientes mostró niveles variables del transcrito EplD6Des que generalmente se correlacionaban con los niveles de productos �6-desaturados sintetizados en las plantas. Por ejemplo, la planta transgénica ET27-2 que contenía niveles bajos del transcrito EplD6Des sintetizó sólo 1,95 % de los lípidos totales de sus hojas como ácidos grasos �6-desaturados. Por otra parte, la planta transgénica ET27-4 contenía niveles significativamente mayores del transcrito EplD6Des y también tenía una proporción mucho mayor (30 %) de ácidos grasos �6-desaturados en los lípidos de sus hojas.

El análisis de las plantas de tabaco individuales mostró que, sin excepción, GLA estaba presente a una concentración mayor que SDA aunque una concentración mayor de ALA que de LA estaba presente en las plantas no transformadas. Por el contrario, la expresión de EplD6Des en levadura había resultado en niveles aproximadamente equivalentes de conversión de LA en GLA y ALA en SDA. Las semillas de Echium plantagineum, por otra parte, contienen niveles mayores de SDA que de GLA. EplD6Des lleva a cabo probablemente su desaturación in vivo en las semillas de Echium plantagineum sobre LA y ALA esterificados a fosfatidilcolina (PC) (Jones y Harwood 1980). En el ensayo en hojas de tabaco, la enzima lo más probablemente desatura LA y ALA esterificados al lípido monogalactosildiacilglierol (MGDG) del cloroplasto (Browse y Slack, 1981). En el ensayo de levadura, los precursores de ácidos grasos libres LA y ALA añadidos al medio lo más probablemente entran en el combinado de acil-CoA y están disponibles para que actúe sobre ellos EplD6Des en esta forma.

Expresión funcional del gen de �6-desaturasa de E. platangineum en semillas transgénicas

Para mostrar la expresión específica de semillas del gen �6-desaturasa de Echium, la región codificadora se insertó en el casete de expresión específico de semillas como sigue. Un fragmento NcoI-SacI incluyendo la región codificadora de �6-desaturasa se insertó en pXZP6, un derivado de pBluescriptSK que contiene un terminador Nos, resultando en el plásmido pXZP157. El fragmento SmaI-ApaI que contiene la región codificadora y el terminador EplD6Des-NosT se clonó en pWVec8-Fp1 aguas abajo del promotor Fp1, resultando en el plásmido pXZP345. El plásmido pXZP345 se usó para transformar plantas de Arabidopsis de tipo salvaje, ecotipo Columbia, y las plantas transgénicas se seleccionaron por selección con higromicina B. Las plantas transgénicas transformadas con este gen se designaron plantas "DP".

El análisis de la composición de ácidos grasos del aceite de las semillas de semillas T2 de once plantas T1 transformadas con la construcción mostró la presencia de GLA y SDA en todas las líneas, con niveles de productos de �6-desaturación alcanzando al menos 11 % (Tabla 12). Esto demostró la �6-desaturación eficiente de LA y ALA en la semilla.

TABLA 12. Composición de ácidos grasos en semillas de Arabidopsis transgénica que expresan �6-desaturasa de Echium.

Planta: Ácido graso (%) 16:0 18:0 18:1�9 18:2�9,12 (LA) 18:3�6,9,12 (GLA) 18:3�9,12,15 (ALA) 18:4�6,9,12,15 (SDA) 20:0 20:1 Productos de �6-desaturación totales ( %)

Columbia

DP-2: 8,0 2,8 22,9 27,3 2,5 11,3 0,7 1,6 15,8 3,2

DP-3: 7,8 2,7 20,6 25,9 3,0 12,1 0,8 1,7 17,8 3,8

DP-4: 7,8 2,8 20,4 28,5 1,2 13,7 0,4 1,7 16,1 1,5

DP-5: 8,2 3,2 17,4 29,3 1,2 14,2 0,3 2,1 15,6 1,6

DP-7: 8,2 2,9 18,4 26,7 5,0 12,7 1,4 1,7 15,2 6,4

DP-11: 9,0 3,5 17,8 28,4 3,0 13,4 0,9 2,1 13,9 3,8

DP-12: 8,6 3,0 18,9 27,8 3,3 12,6 1,0 1,8 15,4 4,3

DP-13: 8,7 2,9 14,4 27,3 8,5 13,7 2,6 1,7 12,4 11,1

DP-14: 9,3 2,9 14,2 32,3 2,1 15,4 0,7 1,8 12,8 2,8

DP-15: 8,2 2,9 17,8 30,1 0,3 15,3 0,2 1,9 15,5 0,5

DP-16: 8,0 2,8 19,5 29,2 2,7 13,1 0,8 1,7 14,2 3,5

Ejemplo 16. Mutagénesis del Gen EpID6Des de E. platangineum

Para determinar si podría introducirse variabilidad en el gen de �6-desaturasa y retener aún así la actividad desaturasa, el ADNc de �6-desaturasa de E. platangineum se mutó aleatoriamente por PCR usando Taq polimerasa y cebadores EPD6DesF1 y EPD6DesR1 en presencia de dITP como describen Zhou y Christie (1997). Los productos de PCR se clonaron como fragmentos XbaI-SacI en pBluescript SK(+) en los sitios XbaIy SacI, y se determinaron las secuencias de clones seleccionados aleatoriamente. Las variantes aleatorias con cambios en residuos de aminoácidos se eligieron para clonar como fragmentos XbaI-SacI en pBI121 y las actividades enzimáticas de las proteínas expresadas a partir de estas variantes se caracterizaron en hojas de tabaco transgénico como se ha descrito anteriormente para el gen de tipo salvaje.

