JP2003116566A - ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法 - Google Patents
ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｎ−３系高度不飽和脂肪酸の１種であるｎ−
３系ドコサペンタエン酸の工業的製造方法を提供する。 【解決手段】 哺乳類由来の鎖長延長酵素遺伝子を宿主
細胞に染色体外発現あるいは染色体内組み込み発現プラ
スミドをベクターとして導入した形質転換体により、イ
コサペンタエン酸の鎖長延長を行うことにより、形質転
換体細胞内あるいは細胞外にｎ−３系ドコサペンタエン
酸を蓄積させるｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。
３系ドコサペンタエン酸の工業的製造方法を提供する。 【解決手段】 哺乳類由来の鎖長延長酵素遺伝子を宿主
細胞に染色体外発現あるいは染色体内組み込み発現プラ
スミドをベクターとして導入した形質転換体により、イ
コサペンタエン酸の鎖長延長を行うことにより、形質転
換体細胞内あるいは細胞外にｎ−３系ドコサペンタエン
酸を蓄積させるｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｎ−３系ドコサペ
ンタエン酸の製造方法に関する。
ンタエン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、二重結合
がメチレン基を夾んで３個以上有り、その最初の二重結
合の位置が、メチル末端からの３番目の炭素に存在する
炭素数１８から２２の脂肪酸を総称するものである。こ
のｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、ヒトなど哺乳類では、
大豆など植物で生産される必須脂肪酸であるα−リノレ
ン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−３）を摂取することによ
り、不飽和化酵素、鎖長延長酵素による二重結合の導入
と炭素鎖長延長を繰り返し、プロスタグランジンIII群
の直接の前駆脂肪酸であるイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ、Ｃ２０：５ｎ−３）及び最終生成物である網膜ある
いは脳神経系に多量に存在し、極めて重要な働きが知ら
れているドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−
３）に変換され、生体の恒常性維持（ホメオスタシス）
に極めて大きな役割を担っている。
がメチレン基を夾んで３個以上有り、その最初の二重結
合の位置が、メチル末端からの３番目の炭素に存在する
炭素数１８から２２の脂肪酸を総称するものである。こ
のｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、ヒトなど哺乳類では、
大豆など植物で生産される必須脂肪酸であるα−リノレ
ン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−３）を摂取することによ
り、不飽和化酵素、鎖長延長酵素による二重結合の導入
と炭素鎖長延長を繰り返し、プロスタグランジンIII群
の直接の前駆脂肪酸であるイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ、Ｃ２０：５ｎ−３）及び最終生成物である網膜ある
いは脳神経系に多量に存在し、極めて重要な働きが知ら
れているドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−
３）に変換され、生体の恒常性維持（ホメオスタシス）
に極めて大きな役割を担っている。
【０００３】ｎ−３系高度不飽和脂肪酸としては、既
に、ＥＰＡ及びＤＨＡが良く知られており、専らマグ
ロ、イワシ、サバ、サンマなどの魚油から抽出、精製し
た素材が各種食品などに栄養強化添加物として用いられ
ている。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸の内では、その存在
は知られているが実際的にその生理作用についても研究
が進んでいなかったｎ−３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２
２：５ｎ−３、以下、ＤＰＡ（ｎ−３）と略記すること
がある）が、新たに冠状動脈硬化抑制因子としての生理
活性において、ＥＰＡの１０〜２０倍の活性を持つこと
が報告された（Docosapentaenoic acid:another key n-
3 player? INFORM,8,426-447(1997))。
に、ＥＰＡ及びＤＨＡが良く知られており、専らマグ
ロ、イワシ、サバ、サンマなどの魚油から抽出、精製し
た素材が各種食品などに栄養強化添加物として用いられ
ている。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸の内では、その存在
は知られているが実際的にその生理作用についても研究
が進んでいなかったｎ−３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２
２：５ｎ−３、以下、ＤＰＡ（ｎ−３）と略記すること
がある）が、新たに冠状動脈硬化抑制因子としての生理
活性において、ＥＰＡの１０〜２０倍の活性を持つこと
が報告された（Docosapentaenoic acid:another key n-
3 player? INFORM,8,426-447(1997))。
【０００４】ＤＰＡ（ｎ−３）は炭素数２２で、カルボ
ン酸末端から７、１０、１３、１６、１９番目の炭素に
ｃｉｓ形の不飽和結合を持つｎ−３系高度不飽和脂肪酸
であり、ＥＰＡが炭素鎖長を延長したｎ−３系高度不飽
和脂肪酸であり、ＤＨＡに変換する脂肪酸中間体であ
る。その自然界での存在は、魚油中にもほとんど認めら
れず、僅かに、海産哺乳動物類でその存在が認められて
いるが、例えば、アザラシ（Harp seal）において、全
脂肪酸中の約６％の存在が認められているにとどまり、
クジラ（Sea whale）で１％内外である（日本油化学協
会編：油化学便覧改訂第３版pp.131,1990、丸善
（株））。
ン酸末端から７、１０、１３、１６、１９番目の炭素に
ｃｉｓ形の不飽和結合を持つｎ−３系高度不飽和脂肪酸
であり、ＥＰＡが炭素鎖長を延長したｎ−３系高度不飽
和脂肪酸であり、ＤＨＡに変換する脂肪酸中間体であ
る。その自然界での存在は、魚油中にもほとんど認めら
れず、僅かに、海産哺乳動物類でその存在が認められて
いるが、例えば、アザラシ（Harp seal）において、全
脂肪酸中の約６％の存在が認められているにとどまり、
クジラ（Sea whale）で１％内外である（日本油化学協
会編：油化学便覧改訂第３版pp.131,1990、丸善
（株））。
【０００５】ラビリンチュラ類の海洋性菌において、Ｄ
ＰＡ（ｎ−３）を約１〜３％生産する菌も得られている
が、その脂肪酸中の含量のレベルは低い（Kendrick, A.
andC.Ratledge, Lipids,27,15-10(1992))。前記海洋性
菌であるシゾキトリウム属菌（Shizochytrium sp.）に
おけるＤＨＡの生合成経路は、哺乳類におけるＤＨＡ生
合成経路とは全く異なり、ＤＰＡ（ｎ−６）を前駆脂肪
酸としており、ＤＰＡ（ｎ−３）をその前駆脂肪酸とは
していないため、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積するこ
とは、生合成経路上から可能性の低いことが報告された
（ラビリンチュラ類における高度不飽和脂肪酸の生合成
機構：秋庸裕、鈴木修、海洋と生物、２３（１）４６−
５１（２００１）。一方、同じくラビリンチュラ類に属
するトラウストキトリウム属菌（Traustochytrium s
p.）からＤＰＡ（ｎ−３）を前駆脂肪酸としてＤＨＡに
変換するΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が取得されたこ
とが極最近報告された（Identificaton ofa Δ4 desatu
rase from Traustchytrium sp. involved in biosynthe
sis of docosahexaenoic acid by heterologous expres
sion in Saccharomyces cerevisiae and Brasixa junca
(2001), Xiao Quis,Haping Hong Samuel L. and L.Mack
enzie, J.Biological Chemistry ）。
ＰＡ（ｎ−３）を約１〜３％生産する菌も得られている
が、その脂肪酸中の含量のレベルは低い（Kendrick, A.
andC.Ratledge, Lipids,27,15-10(1992))。前記海洋性
菌であるシゾキトリウム属菌（Shizochytrium sp.）に
おけるＤＨＡの生合成経路は、哺乳類におけるＤＨＡ生
合成経路とは全く異なり、ＤＰＡ（ｎ−６）を前駆脂肪
酸としており、ＤＰＡ（ｎ−３）をその前駆脂肪酸とは
していないため、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積するこ
とは、生合成経路上から可能性の低いことが報告された
（ラビリンチュラ類における高度不飽和脂肪酸の生合成
機構：秋庸裕、鈴木修、海洋と生物、２３（１）４６−
５１（２００１）。一方、同じくラビリンチュラ類に属
するトラウストキトリウム属菌（Traustochytrium s
p.）からＤＰＡ（ｎ−３）を前駆脂肪酸としてＤＨＡに
変換するΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が取得されたこ
とが極最近報告された（Identificaton ofa Δ4 desatu
rase from Traustchytrium sp. involved in biosynthe
sis of docosahexaenoic acid by heterologous expres
sion in Saccharomyces cerevisiae and Brasixa junca
(2001), Xiao Quis,Haping Hong Samuel L. and L.Mack
enzie, J.Biological Chemistry ）。
【０００６】海洋性菌においてのＤＨＡの生合成経路に
は多様な経路が存在し、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積
する菌株の存在の可能性は否定できないものの、ＤＰＡ
（ｎ−３）の大量生産菌のスクリーニングを数多くのサ
ンプルから試みたが、現段階では取得されていない。海
洋性菌においてもＤＰＡ（ｎ−３）はＤＨＡの前駆脂肪
酸であるため速やかにＤＨＡに変換され、菌体内に蓄積
される菌株は少ないことが推察された。
は多様な経路が存在し、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積
する菌株の存在の可能性は否定できないものの、ＤＰＡ
（ｎ−３）の大量生産菌のスクリーニングを数多くのサ
ンプルから試みたが、現段階では取得されていない。海
洋性菌においてもＤＰＡ（ｎ−３）はＤＨＡの前駆脂肪
酸であるため速やかにＤＨＡに変換され、菌体内に蓄積
される菌株は少ないことが推察された。
【０００７】ＤＰＡ（ｎ−３）は、海産哺乳類動物油脂
から分離による取得もその含量が少ないため困難であ
り、新規のｎ−３系高度不飽和脂肪酸素材としての市場
化はされておらず、また、素材の入手が容易でないた
め、その生理機能に関しての検討も充分行われていると
は言えない状況である。また、ＥＰＡは魚油に豊富に存
在しており、その単離も既に技術的に確立されている。
それ故、何らかの方法でＥＰＡをＤＰＡ（ｎ−３）に変
換することが出来れば、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の
高生産技術を確立することが可能となる。
から分離による取得もその含量が少ないため困難であ
り、新規のｎ−３系高度不飽和脂肪酸素材としての市場
化はされておらず、また、素材の入手が容易でないた
め、その生理機能に関しての検討も充分行われていると
は言えない状況である。また、ＥＰＡは魚油に豊富に存
在しており、その単離も既に技術的に確立されている。
それ故、何らかの方法でＥＰＡをＤＰＡ（ｎ−３）に変
換することが出来れば、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の
高生産技術を確立することが可能となる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＥＰＡの鎖
長延長を行うことによるｎ−３系ドコサペンタエン酸の
工業的な製造方法を提供することをその課題とする。
長延長を行うことによるｎ−３系ドコサペンタエン酸の
工業的な製造方法を提供することをその課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。本発明によれば、以下の方法が提供される。 （１）哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を導入し
て得られた形質転換体を培地に培養する際に、該培地に
イコサペンタエン酸を添加することにより、該イコサペ
ンタエン酸の炭素鎖長を延長してｎ−３系ドコサペンタ
エン酸に変換することを特徴とするｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （２）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が哺乳類由来の遺伝
子あることを特徴とする前記（１）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （３）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、ラット肝ｃＤＮ
Ａライブラリーよりクローニングされた脂肪酸鎖長延長
酵素遺伝子であることを特徴とする前記（２）に記載の
ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （４）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の２９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることを特徴とする前記（３）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （５）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の９００ｂｐの塩基配列を有する遺伝子であ
ることを特徴とする前記（４）に記載のｎ−３系ドコサ
ペンタエン酸の製造方法。 （６）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体外組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）にいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （７）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体内組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （８）該宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする
前記（６）又は（７）のいずれかに記載のｎ−３系ドコ
サペンタエン酸の製造方法。 （９）該真核細胞が、酵母であることを特徴とする前記
（８）に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。 （１０）該酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pich
ia pastoris）であることを特徴とする前記（９）に記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１１）該培養を、ＧＹ培地、ＹＭ培地あるいは培地組
成、グルコース１〜１０％、酵母エキス０．１〜３％、
ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％、ＫＨ2ＰＯ4０．０１
〜０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１〜０．２％
を水に溶解した培地を用いて培養温度２０〜３５℃で行
うことを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１２）該培地に添加する該イコサペンタエン酸が、遊
離脂肪酸又はそのメチルもしくはエチルエステルである
ことを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれかに記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１３）前記（１）〜（１２）のいずれかに記載のｎ−
３系ドコサペンタエン酸の製造方法により得られたｎ−
３系ドコサペンタエン酸又はそのエステル。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。本発明によれば、以下の方法が提供される。 （１）哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を導入し
て得られた形質転換体を培地に培養する際に、該培地に
イコサペンタエン酸を添加することにより、該イコサペ
ンタエン酸の炭素鎖長を延長してｎ−３系ドコサペンタ
エン酸に変換することを特徴とするｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （２）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が哺乳類由来の遺伝
子あることを特徴とする前記（１）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （３）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、ラット肝ｃＤＮ
Ａライブラリーよりクローニングされた脂肪酸鎖長延長
酵素遺伝子であることを特徴とする前記（２）に記載の
ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （４）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の２９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることを特徴とする前記（３）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （５）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の９００ｂｐの塩基配列を有する遺伝子であ
ることを特徴とする前記（４）に記載のｎ−３系ドコサ
ペンタエン酸の製造方法。 （６）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体外組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）にいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （７）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体内組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （８）該宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする
前記（６）又は（７）のいずれかに記載のｎ−３系ドコ
サペンタエン酸の製造方法。 （９）該真核細胞が、酵母であることを特徴とする前記
（８）に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。 （１０）該酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pich
ia pastoris）であることを特徴とする前記（９）に記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１１）該培養を、ＧＹ培地、ＹＭ培地あるいは培地組
成、グルコース１〜１０％、酵母エキス０．１〜３％、
ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％、ＫＨ2ＰＯ4０．０１
〜０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１〜０．２％
を水に溶解した培地を用いて培養温度２０〜３５℃で行
うことを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１２）該培地に添加する該イコサペンタエン酸が、遊
離脂肪酸又はそのメチルもしくはエチルエステルである
ことを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれかに記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１３）前記（１）〜（１２）のいずれかに記載のｎ−
３系ドコサペンタエン酸の製造方法により得られたｎ−
３系ドコサペンタエン酸又はそのエステル。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において用いる反応原料
は、イコサペンタエン酸又はそのエステルである。この
場合エステルとしては、炭素数１〜６の直鎖アルキルエ
ステル、好ましくはメチル及びエチルエステルが用いら
れる。
は、イコサペンタエン酸又はそのエステルである。この
場合エステルとしては、炭素数１〜６の直鎖アルキルエ
ステル、好ましくはメチル及びエチルエステルが用いら
れる。
【００１１】本発明において、哺乳類由来の脂肪酸鎖長
延長酵素遺伝子（以下、単に酵素遺伝子とも言う）の発
現プラスミド（以下、単にプラスミドとも言う）をベク
ターとして宿主細胞に導入した形質転換体を培養する際
に、該培地にイコサペンタエン酸又はそのエステルを添
加する。
延長酵素遺伝子（以下、単に酵素遺伝子とも言う）の発
現プラスミド（以下、単にプラスミドとも言う）をベク
ターとして宿主細胞に導入した形質転換体を培養する際
に、該培地にイコサペンタエン酸又はそのエステルを添
加する。
【００１２】本発明で用いる前記酵素遺伝子は哺乳類由
来の物であればよい。この場合哺乳類には、ヒト、マウ
ス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が包含され
る。
来の物であればよい。この場合哺乳類には、ヒト、マウ
ス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が包含され
る。
【００１３】前記酵素遺伝子として、ラット肝ｃＤＮＡ
ライブラリーから取得され、クローニングされた酵素遺
伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を持つ脂肪
酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）は、ヒト由来の該酵素
（ＨＥＬＯ１）とは高い相同性（９３．０％）を有して
いるが、線虫（Ｃｅｌｅ；Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状
菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬＯ）とは相同性が低いこと（２
７．３％及び３１．４％）が明らかである（Cloning of
a human cDNA encoding a novel enzyme involved in
the elongation of long-chain polyunsaturated fatty
acid(2000),Amenda E. Lonard, Emile G. Bobink, Jos
eph Dorad, Paul E. Kroeger, Lu-Te Chuang, Jennifer
M. Thurmond, Jennifer M. Parker-Branes, Tapas Da
s, Yung-Sheng Huang and Pradip Mukerji, Biochem.
J.,350,756-770））。しかも、線虫及び糸状菌の脂肪酸
鎖長延長酵素においては、その脂肪酸の鎖長が炭素数１
８の脂肪酸を炭素数２０への延長機能は持つが、炭素数
２０の脂肪酸を炭素数２２の脂肪酸への延長機能は持た
ないことが認められている（Heterologus reconstituti
on in yeast of the polyunsaturated fatty acid bios
ynthetic pathway(2000), Frederic Beaudoin, Louis
V. Michaelson, Sandra J. Hey, Mervyn J. Lewis, Pet
er R. Shewry, Olga Sayanova and Johnathan A. Napie
r, PANS,97,6421-6426 , Identification and characte
rization of an enzyme involved in the elongation o
f n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids(2000),Je
nnifer M. Paker-Barnes, Tapas Das, Emile Bobik, Am
anda E. Leonard, Jennifer M. Thurmond, Lu-Te Chaun
g, Yung-Sheng Huang, and Pradip Mukerji, PNAS,97,8
284-8289）。炭素数２０のイコサペンタエン酸を炭素数
２２のドコサペンタエン酸に炭素鎖長を延長するために
は哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素が必要であり、ｎ−
３系ドコサペンタエン酸製造の目的を果たすための脂肪
酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子は哺乳類由来である
ことが示される。
ライブラリーから取得され、クローニングされた酵素遺
伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を持つ脂肪
酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）は、ヒト由来の該酵素
（ＨＥＬＯ１）とは高い相同性（９３．０％）を有して
いるが、線虫（Ｃｅｌｅ；Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状
菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬＯ）とは相同性が低いこと（２
７．３％及び３１．４％）が明らかである（Cloning of
a human cDNA encoding a novel enzyme involved in
the elongation of long-chain polyunsaturated fatty
acid(2000),Amenda E. Lonard, Emile G. Bobink, Jos
eph Dorad, Paul E. Kroeger, Lu-Te Chuang, Jennifer
M. Thurmond, Jennifer M. Parker-Branes, Tapas Da
s, Yung-Sheng Huang and Pradip Mukerji, Biochem.
