ES2592377T3

ES2592377T3 - Nuevos glucósidos de esteviol

Info

Publication number: ES2592377T3
Application number: ES09817935.1T
Authority: ES
Inventors: Toyoshige Morita; Isao Fujita; Fumito Matsuura; Masaya Ota
Original assignee: Morita Kagaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Morita Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-02
Publication date: 2016-11-29
Anticipated expiration: 2029-10-02
Also published as: MY158626A; JP5604426B2; US20190357581A1; JP2016102134A; US10420360B2; WO2010038911A1; KR20200000478A; CN107033200A; CN107011397A; US20140187761A1; US20180077959A1; US20210037864A1; EP3101023A1; CN116102603A; KR102061165B1; EP2350110B1; US9215889B2; US10849346B2; KR20170018983A; JP2017141293A

Abstract

Un glucósido de esteviol de la fórmula III, VII, VIII, IX y X:**Fórmula** en la que R1 y R2 son una cadena de azúcar definida en la siguiente tabla;**Tabla**

Description

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DESCRIPCION

Nuevos glucosidos de esteviol Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un nuevo glucosido de esteviol, un edulcorante que contiene rebaudiosido A y el nuevo glucosido de esteviol, que esta incluido en la variedad Stevia Rebaudiana Bertoni que contiene un alto contenido de rebaudiosido A, un metodo de fabricacion de alimentos, productos farmaceuticos, productos no farmaceuticos y cosmeticos, confirmacion de variedades de estevia y metodo analltico del nuevo glucosido de esteviol.

Tecnica anterior

La estevia es una planta perenne de la familia Asteraceae que crece en Paraguay, Sudamerica. Su nombre cientlfico es Stevia Rebaudiana Bertoni. La estevia contiene componentes, cuyo dulzor es 300 veces o mas el de la sacarosa, y se plantea usarla como un edulcorante natural despues de extraer los componentes dulces.

El esteviosido (C38H60O18), rebaudiosido A (C44H70O23), rebaudiosido C, D y E, dulcosido A etc. se han conocido como componentes dulces de la estevia. En la variedad de estevia generalmente plantada, el esteviosido (en lo sucesivo en este documento ST) es el componente principal entre los componentes dulces mencionados anteriormente, con una cantidad de rebaudiosido A contenida (en lo sucesivo en este documento RA) de aproximadamente 40 % en peso del contenido y la de rebaudiosido C es ligeramente menor. Pero dependiendo de la variedad hay diversos tipos, tales como aquellos en los que el rebaudiosido C es el componente principal.

Debido a que el ST tiene un grado de dulzor de 300 veces el de la sacarosa, se ha usado ampliamente en la industria alimentaria como un edulcorante natural. Su dulzor es relativamente similar al del azucar, pero se sabe que, en comparacion con el RA, permanece en la boca un sabor desagradable de amargor. En comparacion con esto, el RA tiene una buena calidad de dulzor, con un grado de dulzor de 1,3 a 1,5 veces el del ST, por lo que en general un edulcorante de estevia con una alta relacion de contenido de RA es deseable mas que uno de ST. Los inventores de la presente invencion llevaron a cabo citomejoramiento por repeticion de fertilizaciones cruzadas selectivas de variedades convencionales, obteniendo as! unicamente variedades de estevia con muy pocas cantidades de ST en comparacion con RA, desarrollando edulcorantes de estas variedades (vease la bibliografla de patente 1, por ejemplo).

Sin embargo, entre los sabores tales como amargor, astringencia y suavidad para la lengua, el sabor suave es bastante delicado. Esta suavidad delicada no depende de la proporcion entre ST y RA unicamente. Cuando se anade glucosa a la estructura qulmica de los diversos componentes dulces contenidos en la estevia, el sabor suave mejora, y se ha desarrollado un metodo para mejorar los sabores suave y fuerte anadiendo estructuralmente glucosa a los componentes dulces de la estevia (bibliografla de patente 2 y 3).

De esta manera, incluso si la cantidad de contenido es pequena, es muy importante analizar los componentes desconocidos contenidos en la estevia, en particular para conocer los componentes en los cuales la glucosa se anade estructuralmente mas que el ST, y es extremadamente importante ejecutar un examen cuidadoso de la glucosa anadida estructuralmente a los mismos desde una perspectiva del sabor-control de calidad.

Simultaneamente, puesto que la calidad del sabor esta influida por los componentes dulces incluidos en las propias plantas como materia prima, es importante sujetar minuciosamente los componentes dulces para desarrollar excelentes variedades de estevia y usarlas. De ahora en adelante, la mejora del cultivo de la planta como materia prima probablemente se hara muy popular, pero sera posible conocer en detalle los resultados del mejoramiento del cultivo especificando de forma diligente los componentes dulces contenidos en las plantas desarrolladas.

Por otro lado, los inventores de la presente invencion desarrollaron un metodo para establecer una variedad para variedades vegetales recien desarrolladas usando genes (bibliografla de patente 4 y 5), pero actualmente no hay medios de especificar las plantas de materia prima respecto al edulcorante extraldo y procesado de estas plantas de materia prima y los productos que hacen uso de las mismas.