La Figura 11A representa la actividad de las variantes de secuencia de EplD6Des cuando se expresan en plantas de tabaco. Las variantes podrían dividirse en dos clases amplias en términos de su capacidad para llevar a cabo �6desaturación. Las mutaciones representadas como diamantes vacíos mostraron reducciones sustanciales en la actividad de �6-desaturación mientras las mutaciones indicadas como diamantes llenos tuvieron poco o ningún efecto en la actividad de la enzima �6-desaturasa codificada. La Figura 11B representa el efecto cuantitativo que tuvo una selección de mutaciones en el gen EplD6Des en la actividad �6-desaturasa. Una mutación L14P en el dominio del citocromo b5 y una mutación S301P entre la caja de histidina II y la caja de histidina III de EplD6Des causó reducciones sustanciales en sus actividades �6-desaturasa, resultando en una reducción de 3 a 5 veces en los ácidos grasos �6-desaturados totales cuando se compara con la enzima de tipo salvaje en plantas W38. Sorprendentemente, para cada una se retuvo una actividad significativa. Por el contrario, la mayor parte de las variantes examinadas, como se ejemplifica por la mutación S205N, no tuvieron efecto en la actividad de �6desaturación del gen EplD6Des.

Ejemplo 17. Comparación de desaturasas dependientes de sustrato acil-CoA y acil-PC para la producción de LC-PUFA en células

Como se ha descrito anteriormente, la síntesis de LC-PUFA tales como EPA y DHA en células por la ruta convencional de �6 desaturación requiere la acción secuencial de PUFA desaturasas y elongasas, mostrada esquemáticamente en la Figura 12 parte A. Esta ruta convencional opera en algas, musgos, hongos, diatomeas, nematodos y algunos peces de agua dulce (Sayanova y Napier, 2004). Las PUFA desaturasas de algas, hongos, musgos y gusanos son selectivas para la desaturación de ácidos grasos esterificados en la posición sn-2 de fosfatidilcolina (PC) mientras las PUFA elongasas actúan en ácidos grasos en la forma de sustratos acil-CoA representados en el combinado acil-CoA en el retículo endoplásmico (ER), que está separado fisiológicamente del componente PC del ER. Por lo tanto, las reacciones secuenciales de desaturación y elongación en un sustrato ácido graso requieren que el ácido graso se transfiera entre los combinados de acil-PC y acil-CoA en el ER. Esto requiere aciltransferasas que son capaces de acomodar sustratos LC-PUFA. Este requerimiento de "cambio de sustrato" puede ser responsable de la baja eficiencia observada en intentos de los que se ha informado anteriormente para reconstituir la biosíntesis de LC-PUFA (Beaudoin et al., 2000, Domergue et al., 2003a). La ruta de �8 desaturación alternativa (Figura 12 parte B) presenta la misma desventaja de requerir "cambio de sustrato".

Como se describe en el Ejemplo 5, la estrategia de usar una desaturasa de vertebrados que era capaz de desaturar sustratos acil-CoA, proporcionó una producción relativamente eficiente de LC-PUFA en células de planta incluyendo en la semilla. En el Ejemplo 5, la combinación de una �5/�6 desaturasa de pez cebra, con una �6 elongasa de C. elegans tenía la ventaja de que ambas enzimas desaturasa y elongasa tenían actividad en sustratos acil-CoA en el combinado acil-CoA. Esto puede explicar por qué esta estrategia fue más eficiente en la síntesis de LC-PUFA. Para proporcionar una comparación directa de las eficiencias relativas de usar desaturasa dependiente de sustrato acil-CoA comparado con una desaturasa dependiente de sustrato acil-PC, llevamos a cabo el experimento siguiente. Éste comparó el uso de la �6 desaturasa de Echium (Ejemplo 15) y la �5 desaturasa de P. salina (Ejemplo 14), ambas de las cuales se piensa que usan sustratos acil-PC, con la �6/�5 desaturasa de pez cebra que usa un sustrato acil-CoA (Ejemplo 5).

Se preparó una construcción que contenía dos desaturasas dependientes de acil-PC, concretamente la �6 desaturasa de Echium y la �5 desaturasa de P. salina, en combinación con la �6 elongasa de C. elegans. El gen de

�6 desaturasa de Echium en un fragmento NcoI-SacI se insertó en pXZP143 (Ejemplo 15) resultando en pXZP192. El gen de �6 elongasa de C. elegans (casete de expresión Fp1-CeElo-NosT) en el fragmento HindIII-ApaI de pCeloPWVec8 (Ejemplo 5) se insertó en los sitios StuI-ApaI de pXZP147 (Ejemplo 14) para preparar pXZP193. El fragmento HindIII-ApaI de pXZP193 que contenía ambos genes (Fp1-PsD5Des-NosT y Fp1-CeElo-NosT) se insertó en los sitios ApaI-StuI de pXZP192, resultando en el plásmido pXZP194 que contenía los tres casetes de expresión. El fragmento XbaI-ApaI de pXZP194 se insertó en un derivado de pWvec8, resultando en pXZP357.

