ES2527122T3 - Virus interferente defectuoso - Google Patents
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Abstract
Un virus ID de la gripe A humana clonado para su uso como medicamento en el que la secuencia de nucleótidos del segmento 1 de ARN del virus ID de la gripe A clonado comprende: (a) una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; o (b) una secuencia de ácidos nucleicos de al menos el 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
Description
E07732910
30-12-2014
La tabla 16 mostrada a continuación recoge el destino de los ratones que recibieron una dosis baja de virus infectante, seguido por la administración de virus ID 24 h después con respecto a un control de administración de virus ID inactivado. Se realizó un control adicional de ratones no infectados en el que se administró virus ID en
5 solitario.
Tabla 16
- Día de infección
- Virus + virus IDi 24 h después de la infeccióna Virus + virus ID 24 h después de la infeccióna virus ID 24 h después de la infecciónb
- Peso
- Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos
- 0
- 114 0 0 114 0 0 35
- 0
- 0
- 1
- 114 0 0 116 0 0 36 0 0
- 2
- 112 0 0 112 0 0 35 0 0
- 3
- 106 6 0 112 0 0 35 0 0
- 4
- 102 6 0 116 0 0 38 0 0
- 5
- 95 5 1 116 0 0 37 0 0
- 6
- 74 3 3 117 0 0 36 0 0
- 7
- 31 2 119 0 0 37 0 0
- 8
- 115 ?1 0 37 0 0
- 9
- 116 ?1 0 38 0 0
- 10
- 117 0 0 38 0 0
- 11
- 117 ?2 0 37 0 0
- 12
- 118 ?1 0 37 0 0
- 13
- 118 0 0 37 0 0
- 14
- 121 121 0 0 39 0 0
- VPi, virus protector inactivado por UV; ID, virus interferente defectuoso; el peso se indica en gramos; se muestra el número de ratones enfermos/muertos en cada grupo ocurridos cada día. El signo (?) se refiere a ratones que pueden haber estado enfermos, pero no gravemente enfermos. a 6 ratones/grupo; b 2 ratones/grupo).
Todos los ratones infectados tratados con virus ID inactivado de control perdieron peso, y estaban enfermos en el 10 día 3 después de la infección. Todos los ratones habían muerto en el día 7.
Los ratones infectados tratados con virus ID perdieron poco peso y/o dejaron de ganar peso, pero se mantuvieron clínicamente normales durante el periodo en que el grupo de control estaba muriendo. Existió una posible enfermedad leve en los días 8, 9, 11 y 12, pero fue transitoria. Todos los ratones (100%) estaban sanos al final del
15 experimento.
Tres semanas después de la infección, los ratones que habían sido protegidos con virus ID (columna 2 en la tabla 16 anterior) fueron sometidos a prueba de provocación por vía intranasal con una fuerte dosis letal de A/WSN. Los ratones resultaron completamente indemnes según el criterio del peso y los signos clínicos, mientras que todos los
20 ratones de control que antes no habían experimentado ningún virus de la gripe murieron. La dosis de virus usada es demasiado grande para que el virus ID proteja contra ella, así que estos datos sugieren que los ratones habían desarrollado una inmunidad adaptativa a A/WSN aunque no habían estado claramente enfermos durante la primera infección.
25 La tabla 17 mostrada a continuación recoge el destino de los ratones que recibieron una dosis intermedia (aproximadamente 5 DLM50 de virus A/WSN infectante, seguido por la administración de virus ID 24 h más tarde con respecto a un control de administración de virus ID inactivado (ambos a 4.000 UHA que es aproximadamente 10 �g de proteína de virus). Se realizó un control adicional de ratones no infectados en el que se administró virus ID en solitario.
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E07732910
30-12-2014
Tabla 17
- Día de infección
- Virus + virus IDi 24 h después de la infeccióna Virus + virus ID 24 h después de la infeccióna Virus ID 24 h después de la infecciónb
- Peso
- Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos
- 0
- 114 0 0 115 0 0 45
- 0
- 0
- 1
- 114 0 0 114 0 0 45 0 0
- 2
- 113 0 0 109 0 0 43 0 0
- 3
- 108 0 0 106 0 0 40 0 0
- 4
- 101 4 0 103 4 0 38 1 0
- 5
- 93 6 0 104 3 0 38 1 0
- 6
- 88 1 5 104 1 0 38 1 0
- 7
- 14 1 0 101 5 0 37 0 1
- 8
- 13 1 98 6 0 21 0 0
- 9
- 0 94 4 1 22 0 0
- 10
- 0 81 3 1 22 0 0
- 11
- 0 70 2 0 22 0 0
- 12
- 0 72 2 0 22 0 0
- 13
- 0 72 1 0 22 0 0
- 14
- 0 76 1 0 22 0 0
- 15
- 0 78 1 0 23 0 0
- 16
- 0 79 1 0 23 0 0
- 17
- 0 79 0 0 24 0 0
- IDi, virus interferente defectuoso inactivado por UV; ID, interferente defectuoso. a 6 ratones/grupo; b 2 ratones/grupo).