[Bibliografla de patente 1] Publicacion de patente abierta a inspeccion publica JP2002-262822 Gazette [Bibliografla de patente 2] Publicacion de patente JP1957-18779 Gazette

[Bibliografla de patente 3] Publicacion de patente abierta a inspeccion publica JP1997-107913 Gazette [Bibliografla de patente 4] Publicacion de patente abierta a inspeccion publica JP2003-009878, Gazette [Bibliografla de patente 5] Publicacion de patente internacional del tratado de cooperation en materia de patentes PCT WO06/093229 Gazette

El documento EP 1 856 967 se refiere a una planta que pertenece a la variedad Stevia Rebaudiana Bertoni que contiene 4 partes en peso o mas de rebaudiosido A con respecto a una parte en peso de esteviosido y permite que

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pueda producirse un endulzamiento de una buena calidad.

El documento EP 2 298 084 se refiere a una mezcla aromatizante que comprende una o mas sustancias con sabor dulce seleccionadas del grupo de sustancias de sabor dulce de origen natural y sus sales fisiologicamente aceptables, sin filodulcina y sus sales fisiologicamente aceptables. Kobayashi et al. Phytochemistry, Pergamon Press, vol. 16, enero 1977, paginas 1405-1408 se refiere a los dulcosidos A y B, nuevos glucosidos de diterpeno de Stevia Rebaudiana.

Shintaro Kamiya et al, Agricultural and Biological Chemistry, Japan Soc. For Bioscience, Biotechnology and Agrochem, vol. 43, n.° 9, 1 enero 1979, paginas 1863-1879, se refiere a la slntesis y sabor de algunos analogos de esteviosido.

Divulgacion de la invencion Problemas que se deben resolver

Se han analizado y normalizado cinco componentes del edulcorante estevia (ST, RA, rebaudiosido A, dulcosido A y biosido de esteviol), pero no existe conocimiento sobre los otros componentes desconocidos. Ademas, no hay manera de confirmar su presencia ni siquiera para los componentes dulces ya conocidos, puesto que no se ha establecido un metodo analltico. Sin embargo, recientemente, se ha establecido la norma JECFA para 7 de los componentes de glucosidos de esteviol, los edulcorantes conocidos en la estevia se han confirmado y los componentes desconocidos se han aclarado, junto con la conciencia de la importancia de conocer la influencia del sabor delicado de estos componentes.

El fin de la presente invencion es definir la estructura de los edulcorantes presentes en pequena cantidad contenidos en la variedad estevia y confirmar su influencia sobre el sabor del edulcorante de estevia.

Tambien el otro fin es proporcionar las medidas para especificar la planta de estevia que resulta como materia prima respecto al edulcorante de estevia y los productos que usa este.

Los inventores de la presente invencion han buscado nuevos glucosidos de esteviol contenidos en la variedad estevia, cuyo componente principal es RA, y descubrieron 10 componentes de los nuevos glucosidos de esteviol que pueden tener una sutil influencia sobre la calidad del sabor. Despues completaron la presente invencion descubriendo que habla una diferencia en el contenido en volumen de estos componentes entre las variedades y que ciertos componentes estaban presentes unicamente en las variedades de estevia especificadas que tenlan rA como su componente principal, seguido de la confirmacion de que era posible usar este como un marcador del edulcorante originado en tales plantas.

Efectos de la invencion

Los glucosidos de esteviol de la presente invencion tienen estructuras en las cuales se anade mas glucosa que en ST o RA y, por lo tanto, proporcionan un edulcorante de estevia que tiene un excelente sabor fuerte.

Aparte, es posible suponer el origen de la materia prima confirmando el glucosido de esteviol X en el extracto o los cristales, y el analisis del producto final permite juzgar si la planta de materia prima se opone a los derechos tales como patentes y otros.

(El mejor modo para llevar a cabo la invencion)

La variedad de estevia con RA como componente principal mencionado en la presente invencion es una variedad que contiene mayor contenido de RA que de ST, y que se describe en las solicitudes de patente JP2001-200944 y JP2007-506004; el extracto obtenido de las hojas secas tiene un mayor contenido de Ra que de ST y tambien contiene rebaudiosido D (R-D), glucosido de esteviol III, V, VI, VII y X, haciendo posible obtener un edulcorante excelente de sabor fuerte que contiene el componente en el cual se anaden estructuralmente mas glucosas que en el ST y/o RA.

Ademas, es posible obtener eficazmente un edulcorante de RA altamente puro que contiene una cantidad traza de ST y glucosido de esteviol X por recristalizacion.

La primera realizacion de la presente invencion es glucosido de esteviol de formula III para x, donde los compuestos que no caen dentro de las reivindicaciones se consideran ejemplos de referencia utiles para el entendimiento de la invencion:

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en la que Ri y R2 son una cadena de azucar definida en la siguiente tabla;

N.° (glucosido de esteviol) | Ri I R2

III (Rebaudiosido I): B'gic-8'glc(2-+l) B-gfc(3-a) B-glc-B-glc(3^ 1)

IV (Rebaudiosido H): 8'glc-a'rha(2—► l)-Bglc(3' l) \ 8*glc(3-l) B-glc

V (Rebaudiosido L): 8glc'8glc(2l)^ \ hB-glc(6-l) B glc(3 l) J B-glc

VI (Rebaudiosido K): 6-glc-a-rha(2->l) 6-glc(3->l) Bglc-B-glc(2^1)

VII (Rebaudiosido J): 8glc-B-glc(2 —> l) 8-gte(3^i> B-glc-a-rha(2^1)

VIII (Rebaudiosido M): 8‘glc-B-eIc(2—> 1) \ 8-glc(3-+l) B-glc"8-gIc(2—*•!) \ B*glc(3-vl)