El plásmido pXZP357 se usó para transformar plantas de Arabidopsis de tipo salvaje ecotipo Columbia por el método de inmersión floral mediado por Agrobacterium, y se obtuvieron seis plantas transgénicas después de selección con higromicina B (20 mg/L). Las plantas T1 transgénicas se designaron plantas "DT". Las plantas transformadas resistentes a higromicina se transfirieron a tierra y se auto-fertilizaron. Las semillas T2 se recogieron y se analizó la composición de ácidos grasos de las semillas de dos líneas, DT1 y DT2. Los ácidos grasos de las semillas de DT1 y DT2 contenían niveles bajos de 18:3ω6 y 18:4ω4(0,9y0,8 %deGLA,0,3%y0,1%deSDA, respectivamente, Tabla 13). Además, tanto las semillas DT1 como DT2 también contenían 0,3 % y 0,1 % de 20:4ω6 (ARA). Sin embargo, no hubo síntesis aparente del ácido graso ω3 EPA en ninguna de las líneas de semilla T2, lo que probablemente reflejaba la mayor capacidad de desaturación de la �6 desaturasa de Echium sobre el sustrato ω6 LA comparado con el sustrato ω3 ALA (Ejemplo 15).

TABLA 13. Composición de ácidos grasos de aceite de semilla de semilla T2 de DT1 y DT2. Los valores de ácidos grasos son % de ácidos grasos totales.

Ácido graso Control DT1 DT2

16:0 7,2 6,5 6,5

18:0 2,9 3,6 3,3 18:1ω9 20,0 23,2 22,3 18:2ω6 27,5 23,6 24,4 18:3ω3 15,1 15,4 16,1

20:0 2,2 2,0 1,9 20:1ω9/ ω11 19,9 19,4 19,5 20:1ω7 2,2 3,4 3,0 20:2ω6 0,1 0,0 0,0 22:1ω7 0,0 0,0 0,0 Otros menores 2,8 1,5 1,9 Total 100,0 98,6 98,9

Nuevo ω6-PUFA

18:3ω6 0,0 0,9 0,8 20:3ω6 0,0 0,0 0,0 20:4ω6 0,0 0,3 0,1 Total 0,0 1,2 0,9

Nuevo ω3-PUFA

18:4ω3 0,0 0,3 0,2 20:4ω3 0,0 0,0 0,0 20:5ω3 0,0 0,0 0,0 Total 0,0 0,3 0,2 Ácidos grasos totales 100,0 100,0 100,0

Estos datos son claramente contrarios al Ejemplo 5, más arriba, en el que la expresión de la desaturasa dependiente de acil-CoA de pez cebra en combinación con una �6 elongasa resultó en la producción de al menos 1,1 % ARA y 2,3 % EPA en ácidos grasos de semilla T2. Así, parecería que las desaturasas dependientes de acil-PC son menos efectivas que las desaturasas dependientes de acil-CoA para dirigir la síntesis de LC-PUFA en células de planta.

Ejemplo 18. Expresión de los genes LC-PUFA en Synechococcus (comparativo)

Synechococcus spp. (Bacterias; Cianobacterias; Chroococcales; especies de Synechococcus por ejemplo Synechococcus elongatus, también conocido como Synechocystis spp.) son bacterias unicelulares, fotosintéticas, marinas o de agua dulce en el orden cianobacteria que utilizan clorofila a en el aparato de recogida de luz. Las especies incluyen productores primarios importantes en el entorno marino. Una característica bioquímica distintiva de Synechococcus es la presencia de ficoeritrina, un compuesto fluorescente naranja que puede detectarse a una longitud de onda de excitación de 540 nm, y que puede usarse para identificar Synechococcus. Los miembros del grupo marino synechococccus están relacionados muy de cerca a nivel del ARNr 16s. Son obligatoriamente marinos y tienen requerimientos elevados de crecimiento para Na+, Cl-, Mg2+, y Ca2+, pero pueden crecerse fácilmente tanto en medio líquido de agua de mar natural y artificial así como en placas (Waterbury et al. 1988). Como tienen una velocidad rápida de crecimiento heterotrófico o autotrófico, contienen precursores de ácidos grasos tales como LA y ALA, y se transforman de una manera relativamente sencilla, son adecuados para estudios funcionales que implican los genes de síntesis de LC-PUFA, o para la producción de LC-PUFA en sistemas de producción de tipo fermentador. Las cepas tales como Synechococcus sp. cepa WH8102, PCC7002 (7002, marina), o PCC7942 (agua dulce) pueden crecerse fácilmente y son susceptibles de manipulación bioquímica y genética (Carr, N.G., y N. H. Mann. 1994. The oceanic cyanobacterial picoplankton, p. 27-48. En D. A. Bryant (ed.), the Molecular biology of cyanobacteria. Kluwer Academic publishers, Boston). Por ejemplo, Synechococcus se ha usado como un sistema de expresión heterólogo para desaturasas (Domergue 2003b).

