ES2321068T3 - Matrices de suministro de farmacos para mejorar la curacion de heridas. - Google Patents

Abstract

Un sistema para curar heridas que comprende al menos una primera y una segunda composición separadas una de la otra, en donde la primera composición comprende un componente precursor en una red tridimensional, la segunda composición comprende un componente precursor en una cadena tridimensional posterior, los componentes precursores cuando son mezclados bajo condiciones que permiten la polimerización de los componentes de los precursores forman una cadena sintética tridimensional por una reacción de adición de tipo Michael; y ademas en donde al menos una de la primera o segunda composición comprende una molécula biológicamente activa que ha sido seleccionada de los miembros desglucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína.

Description

Matrices de suministro de fármacos para mejorar la curación de heridas.

Antecedentes de la invención

Está invención esta generalmente en el campo del suministro de fármacos y más específicamente en el área de las matrices sintéticas y de fibrina para mejorar la curación de heridas.

Las matrices de fibrina están presentes naturalmente en el cuerpo y sirven como la matriz inicial para la curación de heridas. Cuando una lesión ocurre en el tejido, los vasos sanguíneos son comprimidos, permitiendo a la molécula precursora, al fibrinógeno invadir la herida. El fibrinógeno luego es dividido enzimáticamente y auto-catalizado en un gel poco formado. El gel luego se entre-enlaza covaléntemente a través de la acción de la transglutaminasa, factor XIIIa, resultando en una matriz estable. Pisano, Finlayson and Peyton, Science, 160, 892-893
(1068).

In vivo, la matriz de fibrina final incluye varias proteínas en adición al fibrinógeno, tal como las proteínas de suero presentes durante el procedimiento de coagulación, Por ejemplo fibronectina y el inhibidor de \alpha2-plásmido. El factor XIIIa puede entre-enlazar covalentemente estas proteínas de suero a la matriz de fibrina, lo cual puede luego adicionarse a las bioactividades adicionales a la matriz que puede modificar la habilidad de las células para infiltrar y degradar la matriz. Tamaki y Auki, J. Biol. Chem., 257, 1467-1472 (1992). Estas matrices también contienen la mayoría de las células sanguíneas, las cuales son adecuadas para introducirse en la matriz durante la coagulación, además de la modificación del carácter bioquímico de la matriz. Un tipo de célula mayor es la plaqueta, una célula rica con suministros naturales de los factores de crecimiento potencialmente terapéuticos.

Una ventaja importante de la fibrina es que es una matriz que es altamente conductora para las células, permitiendo que fácilmente se infiltren al lugar de la herida. El procedimiento empleado desarrolla dos modalidades principales. Primero, la matriz contiene sitios de adhesión, que permite que las células se unan y migren en el gel. Adicionalmente, la matriz es sensible a la actividad proteolítica derivada de la célula. Esto permite que la matriz se degrade localmente, permitiendo que las células migren en la matriz no inhibida pero que previene la degradación global de la matriz. Herbert, Bittner and Hubell, J Compar Neuro, 365, 380-391 (1996); Pittman and Buettner, Dev. Neuro, 11, 361-375 (1989). Por lo tanto la matriz natural permanece en el lado de la lesión hasta que se infiltre mediante las células, en este tiempo se degrada durante este procedimiento que conduce al tejido regenerado.

El procedimiento de curación natural es algunas veces inadecuado, tal-como cuando esta respuesta de curación general falla para conducir a la regeneración del tejido especial funcional. Ver por ejemplo, Robello GT and Aron DN, Semin Vet Med Surg (Small Anim), 7, 98-104 (1992). Por lo tanto, existe una necesidad para un medio que induzca la formación del tejido regenerado, funcional completo, especialmente el tejido especializado regenerado especialmente. La mayoría de las moléculas bioactivas, incluyen los factores de crecimiento, péptidos, y otras moléculas combinadas, que han sido descubiertas las cuales pueden afectar la regeneración del tejido. Schense and Hubbell, Bioconj. Chem, 10, 75-81 (1999). Trabajos anteriores han mostrado que los factores de crecimiento pueden ser precipitados dentro de la matriz de fibrina. MacPHee, Druhan y col., 76 (1995); las Patentes de E.U.A. Nos. 6,117,425 y 6,197,325 a MacFee y col., Sin embargo, estos investigadores no han reconocido las ventajas poderosas del trabajo con los factores de crecimiento no glucosilados, y especialmente los miembros no glucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del ánodo de cisteína, en particular la familia de TGB\beta.

Los factores de crecimiento tienen una acción importante en -la curación de heridas, y están frecuentemente presentes naturalmente en el sitio de la lesión. Sin embargo, si los factores de crecimiento son aplicados al cuerpo en concentraciones elevadas, los efectos adversos son similarmente a los observados. Por ejemplo, si el mecanismo de retención de BMP en una matriz no esta optimizada, es decir si el BMP simplemente se difunde desde la matriz dentro de las primeras horas, dosis elevadas de BMP en la matriz son necesarias para originar una respuesta local en el sitio de la lesión. Como un resultado la mayor cantidad de MBP circula libremente en el cuerpo y la formación de hueso ectópico puede ocurrir. Por lo tanto es necesario mantener la concentración de la circulación libremente de los factores de crecimiento tan bajo como sea posible aunque local suficientemente elevado tal que la respuesta terapéutica deseada esta iniciando la señal del sitio de la lesión. Se conoce, que por ejemplo, algunos receptores del factor de crecimiento deben estar ocupados por al menos 12 horas para producir el efecto biológico máximo. Un contacto prolongado originado por un pequeño aunque flujo constante del factor de crecimiento cercano al sitio de la necesidad por lo tanto es muy favorable para una respuesta de curación. A la misma variación de liberación constante, liberación de la matriz es la mas larga, la más elevada concentración inicial del factor de crecimiento es retenido en la matriz.

Por lo tanto es un objeto de la presente invención aumentar la concentración de retención de las moléculas bioactivas, en particular de los factores de crecimiento en una matriz. Un objeto mas de la invención es para proporcionar un método para la reducción de la solubilidad del factor de crecimiento en una matriz que se obtiene de fibrina o que se obtiene de polímeros sintéticos.

En particular se resuelve mediante las moléculas bioactivas desglucosiladas, en particular mediante los miembros desglucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistina, en particular mediante los miembros desglucosilados de la superfamilia de TGF\beta. En aún un objeto adicional de la invención se proporcionan las composiciones y los métodos para la obtención de la composición para mejorar la curación de las heridas, especialmente por el suministro. Estos objetos son resueltos por las modalidades de las cláusulas independientes. En particular son resueltos mediante el suministro de los miembros desglucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistina, en particular de los miembros no glucosilados de la superfamilia de TGF\beta.

Las moléculas bioactivas son introducidas dentro de una matriz para el suministro regulado de estos compuestos para las aplicaciones de curación terapéuticas. La matriz se puede formar de compuestos sintéticos o naturales. El método principal de introducción de la molécula bioactiva es a través de la precipitación de la molécula bioactiva durante el proceso de la formación de gel de la matriz, ya sea in vivo o in vitro. La molécula bioactiva puede estar modificado para reducir su solubilidad efectiva en la matriz para retenerla mas efectivamente dentro de la matriz, tal como a través de la desglucolisis de los miembros dentro de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína y particularmente dentro de la superfamilia de TGFP. La matriz puede estar modificada para incluir los sitios con la afinidad de enlazar para las moléculas bioactivas diferentes, por ejemplo, para el enlazamiento de la heparina.

Cuando estas moléculas bioactivas diferentes se adicionan a la matriz, las moléculas bioactivas se enlazan a la matriz ambas mediante la precipitación dentro de la matriz y mediante el enlazamiento a los sitios en la matriz, con lo cual se proporciona el suministro regulado mejorado a un paciente.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficas de medición de la incorporación de un péptido de substrato del factor XIIIa en la fibrina. Los geles de fibrina son sintetizados a 8 mg/ml, a partir de Paquetes de Tissucol^{MR} (Baxter) (Figura 1A) prediluido, los cuales están diluidos mediante un factor 2 (\blacksquare) y 10 (\blacklozenge) o a partir de fibrinógeno purificado ya sea con(\blacklozenge) o sin (\blacksquare) 1 U/ml del factor exógeno XIIIa adicionado a la mezcla de pre-polimerización (Figura 1B).

La Figura 2, es una gráfica de medición de la retención de las moléculas bioactivas en una matriz de fibrina después de que se lava. Dos moléculas bioactivas separadas, una molécula soluble en agua, heparina (\lozenge) y con una solubilidad baja a pH fisiológico, la proteína morfogéntica de hueso humano recombinante (rh-BMP-2) (\Box), se adiciona a la fibrina durante la polimerización y se lavan repetidamente en una solución reguladora de fosfato (SRF).

Las Figuras 3A y 3B muestran la retención de rh-BMP-2 en los geles de fibrina. En la Figura 3A, los geles de fibrina se polimerizan con 10 (\Delta), 20 (\Box), 100 (\lozenge) y 200 (\medcirc) \mug/ml., de la rh-BMP-2 sin glucosilar, presente durante la polimerización del gel y el porcentaje de rh-BMP-2 permanece en el gel se determina después de 10, 20, 30, 40 y 50 volúmenes del lavado en PBS. En la Figura 3B, la retención en los geles de fibrina con 20 \mug/ml, de la rh-BMP-2 procariótica (\Box), 20 mg/ml del rh-BMP-2 glucosilada derivada de las células CHO (\lozenge), y 20 \mug/ml., de la rh-BMP-2 premezclada con heparina equimolar (\medcirc) también se analiza. Los valores promedio y las desviaciones estándar se muestran en cada una de las figuras.

Las figuras 4A y 4B, muestran niveles de curación de los defectos calvariales de la rata de una manera critica. La eficacia de curación de los geles de fibrina con varias formulaciones de rh-BMP-2 no glucosilado y glucosilado se mezclan dentro del gel que se esta cuantificando. En la Figura 4A, la rh-BMP-2 no glucosilada se mezcla dentro del gel de fibrina a una concentración de 0 (I), 1 (II), 5 (III) y 20 (IV) \mug/ml. Adicionalmente en la Figura 4B, el gel de fibrina (I), el gel de fibrina con 1 \mug/ml., de la rh-BMP-2 no glucosilada el gel de fibrina con 1 \mug/ml., de la rh-BMP-2 no glucosilada premezclada con una cantidad equimolar de heparina (VII), el gel de fibrina mezclado con la misma cantidad de heparina (V), el gel de fibrina con 1.0 \mug/ml., de rh-BMP-2 glucosilada (VI) con un dominio de transglutaminasa para enlazarse covalentemente a la matriz de fibrina (como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,331,422) y el gel de fibrina con 1 g/ml., de rh-BMP-2 glucosilada (VIII) son probados. El área promedio de defecto se llena con tejido calcificado después de 21 días de curación con la desviación estándar que se indica en esta figura.

