ES2588979T3 - Procedimientos para la predicción de una respuesta contra el cáncer - Google Patents

Abstract

Procedimiento para predecir el resultado del tratamiento contra el cáncer de un sujeto con un trastorno hiperproliferativo celular, que comprende determinar una puntuación global de aberraciones cromosómicas (GCAS) mediante: (i) el análisis de una muestra biológica que comprende células tumorales obtenidas del sujeto para determinar si una pluralidad de loci cromosómicos distribuidos a lo largo del genoma muestran una aberración cromosómica seleccionada del grupo que consiste en desequilibrio alélico (NAI), pérdida de heterocigosidad (NLOH), aberraciones en el número de copias (NCNA), ganancia del número de copias (NCNG), disminución del número de copias (NCND) y combinaciones de los mismos, y (ii) la determinación del recuento en todo el genoma de los loci cromosómicos que muestran aberraciones cromosómicas en la muestra biológica en relación a un control, en el que la suma de las aberraciones cromosómicas individuales en la muestra biológica predice el resultado del tratamiento contra el cáncer del sujeto independientemente de la identificación de aberraciones cromosómicas específicas.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos para la prediccion de una respuesta contra el cancer

[0001] Los oncologos medicos se han beneficiado en gran medida de los esfuerzos relativamente recientes para diseccionar y comprender los elementos geneticos subyacentes del cancer en mamlferos. La identification de predisposiciones geneticas especlficas, tales como mutaciones en BRCA-1, BRCA2, y HER2, ha proporcionado information clave en los mecanismos subyacentes de la tumorigenesis y ha demostrado ser util para el diseno de nuevas generaciones de enfoques dirigidos para la intervention cllnica. Con la determination de la secuencia del genoma humano y las mejoras en las tecnologlas de secuenciacion y bioinformatica, se han convertido en posibles los analisis sistematicos de alteraciones geneticas en canceres humanos. Sin embargo, las intervenciones cllnicas en base a esta informacion se han visto gravemente obstaculizadas por el hecho de que a menudo solo un porcentaje de los pacientes respondera favorablemente a un tratamiento contra un cancer determinado. Actualmente, los oncologos medicos, en general, no pueden predecir que pacientes responderan o no a un tratamiento quimioterapeutico propuesto. En consecuencia, hay una gran necesidad en la tecnica para identificar la capacidad de respuesta del paciente a determinadas terapias contra el cancer.

[0002] El documento WO 2004/042032 describe anomallas citogeneticas en loci especlficos que se utilizan para predecir la respuesta al tratamiento de la leucemia linfocltica cronica.

[0003] El documento WO 2006/098978 describe un procedimiento de diagnostico para la identificacion de pacientes candidates para el tratamiento con trastuzumab.

[0004] El documento WO 2009/148528 describe la evaluation de alteraciones cromosomicas en loci geneticos especlficos para predecir el resultado cllnico del tratamiento con bortezomib.

[0005] Ferreira et al., Oncogene, vol. 27 (14), 27 de marzo de 2008, paginas 2084-2090, describe que la matriz (“array”) de CGH y elaboration de perfiles de expresion genetica revelan distintos patrones de inestabilidad genomica asociada con los mecanismos de reparation del ADN y los puntos de control del ciclo celular en el sarcoma de Ewing.

[0006] Etemadmoghadam et al., Clinical Cancer Research, vol. 15 (4), 15 de febrero de 2009, paginas 1417-1427, describe que el numero de copias de ADN integrado en todo el genoma y el analisis de expresion identifican mecanismos distintos de quimioresistencia primaria en carcinomas de ovario.

[0007] El documento WO 2011/048495 describe un procedimiento para predecir el beneficio de la terapia contra el cancer a traves dela matriz de hibridacion genomica comparativa.

[0008] La presente invention se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que ciertos patrones de aberraciones de ADN descritas en este documento son predictivos de la respuesta contra el cancer de las celulas que albergan tales aberraciones de ADN a las terapias contra el cancer.

[0009] Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion presenta un procedimiento (tal como se define en las reivindicaciones) para predecir el resultado del tratamiento contra el cancer de un sujeto con un trastorno hiperproliferativo celular, que comprende determinar una puntuacion de aberraciones cromosomicas globales (GCAS), que comprende todas las etapas citadas en la reivindicacion 1.

[0010] El sujeto puede ser un mamlfero, tal como un humano.

[0011] En un aspecto, el tratamiento contra el cancer es el tratamiento por quimioterapia. En otra realization, el tratamiento contra el cancer comprende agentes quimioterapeuticos basados en platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino e iproplatino).

[0012] En otro aspecto, el trastorno hiperproliferativo celular se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de ovario, cancer de vejiga de celulas transicionales, cancer de pulmon broncogenico, cancer de tiroides, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer de utero, cancer testicular, cancer gastrico, sarcomas de tejidos blandos y osteogenicos, neuroblastoma, tumor de Wilms, linfoma maligno (de Hodgkin y no Hodgkin), leucemia mieloblastica aguda, leucemia linfoblastica aguda, sarcoma de Kaposi, tumor de Ewing, mieloma multiple refractario, y carcinomas de celulas escamosas de la cabeza, el cuello, el cuello del utero y la vagina.

[0013] En aun otro aspecto, la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en celulas, llneas celulares, cortes histologicos, biopsias centrales congeladas, tejidos embebidos en parafina, tejidos fijados con formalina, biopsias, sangre completa, aspirado de pezon, suero, plasma, raspadura bucal, saliva, llquido cefalorraquldeo, orina, heces, y medula osea. En una realizacion, la muestra biologica se enriquece por la presencia de celulas hiperproliferativas hasta por lo menos el 75% de la poblacion total de celulas. En otra realizacion, el enriquecimiento se realiza segun al menos una tecnica seleccionada del grupo que consiste en microdiseccion con aguja,

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microdiseccion por laser, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia y clasificacion de celulas inmunologicas. En aun otra realizacion, una maquina automatizada realiza dicha al menos una tecnica para transformar as! la muestra biologica en una forma purificada enriquecida por la presencia de celulas hiperproliferativas. En aun otra realizacion, la muestra biologica se obtiene antes de que el sujeto haya recibido quimioterapia adyuvante. Alternativamente, la muestra biologica se obtiene despues de que el sujeto haya recibido quimioterapia adyuvante.

[0014] En aun otro aspecto, el control se determina a partir de una muestra de celulas no hiperproliferativas del paciente o miembro de la misma especie a la que pertenece el paciente. En una realizacion, el control se determina a partir de la frecuencia media de aparicion del locus genomico de regiones cromosomicas del mismo grupo etnico dentro de la especie a la que pertenece el paciente. En otra realizacion, el control proviene de tejido no canceroso que es el mismo tipo de tejido que dicho tejido canceroso del sujeto. En aun otra realizacion, el control proviene de tejido no canceroso que no es el mismo tipo de tejido que dicho tejido canceroso del sujeto.

[0015] En otro aspecto, el AI se determina usando una proporcion mayoritaria de copias (MCP). En una realizacion, el IA para una region genomica determinada se cuenta cuando MCP es mayor que 0,70.

[0016] En aun otro aspecto, la pluralidad de loci cromosomicos estan distribuidos al azar en todo el genoma al menos cada 100 Kb de ADN. En una realizacion, la pluralidad de loci cromosomicos comprende al menos un locus cromosomico en cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos. En otra realizacion, la pluralidad de loci cromosomicos comprende al menos un locus cromosomico en cada brazo de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos. En aun otra realizacion, la pluralidad de loci cromosomicos comprenden al menos un locus cromosomico en al menos un telomero de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos. En aun otra realizacion, la pluralidad de loci cromosomicos comprende al menos un locus cromosomico en cada telomero de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos.

[0017] En aun otro aspecto, las aberraciones cromosomicas tienen un tamano de segmento mlnimo de al menos 1 Mb. En una realizacion, las aberraciones cromosomicas tienen un tamano de segmento mlnimo de al menos 12 Mb.

[0018] En otro aspecto, la pluralidad de aberraciones cromosomicas comprende al menos 5 aberraciones cromosomicas. En una realizacion, la pluralidad de aberraciones cromosomicas comprende al menos 13 aberraciones cromosomicas.

[0019] En aun otro aspecto, los loci cromosomicos se seleccionan del grupo que consiste en polimorfismos de nucleotido unico (SNP), polimorfismos de longitud de fragmento de restriccion (RFLP), y repeticiones en tandem simples (STR).

[0020] En aun otro aspecto, los loci cromosomicos se analizan usando al menos una tecnica seleccionada del grupo que consiste en sonda de inversion molecular (MIP), matriz de polimorfismos de nucleotido unico (SNP), hibridacion in situ, transferencia Southern, matriz de hibridacion genomica comparada (aCGH) y la secuenciacion de proxima generacion.

[0021] En otro aspecto, el resultado del tratamiento se mide mediante al menos un criterio seleccionado del grupo que consiste en la supervivencia hasta la mortalidad, respuesta patologica completa, mediciones semicuantitativas de la respuesta patologica, remision cllnica completa, remision cllnica parcial, enfermedad cllnica estable, supervivencia libre de recurrencia, supervivencia libre de metastasis, supervivencia libre de enfermedad, disminucion de celulas tumorales circulantes, respuesta del marcador circulante y criterios RECIST.

[0022] En aun otro aspecto, el procedimiento comprende ademas la determinacion de un regimen de tratamiento adecuado para el sujeto. En una realizacion, el regimen de tratamiento adecuado comprende al menos un agente quimioterapeutico basado en platino cuando se determina una pluralidad de aberraciones cromosomicas genomicas o no comprende al menos un agente quimioterapeutico basado en platino cuando no se determina una pluralidad de aberraciones cromosomicas genomicas.

Breve descripcion de los dibujos

[0023]

Las figuras 1A-1C muestran la correlacion entre las regiones de desequilibrio alelico (AI) y la sensibilidad al cisplatino in vitro. La figura 1A muestra curvas dosis-respuesta de seis llneas celulares TNBC tal como se determina por un ensayo de proliferacion despues de 48 horas de exposicion a cisplatino. Las curvas para celulas con valores de IC50 inferiores (mayor sensibilidad) se muestran en azul; la llnea celular con la mayor IC50 (mayor resistencia) se muestra en rojo; las llneas celulares con una sensibilidad intermedia se muestran en gris. La Figura 1B muestra el efecto del umbral de tamano de segmento de AI sobre la correlacion entre el numero de regiones de AI telomerico y la sensibilidad a cisplatino en las seis llneas celulares. Cada punto representa un valor R2 basado en la regresion lineal entre el numero de regiones CNA de un tamano mlnimo indicado en el eje X, y IC50 de cisplatino en un panel de 6 llneas celulares de 6 TNBC (BT20, BT-549, HCC1187, HCC38, MDA-MB-231, MDA-MB-468). El umbral de

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tamano de segmento mlnimo optimo se indica por la ilnea de puntos. La Figura 1C muestra una comparacion entre el numero de regiones de AI telomerico (NtAi,i2) y la sensibilidad a cisplatino en el umbral optimo seleccionado de 12 Mb. Las llneas celulares se indican de la siguiente manera: 1, BT-20; 2, BT-549; 3, HCC1187; 4, HCC38; 5, MDA- MB-231; 6, MDA-MB-468.

Las figuras 2A-2C muestran que el analisis de la proporcion mayoritaria de copias (MCP) identifica el desequilibrio alelico en muestras de biopsia de tumores con diferentes grados de pureza de las celulas tumorales. La Figura 2A muestra la formula para el calculo de MCP, as! como los cromosomas bialelicos normales y tres maneras diferentes en las que se puede producir el desequilibrio alelico de una region cromosomica y el calculo de MCP correspondiente. Las Figuras 2B y 2C muestran diagramas que representan la observacion de la perdida de heterocigosidad (LOH), AI determinado por MCP, y el analisis del numero absoluto de copias en dos muestras de tumores con diferentes grados de contaminacion celular normal: T7 con un contenido de celulas tumorales > 95% (Figura 2B) y T5 con un contenido de tumor de aproximadamente el 80% (Figura 2C). Los cromosomas se indican a lo largo de la parte izquierda. Las primeras columnas para cada tumor muestran las celulas para LOH (azul) y la retencion de la heterocigosidad (amarillo) en cada posicion de cromosoma. La segunda columna muestra los niveles de MCP (entre 0,5 y 1,0) en cada posicion cromosomica. El corte de MCP de 0,7 se indica con llneas rojas. El AI se pronostica para las regiones con MCP superiores a 0,7. La tercera y cuarta columnas muestran el numero absoluto de copias de ADN en cada posicion, indicando el blanco el diploide, indicando los tonos de rojo la ganancia de copias e indicando los tonos de azul la perdida de copias. Los niveles del numero de copias se muestran en los paneles de mas a la derecha. La muestra de tumor con mayor pureza (T7 en la Figura 2B), muestra una concordancia entre la LOH y las celulas con AI determinado por MCP. En la muestra de tumor con solo un 80% de celulas tumorales, se pierde la senal LOH, pero AI todavla se puede estimar mediante MCP con un umbral de 0,70. Las figuras 3A-3D muestran la asociacion entre la sensibilidad a cisplatino y el numero de alteraciones genomicas en un panel de llneas celulares TNBC. La figura 3A muestra la IC50 de cisplatino frente al numero de regiones AI telomericas de al menos 1 Mb de largo con AI definido por MCP > 0,7. La Figura 3B muestra IC50 de cisplatino frente al recuento de las regiones con aberracion en el numero de copias, incluyendo las ganancias y las perdidas, de al menos 1 Mb de largo. La figura 3C muestra IC50 de cisplatino frente al recuento de las regiones con una ganancia del numero de copias, de al menos 1 Mb de largo. La Figura 3D muestra IC50 de cisplatino frente al recuento de las regiones con una perdida del numero de copias, de al menos 1 Mb largos. Las llneas de celulas se indican en cada figura y son las mismas que en la figura 1.