J.,350,756-770））。しかも、線虫及び糸状菌の脂肪酸
鎖長延長酵素においては、その脂肪酸の鎖長が炭素数１
８の脂肪酸を炭素数２０への延長機能は持つが、炭素数
２０の脂肪酸を炭素数２２の脂肪酸への延長機能は持た
ないことが認められている（Heterologus reconstituti
on in yeast of the polyunsaturated fatty acid bios
ynthetic pathway(2000), Frederic Beaudoin, Louis
V. Michaelson, Sandra J. Hey, Mervyn J. Lewis, Pet
er R. Shewry, Olga Sayanova and Johnathan A. Napie
r, PANS,97,6421-6426 , Identification and characte
rization of an enzyme involved in the elongation o
f n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids(2000),Je
nnifer M. Paker-Barnes, Tapas Das, Emile Bobik, Am
anda E. Leonard, Jennifer M. Thurmond, Lu-Te Chaun
g, Yung-Sheng Huang, and Pradip Mukerji, PNAS,97,8
284-8289）。炭素数２０のイコサペンタエン酸を炭素数
２２のドコサペンタエン酸に炭素鎖長を延長するために
は哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素が必要であり、ｎ−
３系ドコサペンタエン酸製造の目的を果たすための脂肪
酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子は哺乳類由来である
ことが示される。
【００１４】ラット肝の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子のク
ローニングは、ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長
酵素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考
として、これらに相同なマウスＥＳＴクローンをＮＣＢ
Ｉデータベースにおいて検索を行い、高い相同性を示す
ものとしてＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得
た。これらは互いにオーバーラップしており、それぞれ
開始コドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を
含んでおり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１
と高相同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウ
スの遺伝子情報から、ＰＣＲに使用するプライマーの設
計を行った。ＰＣＲに使用するプライマーの例として、
プライマーＦ１及びプライマーＲ１（それぞれの塩基配
列は、配列表の配列番号２、３参照）を用いることが出
来る。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含み、プラ
イマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素ＸｂａＩによる
開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。プライマ
ーＦ１及びＲ１を用いてラット肝ｃＤＮＡライブラリー
（Ｔａｋａｒａ 社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ
を行い、プライマーＦ１及びＲ１に挟まれた増幅産物
（ｒＥＬＯ１）を得て、塩基配列の決定した。
ローニングは、ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長
酵素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考
として、これらに相同なマウスＥＳＴクローンをＮＣＢ
Ｉデータベースにおいて検索を行い、高い相同性を示す
ものとしてＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得
た。これらは互いにオーバーラップしており、それぞれ
開始コドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を
含んでおり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１
と高相同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウ
スの遺伝子情報から、ＰＣＲに使用するプライマーの設
計を行った。ＰＣＲに使用するプライマーの例として、
プライマーＦ１及びプライマーＲ１（それぞれの塩基配
列は、配列表の配列番号２、３参照）を用いることが出
来る。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含み、プラ
イマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素ＸｂａＩによる
開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。プライマ
ーＦ１及びＲ１を用いてラット肝ｃＤＮＡライブラリー
（Ｔａｋａｒａ 社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ
を行い、プライマーＦ１及びＲ１に挟まれた増幅産物
（ｒＥＬＯ１）を得て、塩基配列の決定した。
【００１５】該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は、９００ｂｐか
らなるオープンリーディングフレームを含み、２９９ア
ミノ酸をコードしており、その全塩基配列及び推定アミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示した。該遺
伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列についてヒト
（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caenohabditis elegans, Cele;
F56H11.4）及び糸状菌（Mortierella alpina, Malp;GLE
LO）の脂肪酸鎖長延長酵素との比較した。 いずれのア
ミノ酸配列においても不飽和化酵素において見出された
タイプのヒスチジンクラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所
保存されていた。
らなるオープンリーディングフレームを含み、２９９ア
ミノ酸をコードしており、その全塩基配列及び推定アミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示した。該遺
伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列についてヒト
（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caenohabditis elegans, Cele;
F56H11.4）及び糸状菌（Mortierella alpina, Malp;GLE
LO）の脂肪酸鎖長延長酵素との比較した。 いずれのア
ミノ酸配列においても不飽和化酵素において見出された
タイプのヒスチジンクラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所
保存されていた。
【００１６】該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーデ
ィングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクター
ｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に挿入し、ｒ
ＥＬＯ１の酵母内染色体外発現用プラスミドを構築し
た。該酵素遺伝子の染色体内組み込み発現ベクターによ
り、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲ
ＯＧＥＮ社製）などの酵母に導入し組換えた酵母を常法
により培養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８
℃で２日間振とう培養を行い、培地にイコサペンタエン
酸を添加した結果、以下の操作により酵母菌体内にＤＰ
Ａ（ｎ−３）の蓄積することが確認された。終濃度 ２
％ となるようにガラクトースを添加して発現誘導さ
せ、２８時間培養を続けた後、細胞を回収した。細胞を
蒸留水で洗浄した後、クロロフォルム−メタノール
（２：１，ｖ／ｖ）を加えて脂質を抽出した。クロロフ
ォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて ６０
℃、３時間処理することにより、脂肪酸をメチルエステ
ル化した。
ィングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクター
ｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に挿入し、ｒ
ＥＬＯ１の酵母内染色体外発現用プラスミドを構築し
た。該酵素遺伝子の染色体内組み込み発現ベクターによ
り、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲ
ＯＧＥＮ社製）などの酵母に導入し組換えた酵母を常法
により培養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８
℃で２日間振とう培養を行い、培地にイコサペンタエン
酸を添加した結果、以下の操作により酵母菌体内にＤＰ
Ａ（ｎ−３）の蓄積することが確認された。終濃度 ２
％ となるようにガラクトースを添加して発現誘導さ
せ、２８時間培養を続けた後、細胞を回収した。細胞を
蒸留水で洗浄した後、クロロフォルム−メタノール
（２：１，ｖ／ｖ）を加えて脂質を抽出した。クロロフ
ォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて ６０
℃、３時間処理することにより、脂肪酸をメチルエステ
ル化した。
【００１７】前記脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出
後、ガスクロマトグラフィー （Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｇ
Ｃ−１７Ａ、カラム ＴＣ−７０）により、脂肪酸組成
を分析した。ＧＣ−ＭＳ分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯ
Ｌ） を用いて、７０ｅＶにおけるＥＩ−ＭＳにより行
った。 その結果、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープン
リーディングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベ
クターに挿入し、まず、基質脂肪酸を添加しない条件で
酵母発現に供したところパルミトオレイン酸の鎖長延長
産物であるＣ１８：１ｎ−７の生成が認められた。γ−
リノレン酸（ＧＬＡ）あるいはアラキドン酸の存在下で
は、それぞれジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）及び
ドコサテトラエン酸に対応するピークの生成が認められ
た。
後、ガスクロマトグラフィー （Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｇ
Ｃ−１７Ａ、カラム ＴＣ−７０）により、脂肪酸組成
を分析した。ＧＣ−ＭＳ分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯ
Ｌ） を用いて、７０ｅＶにおけるＥＩ−ＭＳにより行
った。 その結果、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープン
リーディングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベ
クターに挿入し、まず、基質脂肪酸を添加しない条件で
酵母発現に供したところパルミトオレイン酸の鎖長延長
産物であるＣ１８：１ｎ−７の生成が認められた。γ−
リノレン酸（ＧＬＡ）あるいはアラキドン酸の存在下で
は、それぞれジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）及び
ドコサテトラエン酸に対応するピークの生成が認められ
た。
【００１８】イコサペンタエン酸の存在下で該遺伝子
（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現を行った結果、目的物質で
あるｎ−３系ドコサペンタエン酸を５１．６％の変換率
で生成することが出来た（図１）。その他、α−リノレ
ン酸、ｎ−３オクタデカテトラエン酸、ＤＧＬＡについ
ても鎖長延長が認められ、これらの基質脂肪酸の変換率
を表１に示した。 ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及び
ｎ−６ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）につい
ては基質脂肪酸として添加しても、鎖長延長は認められ
なかった。
（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現を行った結果、目的物質で
あるｎ−３系ドコサペンタエン酸を５１．６％の変換率
で生成することが出来た（図１）。その他、α−リノレ
ン酸、ｎ−３オクタデカテトラエン酸、ＤＧＬＡについ
ても鎖長延長が認められ、これらの基質脂肪酸の変換率
を表１に示した。 ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及び
ｎ−６ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）につい
ては基質脂肪酸として添加しても、鎖長延長は認められ
なかった。
【００１９】表１に遺伝子（ｒＥＬＯ１）発現酵素の基
質特異性をまとめた。
質特異性をまとめた。
【００２０】
【表１】
【００２１】＊変換率＝％生成脂肪酸／（％生成脂肪酸
＋％基質脂肪酸）×１００、 ３回の平均値を示す。
＋％基質脂肪酸）×１００、 ３回の平均値を示す。
【００２２】ラット肝ｃＤＮＡライブラリーからクロー
ニングされた該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は脂肪酸鎖長延長
酵素をコードしており、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）の産生
する酵素は、脂肪酸の鎖長延長を行いイコサペンタエン
酸からｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換する機能を
持つ酵素である。
ニングされた該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は脂肪酸鎖長延長
酵素をコードしており、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）の産生
する酵素は、脂肪酸の鎖長延長を行いイコサペンタエン
酸からｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換する機能を
持つ酵素である。
【００２３】本発明において、該酵素遺伝子の活性発現
のため宿主細胞における発現用ベクターとして、例え
ば、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）を宿主細胞への組み込み
に、染色体外組み込みプラスミド、例えば、酵母発現用
プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１により形質転換され
てなる形質転換体を用いる。すなわち、該酵素遺伝子の
活性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一
例として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae ）の染色体外発現用プラスミ
ドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図２で示さ
れる。該プラスミドの酵母サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）への組み込みはＵＲＡ３
マーカーにより選択される。遺伝子発現は．ＧＡＬ１プ
ロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネーター
（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースにより誘
導される。
のため宿主細胞における発現用ベクターとして、例え
ば、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）を宿主細胞への組み込み
に、染色体外組み込みプラスミド、例えば、酵母発現用
プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１により形質転換され
てなる形質転換体を用いる。すなわち、該酵素遺伝子の
活性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一
例として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae ）の染色体外発現用プラスミ
ドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図２で示さ
れる。該プラスミドの酵母サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）への組み込みはＵＲＡ３
マーカーにより選択される。遺伝子発現は．ＧＡＬ１プ
ロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネーター
（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースにより誘
導される。
【００２４】該プラスミド（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
の酵母へのトランスフォーメーションは次のようにして
行うのがよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）などの酵母を、常法により培
養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２日
間浸透培養を行った。得られた培養液について、遠心分
離を繰り返して精製した後、酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液
と上記のプラスミドベクターｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１溶
液とを加え、良く混合した後、再び培養する。培養は十
分に乾かしたＳＤ培地にて２８℃で３〜４日の条件で行
うのがよい。
の酵母へのトランスフォーメーションは次のようにして
行うのがよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）などの酵母を、常法により培
養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２日
間浸透培養を行った。得られた培養液について、遠心分
離を繰り返して精製した後、酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液
と上記のプラスミドベクターｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１溶
液とを加え、良く混合した後、再び培養する。培養は十
分に乾かしたＳＤ培地にて２８℃で３〜４日の条件で行
うのがよい。
【００２５】本発明における、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）
を宿主細胞への組み込みに、染色体内組み込みプラスミ
ド、例えば、酵母発現用プラスミドｐＭＯ３／ｒＥＬＯ
１により形質転換される。すなわち、該酵素遺伝子の活
性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一例
として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）の染色体内発現用プラスミドｐ
ＭＯ３／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図３で示される。
該プラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵素消化した後、酵
母内に導入すると、δ配列（トランスポゾン）により染
色体ＤＮＡにランダムに組み込まれる。酵母発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１の酵母へのトラン
スフォーメーションはプラスミドベクターｐＹＥＳ２／
ｒＥＬＯ１と同様に行い、ＵＲＡ３マーカーにより選択
されるが、染色体に組み込まれた後は選択を必要としな
い。
を宿主細胞への組み込みに、染色体内組み込みプラスミ
ド、例えば、酵母発現用プラスミドｐＭＯ３／ｒＥＬＯ
１により形質転換される。すなわち、該酵素遺伝子の活
性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一例
として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）の染色体内発現用プラスミドｐ
ＭＯ３／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図３で示される。
該プラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵素消化した後、酵
母内に導入すると、δ配列（トランスポゾン）により染
色体ＤＮＡにランダムに組み込まれる。酵母発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１の酵母へのトラン
スフォーメーションはプラスミドベクターｐＹＥＳ２／
ｒＥＬＯ１と同様に行い、ＵＲＡ３マーカーにより選択
されるが、染色体に組み込まれた後は選択を必要としな
い。
【００２６】本発明においては、該遺伝子の発現のため
の宿主細胞は、真核細胞であればよい。すなわち、上記
のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の代わりに他の酵母やムコール属（Mucor s
p.）、モルティエレラ属（Mortierella sp.）などの糸
状菌を初め、植物、動物を宿主細胞として用いても、そ
れぞれに適切な条件を選択することにより形質転換をす
ることが可能である。これらの形質転換体を用いる場
合、適切にイコサペンタエン酸を供給し、該遺伝子の発
現条件を整えることによりイコサペンタエン酸の炭素鎖
長の延長によるｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換す
ることができる。
の宿主細胞は、真核細胞であればよい。すなわち、上記
のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の代わりに他の酵母やムコール属（Mucor s
p.）、モルティエレラ属（Mortierella sp.）などの糸
状菌を初め、植物、動物を宿主細胞として用いても、そ
れぞれに適切な条件を選択することにより形質転換をす
ることが可能である。これらの形質転換体を用いる場
合、適切にイコサペンタエン酸を供給し、該遺伝子の発
現条件を整えることによりイコサペンタエン酸の炭素鎖
長の延長によるｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換す
ることができる。
【００２７】本発明においては、該真核細胞の中でも、
該ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換
体作成のための宿主細胞としては酵母を用いることが好
ましい。酵母は真核細胞にして、特に、哺乳類由来の脂
肪酸不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現に
優れた機能を持ち、しかも、該遺伝子の導入された形質
転換体も、該脂肪酸の製造方法についての実施の形態に
おいて記述してあるようにその作成する上での、ベクタ
ープラスミドの構築など従来の知見を多く利用できるほ
か、作成された形質転換体の機能発現における、培養の
し易さ、発現を促進するための培養条件の設定におい
て、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造のために原料と
なるイコサペンタエン酸添加条件の設定を行う上での簡
便さにおいて優れた機能を有している。
該ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換
体作成のための宿主細胞としては酵母を用いることが好
ましい。酵母は真核細胞にして、特に、哺乳類由来の脂
肪酸不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現に
優れた機能を持ち、しかも、該遺伝子の導入された形質
転換体も、該脂肪酸の製造方法についての実施の形態に
おいて記述してあるようにその作成する上での、ベクタ
ープラスミドの構築など従来の知見を多く利用できるほ
か、作成された形質転換体の機能発現における、培養の
し易さ、発現を促進するための培養条件の設定におい
て、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造のために原料と
なるイコサペンタエン酸添加条件の設定を行う上での簡
便さにおいて優れた機能を有している。
【００２８】本発明においては、該酵母の中でも、該ｎ
−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換体作
成のための宿主細胞としてサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス
（Pichia pastoris）を用いることが好ましい。該長酵
素遺伝子の活性発現のため、宿主細胞における発現用ベ
クターの一例として構築した酵母サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に組み込むため
の、図２で示された染色体外発現用プラスミドｐＹＥＳ
２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は、サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＩＮＶＳｃ１
（his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社
製）などの酵母に組み込まれる。酵母ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）を宿主細胞とする形質転換体作