La Figura 5, muestra la curación radiológica de la artrodesis pancarpal canina. La eficacia del uso de BMP-2 no glucosilada en matrices de fibrina se prueban en este defecto y se compara al estándar clínico del auto-injerto cancellous. El promedio de la marca de curación de tres filas de articulaciones carpal de nueve perros con el reemplazamiento del auto-injerto con un gel de rh-BMP-2/fibrina desglucosilada se calcula en cuatro, ocho y doce semanas. Un método estándar se desarrolla para determinar el grado de curación en donde 0 corresponde a sin mineralización siendo visible, 1 corresponde a algo de mineralización siendo visible, 2 corresponde a un defecto que está completamente mineralizado y 3 corresponde a defectos remodelados y curados. La rh-BMP-2/fibrina desglucosilada para tratar a perros muestra un grado de curación radiológico mayor que al comparado al grupo de control tratado con un auto-injerto.

Descripción detallada de la invención I. Composiciones

Las composiciones se forman de una matriz sintética o natural y una molécula bioactiva, en particular un factor de crecimiento, el cual se puede administrar a un paciente para mejorar la curación de herida. Las composiciones también pueden entender como materiales iniciadores para que la matriz tenga moléculas bioactivas integradas en la misma, por ejemplo puede contener al menos un componente necesario o adecuado para la formación de la matriz con las moléculas bioactivas atrapadas. El compuesto bioactivo se libera de una manera regulada a partir de la matriz.

La molécula bioactiva es un miembro desglucosilado de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína, de preferencia un miembro no glucosilado de la superfamilia de TGF\beta. En el contexto de la presente invención un factor bioactivo precipita concentración factor bioactivo excede la concentración límite que es soluble en el vehículo respectivo a un pH predefinido y temperatura. Si esta definición es apta, la precipitación también puede realizar la precipitación debido a cualquier interacción física de la molécula bioactiva y la matriz, por ejemplo, la adsorción, las fuerzas electrostáticas, la precipitación de afinidad, co-precipitación, etc. Los términos, introducir, inclusión y precipitación son usados sinónimamente a través de la aplicación como medios para lograr la retención.

"Matriz" significará una red tridimensional la cual puede actuar como entablillado para el crecimiento hacia dentro de la célula para las moléculas bioactivas sobre cierto periodo de tiempo.

"Moléculas bioactivas desglucosiladas" significa las moléculas bioactivas las cuales cuando se encuentran en la naturaleza son glucosiladas en uno o más sitios de la molécula, sin embargo en donde la glucólisis ha sido eliminada desde la molécula mediante métodos químicos o enzimáticos o mediante la producción como una molécula no glucosilada. Un "factor de crecimiento desglucosilado" es un factor de crecimiento que puede esta glucosilado cuando se expresa en una célula eucariótica y en donde la secuencia del polisacárido o las glucosaminoglicanos han sido ya sea sujeta hacia delante, o el método de expresión es tal que el factor de crecimiento no esta glucosilado. Los hechos recientes por ejemplo si el factor de crecimiento se expresa en una célula procariota. Los términos "desglucosilados", "sin glucosilar" "no glucosilados" son usados sinónimamente a través de la solicitud.

"Retención" significa que al menos 10% de la concentración aplicada inicial de la molécula bioactiva, de preferencia al menos 60% y aún mas preferiblemente al menos 80% está aún presente en la matriz después de volúmenes de 10 lavados. El volumen de los lavados se definen como el mantenimiento de la matriz en la cual la molécula bioactiva se atrapa en una proporción en volumen de 1 parte de matriz a 10 partes de la solución salina reguladora de fosfato (PBS 0.01 M; pH 7.4), por al menos 12 horas a 37ºC. La retención se puede lograr por ejemplo mediante la precipitación de la molécula bioactiva. "La concentración de- retención" significará el % de la concentración inicial la cual es retenida de conformidad a la definición dada en la presente.

Los términos "liberación de una manera regulada" o "liberación regulada" y "liberación prolongada" tienen los mismos significados y expresarán el resultado de la retención. La liberación regulada no solo se debe para retrazar y estabilizar la desintegración del factor de crecimiento y la siguiente difusión de la matriz aunque también se debe a la desintegración y a la división enzimática de la matriz.

"Procedimiento de formación de gel" significa la formación de una red de tres dimensiones y por lo tanto la transformación de una composición líquida a una composición viscosa. Los términos "gel" y "matriz" se usa de una forma sinónima a través de la solicitud. Una formación in situ del gel o de la matriz se entenderá como la transición de un estado líquido a un estado sólido en el sitio de la aplicación. en el cuerpo. "Hidrogel" significa una clase de material polimérico el cual es extensivamente dilatado en un medio acuoso, aunque no se disuelva en agua.

"Adición Michael o reacción de adición del tipo Michael" es la reacción de adición de 1,4 de un nucleófilo o de un sistema insaturado conjugado bajo condiciones básicas. El mecanismo de adición puede ser netamente polar, o procesado a través de un estado(s) intermedio(s) similar(es) al radical; las bases de Lewis o el hidrógeno apropiadamente designado enlaza especies que pueden actuar como catalizadores. El término conjugación se puede referir tanto a la alteración de carbono-carbono, carbono-hetero-átomo o hetero átomo-hetero átomo de enlaces múltiples con enlaces sencillos o al enlazamiento de un grupo funcional a una macromolécula, tal como un polímero sintético o una proteína. Los dobles enlaces espaciados por una unidad de CH o CH_{2} son referidas a como dobles enlaces homo-conjugados. La adición del tipo de Michael a los grupos insaturados conjugados se puede realizar en substancialmente rendimientos cuantitativos a las temperaturas fisiológicas, en particular a la temperatura del cuerpo aunque también a temperaturas mas bajas y más altas que la del cuerpo. Esto se realiza en condicione suaves con una variedad amplia de los nucléofilos, similares a las amainas y los tioles. La reacción como se usa para la presente invención es de. preferencia auto-selectiva lo que significa que el primer componente inicial de la reacción actúe lo mas rápido con el segundo componente de iniciación de la reacción que con otros compuestos presentes en la mezcla al lado de la reacción, y el segundo componente de iniciación reaccione mucho más rápido que el primer componente de iniciación que con los otros compuestos presentes en la mezcla al lado de la reacción. Como se usa en la presente un nucléofilo preferencialmente se une a una instauración conjugada, mejor que a otros compuestos biológicos, y un grupo insaturado conjugado preferencialmente se enlaza a un nucleófilo mejor que a otros compuestos biológicos.

"Red polimérica" significa el producto de un procedimiento en el cual substancialmente todos los monómeros, oligo- o polímeros se enlazan mediante las uniones covalentes intermoleculares a través de sus grupos funcionales disponible con lo cual da como resultado una molécula grande.

"Formación in situ" se refiere a la habilidad de las mezclas de los componentes de los iniciadores los cuales están substancialmente no entrelazados antes a y al tiempo de la inyección para formar las uniones covalentes uno con el otro a, una temperatura fisiológica en el sitio de la inyección en el cuerpo.

Como se usa en la presente las palabras "polimerización" y "entre-lazado" se usan para indicar un enlazamiento de las moléculas de los componentes de iniciación múltiple para resultar en un incremento substancial en el peso molecular. "Entre-lazado" indica además la ramificación, típica para obtener una red del polímero.

Por "funcional" se entenderá que se usa para modificar tal resultado en la unión de un grupo o fracción funcional. Por ejemplo, una molécula puede ser funcional mediante la introducción de una molécula lo que hace a la molécula un nucleófilo fuerte o una insaturación conjugada. De preferencia, por ejemplo, PEG es funcional para convertir un tiol, amina, acrilato o quinona.

Por "funcionalidad" significa el número de sitios reactivos sobre una molécula. Como se usa en la presente la funcionabilidad de un nucleófilo fuerte y una instauración conjugada cada una siendo al menos dos. La mezcla de los dos componentes, por ejemplo un nucleófilo fuerte y una insaturación conjugada, con la funcionabilidad de dos cada uno resultará en un biomaterial polimérico lineal, y la mezcla a los dos componentes con la funcionabilidad de al menos dos de cada uno, uno de los componentes teniendo una -funcionabilidad de mas de dos, resultando en un biomaterial de entre-lazado.

Como se usa en la presente por "regenerar" se entenderá como un crecimiento posterior de una porción, o de todo un tejido. Por ejemplo, la presente invención realiza métodos de regeneración de hueso después del trauma, la eliminación del tumor, o la fusión de la columna vertebral, o para la regeneración de la piel para ayudar en la curación de las úlceras de píes diabéticos, llagas por la presión, e insuficiencia venosa. Otros tejidos los cuales se pueden regenerar incluyen pero no se limitan a la piel, hueso, nervios, vasos sanguíneos y tejido de cartílago.

Como se usa en la presente "péptido" y "proteína" son diferenciados mediante su longitud de la cadena de conformidad a las definiciones de la longitud de la cadena usual en la técnica. Preferiblemente, "péptido" significa los poli aminoácidos hasta de 30 aminoácidos, más preferiblemente desde aproximadamente 10 a 20 amino ácidos con lo cual las proteínas son de preferencia los poli-aminoácidos mencionados antes de 30 aminoácidos

A. Matriz

Las matrices pueden ser biodegradables o no degradables. Las matrices se puede obtener de los polímeros sintéticos o naturales, oligómeros y monómeros. Los términos polímero, oligómero y monómero son usado en el sentido común de la palabra. Los polímeros sintéticos, los oligómeros, y los monómeros incluyen aquellos derivados de las moléculas de iniciación del óxido de polialquileno, tal como el poli (óxido de etileno) (PEO), poli(etileno glicol) (PEG), y los copolímeros con el poli(óxido de polipropileno) (PEG-co-PEG), poli (alcohol de vinilo) (PVA), poli (vinilpirrolidona) (PVP), poli(etiloxazolina) (PEOX), poli aminoácidos, y pseudo poli-aminoácidos, y los copolímeros de estos polímeros. Sawhney AS, Pathak CP y Hubbell JA, Macromolecules, 26, 581-587 (1993). Los copolímeros pueden también ser formados con otros polímeros solubles en agua o con polímeros insolubles en agua, con la condición de que el conjugado sea soluble en agua. Un ejemplo del conjugado soluble en agua, es un copolímero de bloque del polietileno glicol, y el óxido de polipropileno, comercialmente disponibles como el surfactante de Pluronic^{MR} (BASF).