Las figuras 4A-4B muestran la asociacion entre la sensibilidad a cisplatino y el recuento de regiones de AI telomerico o intersticial en un panel de llneas celulares TNBC. La figura 4A muestra IC50 de cisplatino frente al numero de regiones de AI telomerico de al menos 1 Mb de largo con AI definido por MCP > 0,7. La figura 4B muestra IC50 de cisplatino frente a varias regiones de AI intersticiales de al menos 1 Mb de largo con AI definido por MCP > 0,7. Las llneas celulares se indican en cada figura y son las mismas que en la figura 1.

Las figuras 5A-5F muestran la asociacion entre las aberraciones del numero de copias (CNA) enumeradas y la sensibilidad al cisplatino in vitro. Las figuras 5A-5C muestran la determinacion del tamano de segmento mlnimo que demuestra la mejor correlacion con la sensibilidad a cisplatino para el numero aberraciones del numero de copias (NCNA; Figura 5A), el numero de regiones con ganancia del numero de copias (NCNA, ganancia; figura 5B), y el numero de regiones con perdida del numero de copias (NCNA, perdida; Figura 5C). Cada punto representa un valor R2 basado en la regresion lineal entre el recuento de regiones de CNA de un tamano mlnimo indicado en el eje X, y IC50 de cisplatino en un panel de 6 llneas celulares TNBC (BT20, BT-549, HCC1187, HCC38, MDA-MB-231, MDA- MB-468). El tamano mlnimo optimo de regiones de CNA se indica por la llnea de puntos. Las Figuras 5D-5F muestran representaciones de los valores de IC50 de cisplatino (pM, eje X) frente al numero de regiones de CNA con tamanos de segmento mlnimo optimos (eje Y) tal como se indica a continuacion: NCNA de al menos 9 Mb de largo (figura 5D), NCNA, ganancia, de al menos 9 Mb de largo (Figura 5E), y NCNA, perdida, de al menos 5 Mb de largo, en 6 llneas celulares TNBC (Figura 5F), tal como se indica.

Las figuras 6A-6C muestran regiones AI y respuesta a cisplatino en cancer de mama. La respuesta patologica a cisplatino se evaluo mediante la puntuacion de Miller-Payne (MP), que puede variar de 0 (progresion) a 5 (respuesta patologica completa, pCR). Higo. La figura 6A muestra representaciones de genomas de tumores individuales dispuestos en orden creciente de puntuacion de MP. Se indican las regiones de AI telomerico (azul oscuro) y AI intersticial (azul claro), con finas llneas blancas delimitando los cromosomas individuales. La figura 6B muestra la asociacion entre la puntuacion MP y NtAI,12. La Figura 6C muestra una curva de caracterlsticas de operation del receptor (ROC) para evaluar el rendimiento de NtAI,12 para predecir la pCR al tratamiento con cisplatino (pCR, n = 4; no pCR, n = 20).

La figura 7 muestra el desequilibrio alelica del cromosoma completo (isodisomla) y la sensibilidad a cisplatino en los canceres de mama. Las regiones de AI del cromosoma completo se indican en rojo para cada localization cromosomica. Cada fila definida por las llneas blancas finas representa un cromosoma diferente y los numeros de cromosoma se indican a lo largo dela parte izquierda. Cada columna representa una muestra de tumor individual. La puntuacion de respuesta patologica de Miller-Payne (MP) para cada tumor se indica en la parte inferior. Los casos estan dispuestos en orden creciente de respuesta patologica al cisplatino (0 = progresion, 5 = respuesta patologica completa (pCR)).

Las figuras 8A-8B muestran regiones AI y el tiempo hasta la recalda en el cancer de ovario seroso tratado con terapia basada en platino. La figura 8A muestra un rango de individuos segun el aumento de NtAI,12. Los que recayeron en menos de un ano se indican con clrculos solidos y los que no experimentaron recalda en menos de un ano se indican con clrculos no solidos. El valor de corte de NtAI,12 = 13, basado en el analisis ROC de TNBC para la prediction de la respuesta patologica completa (pCR) a cisplatino, esta indicado por la llnea de puntos. La Figura

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8B muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para el tiempo hasta la recalda en individuos clasificados como NtAI,12 alto (regiones de Nai,12 13 o mayor, azul) o NtAI,12 bajo (regiones de NtAI,12 de menos de 13, rojo).

La figura 9 muestra un modelo que relaciona la reparacion del ADN a la acumulacion de AI y la respuesta a los agentes de platino. Diversas lesiones geneticas pueden dar lugar a defectos en los mecanismos comunes de la reparacion del ADN, lo que lleva primero a la reparacion de roturas espontaneas de ADN, a continuation, la recombination ilegltima de cromosomas y la formation de cromosoma cuadriradial aberrante, y, finalmente, a altos niveles de desequilibrio alelico telomerico. En paralelo, el mecanismo de reparacion del ADN defectuoso tambien puede dar lugar a la incapacidad de la celula tumoral de reparar el dano del ADN inducido por farmacos, lo que conduce a la sensibilidad del tumor a farmacos, tales como las sales de platino. Por lo tanto, el nivel de AI telomerico en un tumor sirve como un indicador de la reparacion del ADN defectuoso y predice la sensibilidad al tratamiento con agentes genotoxicos.

Descripcion detallada de la invencion

[0024] La presente invencion se refiere a procedimientos para predecir la respuesta de un cancer en un sujeto a las terapias contra el cancer basadas en la determination y el analisis de una puntuacion global de aberration cromosomica (GCAS).

I. Determinacion de la puntuacion global de aberracion cromosomica (GCAS)

[0025] Segun un aspecto de la invencion, la GCAS es una medicion predictiva de la capacidad de respuesta a las terapias contra el cancer de un cancer en un sujeto. Esta utilidad de GCAS se basa en el hallazgo novedoso de que la suma de las aberraciones cromosomicas individuales puede predecir la capacidad de respuesta de un cancer en un sujeto a los agentes contra el cancer independientemente de identificar aberraciones cromosomicas especlficas. Se utilizan loci informativos de interes (por ejemplo, polimorfismos de nucleotido unico (SNP), polimorfismos de longitud de fragmento de restriction (RFLp), repeticiones en tandem simples (STRs), etc.), para determinar GCAS, ya que son utiles para detectar y/o distinguir aberraciones cromosomicas (por ejemplo, desequilibrio alelico, perdida de heterocigosidad, cambio del numero total de copias, ganancia del numero de copias y perdida del numero de copias).

[0026] La GCAS se determina mediante la determinacion de una pluralidad o el numero total de regiones cromosomicas que presentan desequilibrio alelico (Nai), la perdida de heterocigosidad (LOH), aberraciones del numero de copias (Ncna), ganancia del numero de copias (Ncng), y/o la perdida del numero de copias (Ncnd), tal como se describe adicionalmente en este documento y segun procedimientos bien conocidos en la tecnica. Una GCAS de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 o mas es predictivo de la respuesta a la terapia contra el cancer de la celula cancerosa de la que se derivaba el acido nucleico ensayado.

[0027] En una realization, el analisis se basa en los acidos nucleicos obtenidos de un sujeto y/o muestra de control. Dichas muestras pueden incluir "fluidos corporales", que se refieren a los fluidos que se excretan o secretan del cuerpo, as! como los fluidos que normalmente no lo hacen (por ejemplo, llquido amniotico, humor acuoso, bilis, sangre y plasma sangulneo, llquido cefalorraquldeo, cerumen y cera de los oldos, fluido de Cowper o pre- eyaculatorio, quilo, quimo, heces, eyaculado femenino, llquido intersticial, llquido intracelular, linfa, menstruation, leche materna, moco, llquido pleural, pus, saliva, sebo, semen, suero, sudor, llquido sinovial, lagrimas, orina, lubrication vaginal, humor vltreo, vomito). En una realizacion preferida, el sujeto y/o muestra de control se seleccionan del grupo que consiste en celulas, llneas celulares, cortes histologicos, tejidos embebidos en parafina, biopsias, sangre completa, aspirado de pezon, suero, plasma, raspado bucal, saliva, llquido cefalorraquldeo, orina, heces y medula osea.

[0028] En una realizacion, se utilizan SNP en la determinacion de GCAS para predecir la capacidad de respuesta de un cancer a una terapia contra el cancer. Hay seis tipos posibles de SNP, ya sean transiciones (A <> T o G <> C) o transversiones (A <> G, A <> C, G <> T o C <> T). Los SNP son ventajosos en que se pueden identificar grandes cantidades.

[0029] En algunas realizaciones, los SNP u otros loci genomicos se puede puntuar para detectar anomallas en el numero de copias. En tales casos, dichos loci genomicos no necesitan ser informativos en terminos de genotipo, ya que el numero de copias se determina mediante las intensidades de hibridacion y no depende del genotipo. Ademas, las anomallas del numero de copias se pueden detectar usando procedimientos que no utilizan SNP, tales como, por ejemplo, una matriz de CGH utilizando BAC, cDNA y/o grupos de oligonucleotidos.

[0030] Por ejemplo, los procedimientos para evaluar el numero de copias de acido nucleico en una muestra incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en hibridacion. Un procedimiento para evaluar el numero de copias del acido nucleico codificante en una muestra implica una transferencia Southern. En una transferencia Southern, el ADN genomico (habitualmente fragmentado y separado en un gel electroforetico) se hibrida con una sonda especlfica para la region diana. La comparacion de la intensidad de la senal de hibridacion de la sonda para la region diana con

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la senal de sonda de control a partir del analisis de ADN genomico normal (por ejemplo, una parte no amplificada del mismo o celula, tejido, organo, etc. relacionados) proporciona una estimacion del numero relativo de copias del acido nucleico diana. Alternativamente, se puede utilizar una transferencia Northern para evaluar el numero de copias del acido nucleico codificante en una muestra. En una transferencia Northern, el ARNm se hibrida con una sonda especlfica para la region diana. La comparacion de la intensidad de la senal de hibridacion de la sonda para la region diana con la senal de sonda de control a partir del analisis de ARNm normal (por ejemplo, una parte no amplificada del mismo o celula, tejido, organo, etc. relacionados) proporciona una estimacion del numero relativo de copias del acido nucleico diana. Se pueden realizar procedimientos similares para determinar el numero de copias utilizando matrices de transcripcion que son bien conocidos en la tecnica.

[0031] Un medio alternativo para la determinacion del numero de copias es la hibridacion in situ (por ejemplo, Angerer (1987) Meth Enzymol 152: 649). En general, la hibridacion in situ comprende las siguientes etapas: (1) fijacion del tejido o de la estructura biologica a analizar; (2) tratamiento previo a la hibridacion de la estructura biologica para aumentar la accesibilidad del ADN diana, y para reducir la union no especlfica; (3) hibridacion de la mezcla de acidos nucleicos con el acido nucleico en la estructura o tejido biologico; (4) lavados posteriores a la hibridacion para eliminar fragmentos de acido nucleico no unidos en la hibridacion y (5) deteccion de los fragmentos de acido nucleico hibridados. El reactivo utilizado en cada una de estas etapas y las condiciones de uso varlan dependiendo de la aplicacion particular.

[0032] Los ensayos basados en hibridacion preferidos incluyen, pero sin limitarse a, procedimientos tradicionales de "sonda directa", tales como transferencias Southern o hibridacion in situ (por ejemplo, FISH y FISH mas SKY), y los procedimientos de "sonda comparativa", tales como hibridacion genomica comparada (CGH), por ejemplo, CGH basada en ADNc o basada en oligonucleotidos. Los procedimientos se pueden utilizar en una amplia variedad de formatos, incluyendo, pero sin limitarse a, procedimientos de union a sustrato (por ejemplo, membrana o vidrio) o estrategias basadas en matrices.

[0033] En un ensayo de hibridacion in situ tlpico, las celulas se fijan a un soporte solido, habitualmente un portaobjetos de vidrio. Si se debe sondar un acido nucleico, las celulas habitualmente se desnaturalizan con calor o alcali. Las celulas se ponen en contacto a continuation con una solution de hibridacion a una temperatura moderada para permitir la hibridacion de sondas marcadas especlficas a la secuencia de acido nucleico que codifica la protelna. Las dianas (por ejemplo, celulas) a continuacion habitualmente se lavan a una rigurosidad predeterminada o a una rigurosidad creciente hasta que se obtiene una relation de senal a ruido apropiada.

[0034] Las sondas se marcan habitualmente, por ejemplo, con radioisotopos o indicadores fluorescentes. Las sondas preferidas son suficientemente largas para hibridarse especlficamente con el acido o acidos nucleicos diana en condiciones rigurosas. El intervalo de tamano preferido es de aproximadamente 200 bases a aproximadamente 1000 bases.