成系は、宿主、ベクター系において形質転換体の形質発
現に優れており、菌体の増殖性能に優れ、形質転換体を
用いてのｎ−３系ドコサペンタエン酸の工業的な製造に
関しては望ましい宿主細胞として利用できる。
−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換体作
成のための宿主細胞としてサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス
（Pichia pastoris）を用いることが好ましい。該長酵
素遺伝子の活性発現のため、宿主細胞における発現用ベ
クターの一例として構築した酵母サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に組み込むため
の、図２で示された染色体外発現用プラスミドｐＹＥＳ
２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は、サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＩＮＶＳｃ１
（his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社
製）などの酵母に組み込まれる。酵母ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）を宿主細胞とする形質転換体作
成系は、宿主、ベクター系において形質転換体の形質発
現に優れており、菌体の増殖性能に優れ、形質転換体を
用いてのｎ−３系ドコサペンタエン酸の工業的な製造に
関しては望ましい宿主細胞として利用できる。
【００２９】本発明では、前記形質転換体、一例として
形質転換酵母ＹＥＬ−５株（ＦＥＲＭ）を、ＧＹ培地、
ＹＭ培地あるいは培地組成、グルコース１〜１０％好ま
しくは２〜８％、酵母エキス０．１〜３％好ましくは
０．５〜２％、ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％好まし
くは０．１〜０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０１〜０．２
％好ましくは０．０２〜０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．０１〜０．２％好ましくは０．０２〜０．１％を
水に溶解した培地に培養温度２０〜３５℃好ましくは２
５〜３２℃で培養し、イコサペンタエン酸０．１〜２０
０ｍＭ好ましくは０．５〜１００ｍＭを添加し、当該脂
肪酸を細胞内あるいは細胞外に蓄積させることを特徴と
する。すなわち、該形質転換体を培養するにあたり、培
地の炭素源や窒素源の種類、培養温度、培養時間などの
培養条件については、ｎ−３系ドコサペンタエン酸を多
量に生産するのに最適な条件を適宜選択することが出来
る。
形質転換酵母ＹＥＬ−５株（ＦＥＲＭ）を、ＧＹ培地、
ＹＭ培地あるいは培地組成、グルコース１〜１０％好ま
しくは２〜８％、酵母エキス０．１〜３％好ましくは
０．５〜２％、ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％好まし
くは０．１〜０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０１〜０．２
％好ましくは０．０２〜０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．０１〜０．２％好ましくは０．０２〜０．１％を
水に溶解した培地に培養温度２０〜３５℃好ましくは２
５〜３２℃で培養し、イコサペンタエン酸０．１〜２０
０ｍＭ好ましくは０．５〜１００ｍＭを添加し、当該脂
肪酸を細胞内あるいは細胞外に蓄積させることを特徴と
する。すなわち、該形質転換体を培養するにあたり、培
地の炭素源や窒素源の種類、培養温度、培養時間などの
培養条件については、ｎ−３系ドコサペンタエン酸を多
量に生産するのに最適な条件を適宜選択することが出来
る。
【００３０】以下において、本発明を実施例により詳し
く説明する。なお、本発明は実施例のみに限定されるも
のではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特
記しない限り宝酒造、シグマ、ナカライテスク、片山化
学又はＤｉｆｃｏの各社から購入した分析レベルおよび
生化学レベルのものを使用した。
く説明する。なお、本発明は実施例のみに限定されるも
のではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特
記しない限り宝酒造、シグマ、ナカライテスク、片山化
学又はＤｉｆｃｏの各社から購入した分析レベルおよび
生化学レベルのものを使用した。
【００３１】実施例１
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子のクローニングに関す
る。
る。
【００３２】ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長酵
素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考と
して、これに相同のマウスＥＳＴクローンをＮＣＢＩデ
ータベースにおいて検索し、高い相同性を示すものとし
てＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得た。 こ
れらは互いにオーバーラップしており、それぞれ開始コ
ドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を含んで
おり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１と高相
同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウスの遺
伝子情報から、以下のプライマーＦ１及びプライマーＲ
１を作成した。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限
酵素ＨｉｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含
み、プライマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素Ｘｂａ
Ｉによる開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。
Ｆ１，５’−ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’ （配列番号
２） （斜字体はＨｉｎｄIII部位、下線は開始コドン） Ｒ１，５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧ−３’ （配列番号
３） （斜字体はＸｂａ Ｉ部位、下線は終止コドン）
素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考と
して、これに相同のマウスＥＳＴクローンをＮＣＢＩデ
ータベースにおいて検索し、高い相同性を示すものとし
てＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得た。 こ
れらは互いにオーバーラップしており、それぞれ開始コ
ドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を含んで
おり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１と高相
同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウスの遺
伝子情報から、以下のプライマーＦ１及びプライマーＲ
１を作成した。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限
酵素ＨｉｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含
み、プライマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素Ｘｂａ
Ｉによる開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。
Ｆ１，５’−ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’ （配列番号
２） （斜字体はＨｉｎｄIII部位、下線は開始コドン） Ｒ１，５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧ−３’ （配列番号
３） （斜字体はＸｂａ Ｉ部位、下線は終止コドン）
【００３３】これらを用いてラット肝ｃＤＮＡライブラ
リー（Takara社製）をテンプレートとしてＰＣＲを行っ
た。このとき、ポリメラーゼとして高fidelityでＴｄＴ
（末端核酸付加酵素）活性のないＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ製）を用いた。反応混合液組成は以下の通り
である。
リー（Takara社製）をテンプレートとしてＰＣＲを行っ
た。このとき、ポリメラーゼとして高fidelityでＴｄＴ
（末端核酸付加酵素）活性のないＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ製）を用いた。反応混合液組成は以下の通り
である。
【００３４】
【表２】
【００３５】ＰＣＲの反応条件は９４℃×２ｍｉｎで反
応させた後、９４℃×１５ｓｅｃ／６０℃×３０ｓｅｃ
／６８℃×１ｍｉｎを１サイクルとして３５回繰り返す
ことで行った。反応液をアガロースゲル電気永動にか
け、染色後、紫外線照射して一つのバンドを確認した。
その結果得られた増幅断片（ｒＥＬＯ１）をｐＹＥＳ２
（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）の対応部位に挿入し形質
転換体を作成し、ダイターミネーター法により塩基配列
を決定した。
応させた後、９４℃×１５ｓｅｃ／６０℃×３０ｓｅｃ
／６８℃×１ｍｉｎを１サイクルとして３５回繰り返す
ことで行った。反応液をアガロースゲル電気永動にか
け、染色後、紫外線照射して一つのバンドを確認した。
その結果得られた増幅断片（ｒＥＬＯ１）をｐＹＥＳ２
（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）の対応部位に挿入し形質
転換体を作成し、ダイターミネーター法により塩基配列
を決定した。
【００３６】以下にその具体的な実施方法を例記する。
（１）アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出
ＵＶトランスイルミネーターで確認した目的のＤＮＡ断
片を、アガロースゲルより切り出し、ＣＯＮＣＥＲＴ
Rapid Gel Extraction System（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）およびＱＩＡＥＸ II Gel Extraction Kit（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）の各精製キットを用いて精製を行った。
方法は付属のプロトコールによった。 （２）ベクターへのライゲーション 上記（１）で取得し、精製したフラグメントを、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ easy vectorsystem（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
と、インサート：ベクター比が１：１０となるよう混合
した。混合溶液と等量のLigation High（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、１６℃で１時間以上インキュベートし
た。
片を、アガロースゲルより切り出し、ＣＯＮＣＥＲＴ
Rapid Gel Extraction System（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）およびＱＩＡＥＸ II Gel Extraction Kit（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）の各精製キットを用いて精製を行った。
方法は付属のプロトコールによった。 （２）ベクターへのライゲーション 上記（１）で取得し、精製したフラグメントを、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ easy vectorsystem（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
と、インサート：ベクター比が１：１０となるよう混合
した。混合溶液と等量のLigation High（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、１６℃で１時間以上インキュベートし
た。
【００３７】（３）コンピテントセルの調製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをＭ９プレートにストリーク
し、コロニーが確認出来るまで３７℃で培養した。シン
グルコロニーを掻き取り、１００ｍＬ（１Ｌフラスコ）
のＳＯＢ培地に懸濁し、１８℃で振とう培養した。ＯＤ
６００＝０．４〜０．８に達したとき、培養を終了して
培養液を直ちに氷水中において１０分間冷却した。培養
液を４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して上清を捨
てた。沈殿を３３ｍＬの氷冷Transformation buffer
（ＴＢ）に懸濁した後、さらに１０分間氷冷した。次い
で、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を回
収し、４ｍＬの氷冷ＴＢに懸濁した。さらに１ｍＬの５
０％グリセロールを加え、４００μＬずつ分注し、液体
窒素で凍らせて−８０℃で保存した。なお、ここで用い
たＴＢは、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ
2・２Ｈ2Ｏ、２５０ｍＭ ＫＣｌおよび５５ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏからなるものである。
し、コロニーが確認出来るまで３７℃で培養した。シン
グルコロニーを掻き取り、１００ｍＬ（１Ｌフラスコ）
のＳＯＢ培地に懸濁し、１８℃で振とう培養した。ＯＤ
６００＝０．４〜０．８に達したとき、培養を終了して
培養液を直ちに氷水中において１０分間冷却した。培養
液を４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して上清を捨
てた。沈殿を３３ｍＬの氷冷Transformation buffer
（ＴＢ）に懸濁した後、さらに１０分間氷冷した。次い
で、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を回
収し、４ｍＬの氷冷ＴＢに懸濁した。さらに１ｍＬの５
０％グリセロールを加え、４００μＬずつ分注し、液体
窒素で凍らせて−８０℃で保存した。なお、ここで用い
たＴＢは、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ
2・２Ｈ2Ｏ、２５０ｍＭ ＫＣｌおよび５５ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏからなるものである。
【００３８】（４）大腸菌への形質転換 コンピテント
セルとして調製したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、氷上で
融解し、ライゲーション済みのベクター溶液と混合し
た。氷上で５分間インキュベート後、３７℃で２分間熱
ショックを与えた後、再び氷上で５分間インキュベート
した。次に、これに滅菌水を９００μＬ加え、１２００
０ｒｐｍで２分間遠心した。上清を捨て、沈殿を５０μ
Ｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧに懸濁し、Ｘ−Ｇａｌとアン
ピシリンを含むＬＢプレート培地にまいた。プレートを
３７℃で１２時間インキュベートした後、コロニーの有
無の確認を行った。
セルとして調製したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、氷上で
融解し、ライゲーション済みのベクター溶液と混合し
た。氷上で５分間インキュベート後、３７℃で２分間熱
ショックを与えた後、再び氷上で５分間インキュベート
した。次に、これに滅菌水を９００μＬ加え、１２００
０ｒｐｍで２分間遠心した。上清を捨て、沈殿を５０μ
Ｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧに懸濁し、Ｘ−Ｇａｌとアン
ピシリンを含むＬＢプレート培地にまいた。プレートを
３７℃で１２時間インキュベートした後、コロニーの有
無の確認を行った。
【００３９】（５）ミニスケールでのプラスミド調製
終夜培養した大腸菌液の適量を採取し、９０００ｒｐｍ
で２分間遠心して菌体を回収した。これにＳｏｌｕｔｉ
ｏｎＩを１００μＬ加えてボルテックス懸濁し、さらに
ＳｏｌｕｔｉｏｎIIを２００μＬ加えて溶菌した。氷上
で５分間インキュベートしてから、ＳｏｌｕｔｉｏｎII
Iを２００μＬ加えて、ボルテックス後、１２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。得られた上清を別のチューブ
に採り、等量のイソプロパノールを加えてアルコール沈
殿にて精製した。なお、ここで用いたＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ〜IIIは、以下の組成からなるものである。 SolutionI : 50mM グルコース、25mM Tris-HCl(pH8.
0)、10mM EDTA SolutionII : 0.2N NaOH、1% SDSSolutionIII : 3M K-
acetate、11.5% acetate
で２分間遠心して菌体を回収した。これにＳｏｌｕｔｉ
ｏｎＩを１００μＬ加えてボルテックス懸濁し、さらに
ＳｏｌｕｔｉｏｎIIを２００μＬ加えて溶菌した。氷上
で５分間インキュベートしてから、ＳｏｌｕｔｉｏｎII
Iを２００μＬ加えて、ボルテックス後、１２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。得られた上清を別のチューブ
に採り、等量のイソプロパノールを加えてアルコール沈
殿にて精製した。なお、ここで用いたＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ〜IIIは、以下の組成からなるものである。 SolutionI : 50mM グルコース、25mM Tris-HCl(pH8.
0)、10mM EDTA SolutionII : 0.2N NaOH、1% SDSSolutionIII : 3M K-
acetate、11.5% acetate
【００４０】（６）制限酵素消化によるインサートの確
認 各酵素、バッファー、サンプルＤＮＡを以下の組成で混
合した。
認 各酵素、バッファー、サンプルＤＮＡを以下の組成で混
合した。
【表３】
なお、制限酵素の種類により、バッファーの種類の選
択、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＢＳＡの添加を適宜行
った。また、反応は３７℃で行った。
択、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＢＳＡの添加を適宜行
った。また、反応は３７℃で行った。
【００４１】（７）酵母発現用プラスミドベクターへの
組み込み 上記においてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ
（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）にクローニングされたラット肝
脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）をＨｉｎｄII
IおよびＸｂａＩにより制限酵素消化して切り出し、ア
ガロースゲル電気泳動、ゲル抽出を経て、インサートを
精製した。このインサートを、同じくＨｉｎｄIIIおよ
びＸｂａＩ消化後、脱リン酸化処理により精製されたｐ
ＹＥＳ２のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ部位にライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。コ
ロニーを終夜液体培養し、プラスミドの少量精製、制限
酵素消化によるインサートチェックおよび正逆判定を行
った。構築されたプラスミドベクターをｐＹＥＳ２／ｒ
ＥＬＯ１と名付けた。
組み込み 上記においてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ
（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）にクローニングされたラット肝
脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）をＨｉｎｄII
IおよびＸｂａＩにより制限酵素消化して切り出し、ア
ガロースゲル電気泳動、ゲル抽出を経て、インサートを
精製した。このインサートを、同じくＨｉｎｄIIIおよ
びＸｂａＩ消化後、脱リン酸化処理により精製されたｐ
ＹＥＳ２のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ部位にライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。コ
ロニーを終夜液体培養し、プラスミドの少量精製、制限
酵素消化によるインサートチェックおよび正逆判定を行
った。構築されたプラスミドベクターをｐＹＥＳ２／ｒ
ＥＬＯ１と名付けた。
【００４２】ダイターミネーター法による塩基配列の決
定は以下のように行った。DYEnamic ET Terminator Cyc
le Sequencing KIt (Amersham Pharmacia 社製）を用い
てサンプルを調製し、310 Genetic Analyzer(Applied B
iosystems 社製）によって配列を決定した。その結果、
得られたラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ
１）は、９００ｂｐからなるオープンリーディングフレ
ームを含み、２９９アミノ酸をコードしており、その全
塩基配列並びにその推定アミノ酸配列はそれぞれ配列表
の配列番号１の通りである。ラット肝脂肪酸鎖長延長酵
素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列（配列表の
配列番号１）についてヒト（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caen
ohabditis elegans,Cele;F56H11.4)及び糸状菌(Mortier
ella alpina, Malp;GLELO）の脂肪酸鎖長延長酵素との
比較した。
定は以下のように行った。DYEnamic ET Terminator Cyc
le Sequencing KIt (Amersham Pharmacia 社製）を用い
てサンプルを調製し、310 Genetic Analyzer(Applied B
iosystems 社製）によって配列を決定した。その結果、
得られたラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ
１）は、９００ｂｐからなるオープンリーディングフレ
ームを含み、２９９アミノ酸をコードしており、その全
塩基配列並びにその推定アミノ酸配列はそれぞれ配列表
の配列番号１の通りである。ラット肝脂肪酸鎖長延長酵
素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列（配列表の
配列番号１）についてヒト（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caen
ohabditis elegans,Cele;F56H11.4)及び糸状菌(Mortier
ella alpina, Malp;GLELO）の脂肪酸鎖長延長酵素との
比較した。
【００４３】ｒＥＬＯ１がＨＥＬＯ１とは極めて高い相
同性（９３．０％）を有しているが、線虫（Ｃｅｌｅ；
Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬ
Ｏ）とは相同性が低いこと（２７．３％及び３１．４
％）が明らかになった。いずれのアミノ酸配列において
も不飽和化酵素において見出されたタイプのヒスチジン
クラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所保存されていた。こ
れらの結果から、この配列表の配列番号１に記載された
塩基配列からなるフラグメントは、脂肪酸鎖長延長酵素
をコードした遺伝子であることが明らかである。
同性（９３．０％）を有しているが、線虫（Ｃｅｌｅ；
Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬ
Ｏ）とは相同性が低いこと（２７．３％及び３１．４
％）が明らかになった。いずれのアミノ酸配列において
も不飽和化酵素において見出されたタイプのヒスチジン
クラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所保存されていた。こ
れらの結果から、この配列表の配列番号１に記載された
塩基配列からなるフラグメントは、脂肪酸鎖長延長酵素
をコードした遺伝子であることが明らかである。
【００４４】実施例２
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の染色
体外発現用プラスミドベクターの構築に関する。
体外発現用プラスミドベクターの構築に関する。
【００４５】酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae ）の染色体外発現用ベクターｐＹ
ＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、酵母に
おいてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）
の活性を発現させるためのプラスミドベクターを以下の
ように構築した。実施例１で構築した酵母サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）の染色
体外発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８
ｋｂ）は図２で示される。このプラスミドの組み込みは
ＵＲＡ３マーカーにより選択される。遺伝子発現はＧＡ
Ｌ１プロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネ
ーター（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースに
より誘導される。
romyces cerevisiae ）の染色体外発現用ベクターｐＹ
ＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、酵母に
おいてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）
の活性を発現させるためのプラスミドベクターを以下の