Los polímeros naturales, oligómeros, y monómeros incluyen las proteínas, tales como el fibrinógeno, fibrina, gelatina, colágeno, elastina, zeína, y albúmina las que se producen a partir de fuentes naturales o recombinantes, y los polisacáridos, tales como la agarosa, alginato, ácido halurónico, sulfato de condroitina, dextrano, sulfato de dextrano, heparina, sulfato de heparina, quitona, goma de gellan, goma de xantano, goma de guar, derivados de celulosa solubles en agua, y carragenina. Estos polímeros son solamente ejemplos de los tipos de matrices que pueden ser utilizadas y no se pretende que representen todas las matrices dentro de las cuales se puede atrapar al compuesto.

Matrices de fibrina

Debido a su acción natural, en la curación y en la habilidad de infiltración celular conveniente, la fibrina es una selección preferida para la obtención de una matriz. En una modalidad preferida, la matriz es un gel de fibrina, originado de cualquier fuente de fibrinógeno. Cuando se mezcla con la cantidad apropiada de la trombina, el calcio y la molécula bioactiva, un gel de fibrina puede ser creado en las condiciones fisiológicas, lo que significa en condiciones como aquellas que se encuentran en los seres humanos o animales.

Sin embargo: la formación del gel de fibrina, también puede ocurrir fuera del cuerpo, y en la presencia de trombina y calcio, dependiendo principalmente de la temperatura y del pH. El gel de fribina se puede formar fuera del cuerpo a una temperatura de entre 25ºC a 40ºC y en una variación de pH de entre 7 a 8. Si la molécula bioactiva no es soluble en estas condiciones, se precipitará durante la polimerización y se convierte para quedar atrapada en la matriz.

Como una modalidad adicional, la mayoría de las formas de fibrina están disponibles para usarse como una matriz. Los geles de fibrina se pueden sintetizar a partir del plasma autólogo, plasma crioprecipitado, (por ejemplo paquetes de goma de fibrina, los cuales están disponibles en el comercio), fibrinógeno purificado a partir de plasma, y fibrinógeno recombinante y el factor XIIIa. Cada uno de los materiales proporciona una matriz similar fundamentalmente, con una variación pequeña en las composiciones bioquimicas. Sierra DH. J Biomater Appl, 7, 309-352 (1993). Similitudes entre estos materiales existen tanto en la bioactividad enzimática específica y respuestas en general de curación.

Matrices sintéticas

Las matrices sintéticas son conocidas en la regeneración de tejidos y en la curación de las heridas. Esto incluye esponjas macroporosas de los polímeros degradables tales como el ácido poliacético y sus copolímeros así también como las matrices de hidrogel basadas en los polímeros solubles en agua tales como PEG. En una formulación preferida, el PEG se usa como un material de iniciación de base para la obtención de una matriz degadrable enzimáticamente. El PEG es funcional con los grupos reactivos químicamente tales como los grupos aceptores en la forma de los enlaces insaturados conjugados para las reaccione de adición del tipo de Michael, incluyendo los acrilatos, sulfonas de vinilo y las acrilamida. De preferencia el PEG es un PEG de cuatro ramas, de un peso molecular promedio de entre 15 a 25000 de kD.

Estos iniciadores (en solución) se mezclan con los péptidos como un segundo componente de iniciación (en solución) que contiene dos o más residuos de cisteína reducidos (grupos de tiol nucleofílicos) con los sitios del substrato de proteasa que intervienen entre estos sitios de cisteína. Bajo las condiciones básicas un gel rápidamente se forma por una reacción de adición del tipo de Michael entre el componente de multi-tiol (el péptido funcional) y el componente del multi-aceptor, (la funcionabilidad de PEG) tan largo como la suma de la funcionabilidad del multi-aceptor (número de los grupos del aceptor de Michael (m) por molécula) y la funcionabilidad del multitiol (número de los grupos de tiol (n) por moléculas es mayor que 5.

La adición de Michael entre el tiol y los grupos aceptores trabajan desde el pH 6.5 hasta las condiciones muy básicas a una variedad amplia de temperatura. Pero cuando los componentes iniciadores se inyectan en el cuerpo para una formación in situ, de la matriz, el pH debe ser el apropiado para el cuerpo y por lo tanto en una modalidad preferida el pH está entre 7 y 8.

La temperatura preferida varía entre 25ºC a 40ºC cuando el gel se forma fuera del cuerpo. Dentro del cuerpo el gel se forma a la temperatura del cuerpo. Cuando el péptido se designa para ser un substrato para plasmina o una matriz de metaloproteinasa, los geles sintéticos resultantes se degradan en respuesta a la influencia de la remodelación de la matriz enzimática de las células. El multitiol, por ejemplo el componente del iniciador nucleofílico no necesariamente tiene que ser un péptido. Si por ejemplo, la matriz no tiene que estar degradable enzimáticamente, el componente del iniciador nucleofílico, por ejemplo el mutitiol puede ser PEG también.

El gel puede además comprender los sitios de enlace de la células, similar por ejemplo a las secuencias de RGD, el enlace covalente a la matriz para ayudar al crecimiento interno y a la unión de las células en la matriz. El sitio de unión de la célula que se puede enlazar a la matriz por la reacción de adición de Michael, también. Por lo tanto, el RGD se modifica tal que contiene los grupos de tiol libres/cisteína para al reacción con el enlace insaturado conjugado.

B Moléculas Bioactivas

Las matrices pueden además ser modificadas mediante la inclusión de moléculas bioactivas, frecuentemente derivadas del desarrollo, para mejorar la regeneración del tejido de las heridas. Pandit y col., J. Biomater Appl, 14, 229-42 (2000); Hildebrand y col., Am J. Sport Med. 26, 549-54 (1998); Quirinia A. Scand J Plast Reconstr. Surg Hand Surg, 32, 9-18 (1998).

El tipo de la molécula que está atrapada puede ser una de una lista larga de las moléculas bioactivas posibles, incluyendo los factores de crecimiento, péptidos, enzimas, inhibidores de la proteasa, antibióticos, homólogos sintéticos, y otras moléculas diversas. Las moléculas bioactivas preferidas tienen estabilidad reducida a pHs fisiológicos.

Factores de Crecimiento

Los factores de crecimiento son particularmente útiles debido a que proporcionan una acción química bien caracterizada tal que ha sido mostrada para tener un papel importante en la curación de heridas, y están frecuentemente presentes de una forma natural en el sitio de la lesión. Adicionalmente, los factores de crecimiento son moléculas pluripotentes, que permiten activar la mayoría de los tipos de células diferentes e inducen una respuesta de curación complicada.

La estructura cristalina de los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de la cistína han sido informados que tienen dobleces no usuales, que desarrollan puentes de disulfuro intramolecular. En la transformación del factor-beta 2 de crecimiento, las plaquetas derivadas del factor de crecimiento (PDGF), el factor de crecimiento del nervio (NGF) y la ganodotropina corionica humana (hCG), seis cisteínas conservadas (Ia IV en el orden de secuencia), forman tres enlaces del di sulfuro dispuestos en la topología de ser semejante a un nodo. Las cisteínas [II a V] y [III a VI] forman un anillo de 8 aminoácidos a través de los cuales el enlace del di-sulfuro restante (Cys [I a IV] penetre. Esta topología difiere de la clase estructural del inhibidor similar a los nodos de la cisteína en el cual el Cys [III-IV] penetra un anillo macrocíclico formado por Cys [I-IV] y Cys [II-V].

Por lo tanto los nodos de cistína caen en dos clases estructurales: del tipo de factor de crecimiento y de los nodos de la cistína similar al inhibidor. Los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento el nodo de cistína en las plaquetas derivadas de la superfamilia del factor de crecimiento, la transformación de la superfamilia del factor de crecimiento beta (TGF\beta) y la familia de las glicoproteinas alfa.

Los ejemplos de los factores de crecimiento individuales son BMPs, PDGFs, TGFbetas. Ninguno de los factores de crecimiento están glucosilados cuando se expresan mediante células eucariotas, la TGF beta 1, 2, y 3 por ejemplo nunca son glucosilados sin tomar en cuenta el sistema de expresión usado.

Dentro de la superfamilina de TGF beta las moléculas mas comúnmente usadas para la regeneración del hueso provienen de la proteína morfogenética del hueso (BMP). Inicialmente, las BMPs se usan como una combinación de los factores de crecimiento purificados a partir del hueso. Urist y col., Proc. Natl Acad. Sci., U.S.A. 76, 1828-32 (1979). Estas mezclas son atrapadas dentro de la matriz de la fibrina y su eficacia terapéutica se mide. Esto proporciona un bosquejo del potencial terapéutico de la fibrina mezclada con BMP. Sin embargo, los efectos de cada uno de los varios factores de crecimiento presentes en la matriz no son determinados.

El BMP-2 y BMP-7 tienen ambos la afinidad de enlazamiento de heparina, que son solubles a pHs bajos y que son inductores fuertes de la curación del hueso. Wozney JM Pro'g Growth Factor Res., 1, 267-80 (1989); Wozney y col.. J. Cell Sci suppl., 13, 149-56 (1990). La rh-BMP-2 ha demostrado el potencial de curación mas fuerte y es aún adecuada para inducir la formación de hueso en un sitio ectópico. Jin y col., J. Biomed Mat. Res., 52, 841 (2000). Debido a la solubilidad de la rh-BMP-2 en condiciones fisiológicas es baja, lo que puede precipitar dentro de una matriz. Por lo tanto, esta molécula fija las características necesarias para el suministro.

La precipitación de este factor de crecimiento y por lo tanto su liberación prolongada ha sido además mejorada mediante el uso de una forma recombinante de rh-BMP-2, la cual no esta glucosilada y por lo tanto es menos soluble en la fibrina o en matrices sintéticas. También es posible mejorar la precipitación de este factor de crecimiento cuando se expresa en la forma glucosilada mediante la desglucolización enzimática o química. La homología estructural, entre los miembros de la familia BMP es elevada, por lo tanto los resultados obtenidos con rh-BMP-2 se pueden esperara que se obtengan con las otras BMPs, incluyendo BMP-7 (OP-1). Superfamlia TGFbeta.