Perfil de Ácidos grasos y Velocidades de Crecimiento de Synechococcus 7002 de Tipo Salvaje

Para mostrar que la cianobacteria Synechococcus 7002 era un huésped adecuado para la transformación de genes de la síntesis de ácidos grasos y que este sistema de expresión podría usarse para ensayar rápidamente las funciones y especificidades de los genes de la síntesis de ácidos grasos, se analizó el crecimiento de la cepa de tipo salvaje 7002 en primer lugar a 22 °C, 25 °C y 30 °C y los perfiles de ácidos grasos resultantes se analizaron por cromatografía de gas para crecimiento a 22 °C y 30 °C (Tabla 14).

TABLA 14. Perfiles de ácidos grasos de Synechococcus 7002 de tipo salvaje a temperaturas de crecimiento de 22 °C y 30 °C (% de ácido graso total).

Temp: Mirístico Palmítico Palmitoleico Esteárico Oleico 18:1iso Linoleico GLA Linolénico

22 °C: 0,79 42,5 10,6 0,92 8,4 1,5 7,5 0,54 27,1

30 °C: 0,76 47,1 10,9 0,67 17,0 0,34 20,4 2,9

El crecimiento a 30 °C fue mucho más rápido que a 22 °C, con velocidades intermedias a 25 °C (Figura 13). Se encontró que las células contenían ácidos tanto linoleico (LA, 18:2 ω6) como linolénico (ALA, 18:3 ω3) que podrían usarse como precursores para la síntesis de LC-PUFA. Aunque algo del precursor preferido ALA se produjo a 30 °C, los niveles mayores se obtuvieron a 22 °C. También se realizaron ensayos para determinar si las células podrían crecerse a 30 °C, seguido de la reducción de la temperatura de incubación hasta 22 °C después de haber alcanzado biomasa suficiente, para ver si esto resultaría en un desplazamiento hacia una mayor producción de ácido linolénico (Figura 14). En este experimento, los niveles de ALA obtenidos fueron mayores de 5 %. En experimentos adicionales, se usó 25 °C como la temperatura preferida para la cepa 7002, proporcionando velocidades de crecimiento adecuadas y un perfil de ácido graso precursor adecuado.

Estrategia de Transformación

Anteriormente se han usado tanto vectores plasmídicos replicativos como vectores de recombinación homólogos no replicativos para transformar varias especies de cianobacterias, incluyendo Synechococcus 7002 (Williams y Szalay, 1983; Ikeda et al., 2002; Akiyama et al., 1998a). Los vectores de recombinación pueden preferirse en determinadas aplicaciones, y se han usado para inactivar un gen, en lugar de crear una cepa de expresión.

Se construyó un vector de recombinación que era adecuado para la introducción de uno o más genes de la síntesis de ácidos grasos en el cromosoma de cepas de Synechococcus tales como la cepa 7002. Este vector contenía el gen sul2 de Synechococcus 7002 en un núcleo de plásmido pBluescript, que proporcionó un gen de ampicilina como un marcador seleccionable y permitió la replicación bacteriana en especies tales como E. coli. El vector se preparó por ingeniería para contener un promotor plac de E. coli fusionado con un sitio de clonación múltiple aguas abajo, con los dos elementos insertados aproximadamente en el centro del gen sul2. El gen sul2 en Synechococcus codifica un sulfato de baja afinidad que no es esencial en condiciones normales de crecimiento. Cualquier gen distinto de sul2, preferiblemente un gen no esencial, podría haberse elegido para incorporación en el vector de recombinación.

El gen sul2 se amplificó a partir del ADN genómico de Synechococcus 7002 usando cebadores específicos de gen, tomando como base la secuencia casi idéntica en la cepa PCC6803 (Genbank No. de Registro NC_000911, nucleótidos 2902831 a 2904501) e insertada en el vector pGEM-T. El promotor plac de pBluescript se amplificó usando los cebadores 5'-gctacgcccggggatcctcgaggctggcgcaacgcaattaatgtga-3' (SEQ ID NO:81) (con sentido) y 5'cacaggaaacagcttgacatcgattaccggcaattgtacggcggccgctacggatatcctcgctcgagctcgcccgggg tagct-3' (SEQ ID NO:82) (antisentido), que también introdujeron varios sitios de restricción en los extremos de la secuencia promotora. El fragmento amplificado se digirió con SmaI y se ligó al fragmento grande PvuII de pBluescript incluyendo el gen de beta-lactamasa. Este vector intermedio se digirió con EcoRV y SacI y se ligó en el fragmento HpaIa SacI (designado sul2b) del gen sul2. El plásmido resultante se digirió con BamHI, se trató con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) para rellenar los extremos, y se ligó al fragmento SmaIa HpaI (designado sul2a) del gen sul2. Los sitios de restricción en exceso se eliminaron de este vector por digestión con SacIy SpeI, haciendo romos los extremos con ADN polimerasa T4, y religación. Finalmente, se introdujo un sitio de clonación múltiple aguas abajo del promotor plac digiriendo el vector con ClaIy NotI, y ligando en un fragmento ClaIa NotI de pBluescript, generando el vector de recombinación que se designó pJRP3.2.

