ES2593051T3

ES2593051T3 - Matrices suplementadas para la reparación de fracturas óseas

Info

Publication number: ES2593051T3
Application number: ES06707674.5T
Authority: ES
Inventors: Jason Schense; John Watson; Isabelle Arrighi
Original assignee: Kuros Biosurgery AG
Current assignee: Kuros Biosurgery AG
Priority date: 2005-01-06
Filing date: 2006-01-06
Publication date: 2016-12-05
Anticipated expiration: 2026-01-06
Also published as: JP5328153B2; CA2592973A1; ES2902872T3; RU2007129844A; KR20070108170A; BRPI0606409A2; JP2013173770A; EP1833522A2; WO2006072622A3; MX2007008319A; JP2008526810A; WO2006072622A2; SG161218A1; EP2316497A2; EP3111966B1; EP1833522B1; AU2006204461C1; EP3111966A1; EP2316497A3; AU2006204461B2

Abstract

Una formulación apropiada para la reparación de fracturas óseas, que comprende (i) un péptido seleccionado del grupo que consiste de PTH y un péptido de fusión PTH; (ii) un material granular que comprende un mineral de calcio y (iii) una composición capaz de formar una matriz de fibrina bajo condiciones fisiológicas que comprende un componente precursor fibrinógenoy el componente precursor de la trombina, en dondel PTH o péptido de fusión PTH está presente en un intervalo de concentración entre 0.01 a 2 mg/mL de matriz de fibrina o precursor de componente formando la matriz, con la condición de que una concentración de 0.4 mg/mL de matriz de fibrina o precursor componente de de formación de la matriz no esté incluido.

Description

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3.: Besson et al., (1996) Analytical Biochemistry 237:216-223.

4.: 4. Netzel-Arnett et al., (1991) J. Biol. Chem.. 266:6747-6755.

5.: Coombs et al., 1998. J. Biol. Chem. 273:4323-4328.

Una realización preferida es la secuencia de YKNR (SEQ.NO. 18) entre el primer dominio y el segundo dominio hace degradable el enlace de plasmina

Un péptido de fusión PTH particular preferido es TGp1PTH:

NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 19)

Las proteínas de fusión preferidas incluyen:

TG-PTH1-34: Esta es una forma modificada de PTH que comprende los aminoácidos 1-34 del PTH nativo, así como un dominio sustrato TG (transglutaminasa):

NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 20)

TG-pl-PTH1-34: Esta forma corresponde a TG-PTH, excepto que contiene adicionalmente una secuencia de plasminadegradable (pl) entre la secuencia de TG y el PTH1-34:

NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 19)

Las enzimas que se podrían usar para degradación proteolítica son numerosas. Sitios degradables proteolíticamente podrían incluir sustratos para activadores de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o plasminógeno.

En otra realización preferida un dominio de oligo-éster podría insertarse entre el primero y el segundo dominio. Esto se puede lograr utilizando un oligo-ésteres tales como oligómeros de ácido láctico.

Combinación de matrices o componentes precursores y PTH

El PTH o péptido de fusión PTH está preferiblemente en una gama de componentes entre 0.01 a 2 mg de PTH/ml de matriz o precursores que forman la matriz, que es apropiada para la reparación y la curación de fracturas óseas con la condición de que una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz no está incluido. Preferiblemente, la concentración de PTH se encuentra en una gama de componentes entre

0.1 a 1,7 mg/mL de matriz de fibrina o precursores que forman la matriz, incluso más preferiblemente el intervalo de concentración está en un intervalo entre 0.3 a 1.5 mg/mL componentes de la matriz de fibrina o precursores formando la matriz y más preferiblemente en un intervalo de concentración de los componentes entre 0.4 a 1.1 mg/ml de matriz de fibrina o precursores que forman la matriz con la condición de que una concentración de PTH 0.4 mg/mL de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz no esté incluida. Dependiendo de la edad del paciente, se prefieren ciertas concentraciones del PTH o péptido de fusión PTH en las matrices. Si la formulación se aplica a fracturas de hueso en niños, la concentración de PTH o péptido de fusión PTH está preferiblemente por debajo de 0.4 mg de PTH o matriz de péptido/mL de fusión o componentes precursores que forman la matriz pero por encima de