Las BMPs son por si mismos miembros de la transformación de la superfamilia del factor de crecimiento beta, y la homología estructural entre los miembros de la superfamilia de TGBP que es también elevada. Tales resultados, obtenidos con BMP-2 se pueden esperar para que se obtenga con otros miembros de la superfamilia de TGB\beta y miembros de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de la cistína. La precipitación de los factores de crecimiento que son miembros de la superfamilia y su liberación prolongada es además mejorada mediante el uso de las formas recombinantes que no están glucosilados y por lo tanto son menos solubles.

BMPs desglucosiladas

Las versiones desglucosiladas de BMP y de otros factores de crecimiento se pueden obtener usando un determinado número de técnicas. Varios métodos de desglucólisis se encuentran disponibles en la práctica común, tanto de una manera química como biológica. Un método químico ocurre a través del uso de fluoruro de hidrógeno. Brevemente las proteínas glucosiladas se mezclan con fluoruro de polihidrógeno, piridina y un antioxidante y esto conduce a completar esencialmente la desglucolización sin la modificación de la proteína misma. El centro de los métodos biológicos alrededor del uso de las enzimas para dividir los glucoaminoglicanos a partir de la proteína o de la expresión en bacterias. Dos ejemplos son N-glicanasa (Lin, Zhang y col, J Neurochem 63, 758-768 (1994) o grupo peptidasa F (Chen y Gonatas Biochem BiopHys Res Común, 234, 68-72 (1997) que pueden ser usadas para las proteínas de desglucosiladas. Estos ejemplos son solamente ilustrativos de los métodos biológicos y químicos que se pueden usar para obtener una proteína desglucosilada a partir de una fuente eucariota (es decir glucosilada) y no son una lista completa de todos los métodos posibles. Usando estas técnicas estándar la solubilidad de la rh-BMP-2 glucosilada se puede obtener lo semejante a tal rh-BMP-2 no glucosilada. Además se pueden usar los excipientes para reducir la solubilidad de las proteínas por ejemplo polímeros de carga opuesta para reducir la carga total de la proteína.

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II Métodos de Incorporación de Moléculas Bioactivas dentro de la matriz

Los dos métodos principales para el suministro de los factores bioactivos son a través de los métodos bioquímicos y físicos. En los métodos bioquímicos las matrices se obtienen para tener una afinidad química con el factor bioactivo de interés cuando la matriz se mezcla con la molécula bioactiva, la liberación de la molécula puede ser eliminada. El método físico el cuál se puede usar para retener las moléculas bioactivas en la matriz incluyen, precipitación, co-precipitación, precipitación de afinidad, e inclusión física. Por ejemplo en una modalidad, las moléculas bioactivas se precipitan dentro de una matriz de fibrina para mejorar la retención. Esta matriz la cuál contiene las moléculas precipitadas tiene un potencial significativo para la curación de las heridas.

A. Precipitación y modificación química de la matriz

La precipitación se puede combinar con otros métodos de retención para producir biomateriales los cuáles mejoran la curación de heridas. Un ejemplo es el uso de biomateriales modificados, los cuales contienen sitios con afinidad de enlazamiento para las moléculas bioactivas. La molécula bioactiva se enlaza a la matriz mejorando la retención de la molécula bioactiva en la matriz. Por ejemplo una matriz se puede modificar para incluir los sitios enlazamiento con afinidad de la heparina y la heparina se puede adicionar para mezclarse con la matriz. Luego si la molécula bioactiva tiene afinidad de enlazamiento de heparina, la molécula bioactiva se enlazará con la heparina y por lo tanto esta retenida en la matriz. Este método puede ser realizado en conjunción con el uso de precipitación para sustancias cinéticas de liberación más lenta.

En una modalidad la retención de rh-BMP-2 se mejora mediante el enlazamiento a la heparina la cuál se enlaza a una matriz de fibrina modificada. Por lo tanto la rh-BMP-2 desglucosilada se retiene en la matriz, debido a que se precipita dentro de la matriz ya que su solubilidad pobre y enlazamiento en la heparina se debe a su afinidad de enlazamiento de la heparina.

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III. Métodos de uso de las matrices para mejorar la curación de las heridas A. Tipos de pacientes que necesitan de la composición

Estas matrices proporcionan un rango amplio de pacientes con terapias para la curación de defectos óseos. En una modalidad las matrices sintéticas o de fibrina modificada sirven como reemplazamiento de injertos de hueso, y por lo tanto se puede aplicar en la mayoría de las mismas indicaciones. Estas indicaciones incluyen pero no se limitan a la estructura de unión de la columna vertebral, curación de los defectos sin unión incremento del hueso y regeneración dental. Adicionalmente en otra modalidad estas matrices se pueden usar en la integración de implantes. En, la integración de implantes, los implantes se pueden revestir con una matriz modificada ya sea natural o sintética induciendo el área del hueso cercana para crecer en la superficie del implante y prevenir el relajamiento y otros problemas asociados. Estos ejemplos son solamente ilustrativos y no limitan el número de indicaciones posibles, para que las matrices descritas en la presente se puedan usar. En otra modalidad las matrices enriquecidas del factor de crecimiento se pueden usar para la curación de heridas crónicas en la piel.

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B. Métodos de administración

En una modalidad, el material se aplica al área de la herida como una matriz preformada. En una segunda modalidad el material se hace gel in situ en el cuerpo. En ambas de estas modalidades, el material de la matriz se puede obtener a partir de los componentes iniciadores sintéticos o naturales. Sin salirse de lo indicado y respectivamente de la clase del componente iniciador usado se tiene que evitar que los componentes iniciadores se combinen o que estén en contacto uno con el otro bajo condiciones que permitan la polimerización de los componentes antes de la aplicación de la mezcla al cuerpo. En sentido general esto es por ejemplo lograr mediante un sistema que comprende al menos una primera y segunda composición separada una de la otra en donde la primera y segunda composición comprende componentes que forman una red tridimensional después de que se mezclan bajo condiciones que permiten la polimerización de los componentes. Adicionalmente el sistema comprende una molécula activa biológica que se selecciona de los miembros desglucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína en al menos una de las composiciones. Dependiendo de los componentes iniciadores y su concentración de la formación de gel puede hacerse casi instantáneamente después del mezclado, lo que hace la inyección por ejemplo la compresión del material en forma de gel a través de la aguja de inyección casi imposible.

En una modalidad la matriz se forma del fibrinógeno. El fibrinógeno a través de una serie de varios geles de reacción a una matriz cuando están en contacto con la trombina y la fuente de calcio a temperatura y pH apropiados. Para el almacenaje es necesario no permitir que los tres componentes entren en contacto. En este tiempo al menos una de las tres partes se mantiene separada en cualquier otra combinación de los tres componentes sea factible.

En una primera modalidad el fibrinógeno se disuelve (el cual puede contener adicionalmente aprotinina para aumentar la estabilidad) en una solución reguladora a pH fisiológico (en una escala de pH de 6.5 a 8.0 preferiblemente de 7.0 a 7.5) y se almacena por separado a partir de una solución de trombina en una solución reguladora de cloruro de calcio (rango de concentración de 40 a 50 mM) la solución reguladora para el fibrinógeno puede ser una solución reguladora de histidina a una concentración preferida de 50 mM que comprende adicionalmente NaCl a una concentración preferida de 150 mM de la solución salina reguladora de TRIS (preferiblemente a una concentración de 33 mM) la molécula bioactiva puede estar presente en ya sea en el fibrinógeno o la solución de trombina. En una modalidad preferida la soluciones del fibrinógeno contienen la molécula bioactiva. El fibrinógeno y las soluciones de trombina Se pueden adicionalmente almacenar congeladas para mejorar Su estabilidad de almacenamiento. Anterior al uso de la parte del fibrinógeno y de la parte de la trombina son descongeladas (cuando es necesario) y mezcladas. En otro sistema de fibrinógeno y trombina se pueden almacenar por separado de la fuente de calcio. En aún otra modalidad el fibrinógeno se puede almacenar con la fuente de calcio separada de la trombina.

En otra modalidad preferida tanto el fibrinógeno como la trombina son almacenadas por separado en forma liofilizada. Ya sea que uno de los dos pueda contener la molécula bioactiva. Antes de que se use la solución reguladora de TRIS o de histidina se adiciona al fibrinógeno la solución reguladora que puede contener adicionalmente aprotinina. La trombina liofilizada se disuelve en la solución de cloruro de calcio. Después las soluciones de fibrinógeno y de trombina se mezclan, otra vez de preferencia mediante la combinación de los recipientes/viales/jeringas que comprenden las soluciones mediante un dispositivo de conexión de vía doble que tiene una aguja que se une a uno de sus lados. Es muy conveniente si los viales son divididos que tengan dos cámaras separadas mediante una división ajustable a la pared del cuerpo de la jeringa.

Una de las cámaras puede contener fibrinógeno liofilizado, la otra cámara contiene una solución reguladora apropiada. Si se aplica presión a uno de los extremos del cuerpo de la jeringa, la división se mueve y libera las burbujas en la pared de la jeringa con el fin de que la solución reguladora pueda flotar en la cámara del fibrinógeno y disolver el fibrinógeno. Un cuerpo de la jeringa bi dividido se usa para almacenar y disolver la trombina de la misma manera. Si ambas, la trombina como el fibrinógeno se disuelven, ambos cuerpos de la jeringa bi dividida se unen a los dos dispositivos de conexión y los contenidos se mezclan mediante la compresión a través de la aguja de la inyección que se une al dispositivo de conexión. El dispositivo de conexión adicionalmente puede comprender un mezclador estático para mejorar el mezclado de los contenidos.

En una modalidad preferido el fibrinógeno se diluye 8 veces y la trombina se diluye 20 veces antes de mezclarse. Los resultados de la proporción en el tiempo de la formación de gel es de aproximadamente de 1 minuto.

En otro aspecto preferido, la matriz se forma a partir de los componentes iniciadores sintéticos capaces de producir la reacción de adicción de Michael. Algunos de los componentes iniciadores nucleofílicos (el multitiol) solo reacciona. con el componente del multiaceptor (el grupo insaturado conjugado) a PH básico, los 3 componentes tienen que ser mantenidos por separado antes del mezclado de la base, el componente nucleofílico y el componente multiaceptor. Tanto el componente multiaceptor y del multitiol son almacenados como una solución en una solución reguladora.