IX (Rebaudiosido N): B-gitc-8*glc(2-»l) B-glc(3>l) 8-gk-crrha(2—>l) 8-gle(3-> I)

X (Rebaudiosido O): B-glc“B'glc(2-)-l) Bglc(3-»l) 8-glc-a-rha(2-+l) B glc(3~> 1) \ B-glc(3—*l)

Los simbolos en la formula son los azucares a continuacion: glc: D-glucopiranosilo rha: L-ramnopiranosilo xyl: xilopiranosilo

Puede obtenerse un extracto que contiene glucosido de esteviol X (rebaudiosido 0) extrayendo un cuerpo de planta de Estevia Rebaudiana Bertoni, una planta de la familia de Asteraceae, o sus hojas secas, como un componente principal del cual es rebaudiosido A, con agua o un disolvente que contiene agua.

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Un metodo para obtener rebaudiosido A muy puro que contiene el glucosido de esteviol X (rebaudiosido 0) puede proporcionarse mediante la recristalizacion del extracto mencionado anteriormente.

Puede proporcionarse un metodo de fabricacion para productos alimentarios, en el cual el extracto del extracto anterior se anade al alimento en una cantidad igual a o menor del 1 % del alimento.

Puede proporcionarse un metodo de fabricacion de productos alimentarios, en el cual el rebaudiosido A altamente puro obtenido en el metodo anterior se anade al alimento en una cantidad igual a o menor del 1 % del alimento.

En el extracto obtenido de la variedad de materia prima, cuyo componente principal es ST, no hay glucosido de esteviol X, sino el extracto obtenido de las variedades de materia prima, cuyo componente principal es RA, tiene el glucosido X, es posible juzgar la variedad de materia prima respecto a si el componente principal es ST o RA. Es decir, puesto que no hay glucosido X en el extracto que contiene RA como un componente principal, que se obtiene eliminando ST por cristalizacion a traves del extracto obtenido de las variedades cuyo componente principal es ST, o en los productos de alta pureza obtenidos a partir de su recristalizacion, es posible confirmar las variedades de materia prima. La sexta realizacion de la presente invention es el metodo para confirmar las variedades de estevia por el glucosido de esteviol X.

Puede proporcionarse un metodo analltico de los glucosidos de esteviol III-X mediante cromatografla llquida de alto rendimiento (en lo sucesivo en este documento HPLC).

Para conseguir estos objetivos, los inventores de la presente invencion estudiaron exhaustivamente los componentes dulces incluidos en las variedades cuyo componente principal es RA y las variedades de las solicitudes JP2001-200944 y JP2007-506004, encontraron nuevos componentes dulces y determinaron su estructura qulmica. Ademas, confirmaron la utilidad de estos componentes como edulcorantes y completaron el metodo analltico y el metodo de confirmation de las variedades a traves de estas variedades.

La confirmacion de los nuevos componentes se ejecuto por extraction con agua o un disolvente que contenla agua de las variedades cuyos componentes principales eran RA como en el Ejemplo 1 (en lo sucesivo en este documento denominada Variedad A) y las hojas secas de las solicitudes JP2001-200944 (en lo sucesivo en este documento denominada Variedad B) y 2007-506004 (en lo sucesivo en este documento denominada Variedad C).

Despues de esto, la solution de extracto se concentra directamente o, si fuera necesario, las impurezas ionicas se retiran con una resina de intercambio ionico o una resina de intercambio cationico o carbono activado, se permite que los componentes edulcorantes se absorban en una resina de absorcion, seguido de la elucion con un disolvente hidrofilo, y si fuera necesario, el eluido se concentra y se seca y el eluyente se vuelve a tratar con una resina de intercambio ionico o una resina de intercambio cationico, o carbono activado, y puede confirmarse el extracto obtenido de esta manera o el extracto obtenido por medios de purification apropiados de la tecnica convencional tales como decoloracion.

Los glucosidos de esteviol del extracto de RA-C obtenido del Ejemplo 1 (1) descrito anteriormente en este documento se separaron y analizaron mediante un dispositivo de cromatografla llquida de alto rendimiento y

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en la que R1 y R2 son, respectivamente, un atomo de hidrogeno, y se determino la cadena de azucar mencionada anteriormente.

El glucosido de esteviol I (Dulcosido B) es un glucosido con una estructura de peso molecular 788, segun se confirmo en un tiempo de retention (en lo sucesivo en este documento T.R.) de aproximadamente 13 minutos en el cromatografo de la HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol II (Rebaudiosido G) es un glucosido con una estructura de peso molecular 804, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 15 minutos de HPLC en la Figura 1.

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El glucosido de esteviol III (Rebaudiosido I) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1128, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 28 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol IV (Rebaudiosido H) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1112, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 29 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol V (Rebaudiosido L) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1128, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 34 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol VI (Rebaudiosido K) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1112, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 34 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol VII (Rebaudiosido J) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1112, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 34 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol VIII (Rebaudiosido M) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1290, segun se confirmo duplicando el Rebaudiosido D en un T.R. de aproximadamente 34 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol IX (Rebaudiosido N) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1274, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 43 minutos de HPLC en la Figura 1.

El glucosido de esteviol X (Rebaudiosido O) es un glucosido con una estructura de peso molecular 1436, segun se confirmo en un T.R. de aproximadamente 51 minutos de HPLC en la Figura 1.