Varios genes relacionados con la síntesis de LC-PUFA se adaptaron por métodos de PCR para incluir sitios de restricción flanqueantes así como secuencias de sitio de unión a ribosoma (RBS) que eran adecuados para la expresión en el procariota, Synechococcus. Por ejemplo, la �6-desaturasa de Echium plantagineum (Ejemplo 15) se amplificó con los cebadores 5'-AGCACATCGATGAAGGAGATATACCCatggctaatgcaatcaagaa-3' (SEQ ID NO:83) (con sentido) y 5'-ACGATGCGGCCGCTCAACCATGAGTATTAAGAGCTT-3' (SEQ ID NO:84) (antisentido).

El producto amplificado se digirió con ClaIy NotI y se clonó en los sitios ClaIa NotI de pJRP3.2. Se insertó un gen marcador seleccionable que comprendía una región codificadora de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) (gen catB3, No. de Registro AAC53634) aguas abajo de un promotor pbsA (psbA-CAT) en el sitio XhoI de pJRP3.2, produciendo el vector pJRP3.3. El gen del marcador seleccionable se insertó en el gen sulB para permitir la selección fácil para eventos de recombinación homóloga después de la introducción del vector de recombinación en Synechococcus.

La transformación de Synechococcus 7002 se consiguió mezclando el ADN del vector con células durante la fase exponencial de crecimiento, durante la cual ocurría la captación de ADN, como sigue. Aproximadamente 1µg del ADN del vector de recombinación resuspendido en 100µL de 10 mM Tris-HCl se añadió a 900µL de células en fase semi logarítmica creciendo en caldo BG-11. Las células se incubaron durante 90 min a 30 °C e intensidad de luz de 20µmoles fotones.m-2 .s -1. Se añadieron alicuotas de 250µL a 2mL de caldo BG-11, se mezcló con 2mL de agar fundido (1,5 %) y se vertió en placas de agar BG-11 que contenían 50µg/mL de cloranfenicol (Cm) para la selección de células recombinantes. Las placas se incubaron durante 10-14 días en las mismas condiciones de temperatura/luz antes de que las colonias resistentes a Cm fueran claramente visibles. Estas colonias se volvieron a sembrar en estrías varias veces en placas frescas de BG-11/Cm50. Después de varias rondas de siembra en estrías en placas selectivas, se inoculó medio líquido con colonias individuales y los cultivos se incubaron a 25 °C

Las células de Synechococcus 7002 que contenían el gen de �6-desaturasa de Echium insertado en el gen sulB mediante el vector de recombinación y expresado a partir del promotor plac se muestra que producen GLA (18:3 �6,9,12) y SDA (18:4, �6,9,12,15) a partir de ácido linoleico (LA) y ácido linolénico (ALA) endógenos, respectivamente, como sustratos.

También pueden usarse vectores episomales en Synechococcus en lugar de los vectores integrativos/de recombinación descritos anteriormente. Las especies de Synechococcus tienen plásmidos nativos que se han adaptado para uso en transformación, por ejemplo pAQ-EX1, en el que un fragmento del plásmido nativo pAQ1 (No. de Registro NC_005025) se fusionó con un plásmido de E. coli para formar un vector lanzadera con ambos orígenes de replicación de E. coli y Synechococcus (Ikeda et al., 2002; Akiyama et al., 1998b).

Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o semejantes que se ha incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No debe tomarse como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica anterior o eran conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención al existir antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation 5 <120> Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en células recombinantes

<130> 503364

<160> 89 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 427 15 <212> PRT

<213> Pavlova salina

<400> 1

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> Pavlova salina

<400> 2

<210> 3

<211> 304

<212> PRT

<213> Pavlova salina

<400> 3

<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> Pavlova salina

<400> 4

<210> 5

<211> 1235

<212> ADN

<213> Pavlova salina

<400> 5

<210> 6

<211> 1700

<212>: ADN 15 <213> Pavlova salina

<400> 6

<210> 7

<211> 909

<212> ADN

<213> Pavlova salina

<400> 7

<210> 8

<211> 1216

<212>: ADN 15 <213> Pavlova salina

<400> 8

<210> 9

<211> 915

<212> ADN

<213> Pavlova salina

<400> 9

<210> 10

<211> 1219

<212>: ADN 15 <213> Pavlova salina

<400> 10

<210> 11

<211> 125

<212> ADN

<213> Pavlova salina

<400> 11

<210> 12

<211> 1344

<212>: ADN 10 <213> Pavlova salina

<400> 12

15

<210> 13

<211> 1687

<212> ADN

<213> Pavlova salina

20

<400> 13

<210> 14

<211> 288

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 14

<210> 15

<211> 444

<212> PRT

<213> Danio rerio

<400> 15

<210> 16

<211> 444

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 456

<212> PRT

<213> Pythium irregulare

<400> 17

<210> 18

<211> 439

<212> PRT

<213> Thraustochytrium sp.