Ambas composiciones pueden comprender el sitio de unión de la célula y adicionalmente la molécula bioactiva. Por lo tanto la primera composición del sistema puede por ejemplo comprender la solución del componente nucleofílico y la segunda composición del sistema puede comprender la solución del componente multiaceptor.

Ya sea que los dos componentes puedan comprender la base o la base que puede estar presente en ambas composiciones. En otra modalidad el multiaceptor y el multitiol pueden estar comprendidas como la solución en la primera composición y la segunda composición puede comprender la base. La conexión y el mezclado ocurre de la misma manera como se ha descrito anteriormente para el fibrinógeno. Además el cuerpo de la jeringa bi dividida es adecuada igualmente para los componentes iniciadores sintéticos. En lugar del fibrinógeno y la trombina los componentes del multitiol y del multiaceptor son almacenados en forma pulverizada en una de las cámaras y la otra cámara contiene la solución reguladora básica.

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C. Dosificación

Las matrices contienen típicamente una dosis de 0.01 a 5 mg/ml de la molécula bioactiva. Esta variación de la dosis esta de acuerdo con las cantidades de la proteína activa usada en otros ensayos clínicos. Sin embargo dosis más bajas también se pueden usar debido al suministro mejorado que las matrices proporcionan. Por ejemplo cuando la rh-BMPL-2 no glucosilada se usa en la curación de los defectos cranianos sin unión en ratas, dosis muy bajas de 1-10 \mug/ml son efectivos. Como tal cuando se usa los factores de crecimiento precipitados y ventajosos especialmente se obtienen formas, tales formas no glucosiladas, reducciones significativas en la dosis son posibles. Por lo tanto la proteína en menor cantidad es necesario para proporcionar el mismo resultado.

El tiempo de suministro de la molécula bioactiva está dentro de varias semanas de administración. Dentro de 2 a 4 semanas es similar que la matriz original ha sido remodelada completamente y todas las moléculas bioactivas han sido liberadas. La presente invención se puede entender además por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

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Ejemplo 1 Determinación de la incorporación en geles de fibrina

Una prueba mide la actividad enzimática nativa de la enzima de coagulación y del factor XIIIa. Esta prueba se realiza mediante la medición de la habilidad del gel de fibrina a partir de dos diferentes fuentes para incorporar covalentemente un substrato sintético durante el procedimiento de coagulación. Una fuente del gel de fibrina proviene de un equipo de goma de fibrina, mientras la segunda fuente proviene de un gel de fibrina purificado. Los péptidos derivados del inhibidor \alpha2-plasmina que puede incorporarse covalentemente en los geles de fibrina a través de la acción del factor XIIIa.

Por lo tanto un método para probar la actividad enzimática en un gel de fibrina o dilución del mismo comprende la prueba de la habilidad de las diferentes fuentes de fibrina para incorporar este mismo péptido. Los geles son sintetizados con varias cantidades de péptido marcado de fluorcentilo y se lava con PBS (0.03 m, pH 7.4) para eliminar el péptido libre de la matriz. Los geles son luego degradados con una cantidad mínima de plasmina necesaria y analizada con cromatografía de exclusión de cantidad. La cantidad de la señal fluorescente (por ejemplo péptido) enlaza a la matriz que se determino cuando varias diluciones de los paquetes de goma de fibrina o de los geles de fibrina purificados son empleados. Este resultado se correlaciona a la cantidad de la actividad entrelazada presente en la matriz.

Las figuras 1A y 1B describen los resultados de esta prueba. Los resultados de esta prueba demuestran que cuando las concentraciones similares de la fibrina son ensayadas, la cantidad de incorporación es similar. Por ejemplo la actividad enzimática bioquímica en un paquete de goma de fibrina (figura 1A) proporciona ser similar a la del gel de fibrina purificado (figura 1B). Sin embargo las concentraciones de proteína más elevadas y el (factor XIIIa) conducen a cantidades de incorporación más elevadas.

Ejemplo 2 Comparación in vivo de geles de fibrina a partir de fuentes diferentes

Una forma recombinante no glucosilada de una proteína morfogéntica ósea, la cuál se prepara a partir de células procariotas (E. coli), (rh-BMP-2) se mezclan en geles de fibrina diferentes, y los geles se prueban en un defecto de fémur de ratón. Debido a que la proteína se expresa en un sistema procáriota no esta glucosilado. Los geles de fibrina son sintetizados desde una variedad de fuentes. El fibrinógeno purificado de Sigma Chemical, y un banco sanguíneo son empleados así como también gomas de fibrina (Baxter) a varias diluciones. Estos geles son cargados con rh-BMP-2-y colocados en un defecto de fémur de cantidad crítica (espesor total de 5 mm).

Se observa que todas las diluciones de la goma de fibrina empleadas en la fibrina de Sigma dan una respuesta de curación similar conduciendo a un puente de cada efecto de cantidad crítica. La fibrina del banco de sangre da una respuesta total inferior, la cuál es más similar debido a las propiedades de infiltración celular que a la retención de rh-BMP-2 (datos sin publicar). Por lo tanto mientras la cantidad de curación varía la capacidad de varias matrices para retener rh-BMP-2 no dependen de la matriz de fibrina exacta empleada.

Ejemplo 3 Comparación de Retención de las Moléculas Bioactivas Solubles e Insolubles en una Matriz de Fibrina

Este ensayo in vitro comprende la comparación de las substancias cinéticas liberadas del rh-BMP-2 no glucosilada atrapada para la liberación de las substancias cinéticas que se conocen que tienen una elevada solubilidad a pH fisiológico. Los geles de fibrina son polimerizados usando el fibrinógeno purificado (Sigma) a 8 mg/ml y 2 U/ml, trombina a pH 7.4. El calcio se le adiciona de manera que la concentración final es de 2.5 mM para aumentar la proporción de la acción del gel.

Estos geles son sintetizados con una molécula bioactiva presente durante el proceso de coagulación y la retención de la molécula dentro de la matriz de fibrina que se determina. Los geles se lavan y se mantienen en la solución salina reguladora de fosfato (PBS 0.01 M, pH 7.4) a 37ºC y el lavado se cambia cada 12 horas. Después del lavado los geles son degradados con 0.05 unidades de plasmina. La cantidad de cada una de las moléculas bioactivas presentes en los lavados y en la matriz degradada se determinan.

En la primera prueba la retención de la heparina marcada FITC, una molécula altamente soluble se prueba. La cantidad de fluorescencia en los lavados y en los geles degradados son analizados mediante espectroscopia fluorescente, y el porcentaje de heparina liberada en cada uno de los volúmenes de lavado se determina. Los geles de fibrina contienen una secuencia de enlazamiento de heparina natural, por lo tanto se espera que exista alguna retención de heparina dentro de la matriz. La espectroscopia fluorescente revela que la liberación de heparina de la matriz es eliminada en relación a la eliminación regulada de difusión (ver figura 2). Lo que es similarmente a que esta eliminación se deba al sitio de enlazamiento de heparina en la fibrina. Sin embargo mucho de la heparina se difunde fuera de la matriz, con esencialmente con toda la heparina liberada de la matriz (ver figura 2).

En la segunda prueba la rh-MBP-2 no glucosilada, una molécula con baja solubilidad a pH 7.4 se introduce en la matriz de fibrina durante la polimerización. El perfil de liberación para rh-BPM-2 demuestra que el rh-BMP-2 se libera de la matriz más lentamente que la heparina marcada FITC. Además aproximadamente 80% de la dosis inicial permanece precipitada dentro de la matriz al complementar la prueba (ver figura 2).

Una variación de las concentraciones de rh-BMP-2 no glucosilada inicial es probada a partir de 10 a 200 \mug/ml. Lo que se puede ver que entre 60 y 80% de la rh-BMP-2 permanece en el gel a un después de 50 lavadas (figura 3a). No existe una concentración notable dependiente de la retención de rh-BMP-2 con cantidades elevadas retenidas en todas las concentraciones relevantes empleadas. Claramente esta precipitación efectúa trabajos a concentraciones múltiples del factor de crecimiento.

Este resultado se debe a la solubilidad baja de la rh-BMP-2 no glucosilada a pH 7.4 lo cual origina una cantidad significativa de la rh-BMP-2 para precipitarse dentro de la matriz.

Por lo tanto un mecanismo físico tal como precipitación se puede usar para incluir las moléculas bioactivas dentro de las matrices de fibrina.

Con el fin de probar el mecanismo para la retención elevada de la rh-BPM-2 no glucosilada, la retención de las especies solubles más elevadas de la rh-BMP-2 se estudian. Un método posible para mejorar la solubilidad de la rh-BMP-2 es enlazarla con un polisacárido altamente soluble esto ha sido demostrado previamente con heparina en donde se tiene que la estabilidad de las proteínas en solución se pueden mejorar cuando electrostaticamente se enlazan a la heparina (Pineda-Lucena, Jiménez y col. J. Mol Biol, 64, 162-178) (1996)). Alternativamente el polisacárido puede estar covalentemente enlazado directamente a la proteína mediante el uso natural (Rajan, Tsabopoulos y col Biochem Biophys Res Commun. 206, 694-702 (1995)) o sintéticamente (Tams, 'Vind y col. Biochem Biophys Acta, 1432, 214-221 (1999)) versiones glucosiladas. Si la solubilidad baja de la rh-BMP-2 es lo que origina para su retención elevada, luego ambas de estas formulaciones tendrán una retención más baja correspondientemente.

Cuando la heparina se premezcla con rh-BMP-2 en una proporción molar 1:1, la retención de rh-BMP-2 se demuestra ser mucho más baja, con solamente 20% siendo retenido dentro matriz fibrina (p<0.05). Esto se prueba además mediante la medición de la liberación de la rh-BMP-2 glucosilada derivada de las células CHO. Cuando la retención de esta rh-BMP-2 se ensaya, la liberación es muy alta, con solamente 30% restante dentro del gel (figura 3b). Una cantidad que no es estadísticamente diferente del resultado obtenido con la mezcla de la rh-BMP-2 procariota con heparina (figura 3a). Basados en estos resultados es similar que el mecanismo por el cuál la rh-BMP-2 procariota se retenga en tales cantidades elevadas que esta a través de la precipitación en la matriz. Por lo tanto estos resultados demuestran la naturaleza ventajosa de rh-BMP-2 no glucosilada dentro de las matrices, tal como las matrices de fibrina en la iniciación de la curación.