[0035] En algunas aplicaciones, es necesario bloquear la capacidad de hibridacion de secuencias repetitivas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, ARNt, ADN genomico humano, o ADN Cot-I se utilizan para bloquear la hibridacion no especlfica.

[0036] En los procedimientos de CGH, se marca una primera coleccion de acidos nucleicos (por ejemplo, de una muestra, por ejemplo, un posible tumor) con un primer marcador, mientras que una segunda coleccion de acidos nucleicos (por ejemplo, un control, por ejemplo, una celula/tejido sano) se marca con un segundo marcador. Se determina la proportion la proportion de hibridacion de los acidos nucleicos mediante la proportion de los dos marcadores (primero y segundo) que se unen a cada fibra en la matriz. Donde hay deleciones o multiplicaciones cromosomicas, se detectaran diferencias en la proporcion de las senales de los dos marcadores y la proporcion proporcionara una medida del numero de copias. La CGH basada en una matriz tambien se puede realizar con marcaje de un solo color (en lugar de marcar el control y la posible muestra de tumor con dos colorantes diferentes y mezclarlos antes de la hibridacion, lo que producira una proporcion debido a la hibridacion competitiva de sondas en las matrices). En CGH de un solo color, el control se marca y se hibrida con una matriz y se leen las senales absolutas, y la posible muestra de tumor se marca y se hibrida con una segunda matriz (con identico contenido) y se leen las senales absolutas. Se calcula la diferencia en el numero de copias en base a las senales absolutas de las dos matrices. Se describen protocolos de hibridacion adecuados para su uso con los procedimientos de la invention, por ejemplo, en Albertson (1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 9138-9142; EPO Pub. N° 430.402; Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed, Humana Press, Totowa, NJ (1994), etc. En una realization, se utiliza el protocolo de hibridacion de Pinkel, et al. (1998) Nature Genetics 20: 207-211, o de Kallioniemi (1992) Proc. Natl Acad Sci USA. 89: 5321-5325 (1992).

[0037] Los procedimientos de la invencion estan particularmente bien adaptados a los formatos de hibridacion basados en matrices. La CGH basada en una matriz se describe en la patente de Estados Unidos N° 6.455.258.

[0038] En aun otra realizacion, se pueden utilizar ensayos basados en la amplification para medir el numero de copias. En tales ensayos basados en la amplificacion, las secuencias de acidos nucleicos actuan como una plantilla en una reaction de amplificacion (por ejemplo, reaction en cadena de la polimerasa (PCR)). En una amplificacion

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cuantitativa, la cantidad de producto de amplificacion sera proporcional a la cantidad de plantilla en la muestra original. La comparacion con los controles adecuados, por ejemplo, tejido sano, proporciona una medida del numero de copias.

[0039] Los procedimientos de amplificacion "cuantitativa" son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, una PCR cuantitativa implica la coamplificacion simultanea de una cantidad conocida de una secuencia de control usando los mismos cebadores. Esto proporciona un patron interno que puede usarse para calibrar la reaccion de PCR. Los protocolos detallados para la PCR cuantitativa se proporcionan en Innis, et al. (1990) PRC Protocol, A guide to methods and application, Academic Press, Inc. NY). La medicion del numero de copias de ADN en los loci de microsatelites utilizando analisis de PCR cuantitativa se describe en Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60: 5405-5409. La secuencia nucleica conocida para los genes es suficiente para permitir a un experto en la materia seleccionar de forma rutinaria cebadores para amplificar cualquier parte del gen. Tambien se puede usar PCR cuantitativa fluorogenica en los procedimientos de la invencion. En la PCR cuantitativa fluorogenica, la cuantificacion se basa en la cantidad de senales de fluorescencia, por ejemplo, TaqMan y verde sybr.

[0040] Otros procedimientos de amplificacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, reaccion en cadena de la ligasa (LCR) (vease Wu y Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al (1988) Science 241: 1077, y Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), amplificacion de la transcripcion (Kwoh, et al. (1989). Proc Natl Acad Sci USA. 86: 1173), replicacion de secuencia autosostenida (Guatelli, et al. (1990), Proc Nat Acad Sci USA. 87: 1874), PCR de puntos y PCR con adaptador enlazador, etc.

[0041] En aun otras realizaciones de los procedimientos proporcionados en este documento, se realiza la secuenciacion por separado de las moleculas nucleicas individuales (o sus productos de amplificacion), como una alternativa a los ensayos basados en hibridacion, usando tecnicas de secuenciacion de acido nucleico. En una realizacion, se utiliza una tecnica de secuenciacion en paralelo de alto rendimiento que alsla moleculas de acido nucleico individuales de una poblacion de moleculas de acido nucleico antes de la secuenciacion. Dichas estrategias utilizadas se llaman "sistemas de secuenciacion de proxima generacion", incluyendo, sin limitacion, maquinas de secuenciacion y/o estrategias bien conocidas en la tecnica, tales como las desarrollados por Illumina/Solexa (el analizador Genoma; Bennett et al (2005) Pharmacogenomics, 6: 373-382), por Applied Biosystems, Inc. (el secuenciador SOLiD; solid.appliedbiosystems.com), por Roche (por ejemplo, el secuenciador 454 GS FLX; Margulies et al (2005). Nature, 437: 376-380; patente de Estados Unidos N° 6.274.320; 6.258.568; 6.210.891), mediante el sistema Heliscope® de Helicos Biosciences (vease, por ejemplo, publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos N° 2007/0070349), y por otros. Todas las estrategias de determinacion del numero de copias descritas en el presente documento se pueden aplicar de manera similar a cualquiera de otros analisis basados en acidos nucleicos descritos en este documento, tales como para loci informativo y similares descritos mas adelante.

[0042] En otras realizaciones, los SNP se puede valorar para heterocigosidad o ausencia de heterocigosidad. Tecnicas, como el analisis de la proportion mayoritaria de copias, utilizan la information del desequilibrio alelico y el numero de copias para ampliar los analisis que se pueden realizar con el numero de copias de sucesos LOH solos, ya que pueden implicar sucesos de elimination, ganancia o ninguna variation del numero de copias elimination.

[0043] En otras realizaciones, para determinar la GCAS de un cancer en un sujeto, se identifican los SNP heterocigotos localizados en todo el genoma usando muestras de acido nucleico derivadas de tejido no canceroso del sujeto o una poblacion de sujetos de una misma especie, y se determina el numero de los SNP heterocigotos identificados que mantienen la heterocigosidad (o, alternativamente, no exhiben heterocigosidad, es decir, han perdido la heterocigosidad) en una muestra de acido nucleico de, o derivado de, ADN genomico de tejido canceroso del sujeto. Una muestra de acido nucleico "derivado de" ADN genomico incluye, pero no se limita a, pre-ARN mensajero (que contiene intrones), productos de amplificacion de ADN genomico o pre-ARN mensajero, fragmentos de ADN genomico opcionalmente con oligonucleotidos adaptadores ligados al mismo o presentes en vectores de donation u otros vectores, etc. (los intrones y regiones no codificantes no deben ser eliminados de forma selectiva).

[0044] Todos los SNP conocidos que muestran heterocigosidad en la especie a la que el sujeto con cancer pertenece, no deben incluirse en el numero de SNP heterocigotos utilizados. En algunas realizaciones, se utilizan al menos 250, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000,

14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000, 21.000, 22.000, 23.000, 24.000, 25.000, 26.000, 27.000,

28.000, 29.000, 30.000, 31.000, 32.000, 33,000,34,000, 35.000, 36.000, 37.000, 38.000, 39.000, 40.000, 41.000,

42.000, 43.000, 44.000, 45.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 150.000, 200.000, 250.000,

300.000, 350.000, 400.000, 450.000, 500.000, 550.000, 600.000, 650.000, 700.000, 750.000, 800.000, 850.000,

900.000, 950.000, 1.000.000 SNPs o mas o en cualquier intervalo intermedio o en otros loci informativos de interes (por ejemplo, RFLP, STR, etc.). Preferiblemente, dichos SNP estan en el genoma humano. En una realizacion, la pluralidad de SNP heterocigotos estan distribuidos al azar en todo el genoma al menos cada 1, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 5.000, 10.000 kb o mas, o cualquier intervalo intermedio. Por "distribuido al azar", como se usa anteriormente, se entiende que los SNP de la pluralidad no se selecciona por predisposition hacia cualquier locus o loci cromosomicos especlficos; sin embargo, se pueden utilizar otras preferencias (por ejemplo, evitar secuencias de ADN repetitivas) en la selection de los SNP. En otras realizaciones, la pluralidad de SNP heterocigotos no estan distribuidos al azar en todo el genoma (es decir, distribuidos dentro de al menos 250,

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18.000, 19.000, 20.000, 21.000, 22.000, 23.000, 24.000, o 25.000 kb = 25 Mb). Dichas regiones pueden ademas estar predispuestas, en algunas realizaciones, a regiones cromosomicas especlficas, tales como telomeros, definidas como regiones que se extienden hacia el telomero pero que no cruzan el centromero. En una realizacion, el tamano de segmento telomerico con desequilibrio alelico es de al menos 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 11 Mb, 12 Mb, 13 Mb, 14 Mb, 15 Mb, 16 Mb, 17 Mb, 18 Mb, 19 Mb, 20 Mb, 21 Mb, 22 Mb, 23 Mb, 24 Mb, 25 Mb o mas, o cualquier intervalo intermedio, como por ejemplo entre 5 y 25 Mb. En otra realizacion, el tamano de segmento telomerico con desequilibrio alelica es de 12 Mb. Por el contrario, las regiones intersticiales no implican el telomero. Las regiones intersticiales se definen en el presente documento como regiones de desequilibrio alelico que comienzan en direccion 3' del telomero, lo que significa que hay al menos una parte del cromosoma sin desequilibrio alelico entre el telomero y la region de desequilibrio alelico. En una realizacion, la pluralidad de SNP heterocigotos no se encuentra en regiones de ADN genomico que son repetitivas. En otra realizacion, la pluralidad de SNP heterocigotos comprende SNP situados en el genoma en diferentes loci cromosomicos, en el que los diferentes loci cromosomicos comprenden loci en cada uno de los cromosomas de la especie, o en cada brazo de cada cromosoma de la especie (por ejemplo, region telomerica del mismo).

[0045] Los SNP heterocigotos que se puede utilizar en los procedimientos de la invencion para determinar el fenotipo de un cancer son informativos, lo que significa que se observa heterocigosidad en la muestra de acido nucleico de tejidos y/o celulas no cancerosos de un sujeto. Segun los procedimientos de la invencion, estos SNP informativos se examinan en la muestra de acido nucleico de un tejido y/o celulas cancerosas de un sujeto para determinar la GCAS.

[0046] En una realizacion adicional, las muestras de acido nucleico usadas para determinar el numero de SNP heterocigotos en la pluralidad de SNP, que muestran heterocigosidad en el ADN genomico de tejido no canceroso de la especie a la que pertenece el paciente de cancer, se toman de al menos 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, o 250 organismos diferentes de esa especie. Un experto en la materia podra entender que se pueden determinar controles adecuados en base a la frecuencia promedio de alelos SNP que existen dentro del mismo grupo etnico de la especie a la que pertenece el paciente.

[0047] En ciertas realizaciones, los SNP informativos utilizados en los procedimientos de la invencion para determinar y/o predecir el fenotipo de un cancer comprenden al menos un SNP en cada cromosoma de un sujeto (por ejemplo, una region telomerica de cada cromosoma). En una realizacion relacionada, los SNP informativos utilizados en los procedimientos de la invencion para determinar y/o predecir el fenotipo de un cancer comprenden al menos un SNP en cada brazo de cada cromosoma de un sujeto (por ejemplo, una region telomerica de cada brazo de cada cromosoma).

II. Prediccion de la respuesta a la terapia

[0048] En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona procedimientos para determinar el fenotipo de un cancer, en el que el fenotipo es la respuesta a la terapia. La terapia puede ser cualquier terapia contra el cancer, incluyendo, pero no limitado a, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, inhibidores de moleculas pequenas, shARN, hormonal, y combinaciones de los mismos.

[0049] Cuando GCAS representa deleciones de copias, ganancia de copias, perdidas de cromosomas enteros, ganancias de cromosomas enteros y/o perdida de heterocigosidad, los sujetos cuyo tejido canceroso muestra una GCAS por debajo de un valor umbral se predice que tienen una peor respuesta al tratamiento (por ejemplo, radiacion o quimioterapia) que aquellos con una GCAS alta (por encima del valor umbral). Cuando la GCAS representa la falta de copias o cambios en el numero de cromosomas y/o retencion de heterocigosidad, los sujetos cuyo tejido canceroso muestra una GCAS por encima de un valor umbral se predice que tienen una peor respuesta al tratamiento (por ejemplo, radiacion o quimioterapia) que aquellos con una GCAS baja (por debajo del valor umbral).