<400> 18

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> Mortierella alpina

<400> 19

<210> 20

<211> 447

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 20

<210> 21

<211> 444

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 444

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23

<211> 459

<212> PRT

<213> Pythium irregulare

<400> 23

<210> 24

<211> 448

<212> PRT

<213> Borago officinalis

<400> 24

<210> 25

<211> 446

<212> PRT

<213> Anemone leveillei

<400> 25

<210> 26

<211> 520

<212> PRT

<213> Ceratodon purpureus

<400> 26

<210> 27

<211> 525

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 27

<210> 28

<211> 457

<212> PRT

<213> Mortierella alpina

<400> 28

<210> 29

<211> 443

<212> PRT

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 29

<210> 30

<211> 299

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 290

<212> PRT

<213> Physcomitrella patens

<400> 31

<210> 32

<211> 318

<212> PRT

<213> Mortierella alpina

<400> 32

<210> 33

<211> 519

<212> PRT

<213> Thraustochytrium sp.

<400> 33

<210> 34

<211> 541

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 34

<210> 35

<211> 263

<212> PRT

<213> Isochrysis galbana

<400> 35

10 <210> 36

<211> 419

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

15 <400> 36

<210> 37

<211> 867

<212> ADN

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 37

<210> 38

<211> 1335 <212> ADN 15 <213> Danio rerio

<400> 38

<210> 39 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 39

cccaagctta ctatgggtgg cggaggacag c: 31

<210> 40 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 40

ccgctggagt tatttgttga gatacgc: 27

<210> 41 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 41

gcgggtacca tggctcagca tccgctc: 27

<210> 42 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<400> 42 gcgggatcct tagttgttct tcttctt

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada

<400> 43

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada

<400> 45

<210> 46

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<400> 46

tggtggaarc ayaarcayaa y

<210> 47

<211> 30 <212>. ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<220>

<221> característica_misc

<222> (19)..(19)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 47

gcgagggatc caaggraana rrtgrtgytc 30

<210> 48

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (4)..(4)

<223> X = cualquier aminoácido

<400> 48

<210> 49

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (3)..(3)

<223> X = cualquier aminoácido

<400> 49

<210> 50

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<220>

<221> característica_misc

<222> (14)..(14)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_misc <210> 53

<222> (18)..(18) <223> n = cualquier nucleótido

<220> <221> característica_misc <222> (19)..(19) <223> n = cualquier nucleótido

<220> <221> característica_misc <222> (20)..(20) <223> n = cualquier nucleótido

<400> 50

caggatcctt yytncatnnn tayca: 25

<210> 51 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<220> <221> característica_misc <222> (18)..(18) <223> n = cualquier nucleótido

<400> 51

gatctagara artartannn rtacat: 26

<210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Región conservada

<400> 52

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<400> 53

5 10: agcacgacgs sarccacggc g <210> 54 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico 21

15: <400> 54 gtggtgcayc abcacgtgct 20

20: <210> 55 <211> 642 <212> ADN <213> Pavlova salina

25: <220> <221> característica_misc <222> (13)..(13) <223> n = desconocido

30: <220> <221> característica_misc <222> (39)..(39) <223> n = desconocido

35: <220> <221> característica_misc <222> (51)..(51) <223> n = desconocido

40: <220> <221> característica_misc <222> (77)..(77) <223> n = desconocido

45: <220> <221> característica_misc <222> (302)..(302) <223> n = desconocido

50: <220> <221> característica_misc <222> (639)..(639) <223> n = desconocido

<400> 55

<210> 56

<211> 100

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

10 <400> 56

<210> 57 15 <211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 57

25

<210> 58

<211> 1612

<212> ADN

<213> Pavlova salina

30

<400> 58

<210> 59

<211> 1278

<212> ADN

<213> Pavlova salina

<400> 59

<210> 60

<211> 425

<212>: PRT 10 <213> Pavlova salina

<400> 60

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> Echium pitardii

<400> 61

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> Echium pitardii

<400> 62

<210> 63

<211> 1347

<212> ADN

<213> Echium plantagineum

<400> 63

<210> 64

<211> 448

<212> PRT

<213> Echium plantagineum

<400> 64

<210> 65

<211> 448

<212> PRT

<213> Echium gentianoides

<400> 65

<210> 66

<211> 448

<212> PRT

<213> Echium pitardii

<400> 66

<210> 67

<211> 448

<212> PRT

<213> Borago officinalis

<400> 67

<210> 68

<211> 446

<212> PRT

<213> Borago officinalis

<400> 68

<210> 69

<211> 458

<212> PRT

<213> Helianthus annus

<400> 69

<210> 70

<211> 449

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 70

<210> 71

<211> 449

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 71

<210> 72

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto conservado

<400> 72

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto conservado

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (2)..(2)

<223> X = cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (3)..(3)

<223> X = cualquier aminoácido

<400> 73

<210> 74

<211> 271

<212> PRT

<213> Thraustochytrium sp.