ように構築した。実施例１で構築した酵母サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）の染色
体外発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８
ｋｂ）は図２で示される。このプラスミドの組み込みは
ＵＲＡ３マーカーにより選択される。遺伝子発現はＧＡ
Ｌ１プロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネ
ーター（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースに
より誘導される。
【００４６】実施例３
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の染色
体内組み込み発現用プラスミドベクターに関する。
体内組み込み発現用プラスミドベクターに関する。
【００４７】酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）
を用いて、酵母においてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝
子（ｒＥＬＯ１）の活性を発現させるためのプラスミド
ベクターを以下のように構築した。実施例１と同様にし
て構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラス
ミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１（７．８ｋｂ）は図
３で示される。このプラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵
素消化した後、酵母内に導入すると、δ配列（トランス
ポゾン）により染色体ＤＮＡにランダムに組み込まれ
る。ＵＲＡ３マーカーにより選択されるが、染色体に組
み込まれた後は選択の必要がない。遺伝子発現は、ＧＡ
Ｐプロモーター（ＰＧＡＰ）及びＧＡＰターミネーター
（ＴＧＡＰ）により制御され、構成的に発現される。
romyces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）
を用いて、酵母においてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝
子（ｒＥＬＯ１）の活性を発現させるためのプラスミド
ベクターを以下のように構築した。実施例１と同様にし
て構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラス
ミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１（７．８ｋｂ）は図
３で示される。このプラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵
素消化した後、酵母内に導入すると、δ配列（トランス
ポゾン）により染色体ＤＮＡにランダムに組み込まれ
る。ＵＲＡ３マーカーにより選択されるが、染色体に組
み込まれた後は選択の必要がない。遺伝子発現は、ＧＡ
Ｐプロモーター（ＰＧＡＰ）及びＧＡＰターミネーター
（ＴＧＡＰ）により制御され、構成的に発現される。
【００４８】実施例４
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母
への形質転換並びに該遺伝子の酵母内での活性発現に関
する。
への形質転換並びに該遺伝子の酵母内での活性発現に関
する。
【００４９】ｒＥＬＯ１遺伝子染色体外発現プラスミド
ベクター（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１、図２）を酢酸リチ
ウム法により酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae )INVSc1(α/a,his3,leu2,ura3,trp
1）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に 導入し、形質転
換した。その手順は以下の通りである。ＹＰＤ液体培地
５ｍＬに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae ）ＩＮＶＳｃ１株を植菌し、２８℃で２
日間振とう培養を行った。ＹＰＤ液体培地の組成は、グ
ルコース２％、ポリペプトン２％および酵母エキス１％
を含むものである。培養液１ｍＬをチューブに採り、２
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿に酢
酸リチウム溶液を１ｍＬ加え、良く混合した後、２００
０ｒｐｍで５分間遠心して、上清を捨てた。
ベクター（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１、図２）を酢酸リチ
ウム法により酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae )INVSc1(α/a,his3,leu2,ura3,trp
1）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に 導入し、形質転
換した。その手順は以下の通りである。ＹＰＤ液体培地
５ｍＬに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae ）ＩＮＶＳｃ１株を植菌し、２８℃で２
日間振とう培養を行った。ＹＰＤ液体培地の組成は、グ
ルコース２％、ポリペプトン２％および酵母エキス１％
を含むものである。培養液１ｍＬをチューブに採り、２
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿に酢
酸リチウム溶液を１ｍＬ加え、良く混合した後、２００
０ｒｐｍで５分間遠心して、上清を捨てた。
【００５０】なお、ここで用いた酢酸リチウム溶液は、
１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるものであ
る。次いで、沈殿に酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液２００μ
Ｌとプラスミド溶液５μＬ（１μｇ／μＬ）とを加え、
よく混合した後、混合液を３０℃の湯浴で１時間インキ
ュベートした。その後、さらに４２℃の湯浴で１０分間
インキュベートした。ここで用いた酢酸リチウム／ＰＥ
Ｇ溶液は、１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび
４０％ＰＥＧ４０００からなるものである。続いて、こ
の培養物を、よく乾かしたＳＤ培地にまいて２８℃で
３，４日培養した。ＳＤ培地の組成は、グルコース２
％、yeast nitrogen-base w/o amino acid ０．７％、
ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン ６０μｇ／ｍ
Ｌ、トリプトファン ４０μｇ／ｍＬである。
１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるものであ
る。次いで、沈殿に酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液２００μ
Ｌとプラスミド溶液５μＬ（１μｇ／μＬ）とを加え、
よく混合した後、混合液を３０℃の湯浴で１時間インキ
ュベートした。その後、さらに４２℃の湯浴で１０分間
インキュベートした。ここで用いた酢酸リチウム／ＰＥ
Ｇ溶液は、１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび
４０％ＰＥＧ４０００からなるものである。続いて、こ
の培養物を、よく乾かしたＳＤ培地にまいて２８℃で
３，４日培養した。ＳＤ培地の組成は、グルコース２
％、yeast nitrogen-base w/o amino acid ０．７％、
ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン ６０μｇ／ｍ
Ｌ、トリプトファン ４０μｇ／ｍＬである。
【００５１】以下、酵母での脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子
の活性発現について記述する。上記ＳＤ培地上に現れた
コロニーを掻き取り、５ｍＬのＳＣＴ培地（選択培地）
にて２８℃で一晩前培養を行った。なお、ＳＣＴ培地の
組成は、ラフィノース４％、yeast nitrogen-base w/o
amino acid ０．７％、界面活性剤（商品名：ｔｅｒｇ
ｉｔｏｌ）１％、ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン
６０μｇ／ｍＬ、トリプトファン４０μｇ／ｍＬであ
る。ＳＣＴ培地に、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）、
α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）、γ−リノレン酸
（Ｃ１８：３ｎ−６）、ｎ−３オクタデカテトラエン酸
（Ｃ１８：４ｎ−３）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２
０：３ｎ−６）、ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）、アラ
キドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、イコサペンタエン酸
（Ｃ２０：５ｎ−３）およびｎ−６ドコサテトラエン酸
（Ｃ２０：４ｎ−６）のうちのいずれかを基質として１
ｍＭ添加したものを各４５ｍＬを用意した。これら９つ
のＳＣＴ培地および脂肪酸を加えない培地それぞれに、
前培養液を菌数が２×１０5／ｍＬとなるように植菌
し、２８℃で振とうしながらガラクトースを添加し、さ
らに１６時間培養した。
の活性発現について記述する。上記ＳＤ培地上に現れた
コロニーを掻き取り、５ｍＬのＳＣＴ培地（選択培地）
にて２８℃で一晩前培養を行った。なお、ＳＣＴ培地の
組成は、ラフィノース４％、yeast nitrogen-base w/o
amino acid ０．７％、界面活性剤（商品名：ｔｅｒｇ
ｉｔｏｌ）１％、ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン
６０μｇ／ｍＬ、トリプトファン４０μｇ／ｍＬであ
る。ＳＣＴ培地に、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）、
α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）、γ−リノレン酸
（Ｃ１８：３ｎ−６）、ｎ−３オクタデカテトラエン酸
（Ｃ１８：４ｎ−３）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２
０：３ｎ−６）、ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）、アラ
キドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、イコサペンタエン酸
（Ｃ２０：５ｎ−３）およびｎ−６ドコサテトラエン酸
（Ｃ２０：４ｎ−６）のうちのいずれかを基質として１
ｍＭ添加したものを各４５ｍＬを用意した。これら９つ
のＳＣＴ培地および脂肪酸を加えない培地それぞれに、
前培養液を菌数が２×１０5／ｍＬとなるように植菌
し、２８℃で振とうしながらガラクトースを添加し、さ
らに１６時間培養した。
【００５２】培養終了後、培養液を５０ｍＬ容コニカル
チューブに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清
を捨てた。次いで、菌体に滅菌水５ｍＬ加えてボルテッ
クスし、再び２０００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て
た。菌体からの脂質の抽出は以下のようにして行った。
菌体を１ｍＬの滅菌水に懸濁し、ネジ口試験管に移して
等量のクロロフォルム−メタノール（２：１，ｖ／ｖ）
を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで２分間遠心
した。下層のクロロフォルム層を試験管に取り、クロロ
フォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて６０
℃、３時間処理することによりメチルエステル化した。
脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出後、ガスクロマト
グラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１７Ａ、カラム
ＴＣ−７０）により脂肪酸組成を分析した。ＧＣ−ＭＳ
分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯＬ）を用いて、７０ｅＶ
におけるＥＩ−ＭＳにより行った。
チューブに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清
を捨てた。次いで、菌体に滅菌水５ｍＬ加えてボルテッ
クスし、再び２０００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て
た。菌体からの脂質の抽出は以下のようにして行った。
菌体を１ｍＬの滅菌水に懸濁し、ネジ口試験管に移して
等量のクロロフォルム−メタノール（２：１，ｖ／ｖ）
を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで２分間遠心
した。下層のクロロフォルム層を試験管に取り、クロロ
フォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて６０
℃、３時間処理することによりメチルエステル化した。
脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出後、ガスクロマト
グラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１７Ａ、カラム
ＴＣ−７０）により脂肪酸組成を分析した。ＧＣ−ＭＳ
分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯＬ）を用いて、７０ｅＶ
におけるＥＩ−ＭＳにより行った。
【００５３】その結果、ラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺
伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクターに挿入し、まず、
基質脂肪酸を添加しない条件で酵母発現に供したところ
パルミトオレイン酸の鎖長延長産物であるＣ１８：１ｎ
−７の生成が認められた。このとき、微量ではあるがさ
らに鎖長延長されたＣ２０：１ｎ−７に対応すると思わ
れるピークが９．６ｍｉｎに観察され、これら内在性脂
肪酸に由来する鎖長延長産物は、基質脂肪酸を添加した
場合にも検出された。γ−リノレン酸（ＧＬＡ）あるい
はアラキドン酸の存在下では、それぞれジホモ−γ−リ
ノレン酸（ＤＧＬＡ）及びドコサテトラエン酸に対応す
るピークの生成が認められた。また、リノール酸存在下
で発現解析を行ったところ、微量であるがその鎖長延長
産物であるＣ２０：２Δ１１，１４の生成が認められ
た。イコサペンタエン酸の存在下でｒＥＬＯ１の酵母内
発現を行った結果、目的物質であるｎ−３系ドコサペン
タエン酸を５１．６％の変換率で生成することが出来た
（図１）。
伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクターに挿入し、まず、
基質脂肪酸を添加しない条件で酵母発現に供したところ
パルミトオレイン酸の鎖長延長産物であるＣ１８：１ｎ
−７の生成が認められた。このとき、微量ではあるがさ
らに鎖長延長されたＣ２０：１ｎ−７に対応すると思わ
れるピークが９．６ｍｉｎに観察され、これら内在性脂
肪酸に由来する鎖長延長産物は、基質脂肪酸を添加した
場合にも検出された。γ−リノレン酸（ＧＬＡ）あるい
はアラキドン酸の存在下では、それぞれジホモ−γ−リ
ノレン酸（ＤＧＬＡ）及びドコサテトラエン酸に対応す
るピークの生成が認められた。また、リノール酸存在下
で発現解析を行ったところ、微量であるがその鎖長延長
産物であるＣ２０：２Δ１１，１４の生成が認められ
た。イコサペンタエン酸の存在下でｒＥＬＯ１の酵母内
発現を行った結果、目的物質であるｎ−３系ドコサペン
タエン酸を５１．６％の変換率で生成することが出来た
（図１）。
【００５４】その他、α−リノレン酸、ｎ−３オクタデ
カテトラエン酸、ＤＧＬＡについても鎖長延長が認めら
れ、これらの基質脂肪酸の変換率を表１に示した。ミー
ド酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及びｎ−６ドコサテトラエン
酸（Ｃ２２：４ｎ−６）については基質脂肪酸を添加し
ても鎖長延長は認められなかった（表１）。このことか
らラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子による形質転換酵
母ＹＥＬ−５株において、イコサペンタエン酸の存在下
で培養することにより、ｎ−３系ドコサペンタエン酸に
変換され、ｎ−３系ドコサペンタエン酸が生産されるこ
とが確認できた。
カテトラエン酸、ＤＧＬＡについても鎖長延長が認めら
れ、これらの基質脂肪酸の変換率を表１に示した。ミー
ド酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及びｎ−６ドコサテトラエン
酸（Ｃ２２：４ｎ−６）については基質脂肪酸を添加し
ても鎖長延長は認められなかった（表１）。このことか
らラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子による形質転換酵
母ＹＥＬ−５株において、イコサペンタエン酸の存在下
で培養することにより、ｎ−３系ドコサペンタエン酸に
変換され、ｎ−３系ドコサペンタエン酸が生産されるこ
とが確認できた。
【００５５】
【表４】
【００５６】
【表５】
【００５７】
【表６】
【００５８】
【表７】
【００５９】
【発明の効果】本発明によるｎ−３系ドコサペンタエン
酸の製造方法は、従来その生産技術が存在しないｎ−３
系ドコサペンタエン酸の工場生産を可能にするものであ
る。また、ｎ−３系ドコサペンタエン酸は高い生理活性
が期待され、その生産物は医薬品、健康食品、特定保健
養食品等の広範な用途が期待される。
酸の製造方法は、従来その生産技術が存在しないｎ−３
系ドコサペンタエン酸の工場生産を可能にするものであ
る。また、ｎ−３系ドコサペンタエン酸は高い生理活性
が期待され、その生産物は医薬品、健康食品、特定保健
養食品等の広範な用途が期待される。
【図１】本発明の形質転換酵母において導入した脂肪酸
鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現により
生じた脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の結果
を示した図である。すなわち、ｐＹＥＳ２またはｐＹＥ
Ｓ２にｒＥＬＯ１遺伝子を挿入したプラスミドを酵母サ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e） に導入してガラクトースによる発現誘導を行い、
細胞内脂肪酸をＧＣ解析した。ＥＰＡを基質として添加
し、ＤＰＡ（ｎ−３）の生成を確認した。ＥＰＡはイコ
サペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）を、ＤＰＡはｎ−
３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）をそれぞ
れ示している。
鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現により
生じた脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の結果
を示した図である。すなわち、ｐＹＥＳ２またはｐＹＥ
Ｓ２にｒＥＬＯ１遺伝子を挿入したプラスミドを酵母サ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e） に導入してガラクトースによる発現誘導を行い、
細胞内脂肪酸をＧＣ解析した。ＥＰＡを基質として添加
し、ＤＰＡ（ｎ−３）の生成を確認した。ＥＰＡはイコ
サペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）を、ＤＰＡはｎ−
３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）をそれぞ
れ示している。
【図２】ラット脂肪酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）の染
色体外発現用プラスミド （ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモ
ーター、ＴＣＹＣ１はＣＹＣ１ターミネーター、ＵＲＡ
３はマーカーを示している。
色体外発現用プラスミド （ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモ
ーター、ＴＣＹＣ１はＣＹＣ１ターミネーター、ＵＲＡ
３はマーカーを示している。
【図３】ラット脂肪酸鎖長延長酵素ｒＥＬＯ１の染色体
内組み込み発現用プラスミド（ｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＰはＧＡＰプロモータ
ー、ＴＧＡＰはＧＡＰターミネーター、δはトランスポ
ゾンδ配列、ＵＲＡ３はマーカーを示している。
内組み込み発現用プラスミド（ｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＰはＧＡＰプロモータ
ー、ＴＧＡＰはＧＡＰターミネーター、δはトランスポ
ゾンδ配列、ＵＲＡ３はマーカーを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月３０日（２００２．９．３
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法
法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｎ−３系ドコサペ
ンタエン酸の製造方法に関する。
ンタエン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、二重結合
がメチレン基を夾んで３個以上有り、その最初の二重結
合の位置が、メチル末端からの３番目の炭素に存在する
炭素数１８から２２の脂肪酸を総称するものである。こ
のｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、ヒトなど哺乳類では、
大豆など植物で生産される必須脂肪酸であるα−リノレ
ン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−３）を摂取することによ
り、不飽和化酵素、鎖長延長酵素による二重結合の導入
と炭素鎖長延長を繰り返し、プロスタグランジンIII群
の直接の前駆脂肪酸であるイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ、Ｃ２０：５ｎ−３）及び最終生成物である網膜ある
いは脳神経系に多量に存在し、極めて重要な働きが知ら
れているドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−
３）に変換され、生体の恒常性維持（ホメオスタシス）
に極めて大きな役割を担っている。
がメチレン基を夾んで３個以上有り、その最初の二重結
合の位置が、メチル末端からの３番目の炭素に存在する
炭素数１８から２２の脂肪酸を総称するものである。こ
のｎ−３系高度不飽和脂肪酸は、ヒトなど哺乳類では、
大豆など植物で生産される必須脂肪酸であるα−リノレ
ン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−３）を摂取することによ
り、不飽和化酵素、鎖長延長酵素による二重結合の導入
と炭素鎖長延長を繰り返し、プロスタグランジンIII群
の直接の前駆脂肪酸であるイコサペンタエン酸（ＥＰ
Ａ、Ｃ２０：５ｎ−３）及び最終生成物である網膜ある
いは脳神経系に多量に存在し、極めて重要な働きが知ら
れているドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−
３）に変換され、生体の恒常性維持（ホメオスタシス）
に極めて大きな役割を担っている。
【０００３】ｎ−３系高度不飽和脂肪酸としては、既
に、ＥＰＡ及びＤＨＡが良く知られており、専らマグ
ロ、イワシ、サバ、サンマなどの魚油から抽出、精製し
た素材が各種食品などに栄養強化添加物として用いられ
ている。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸の内では、その存在
は知られているが実際的にその生理作用についても研究
が進んでいなかったｎ−３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２
２：５ｎ−３、以下、ＤＰＡ（ｎ−３）と略記すること
がある）が、新たに冠状動脈硬化抑制因子としての生理
活性において、ＥＰＡの１０〜２０倍の活性を持つこと
が報告された（Docosapentaenoic acid:another key n-
3 player? INFORM,8,426-447(1997))。
に、ＥＰＡ及びＤＨＡが良く知られており、専らマグ
ロ、イワシ、サバ、サンマなどの魚油から抽出、精製し
た素材が各種食品などに栄養強化添加物として用いられ
ている。ｎ−３系高度不飽和脂肪酸の内では、その存在
は知られているが実際的にその生理作用についても研究
が進んでいなかったｎ−３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２
２：５ｎ−３、以下、ＤＰＡ（ｎ−３）と略記すること
がある）が、新たに冠状動脈硬化抑制因子としての生理
活性において、ＥＰＡの１０〜２０倍の活性を持つこと
が報告された（Docosapentaenoic acid:another key n-
3 player? INFORM,8,426-447(1997))。
【０００４】ＤＰＡ（ｎ−３）は炭素数２２で、カルボ
ン酸末端から７、１０、１３、１６、１９番目の炭素に
ｃｉｓ形の不飽和結合を持つｎ−３系高度不飽和脂肪酸
であり、ＥＰＡが炭素鎖長を延長したｎ−３系高度不飽
和脂肪酸であり、ＤＨＡに変換する脂肪酸中間体であ
る。その自然界での存在は、魚油中にもほとんど認めら
れず、僅かに、海産哺乳動物類でその存在が認められて
いるが、例えば、アザラシ（Harp seal）において、全
脂肪酸中の約６％の存在が認められているにとどまり、
クジラ（Sea whale）で１％内外である（日本油化学協
会編：油化学便覧改訂第３版pp.131,1990、丸善
（株））。
ン酸末端から７、１０、１３、１６、１９番目の炭素に
ｃｉｓ形の不飽和結合を持つｎ−３系高度不飽和脂肪酸
であり、ＥＰＡが炭素鎖長を延長したｎ−３系高度不飽
和脂肪酸であり、ＤＨＡに変換する脂肪酸中間体であ
る。その自然界での存在は、魚油中にもほとんど認めら
れず、僅かに、海産哺乳動物類でその存在が認められて
いるが、例えば、アザラシ（Harp seal）において、全
脂肪酸中の約６％の存在が認められているにとどまり、
クジラ（Sea whale）で１％内外である（日本油化学協
会編：油化学便覧改訂第３版pp.131,1990、丸善
（株））。
【０００５】ラビリンチュラ類の海洋性菌において、Ｄ
ＰＡ（ｎ−３）を約１〜３％生産する菌も得られている
が、その脂肪酸中の含量のレベルは低い（Kendrick, A.