0.01 mg de PTH o matriz de péptido/mL de fusión o componentes precursores que forman la matriz. En concreto la concentración de PTH o péptido de fusión PTH está en un intervalo entre 0.01 y 0.35 mg de PTH o matriz de péptido/mL de fusión PTH o componentes precursores que forman la matriz, más preferiblemente en un intervalo de concentración entre 0.1 a 0.3 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz y más preferiblemente en un intervalo de concentración entre 0.05 y 0.15 mg de PTH o matriz de péptidos/mL de fusión PTH

: o componentes precursores de la formación de la matriz. Mientras que si la formulación se aplica a los adultos, la concentración de PTH o péptido de fusión PTH está preferiblemente por encima de 0.4 mg de PTH o matriz de péptidos/mL de fusión de PTH o componentes precursores que forman la matriz pero no superior a 2 mg de PTH o matriz de péptidos/mL de fusión de PTH o precursores que forman la matriz. Específicamente, la concentración preferida de PTH o péptido de fusión PTH está en un intervalo entre 0.45 y 2 mg de PTH o matriz de pepetidos/mL de fusión de PTH o precursores que forman la matriz, más preferiblemente entre 0.7 y 1.5 mg de PTH o matriz de péptido/mL de fusión de PTH o componentes precursores y más preferiblemente entre 0.9 y 1.1 mg de PTH o matriz de péptido/mL de fusión del PTH o componentes precursores que forman la matriz. En una realización preferida la matriz es una matriz de fibrina.

E.: Material granular

La matriz también puede contener un material granular, preferiblemente el material granular contiene un mineral de calcio. Este material granular soporta principalmente las propiedades mecánicas de la matriz de fibrina para adaptar la matriz a las necesidades específicas de la indicación. El material granular puede ser cualquier material biocompatible que proporciona el soporte mecánico necesario para la composición, por lo que el grado de soporte mecánico

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directamente en la solución reguladora en una concentración de 0.5 µg de PTH o matriz de fibrina TGPTH/mL. Diferentes soluciones reguladoras se probaron: agua destilada, solución salina reguladora de fosfato, solución salina reguladora tris.

Se tomaron alícuotas en los días 0, 1, 2, 4 y 6 y se analizaron por ELISA directo. Los resultados mostraron que el PTH

5 no era estable durante más de 2 días en cualquiera de las soluciones reguladoras. Por lo tanto, no se pudieron establecer conclusiones sobre los datos de liberación. La estabilidad del PTH fue sin duda afectada por su baja concentración y los tampones que no eran óptimos.

El experimento de liberación se repitió mediante el uso de una solución reguladora estabilizante que contiene manitol 50 mM en una solución reguladora de acetato de sodio 10 mM. Además, la solución reguladora se intercambió cada 2 10 días con el fin de evitar cualquier degradación de péptidos. La concentración de PTH o TGPTH se aumentó a 1 mg de PTH o matriz de fibrina TGPTH/mL en una matriz de 100 µl de fibrina y la incubación se logró en 1 ml de tampón. La concentración de PTH o TGPTH en la solución reguladora en caso de una liberación total sería de 100 µg/ml de la matriz de fibrina (200 veces más que antes). Como en el primer experimento, ajustando muestras (misma cantidad de PTH o TGPTH disolvió en el tampón como control) se prepararon para evaluar la estabilidad del PTH o TGPTH

15 durante el experimento (100 µg/ml). Se recogieron muestras cada 2 a 4 días (con un cambio de solución reguladora) durante 2 semanas y se analizaron por ELISA directo. Las muestras contaminadas, también se recogieron cada 2 días. Los resultados mostraron que en estas condiciones el PTH y TGPTH son estables durante 2 semanas.