Los resultados del ejemplo 3 demuestran el uso muy ventajoso de la rh-BMP-2 glucosilada en la regeneración ósea en matrices de fibrina. LA rh-BMP-2 no glucosilada similarmente será ventajosa para la regeneración del hueso, así también como otros tejidos matrices diferentes fibrina. Además los resultados de este ejemplo se pueden extender por similitud estructural a otros miembros de la familia BMP y la misma similitud estructural a otros miembros de la superfamilia TGF\beta incluyendo TGF\beta1, TGF\beta2, TGF\beta3, y otros miembros numerosos de la superfamilia TGF\beta. Además estos resultados se pueden extender a otras situaciones de curación de heridas incluyendo la curación de heridas crónicas en el diabético en el paciente de insuficiencia venosas y la úlcera de presión. En esto y esencialmente todas las situaciones en la iniciación de la curación y regeneración bajo la influencia estimulada de un factor de crecimiento, la presencia prolongada del factor de crecimiento en una regeneración de matriz es deseable. Como tal los miembros no glucosilados de la superfamilia TGF\beta son ampliamente útiles en la iniciación de la regeneración de tejido y curación de las heridas.

Los ejemplos 4 y 5 describen las pruebas in vivo, en las cuales la bioactividad de la rh-BMP-2 desglucosilada precipitada se examina. Los ensayos in vivo, comprenden el uso de matrices con rh-BMP-2 incluida en los defectos óseos de dimensión crítica en la rata. Estos defectos no Se sanan espontáneamente sobre sí mismos. Por lo tanto estos modelos muestran uno para determinar el potencial osteogenico de un tratamiento particular debido al antecedente de curación que es muy bajo. Schmitz JP, Clin Orthop 1986, 205, 299-308. En la presente tanto el modelo de hueso largo (5 mm del defecto del Fémur en segmentos total) (ejemplo 4) y un modelo craniano (defecto 8 mm) (ejemplo 5) se emplean. En cada modelo el potencial de curación de una matriz de fibrina con rh-BMP-2 incluida se compara al de una matriz de fibrina que no tiene rh-BMP-2.

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Ejemplo 4 Curación in vivo de una defecto de fémur crítico en un ratón

Los geles de fibrina son polimerizados usando fibrinógeno purificado (Sigma) a 8 mg/mL y 2 UmL de trombina a pH 7.4. Algunos de estos geles incluyen rh-BMP-2 procariota mezclado en la solución antes de la acción de gel. El calcio se le adiciona para mejorar la variación de la formación de gel. Los defectos del espesor total de 5 mm se forman en un fémur de ratón y se forman y se llenan con matrices de fibrina. Algunas matrices contienen rh-BMP-2 desglucosilada mientras que otras no lo contienen. Para las matrices con rh-BMP-2, tres cantidades diferentes de rh-BMP-2 se ensayan (2 \mug, 5 \mug, y 10 \mug). La cantidad del hueso regenerado dentro del defecto se mide a las cuatro semanas para determinar la eficacia de la rh-BMP-2 precipitada en la regeneración ósea y se compara a los resultados de los geles de fibrina los cuáles carecen de rh-BMP-2.

Cuando los geles de fibrina carecen de rh-BMP-2 son extraídos y probados a las cuatro semanas el nivel del hueso calcificado nuevo dentro del margen del defecto que es muy bajo. En lugar del defecto se conecta con el tejido fibroso que resulta en la curación no funcional. Ninguno de los defectos que se llenaron con la matriz base demuestran curación completa.

A cuatro semanas los geles de fibrina con ya sea con 2, 5 o 10 \mug de rh-BMP-2 se adiciona a la mezcla de polimerización que ha sido extraída y probada. Cada uno de los animales que recibe ya sea 5 o 10 \mug de rh-BMP-2 en la curación completa que exhibe el defecto, con el defecto original que se llena con hueso calcificado y con la médula espinal y el espacio completo Se conecta con el tejido calcificado. Los animales que recibieron materiales con 2 \mug de rh-BMP-2 en el defecto curado muy bien con 69% del área del defecto original se llena con el hueso curado maduro, el porcentaje promedio del área del defecto del hueso se llena con hueso calcificado como se muestra en la Tabla 1, en cada ejemplo no existe signo de inflamación o cicatrización al lado de la curación.

TABLA 1 Por ciento del tejido calcificado en los defectos del fémur curado

1

Ejemplo 5 Curación del defecto craniano crítico in vivo

Se trabaja in vivo con matrices de fibrina. Los geles de fibrina se polimerizan usando fibrinógeno purificado (Sigma) a 8 mg/mL y 2 U/mL, trombina a pH 7.4. Algunos de los geles incluyen rh-BMP-2 procariota mezclada en una solución antes de la formación del gel. Se le adiciona calcio para mejorar la variación de la formación de gel.

Los defectos de 8 mm son formados en el cráneo del ratón y se llenan ya sea con un gel de fibrina o un gel de fibrina con el precipitado interno de rh-BMP-2. Para las matrices con rh-BMP-2 desglucosiladas, tres diferentes cantidades de rh-BMP-2 se prueban (1 \mug, 5 \mug y 20 \mug). La cantidad del hueso regenerado dentro del defecto se mide a las tres semanas para determinar la eficacia de la rh-BMP-2 precipitada en la regeneración del hueso y se comparan a los resultados cuando los geles de fibrina son sintetizados sin que este presente rh-BMP-2.

A las tres semanas los geles de fibrina que carecen de rh-BMP-2 son extraídos y probados. La cantidad del hueso herido nuevo dentro del margen de defecto es muy baja. La cantidad del hueso herido nuevo dentro del defecto se mide aproximadamente 13% del área del defecto original. Ninguna de las matrices conducen a una curación completa del defecto y la mayoría del defecto estando a un lleno con el tejido fibroso.

Los geles de fibrina los cuáles contienen rh-BMP- 2 desglucosilada, contienen ya sea 1.5 ó 20 \mug de rh-BMP-2 adicionada a la mezcla de polimerización. Estos materiales son extraídos y probados a las tres semanas. Todos los defectos tratados con 20 \mug de la rh-BMP-2 precipitada se llenan completamente con el hueso herido y con la médula espinal. Los defectos con 5 \mug de rh-BMP-2 (III) tienen curación cercanamente completa con 90% del área del defecto original que se llena con el tejido calcificado. Los defectos con 1 \mug de rh-BMP-2 (I) muestran curación muy buena como con el 73% del área del defecto que se llena con el hueso herido nuevo. La cantidad promedio del área del defecto que se llena con el tejido calcificado se muestra en la Tabla 2 y en la figura 4A. De la Tabla 2 una respuesta de la dependencia de la dosis se muestra, con concentraciones más elevadas de la rh-BMP-2 precipitada que conduce a resultados de curación mejores. Finalmente en cada una de las muestras no existe signo de inflamación o cicatrización en el sitio de curación o sobre la membrana que envuelve al cerebro.

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TABLA 2 Porcentaje de tejido calcificado en defectos craneales curados

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Las dos formas de rh-BMP-2 que tienen mayor solubilidad son probadas y estas tienen respuestas de curación significativamente inferiores. Cuando 1 \mug de rh-BMP-2 no glucosilada se premezcla con una cantidad equimolar de heparina (VII) y se adiciona antes de la polimerización de un gel de fibrina, el nivel de curación cae hasta 50%, estadísticamente más bajo que la curación equivalente con 1 \mug de rh-BMP-2 sola (II; 73%) (p<0.05) este resultado no se puede atribuir al efecto de la heparina sola debido a que la fibrina con la heparina premezclada dentro de la matriz proporciona una respuesta de curación similar a la de la fibrina sola (ver las primeras dos columnas de la figura 4B)
(I y V) similarmente cuando la rh-BMP-2 glucosilado se usa una respuesta de curación más baja se logra (VIII). La rh-BMP-2 glucosilada tiene una actividad específica mucho más elevada que rh-BMP-2 no glucosilada debido a la mejor dimerisación por varias veces y muchos otros factores. Sin embargo cuando una dosis molar equivalente (1 \mug) de rh-BMP-2 glucosilada se emplea la respuesta de curación es solamente 44% del defecto lleno con tejido calcificado, en comparación al resultado del 73% obtenido con rh-BMP-2 no glucosilada (figura 4B).

Como se espera, usando una matriz de fibrina plana en la ausencia de cualquier molécula bioactiva para curar un defecto de dimensión crítica conduce a una respuesta de curación muy pobre con tejido calcificado pequeño en ya sea el modelo craneano o de fémur. Este antecedente de curación muy bajo con la matriz de control demuestra que la respuesta de curación fuerte resulta cuando la rh-BMP-2 se precipita dentro de la matriz que representa una habilidad de curación terapéutica fuerte en el tejido óseo. Por lo tanto los procedimientos físicos tales como precipitación, especialmente a través del uso del factor de crecimiento de la superfamilia TGF\beta no glucosilado proporciona una herramienta clave para el desarrollo de matrices terapéuticas para la curación de heridas.

Trabajo in vivo con matrices sintéticas

Las matrices sintéticas degradables enzimáticamente se prueban en el mismo modelo del defecto craniano como las matrices de fibrina descritas anteriormente. Los geles sintéticos se forman mediante la reacción de una vinilsulfona de PEG de cuatro ramificaciones que tienen un peso molecular promedio de 20000D con péptidos lineales de entrelazado que contienen cisteinas múltiples (por ejemplo GCRPQGIWGQDRC) a pH 7.5. El PEG se disuelve en una solución reguladora de TEOA (0.3 M, pH 8.0) con lo cuál se proporciona una solución al 10% (p/p).

El péptido se disuelve en la misma solución reguladora. Los tiolatos que están presentes reaccionan con la fracción insaturada proporcionando un hidrogel de extremo entrelazado. Mediante la incorporación de las secuencias de degradación entre las dos císteinas que son específicamente sensibles a ya sea el plásmido o colagenasa, un substituto sintético para la fibrina Y el colágeno (respectivamente) se pueden formar. A través de la adición de señales de adhesión, usualmente los péptidos RGD, estos geles pueden servir como una matriz de infiltración celular y una matriz de suministro para las moléculas bioactivas.