andC.Ratledge, Lipids,27,15-10(1992))。前記海洋性
菌であるシゾキトリウム属菌（Shizochytrium sp.）に
おけるＤＨＡの生合成経路は、哺乳類におけるＤＨＡ生
合成経路とは全く異なり、ＤＰＡ（ｎ−６）を前駆脂肪
酸としており、ＤＰＡ（ｎ−３）をその前駆脂肪酸とは
していないため、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積するこ
とは、生合成経路上から可能性の低いことが報告された
（ラビリンチュラ類における高度不飽和脂肪酸の生合成
機構：秋庸裕、鈴木修、海洋と生物、２３（１）４６−
５１（２００１）。一方、同じくラビリンチュラ類に属
するトラウストキトリウム属菌（Traustochytrium s
p.）からＤＰＡ（ｎ−３）を前駆脂肪酸としてＤＨＡに
変換するΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が取得されたこ
とが極最近報告された（Identificaton ofa Δ4 desatu
rase from Traustchytrium sp. involved in biosynthe
sis of docosahexaenoic acid by heterologous expres
sion in Saccharomyces cerevisiae and Brasixa junc
a(2001), Xiao Quis,Haping Hong Samuel L. and L.Mac
kenzie, J.Biological Chemistry ）。
ＰＡ（ｎ−３）を約１〜３％生産する菌も得られている
が、その脂肪酸中の含量のレベルは低い（Kendrick, A.
andC.Ratledge, Lipids,27,15-10(1992))。前記海洋性
菌であるシゾキトリウム属菌（Shizochytrium sp.）に
おけるＤＨＡの生合成経路は、哺乳類におけるＤＨＡ生
合成経路とは全く異なり、ＤＰＡ（ｎ−６）を前駆脂肪
酸としており、ＤＰＡ（ｎ−３）をその前駆脂肪酸とは
していないため、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積するこ
とは、生合成経路上から可能性の低いことが報告された
（ラビリンチュラ類における高度不飽和脂肪酸の生合成
機構：秋庸裕、鈴木修、海洋と生物、２３（１）４６−
５１（２００１）。一方、同じくラビリンチュラ類に属
するトラウストキトリウム属菌（Traustochytrium s
p.）からＤＰＡ（ｎ−３）を前駆脂肪酸としてＤＨＡに
変換するΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が取得されたこ
とが極最近報告された（Identificaton ofa Δ4 desatu
rase from Traustchytrium sp. involved in biosynthe
sis of docosahexaenoic acid by heterologous expres
sion in Saccharomyces cerevisiae and Brasixa junc
a(2001), Xiao Quis,Haping Hong Samuel L. and L.Mac
kenzie, J.Biological Chemistry ）。
【０００６】海洋性菌においてのＤＨＡの生合成経路に
は多様な経路が存在し、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積
する菌株の存在の可能性は否定できないものの、ＤＰＡ
（ｎ−３）の大量生産菌のスクリーニングを数多くのサ
ンプルから試みたが、現段階では取得されていない。海
洋性菌においてもＤＰＡ（ｎ−３）はＤＨＡの前駆脂肪
酸であるため速やかにＤＨＡに変換され、菌体内に蓄積
される菌株は少ないことが推察された。
は多様な経路が存在し、ＤＰＡ（ｎ−３）を大量に蓄積
する菌株の存在の可能性は否定できないものの、ＤＰＡ
（ｎ−３）の大量生産菌のスクリーニングを数多くのサ
ンプルから試みたが、現段階では取得されていない。海
洋性菌においてもＤＰＡ（ｎ−３）はＤＨＡの前駆脂肪
酸であるため速やかにＤＨＡに変換され、菌体内に蓄積
される菌株は少ないことが推察された。
【０００７】ＤＰＡ（ｎ−３）は、海産哺乳類動物油脂
から分離による取得もその含量が少ないため困難であ
り、新規のｎ−３系高度不飽和脂肪酸素材としての市場
化はされておらず、また、素材の入手が容易でないた
め、その生理機能に関しての検討も充分行われていると
は言えない状況である。また、ＥＰＡは魚油に豊富に存
在しており、その単離も既に技術的に確立されている。
それ故、何らかの方法でＥＰＡをＤＰＡ（ｎ−３）に変
換することが出来れば、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の
高生産技術を確立することが可能となる。
から分離による取得もその含量が少ないため困難であ
り、新規のｎ−３系高度不飽和脂肪酸素材としての市場
化はされておらず、また、素材の入手が容易でないた
め、その生理機能に関しての検討も充分行われていると
は言えない状況である。また、ＥＰＡは魚油に豊富に存
在しており、その単離も既に技術的に確立されている。
それ故、何らかの方法でＥＰＡをＤＰＡ（ｎ−３）に変
換することが出来れば、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の
高生産技術を確立することが可能となる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＥＰＡの鎖
長延長を行うことによるｎ−３系ドコサペンタエン酸の
工業的な製造方法を提供することをその課題とする。
長延長を行うことによるｎ−３系ドコサペンタエン酸の
工業的な製造方法を提供することをその課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。本発明によれば、以下の方法が提供される。 （１）哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を導入し
て得られた形質転換体を培地に培養する際に、該培地に
イコサペンタエン酸を添加することにより、該イコサペ
ンタエン酸の炭素鎖長を延長してｎ−３系ドコサペンタ
エン酸に変換することを特徴とするｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （２）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が哺乳類由来の遺伝
子あることを特徴とする前記（１）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （３）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、ラット肝ｃＤＮ
Ａライブラリーよりクローニングされた脂肪酸鎖長延長
酵素遺伝子であることを特徴とする前記（２）に記載の
ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （４）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の２９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることを特徴とする前記（３）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （５）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の９００ｂｐの塩基配列を有する遺伝子であ
ることを特徴とする前記（４）に記載のｎ−３系ドコサ
ペンタエン酸の製造方法。 （６）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体外組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）にいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （７）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体内組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （８）該宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする
前記（６）又は（７）のいずれかに記載のｎ−３系ドコ
サペンタエン酸の製造方法。 （９）該真核細胞が、酵母であることを特徴とする前記
（８）に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。 （１０）該酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pich
ia pastoris）であることを特徴とする前記（９）に記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１１）該培養を、ＧＹ培地、ＹＭ培地あるいは培地組
成、グルコース１〜１０％、酵母エキス０．１〜３％、
ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％、ＫＨ2ＰＯ4０．０１
〜０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１〜０．２％
を水に溶解した培地を用いて培養温度２０〜３５℃で行
うことを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１２）該培地に添加する該イコサペンタエン酸が、遊
離脂肪酸又はそのメチルもしくはエチルエステルである
ことを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれかに記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１３）前記（１）〜（１２）のいずれかに記載のｎ−
３系ドコサペンタエン酸の製造方法により得られたｎ−
３系ドコサペンタエン酸又はそのエステル。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。本発明によれば、以下の方法が提供される。 （１）哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を導入し
て得られた形質転換体を培地に培養する際に、該培地に
イコサペンタエン酸を添加することにより、該イコサペ
ンタエン酸の炭素鎖長を延長してｎ−３系ドコサペンタ
エン酸に変換することを特徴とするｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （２）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が哺乳類由来の遺伝
子あることを特徴とする前記（１）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （３）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、ラット肝ｃＤＮ
Ａライブラリーよりクローニングされた脂肪酸鎖長延長
酵素遺伝子であることを特徴とする前記（２）に記載の
ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （４）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の２９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子
であることを特徴とする前記（３）に記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 （５）該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表の配列番
号１に記載の９００ｂｐの塩基配列を有する遺伝子であ
ることを特徴とする前記（４）に記載のｎ−３系ドコサ
ペンタエン酸の製造方法。 （６）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体外組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）にいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （７）該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の
宿主細胞への導入において、染色体内組み込み発現プラ
スミドにより形質転換されてなることを特徴とする前記
（１）〜（５）のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペン
タエン酸の製造方法。 （８）該宿主細胞が、真核細胞であることを特徴とする
前記（６）又は（７）のいずれかに記載のｎ−３系ドコ
サペンタエン酸の製造方法。 （９）該真核細胞が、酵母であることを特徴とする前記
（８）に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方
法。 （１０）該酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pich
ia pastoris）であることを特徴とする前記（９）に記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１１）該培養を、ＧＹ培地、ＹＭ培地あるいは培地組
成、グルコース１〜１０％、酵母エキス０．１〜３％、
ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％、ＫＨ2ＰＯ4０．０１
〜０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１〜０．２％
を水に溶解した培地を用いて培養温度２０〜３５℃で行
うことを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１２）該培地に添加する該イコサペンタエン酸が、遊
離脂肪酸又はそのメチルもしくはエチルエステルである
ことを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれかに記
載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 （１３）前記（１）〜（１２）のいずれかに記載のｎ−
３系ドコサペンタエン酸の製造方法により得られたｎ−
３系ドコサペンタエン酸又はそのエステル。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において用いる反応原料
は、イコサペンタエン酸又はそのエステルである。この
場合エステルとしては、炭素数１〜６の直鎖アルキルエ
ステル、好ましくはメチル及びエチルエステルが用いら
れる。
は、イコサペンタエン酸又はそのエステルである。この
場合エステルとしては、炭素数１〜６の直鎖アルキルエ
ステル、好ましくはメチル及びエチルエステルが用いら
れる。
【００１１】本発明において、哺乳類由来の脂肪酸鎖長
延長酵素遺伝子（以下、単に酵素遺伝子とも言う）の発
現プラスミド（以下、単にプラスミドとも言う）をベク
ターとして宿主細胞に導入した形質転換体を培養する際
に、該培地にイコサペンタエン酸又はそのエステルを添
加する。
延長酵素遺伝子（以下、単に酵素遺伝子とも言う）の発
現プラスミド（以下、単にプラスミドとも言う）をベク
ターとして宿主細胞に導入した形質転換体を培養する際
に、該培地にイコサペンタエン酸又はそのエステルを添
加する。
【００１２】本発明で用いる前記酵素遺伝子は哺乳類由
来の物であればよい。この場合哺乳類には、ヒト、マウ
ス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が包含され
る。
来の物であればよい。この場合哺乳類には、ヒト、マウ
ス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が包含され
る。
【００１３】前記酵素遺伝子として、ラット肝ｃＤＮＡ
ライブラリーから取得され、クローニングされた酵素遺
伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を持つ脂肪
酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）は、ヒト由来の該酵素
（ＨＥＬＯ１）とは高い相同性（９３．０％）を有して
いるが、線虫（Ｃｅｌｅ；Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状
菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬＯ）とは相同性が低いこと（２
７．３％及び３１．４％）が明らかである（Cloning of
a human cDNA encoding a novel enzyme involved in
the elongation of long-chain polyunsaturated fatty
acid(2000),Amenda E. Lonard, Emile G. Bobink, Jos
eph Dorad, Paul E. Kroeger, Lu-Te Chuang, Jennifer
M. Thurmond, Jennifer M. Parker-Branes, Tapas Da
s, Yung-Sheng Huang and Pradip Mukerji, Biochem.
J.,350,756-770））。しかも、線虫及び糸状菌の脂肪酸
鎖長延長酵素においては、その脂肪酸の鎖長が炭素数１
８の脂肪酸を炭素数２０への延長機能は持つが、炭素数
２０の脂肪酸を炭素数２２の脂肪酸への延長機能は持た
ないことが認められている（Heterologus reconstituti
on in yeast of the polyunsaturated fatty acid bios
ynthetic pathway(2000), Frederic Beaudoin, Louis
V. Michaelson, Sandra J. Hey, Mervyn J. Lewis, Pet
er R. Shewry, Olga Sayanova and Johnathan A. Napie
r, PANS,97,6421-6426 , Identification and characte
rization of an enzyme involved in the elongation o
f n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids(2000),Je
nnifer M. Paker-Barnes, Tapas Das, Emile Bobik, Am
anda E. Leonard, Jennifer M. Thurmond, Lu-Te Chaun
g, Yung-Sheng Huang, and Pradip Mukerji, PNAS,97,8
284-8289）。炭素数２０のイコサペンタエン酸を炭素数
２２のドコサペンタエン酸に炭素鎖長を延長するために
は哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素が必要であり、ｎ−
３系ドコサペンタエン酸製造の目的を果たすための脂肪
酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子は哺乳類由来である
ことが示される。
ライブラリーから取得され、クローニングされた酵素遺
伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を持つ脂肪
酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）は、ヒト由来の該酵素
（ＨＥＬＯ１）とは高い相同性（９３．０％）を有して
いるが、線虫（Ｃｅｌｅ；Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状
菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬＯ）とは相同性が低いこと（２
７．３％及び３１．４％）が明らかである（Cloning of
a human cDNA encoding a novel enzyme involved in
the elongation of long-chain polyunsaturated fatty
acid(2000),Amenda E. Lonard, Emile G. Bobink, Jos
eph Dorad, Paul E. Kroeger, Lu-Te Chuang, Jennifer
M. Thurmond, Jennifer M. Parker-Branes, Tapas Da
s, Yung-Sheng Huang and Pradip Mukerji, Biochem.
J.,350,756-770））。しかも、線虫及び糸状菌の脂肪酸
鎖長延長酵素においては、その脂肪酸の鎖長が炭素数１
８の脂肪酸を炭素数２０への延長機能は持つが、炭素数
２０の脂肪酸を炭素数２２の脂肪酸への延長機能は持た
ないことが認められている（Heterologus reconstituti
on in yeast of the polyunsaturated fatty acid bios
ynthetic pathway(2000), Frederic Beaudoin, Louis
V. Michaelson, Sandra J. Hey, Mervyn J. Lewis, Pet
er R. Shewry, Olga Sayanova and Johnathan A. Napie
r, PANS,97,6421-6426 , Identification and characte
rization of an enzyme involved in the elongation o
f n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids(2000),Je
nnifer M. Paker-Barnes, Tapas Das, Emile Bobik, Am
anda E. Leonard, Jennifer M. Thurmond, Lu-Te Chaun
g, Yung-Sheng Huang, and Pradip Mukerji, PNAS,97,8
284-8289）。炭素数２０のイコサペンタエン酸を炭素数
２２のドコサペンタエン酸に炭素鎖長を延長するために
は哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素が必要であり、ｎ−
３系ドコサペンタエン酸製造の目的を果たすための脂肪
酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子は哺乳類由来である
ことが示される。
【００１４】ラット肝の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子のク
ローニングは、ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長
酵素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考
として、これらに相同なマウスＥＳＴクローンをＮＣＢ
Ｉデータベースにおいて検索を行い、高い相同性を示す
ものとしてＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得
た。これらは互いにオーバーラップしており、それぞれ
開始コドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を
含んでおり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１
と高相同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウ
スの遺伝子情報から、ＰＣＲに使用するプライマーの設
計を行った。ＰＣＲに使用するプライマーの例として、
プライマーＦ１及びプライマーＲ１（それぞれの塩基配
列は、配列表の配列番号２、３参照）を用いることが出
来る。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含み、プラ
イマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素ＸｂａＩによる
開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。プライマ
ーＦ１及びＲ１を用いてラット肝ｃＤＮＡライブラリー
（Ｔａｋａｒａ 社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ
を行い、プライマーＦ１及びＲ１に挟まれた増幅産物
（ｒＥＬＯ１）を得て、塩基配列の決定した。
ローニングは、ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長
酵素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考
として、これらに相同なマウスＥＳＴクローンをＮＣＢ
Ｉデータベースにおいて検索を行い、高い相同性を示す
ものとしてＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得
た。これらは互いにオーバーラップしており、それぞれ
開始コドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を
含んでおり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１
と高相同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウ
スの遺伝子情報から、ＰＣＲに使用するプライマーの設
計を行った。ＰＣＲに使用するプライマーの例として、
プライマーＦ１及びプライマーＲ１（それぞれの塩基配
列は、配列表の配列番号２、３参照）を用いることが出
来る。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含み、プラ
イマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素ＸｂａＩによる
開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。プライマ
ーＦ１及びＲ１を用いてラット肝ｃＤＮＡライブラリー
（Ｔａｋａｒａ 社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ
を行い、プライマーＦ１及びＲ１に挟まれた増幅産物
（ｒＥＬＯ１）を得て、塩基配列の決定した。
【００１５】該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は、９００ｂｐか
らなるオープンリーディングフレームを含み、２９９ア
ミノ酸をコードしており、その全塩基配列及び推定アミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示した。該遺
伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列についてヒト
（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caenohabditis elegans, Cele;
F56H11.4）及び糸状菌（Mortierella alpina, Malp;GLE
LO）の脂肪酸鎖長延長酵素との比較した。 いずれのア
ミノ酸配列においても不飽和化酵素において見出された
タイプのヒスチジンクラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所
保存されていた。
らなるオープンリーディングフレームを含み、２９９ア
ミノ酸をコードしており、その全塩基配列及び推定アミ
ノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示した。該遺
伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列についてヒト
（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caenohabditis elegans, Cele;
F56H11.4）及び糸状菌（Mortierella alpina, Malp;GLE
LO）の脂肪酸鎖長延長酵素との比較した。 いずれのア
ミノ酸配列においても不飽和化酵素において見出された
タイプのヒスチジンクラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所
保存されていた。
【００１６】該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーデ
ィングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクター
ｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に挿入し、ｒ
ＥＬＯ１の酵母内染色体外発現用プラスミドを構築し
た。該酵素遺伝子の染色体内組み込み発現ベクターによ
り、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲ
ＯＧＥＮ社製）などの酵母に導入し組換えた酵母を常法
により培養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８
℃で２日間振とう培養を行い、培地にイコサペンタエン
酸を添加した結果、以下の操作により酵母菌体内にＤＰ
Ａ（ｎ−３）の蓄積することが確認された。終濃度 ２
％ となるようにガラクトースを添加して発現誘導さ
せ、２８時間培養を続けた後、細胞を回収した。細胞を
蒸留水で洗浄した後、クロロフォルム−メタノール
（２：１，ｖ／ｖ）を加えて脂質を抽出した。クロロフ
ォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて ６０
℃、３時間処理することにより、脂肪酸をメチルエステ
ル化した。
ィングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクター
ｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に挿入し、ｒ
ＥＬＯ１の酵母内染色体外発現用プラスミドを構築し
た。該酵素遺伝子の染色体内組み込み発現ベクターによ
り、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲ
ＯＧＥＮ社製）などの酵母に導入し組換えた酵母を常法
により培養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８
℃で２日間振とう培養を行い、培地にイコサペンタエン
酸を添加した結果、以下の操作により酵母菌体内にＤＰ
Ａ（ｎ−３）の蓄積することが確認された。終濃度 ２
％ となるようにガラクトースを添加して発現誘導さ
せ、２８時間培養を続けた後、細胞を回収した。細胞を
蒸留水で洗浄した後、クロロフォルム−メタノール
（２：１，ｖ／ｖ）を加えて脂質を抽出した。クロロフ
ォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて ６０
℃、３時間処理することにより、脂肪酸をメチルエステ
ル化した。
【００１７】前記脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出
後、ガスクロマトグラフィー （Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｇ
Ｃ−１７Ａ、カラム ＴＣ−７０）により、脂肪酸組成
を分析した。ＧＣ−ＭＳ分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯ
Ｌ） を用いて、７０ｅＶにおけるＥＩ−ＭＳにより行
った。 その結果、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープン
リーディングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベ
クターに挿入し、まず、基質脂肪酸を添加しない条件で
酵母発現に供したところパルミトオレイン酸の鎖長延長
産物であるＣ１８：１ｎ−７の生成が認められた。γ−
リノレン酸（ＧＬＡ）あるいはアラキドン酸の存在下で
は、それぞれジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）及び