Sin embargo, cualquier experto en la materia entendera que el T.R. de analisis mencionado anteriormente usando elucion en gradiente es variable.

Como se ha mencionado anteriormente, esto proporciona una importante informacion para la identificacion de la variedad de materia prima y si el glucosido de esteviol X esta presente o no en el producto final.

Simultaneamente, puesto que es posible confirmar estos glucosidos de esteviol por HPLC, incluso en el caso de que se usen como edulcorantes, la calidad y el sabor pueden controlarse totalmente con facilidad por el analisis de HPLC.

El extracto o los cristales obtenidos pueden usarse como edulcorantes en caramelos, gelatinas, bebidas en polvo, sopas de fideos instantaneas, mermeladas, frutas congeladas, chicles, dulces japoneses, alimentos saludables, chocolate, edulcorantes de mesa, dulces fritos, delicias, alimentos hervidos en agua, bebidas lacticas fermentadas, bebidas de cafe, bebidas de cacao, bebidas de te, licores, vinos, sorbetes, cereales, alimentos que contienen fibra vegetal, salsas, salsa de soja, pasta de soja, vinagres, aderezos, mayonesas, ketchup, curry, sopas, dulces de arroz, arare, panes, bizcochos, galletas tipo craker, mezclas para crepes, frutas en lata, verduras en lata, productos carnicos, productos fabricados con pasta de pescado hervida, alimentos salados, escabeches, condimentos combinados, alimentos de lujo, productos cosmeticos, etc., dando como resultado una disminucion de calorlas, reduccion de la sacarosa, disminucion del punto de fusion, mejora de la calidad del dulzor y efecto de enmascarado, entre otros, siendo posible tambien anadir a otros edulcorantes y disolventes naturales y artificiales.

Ejemplos

Ejemplo 1 Fabricacion de extracto de RA

(1) Extracto

100 g de hojas secas obtenidas de las variedades A, B o C, cuyo componente principal es RA, se extrajeron varias veces con 20 veces la cantidad de agua en peso hasta que el dulzor no pudo saborearse. El extracto se hizo pasar a traves de una columna rellena con 300 ml de resina de absorcion (Diaion HP-20) y los componentes dulces del extracto se absorbieron en la resina, que se lavo suficientemente con agua, y los componentes se eluyeron con 900 ml de metanol. El eluato se hizo pasar a traves de una columna rellena con 200 ml de resina de intercambio ionico (Diaion WA-30), se anadieron 10 g de carbono activado al eluato y se agitaron. La mezcla se filtro, el filtrado se concentro y el residuo se seco para dar 13,0 g del extracto de RA-A, cuyo componente principal es rebaudiosido A amarillo claro (ST 35,4 %, RA 41,7 % y RC 9,8 %), 11,5 g del extracto de RA-B (ST 19,5 %, RA 58,1 % y RC 8,8 %) y 12 g del extracto RA-C (ST 5,4 %, RA 72,3 % y RC 8,1 %), respectivamente.

(2) Recristalizacion de RA

Cada 5 g del extracto de RA-B y el extracto de RA-C mencionados anteriormente se disolvieron en 10 veces el peso de metanol al 90 % con calentamiento, y se dejo reposar a 4 °C durante seis dlas. Los cristales resultantes se separaron, se lavaron con metanol y se secaron a presion reducida para dar 3,9 g de cristales de RA-B blancos (ST

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0,2 %, RA 95,0 % y RC 0,2 %) y 4,5 g de cristales de RA-C (ST 0,2 %, RA 95,6 % y RC 0,1 %) respectivamente. Ejemplo 2 Fabricacion de extracto de ST

Para fines de comparacion, se llevo a cabo el mismo procedimiento con respecto a la variedad, cuyo componente principal es ST, para dar 11,3 g de extracto de ST (ST 51,9 %, RA 23,7 % y rC 7,4 %).

Ejemplo 3 Aguas madre de RA-A, aguas madre de ST

Cada 10 g del extracto de RA-A y el extracto ST mencionados anteriormente se disolvieron en 10 veces el peso de metanol al 90 % con calentamiento, y se dejo reposar a 4 °C durante seis dlas. Los cristales resultantes se separaron, se lavaron con metanol al 98 % frlo y se secaron a presion reducida para dar 2,1 g de cristales de RA- ST, que son cristales blancos de esteviosido y 3,8 g de cristales de ST-ST, respectivamente.

Cada 8,8 g de las aguas madre de RA-A (ST 15,7 %, RA 43,8 % y RC 6,9 %) y 6,1 g de las aguas madre de ST (ST 20,0 %, RA 37,1 % y RC 11,2 %), cuyo componente principal es RA, se concentran y secan para dar un polvo del agua madre, cuyo componente principal era un RA amarillo palido, respectivamente.

Ejemplo 4 Cristal de RA-A, cristal de ST-RA

Cada uno del polvo de aguas madre del Ejemplo 3 se disolvio en 10 veces el peso de metanol al 90 % con calentamiento y se dejo reposar a 4 °C durante seis dlas. Los cristales resultantes se separaron, se lavaron con metanol al 98 % frlo y se secaron a presion reducida para dar 2,2 g de cristales de RA-A blancos (ST 1,6 %, RA 90,4 % y RC 1,4 %) y 1,2 g de cristales de ST- RA (ST 1,6 %, RA 96,9 % y RC 1,4 %), respectivamente.