Los geles sintéticos que se han descrito anteriormente se forman con 5 \mug de rh-BMP-2 desglucosilada precipitada en la matriz y colocada dentro del defecto craniano de la rata de dimensión crítica de 8 mm. Estos son extraídos después de una tres y cinco semanas. Ningún signo de inflamación o tejido cicatrizado se observan. Además la variación de curación es de 80% después de 5 semanas, indicando que estas matrices sintéticas sirven como matrices adecuadas para la precipitación de la rh-BMP-2 y actúa como matrices de curación.

Trabajo in vivo con matrices de colágeno

Esponjas de colágeno absorbibles clínicamente disponibles (Integra Lifesciences), se obtienen y se cortan en la forma apropiada para el defecto craniano de dimensión crítica del ratón. Con el fin de preparar estos para la implantación, estas esponjas son luego lavadas en una solución que contiene 5 \mug del BMP-2 no glucosilada.

Los defectos de 8 mm son formados en el cráneo de ratón y una esponja de colágeno con rh-BMP-2 incluida se coloca dentro del defecto. La cantidad del hueso regenerado dentro del defecto en ambas 3 y 5 semanas se miden radiográficamente para determinar la eficacia de la rh-BMP-2 precipitada en la regeneración del hueso.

Cuando las esponjas de colágeno que contienen 5 \mug de rh-BMP-2 son extraídas no existe indicación de una reacción adversa al material implantado en cada muestra no hay signo de inflamación o de cicatrización al lado de la curación o sobre la membrana que cubre al cerebro. Un total de 7 muestras se prueban con tres pruebas a las tres semanas y 4 a las 5 semanas. Cuando las muestras son extraídas a las tres semanas, cada uno de los defectos se llena completamente con tejido calcificado. Después de 5 semanas, un resultado similar se observa en donde radiográficamente, 94% del defecto se llena con hueso herido. Claramente luego, la adición de una BMP-2 no glucosilada en una matriz de colágeno proporciona curación excelente. Esto demuestra que la retención del BMP-2 dentro de una matriz mediante la utilización de una forma no glucosilada es también funcional en las esponjas de colágeno.

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Ejemplo 6 Curación en la Artrodesis Pancarpal canino

Los componentes para los geles son preparados tal que la concentración final obtenida es de 8 mg/ml de fibrinógeno, 2.5 mM de Ca^{++}, 10 Unidades de NIH/ml de trombina y 600 \mug de rh-BMP-2/ml de gel no glucosilado. La acción de la formación de gel empieza después del mezclado y de la inyección de los componentes en el sitio de la fractura. El tiempo de formación de gel es de 30-60 segundos, la contaminación de los componentes con cantidades pequeñas de sangre en la herida no influyen las propiedades de la formación de gel.

Diez casos consecutivos de perros con dueño requieren de una Panartrodesis Carpal después de un trauma de la operación en Small Animal Clinic of University of Berne. La técnica estándar de la aplicación dorsal se logra en todos los perros. Después de cortar adecuadamente la articulación del cartílago, una placa del tamaño adecuado se fija con tornillos usando la técnica AO. El campo de operación luego se limpia con solución de NaCl fisiológica y la solución de fibrina/ng-rhBMP-2 inyectada en los espacios del hueso (10-40 \mug de ngly-rhBMP-2/kg de peso de cuerpo). La acción de la formación de gel se hace de 30 a 60 segundos para estar completa. La herida se cierra rutinariamente usando material de sutura absorbible.

Un perro (de 10 perros) que sufren de la lesión Carpal bilateral después de una caída. Sobre ambos carpos, una Panartrodesis se realiza mediante el mismo cirujano el mismo día y al final del procedimiento los carpos son seleccionados aleatoriamente para recibir un autotransplante esponjoso o fibrina/rh-BMP-2. Mientras este caso no será incluido en el análisis estadístico debido a la lesión bilateral proporciona una comparación interna directa entre el auto injerto y la fibrina (rh-BMP-2).

Después de las radiografías post operatorias un entablillado protector se adapta. La limitación de la carrera libre y el control del vendaje similar se recomiendan por 6 semanas según se realice en el grupo de control. Las radiografías de control estándar se hacen a las 4, 8 y 12 semanas después de la operación. Los perros son clínicamente examinados al mismo tiempo en los puntos de su forma de andar que es evaluada. La mejoría ósea radiográfica se juzga usando un sistema de medición mediante un radiólogo certificado independiente y los resultados se comparan a un grupo de control de 17 perros los cuales son operados con la misma técnica pero usando un auto injerto esponjoso.

Sistema de valoración: 0 = a tejido no mineralizado en el espacio de la articulación visible, 1 = a tejido mineralizado en el espacio de la articulación, 3 = a unión ósea remodelada con placa subcondral ausente.

Ningún perro muestra signos sistemicos o locales de reacciones adversas al fármaco y las operaciones de las heridas consistentemente se sanan sin ningún problema.

Solo complicaciones menores ocurren en algunos pacientes relacionados al entablillado (heridas de presión pequeñas) las cuales se manejan mediante el cambio del vendaje y la limpieza de la piel irritada.

La valoración de curación radiológica promedio es en todos los puntos (4, 8, 12 semanas) mayores en el grupo (ngly)-rhBMP-2 no glucosilado que en el grupo esponjoso (p_{4 \ semanas} = 0.0063, p_{8 \ semanas} = 0.115, p_{12 \ semanas} = 0.268 (Figura 5).

A las 12 semanas después de la operación el 59% del grupo esponjoso alcanza una valoración elevada de 2 o mayor en todas las articulaciones (la cantidad estándar indica el mejoramiento clínico) con lo cual el 87.5 del grupo (ngly)-rhBMP-2 alcanza tal valoración.

El perro 10 con la panartrodesis bilateral tiene un periodo post operativo sin complicaciones. La primera radiografía de control después de 4 semanas no muestra ninguna diferencia visible en el gel es de 30-60 segundos, la contaminación de los componentes con cantidades pequeñas de sangre en la herida no tiene ninguna influencia en las propiedades de la formación de gel.

5 casos consecutivos de las fracturas sin uniones en los gatos de pelo corto, 3 machos y 2 hembras con edad promedio de 3.4 años (2 a 10 años) son tratados en Veterinary Teaching Hospital of the University of Berne. Cada uno de los pacientes tiene una desunión atrópica, que muestra ningún progreso en la curación por un tiempo mínimo de 3 meses antes de que se trate con rhBMP-2. La fijación principal de las fracturas se proporciona mediante un dispositivo de fijación externo en el gato números 1-4 y en el gato sujeto número 5. En el gato número 1-3 y el 5 el dispositivo de fijación principal es inestable, y una placa se aplica para ganar estabilidad. En la misma operación el rhBMP-2 se inserta al sitio de la fractura. En el gato número 4, el dispositivo de fijación externo no presenta signos de relajamiento y el rhBMP-2 se inserta a través de una incisión de corte al espacio de fractura (tabla 3). Dos meses después de la aplicación del rhBMP-2, la placa se suelta en el gato número 3 debido a que se cae. La placa se elimina y 300 \mug del rhBMP-2 en fibrina se inserta en un segundo tiempo al área de la fractura. Un molde se adiciona y después de 6 semanas un sujeción se inserta para proporcionar estabilidad. En el gato número 5 una placa pequeña se coloca en el aspecto lateral del hueso del metacarpo (Mc) 5 para estabilizar las fracturas junto con el Mc2 intacto. A través de una investigación pequeña a las fracturas de Mc4 y 4, la fibrina con 300 \mug del rhBMP-2 se inyecta.

Varias radiografías de control se toman en todos los casos durante los meses siguientes al tratamiento con fibrina y rhBMP-2.

Ningún gato muestra signos sistémicos o locales de reacciones adversas al fármaco, la operación de curación de las heridas son exitosas.

TABLA 3 Curación en el felino sin unión

3

En el gato número 1, 4 semanas después del tratamiento el tejido calcificado nuevo es visible en las radiografías en el área de la fractura. 4 meses después de la aplicación del rhBMP-2 la fractura se curó y el gato no mostró ninguna cojera.

En el gato número 2, el espacio de la fractura después de la colocación de la placa pequeña T es pequeña, y 6 semanas después del tratamiento con rhBMP-2, la fractura se une con excelente función a su extremidad.

El gato número 3 sufre de una fractura de tibia muy aguda, lo cual se estabiliza mediante un dispositivo de fijación externo. La tibia desarrolla una desunión atrófica con pérdida de hueso severa. Una placa de 2.7 mm se aplica después del corte de la fíbula para reducir el espacio de la tibia. El hueso de la fíbula se rompe y se mezcla en la fibrina con rhBMP-2 para proporcionar vida a las células en el sitio de la fractura. Después de las radiografías se muestra nueva formación del hueso y la construcción de una corteza nueva a lo largo de la tibia completa. Después de jalar los tornillos alejados por el trauma, la placa se elimina, y 300 \mug de rhBMP-2 en la fibrina se aplica un segundo tiempo. El hueso continúa creciendo, y 6 meses después del primer tratamiento con rhBMP-2 la fractura está sana.

El gato número 4 tiene la fractura de tibia abierta, la cual se estabiliza mediante un dispositivo de fijación externo, después de una suave osteomielitis transitoria el hueso de la tibia desarrolla la atrofia a pesar de las condiciones estables. La fibrina rhBMP-2 se aplica a través de un corte del entablillado en el espacio de la fractura. Después de 4 semanas ninguna reacción del hueso es visible en la radiografía, pero después de 7 semanas el espacio de la fractura es más pequeño y 4 meses después del tratamiento el hueso está unido.

En el gato número 5 los huesos del metatarso 3, 4 y 5 atrofiados severamente después de la estabilización de las fracturas con sujeción. Las radiografías de control revela ningún efecto del rhBMP-2 después de 4 y 7 semanas. El tratamiento adicional, no es tan largo como sea posible.

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Ejemplo 8 Retención del rhPDGF-AB no glucosilados en la fibrina y en la matriz sintética

Esto en ensayos in vitro prueban la retención del rhPDGF-AB no glucosilado en la fibrina y una matriz sintética. El PDGF-AB se conoce que contiene un sitio de N-glucosilación en la cadena A la cual se sugiere que se usa cuando la proteína se expresa mediante una célula eucariota. El rhPDGF-AB expresado en E-Coli se espera que sea no glucolsilado, en cual se usa en este estudio y es soluble en el pH fisiológico hasta 0.2 mg/ml. (Hoppe, J. y col., Biochemistry, 28, 2956-60 (1989); Hoppe, J. y col. Eur J Biochem, 187, 207-14 (1990)).