ドコサテトラエン酸に対応するピークの生成が認められ
た。
後、ガスクロマトグラフィー （Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｇ
Ｃ−１７Ａ、カラム ＴＣ−７０）により、脂肪酸組成
を分析した。ＧＣ−ＭＳ分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯ
Ｌ） を用いて、７０ｅＶにおけるＥＩ−ＭＳにより行
った。 その結果、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）のオープン
リーディングフレームを含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベ
クターに挿入し、まず、基質脂肪酸を添加しない条件で
酵母発現に供したところパルミトオレイン酸の鎖長延長
産物であるＣ１８：１ｎ−７の生成が認められた。γ−
リノレン酸（ＧＬＡ）あるいはアラキドン酸の存在下で
は、それぞれジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）及び
ドコサテトラエン酸に対応するピークの生成が認められ
た。
【００１８】イコサペンタエン酸の存在下で該遺伝子
（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現を行った結果、目的物質で
あるｎ−３系ドコサペンタエン酸を５１．６％の変換率
で生成することが出来た（図１）。その他、α−リノレ
ン酸、ｎ−３オクタデカテトラエン酸、ＤＧＬＡについ
ても鎖長延長が認められ、これらの基質脂肪酸の変換率
を表１に示した。 ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及び
ｎ−６ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）につい
ては基質脂肪酸として添加しても、鎖長延長は認められ
なかった。
（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現を行った結果、目的物質で
あるｎ−３系ドコサペンタエン酸を５１．６％の変換率
で生成することが出来た（図１）。その他、α−リノレ
ン酸、ｎ−３オクタデカテトラエン酸、ＤＧＬＡについ
ても鎖長延長が認められ、これらの基質脂肪酸の変換率
を表１に示した。 ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及び
ｎ−６ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）につい
ては基質脂肪酸として添加しても、鎖長延長は認められ
なかった。
【００１９】表１に遺伝子（ｒＥＬＯ１）発現酵素の基
質特異性をまとめた。
質特異性をまとめた。
【００２０】
【表１】
【００２１】＊変換率＝％生成脂肪酸／（％生成脂肪酸
＋％基質脂肪酸）×１００、 ３回の平均値を示す。
＋％基質脂肪酸）×１００、 ３回の平均値を示す。
【００２２】ラット肝ｃＤＮＡライブラリーからクロー
ニングされた該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は脂肪酸鎖長延長
酵素をコードしており、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）の産生
する酵素は、脂肪酸の鎖長延長を行いイコサペンタエン
酸からｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換する機能を
持つ酵素である。
ニングされた該遺伝子（ｒＥＬＯ１）は脂肪酸鎖長延長
酵素をコードしており、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）の産生
する酵素は、脂肪酸の鎖長延長を行いイコサペンタエン
酸からｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換する機能を
持つ酵素である。
【００２３】本発明において、該酵素遺伝子の活性発現
のため宿主細胞における発現用ベクターとして、例え
ば、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）を宿主細胞への組み込み
に、染色体外組み込みプラスミド、例えば、酵母発現用
プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１により形質転換され
てなる形質転換体を用いる。すなわち、該酵素遺伝子の
活性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一
例として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae ）の染色体外発現用プラスミ
ドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図２で示さ
れる。該プラスミドの酵母サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）への組み込みはＵＲＡ３
マーカーにより選択される。遺伝子発現は．ＧＡＬ１プ
ロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネーター
（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースにより誘
導される。
のため宿主細胞における発現用ベクターとして、例え
ば、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）を宿主細胞への組み込み
に、染色体外組み込みプラスミド、例えば、酵母発現用
プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１により形質転換され
てなる形質転換体を用いる。すなわち、該酵素遺伝子の
活性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一
例として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae ）の染色体外発現用プラスミ
ドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図２で示さ
れる。該プラスミドの酵母サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）への組み込みはＵＲＡ３
マーカーにより選択される。遺伝子発現は．ＧＡＬ１プ
ロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネーター
（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースにより誘
導される。
【００２４】該プラスミド（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
の酵母へのトランスフォーメーションは次のようにして
行うのがよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）などの酵母を、常法により培
養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２日
間浸透培養を行った。得られた培養液について、遠心分
離を繰り返して精製した後、酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液
と上記のプラスミドベクターｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１溶
液とを加え、良く混合した後、再び培養する。培養は十
分に乾かしたＳＤ培地にて２８℃で３〜４日の条件で行
うのがよい。
の酵母へのトランスフォーメーションは次のようにして
行うのがよい。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae )INVSc1(his3,leu2,trp1,ura3）（Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）などの酵母を、常法により培
養する。すなわち、ＹＰＤ培地を用いて、２８℃で２日
間浸透培養を行った。得られた培養液について、遠心分
離を繰り返して精製した後、酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液
と上記のプラスミドベクターｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１溶
液とを加え、良く混合した後、再び培養する。培養は十
分に乾かしたＳＤ培地にて２８℃で３〜４日の条件で行
うのがよい。
【００２５】本発明における、該遺伝子（ｒＥＬＯ１）
を宿主細胞への組み込みに、染色体内組み込みプラスミ
ド、例えば、酵母発現用プラスミドｐＭＯ３／ｒＥＬＯ
１により形質転換される。すなわち、該酵素遺伝子の活
性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一例
として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）の染色体内発現用プラスミドｐ
ＭＯ３／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図３で示される。
該プラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵素消化した後、酵
母内に導入すると、δ配列（トランスポゾン）により染
色体ＤＮＡにランダムに組み込まれる。酵母発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１の酵母へのトラン
スフォーメーションはプラスミドベクターｐＹＥＳ２／
ｒＥＬＯ１と同様に行い、ＵＲＡ３マーカーにより選択
されるが、染色体に組み込まれた後は選択を必要としな
い。
を宿主細胞への組み込みに、染色体内組み込みプラスミ
ド、例えば、酵母発現用プラスミドｐＭＯ３／ｒＥＬＯ
１により形質転換される。すなわち、該酵素遺伝子の活
性発現のため、宿主細胞における発現用ベクターの一例
として構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）の染色体内発現用プラスミドｐ
ＭＯ３／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は図３で示される。
該プラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵素消化した後、酵
母内に導入すると、δ配列（トランスポゾン）により染
色体ＤＮＡにランダムに組み込まれる。酵母発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１の酵母へのトラン
スフォーメーションはプラスミドベクターｐＹＥＳ２／
ｒＥＬＯ１と同様に行い、ＵＲＡ３マーカーにより選択
されるが、染色体に組み込まれた後は選択を必要としな
い。
【００２６】本発明においては、該遺伝子の発現のため
の宿主細胞は、真核細胞であればよい。すなわち、上記
のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の代わりに他の酵母やムコール属（Mucor s
p.）、モルティエレラ属（Mortierella sp.）などの糸
状菌を初め、植物、動物を宿主細胞として用いても、そ
れぞれに適切な条件を選択することにより形質転換をす
ることが可能である。これらの形質転換体を用いる場
合、適切にイコサペンタエン酸を供給し、該遺伝子の発
現条件を整えることによりイコサペンタエン酸の炭素鎖
長の延長によるｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換す
ることができる。
の宿主細胞は、真核細胞であればよい。すなわち、上記
のサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）の代わりに他の酵母やムコール属（Mucor s
p.）、モルティエレラ属（Mortierella sp.）などの糸
状菌を初め、植物、動物を宿主細胞として用いても、そ
れぞれに適切な条件を選択することにより形質転換をす
ることが可能である。これらの形質転換体を用いる場
合、適切にイコサペンタエン酸を供給し、該遺伝子の発
現条件を整えることによりイコサペンタエン酸の炭素鎖
長の延長によるｎ−３系ドコサペンタエン酸への変換す
ることができる。
【００２７】本発明においては、該真核細胞の中でも、
該ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換
体作成のための宿主細胞としては酵母を用いることが好
ましい。酵母は真核細胞にして、特に、哺乳類由来の脂
肪酸不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現に
優れた機能を持ち、しかも、該遺伝子の導入された形質
転換体も、該脂肪酸の製造方法についての実施の形態に
おいて記述してあるようにその作成する上での、ベクタ
ープラスミドの構築など従来の知見を多く利用できるほ
か、作成された形質転換体の機能発現における、培養の
し易さ、発現を促進するための培養条件の設定におい
て、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造のために原料と
なるイコサペンタエン酸添加条件の設定を行う上での簡
便さにおいて優れた機能を有している。
該ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換
体作成のための宿主細胞としては酵母を用いることが好
ましい。酵母は真核細胞にして、特に、哺乳類由来の脂
肪酸不飽和化酵素、脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子の発現に
優れた機能を持ち、しかも、該遺伝子の導入された形質
転換体も、該脂肪酸の製造方法についての実施の形態に
おいて記述してあるようにその作成する上での、ベクタ
ープラスミドの構築など従来の知見を多く利用できるほ
か、作成された形質転換体の機能発現における、培養の
し易さ、発現を促進するための培養条件の設定におい
て、ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造のために原料と
なるイコサペンタエン酸添加条件の設定を行う上での簡
便さにおいて優れた機能を有している。
【００２８】本発明においては、該酵母の中でも、該ｎ
−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換体作
成のための宿主細胞としてサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス
（Pichia pastoris）を用いることが好ましい。該長酵
素遺伝子の活性発現のため、宿主細胞における発現用ベ
クターの一例として構築した酵母サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に組み込むため
の、図２で示された染色体外発現用プラスミドｐＹＥＳ
２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は、サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＩＮＶＳｃ１
（his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社
製）などの酵母に組み込まれる。酵母ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）を宿主細胞とする形質転換体作
成系は、宿主、ベクター系において形質転換体の形質発
現に優れており、菌体の増殖性能に優れ、形質転換体を
用いてのｎ−３系ドコサペンタエン酸の工業的な製造に
関しては望ましい宿主細胞として利用できる。
−３系ドコサペンタエン酸の製造に係わる形質転換体作
成のための宿主細胞としてサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス
（Pichia pastoris）を用いることが好ましい。該長酵
素遺伝子の活性発現のため、宿主細胞における発現用ベ
クターの一例として構築した酵母サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に組み込むため
の、図２で示された染色体外発現用プラスミドｐＹＥＳ
２／ｒＥＬＯ１（６．８ｋｂ）は、サッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＩＮＶＳｃ１
（his3,leu2,trp1,ura3）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社
製）などの酵母に組み込まれる。酵母ピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）を宿主細胞とする形質転換体作
成系は、宿主、ベクター系において形質転換体の形質発
現に優れており、菌体の増殖性能に優れ、形質転換体を
用いてのｎ−３系ドコサペンタエン酸の工業的な製造に
関しては望ましい宿主細胞として利用できる。
【００２９】本発明では、前記形質転換体、一例として
形質転換酵母ＹＥＬ−５株（ＦＥＲＭ）を、ＧＹ培地、
ＹＭ培地あるいは培地組成、グルコース１〜１０％好ま
しくは２〜８％、酵母エキス０．１〜３％好ましくは
０．５〜２％、ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％好まし
くは０．１〜０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０１〜０．２
％好ましくは０．０２〜０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．０１〜０．２％好ましくは０．０２〜０．１％を
水に溶解した培地に培養温度２０〜３５℃好ましくは２
５〜３２℃で培養し、イコサペンタエン酸０．１〜２０
０ｍＭ好ましくは０．５〜１００ｍＭを添加し、当該脂
肪酸を細胞内あるいは細胞外に蓄積させることを特徴と
する。すなわち、該形質転換体を培養するにあたり、培
地の炭素源や窒素源の種類、培養温度、培養時間などの
培養条件については、ｎ−３系ドコサペンタエン酸を多
量に生産するのに最適な条件を適宜選択することが出来
る。
形質転換酵母ＹＥＬ−５株（ＦＥＲＭ）を、ＧＹ培地、
ＹＭ培地あるいは培地組成、グルコース１〜１０％好ま
しくは２〜８％、酵母エキス０．１〜３％好ましくは
０．５〜２％、ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％好まし
くは０．１〜０．３％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０１〜０．２
％好ましくは０．０２〜０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０．０１〜０．２％好ましくは０．０２〜０．１％を
水に溶解した培地に培養温度２０〜３５℃好ましくは２
５〜３２℃で培養し、イコサペンタエン酸０．１〜２０
０ｍＭ好ましくは０．５〜１００ｍＭを添加し、当該脂
肪酸を細胞内あるいは細胞外に蓄積させることを特徴と
する。すなわち、該形質転換体を培養するにあたり、培
地の炭素源や窒素源の種類、培養温度、培養時間などの
培養条件については、ｎ−３系ドコサペンタエン酸を多
量に生産するのに最適な条件を適宜選択することが出来
る。
【００３０】以下において、本発明を実施例により詳し
く説明する。なお、本発明は実施例のみに限定されるも
のではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特
記しない限り宝酒造、シグマ、ナカライテスク、片山化
学又はＤｉｆｃｏの各社から購入した分析レベルおよび
生化学レベルのものを使用した。
く説明する。なお、本発明は実施例のみに限定されるも
のではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特
記しない限り宝酒造、シグマ、ナカライテスク、片山化
学又はＤｉｆｃｏの各社から購入した分析レベルおよび
生化学レベルのものを使用した。
【００３１】実施例１
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子のクローニングに関す
る。
る。
【００３２】ヒトにおいて同定された脂肪酸鎖長延長酵
素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考と
して、これに相同のマウスＥＳＴクローンをＮＣＢＩデ
ータベースにおいて検索し、高い相同性を示すものとし
てＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得た。 こ
れらは互いにオーバーラップしており、それぞれ開始コ
ドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を含んで
おり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１と高相
同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウスの遺
伝子情報から、以下のプライマーＦ１及びプライマーＲ
１を作成した。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限
酵素ＨｉｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含
み、プライマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素Ｘｂａ
Ｉによる開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。 Ｆ１，５’−ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’ （配列番号
２） （斜字体はＨｉｎｄIII部位、下線は開始コドン） Ｒ１，５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧ−３’ （配列番号
３） （斜字体はＸｂａ Ｉ部位、下線は終止コドン）
素ＨＥＬＯ１の全アミノ酸配列（２９９残基）を参考と
して、これに相同のマウスＥＳＴクローンをＮＣＢＩデ
ータベースにおいて検索し、高い相同性を示すものとし
てＡＵ０７９８９７及びＢＥ５３５１１８を得た。 こ
れらは互いにオーバーラップしており、それぞれ開始コ
ドンを含む５’側と終止コドンを含む３’領域を含んで
おり、これらをつなぎ合わせた配列はＨＥＬＯ１と高相
同な２９９アミノ酸をコードしていた。このマウスの遺
伝子情報から、以下のプライマーＦ１及びプライマーＲ
１を作成した。プライマーＦ１にはＡＡＧＣＴＴの制限
酵素ＨｉｎｄIII開裂部位及びＡＴＧの開始コドンを含
み、プライマーＲ１にはＴＣＴＡＧＡの制限酵素Ｘｂａ
Ｉによる開裂部位及び終止コドンＴＣＡを含んでいる。 Ｆ１，５’−ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’ （配列番号
２） （斜字体はＨｉｎｄIII部位、下線は開始コドン） Ｒ１，５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧ−３’ （配列番号
３） （斜字体はＸｂａ Ｉ部位、下線は終止コドン）
【００３３】これらを用いてラット肝ｃＤＮＡライブラ
リー（Takara社製）をテンプレートとしてＰＣＲを行っ
た。このとき、ポリメラーゼとして高fidelityでＴｄＴ
（末端核酸付加酵素）活性のないＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ製）を用いた。反応混合液組成は以下の通り
である。
リー（Takara社製）をテンプレートとしてＰＣＲを行っ
た。このとき、ポリメラーゼとして高fidelityでＴｄＴ
（末端核酸付加酵素）活性のないＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ製）を用いた。反応混合液組成は以下の通り
である。
【００３４】
【表２】
【００３５】ＰＣＲの反応条件は９４℃×２ｍｉｎで反
応させた後、９４℃×１５ｓｅｃ／６０℃×３０ｓｅｃ
／６８℃×１ｍｉｎを１サイクルとして３５回繰り返す
ことで行った。反応液をアガロースゲル電気永動にか
け、染色後、紫外線照射して一つのバンドを確認した。
その結果得られた増幅断片（ｒＥＬＯ１）をｐＹＥＳ２
（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）の対応部位に挿入し形質
転換体を作成し、ダイターミネーター法により塩基配列
を決定した。
応させた後、９４℃×１５ｓｅｃ／６０℃×３０ｓｅｃ
／６８℃×１ｍｉｎを１サイクルとして３５回繰り返す
ことで行った。反応液をアガロースゲル電気永動にか
け、染色後、紫外線照射して一つのバンドを確認した。
その結果得られた増幅断片（ｒＥＬＯ１）をｐＹＥＳ２
（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）の対応部位に挿入し形質
転換体を作成し、ダイターミネーター法により塩基配列
を決定した。
【００３６】以下にその具体的な実施方法を例記する。
（１）アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出
ＵＶトランスイルミネーターで確認した目的のＤＮＡ断
片を、アガロースゲルより切り出し、ＣＯＮＣＥＲＴ
Rapid Gel Extraction System（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）およびＱＩＡＥＸ II Gel Extraction Kit（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）の各精製キットを用いて精製を行った。
方法は付属のプロトコールによった。 （２）ベクターへのライゲーション 上記（１）で取得し、精製したフラグメントを、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ easy vectorsystem（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
と、インサート：ベクター比が１：１０となるよう混合
した。混合溶液と等量のLigation High（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、１６℃で１時間以上インキュベートし
た。
片を、アガロースゲルより切り出し、ＣＯＮＣＥＲＴ
Rapid Gel Extraction System（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社
製）およびＱＩＡＥＸ II Gel Extraction Kit（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）の各精製キットを用いて精製を行った。
方法は付属のプロトコールによった。 （２）ベクターへのライゲーション 上記（１）で取得し、精製したフラグメントを、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ easy vectorsystem（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）
と、インサート：ベクター比が１：１０となるよう混合
した。混合溶液と等量のLigation High（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、１６℃で１時間以上インキュベートし
た。
【００３７】（３）コンピテントセルの調製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをＭ９プレートにストリーク
し、コロニーが確認出来るまで３７℃で培養した。シン
グルコロニーを掻き取り、１００ｍＬ（１Ｌフラスコ）
のＳＯＢ培地に懸濁し、１８℃で振とう培養した。ＯＤ
６００＝０．４〜０．８に達したとき、培養を終了して
培養液を直ちに氷水中において１０分間冷却した。培養
液を４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して上清を捨
てた。沈殿を３３ｍＬの氷冷Transformation buffer
（ＴＢ）に懸濁した後、さらに１０分間氷冷した。次い
で、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を回
収し、４ｍＬの氷冷ＴＢに懸濁した。さらに１ｍＬの５
０％グリセロールを加え、４００μＬずつ分注し、液体
窒素で凍らせて−８０℃で保存した。なお、ここで用い
たＴＢは、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ
2・２Ｈ2Ｏ、２５０ｍＭ ＫＣｌおよび５５ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏからなるものである。
し、コロニーが確認出来るまで３７℃で培養した。シン
グルコロニーを掻き取り、１００ｍＬ（１Ｌフラスコ）
のＳＯＢ培地に懸濁し、１８℃で振とう培養した。ＯＤ
６００＝０．４〜０．８に達したとき、培養を終了して
培養液を直ちに氷水中において１０分間冷却した。培養
液を４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して上清を捨
てた。沈殿を３３ｍＬの氷冷Transformation buffer
（ＴＢ）に懸濁した後、さらに１０分間氷冷した。次い
で、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心して菌体を回
収し、４ｍＬの氷冷ＴＢに懸濁した。さらに１ｍＬの５
０％グリセロールを加え、４００μＬずつ分注し、液体
窒素で凍らせて−８０℃で保存した。なお、ここで用い
たＴＢは、１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１５ｍＭ ＣａＣｌ
2・２Ｈ2Ｏ、２５０ｍＭ ＫＣｌおよび５５ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2・４Ｈ2Ｏからなるものである。
【００３８】（４）大腸菌への形質転換 コンピテント
セルとして調製したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、氷上で
融解し、ライゲーション済みのベクター溶液と混合し
た。氷上で５分間インキュベート後、３７℃で２分間熱
ショックを与えた後、再び氷上で５分間インキュベート
した。次に、これに滅菌水を９００μＬ加え、１２００
０ｒｐｍで２分間遠心した。上清を捨て、沈殿を５０μ
Ｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧに懸濁し、Ｘ−Ｇａｌとアン
ピシリンを含むＬＢプレート培地にまいた。プレートを
３７℃で１２時間インキュベートした後、コロニーの有
無の確認を行った。
セルとして調製したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、氷上で
融解し、ライゲーション済みのベクター溶液と混合し
た。氷上で５分間インキュベート後、３７℃で２分間熱
ショックを与えた後、再び氷上で５分間インキュベート
した。次に、これに滅菌水を９００μＬ加え、１２００
０ｒｐｍで２分間遠心した。上清を捨て、沈殿を５０μ
Ｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧに懸濁し、Ｘ−Ｇａｌとアン
ピシリンを含むＬＢプレート培地にまいた。プレートを
３７℃で１２時間インキュベートした後、コロニーの有
無の確認を行った。
【００３９】（５）ミニスケールでのプラスミド調製
終夜培養した大腸菌液の適量を採取し、９０００ｒｐｍ
で２分間遠心して菌体を回収した。これにＳｏｌｕｔｉ
ｏｎＩを１００μＬ加えてボルテックス懸濁し、さらに
ＳｏｌｕｔｉｏｎIIを２００μＬ加えて溶菌した。氷上
で５分間インキュベートしてから、ＳｏｌｕｔｉｏｎII
Iを２００μＬ加えて、ボルテックス後、１２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。得られた上清を別のチューブ
に採り、等量のイソプロパノールを加えてアルコール沈
殿にて精製した。なお、ここで用いたＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ〜IIIは、以下の組成からなるものである。 SolutionI : 50mM グルコース、25mM Tris-HCl(pH8.