[0050] A modo de explicacion, pero sin pretender imponer ninguna teorla, se cree que cuando el valor de GCAS representa la perdida de heterocigosidad o desequilibrio alelico, se identifican celulas que albergan roturas de la doble cadena de ADN cromosomico reparado incorrectamente y el recuento en todo el genoma de estos reordenamientos cromosomicos en un tumor especlfico indica el grado de incompetencia en la reparacion del ADN, independientemente del defecto causante especlfico de la reparacion del ADN. En estos sujetos, el numero total de reordenamientos cromosomicos en un tumor indica la incapacidad de reparar el dano en el ADN inducido por las terapias contra el cancer, y en consecuencia predice la sensibilidad a este tipo de terapias contra el cancer. Tambien a modo de explicacion y sin pretender imponer ninguna teorla, se cree que la GCAS que representa las ganancias de copias puede indicar defectos geneticos distintos o adicionalmente a los defectos de reparacion del ADN y que la GCAS que representa la perdida o ganancia del cromosoma entero puede indicar defectos de verificacion mitotica o defectos en la segregacion de cromosomas, y similares. Se ha determinado que tales aberraciones en la reparacion fiel de ADN, la segregacion, el control del punto de verificacion, etc. son predictivas de las celulas que albergan tales aberraciones al tratamiento con terapias contra el cancer (por ejemplo, agentes quimioterapeuticos) en sujetos.

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[0051] La respuesta a las terapias contra el cancer se refiere a cualquier respuesta del tumor a la quimioterapia, preferiblemente a un cambio en la masa y/o el volumen del tumor despues de la iniciacion de la quimioterapia neoadyuvante o adyuvante. La respuesta del tumor puede evaluarse en un entorno neoadyuvante o adyuvante en la que se puede comparar el tamano de un tumor despues de una intervencion sistemica con el tamano y las dimensiones iniciales medidas por CT, PET, mamografla, ecografla o palpacion y se puede estimar la celularidad de un tumor histologicamente y compararse con la celularidad de una biopsia de tumor antes de iniciar el tratamiento. La respuesta tambien puede evaluarse por medicion del calibre o examen patologico del tumor despues de la biopsia o reseccion quirurgica. La respuesta puede registrarse de forma cuantitativa como el cambio porcentual en el volumen del tumor o la celularidad o utilizando un sistema de puntuacion semicuantitativo, tal como la carga de cancer residual (Symmans et al., J. Clin Oncol (2007) 25: 4.414 a 4.422) o la puntuacion de Miller-Payne (Ogston et al, Breast (Edimburgo, Escocia) (2003). 12: 320-327) de una manera cualitativa como la "respuesta patologica completa" (pCR), "remision cllnica completa" (cCR), " remision cllnica parcial "(cPR)," enfermedad cllnica estable" (cSD)," enfermedad cllnica progresiva" (cPD) u otros criterios cualitativos. La evaluacion de la respuesta del tumor puede llevar a cabo poco despues de la aparicion de la terapia neoadyuvante o adyuvante, por ejemplo, despues de unas horas, dlas, semanas o preferiblemente despues de unos meses. Un punto final tlpico para la evaluacion de la respuesta es tras la terminacion de la quimioterapia neoadyuvante o tras la extirpacion quirurgica de las celulas tumorales residuales y/o el lecho del tumor.

[0052] Los criterios adicionales para evaluar la respuesta a las terapias contra el cancer estan relacionados con la "supervivencia", que incluye todas las caracterlsticas siguientes: la supervivencia hasta la mortalidad, tambien conocida como la supervivencia global (en la que dicha mortalidad puede ser independiente de la causa o relacionado con el tumor); "supervivencia libre de recurrencia" (en la que el termino recurrencia incluira tanto la recurrencia localizada como distante); supervivencia libre de metastasis; supervivencia libre de enfermedad (en la que el termino enfermedad incluira el cancer y las enfermedades asociadas con el mismo). El tiempo de dicha supervivencia puede calcularse en referencia a un punto de inicio definido (por ejemplo, tiempo de diagnostico o inicio del tratamiento) y un punto final (por ejemplo, la muerte, la recurrencia o metastasis). Ademas, los criterios de eficacia del tratamiento se pueden ampliar para incluir la respuesta a la quimioterapia, la probabilidad de supervivencia, la probabilidad de metastasis dentro de un perlodo de tiempo determinado, y la probabilidad de recurrencia del tumor.

[0053] Por ejemplo, con el fin de determinar los valores umbral apropiados, se puede administrar un regimen terapeutico contra el cancer particular a una poblacion de sujetos y el resultado puede correlacionarse con la de GCAs que se determinaron antes de la administracion de cualquier terapia contra el cancer. La medicion de los resultados puede ser la respuesta patologica al tratamiento proporcionado en el entorno neoadyuvante. Alternativamente, las mediciones del resultado, tales como la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad, pueden monitorizarse durante un periodo de tiempo en los sujetos despues de la terapia contra el cancer para los que se conocen los valores de GcAS. En ciertas realizaciones, se administran las mismas dosis de agentes contra el cancer a cada sujeto. En realizaciones relacionadas, las dosis administradas son dosis estandar conocidas en la tecnica para agentes contra el cancer. El perlodo de tiempo durante el cual se supervisan los sujetos puede variar. Por ejemplo, los sujetos se pueden monitorizar durante al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 meses. Los valores umbral de GCAS que se correlacionan con el resultado de una terapia contra el cancer se pueden determinar usando procedimientos tales como los descritos en la seccion de Ejemplos.

III. Agentes terapeuticos contra el cancer

[0054] La eficacia de las terapias contra el cancer que danan el ADN, as! como agentes que se aprovechan de los defectos de reparacion del ADN, pero no danan el ADN por si mismos, tales como inhibidores de la poli ADP ribosa polimerasa (PARP), as! como la quimioterapia o terapia de radiacion, se preve segun el nivel de GCAS de un cancer en un sujeto segun los procedimientos descritos en el presente documento.

[0055] En una realization, se predice la eficacia de la quimioterapia. La quimioterapia incluye la administracion de un agente quimioterapeutico. Dicho agente quimioterapeutico puede ser, pero no se limita a, los seleccionados entre los siguientes grupos de compuestos: compuestos de platino, antibioticos citotoxicos, antimetabolitos, agentes anti- mitoticos, agentes alquilantes, compuestos de arsenico, inhibidores de la ADN topoisomerasa, taxanos, analogos de nucleosidos, alcaloides de plantas, y toxinas; y derivados sinteticos de los mismos. Los compuestos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes: cisplatino, treosulfan, y trofosfamida; alcaloides de plantas: vinblastina, paclitaxel, docetaxol; inhibidores de la ADN topoisomerasa: teniposido, crisnatol, y mitomicina; anti- folatos: metotrexato, acido micofenolico, e hidroxiurea; analogos de pirimidina: 5-fluorouracilo, doxifluridina, y arabinosido de citosina; analogos de purina: mercaptopurina y tioguanina; antimetabolitos de ADN: 2'-desoxi-5- fluorouridina, glicinato de afidicolina, y pirazoloimidazol; y agentes antimitoticos: halicondrina, colchicina, y rizoxina. Tambien se pueden utilizar composiciones que comprenden uno o mas agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, FLAG, CHOP). FLAG comprende fludarabina, arabinosido de citosina (Ara-C) y G-CSF. CHOP comprende ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina y prednisona. En otras realizaciones, se utilizan inhibidores de PARP (por ejemplo, PARP-1 y/o PARP-2) y dichos inhibidores son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, olaparib, ABT- 888, BSI-201, BGP-15 (N-Gene Research Laboratories, Inc.); INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals Inc.); PJ34 (Soriano

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et al, 2001; Pacher et al, 2002b); 3-aminobenzamida (Trevigen); 4-amino-1,8-naftalimida; (Trevigen); 6(5H)- fenantridinona (Trevigen); benzamida (patente de Estados Unidos Re 36.397), y NU1025 (Bowman et al). Los ejemplos anteriores de agentes quimioterapeuticos son ilustrativos, y no se pretende que sean limitativos.

[0056] En una realization preferida, los agentes quimioterapeuticos son compuestos de platino, tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino e iproplatino. Otros compuestos de coordination de platino antineoplasicos son bien conocidos en la tecnica, y se pueden modificar segun procedimientos bien conocidos en la tecnica, e incluyen los compuestos descritos en las patentes de los Estados Unidos. Nos. 4.996.337, 4.946.954, 5.091.521, 5.434.256, 5.527.905, y 5.633.243, todas las cuales se incorporan aqul por referencia.

[0057] En otra realizacion, la GCAS predice la eficacia de la radioterapia. La radiation utilizada en radioterapia puede ser radiacion ionizante. La radioterapia tambien puede ser rayos gamma, rayos X o haces de protones. Los ejemplos de radioterapia incluyen, pero no se limitan a, radioterapia de haz externo, implantation intersticial de radioisotopos (I-125, paladio, iridio), radioisotopos tales como el estroncio-89, radioterapia toracica, radioterapia P- 32intraperitoneal, y/o radioterapia abdominal y pelvica total. Para una vision general de la radioterapia, vease Hellman, Capltulo 16: Principles of Cancer Management: RadiationTherapy, 6a edition, 2001, DeVita et al, eds, J.B. Lippencott Company, Philadelphia. La radioterapia se puede administrar en forma de radiacion de haz externo o teleterapia, en la que la radiacion se dirige desde una fuente remota. El tratamiento con radiacion tambien se puede administrar como una terapia interna o braquiterapia, en la que se coloca una fuente radiactiva dentro del cuerpo cerca de las celulas cancerosas o una masa tumoral. Tambien se abarca el uso de terapia fotodinamica que comprende la administration de fotosensibilizadores, tales como hematoporfirina y sus derivados, Vertoporfina (BPD-MA), ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, desmetoxi-hipocrelina A; y 2BA-2-DMHA.

[0058] Las terapias contra el cancer que danan el ADN en menor medida que la quimioterapia o la radioterapia pueden tener eficacia en sujetos que tienen determinaciones de GCAS relativamente mas bajas o mas altas utilizando los procedimientos de la invention para determinar el fenotipo de un cancer. Los ejemplos de dichas terapias incluyen la inmunoterapia, terapia hormonal y terapia genica. Dichas terapias incluyen, pero no se limitan a, el uso de polinucleotidos antisentido, ribozimas, moleculas de ARN de interferencia, polinucleotidos de triple helice y similares, donde la secuencia de nucleotidos de dichos compuestos esta relacionada con las secuencias de nucleotidos de ADN y/o ARN de genes que estan relacionados con la initiation, progresion y/o patologla de un tumor o cancer. Por ejemplo, se pueden utilizar oncogenes, genes de factores de crecimiento, genes de receptores de factores de crecimiento, genes del ciclo celular, genes de reparation del ADN, y otros, en este tipo de terapias.

[0059] La inmunoterapia puede comprender, por ejemplo, el uso de vacunas contra el cancer y/o celulas presentadoras de antlgenos sensibilizadas. La inmunoterapia puede implicar la inmunidad pasiva para la protection a corto plazo de un huesped, lograda mediante la administracion de anticuerpo preformado dirigido contra un antlgeno de cancer o antlgeno de enfermedad (por ejemplo, la administracion de un anticuerpo monoclonal, opcionalmente ligado a un agente quimioterapeutico o una toxina, a un antlgeno tumoral). La inmunoterapia tambien puede centrarse en el uso de los epltopos reconocidos por linfocitos citotoxicos de llneas celulares de cancer.

[0060] Los tratamientos terapeuticos hormonales pueden comprender, por ejemplo, agonistas hormonales, antagonistas hormonales (por ejemplo, flutamida, bicalutamida, tamoxifeno, raloxifeno, acetato de leuprolide (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inhibidores de la bioslntesis y procesamiento de hormonas, y esteroides (por ejemplo, dexametasona, retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, deshidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrogeno, testosterona, progestinas), derivados de vitamina A (por ejemplo, acido retinoico todo trans (ATRA)); analogos de la vitamina D3; antigestagenos (por ejemplo, mifepristona, onapristona), o antiandrogenos (por ejemplo, acetato de ciproterona).

[0061] En una realizacion, la terapia contra el cancer utilizada para los canceres cuyo fenotipo se determina mediante los procedimientos de la invencion pueden comprender uno o mas tipos de terapias descritas en el presente documento, incluyendo, pero no limitado a, agentes quimioterapeuticos, agentes inmunoterapeuticos, agentes antiangiogenicos, citoquinas, hormonas, anticuerpos, polinucleotidos, radiacion y agentes terapeuticos fotodinamicos. Por ejemplo, las terapias de combination pueden comprender uno o mas agentes quimioterapeuticos y radiacion, uno o mas agentes quimioterapeuticos e inmunoterapia, o uno o mas agentes quimioterapeuticos, radiacion y quimioterapia.

[0062] La duration y/o la dosis de tratamiento con terapias contra el cancer pueden variar segun el agente contra el cancer particular o combinacion de los mismos. El experto en la materia entendera el tiempo de tratamiento apropiado para un agente terapeutico particular contra el cancer sera apreciado. La presente invencion contempla la evaluation continua de las pautas de tratamiento optimas para cada agente terapeutico contra el cancer, en la que el fenotipo del cancer del sujeto, tal como se determina por los procedimientos de la invencion, es un factor en la determination de las dosis y pautas de tratamiento optimas.