Todos los ratones infectados tratados con virus ID inactivado de control perdieron peso, y estaban enfermos en el día 5. La mayoría (83%) de los ratones habían muerto (o habían sido sacrificados) en el día 6. Todos habían muerto 5 en el día 8.
Los ratones infectados tratados con virus ID perdieron peso y sufrieron enfermedad clínica al mismo tiempo que el grupo de control infectado. Sin embargo, la enfermedad clínica fue más leve, se produjo durante un periodo más extendido, y tuvo lugar en 2 episodios que alcanzaron su máximo en los días 4 y 8. Dos ratones murieron (en los
10 días 9 y 10) y el resto (4/6 o el 67%) se recuperó.
Uno de los ratones inoculados con VP en solitario enfermó y murió. Se trata de un suceso muy inhabitual, la única vez en varios años de trabajo en que ocurrió.
15 La tabla 18 mostrada a continuación recoge el desenlace en ratones que recibieron una dosis más alta (aproximadamente 10 DLM50 de virus A/WSN infectante, seguido por la administración de virus ID 24 h después con respecto a un control de administración de virus ID inactivado (ambos a 4.000 UHA que es aproximadamente 10 �g de proteína de virus). Se realizó un control adicional de ratones no infectados en el que se administró virus ID en solitario.
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E07732910
30-12-2014
Tabla 18
- Día de infección
- Virus + virus IDi 24 h después de la infeccióna Virus + virus ID 24 h después de la infeccióna virus ID 24 h después de la infecciónb
- Peso
- Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos
- 0
- 112 0 0 115 0 0 46
- 0
- 0
- 1
- 110 0 0 115 0 0 46 0 0
- 2
- 108 0 0 113 0 0 46 0 0
- 3
- 99 4 0 106 0 0 45 0 0
- 4
- 94 5 0 110 0 0 47 0 0
- 5
- 88 3 3 112 1 0 48 0 0
- 6
- 44 1 2 105 4 0 49 0 0
- 7
- 13 1 100 3 1 50 0 0
- 8
- 84 3 0 51 0 0
- 9
- 81 4 0 51 0 0
- 10
- 80 3 1 53 0 0
- 11
- 68 2 0 53 0 0
- 12
- 69 2 0 52 0 0
- 13
- 70 1 0 53 0 0
- 14
- 70 1 0 54 0 0
- 15
- 71 1 0 55 0 0
- 16
- 75 1 0 56 0 0
- 17
- 75 1 0 57 0 0
- IDi, virus interferente defectuoso inactivado por UV; virus ID, virus interferente defectuoso. a 6 ratones/grupo; b 2 ratones/grupo).
Todos los ratones infectados tratados con virus ID de control perdieron peso y en su mayoría estaban enfermos en el día 4. Todos los ratones estaban muertos o habían sido sacrificados en el día 7.
5 Los ratones infectados tratados con virus ID perdieron peso y sufrieron un cierto retraso en la enfermedad clínica que se produjo durante un periodo extendido. Dos ratones murieron (días 7 y 10), y el resto (67%) se recuperó o estaba recuperándose.
Tal como se describe en el Ejemplo 8, aunque los ratones infectados recibieron una dosis de virus ID 48 h después de la infección.
15 La tabla 19 mostrada a continuación recoge el desenlace en ratones que recibieron una dosis intermedia (aproximadamente 5 DLM50 de virus A/WSN infectante, seguido de la administración de virus ID 48 h después con respecto a un control de administración de virus ID inactivado (ambos a 4.000 UHA que es aproximadamente 10 �g de proteína de virus).
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E07732910
30-12-2014
Tabla 19
- Día de infección
- Virus + virus IDi 48 h después de la infeccióna Virus + virus ID 48 h después de la infecciónb
- Peso
- Enfermos Muertos Peso Enfermos Muertos
- 0
- 109 0 0 139
- 0
- 0
- 1
- 108 0 0 141 0 0
- 2
- 111 0 0 142 0 0
- 3
- 107 0 0 138 0 0
- 4
- 99 4 0 133 0 0
- 5
- 90 4 1 136 0 0
- 6
- 71 4 0 131 2 0
- 7
- 69 4 121 2 1
- 8
- 97 5 0
- 9
- 92 4 1
- 10
- 73 3 2
- 11
- 39 2 0
- 12
- 39 2 0
- 13
- 40 2 0
- 14
- 42 1 0
- 15
- 42 2 0
- 16
- 44 2 0
- 17
- 45 0 0
- Virus IDi, virus interferente defectuoso inactivado por UV; virus ID, virus interferente defectuoso; g, peso en gramos; se muestra el número de ratones enfermos/muertos en cada grupo que se produjo en el día. El signo (?) se refiere a ratones que pueden haber estado enfermos, pero no claramente enfermos. a 5 ratones/grupo; b 6 ratones/grupo; c 2 ratones/grupo).