0)、10mM EDTA SolutionII : 0.2N NaOH、1% SDSSolutionIII : 3M K-
acetate、11.5% acetate
で２分間遠心して菌体を回収した。これにＳｏｌｕｔｉ
ｏｎＩを１００μＬ加えてボルテックス懸濁し、さらに
ＳｏｌｕｔｉｏｎIIを２００μＬ加えて溶菌した。氷上
で５分間インキュベートしてから、ＳｏｌｕｔｉｏｎII
Iを２００μＬ加えて、ボルテックス後、１２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心した。得られた上清を別のチューブ
に採り、等量のイソプロパノールを加えてアルコール沈
殿にて精製した。なお、ここで用いたＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ〜IIIは、以下の組成からなるものである。 SolutionI : 50mM グルコース、25mM Tris-HCl(pH8.
0)、10mM EDTA SolutionII : 0.2N NaOH、1% SDSSolutionIII : 3M K-
acetate、11.5% acetate
【００４０】（６）制限酵素消化によるインサートの確
認 各酵素、バッファー、サンプルＤＮＡを以下の組成で混
合した。
認 各酵素、バッファー、サンプルＤＮＡを以下の組成で混
合した。
【表３】
なお、制限酵素の種類により、バッファーの種類の選
択、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＢＳＡの添加を適宜行
った。また、反応は３７℃で行った。
択、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＢＳＡの添加を適宜行
った。また、反応は３７℃で行った。
【００４１】（７）酵母発現用プラスミドベクターへの
組み込み 上記においてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ
（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）にクローニングされたラット肝
脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）をＨｉｎｄII
IおよびＸｂａＩにより制限酵素消化して切り出し、ア
ガロースゲル電気泳動、ゲル抽出を経て、インサートを
精製した。このインサートを、同じくＨｉｎｄIIIおよ
びＸｂａＩ消化後、脱リン酸化処理により精製されたｐ
ＹＥＳ２のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ部位にライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。コ
ロニーを終夜液体培養し、プラスミドの少量精製、制限
酵素消化によるインサートチェックおよび正逆判定を行
った。構築されたプラスミドベクターをｐＹＥＳ２／ｒ
ＥＬＯ１と名付けた。
組み込み 上記においてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ
（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）にクローニングされたラット肝
脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）をＨｉｎｄII
IおよびＸｂａＩにより制限酵素消化して切り出し、ア
ガロースゲル電気泳動、ゲル抽出を経て、インサートを
精製した。このインサートを、同じくＨｉｎｄIIIおよ
びＸｂａＩ消化後、脱リン酸化処理により精製されたｐ
ＹＥＳ２のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ部位にライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。コ
ロニーを終夜液体培養し、プラスミドの少量精製、制限
酵素消化によるインサートチェックおよび正逆判定を行
った。構築されたプラスミドベクターをｐＹＥＳ２／ｒ
ＥＬＯ１と名付けた。
【００４２】ダイターミネーター法による塩基配列の決
定は以下のように行った。DYEnamic ET Terminator Cyc
le Sequencing KIt (Amersham Pharmacia 社製）を用い
てサンプルを調製し、310 Genetic Analyzer(Applied B
iosystems 社製）によって配列を決定した。その結果、
得られたラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ
１）は、９００ｂｐからなるオープンリーディングフレ
ームを含み、２９９アミノ酸をコードしており、その全
塩基配列並びにその推定アミノ酸配列はそれぞれ配列表
の配列番号１の通りである。ラット肝脂肪酸鎖長延長酵
素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列（配列表の
配列番号１）についてヒト（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caen
ohabditis elegans,Cele;F56H11.4)及び糸状菌(Mortier
ella alpina, Malp;GLELO）の脂肪酸鎖長延長酵素との
比較した。
定は以下のように行った。DYEnamic ET Terminator Cyc
le Sequencing KIt (Amersham Pharmacia 社製）を用い
てサンプルを調製し、310 Genetic Analyzer(Applied B
iosystems 社製）によって配列を決定した。その結果、
得られたラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ
１）は、９００ｂｐからなるオープンリーディングフレ
ームを含み、２９９アミノ酸をコードしており、その全
塩基配列並びにその推定アミノ酸配列はそれぞれ配列表
の配列番号１の通りである。ラット肝脂肪酸鎖長延長酵
素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の推定アミノ酸配列（配列表の
配列番号１）についてヒト（ＨＥＬＯ１）、線虫（Caen
ohabditis elegans,Cele;F56H11.4)及び糸状菌(Mortier
ella alpina, Malp;GLELO）の脂肪酸鎖長延長酵素との
比較した。
【００４３】ｒＥＬＯ１がＨＥＬＯ１とは極めて高い相
同性（９３．０％）を有しているが、線虫（Ｃｅｌｅ；
Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬ
Ｏ）とは相同性が低いこと（２７．３％及び３１．４
％）が明らかになった。いずれのアミノ酸配列において
も不飽和化酵素において見出されたタイプのヒスチジン
クラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所保存されていた。こ
れらの結果から、この配列表の配列番号１に記載された
塩基配列からなるフラグメントは、脂肪酸鎖長延長酵素
をコードした遺伝子であることが明らかである。
同性（９３．０％）を有しているが、線虫（Ｃｅｌｅ；
Ｆ５６Ｈ１１．４）及び糸状菌（Ｍａｌｐ；ＧＬＥＬ
Ｏ）とは相同性が低いこと（２７．３％及び３１．４
％）が明らかになった。いずれのアミノ酸配列において
も不飽和化酵素において見出されたタイプのヒスチジン
クラスター（ＨＸＸＨＨ）が１ヶ所保存されていた。こ
れらの結果から、この配列表の配列番号１に記載された
塩基配列からなるフラグメントは、脂肪酸鎖長延長酵素
をコードした遺伝子であることが明らかである。
【００４４】実施例２
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の染色
体外発現用プラスミドベクターの構築に関する。
体外発現用プラスミドベクターの構築に関する。
【００４５】酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae ）の染色体外発現用ベクターｐＹ
ＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、酵母に
おいてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）
の活性を発現させるためのプラスミドベクターを以下の
ように構築した。実施例１で構築した酵母サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）の染色
体外発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８
ｋｂ）は図２で示される。このプラスミドの組み込みは
ＵＲＡ３マーカーにより選択される。遺伝子発現はＧＡ
Ｌ１プロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネ
ーター（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースに
より誘導される。
romyces cerevisiae ）の染色体外発現用ベクターｐＹ
ＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、酵母に
おいてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）
の活性を発現させるためのプラスミドベクターを以下の
ように構築した。実施例１で構築した酵母サッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）の染色
体外発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１（６．８
ｋｂ）は図２で示される。このプラスミドの組み込みは
ＵＲＡ３マーカーにより選択される。遺伝子発現はＧＡ
Ｌ１プロモーター（ＰＧＡＬ１）及びＣＹＣ１ターミネ
ーター（ＴＣＹＣ１）により制御され、ガラクトースに
より誘導される。
【００４６】実施例３
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の染色
体内組み込み発現用プラスミドベクターに関する。
体内組み込み発現用プラスミドベクターに関する。
【００４７】酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）
を用いて、酵母においてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝
子（ｒＥＬＯ１）の活性を発現させるためのプラスミド
ベクターを以下のように構築した。実施例１と同様にし
て構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラス
ミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１（７．８ｋｂ）は図
３で示される。このプラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵
素消化した後、酵母内に導入すると、δ配列（トランス
ポゾン）により染色体ＤＮＡにランダムに組み込まれ
る。ＵＲＡ３マーカーにより選択されるが、染色体に組
み込まれた後は選択の必要がない。遺伝子発現は、ＧＡ
Ｐプロモーター（ＰＧＡＰ）及びＧＡＰターミネーター
（ＴＧＡＰ）により制御され、構成的に発現される。
romyces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラ
スミドベクターｐＭＯ３（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）
を用いて、酵母においてラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝
子（ｒＥＬＯ１）の活性を発現させるためのプラスミド
ベクターを以下のように構築した。実施例１と同様にし
て構築した酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae ）の染色体内組み込み発現用プラス
ミドベクターｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１（７．８ｋｂ）は図
３で示される。このプラスミドはＸｈｏＩ部位で制限酵
素消化した後、酵母内に導入すると、δ配列（トランス
ポゾン）により染色体ＤＮＡにランダムに組み込まれ
る。ＵＲＡ３マーカーにより選択されるが、染色体に組
み込まれた後は選択の必要がない。遺伝子発現は、ＧＡ
Ｐプロモーター（ＰＧＡＰ）及びＧＡＰターミネーター
（ＴＧＡＰ）により制御され、構成的に発現される。
【００４８】実施例４
ラット脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母
への形質転換並びに該遺伝子の酵母内での活性発現に関
する。
への形質転換並びに該遺伝子の酵母内での活性発現に関
する。
【００４９】ｒＥＬＯ１遺伝子染色体外発現プラスミド
ベクター（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１、図２）を酢酸リチ
ウム法により酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae )INVSc1(α/a,his3,leu2,ura3,trp
1）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に 導入し、形質転
換した。その手順は以下の通りである。ＹＰＤ液体培地
５ｍＬに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae ）ＩＮＶＳｃ１株を植菌し、２８℃で２
日間振とう培養を行った。ＹＰＤ液体培地の組成は、グ
ルコース２％、ポリペプトン２％および酵母エキス１％
を含むものである。培養液１ｍＬをチューブに採り、２
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿に酢
酸リチウム溶液を１ｍＬ加え、良く混合した後、２００
０ｒｐｍで５分間遠心して、上清を捨てた。
ベクター（ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１、図２）を酢酸リチ
ウム法により酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae )INVSc1(α/a,his3,leu2,ura3,trp
1）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に 導入し、形質転
換した。その手順は以下の通りである。ＹＰＤ液体培地
５ｍＬに、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae ）ＩＮＶＳｃ１株を植菌し、２８℃で２
日間振とう培養を行った。ＹＰＤ液体培地の組成は、グ
ルコース２％、ポリペプトン２％および酵母エキス１％
を含むものである。培養液１ｍＬをチューブに採り、２
０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。沈殿に酢
酸リチウム溶液を１ｍＬ加え、良く混合した後、２００
０ｒｐｍで５分間遠心して、上清を捨てた。
【００５０】なお、ここで用いた酢酸リチウム溶液は、
１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるものであ
る。次いで、沈殿に酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液２００μ
Ｌとプラスミド溶液５μＬ（１μｇ／μＬ）とを加え、
よく混合した後、混合液を３０℃の湯浴で１時間インキ
ュベートした。その後、さらに４２℃の湯浴で１０分間
インキュベートした。ここで用いた酢酸リチウム／ＰＥ
Ｇ溶液は、１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび
４０％ＰＥＧ４０００からなるものである。続いて、こ
の培養物を、よく乾かしたＳＤ培地にまいて２８℃で
３，４日培養した。ＳＤ培地の組成は、グルコース２
％、yeast nitrogen-base w/o amino acid ０．７％、
ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン ６０μｇ／ｍ
Ｌ、トリプトファン ４０μｇ／ｍＬである。
１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるものであ
る。次いで、沈殿に酢酸リチウム／ＰＥＧ溶液２００μ
Ｌとプラスミド溶液５μＬ（１μｇ／μＬ）とを加え、
よく混合した後、混合液を３０℃の湯浴で１時間インキ
ュベートした。その後、さらに４２℃の湯浴で１０分間
インキュベートした。ここで用いた酢酸リチウム／ＰＥ
Ｇ溶液は、１００ｍＭ 酢酸リチウム、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび
４０％ＰＥＧ４０００からなるものである。続いて、こ
の培養物を、よく乾かしたＳＤ培地にまいて２８℃で
３，４日培養した。ＳＤ培地の組成は、グルコース２
％、yeast nitrogen-base w/o amino acid ０．７％、
ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン ６０μｇ／ｍ
Ｌ、トリプトファン ４０μｇ／ｍＬである。
【００５１】以下、酵母での脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子
の活性発現について記述する。上記ＳＤ培地上に現れた
コロニーを掻き取り、５ｍＬのＳＣＴ培地（選択培地）
にて２８℃で一晩前培養を行った。なお、ＳＣＴ培地の
組成は、ラフィノース４％、yeast nitrogen-base w/o
amino acid ０．７％、界面活性剤（商品名：ｔｅｒｇ
ｉｔｏｌ）１％、ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン
６０μｇ／ｍＬ、トリプトファン４０μｇ／ｍＬであ
る。ＳＣＴ培地に、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）、
α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）、γ−リノレン酸
（Ｃ１８：３ｎ−６）、ｎ−３オクタデカテトラエン酸
（Ｃ１８：４ｎ−３）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２
０：３ｎ−６）、ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）、アラ
キドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、イコサペンタエン酸
（Ｃ２０：５ｎ−３）およびｎ−６ドコサテトラエン酸
（Ｃ２０：４ｎ−６）のうちのいずれかを基質として１
ｍＭ添加したものを各４５ｍＬを用意した。これら９つ
のＳＣＴ培地および脂肪酸を加えない培地それぞれに、
前培養液を菌数が２×１０5／ｍＬとなるように植菌
し、２８℃で振とうしながらガラクトースを添加し、さ
らに１６時間培養した。
の活性発現について記述する。上記ＳＤ培地上に現れた
コロニーを掻き取り、５ｍＬのＳＣＴ培地（選択培地）
にて２８℃で一晩前培養を行った。なお、ＳＣＴ培地の
組成は、ラフィノース４％、yeast nitrogen-base w/o
amino acid ０．７％、界面活性剤（商品名：ｔｅｒｇ
ｉｔｏｌ）１％、ヒスチジン２０μｇ／ｍＬ、ロイシン
６０μｇ／ｍＬ、トリプトファン４０μｇ／ｍＬであ
る。ＳＣＴ培地に、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）、
α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）、γ−リノレン酸
（Ｃ１８：３ｎ−６）、ｎ−３オクタデカテトラエン酸
（Ｃ１８：４ｎ−３）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２
０：３ｎ−６）、ミード酸（Ｃ２０：３ｎ−９）、アラ
キドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、イコサペンタエン酸
（Ｃ２０：５ｎ−３）およびｎ−６ドコサテトラエン酸
（Ｃ２０：４ｎ−６）のうちのいずれかを基質として１
ｍＭ添加したものを各４５ｍＬを用意した。これら９つ
のＳＣＴ培地および脂肪酸を加えない培地それぞれに、
前培養液を菌数が２×１０5／ｍＬとなるように植菌
し、２８℃で振とうしながらガラクトースを添加し、さ
らに１６時間培養した。
【００５２】培養終了後、培養液を５０ｍＬ容コニカル
チューブに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清
を捨てた。次いで、菌体に滅菌水５ｍＬ加えてボルテッ
クスし、再び２０００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て
た。菌体からの脂質の抽出は以下のようにして行った。
菌体を１ｍＬの滅菌水に懸濁し、ネジ口試験管に移して
等量のクロロフォルム−メタノール（２：１，ｖ／ｖ）
を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで２分間遠心
した。下層のクロロフォルム層を試験管に取り、クロロ
フォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて６０
℃、３時間処理することによりメチルエステル化した。
脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出後、ガスクロマト
グラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１７Ａ、カラム
ＴＣ−７０）により脂肪酸組成を分析した。ＧＣ−ＭＳ
分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯＬ）を用いて、７０ｅＶ