Ejemplo 5 Determinacion estructural de glucosidos de esteviol

Como se describe a continuacion, se realizo un analisis usando HPLC. La separation de los glucosidos de esteviol incluidos en cada extracto se llevo a cabo usando HPLC de Shimazu LC-10Advp usando una columna de TSKgel Amide-80 (4,6 x 250 mm Tosoh). Se uso acetonitrilo-agua como disolvente y se llevo a cabo una elucion en gradiente en la cual la proportion de acetonitrilo:agua se cambio de 82:18 a 66:34 en 60 minutos. El caudal era de 0,65 ml/min, la temperatura de la columna era de 40 °C y la detection se realizo a una absorcion ultravioleta de 210 nm.

En la medicion del peso molecular, se usaron un sistema de HPLC Waters' Alliance 2695 y un micro Waters' Quattro (triple cuadrupolo de masa) equipado con ionization de electronebulizacion (ESI)-espectrometro de masas. Respecto a la HPLC, la columna era una TSKgel Amide-80 (2,0 x 250 mm, Tosoh), se uso acetonitrilo-agua como un disolvente y se llevo a cabo una elucion en gradiente en la cual la proporcion de acetonitrilo:agua se cambio de 82:18 a 66:34 en 60 minutos. El caudal era de 0,2 ml/min, la temperatura de la columna era 40 °C, el nitrogeno gas se uso como un gas de desolvatacion y se uso gas argon como un gas de colision. Como una tension capilar, se usaron 15,0 kV en el analisis del glucosido de esteviol en el modo negativo y en el analisis de ABEE-oligosacaridos se usaron 13,5 kV en el modo positivo. Se uso una tension de 10 V a 80 V como la tension de cono y la tension de colision en el momento del analisis MS/MS. La temperatura de la fuente y la temperatura de desolvatacion eran de 100 °C y 400 °C respectivamente, y el volumen de flujo del gas de cono y el gas de desolvatacion era de 50 1/h y 900 1/h respectivamente.

Los resultados del analisis de HPLC respecto a cada extracto y cristal se ilustran en las Figuras 1-10.

Los resultados anallticos de cada pico cromatografico mostrados en las Figuras 2-10 se muestran en las siguientes Tablas 1-9.

CH

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[Tabla 1] - Cristales de RA-A

PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1: 4,857 6932 486 0,2192 Stev mono

2: 8,817 1467 107

3: 9,603 2029 124 0,0642 Rubuso

4: 10,244 3630 214

5: 11,065 12106 605

6: 14,763 14947 397 0,4726 Rebau B

7: 16,782 58617 2320 1,8535 Stev

8: 18,901 35984 1440 1,1379 Rebau C

9: 19,984 23401 820 0,7400 Rebau F

10: 23,334 2971977 97370 93,9772 Rebau A

11: 28,648 4872 191 0,1541 Rebau E+III+IV

12: 34,608 5912 174 0,1869 V+VI+VII

13: 35,531 28131 892 V 0,8895 Rebau D+VIII

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CH: PKNO T A H MK IDNO CONC N