Todos los ratones infectados tratados con virus ID inactivado de control perdieron peso, y estaban enfermos en el día 5 después de la infección. Todos los ratones estaban muertos en el día 7.
5 Los ratones infectados tratados 48 h después de la infección con virus ID perdieron peso, pero la enfermedad se retrasó y no se observó hasta el día 6. No se produjeron muertes (4/6) hasta los días 7, 9 y 10. Dos de los 6 ratones (33%) se recuperaron totalmente.
Se clonó el ARNi 244 en el plásmido de expresión PolI pPOLI-SapIT, de manera que el vector expresa un transcripto en sentido ARNv. Este se transfectó en células 293T junto con los 12 plásmidos requeridos para generar virus WSN infeccioso. La mezcla de ADN contenía cantidades diversas del plásmido 244 (0-0,5 �g), más 0,5 �g de cada
15 segmento génico de WSN (con promotores PolI), 0,5 �g de cada uno de los plásmidos de expresión PB1 y PB2, 0,1 �g de plásmido de expresión PA y 1 �g de plásmido de expresión NP. Después de 24 h, se sometieron las células 293T a tripsinización, se mezclaron con células MDCK y resembraron en placa. Después de 7 días más se recogió el cultivo sobrenadante, y se determinó la producción de virus por ensayo HA.
20 Tabla 20
- Plásmido de ARNi 244 (�g)
- Producción de virus (UHA/ml) Producción de virus como % de control
- 0
- 19.200 100
- 0,1
- 9.600 50
- 0,25
- 1.600 8
- 0,5
- 300 1,6
La tabla 20 muestra que al aumentar la cantidad de plásmido 244, la producción total de virus según se determina por HA se redujo en el 98,4%. Un exceso de ARNi en el inóculo reduce la producción de virus a cantidades inutilizables.
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EJEMPLO 12 – El virus protector previene la enfermedad clínica pero permite que se desarrolle inmunidad adaptativa al virus de provocación
Tres semanas después de proteger a los ratones de 10 DL50 de A/WSN, se realizó una nueva prueba de
5 provocación con una dosis muy superior de A/WSN (10.000 DL50). Se usó esta dosis porque supera ampliamente al virus protector neto (datos no mostrados), y permite así la valoración de la respuesta inmunitaria de los linfocitos B y T específicos para A/WSN. La fig. 3 (c, f, i) muestra que todos los grupos de ratones supervivientes eran completamente inmunes a la nueva prueba de provocación. Como los animales que recibieron 400 ó 40 UHA de virus protector no mostraron signo de enfermedad durante la prueba de provocación primaria, su supervivencia a la
10 segunda prueba de provocación con número alto de virus muestra que los ratones desarrollaron inmunidad protectora, y por tanto que el virus protector convierte de manera eficaz la dosis letal inicial de virus virulento en una vacuna atenuada subclínica. La tabla 21 mostrada a continuación recoge que la máxima dosis de virus protector proporciona sólo un débil efecto de vacuna. De forma contraria a la intuición, ratones que recibieron la dosis máxima de virus protector (4.000 UHA) estaban menos protegidos de la segunda prueba de provocación, lo que sugiere que
15 la replicación de virus y la producción de antígenos están tan intensamente suprimidas en esta situación que la infección resultante es sólo débilmente inmunógena.
Tabla 21
- Primera prueba de provocación
- Segunda prueba de provocación
- Dosis de virus protector (UHA)
- Número de muertos / número de infectados Pérdida de peso Número de enfermos / número de provocación Número de muertos / número de provocación
- 4.000
- 0/7 Sí 5/7 (71%) b 4/7 (57%)c
- 0/4
- Sí 4/4 (100%) 2/4 (50%)
- 0/4
- Sí 4/4 (100%) 3/4 (75%)
- 400
- 0/4 No 0/4 na
- 0/4
- No 0/4 na
- 40
- 0/5 No 0/5 na
- 0/4
- No 0/4 na
- 0/4
- No 0/4 na
- 4
- 2/5 No 0/2 na
- 0d
- 5/5 na na na
- a A los ratones se les inoculó por vía intranasal una mezcla de virus protector + 10 DL50 virus de provocación A/WSN (primera prueba de provocación: columnas 1 y 2); y a continuación 3 semanas después se les inoculó 10.000 DL50 de A/WSN en solitario (segunda prueba de provocación). Este último experimento prueba la inmunidad adaptativa y no la actividad de virus protector residual, ya que las dosis más elevadas de A/WSN superan completamente al virus protector cuando se suministran simultáneamente (no mostrado). Se muestran los datos de 3 experimentos independientes. b Media = 87% enfermos. c Media = 60% muertos. d Suministro de 4.000 UHA de virus protector inactivado. Na, no aplicable.
38
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-
imagen1
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