におけるＥＩ−ＭＳにより行った。
チューブに移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心して上清
を捨てた。次いで、菌体に滅菌水５ｍＬ加えてボルテッ
クスし、再び２０００ｒｐｍで５分間遠心し上清を捨て
た。菌体からの脂質の抽出は以下のようにして行った。
菌体を１ｍＬの滅菌水に懸濁し、ネジ口試験管に移して
等量のクロロフォルム−メタノール（２：１，ｖ／ｖ）
を加え、ボルテックスし、２０００ｒｐｍで２分間遠心
した。下層のクロロフォルム層を試験管に取り、クロロ
フォルム層に１０％ 塩酸−メタノールを加えて６０
℃、３時間処理することによりメチルエステル化した。
脂肪酸メチルエステルをヘキサン抽出後、ガスクロマト
グラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−１７Ａ、カラム
ＴＣ−７０）により脂肪酸組成を分析した。ＧＣ−ＭＳ
分析はＧＣ ｍａｔｅ（ＪＥＯＬ）を用いて、７０ｅＶ
におけるＥＩ−ＭＳにより行った。
【００５３】その結果、ラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺
伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクターに挿入し、まず、
基質脂肪酸を添加しない条件で酵母発現に供したところ
パルミトオレイン酸の鎖長延長産物であるＣ１８：１ｎ
−７の生成が認められた。このとき、微量ではあるがさ
らに鎖長延長されたＣ２０：１ｎ−７に対応すると思わ
れるピークが９．６ｍｉｎに観察され、これら内在性脂
肪酸に由来する鎖長延長産物は、基質脂肪酸を添加した
場合にも検出された。γ−リノレン酸（ＧＬＡ）あるい
はアラキドン酸の存在下では、それぞれジホモ−γ−リ
ノレン酸（ＤＧＬＡ）及びドコサテトラエン酸に対応す
るピークの生成が認められた。また、リノール酸存在下
で発現解析を行ったところ、微量であるがその鎖長延長
産物であるＣ２０：２Δ１１，１４の生成が認められ
た。イコサペンタエン酸の存在下でｒＥＬＯ１の酵母内
発現を行った結果、目的物質であるｎ−３系ドコサペン
タエン酸を５１．６％の変換率で生成することが出来た
（図１）。
伝子（ｒＥＬＯ１）のオープンリーディングフレームを
含むＤＮＡ断片を酵母内発現ベクターに挿入し、まず、
基質脂肪酸を添加しない条件で酵母発現に供したところ
パルミトオレイン酸の鎖長延長産物であるＣ１８：１ｎ
−７の生成が認められた。このとき、微量ではあるがさ
らに鎖長延長されたＣ２０：１ｎ−７に対応すると思わ
れるピークが９．６ｍｉｎに観察され、これら内在性脂
肪酸に由来する鎖長延長産物は、基質脂肪酸を添加した
場合にも検出された。γ−リノレン酸（ＧＬＡ）あるい
はアラキドン酸の存在下では、それぞれジホモ−γ−リ
ノレン酸（ＤＧＬＡ）及びドコサテトラエン酸に対応す
るピークの生成が認められた。また、リノール酸存在下
で発現解析を行ったところ、微量であるがその鎖長延長
産物であるＣ２０：２Δ１１，１４の生成が認められ
た。イコサペンタエン酸の存在下でｒＥＬＯ１の酵母内
発現を行った結果、目的物質であるｎ−３系ドコサペン
タエン酸を５１．６％の変換率で生成することが出来た
（図１）。
【００５４】その他、α−リノレン酸、ｎ−３オクタデ
カテトラエン酸、ＤＧＬＡについても鎖長延長が認めら
れ、これらの基質脂肪酸の変換率を表１に示した。ミー
ド酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及びｎ−６ドコサテトラエン
酸（Ｃ２２：４ｎ−６）については基質脂肪酸を添加し
ても鎖長延長は認められなかった（表１）。このことか
らラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子による形質転換酵
母ＹＥＬ−５株において、イコサペンタエン酸の存在下
で培養することにより、ｎ−３系ドコサペンタエン酸に
変換され、ｎ−３系ドコサペンタエン酸が生産されるこ
とが確認できた。
カテトラエン酸、ＤＧＬＡについても鎖長延長が認めら
れ、これらの基質脂肪酸の変換率を表１に示した。ミー
ド酸（Ｃ２０：３ｎ−９）及びｎ−６ドコサテトラエン
酸（Ｃ２２：４ｎ−６）については基質脂肪酸を添加し
ても鎖長延長は認められなかった（表１）。このことか
らラット肝脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子による形質転換酵
母ＹＥＬ−５株において、イコサペンタエン酸の存在下
で培養することにより、ｎ−３系ドコサペンタエン酸に
変換され、ｎ−３系ドコサペンタエン酸が生産されるこ
とが確認できた。
【００５５】
【発明の効果】本発明によるｎ−３系ドコサペンタエン
酸の製造方法は、従来その生産技術が存在しないｎ−３
系ドコサペンタエン酸の工場生産を可能にするものであ
る。また、ｎ−３系ドコサペンタエン酸は高い生理活性
が期待され、その生産物は医薬品、健康食品、特定保健
養食品等の広範な用途が期待される。
酸の製造方法は、従来その生産技術が存在しないｎ−３
系ドコサペンタエン酸の工場生産を可能にするものであ
る。また、ｎ−３系ドコサペンタエン酸は高い生理活性
が期待され、その生産物は医薬品、健康食品、特定保健
養食品等の広範な用途が期待される。
【００５６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の形質転換酵母において導入した脂肪酸
鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現により
生じた脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の結果
を示した図である。すなわち、ｐＹＥＳ２またはｐＹＥ
Ｓ２にｒＥＬＯ１遺伝子を挿入したプラスミドを酵母サ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e） に導入してガラクトースによる発現誘導を行い、
細胞内脂肪酸をＧＣ解析した。ＥＰＡを基質として添加
し、ＤＰＡ（ｎ−３）の生成を確認した。ＥＰＡはイコ
サペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）を、ＤＰＡはｎ−
３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）をそれぞ
れ示している。
鎖長延長酵素遺伝子（ｒＥＬＯ１）の酵母内発現により
生じた脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の結果
を示した図である。すなわち、ｐＹＥＳ２またはｐＹＥ
Ｓ２にｒＥＬＯ１遺伝子を挿入したプラスミドを酵母サ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e） に導入してガラクトースによる発現誘導を行い、
細胞内脂肪酸をＧＣ解析した。ＥＰＡを基質として添加
し、ＤＰＡ（ｎ−３）の生成を確認した。ＥＰＡはイコ
サペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）を、ＤＰＡはｎ−
３系ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）をそれぞ
れ示している。
【図２】ラット脂肪酸鎖長延長酵素（ｒＥＬＯ１）の染
色体外発現用プラスミド （ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモ
ーター、ＴＣＹＣ１はＣＹＣ１ターミネーター、ＵＲＡ
３はマーカーを示している。
色体外発現用プラスミド （ｐＹＥＳ２／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモ
ーター、ＴＣＹＣ１はＣＹＣ１ターミネーター、ＵＲＡ
３はマーカーを示している。
【図３】ラット脂肪酸鎖長延長酵素ｒＥＬＯ１の染色体
内組み込み発現用プラスミド（ｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＰはＧＡＰプロモータ
ー、ＴＧＡＰはＧＡＰターミネーター、δはトランスポ
ゾンδ配列、ＵＲＡ３はマーカーを示している。
内組み込み発現用プラスミド（ｐＭＯ３／ｒＥＬＯ１）
を示した図である。図中のＰＧＡＰはＧＡＰプロモータ
ー、ＴＧＡＰはＧＡＰターミネーター、δはトランスポ
ゾンδ配列、ＵＲＡ３はマーカーを示している。
【００５７】
【配列表】
SEQUENCE LISTNG
＜110＞ 鈴木 修
＜130＞ ５１３７１
＜160＞ 3
＜210＞ 1
＜211＞ 900
＜212＞ DNA
＜213＞ rat liver
＜400＞ 1
配列
ATG GAA CAT TTC GAT GCG TCA CTC AGT ACC TAT TTC AGG GCA TTA CTG 48
Met Glu His Phe Asp Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Phe Arg Ala Leu Leu
5 10 15
GGC CCC CGA GAC ACA CGA GTC AAA GGA TGG TTT CTT CTG GAC AAT TAC 96
Gly Pro Arg Asp Thr Arg Val Lys Gly Trp Phe Leu Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
ATC CCT ACG TTT GTC TGC TCT GCC ATT TAT TTA CTC ATC GTG TGG CTG 144
Ile Pro Thr Phe Val Cys Ser Ala Ile Tyr Leu Leu Ile Val Trp Leu
35 40 45
GGA CCA AAA TAC ATG AAA AAC AGG CAG CCG TTC TCT TGC CGA GGC ATC 192
Gly Pro Lys Tyr Met Lys Asp Arg Gln Pro Phe Ser Cys Arg Gly Ile
50 55 60
CTG GTG GTG TAT AAT CTT GGG CTC ACC CTG CTG TCT CTC TAC ATG TTC 240
Leu Val Val Tyr Asn Leu Gly Leu Thr Leu Leu Ser Leu Tyr Met Phe
65 70 75 80
TAT GAG TTG GTG ACA GGT GTG TGG GAA GGC AAA TAC AAC TTC TTC TGT 288
Tyr Glu Leu Val Thr Gly Val Trp Glu Gly Lys Tyr Asn Phe Phe Cys
85 90 95
CAG GGA ACA CGC AGC GCA GGA GAA TCA GAT ATG AAG GTT ATT CGT GTC 336
Gln Gly Thr Arg Ser Ala Gly Glu Ser Asp Met Lys Val Ile Arg Val
100 105 110
CTC TGG TGG TAC TAC TTT TCC AAA CTC ATA GAA TTC ATG GAC ACC TTT 384
Leu Trp Trp Tyr Tyr Phe Ser Lys Leu Ile Glu Phe Met Asp Thr Phe
115 120 125
TTC TTC ATT CTT CGC AAG AAC AAC CAC CAG ATC ACA GTC CTG CAC GTC 432
Phe Phe Ile Leu Arg Lys Asn Asn His Gln Ile Thr Val Leu His Val
130 135 140
TAC CAC CAT GCC ACT ATG CTC AAC ATC TGG TGG TTT GTC ATG AAC TGG 480
Tyr His His Ala Thr Met Leu Asn Ile Trp Trp Phe Val Met Asn Trp
145 150 155 160
GTT CCC TGC GGC CAT TCG TAC TTC GGT GCG ACG CTC AAC AGC TTC ATC 528
Val Pro Cys Gly His Ser Tyr Phe Gly Ala Thr Leu Asn Ser Phe Ile
165 170 175
CAC GTC CTC ATG TAC TCG TAC TAT GGC CTG TCC TCT GTC CCT TCC ATG 576
His Val Leu Met Tyr Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser Ser Val Pro Ser Met
180 185 190
CGT CCC TAC CTC TGG TGG AAA AAG TAC ATC ACT CAG GGG CAG CTG GTC 624
Arg Pro Tyr Leu Trp Trp Lys Lys Tyr Ile Thr Gln Gly Gln Leu Val
195 200 205
CAG TTT GTG CTG ACA ATC ATC CAG ACC AGC TGC GGG GTC ATC TGG CCG 672
Gln Phe Val Leu Thr Ile Ile Gln Thr Ser Cys Gly Val Ile Trp Pro
210 215 220
TGC TCC TTC CCT CTC GGG TGG CTG TAC TTC CAG ATC GGA TAC ATG ATT 720
Cys Ser Phe Pro Leu Gly Trp Leu Tyr Phe Gln Ile Gly Tyr Met Ile
225 230 235 240
TCC CTG ATT GCT CTC TTC ACA AAC TTC TAC ATT CAG ACT TAC AAC AAG 768
Ser Leu Ile Ala Leu Phe Thr Asn Phe Tyr Ile Gln Thr Tyr Asn Lys
245 250 255
AAA GGG GCC TCT CGG AGG AAA GAG CAC CTG AAG GGC CAC CAG AAC GGG 816
Lys Gly Ala Ser Arg Arg Lys Glu His Leu Lys Gly His Gln Asn Gly
260 265 270
TCT ATG ACT GCC GTC AAT GGA CAC ACC AAC AAC TTT GCT TCC CTG GAG 864
Ser Met Thr Ala Val Asn Gly His Thr Asn Asn Phe Ala Ser Leu Glu
275 280 285
AAC AGT GTG ACG TCA AGG AAG CAG CGG AAG GAT TGA 900
Asn Ser Val Thr Ser Arg Lys Gln Arg Lys Asp *
290 295 299
＜210＞ 2
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ artificial sequence
＜400＞ 2
AGGTAAGCTT ATGGAACATT TCGATGTCAT CT 32
＜210＞ 3
＜211＞ 33
＜212＞ DNA
＜213＞ artificial sequence
＜400＞ 3
CTCTCTAGAT CAATCCTTTC GCTGCTTCCT GGG 33
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:84）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:84）
Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA80 CA04 DA11 EA04
GA11
4B064 AD90 CA19 CC24 DA01 DA10
4B065 AA77X AA80X AA91Y AB01
AC14 BA02 BB10 CA13 CA41
CA44
4H059 BA26 BB05 BB07 BC48
Claims (13)
- 【請求項１】 哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子
を導入して得られた形質転換体を培地に培養する際に、
該培地にイコサペンタエン酸を添加することにより、該
イコサペンタエン酸の炭素鎖長を延長してｎ−３系ドコ
サペンタエン酸に変換することを特徴とするｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項２】 該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、哺乳類
由来の遺伝子あることを特徴とする請求項１に記載のｎ
−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項３】 該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、ラット
肝ｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされた脂肪酸
鎖長延長酵素遺伝子であることを特徴とする請求項２に
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項４】 該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表
の配列番号１に記載の２９９のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のｎ−
３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項５】 該脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子が、配列表
の配列番号１に記載の９００ｂｐの塩基配列を有する遺
伝子であることを特徴とする請求項４に記載のｎ−３系
ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項６】 該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素
遺伝子の宿主細胞への導入において、染色体外組み込み
発現プラスミドにより形質転換されてなることを特徴と
する請求項１〜５のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペ
ンタエン酸の製造方法。 - 【請求項７】 該形質転換体が、該脂肪酸鎖長延長酵素
遺伝子の宿主細胞への導入において、染色体内組み込み
発現プラスミドにより形質転換されてなることを特徴と
する請求項１〜５のいずれかに記載のｎ−３系ドコサペ
ンタエン酸の製造方法。 - 【請求項８】 該宿主細胞が、真核細胞であることを特
徴とする請求項６又は７のいずれかに記載のｎ−３系ド
コサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項９】 該真核細胞が、酵母であることを特徴と
する請求項８に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製
造方法。 - 【請求項１０】 該酵母が、サッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomycescerevisiae）又はピキア・パストリ
ス（Pichia pastoris）であることを特徴とする請求項
９に記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項１１】 該培養を、ＧＹ培地、ＹＭ培地あるい
は培地組成、グルコース１〜１０％、酵母エキス０．１
〜３％、ＮａＮＯ3 ０．０５〜０．４％、ＫＨ2ＰＯ4
０．０１〜０．２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
〜０．２％を水に溶解した培地を用いて培養温度２０〜
３５℃で行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれ
かに記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項１２】 該培地に添加する該イコサペンタエン
酸が、遊離脂肪酸又はそのメチルもしくはエチルエステ
ルであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに
記載のｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれかに記載のｎ
−３系ドコサペンタエン酸の製造方法により得られたｎ
−３系ドコサペンタエン酸又はそのエステル。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001315838A JP2003116566A (ja) | 2001-10-12 | 2001-10-12 | ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2001315838A JP2003116566A (ja) | 2001-10-12 | 2001-10-12 | ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116566A true JP2003116566A (ja) | 2003-04-22 |
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ID=19133951
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001315838A Pending JP2003116566A (ja) | 2001-10-12 | 2001-10-12 | ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003116566A (ja) |
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-
2001
- 2001-10-12 JP JP2001315838A patent/JP2003116566A/ja active Pending
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