<400> 74

<210> 75

<211> 266

<212> PRT

<213> Dabio rerio

<400> 75

<210> 76

<211> 320

<212> PRT

<213> Pavlova lutheri

<400> 76

<210> 77

<211> 282

<212> PRT

<213> Danio rerio

<400> 77

<210> 78

<211> 396

<212> PRT

<213> Pavlova lutheri

<400> 78

<210> 79

<211> 315

<212> ADN

<213> Heterocapsa niei

<400> 79

<210> 80

<211> 100

<212>: PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína codificada por SEQ ID NO:79 que comprende un codón de parada entre los residuos 17 y 18 lo que

sugiere la presencia de un intrón 20

<400> 80

25 <210> 81

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<400> 81

gctacgcccg gggatcctcg aggctggcgc aacgcaatta atgtga

<210> 82

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico

<400> 82

<210> 83 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 83

agcacatcga tgaaggagat atacccatgg ctaatgcaat caagaa: 46

<210> 84 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oligonucleotídico

<400> 84

acgatgcggc cgctcaacca tgagtattaa gagctt: 36

<210> 85 <211> 294 <212> PRT <213> Pavlova salina

<400> 85

<210> 86

<211> 276

<212> PRT

<213> Pavlova salina

<400> 86

5: <210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Cebador oligonucleotídico <400> 87

cgctctagaa ctagtggatc: 20

15: <210> 88 <211> 223 <212> PRT <213> Melosira sp.

<400> 88

<210> 89

<211> 683

<212> ADN

<213> Melosira sp. 10

<400> 89

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula vegetal recombinante que sintetiza EPA, que comprende más de un polinucleótido heterólogo, en donde dichos polinucleótidos codifican:

a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa;

en donde los más de un polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula, en donde las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, y en donde la síntesis de EPA requiere la acción secuencial de dichas enzimas.
2.

La célula de la reivindicación 1, en la que las enzimas codificadas por los polinucleótidos comprenden al menos una �5 elongasa que cataliza la conversión de EPA en DPA en la célula.
3.

La célula de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que las enzimas codificadas por los polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa de un vertebrado o una variante desaturasa de ésta.
4.

La célula de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 que es una célula vegetal de una angiosperma, una célula vegetal oleaginosa o una célula de una semilla.
5.

La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que al menos un promotor es un promotor específico de semilla.
6.

La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los ácidos grasos totales de dicha célula comprenden al menos el 1,5 % de EPA.
7.

La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha célula es capaz de sintetizar DPA.
8.

La célula de la reivindicación 7, en la que los ácidos grasos totales de dicha célula comprenden al menos el 0,13 %, al menos el 0,15 %, al menos el 0,5 % o al menos el 1,0 % de DPA.
9.

La célula de las reivindicaciones 7 u 8, en la que dicha célula es capaz de sintetizar DHA.
10.

La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha célula

i) es capaz de producir EPA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, SDA, ETA, o cualquier combinación o mezcla de éstos.

ii) es capaz de producir DHA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, ARA, SDA, ETA, EPA, o cualquier combinación o mezcla de éstos, y/o

iii) es capaz de producir DPA a partir de un ácido graso que es ALA, LA, GLA, ARA, SDA, ETA, EPA, o cualquier combinación o mezcla de éstos.
11. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha célula comprende un polinucleótido aislado o un vector que comprenden una secuencia de nucleótidos que es:

i) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6; ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 40 % idéntica a SEQ ID NO:1 y en la que el polipéptido tiene actividad �8 desaturasa;

iii) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8;

iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 % idéntica a SEQ ID NO:2 y en la que el polipéptido tiene actividad �5 elongasa; v) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10; vi) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es

al menos un 40 % idéntica a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86 y en la que el polipéptido tiene actividad

�9 elongasa; vii) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13; viii) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un

70 % idéntica a SEQ ID NO:4 y en la que el polipéptido tiene actividad �4 desaturasa;

ix) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:58 o SEQ ID NO:59;

x) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 55 % idéntica a SEQ ID NO:60 y en la que el polipéptido tiene actividad �5 desaturasa; xi) una secuencia de nucleótidos como se proporciona en SEQ ID NO:63; xii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es

al menos un 90 % idéntica a SEQ ID NO:64 y en la que el polipéptido tiene actividad �6 desaturasa; o xiii) una secuencia que hibrida con una cualquiera de i) a xii) en condiciones de astringencia alta.
12. Un método para producir una célula vegetal recombinante que sintetiza uno o más LC-PUFA(s), comprendiendo el método introducir en la célula más de un polinucleótido heterólogo, en el que dicho polinucleótido codifica: a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa; en el que los más de un polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la célula,

en el que dichos uno o más LC-PUFA comprenden EPA, en el que las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar en un sustrato acil-CoA, y en el que la síntesis de EPA requiere la acción secuencial de dichas enzimas.
13.

Una planta transgénica y/o parte de planta que comprenden al menos una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14.

La planta o parte de planta de la reivindicación 13 en la que dicha planta es una angiosperma.
15.

La planta de las reivindicaciones 13 ó 14 que comprende:

i) al menos una parte de planta que sintetiza EPA, y en donde los ácidos grasos totales de la parte de planta comprenden al menos el 1,5 %, al menos el 2,1 % o al menos el 2,5 % de EPA,

ii) al menos una parte de planta que sintetiza DPA, en donde los ácidos grasos totales de la parte de planta comprenden al menos el 0,1 %, al menos el 0,13 % o al menos el 0,5 % de DPA,

iii) al menos una parte de planta que sintetiza DHA,

iv) al menos una parte de planta que sintetiza al menos un ω3 C20 LC-PUFA, y en donde los ácidos grasos totales de la parte de planta comprenden al menos el 2,5 %, o al menos el 4,1 % de ω3 C20 LC-PUFA,

v) al menos una parte de planta que sintetiza EPA, y en donde la eficiencia de la conversión de ALA en EPA en la parte de planta es al menos del 2 % o al menos del 14,6 %,

vi) al menos una parte de planta que sintetiza ácidos grasos poliinsaturados ω3 que son los productos de �6desaturación de ALA y/o los productos de �9 elongación de ALA, y en el que la eficiencia de la conversión de ALA en dichos productos en la parte de la planta es al menos del 22 % o al menos del 24 %, y/o

vii) al menos una parte de planta que sintetiza DPA a partir de EPA, y en donde la eficiencia de la conversión de EPA en DPA en la parte de planta es al menos del 5 % o al menos del 7 %.
16.