IV. Canceres para los cuales se puede determinar el fenotipo

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[0063] Los procedimientos de la presente invencion se pueden utilizar para determinar el fenotipo de muchos tipos de canceres diferentes. Los ejemplos especlficos de los tipos de cancer para los que se puede determinar el fenotipo por los procedimientos comprendidos por la invencion incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer colorrectal, cancer de pancreas, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glandulas sudorlparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, cancer de hlgado, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, cancer de hueso, tumor cerebral, cancer testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon de celulas pequenas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por ejemplo, leucemia linfocltica aguda y leucemia mielocltica aguda (mieloblastica, promielocltica, mielomonocltica, monocltica y eritroleucemia); leucemia cronica (leucemia mielocltica (granulocltica) cronica y leucemia linfocltica cronica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de las cadenas pesadas.

[0064] En algunas realizaciones, el cancer cuyo fenotipo se determina mediante el procedimiento de la invencion es un cancer epitelial, tal como, pero no limitado a, cancer de vejiga, cancer de mama, cancer cervical, cancer de colon, cancer ginecologico, cancer renal, cancer de laringe, cancer de pulmon, cancer de boca, cancer de cabeza y cuello, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de prostata o cancer de piel. En otras realizaciones, el cancer es cancer de mama, cancer de prostata, cancer de pulmon o cancer de colon. En todavla otras realizaciones, el cancer epitelial es el cancer no microcltico de pulmon, carcinoma de celulas renales no papilar, carcinoma cervical, carcinoma de ovario (por ejemplo, carcinoma de ovario seroso), o carcinoma de mama. Los canceres epiteliales pueden caracterizarse de varias otras maneras incluyendo, pero no limitadas a, seroso, endometrioide, mucinoso, celula de clara, Brenner, o indiferenciada.

V. Sujetos

[0065] En una realizacion, el sujeto para el cual se determina la eficacia predicha de una terapia contra el cancer es un mamlfero (por ejemplo, raton, rata, primate, mamlfero no humano, animal domestico, tal como perro, gato, vaca, caballo), y es preferiblemente un ser humano.

[0066] En otra realizacion de los procedimientos de la invencion, el sujeto no se ha sometido a quimioterapia o radioterapia. En realizaciones alternativas, el sujeto se ha sometido a quimioterapia o radioterapia (por ejemplo, tal como con cisplatino, carboplatino, y/o taxano). En realizaciones relacionadas, el sujeto no ha estado expuesto a niveles de radiacion o agentes quimiotoxicos por encima de los que se encuentran en general o en un promedio por los sujetos de una especie.

[0067] En ciertas realizaciones, el sujeto se ha sometido a cirugla para extirpar el tejido canceroso o precanceroso. En otras realizaciones, el tejido canceroso no se ha extraldo, por ejemplo, el tejido canceroso puede estar situado en una region inoperable del cuerpo, tal como en un tejido que es esencial para la vida, o en una region en la que un procedimiento quirurgico podrla causar considerable un riesgo de dano para el paciente.

[0068] Segun un aspecto de la invencion, la GCAS se puede utilizar para determinar el fenotipo, es decir la capacidad de respuesta a la terapia de un cancer en un sujeto, donde el sujeto se ha sometido previamente a quimioterapia, radioterapia, o ha estado expuesto a la radiacion, o un agente quimiotoxico. Dicha terapia o exposicion podrlan potencialmente danar el ADN y alterar el numero de SNP heterocigotos informativos en un sujeto. El numero alterado de SNP heterocigotos informativos, a su vez, alterarla la GCAS de un sujeto. Dado que las muestras de ADN no cancerosas mostrarlan mayor o menor numero de SNP heterocigotos, el intervalo de GCAS se alterarla para una poblacion de sujetos. En ciertas realizaciones, el dano del ADN de la terapia o la exposicion en un sujeto o poblacion de sujetos se produce alrededor de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos o mas antes de la determinacion de GCAS.

[0069] Para determinar los valores umbral de GCAS para los sujetos que presentan danos en el ADN de la terapia o la exposicion, se controla una poblacion de sujetos que han recibido quimioterapia o radioterapia, preferiblemente a traves de reglmenes de tratamiento identicos o similares, incluyendo dosis y frecuencia, para dichos sujetos.

VI. Preparacion de la muestra de acido nucleico

A. Aislamiento de acido nucleico

[0070] Las muestras de acidos nucleicos derivados de celulas cancerosas y no cancerosas de un sujeto que se pueden utilizar en los procedimientos de la invencion para determinar el fenotipo de un cancer se pueden preparar

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por medios bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se pueden utilizar procedimientos quirurgicos o biopsia por aspiracion con aguja para recoger muestras cancerosas de un sujeto. En algunas realizaciones, es importante enriquecer y/o purificar el tejido canceroso y/o muestras de celulas del tejido no canceroso y/o muestras de celulas. En otras realizaciones, las muestras de tejido y/o de celulas cancerosas se pueden a continuacion microdiseccionar para reducir la cantidad de contaminacion de tejidos normales antes de la extraccion de acido nucleico genomico o pre-ARN para su uso en los procedimientos de la invencion. En todavla otra realizacion, las muestras de tejido y/o de celulas cancerosas estan enriquecidas en celulas cancerosas en por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% , 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%; 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas, o cualquier intervalo intermedio, en el contenido de celulas cancerosas. Dicho enriquecimiento se puede realizar segun procedimientos bien conocidos en la tecnica, tales como la microdiseccion con aguja, microdiseccion por laser, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, y clasificacion de celulas inmunologicas. En una realizacion, una maquina automatica realiza el enriquecimiento de celulas hiperproliferativas para transformar as! la muestra biologica en una forma purificada enriquecida en la presencia de celulas hiperproliferativas.

[0071] La recogida de muestras de acidos nucleicos a partir de celulas no cancerosas de un sujeto tambien se puede realizar con cirugla o aspiracion. En los procedimientos quirurgicos en los que se extirpa tejido canceroso, los cirujanos a menudo extraen muestras de tejido y/o de celulas no cancerosas del mismo tipo de tejido del paciente con cancer para la comparacion. Las muestras de acidos nucleicos pueden aislarse a partir de dicho tejido no canceroso del sujeto para su uso en los procedimientos de la invencion.

[0072] En ciertas realizaciones de los procedimientos de la invencion, las muestras de acidos nucleicos de tejidos no cancerosos se no derivan del mismo tipo de tejido que el tejido y/o celulas cancerosas de la muestra, y/o no se derivan del paciente con cancer. Las muestras de acidos nucleicos de tejidos no cancerosos pueden derivar de cualquier tejido y/o celulas no cancerosas y/o libres de enfermedad. Dichas muestras no cancerosas pueden recogerse mediante procedimientos quirurgicos o no quirurgicos. En ciertas realizaciones, las muestras de acido nucleico no cancerosas derivan de tejidos libres de tumores. Por ejemplo, las muestras no cancerosas se pueden recoger de ganglios linfaticos, linfocitos de sangre periferica y/o celulas mononucleares de sangre, o cualquier subpoblacion de las mismas. En una realizacion preferida, el tejido no canceroso no es tejido precanceroso, por ejemplo, no presenta ningun indicio de una afeccion preneoplasica, tal como hiperplasia, metaplasia, o displasia.

[0073] En una realizacion, las muestras de acidos nucleicos utilizadas para calcular la GCAS (por ejemplo, el numero de SNP heterocigotos en la pluralidad de SNP totales que muestran heterocigosidad en el ADN genomico de tejido no canceroso de la especie a la que pertenece el paciente de cancer) se toman al menos de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, o 200 organismos diferentes de esa especie.

[0074] Segun ciertos aspectos de la invencion, el acido nucleico "derivado de" ADN genomico, tal como se usa en los procedimientos de la invencion, por ejemplo, en experimentos de hibridacion para determinar la heterocigosidad de los SNP, puede ser fragmentos de acido nucleico genomico generado por digestion con enzimas de restriccion y/o ligadura a otro acido nucleico, y/o productos de amplificacion de acidos nucleicos genomicos, o pre-ARN mensajero (pre-ARNm), productos de amplificacion de pre-ARNm, o fragmentos de ADN genomico desarrollados en vectores de clonacion generados, por ejemplo, mediante procedimientos de clonacion "shotgun". En ciertas realizaciones, las muestras de acido nucleico genomico se digirieron con enzimas de restriccion.

B. Amplificacion de acidos nucleicos

[0075] Aunque la muestra de acido nucleico no necesita comprender acido nucleico amplificado, en algunas realizaciones, los acidos nucleicos aislados se pueden procesar de maneras que requieren y/o se aprovechan de la amplificacion. Las muestras de ADN genomico de un sujeto, opcionalmente, pueden fragmentarse utilizando endonucleasas de restriccion y/o se amplifican antes de determinar la GCAS. En una realizacion, los fragmentos de ADN se amplifican usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos para llevar a la practica la PCR son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Una ventaja de la PCR es que se pueden utilizar pequenas cantidades de ADN. Por ejemplo, el ADN genomico de un sujeto puede ser aproximadamente 150 ng, 175, ng, 200 ng, 225 ng, 250 ng, 275 ng, o 300 ng de ADN.

[0076] En ciertas realizaciones de los procedimientos de la invencion, el acido nucleico de un sujeto se amplifica usando un solo par de cebadores. Por ejemplo, se pueden digerir muestras de ADN genomico con endonucleasas de restriccion para generar fragmentos de ADN genomico que a continuacion se ligan a una secuencia de ADN adaptadora que el par de cebadores reconoce. En otras realizaciones de los procedimientos de la invencion, el acido nucleico de un sujeto se amplifica usando conjuntos de pares de cebadores especlficos para loci de interes (por ejemplo, RFLP, STR, SNP, etc.) situados por todo el genoma. Dichos conjuntos de pares de cebadores reconocen cada uno secuencias de ADN genomico que flanquean loci particulares de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.). Se puede obtener una muestra de ADN adecuada para la hibridacion, por ejemplo, mediante amplificacion con la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) e ADN genomico, fragmentos de ADN genomico, fragmentos de ADN genomico ligados secuencias adaptadoras o secuencias clonadas. Se pueden utilizar programas informaticos que son bien conocidos en la tecnica en el diseno de cebadores con la especificidad deseada y propiedades de

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amplificacion optimas, tales como Oligo version 5.0 (National Biosciences). Los procedimientos de PCR son bien conocidos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Innis et al, eds, 1990, pCr Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, Calif. Sera evidente para un experto en la tecnica que los sistemas roboticos controlados son utiles para aislar y amplificar los acidos nucleicos y se pueden utilizar.

[0077] En otras realizaciones, cuando el ADN genomico de un sujeto se fragmenta utilizando endonucleasas de restriction y se amplifica antes de determinar la GCAS, la amplificacion puede comprender regiones de donation de ADN genomico del sujeto. En dichos procedimientos, la amplificacion de las regiones de ADN se logra mediante el proceso de clonacion. Por ejemplo, los vectores de expresion pueden modificarse geneticamente para expresar grandes cantidades de fragmentos particulares de ADN genomico del sujeto (Sambrook, J. et al, eds, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, en las pags. 9.47 a 9.51).

[0078] En aun otras realizaciones, cuando el ADN de un sujeto se fragmenta utilizando endonucleasas de restriccion y se amplifica antes de determinar la GCAS, la amplificacion comprende expresar un acido nucleico que codifica un gen, o un gen y regiones genomicas flanqueantes de acidos nucleicos, del sujeto. A continuation, el ARN (pre-ARN mensajero) que comprende la totalidad de la transcription, incluyendo intrones, se alsla y se utiliza en los procedimientos de la invention para determinar la GCAS y el fenotipo de un cancer.

[0079] En ciertas realizaciones, no se requiere amplificacion. En dichas realizaciones, el ADN genomico, o preARN, de un sujeto pueden fragmentarse utilizando endonucleasas de restriccion u otros procedimientos. Los fragmentos resultantes se pueden hibridar con sondas de SNP. Habitualmente, se necesitan aislar mayores cantidades de ADN en comparacion con la cantidad de ADN o pre-ARNm necesaria cuando se amplifican fragmentos. Por ejemplo, cuando no se amplifica el acido nucleico de un sujeto, una muestra de ADN de un sujeto para su uso en la hibridacion puede ser de aproximadamente 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, o 1000 ng de ADN o mayor. Alternativamente, en otras realizaciones, se utilizan procedimientos que requieren cantidades muy pequenas de acidos nucleicos para el analisis, tales como menos de 400 ng, 300 ng, 200 ng, 100 ng, 90 ng, 85 ng, 80 ng, 75 ng, 70 ng, 65 ng, 60 ng, 55 ng, 50 ng, o menos, tal como se utiliza para los ensayos de sonda de inversion molecular (MIP). Estas tecnicas son particularmente utiles para el analisis de muestras cllnicas, tal como material fijado con formalina embebido en parafina o biopsias centrales pequenas con aguja, caracterizadas por ser de facil acceso, pero en general por tener una calidad de ADN reducida (por ejemplo, ADN pequeno, fragmentado) y/o no proporcionar grandes cantidades de acidos nucleicos.