Como puede verse en la figura 2, la mayor liberación de la matriz de fibrina se logra dentro de los 3 días. Casi 60% de PTH y 13% de TGPTH fueron liberados después de día 3. Estos datos demuestran la retención de PTH en la matriz

20 de fibrina es altamente mejorada mediante la adición de la secuencia de TG.

Ejemplo 3: Modelo de Defecto Tibial Ovino

Se formó la matriz de fibrina a partir del kit de TISSEEL® (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH) de matriz de fibrina dando 4 ml. TISSEEL® se produce a partir de plasma agrupado humano derivado y el contenido de ingredientes activos puede variar de un lote a otro dentro de los rangos predefinidos.

25 Matriz: La matriz se preparó usando 3 jeringas separadas, una solución precursora de fibrina de dos vías y jeringa que contiene péptidso de fusión PTH (jeringas 1 y 2) y dos jeringas de un solo sentido que contienen gránulos (jeringas 3 y 4). La Tabla 2 enumera la composición final utilizada.

Tabla 2: Composición final que comprende TISSEEL® y el componente activo

Ingredientes: Dosis por 2 mL de gel

Jeringa 1 (1mL)

Componente activo: Peptide de fusion PTH1-34 (TGplPTH1-34): 0.4-10 mg

Agentes de coagulación Fibrinógeno (humano) Otras proteínas Aprotinina (bovina) Albúmina humana Componentes de amortiguación Niacinamida L-histidina Citrato de sodio Polisorbato 80 Agua para inyección: 66-100 mg 2046-3409 UIC 9.1 -18.2 mg 2.7 -8.2 mg 9.1 -22.7 mg 4.4-8.8 mg 0.6 -1.7 mg hasta 1 ml

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Ingredientes: Dosis por 2 mL de gel

Jeringa 2 (1mL)

Agentes de coagulación Trombina (humana) Componentes reguladores Cloruro de Calcio Cloruro de sodio Seroalbúmina humana Agua para inyección: 2.5-6.5 UI 5,88 ± 0,6 mg 3.5 a 5.5 mg 45 -55 mg hasta 1 ml

Jeringa 3 (1mL)

Agua para inyección: 1 ml

Jeringa 4 (1mL)

gránulos de hidroxiapatita/fosfato de calcio componentes de amortiguamiento (gránulos TCP): 1.75 -2 g

En primer lugar los gránulos de hidroxiapatita/fosfato de calcio en la jeringa 4 se humedecieron por inyección del agua de la jeringuilla 3. La solución precursora de fibrina de la jeringa 1 (fibrinógeno y PTH suspendido en una solución con la aprotinina, un inhibidor de la proteinasa de la serina que ayuda a reducir la fibrólisis para retener la integridad de la matriz de fibrina) se mezcló con la solución precursor de fibrina de la jeringa 2 (trombina en una solución de cloruro calcio). TGplPTH1-34 se formuló en el componente de fibrinógeno para dar una concentración final en la matriz que varía desde 0.1 mg/ml a 10 mg/ml de la matriz de fibrina y durante el proceso de gelificación TGplPTH1-34 convirtió en reticulada la matriz. Las soluciones precursoras de fibrina también contenían otros componentes de la matriz de fibrina, tales como la fibronectina de plasma, Factor XIIIa, el plasminógeno, y la albúmina humana. Cuando las soluciones precursoras son en volúmenes iguales, un proceso de coagulación se produce para formar fibrina. El proceso de coagulación se lleva a cabo durante varios minutos lo que permite la inyección simultánea de las soluciones mixtas en la jeringa 4, que contienen los gránulos humedecidos. La matriz puede entonces ser introducido en el lugar donde se necesita, donde se solidifica. Se colocó suficiente matriz en el defecto para llenarlo por completo.