: 14 37,222 5390 185

: 15 42,731 6943 222 0,2195 IX

: 16 51,166 2700 88 0,0854 X


: TOT 3185038 105635 100,0000




: [Tabla 2] - Cristales de RA-B

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1 1: 2,098 1307 246

2: 2,309 675 139 V

3: 2,833 7713 1426

4: 4,775 3286 244

5: 13,518 91704 3965 2,8021 I

6: 14,834 14854 462 0,4539 Rebau B

7: 16,077 1125 54

8: 16,8 747 88

9: 17,034 9460 352 V 0,2891 Stev

10: 18,601 2647 110

11: 19,157 7685 314 V 0,2348 Rebau C

12: 20,268 20421 652 0,6240 Rebau F

13: 23,663 3106124 102260 94,9097 Rebau A

14: 27,533 2882 95

15: 29,043 5444 210 0,1663 III + Rebau E+IV

16: 31,461 2828 91 0,0864

17: 35,959 8128 282 0,2484 Rebau D+V+VI+VII

18: 37,696 6165 183

19: 43,225 4259 120 0,1301 IX

20: 51,644 1807 53 0,0552 X


: TOT 3299261 111346 100,0000




: [Tabla 3] - Cristales de RA-C

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1 1: 2,335 15257 2745

2: 3,398 2074 247

3: 4,436 3292 209

4: 9,657 51969 2355 1,6822 Rubuso

5: 14,351 4502 107 0,1457 Rebau B

6: 16,175 5072 189 0,1642 Stev

7: 18,192 2634 88 0,0853 Rebau C

8: 19,366 13008 474 0,4211 Rebau F

9: 22,682 3002254 98794 97,1825 Rebau A

10: 34,744 4564 160 0. 1477 V+VI+Rebau D+VII+VIN

11: 36,455 3018 96 0,0977

12: 41,927 1880 67 0,0609 IX

13: 50,485 393 17 0,0127 X


: TOT 3109917 105548 100,0000




: [Tabla 4] - Extracto de RA-A

CH: PKNO T A H MK IDNO CONC N

1
1: 2,646 12581 1924

: 2 3,502 1786 313

: 3 3,715 5140 389 V

: 4 4,411 36010 2058 V

: 5 4,64 18976 2043 V

: 6 4,904 94086 5839 V 1,3702 Stev mono

: 7 5,683 42933 1608 V

: 8 6,108 9264 666 V

: 9 6,642 30742 778 V

: 10 7,192 23108 906 V

: 11 7,736 52867 2210 V 0,7699 Stev bio

: 12 8,292 22402 750 V

: 13 8,831 44958 2378 V

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

14: 9,615 104428 4765 V 1,5208 Rubuso

15: 10,262 92646 4531 V

16: 10,917 33787 1420 V

17: 12,778 63372 2978 0,9229 Dulco A

18: 13,466 12776 658 V 0,1861 I

19: 14,821 47594 1672 0,6931 Rebau B

20: 16,812 2795705 107308 40,7133 Stev

21: 18,95 683621 23300 V 9,9554 Rebau C

22: 20,017 130330 3792 V 1,8980 Rebau F

23: 22,017 4444 192

24: 23,385 2759980 90911 40,1931 Rebau A

25: 26,082 15240 516

26: 28,592 5443 144 0,0793

27: 29,425 6048 234 V 0,0881 III + Rebau E

28: 30,066 29426 961 V 0,4285 IV

29: 33,96 10732 419 0,1563 V+VI+VII

30: 35,559 51215 1667 0,7458 Rebau D+VIII

31: 42,755 15644 462 0,2278 IX

32: 51,175 3535 108 0,0515 X

: TOT 7260819 267900 100,0000


: [Tabla 5] - Extracto de RA-B

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1 1: 2,136 1244 231

2: 2,862 8119 1484

3: 4,411 37288 2536

4: 4,634 25374 2584 V

5: 4,889 113717 7669 V 3,2793 Stev mono

6: 5,766 57184 1940 V

7: 6,666 16138 503 V

8: 7,319 34921 927 V 0,3964 Stev bio

9: 7,917 13888 628 V

10: 8,533 19410 741 V

11: 8,887 44852 2585 V

12: 9,35 16370 1111 V 0,4751 Rubuso

13: 9,71 81099 3752 V

14: 10,339 81250 3739 V

15: 12,183 4543 172

16: 12,941 26992 1213 V 0,5187 Dulco A

17: 13,658 35796 1693 V 0,7239 I

18: 15,012 62182 2088 0,8928 II

19: 17,039 1579831 61299 26,2115 Stev

20: 19,212 630967 21477 V 9,1836 Rebau C

21: 20,303 129387 3817 V 1,6322 Rebau F

22: 23,721 3953586 128495 S 54,9446 Rebau A

23: 26,44 11802 359 T

24: 29,088 9888 346

25: 29,817 9663 299 V Rebau E+III+IV

26: 30,449 17347 602 V 0,2574

27: 32,984 10425 255

28: 34,415 15693 537

29: 35,159 18016 574 V 0,2454 V+VI+VII

30: 36,025 68454 2067 V 0,8839 Rebau D+VIII

31: 37,749 4538 157

32: 43,275 20100 626 0,2677 IX

33: 51,757 7320 205 0,0877 X

: TOT 7167384 256711 100,0000


: [Tabla 6] - Extracto de RA-C

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1 1: 2,183 616 134

2: 2,597 10175 1537

3: 3,437 1414 323

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

4: 4,46 13740 1017

5: 4,642 6308 820 V

6: 4,906 54449 4098 V 0,8853 Stev mono

7: 5,721 9947 485 V

8: 6,06 3281 277 V

9: 8,264 25348 701

10: 8,844 16133 1093 V

11: 9,66 34116 1479

12: 10,275 34888 1821 V 0,5673 Rubuso

13: 10,799 10225 529 V

14: 11,829 144125 5701

15: 12,826 9263 377 V 0,1506 Dulco A

16: 14,874 129304 2644 2,1024 Rebau B

17: 16,871 437696 17109 V 7,1167 Stev

18: 19,001 472663 16510 7,6852 Rebau C

19: 20,078 99978 2988 V 1,6256 Rebau F

20: 23,439 4700591 156131 76,4290 Rebau A

21: 26,161 6575 216

22: 28,759 19933 692

23: 29,523 16030 496 V 0,2606 Rebau E

24: 30,192 4314 195 V 0,0701 III+IV

25: 32,915 22341 361 0,0000

26: 34,044 20210 662 V 0,3286 V

27: 34,784 37467 1171 V 0,6092 VI+VII

28: 35,637 82080 2479 V 1,3346 Rebau D+VIII

29: 42,833 32965 977 0,5360 IX

30: 51,265 18371 536 0,2987 X

: TOT 6474546 223559 100,0000


: [Tabla 7] - Extracto de ST

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

1 1: 2,626 7139 1183