C. Hibridacion

[0080] Las muestras de acido nucleico derivadas de un sujeto utilizadas en los procedimientos de la invencion se pueden hibridar a matrices que comprenden sondas (por ejemplo, sondas de oligonucleotidos) con el fin de identificar loci informativo de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.). La hibridacion tambien puede utilizarse para determinar si los loci informativo de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.) identificados muestran aberraciones cromosomicas (por ejemplo, desequilibrio alelico, perdida de heterocigosidad, cambio en el numero total de copias, ganancia del numero de copias y perdida del numero de copias) en muestras de acidos nucleicos de tejidos y/o celulas cancerosas del sujeto. En realizaciones preferidas, las sondas utilizadas en los procedimientos de la invencion comprenden una matriz de sondas colocadas en un chip de ADN (por ejemplo, sondas de oligonucleotidos de SNP). En algunas realizaciones, la heterocigosidad de un locus SNP se determina mediante un procedimiento que no comprende la detection de un cambio en el tamano de fragmentos de acido nucleico digeridos por enzimas de restriccion. En otras realizaciones, se analizan SNP para identificar el desequilibrio alelico.

[0081] Las condiciones de hibridacion y condiciones de lavado utilizadas en los procedimientos de la invencion se eligen de modo que las muestras de acido nucleico a analizar por la invencion se unen especlficamente o se hibridan especlficamente con las secuencias de oligonucleotidos complementarias de la matriz, preferiblemente a un sitio especlfico de la matriz, en el que se encuentra su ADN complementario. En algunas realizaciones, el ADN complementario puede aparearse completamente o desaparearse en algun grado tal como se utiliza, por ejemplo, en matrices de oligonucleotidos Affymetrix, tales como los utilizados para analizar SNP en ensayos MIP.

[0082] Las sondas de ADN de acido oligodesoxirribonucleico sintetico de una cadena de una matriz pueden necesitar la desnaturalizacion antes del contacto con las muestras de acido nucleico de un sujeto, por ejemplo, para eliminar horquillas o dlmeros que forman las correspondientes secuencias complementarias o autocomplementarias.

[0083] Las condiciones de hibridacion optimas dependeran de la longitud de las sondas y el tipo de muestras de acido nucleico de un sujeto. Los parametros generales para condiciones de hibridacion especlficas (es decir, rigurosas) para acidos nucleicos se describen en Sambrook, J. et al, eds, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , Nueva York, pags 9.47 a 9.51 y de 11.55 a 11.61; Ausubel et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecules Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, pags. 2.10.1-2.10.16. Las condiciones de hibridacion utiles de ejemplo se proporcionan en, por ejemplo, Tijessen, 1993, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B. V. y Kricka 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, California.

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D. Matrices de acidos nucleicos oligonucleotidos

[0084] En algunas realizaciones de los procedimientos de la presente invencion, se pueden utilizar matrices de ADN para determinar si las muestras de acido nucleico presentan aberraciones cromosomicas (por ejemplo, desequilibrio alelica, perdida de heterocigosidad, cambio en el numero total de copias, ganancia del numero de copias y perdida del numero de copias) midiendo el nivel de hibridacion de la secuencia de acidos nucleicos a sondas de oligonucleotidos que comprenden secuencias complementarias. La hibridacion se puede utilizar para determinar la presencia o ausencia de heterocigosidad. Varios formatos de matrices de ADN que emplean “sondas” de oligonucleotidos, (es decir, moleculas de acido nucleico que tienen secuencias definidas) son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

[0085] Habitualmente, se inmoviliza un conjunto de sondas de acido nucleico, cada una de los cuales con una secuencia definida, sobre un soporte solido de manera que cada sonda diferente esta inmovilizada a una region predeterminada. En ciertas realizaciones, el conjunto de sondas forma una matriz de sitios de union (por ejemplo, la hibridacion) posicionalmente direccionables sobre un soporte. Cada uno de dichos sitios de union comprende una pluralidad de moleculas de oligonucleotidos de una sonda unida a la region predeterminada sobre el soporte. Mas especlficamente, cada sonda de la matriz esta situada preferiblemente en una posicion predeterminada conocida sobre el soporte solido, de modo que se puede determinar la identidad (es decir, la secuencia) de cada sonda a partir de su posicion en la matriz (es decir, sobre el soporte o superficie). Las micromatrices se pueden fabricar de varias maneras, de las cuales varias estan descritas en este documento. Sin embargo, las micromatrices producidas comparten ciertas caracterlsticas, son reproducibles, permiten la produccion de multiples copias de una matriz determinada y se comparan facilmente con las demas.

[0086] Preferiblemente, las micromatrices se fabrican de materiales que son estables en las condiciones de union (por ejemplo, hibridacion de acidos nucleicos). Las micromatrices son preferiblemente pequenas, por ejemplo, entre aproximadamente 1 cm2 y 25 cm2, preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 cm2. Sin embargo, tambien se contemplan matrices mas grandes y mas pequenas y pueden ser preferibles, por ejemplo, para evaluar simultaneamente un gran numero de diferentes sondas.

[0087] Las sondas de oligonucleotidos se pueden sintetizar directamente sobre un soporte para formar la matriz. Las sondas se pueden unir a un soporte solido o superficie, que puede estar fabricada, por ejemplo, de vidrio, plastico (por ejemplo, polipropileno, nylon), poliacrilamida, nitrocelulosa, gel, u otro material poroso o no poroso. El conjunto de sondas inmovilizadas o la matriz de sondas inmovilizadas se pone en contacto con una muestra que contiene especies de acidos nucleicos marcados de modo que los acidos nucleicos que tienen secuencias complementarias a una sonda inmovilizada se hibridan o se unen a la sonda. Despues de la separacion, por ejemplo, mediante lavado, de cualquier material no unido, las, se detectan y se miden las secuencias marcadas unidas. La medicion se efectua habitualmente con ayuda de un ordenador. Utilizando ensayos de matriz de ADN, se pueden analizar mezclas complejas de acidos nucleicos marcados, por ejemplo, fragmentos de acido nucleico derivados de una digestion de restriction de ADN genomico de tejido no canceroso. Las tecnologlas de matriz de ADN han hecho posible determinar la heterocigosidad de un gran numero de loci informativos de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.) en todo el genoma.

[0088] En ciertas realizaciones, se utilizan matrices de oligonucleotidos de alta densidad en los procedimientos de la invencion. Estas matrices que contienen miles de oligonucleotidos complementarios a secuencias definidas, en sitios definidos en una superficie, se pueden sintetizar in situ en la superficie, por ejemplo, mediante tecnicas fotolitograficas (vease, por ejemplo, Fodor et al, 1991, Science 251:. 767-773; Pease et al, 1994, Proc Natl Acad Sci USA. 91: 5.022 a 5.026; Lockhart et al, 1996, Nature Biotechnology 14: 1675; patentes de Estados Unidos n° 5.578.832; 5.556.752; 5.510.270; 5.445.934; 5.744.305 y 6.040.138). Los procedimientos para generar matrices usando la tecnologla de inyeccion de tinta para la slntesis de oligonucleotidos in situ tambien son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Blanchard, publication de patente internacional WO 98/41531, publicada el 24 de septiembre 1998; Blanchard et al., 1996, Biosensors and Bioelectronics 11: 687-690; Blanchard, 1998, en Synthetic DNA Arrays in Genetic Engineering, Vol 20, J.K. Setlow, Ed, Plenum Press, Nueva York, en las paginas 111-123). Otro procedimiento para la fijacion de los acidos nucleicos a una superficie es mediante la impresion sobre placas de vidrio, tal como se describe en general por Schena et al. (1995, Science 270: 467-470). Tambien se pueden utilizar otros procedimientos para la fabrication de micromatrices, por ejemplo, mediante el enmascaramiento (Maskos y del Sur, 1992, Nucl Acids Res. 20: 1679-1684). Cuando se utilizan estos procedimientos, los oligonucleotidos (por ejemplo, de 15 a 60 unidades) de secuencia conocida se sintetizan directamente sobre una superficie, tal como un portaobjetos de vidrio derivatizado. La matriz producida puede ser redundante, con varias moleculas de oligonucleotidos que corresponden a cada locus informativo de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.).

[0089] Un medio de ejemplo para generar las sondas de oligonucleotidos de la matriz de ADN es mediante slntesis de polinucleotidos u oligonucleotidos sinteticos, por ejemplo, utilizando qulmicas de N-fosfonato o fosforamidita (Froehler et al, 1986, Nucleic Acid Res. 14: 5399-5407; McBride et al, 1983, Tetrahedron Lett 24: 246-248). Las secuencias sinteticas tienen habitualmente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 600 bases de longitud, mas habitualmente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 bases, lo mas preferiblemente entre

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aproximadamente 40 y aproximadamente 70 bases de longitud. En algunas realizaciones, los acidos nucleicos sinteticos incluyen bases no naturales, tales como, pero de ninguna manera se limita a, inosina. Como se senalo anteriormente, los analogos de acido nucleico pueden utilizarse como sitios de union para la hibridacion. Un ejemplo de un analogo de acido nucleico adecuado es el acido nucleico peptldico (vease, por ejemplo, Egholm et al, 1993, Nature 363: 566 a 568; patente de Estados Unidos No. 5.539.083). En realizaciones alternativas, los sitios de hibridacion (es decir, las sondas) estan formados de clones de plasmido o de fago de las regiones de ADN genomico correspondientes a SNP o el complemento de las mismas.

[0090] El tamano de las sondas de oligonucleotidos usadas en los procedimientos de la invencion puede ser de al menos 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 nucleotidos de longitud. Es bien conocido en la tecnica que, aunque la hibridacion es selectiva para secuencias complementarias, otras secuencias que no son perfectamente complementarios tambien pueden hibridarse con una sonda determinada en un cierto nivel. Por lo tanto, se pueden utilizar multiples sondas de oligonucleotidos con ligeras variaciones, para optimizar la hibridacion de muestras. Para optimizar adicionalmente la hibridacion, se pueden alterar las condiciones de rigurosidad de la hibridacion, por ejemplo, la temperatura de hibridacion y las concentraciones de sal, mediante procedimientos que son bien conocidos en la tecnica.

[0091] En realizaciones preferidas, las matrices de oligonucleotidos de alta densidad usadas en los procedimientos de la invencion comprenden oligonucleotidos correspondientes a loci informativos de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.). Las sondas de oligonucleotidos pueden comprender ADN o "mimeticos" de ADN (por ejemplo, derivados y analogos) que corresponden a una parte de cada locus informativo de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.) en el genoma de un sujeto. Las sondas de oligonucleotidos se pueden modificar en el resto de base, en el resto de azucar, o en la cadena principal de fosfato. Ejemplos de mimeticos de ADN incluyen, por ejemplo, fosforotioatos. Para cada locus de SNP, se puede utilizar una pluralidad de diferentes oligonucleotidos que son complementarios a las secuencias de los acidos nucleicos de la muestra. Por ejemplo, para un unico locus informativo de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.) se pueden utilizar aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, o mas oligonucleotidos diferentes. Cada uno de los oligonucleotidos para un locus informativo particular de interes puede tener una ligera variacion en apareamientos perfectos, desapareamientos, y la secuencia de flanqueo alrededor del SNP. En ciertas realizaciones, las sondas se generan de manera que las sondas para un locus informativo particular de interes comprenden secuencias solapantes y/o solapantes sucesivas que abarcan o se situan a lo largo de una region genomica que contiene el sitio diana, donde todas las sondas contienen el sitio diana. A modo de ejemplo, las secuencias de sondas solapantes se pueden colocar en las etapas de intervalos de bases predeterminadas, por ejemplo en las etapas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 intervalos de bases.

[0092] En ciertas realizaciones, los ensayos se pueden realizar utilizando matrices adecuadas para su uso con protocolos de sonda de inversion molecular, tales como los descritos por Wang et al. (2007) Genome Biol. 8, R246.

[0093] Para las sondas de oligonucleotidos dirigidas a las especies de acidos nucleicos de secuencias estrechamente parecidas (es decir, homologas), la "hibridacion cruzada" entre sondas similares puede contaminar de manera significativa y confundir los resultados de las mediciones de la hibridacion. Hibridacion cruzada es una preocupacion especialmente significativa en la deteccion de SNP, ya que la secuencia a detectar (es decir, el SNP en particular) debe distinguirse de otras secuencias que difieren solo en un unico nucleotido. La hibridacion cruzada puede minimizarse mediante la regulacion de las condiciones rigurosas de hibridacion y/o durante los lavados post- hibridacion. Las condiciones altamente rigurosas permiten la deteccion de variantes alelicas de una secuencia de nucleotidos, por ejemplo, aproximadamente 1 desapareamiento por cada 10-30 nucleotidos.

[0094] No hay una unica condicion de hibridacion o de lavado que sea optima para todas las diferentes secuencias de acidos nucleicos. Para determinadas matrices de loci informativo de interes, estas condiciones pueden ser identicas a las sugeridas por el fabricante o pueden ajustarse por un experto en la tecnica.