Una semilla transgénica que comprende una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17.

La semilla de la reivindicación 16 que comprende además i) DPA, o ii) DHA y DPA.
18.

La semilla de las reivindicaciones 16 ó 17, derivada de una semilla isogénica no transgénica que produce LA y/o ALA.
19.

La semilla de la reivindicación 18, en donde la semilla isogénica no transgénica comprende una mayor concentración de ALA que de LA en sus ácidos grasos.
20.

La semilla de las reivindicaciones 18 ó 19, en donde la semilla isogénica no transgénica comprende al menos aproximadamente el 13 % de ALA de los ácidos grasos totales (p/p).
21.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en donde los ácidos grasos totales en el aceite de la semilla comprenden al menos el 9 % de ácidos grasos C20 (p/p).
22.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en donde la semilla deriva de una planta oleaginosa.
23.

La semilla de la reivindicación 22, en donde la planta oleaginosa es canola, maíz, girasol, soja, sorgo, lino, remolacha azucarera, algodón, cacahuete, amapola, mostaza, ricino, sésamo o alazor.
24.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en donde la semilla tiene una velocidad de germinación que es sustancialmente la misma que la de una semilla isogénica no transgénica.
25.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24 que comprende DPA que se sintetiza en la semilla y en donde los ácidos grasos totales de la semilla comprenden al menos el 0,1 % de DPA (p/p).
26.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25 que comprende DHA que se sintetiza en la semilla.
27.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26 que comprende al menos un ω3 C20 LC-PUFA que se sintetiza en la semilla y en donde los ácidos grasos totales de la semilla comprenden al menos el 2,5 % ω3 C20 LC-PUFA (p/p).
28.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27 en donde la eficiencia de conversión de ALA en EPA en la semilla es al menos del 14,6 %.
29.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 28 que comprende ácidos grasos poliinsaturados ω3 que son los productos de la �6-desaturación de ALA y/o los productos de �9 elongación de ALA, productos que se sintetizan en la semilla, y en donde la eficiencia de conversión de ALA en dichos productos en la semilla es al menos el 22 %.
30.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 29 que comprende DPA que se sintetiza a partir de EPA en la semilla y en donde la eficiencia de conversión de EPA en DPA en la semilla es al menos del 5 %.
31.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, en donde al menos el 25 % (p/p) del LC-PUFA en la semilla forma parte de triacilgliceroles.
32.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 31 que es homocigota para los polinucleótidos transgénicos.
33.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 32, en donde dicha semilla no comprende un transgén que codifica una enzima que convierte preferentemente un ω6 LC-PUFA en un ω3 LC-PUFA.
34.

Un método para producir una semilla transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, comprendiendo el método

i) introducir en una célula vegetal uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican:

a) una �6 desaturasa, una �6 elongasa y una �5 desaturasa; o

b) una �5/�6 desaturasa bifuncional y una �6 elongasa;

, en donde los uno o más polinucleótidos están unidos de manera operativa a uno o más promotores que son capaces de dirigir la expresión de dichos polinucleótidos en la semilla, y en donde las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos comprenden al menos una desaturasa que es capaz de actuar sobre un sustrato acil-CoA, produciendo de esta manera una célula recombinante,

ii) cultivar dicha célula recombinante para producir una planta, y

iii) recuperar la semilla de la planta así producida.
35. Una planta transgénica que comprende la semilla transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a
33.
36.

Un método para producir un LC-PUFA, comprendiendo el método cultivar, en condiciones adecuadas, una célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho LC-PUFA comprende al menos EPA.
37.

Un método para producir aceite que comprende LC-PUFA, en donde dicho LC-PUFA comprende al menos EPA, que comprende obtener la semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33 y/o la planta transgénica o la parte de planta según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, y extraer aceite de dicha planta, parte de planta o semilla.

5 38. El método según la reivindicación 37, en el que dicho aceite se purifica adicionalmente.
39.

El método según la reivindicación 37, en el que dicho aceite se trata adicionalmente por hidrólisis con una base fuerte para liberar los ácidos grasos libres.
40.

Una composición que comprende la semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, la planta

transgénica o parte de planta según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, la célula recombinante según 10 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo adecuado.
41.

Un producto alimenticio que comprende la semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, la planta transgénica o parte de planta según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y/o una composición de la reivindicación 40.
42.

La semilla según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33, la planta transgénica o parte de planta según

15 una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, la célula recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y/o una composición de la reivindicación 40, para tratar o prevenir una afección que se beneficiaría de un LC-PUFA.