2: 3,325 824 127

3: 3,683 3069 423 V

4: 3,836 9867 1104 V

5: 4,1 20804 2418 V

6: 4,432 158950 6323 V

7: 4,898 244425 14003 V 3,2613 Stev mono

8: 5,679 171018 7277 V

9: 6,067 36443 2486 V

10: 6,567 84143 3356 V

11: 6,833 59479 3255 V

12: 7,702 364999 10439 V 4,8701 Stev bio

13: 8,831 50633 2395 V

14: 9,622 121367 5308 V 1,6194 Rubuso

15: 10,283 61202 2776 V

16: 10,651 82679 3615 V

17: 12,789 172505 7512 2,3017 Dulco A

18: 13,476 39377 1734 V 0,5254 I

19: 14,117 9126 325 V

20: 14,843 56080 1517 V 0,7483 Rebau B

21: 15,883 18828 574 V 0,2512 II

22: 16,837 4190811 160109 SV 55,9165 Stev

23: 18,317 837 72 T

24: 18,961 471940 16634 V 6,2969 Rebau C

25: 20,03 96159 2847 V 1,2830 Rebau F

26: 22,021 11777 430

5

10

15

CH PKNO: T A H MK IDNO CONC N

: 27 23,407 1635704 52768 SV 21,8246 Rebau A

: 28 26,087 18075 573 T

: 29 30,114 37321 1256 0,4980 Rebau E+III+IV

: 30 34,028 11847 362 0,1581 V+VI+VII

: 31 35,633 28790 851 V 0,3841 Rebau D+VIII

: 32 42,867 4616 125 0,0616 IX


: TOT 8280834 314177 100,0000



: [Tabla 8] - Cristales de ST-ST

CH: PKNO T A H MK IDNO CONC N

1
1: 2,64 20368 3347

: 2 3,342 792 150

: 3 8,16 199715 8553

: 4 9,579 28792 1602 0,7198 Rubuso

: 5 13,436 6892 362 0,1723 I

: 6 16,763 3809949 146224 S 95,2514 Stev

: 7 19,017 1413 63 T 0,0353 C

: 8 21,883 3078 108 0,0770 Rebau F

: 9 23,323 138456 4564 V 3,4615 A

: 10 26,007 6455 215

: 11 30,02 11309 367 0,2827 Rebau E+III+IV


: TOT 4227219 165555 100,0000



: [Tabla 9] - Cristales de ST-RA

CH: PKNO T A H MK IDNO CONC N

1
1: 2,567 11398 2039

: 2 3,19 846 174

: 3 11,629 43279 1893

: 4 14,703 13970 400 0,4290 Rebau B

: 5 15,927 1715 79

: 6 16,885 7321 220 0,2248 Stev

: 7 18,961 4537 192 0,1393 Rebau C

: 8 20,055 9706 413 0,2981 Rebau F

: 9 23,428 3204919 106088 98,4203 Rebau A

: 10 28,744 5579 170 0,1713 Rebau E+III+IV

: 11 33,32 4707 121 0,1445 V+VI+VII

: 12 35,603 4198 146 0,1289 Rebau D+VIII

: 13 42,8 1422 45 0,0437 IX


: TOT 33313597 111980 100,0000

Las abreviaturas usadas en las tablas son las siguientes:

PKNO:: Numero de pico

T:: Tiempo (minutos)

A:: Area de pico

H:: Altura de pico

CONC:: Concentracion (%)

N:: Nombre del glucosido

TOT:: Total

Stev mono:: Monoxido de esteviol

Stev bio:: Biosido de esteviol

Rebuso:: Rebusosido

Rebau:: Rebaudiosido

Stev:: Esteviosido

Dulco:: Dulcosido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La concentracion se calcula a partir del area total del espectro de absorcion ultravioleta a 210 nm, y es necesario corregir el peso molecular para medir el volumen contenido. De I a X en el cuadro cromatografico indican el nuevo glucosido de esteviol I a X.

Ejemplo 6 Evaluacion de la calidad del sabor

Una solucion acuosa al 0,05 % de cada extracto y una solucion acuosa al 0,03 % de los cristales fueron evaluadas por 10 personas familiarizadas con un ensayo sensorial de estevia y los resultados de la evaluacion promedio se muestran en la Tabla 10 a continuacion:

Evaluacion 5: excelente, 4: buena, 3: normal, 2: mala, 1: peor

[Tabla 101

Materia obieto del ensayo sensorial: 1) 2) 3) 4) 5) 6)

Extracto de RA-A: 4,1 3,8 4,1 4,9 3,4 3,8

Cristal de RA-A: 5,0 4,9 4,9 3,2 4,9 4,9

Extracto de RA-B: 4,2 3,8 4,1 4,9 3,5 3,7

Cristal de RA-B: 5,0 5,0 4,9 3,5 4,9 4,9

Extracto de RA-C: 4,2 4,0 4,5 4,8 3,5 3,8

Cristal de RA-C: 5,0 5,0 5,0 3,8 5,0 5,0

Extracto de ST: 1,2 1,3 1,2 4,0 2,0 2,0

Cristal de ST-RA: 4,8 4,6 4,6 3,0 4,8 4,3

1) Calidad de dulzor

2) Sabor que queda en la boca

3) Astringencia

4) Sabor delicado

5) Sensacion refrescante

6) Dulzor al acabarlo

Los tres tipos de extracto de RA que contienen los glucosidos de esteviol II a X (Rebaudiosido G a O) son excelentes respecto a un sabor delicado en comparacion con los tres tipos de cristales de RA, pero los cristales de RA son excelentes en las otras evaluaciones. Excepto por la evaluacion de sabor delicado, el extracto de ST es inferior al de los cristales de ST-RA. A partir de este resultado, se verifica que los glucosidos de esteviol II-X influyen en el sabor delicado.

Ejemplo 7 Determinacion de la variedad

De acuerdo con el analisis de HPLC de cada extracto y/o cristal, el extracto obtenido de las variedades que contienen RA como un componente principal (en lo sucesivo en este documento Variedad RA) incluyen mas rebaudiosido D, y tambien incluyen el glucosido de esteviol X (rebaudiosido O) en comparacion con el extracto obtenido de las variedades que contienen ST como un componente principal (en lo sucesivo en este documento Variedad ST). Ademas, se ha encontrado que el glucosido de esteviol X tambien se incluye en los cristales de RA obtenidos por purificacion del extracto de las variedades de RA, aunque en cantidades traza.