[0095] En realizaciones preferidas, las sondas utilizadas en los procedimientos de la invencion se inmovilizan (es decir, se colocan) en un portaobjetos de vidrio llamado chip. Por ejemplo, una micromatriz de ADN puede comprender un chip en el que los oligonucleotidos (secuencias de ADN de cadena simple purificadas en solucion) han sido impresas por un robot en una matriz (aproximadamente) rectangular, donde cada punto de la matriz corresponde a una unica muestra de ADN que codifica un oligonucleotido. En resumen, el procedimiento comprende, inundar el chip de micromatrices de ADN con una muestra marcada en condiciones adecuadas para que se produzca la hibridacion entre las secuencias del portaobjetos y la muestra marcada, a continuacion la matriz se lava y se seca, y la matriz se escanea con un microscopio laser para detectar la hibridacion. En ciertas realizaciones hay por lo menos 250, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000,

11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000, 20.000 , 21.000, 22.000, 23.000, 24.000,

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39.000, 40.000, 41.000, 42.000, 43.000, 44.000, 45.000 , 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000 o mas, o cualquier intervalo intermedio, de loci informativos de interes para los que aparecen sondas en la matriz (con sondas con desapareamientos/apareamientos para un unico locus de interes o sondas colocadas a lo largo de un solo locus

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que cuenta como un locus de interes). El numero maximo de loci informativo de interes que se sonda por matriz se determina por el tamano del genoma y la diversidad genetica de la especie del sujeto. Los chips de ADN son bien conocidos en la tecnica y se pueden adquirir en forma prefabricada con secuencias especlficas para especies particulares. En algunas realizaciones, en los procedimientos de la invencion se utilizan las matrices del GenomeWide Human SNP Array 6,0® y/o 50K Xbal (Affymetrix, Santa Clara, Calif.). En otras realizaciones, pueden detectarse y cuantificarse SNP y/o numero de copias de ADN usando procedimientos de secuenciacion, tales como "procedimientos de secuenciacion de proxima generacion", tal como se describe anteriormente.

E. Deteccion de la senal

[0096] En algunas realizaciones, las muestras de acido nucleico derivadas de un sujeto se hibridan con los sitios de union de una matriz descrita en este documento. En ciertas realizaciones, las muestras de acido nucleico derivadas de cada uno de los dos tipos de muestras de un sujeto (es decir, cancerosas y no cancerosas) se hibridan con matrices separadas, aunque identicas. En ciertas realizaciones, las muestras de acido nucleico derivadas de uno de los dos tipos de muestras de un sujeto (es decir, cancerosas y no cancerosas) se hibridan a dicha matriz, a continuacion, despues de la deteccion de la senal, el chip se lava para eliminar la primera muestra marcada y se vuelven a utilizar para hibridar la muestra restante. En otras realizaciones, la matriz no se vuelve a utilizar mas de una vez. En ciertas realizaciones, las muestras de acidos nucleicos derivadas de cada uno de los dos tipos de muestras de un sujeto (es decir, cancerosas y no cancerosas) se marcan de forma diferente de modo que puedan distinguirse. Cuando las dos muestras se mezclan y se hibridan a la misma matriz, la intensidad relativa de la senal de cada muestra se determina para cada sitio en la matriz, y se detecta cualquier diferencia relativa en la abundancia de un alelo de loci informativos de interes.

[0097] Las senales se pueden registrar y, en algunas realizaciones, analizarse por ordenador. En una realizacion, en una imagen escaneada se extraen los puntos usando un programa de graficos (por ejemplo, HiJaak Graphics Suite) y a continuacion se analizan usando un programa de cuadriculacion de imagenes que crea una hoja de calculo de la hibridacion promedio en cada longitud de onda en cada sitio. Si es necesario, se puede realizar una correction determinada experimentalmente para la "intercomunicacion" (o superposition) entre los canales para los dos compuestos fluorescentes. Para cualquier sitio de hibridacion particular en la matriz, se puede calcular una relacion de la emision de los dos fluoroforos, lo cual puede ayudar en la elimination de las senales de hibridacion cruzadas para determinar con mayor precision si un locus de SNP particular es homocigoto o heterocigoto.

F. Marcaje

[0098] En algunas realizaciones, las muestras de acidos nucleicos, fragmentos de los mismos, o fragmentos de los mismos ligados a regiones adaptadoras utilizadas en los procedimientos de la invencion se marcan de forma detectable. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente, por ejemplo, mediante la incorporation de analogos de nucleotidos. Otros marcadores adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, biotina, iminobiotina, antlgenos, cofactores, dinitrofenol, acido lipoico, compuestos oleflnicos, polipeptidos detectables, moleculas ricas de electrones, enzimas capaces de generar una senal detectable por action sobre un sustrato, e isotopos radiactivos.

[0099] Los isotopos radiactivos incluyen los que se pueden utilizar conjuntamente con los procedimientos de la invencion, pero no se limitan a, 32P y 14C. Las moleculas fluorescentes adecuadas para la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, fluorescelna y sus derivados, rodamina y sus derivados, rojo texas, 5'-carboxi- fluorescelna ("FAM"), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxi-fluorescelna ("JOE"), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxi- rodamina ("TAM-RA"), 6-carboxi-X-rodamina ("ROX" ), HEX, TET, IRD40 e IRD41.

[0100] Las moleculas fluorescentes que son adecuados para usar segun la invencion incluyen ademas: colorantes de cianina, incluyendo pero no limitado a Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 y FLUORX; colorantes BODIPY incluyendo, pero no limitado a, BODIPY-FL, BODIPY-TR, BODIPY-TMR, BODIPY-630/650, y BODIPY-650/670; y colorantes ALEXA, incluyendo pero no limitado a, ALEXA-488, ALEXA -532, ALEXA -546, ALEXA -568 y ALEXA - 594; as! como otros colorantes fluorescentes, que seran conocidos para los expertos en la tecnica. Entre las moleculas indicadoras ricas en electrones adecuadas para la presente invencion se incluyen, pero no se limitan a, ferritina, hemocianina, y oro coloidal.

[0101] Tambien se pueden utilizar esquemas de marcaje y deteccion con fluorescencia de dos colores (Shena y otros, 1995, Science 270: 467-470). El uso de dos o mas marcadores puede ser util en la deteccion de variaciones debido a las diferencias menores en las condiciones experimentales (por ejemplo, condiciones de hibridacion). En algunas realizaciones de la invencion, se pueden utilizar al menos 5, 10, 20, o 100 colorantes de diferentes colores para el marcaje. Dicho marcaje tambien permitirla el analisis de multiples muestras simultaneamente, lo cual esta comprendido por la invencion.

[0102] Las muestras de acidos nucleicos marcados, fragmentos de los mismos, o fragmentos de los mismos ligados a regiones adaptadoras que se pueden utilizar en los procedimientos de la invencion se ponen en contacto con una

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pluralidad de sondas de oligonucleotidos en condiciones que permiten a los acidos nucleicos de muestra que tiene secuencias complementarias a las sondas hibridarse a las mismas.

[0103] Dependiendo del tipo de marcador usado, las senales de hibridacion se pueden detectar usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la tecnica incluyendo, pero no limitado a, pellcula de rayos X, obtencion de imagenes fosforescentes o camara CCD. Cuando se utilizan sondas marcadas con fluorescencia, las emisiones de fluorescencia en cada sitio de una matriz de transcripcion pueden detectarse, preferiblemente, mediante microscopla confocal laser de barrido. En una realizacion, se lleva a cabo un barrido separado, utilizando la llnea de excitacion apropiada, para cada uno de los dos fluoroforos utilizados. Alternativamente, puede usarse un laser que permita la iluminacion de muestras simultaneas a longitudes de onda especlficas para los dos fluoroforos y se pueden analizar simultaneamente las emisiones de los dos fluoroforos (ver Shalon et al. (1996) Genome Res. 6,639-645). En una realizacion preferida, las matrices se escanean con un escaner de fluorescencia laser con una etapa X-Y controlada por ordenador y un objetivo de microscopio. La excitacion secuencial de los dos fluoroforos se consigue con un laser de gas mixto multillnea y la luz emitida se divide por la longitud de onda y se detecta con dos tubos fotomultiplicadores. Dichos dispositivos de barrido por laser de fluorescencia se describen, por ejemplo, en Schena et al. (1996) Genome Res. 6, 639-645. Alternativamente, se puede utilizar un haz de fibra optica, tal como el descrito por Ferguson et al. (1996) Nat. Biotech. 14, 1681-1684. Las senales resultantes se pueden analizar a continuacion para determinar la presencia o ausencia de heterocigosidad o homocigosidad para los loci informativos de interes (por ejemplo, SNP, rFlP, STR, etc.) utilizando software informatico.

G. Algoritmos para el analisis de loci informativos de interes

[0104] Una vez que se ha detectado la senal de hibridacion, los datos resultantes se pueden analizar utilizando algoritmos. En ciertas realizaciones, el algoritmo para determinar la heterocigosidad en loci informativos de interes (por ejemplo, SNP, RFLP, STR, etc.) se basa en procedimientos bien conocidos que requieren desequilibrio alelico (AI), perdida de heterocigosidad (LOH), aberraciones en el numero de copias (CNA), ganancia del numero de copias (CNG), y disminucion del numero de copias (CND). Por ejemplo, AI se puede determinar utilizando la proportion mayoritaria de copias (MCP) a la que se requiere AI para un determinado SNP, cuando el valor de MCP es mayor que 0,60, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80. 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, o 0,99. Una vez que se determina el requerimiento, se pueden aplicar adicionalmente procedimientos de enumeration. Por ejemplo, se puede determinar la GCAS, por ejemplo, mediante: 1) el recuento del numero total de SNP afectados por el Al o la ganancia de copias o LOH, 2) el recuento del numero de regiones afectadas por AI (por ejemplo, NAI, tal como describe adicionalmente en los Ejemplos, una region individual se define como una cadena de SNP vecinos que muestran todos AI limitado en al menos un lado por SNPs que no muestran AI/retencion de heterocigosidad. El tamano de la region se define por la longitud del cromosoma representado por la cadena de SNP con AI); 3) el recuento del numero de cromosomas con la perdida de todo el cromosoma, o 4) el recuento del numero de regiones cromosomicas con la CNA, CNG, CND, etc. Ilustraciones representativas adicionales de dichos algoritmos conocidos se proporcionan en la section de ejemplos a continuacion.

H. Sistemas y procedimientos de implementation por ordenador

[0105] En ciertas realizaciones, los procedimientos de la invention implementan un programa informatico para calcular la GCAS. Por ejemplo, se puede utilizar un programa informatico para realizar los algoritmos descritos en este documento. Un sistema informatico tambien puede almacenar y manipular los datos generados por los procedimientos de la presente invencion, que comprende una pluralidad de cambios/perfiles de la senal de hibridacion durante la aproximacion al equilibrio en diferentes mediciones de hibridacion y que pueden ser utilizados por un sistema informatico en la implementacion de los procedimientos de esta invencion. En ciertas realizaciones, un sistema informatico recibe datos de la hibridacion de las sondas; (Ii) almacena datos de la hibridacion de las sondas; y (iii) compara datos de la hibridacion de las sondas para determinar el estado de los loci informativos de interes en dicha muestra de acido nucleico de tejido canceroso o precanceroso. A continuacion, se calcula la GCAS. En otras realizaciones, un sistema informatico (i) compara la GCAS determinada con un valor umbral; y (ii) da salida a una indication de si dicha GCAS esta por encima o por debajo de un valor umbral, o un fenotipo en base a dicha indication. En ciertas realizaciones, dichos sistemas informaticos tambien se consideran parte de la presente invencion.

[0106] Se pueden utilizar numerosos tipos de sistemas informaticos para implementar los procedimientos anallticos de esta invencion segun el conocimiento que tiene un experto en bioinformatica y/o arte digital.

[0107] Se pueden cargar varios componentes de software en la memoria durante el funcionamiento de dicho sistema informatico. Los componentes de software pueden comprender componentes de software que son estandar en la tecnica y componentes que son especiales para la presente invencion (por ejemplo, software dCHIP descrito en Lin et al (2004) Bioinformatics 20, 1233-1240; software CRLMM descrito en Silver et al., (2007) Cell 128, 991-1002; software Aroma Affymetrix descrito en Richardson et al (2006) Cancer Cell 9, 121-132. Los procedimientos de la invencion tambien pueden programarse o modelarse en paquetes de software matematicos que permiten la entrada simbolica de ecuaciones y la especificacion de alto nivel de procesamiento, incluyendo algoritmos especlficos a

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utilizar, liberando as! al usuario de la necesidad de programa procesalmente ecuaciones y algoritmos individuales. Tales paquetes incluyen, por ejemplo, Matlab de Mathworks (Natick, Mass.), Mathematica de Wolfram Research (Champaign, Illinois.) o S-Plus de MathSoft (Seattle, Wash.).

[0108] En ciertas realizaciones, el ordenador comprende una base de datos para el almacenamiento de los perfiles de la senal de hibridacion. Dichos perfiles almacenados pueden ser accesibles y utilizarse para calcular SAAG. Por ejemplo, el perfil de la senal de hibridacion de una muestra derivada de tejido no canceroso de un sujeto y/o perfiles generados a partir de distribuciones basadas en la poblacion de loci informativos de interes en las poblaciones relevantes de la misma especie almacenados, podrlan entonces compararse con el perfil de la senal de hibridacion de una muestra derivada de tejido canceroso del sujeto.

[0109] Ademas de las estructuras de los programas de ejemplo y los sistemas informaticos descritos en el presente documento, otras estructuras de programas alternativas y sistemas informaticos seran facilmente evidentes para el experto en la materia. Dichos sistemas alternativos, que no se apartan del sistema informatico y las estructuras de programas descritos anteriormente ni en el esplritu ni en su alcance, por lo tanto, se pretende que esten comprendidas dentro de las reivindicaciones adjuntas.