Animales: Un total de 42 ovejas hembras Suizas Alpinas, que oscilan entre 44-83 kg (media: 62,8 kg) y 2,25 -4,75 años de edad fueron elegidos como animales de experimentación. Siete grupos se formaron con autoinjertos como matriz positiva y la fibrina más gránulos de TCP como controles negativos. Los otros grupos consistieron en la misma matriz de fibrina y gránulos de TCP, pero diferían sólo en la dosis de la TGplPTH1-34. Los grupos fueron seguidos durante 12 semanas, cuando los animales se sacrificaron en una planta de sacrificio propiedad de la universidad. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las leyes suizas de protección y bienestar animal y fueron autorizados por el comité de ética local y las autoridades veterinarias.

Cirugía: Un enfoque medial al eje de la tibia se realizó directamente sobre el hueso y que se extiende desde la cara distal de la rodilla a la articulación del corvejón, se realizó una incisión de la fascia medial de la tibia y la cara medial de la tibia expuesta sin perturbar el periostio. 11 agujeros de 3.5 mm de amplitud en la placa de compresión dinámica (Synthes) fueron contorneados para el eje con el extremo distal de la placa que termina encima de la articulación tibiotarsal. La placa se fija al hueso utilizando once tornillos de 3.5 mm en una posición neutral y la distribución de cinco agujeros de tornillo distales y seis proximalmente con el defecto previsto. Se retiraron los tornillos y la placa. A partir de entonces, el defecto fue marcado en el hueso con una hoja de bisturí utilizando un medidor asegurando un defecto normalizado de 1 cm entre el agujero del quinto y sexto tornillo. Con una sierra oscilante, el defecto se cortó bajo riego constante y la preservación de los tejidos blandos. El segmento de 1 cm incluyendo el periostio circunferencial se retiró cuidadosamente y sangrado local de la médula ósea o de los tejidos blandos se detuvo con la aplicación de presión con una gasa. La placa se vuelve a colocar y todos los tornillos fueron reinsertados antes de introducir la matriz en el hueco del hueso como se describe anteriormente. Se tuvo cuidado en distribuir la matriz igualmente debajo de la placa, en el lateral y, así como la transcórtex.

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Para el grupo control positivo de autoinjerto, el hueso autógeno se recogió a través de una incisión local directamente encima de la cresta ilíaca. La médula ósea del íleon fue abierta usando múltiples agujeros de perforación de 3.5 mm. El hueso esponjoso se recogió con una cureta y se colocó inmediatamente en el defecto quirúrgico en la tibia. Tras el llenado de los defectos, la fascia medial se cerró de forma rutinaria y la piel con grapas (Signet 35W®, suturas Auto, Connecticut, EE.UU.). Mientras que los animales todavía estaban anestesiados, se tomaron radiografías usando vistas-medio-lateral y caudo-craneal de la tibia. Se aplicaron moldes completos (Scotch ™ Plus moldeada, Laboratoires 3M Santé, Francia) que involucra la totalidad de las extremidades distales que se extienden hasta el centro de la articulación de la rodilla en el nivel de la rótula. La suela de las garras se dejó abierta para asegurar que se lleva en el lugar de la fractura, pero la prevención de las fuerzas de torsión o de corte a través de la inmovilización de la diáfisis tibial mediante el reparto del peso.

Los animales fueron recuperados en un sistema de suspensión que impedía a los animales acostarse y levantarse a toda prisa causando re-fractura de la extremidad. Los animales se mantuvieron en el sistema de suspensión durante 4-5 semanas, donde podían dormir, comer, defecar y orinar sin interferencias. A partir de entonces, se les mantuvo en pequeños puestos en grupos de 2-3 animales por el resto del período de estudio.