Por otro lado, no hay glucosido de esteviol X en el extracto obtenido a partir de las variedades ST. Naturalmente, el glucosido de esteviol X no se encuentra en los cristales de ST-RA obtenidos de las variedades ST y, por lo tanto, es posible confirmar que el extracto o el cristal se obtienen a partir de la variedad RA, si se confirma la presencia del glucosido de esteviol X.

Ejemplo 8 El metodo analltico del glucosido de esteviol

De acuerdo con la condition de HPLC descrita en el Ejemplo 5, es posible confirmar cada glucosido de esteviol I-X. En principio, es posible confirmar la presencia de glucosido de esteviol a partir del T.R. en el cuadro analltico de HPLC, pero cada glucosido de esteviol I-X puede confirmarse midiendo el peso molecular despues del aislamiento preparativo de cada glucosido.

Ejemplo 9 Azucar de mesa

1) Se preparo el azucar de mesa mezclando 1 g de cristales de RA-A y 99 g de azucar en polvo.

2) Se preparo el azucar de mesa mezclando 1 g de cristales de RA-B y 99 g de eritritol.

3) Se preparo el azucar de mesa mezclando 1 g de cristales de RA-C y 99 g de jarabe de malz de alto contenido en fructosa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo 10 Caramelos

Se prepare caramelo a partir de 0,3 g de extracto de RA-C, 100 g de palatinit y un volumen apropiado de especias. Ejemplo 11 Gelatina de leche

Se prepare gelatina de leche a partir de 15 g de azucar, 0,08 g de extracto de RA-B, 250 g de leche, 5 g de gelatina y un volumen apropiado de aroma de leche.

Ejemplo 12 Bebidas deportivas

Se prepare una bebida deportiva a partir de 0,075 % de cristales de RA-B, 0,11 % de lactato de calcio, 0,045 % de acido cltrico, 0,03 % de citrato trisodico, 0,015 % de cloruro de magnesio, 0,0055 % de acido glutamico y 99,72 % de agua.

Ejemplo 13 Bebidas carbonatadas

Se prepare una bebida carbonatada anadiendo 0,012 % de cristales de RA-B, 8,4 % de fructosa, 0,6 % de acido cltrico, 0,12 % de arginina, 0,1 % de inositol, 0,0025 % de cafelna, 0,0034 % de pantotenato de calcio, 0,003 % de niacinamida, 0,002 % de vitamina B6, 0,00009 % de vitamina B2, 0,000002 % de vitamina B12, y los volumenes apropiados de especias y agua para ajustar el 100 % del total de ingredientes, y despues introduciendo dioxido de carbono gaseoso.

Aplicabilidad industrial

Por analisis de HPLC de los nuevos glucosidos de esteviol proporcionados por la presente invencion, es posible fabricar edulcorantes y otros productos alimentarios con un cierto grado de dulzor y calidad y sabor delicado. Tambien posibilita suponer las variedades de materia prima y la invencion ayuda a juzgar lo correcto de la indicacion de origen, area de cultivo de las variedades de estevia o la infraccion de derechos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el cuadro de analisis de HPLC para el extracto de RA-C.

La Figura 2 muestra el cuadro de analisis de HPLC para los cristales de RA-A.

La Figura 3 muestra el cuadro de analisis de HPLC para los cristales de RA-B.

La Figura 4 muestra el cuadro de analisis de HPLC para los cristales de RA-C.

La Figura 5 muestra el cuadro de analisis de HPLC para el extracto de RA-A.

La Figura 6 muestra el cuadro de analisis de HPLC para el extracto de RA-B.

La Figura 7 muestra el cuadro de analisis de HPLC para el extracto de RA-C.

La Figura 8 muestra el cuadro de analisis de HPLC para el extracto de ST.

La Figura 9 muestra el cuadro de analisis de HPLC para los cristales de ST-ST.

La Figura 10 muestra el cuadro de analisis de HPLC para los cristales de ST-RA.

Claims

5

10

imagen1

en la que R1 y R2 son una cadena de azucar definida en la siguiente tabla;

N.°

Ri r2

III

6-gkrB-glc{2—>1) B-glc(3—>l) B-glo-B-glo(3->1)

VII

6-gkrB-glc{2—>1) B-glc(3—>1) B-glo-a-rha(2->1)

VIII

B-glc-B-glc(2— B-glc(3->l) B-gkHBrglc(2—>1) B-gIc(3-^l)

IX

B-gk-B-glc(2—>1) B-glc(3—>1) B-gb-a-rha(2-»>l) B-gIc(3->l)

X

6-gkrB-glc{2—>1) B-glc(3->l) B-gk-a-rha(2—►l)-B-glc(3—>1) B-glc(3->l)
2. Glucosido de esteviol de la formula III de acuerdo con la reivindicacion 1.
3. Glucosido de esteviol de la formula VII de acuerdo con la reivindicacion 1.
4. Glucosido de esteviol de la formula VIII de acuerdo con la reivindicacion 1.
5. Glucosido de esteviol de la formula IX de acuerdo con la reivindicacion 1.
6. Glucosido de esteviol de la formula X de acuerdo con la reivindicacion 1.