El PDGF-AB no glucosilado se prueba con 2 \mug por 50 \mul de los geles. Los geles de fibrina se polimerizan usando una formulación modificada de Tissucol (Baxter) y el gel sintético es del acrilato-PEG 4-ramas entrelazado con el tiol-PEG de dos ramas. Los geles se lavan en una solución salina reguladora (PBS 0,01 M, pH 7.4 con 0.1% BSA) y se cambia el lavado después de 12 horas. La cantidad de las moléculas terapéuticas liberadas en el lavado luego se determinan mediante ELISA.

Después de 20 volúmenes del lavado, 0.7 \mug de la proteína se detecta en la solución reguladora de lavado de la matriz de fibrina, lo cual resulta en una retención del 65% de la carga de proteína total en la matriz de fibrina. En la matriz sintética, menos de 4 ng se libera después de 20 volúmenes de lavado, como no hay proteína que se detecte dentro de la sensibilidad del ensayo, se sugiere la retención total de la carga de proteína.

Como el control contra la interferencia de la matriz en el ensayo o de la degradación de la proteína en las muestras parecidas son probadas y los resultados muestran que la cantidad significativa de la proteína es detectable después de lavar 20 veces.

Basado en estos resultados se muestra que la rhPDGF-AB procariota se puede retener dentro de las matrices, tal como la fibrina y los geles PEG sintéticos para que se use en la iniciación de las aplicaciones de mejoramiento.

Se entenderá que la invención desarrollada no se limita a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos en la presente. Además en la terminología usada en la presente es para la finalidad de describir modalidades particulares y no entenderá que limita el alcance de la presente invención.

Para aquellos expertos en la técnica reconocerán o serán capaces para acertar el uso de no más que las experimentaciones rutinarias, la mayoría de los equivalentes a las modalidades específicas de la invención descritas en la presente. Se entenderá que tales equivalentes están comprendidas por las siguientes reivindicaciones.

Claims (45)

1. Un sistema para curar heridas que comprende al menos una primera y una segunda composición separadas una de la otra, en donde la primera composición comprende un componente precursor en una red tridimensional, la segunda composición comprende un componente precursor en una cadena tridimensional posterior, los componentes precursores cuando son mezclados bajo condiciones que permiten la polimerización de los componentes de los precursores forman una cadena sintética tridimensional por una reacción de adición de tipo Michael; y ademas en donde al menos una de la primera o segunda composición comprende una molécula biológicamente activa que ha sido seleccionada de los miembros desglucosilados de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína.

2. El sistema de conformidad a la reivindicación 1, en donde la primera composición comprende al menos un componente que tiene grupos n nucleofílicos en donde n es al menos 2, y la segunda composición comprende al menos un componente que tiene m grupos conjugados insaturados, con m siendo al menos dos y n + m son al menos cinco.

3. El sistema de conformidad a la reivindicación 2, en donde al menos una de las composiciones primera y segunda comprende adicionalmente una base.

4. El sistema de conformidad a la reivindicación 1, en donde la primera composición comprende al menos un componente que tiene n grupos nucleofílicos y al menos un componente tiene m grupos insaturados conjugados, en donde m y n es al menos dos y m + n es al menos 5 y en donde la segunda composición comprende al menos una base.

5. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en donde los grupos nucleofílicos y los grupos insaturados conjugados son capaces de reaccionar uno con el otro en una reacción de adición de Michael catalizada con una base.

6. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en donde el grupo nucleofílico es un tiol.

7. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en donde el grupo insaturado conjugado se selecciona del grupo que consiste de vinilsulfona y acrilato.

8. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en donde el componente comprende los grupos nucleofílicos que se seleccionan del grupo que consiste de polietileno glicol, péptidos degradables enzimáticamente y proteínas degradables enzimáticamente.

9. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 en donde el componente comprende el grupo insaturado conjugado que se selecciona de polímeros sintéticos, en particular polietileno glicol.

10. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la molécula bioactiva es un miembro desglucosilado de la superfamilia de TGF\beta.

11. El sistema de conformidad a la reivindicación 10 en donde la molécula bioactiva es un miembro desglucosilado proteína morfogenética ósea.

12. El sistema de conformidad a la reivindicación 11 en donde la molécula es rh-BMP2 desglucosilado.

13. El sistema de conformidad a la reivindicación 10 en donde la molécula bioactiva es una plaqueta derivada del factor de crecimiento (PDGF) y en particular PDGF AB.

14. El sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en donde las condiciones bajo las cuales los componentes forman una matriz tridimensional son condiciones fisiológicas en el cuerpo del animal o humano.

15. El uso del sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la obtención de una red tridimensional para usarse como una matriz para la regeneración del tejido y de la curación de heridas.

16. El uso de conformidad a la reivindicación 15, en donde la herida es un defecto óseo.

17. El uso de conformidad a la reivindicación 15 en donde la herida es una herida crónica cutánea.

18. Una composición para la curación de heridas que comprende: una matriz polimérica formada por polímeros sintéticos y una molécula bioactiva, en donde la molécula está insertada físicamente en la matriz polimérica y en donde la molécula bioactiva es un miembro desglucosilado de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína y los polímeros sintéticos están en función de forma que reaccionen en una adición de reacción de tipo Michael.

19. La composición de conformidad a la reivindicación 18 en donde la molécula bioactiva es un miembro desglucosilado de la superfamilia TGF\beta.

20. La composición o el sistema de conformidad a la reivindicación 19, en donde la molécula bioactiva es una proteína morfogenética ósea desglucosilada.

21. La composición o sistema de conformidad a la reivindicación 20 en donde la molécula bioactiva es rhBMP-2 desglucosilado.

22. La composición o sistema de conformidad a la reivindicación 19, en donde la molécula bioactiva es una plaqueta desglucosilada derivada del factor de crecimiento, en particular PDGF AB.

23. La composición o sistema de conformidad a la reivindicación 18, en donde los polímeros sintéticos son seleccionados del grupo de poli (óxido de etileno) (PEO), poli (etileno glicol) (PEG) y copolímeros con poli (óxido de propileno) (PEG-co-PPG), poli (alcohol de vinilo) (PVA), poli (vinilpirrodilona) (PVP), poli (etiloxazolina) (PEOX), poli-aminoácidos y pseudo poli-aminoácidos, y copolímeros de estos polímeros.

24. Una composición o sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, en donde la molécula bioactiva está insertada físicamente mediante precipitación dentro de la matriz.

25. Un método para la obtención de una matriz que mejora la curación de heridas, que comprende mezclar la composición primera y segunda del sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

26. El método de conformidad a la reivindicación 25, que comprende además un acoplamiento de una segunda. molécula bioactiva diferente a la composición, en donde la matriz polimérica incluye sitios con afinidad de enlazamiento para la segunda molécula bioactiva y en donde la primera molécula bioactiva tiene afinidad de enlazamiento para la segunda molécula bioactiva.

27. El método de conformidad a cualquier de las reivindicaciones 25 ó 26, en donde la molécula bioactiva se precipita durante la formación de la matriz.

28. El método de conformidad a cualquier de las reivindicaciones 25 ó 26 en donde la molécula bioactiva se precipita antes de la formación de la matriz.

29. Un método para reducir la solubilidad de un miembro glucosilado de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína en matrices que consisten de polietileno glicol en donde el polietileno glicol están en función de forma que reaccionen en una adición de reacción de tipo Michael, que comprende la etapa de convertir el factor de crecimiento a un producto desglucosilado.

30. El método de conformidad a la reivindicación 29 en donde el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste de una proteína morfogenética ósea y la plaqueta se deriva del factor de crecimiento (PDGF).

31. El método de conformidad a la reivindicación 30 en donde el factor de crecimiento es rh BMP-2.

32. El método de conformidad a la reivindicación 30 en donde el factor de crecimiento es PDGF AB.

33. Un método para la formación de una composición la cual mejora la curación de heridas, que comprende la precipitación de una molécula bioactiva dentro de una matriz polimérica, en donde la molécula bioactiva es un miembro no glucosilado de la superfamilia del factor de crecimiento del nodo de cistína, y en donde la matriz polimérica esta formada por un polímero sintético formado por la reacción de adición del tipo Michael.

34. El método de conformidad a la reivindicación 33, en donde la molécula bioactiva es un miembro no glucosilado de la superfamilia TGF\beta.

35. El método de conformidad a la reivindicación 34, en donde la molécula bioactiva es un miembro no glucosilado de la proteína morfogenética ósea.

36. El método de conformidad a la reivindicación 35, en donde el miembro no glucosilado de una proteína morfogenética ósea es rhBMP-2.

37. El método de conformidad a la reivindicación 33, en donde los polímeros sintéticos se seleccionan el grupo de poli (óxido de etileno) (PEO), poli (Etileno glicol) (PEG) y copolímeros con poli (óxido de propileno) (PEG-co-PPG), poli (alcohol de vinilo) (PVA), poli (vinilpirrolidona) (PVP), poli (etiloxazolina) (PEOX) poliaminoácidos y pseudo poliaminoácidos y copolímeros de estos polímeros.

38. El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37, que comprende además el acoplamiento de una segunda molécula bioactiva diferente a la composición en donde la matriz polimérica incluye sitios con afinidad de enlazamiento para la segunda molécula bioactiva, y en donde la primera molécula bioactiva tiene afinidad de enlazamiento para la segunda molécula bioactiva.

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39. El método de conformidad a la reivindicación 38, en donde la primera molécula bioactiva es una proteína morfogenética ósea.

40. El método de conformidad a la reivindicación 39, en donde la primera molécula bioactiva es rhBMP-2.

41. El método de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en donde la segunda molécula bioactiva es heparina.

42. Un dispositivo que contiene el sistema de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

43. El dispositivo de conformidad a la reivindicación 42, en donde el dispositivo es una jeringa de dos compartimientos, en donde el primer compartimiento contiene la primera composición y el segundo compartimiento contiene la segunda composición y los dos compartimientos están combinados mediante una conexión de dos vías.

44. El dispositivo de conformidad a la reivindicación 43, en donde los dos compartimientos son bi-divididos y separados mediante una división ajustable rectangular a la pared del compartimiento.

45. El uso de la composición de conformidad a las reivindicaciones 18 a 24 para la preparación de un medicamento para la curación de heridas.