Cambios de enyesado se realizaron cada 7-10 días o antes, si los animales mostraban problemas con la carga de peso, y se dejaron en el lugar como mínimo 4 semanas, pero como máximo y 12 semanas. Las radiografías de seguimiento a través de los moldes fueron tomadas a las 4 y 8 semanas. En el momento del sacrificio (12 semanas), las radiografías se tomaron usando un Faxitron (HP Electronics) después de que el tejido blando, las placas y tornillos se retiraron.

Evaluación macroscópica: Después del sacrificio, la reducción de la brecha se evaluó macroscópicamente centrada en la placa y la estabilidad de la fractura, los signos de inflamación y la formación de callo perióstico. Todos los huesos se documentaron con una cámara digital (Minilta, Dimage 7) La estabilidad mecánica fue probado sólo manualmente, pero con precaución para evitar daños en los tejidos para la futura preparación histológica.

La evaluación radiológica: Un sistema de puntuación semicuantitativa fue desarrollado para evaluar las radiografías. Las puntuaciones altas fueron favorables para la unión ósea. Las radiografías fueron evaluadas por tres revisores independientes, que no estaban informados acerca de los grupos y los puntos de tiempo durante el estudio. Todas las radiografías fueron anotadas durante una sesión y si las puntuaciones diferían, se tomaron las puntuaciones medias para la evaluación estadística.

Histología. Brevemente, las secciones de hueso fueron cortadas de tal manera que toda la brecha anterior estaba cerrada y el corte se hizo proximal y distal del primer agujero del tornillo. Después de la fijación en para-formaldehído al 4% durante 3-4 semanas, los bloques de hueso se lavaron, se deshidrataron en una serie ascendente de alcohol, desgrasada en xileno y, por último infiltrado en resina acrílica. Después de que la infiltración se completó, la polimerización se realizó en formas de teflón. Se cortaron secciones en el medio y paralelas al eje largo del hueso usando una sierra de banda exacta. Antes de que las secciones de corte se montaran en portaobjetos de plástico acropal, fueron tomadas microradiografías con la faxitron usando una película especial (Kodak PPL-2). A continuación, las secciones se molieron y se pulieron hasta un espesor de 30-40 µm. La tinción de la superficie con azul toludine permitió diferenciar entre la matriz del hueso viejo y el nuevo y también los gránulos de TCP.

Para las secciones finas (5µm), los bloques se cortaron en trozos más pequeños que contienen al menos una corteza

y parte del callo perióstica y endóstico. Las secciones fueron montadas en carga positivamente, los portaobjetos de vidrio se cubrieron con cromalina, se desplastificaron y se tiñeron con azul de toluidina o bien von Kossa tinción de plata de contraste con McNeal. En este último, la matriz ósea mineralizada está teñida de negro, mientras que el osteoide no calcificados se tiñe de azul turquesa.

La evaluación histológica cualitativa se realizó centrándose en tipos de células, signos de inflamación y los mecanismos de la degradación de las matrices.

La evaluación semi-cuantitativa se concentró en la aparición de tipos de células utilizando un sistema de puntuación especialmente desarrollado, y las mediciones histomorfométricos sirvieron como base para la evaluación cuantitativa.

La capacidad de regeneración de la matriz (que contiene diferentes concentraciones de TGplPTH1-34) se ensayó adicionalmente en un defecto segmental en las ovejas. Aquí, defectos unilaterales de 1 cm de espesor fueron creados en las tibias de oveja. Después de la osteotomía, el periostio se retiró cuidadosamente para asegurarse de que el defecto era una falta de unión por un período de tiempo para ser estudiado. Después de la creación del defecto, un material de gelificación in situ fue colocado en el defecto como se describió anteriormente en los métodos de la sección de aplicación.

Con fines comparativos, se ensayaron diferentes dosis de TG-PTH: 0.4,1,2.5 y 10 mg/ml, se realizaron dos tratamientos de control, donde no se añadió TGplPTH1-34 a la matriz de fibrina granulada compuesta (0 mg/ml) o un autoinjerto (abreviado "AG" en las figuras 3 y 4) fue aplicado (control positivo).

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Claims

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