[0110] Otras realizaciones de la presente invencion se describen en los siguientes Ejemplos. La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes adicionales.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y Procedimientos para el Ejemplo 2

[0111] Se midio la respuesta patologica despues de la terapia neoadyuvante con cisplatino en la cohorte de TNBC utilizando la escala semicuantitativa de Miller-Payne tal como se ha descrito (Silver et al (2010) J. Clin Oncol 28, 1145-1153; Ogston et al. (2003) Breast 12, 320-327). Se realizo el genotipado de MIP tal como se ha descrito (Wang et al. (2007) Genome Biol. 8, R246). Se procesaron la intensidad de senal de alelos y los genotipos de MIP o los analisis de matrices de SNP publicos por el algoritmo CRLMM (Lin et al. (2008) Genome Biol. 9, R63) tal como se aplica en el "oligo" del paquete R. Se determino el numero de copias de ADN usando el paquete R "AromaAffymetrix" (Bengtsson et al. (2008) Bioinformatics 24, 759-767). Los datos del genotipo procesados se exportaron a dChip (disponible en la World Wide Web en
http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) para la determinacion de la proporcion mayoritaria de copias (MCP), que se define como la relacion del numero de copias mayoritario con respecto al numero de copias mayoritario + menor (Li et al. (2008) Bioinformatics 9, 204). Se realizo una estimation del nivel de contamination de aDn normal a partir de la curva de MCP genomica tal como se ha descrito (Li et al. (2008) Bioinformatics 9, 204). En los analisis se incluyeron los casos de mama u ovario que se estimo que tenia un 75% o mas de contenido tumoral. El desequilibrio alelico (AI) para fines especlficos de los ejemplos descritos en el presente documento se define como MCP> 0,7 y las regiones de AI definidas como mas de 10 sondas consecutivas con AI. El AI telomerico para fines especlficos de los ejemplos descritos en el presente documento se define como regiones de AI que se extienden hasta el telomero y no cruzan el centromero. Se estimo la asociacion entre NtAI,12 y la respuesta a cisplatino en sujetos con TNBC mediante el area bajo la curva (AUC) de la curva caracterlstica de operation del receptor (ROC); valor p es de la prueba de rangos de Wilcoxon de dos colas. Se estimo la asociacion entre AI telomerico y el tiempo hasta la recurrencia del cancer de ovario despues de la terapia con platino mediante el analisis de Kaplan-Meier utilizando un punto de corte de 13 para definir un grupo de ttAI, 12 alto; valor p se basa en la prueba de rangos logarltmicos. Una lista completa de los materiales y procedimientos es la siguiente:

A. Lineas celulares y ensayos de sensibilidad a farmacos

[0112] Se mantuvieron las lineas celulares de cancer de mama triple negativa BT20, BT549, HCC1187, HCC38, MDA-MB231 y MDA-MB468 37°C con 5% de CO2 en medio RPMI 1640 y/o medio MEM suplementado con FBS al 10% u otros suplementos tal como se recomienda por la ATCC para cada linea celular. Para probar la sensibilidad a los farmacos, las celulas se expusieron a una serie de concentraciones de cisplatino durante 48 horas. Se cuantifico el numero de celulas viables utilizando el ensayo CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay segun las instrucciones del fabricante (Promega). Los resultados se presentan como el porcentaje de celulas viables en los pocillos tratados con farmaco frente a los pocillos de control tratados con medio y se representan como curvas de supervivencia celular dependiente de la dosis del farmaco (Figura 1A). La sensibilidad a los farmacos se cuantifico como la dosis de farmaco que causa una reduction del 50% del crecimiento (IC50). Estos datos se generaron originalmente para un estudio separado en el que se informo como "datos no presentados" en Li et al. (2010) Nat. Medicina. 16, 214-218.

B. Cohorte de cancer de mama

[0113] Se trataron un total de 28 pacientes con TNBC principalmente esporadico con monoterapia de cisplatino en un entorno neoadyuvante (Silver et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28, 1145-1153). La respuesta del cisplatino se midio utilizando la puntuacion semicuantitativa de Miller-Payne mediante la evaluation patologica de muestras quirurgicas

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despues de la terapia (Ogston et al. (2003) Breast 12, 320-327). La respuesta patologica completa es equivalente a la puntuacion de Miller-Payne de 5 y se define como un carcinoma no invasivo residual de mama o ganglios linfaticos.

C. Preparacion de las muestras de cancer de mama

[0114] Se obtuvo una biopsia central congelada del tumor antes de iniciar el tratamiento. El tejido tumoral estaba disponible en la biopsia central congelada para 24 de los 28 casos y en muestras de biopsias centrales diagnosticas embebidas en parafina fijadas con formalina de otros 3 casos adicionales. Las celulas tumorales se enriquecieron mediante microdiseccion con aguja para extraer el estroma de secciones de tejido tenidos con hematoxilina y eosina (H y E). El tejido restante en el portaobjetos se examino por microscopla para la estimacion del enriquecimiento. Se extrajo el ADN de celulas tumorales enriquecidas mediante digestiones con proteinasa K y ARNasa A, extraccion con fenol/cloroformo seguido de precipitacion con etanol. Se obtuvo ADN adecuado para el analisis del genotipado de MIP (mlnimo 80 ng) de los 27 casos para los que se disponla de tejido tumoral. Se obtuvo el ADN normal emparejado de cada paciente de linfocitos de sangre periferica.

D. Analisis de genotipado de la sonda de inversion molecular (MIP)

[0115] Se envio ADN de muestras de biopsia de tumor de mama a Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) para el analisis de genotipado dirigido a MIP que genero una intensidad de la senal de alelo y genotipos para 42.000 polimorfismos de nucleotido unico (SNP) individuales. El conjunto de datos del genotipo completo de MIP esta disponible en la base de datos NCBI GEO.

E. Conjuntos de datos publicos

[0116] Se adquirieron los perfiles genomicos con Affymetrix SNP 6.0 de seis llneas celulares triple negativas de cancer de mama, BT20, BT549, HCC1187, HCC38, MDA-MB231 y MDA-MB468, del Wellcome Trust Sanger Institute (informacion disponible en la World Wide Web en
http://www.sanger.ac.uk/).

[0117] Los datos de SNP que representan 118 tumores de carcinoma de ovario dispuestos en la plataforma Affymetrix 50K XbaI se adquirieron de los omnibus de expresion genica (GEO, GSE13813; Etemadmoghadam et al (2009) Clin Cancer Res 15, 1417-1427.). De estos, 38 tumores eran del subtipo seroso, tenia tumor residual despues de la citorreduccion quirurgica de menos de 1 cm, y hablan recibido cisplatino adyuvante o tratamiento con carboplatino. La mayorla de los pacientes (35 de 38) tambien hablan recibido tratamiento con taxanos.

F. Genotipo y analisis del numero de copias

[0118] Se procesaron la intensidad de senal de alelos y los genotipos de del genotipado de MIP o los analisis de matrices de SNP mediante el algoritmo CRLMM (Lin et al. (2008) Genome Biol. 9, R63) tal como se aplica en el "oligo" del paquete R. Se determino el numero de copias de ADN usando el paquete R "AromaAffymetrix" (Bengtsson et al. (2008) Bioinformatics 24, 759-767). Los datos del genotipo procesados se exportaron a dChip (disponible en la World Wide Web en
http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) para la determinacion de la proporcion mayoritaria de copias (MCP), que se define como la relacion del numero de copias mayoritario con respecto al numero de copias mayoritario + menor (Li et al. (2008) Bioinformatics 9, 204). Se realizo una estimacion del grado de contaminacion de celulas normales mediante el grado de desplazamiento en la curva de MCP de la mayorla de regiones que muestran desequilibrio alelico a lo largo del genoma, con exclusion de todas las regiones de ganancia del numero de copias (Figuras 2B y 2C). El desplazamiento observado en las curvas de MCP genomicas en experimentos de mezcla de lineas celulares tumorales y normales emparejadas se utilizo como referencia para estimar la contaminacion normal, tal como se ha descrito (Waddell et al (2009) Breast Cancer Res Treat (4 Dec; publicadao online)). Por consiguiente, 21 de las 27 muestras de tumores de mama y 33 de 38 de los casos de cancer de ovario se estimo que tenian un 25% o menos de la contaminacion de ADN normal (contenido de tumor > 75%) y se consideraron aceptables para su posterior analisis.

[0119] El desequilibrio alelico (AI) se definio para los propositos de los ejemplos descritos en el presente documento como MCP > 0,70, lo que permite la deteccion de la mayoria de sucesos de perdidas de heterocigosidad (LOH) y de amplificaciones monoalelicas de copias elevadas en muestras con 25% o menos de contaminacion o heterogeneidad, pero que tambien excluye las ganancias de copia de bajo nivel (ganancias de 4 copias o menos). Las regiones de AI se definieron para los propositos de los ejemplos descritos en el presente documento como mas de 10 sondas consecutivas que muestran AI. En el conjunto de datos de TNBC, las regiones de AI definidas por estos criterios incluian todas las regiones LOH requeribles determinadas a partir de la comparacion de genotipo convencional. El numero total de copias (la combinacion de ambos alelos) se segmento mediante el algoritmo de segmentacion binaria circular. El ochenta y cinco por ciento de las regiones AI tenia un numero de copias total casi diploide o por debajo, el 9% de las regiones de AI mostro ganancia de copias totales de 3 y un 6% con una ganancia de copias totales > 4. Por lo tanto, las regiones de AI identificadas representan predominantemente LOH o delecion cromosomica uniparental.

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G. Asociacion entre el numero de aberraciones genomicas y la sensibilidad al platino in vitro

[0120] El numero de regiones de AI o regiones con aberracion en el numero de copias se compararon con valores IC50 especlficos de llneas celulares despues de aplicar un filtro de 1 Mb de tamano mlnimo para eliminar regiones muy pequenas que podrlan ser causadas por el ruido en los datos de SNP 6.0 (Figura 3). Para la comparacion de las regiones de AI telomerico e intersticial, el AI telomerico se definio para los propositos de los ejemplos descritos en el presente documento como el AI que se extiende hasta el telomero, pero que no cruza el centromero. Por el contrario, el AI intersticial se definio para los propositos de los ejemplos descritos en el presente documento como regiones de AI que no implican el telomero. Para investigar si habla un tamano mlnimo optimo de AI telomerico o segmentos de alteracion del numero de copias que mostraban una correlation superior a la IC50 del cisplatino, se utilizo la regresion lineal para comparar los valores de IC50 con el numero total de segmentos mas grandes que un cierto umbral, que se incremento en intervalos de 1 Mb entre 0 y 100 Mb (figura 5).

H. Asociacion entre el numero de regiones de AI telomerico y la sensibilidad al platino en tumores

[0121] Se determino el numero total de regiones de AI telomerico para cada caso de TNBC con un contenido de tumor de al menos un 75%. Se aplico el umbral del tamano de segmento mlnimo optimo de AI telomerico de 12 Mb hallado en las llneas celulares y se contaron NtAI12 para cada sujeto. Se realizo un analisis de la curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para evaluar la capacidad del numero total de segmentos de AI telomerico para predecir la pCR (puntuacion de Miller-Payne de 5) para el tratamiento con cisplatino. La asociacion de NtAI,12 con pCR al cisplatino se estimo mediante el area bajo la curva (AUC); el valor p correspondiente es la prueba de rangos de Wilcoxon de dos colas. Basandose en el analisis ROC, un NtAI,12 de 13 dio lugar a una sensibilidad del 100% para la prediction de pCR en la cohorte con TNBC tratada con cisplatino.

[0122] La asociacion entre NtAI,12 y el tiempo hasta la recurrencia despues de la terapia basada en platino en la cohorte de cancer de ovario se estimo mediante el analisis de Kaplan-Meier con el grupo de "NtAI,12 alto" definido como al menos 13 regiones de NtAI12. El valor p se basa en una prueba de rangos logarltmicos.

Ejemplo 2: El numero total de reordenamientos cromosomicos es predictivo de la sensibilidad a farmacos quimioterapeuticos

[0123] Sin pretender imponer ninguna teorla, se cree que la perdida intracromosomica heterocigosidad (LOH) o desequilibrio alelico (AI) resulta de una reparation incorrecta de las roturas de las dobles cadenas de ADN cromosomico que el recuento en todo el genoma de estos reordenamientos cromosomicos en una tumor especlfico puede indicar el grado de incompetencia en la reparacion del ADN, independientemente del defecto especlfico de reparacion del ADN causante. Por lo tanto, el numero total de reordenamientos cromosomicos en un tumor refleja la incapacidad para reparar el dano del ADN inducido por farmacos, tales como cisplatino, y por lo tanto, predice la sensibilidad a estos agentes. La sensibilidad al cisplatino de seis llneas celulares de TNBC para las que los datos de matrices de SNP estaban disponibles en Wellcome Trust Sanger Institute, Reino Unido, se determino de esta manera (Figura 1A). AI se determino por analisis de la proportion mayoritaria de copias (MCP), un procedimiento menos sensible a la contamination normal en muestras de tumores heterogeneos (Li et al. (2008) Bioinformatics 9, 204). La MCP es el numero de alelos de copia mayoritaria en un locus dividido por la suma de los alelos de copia mayoritaria mas menores (Figura 2). Las ganancias o reducciones en el numero total de copias de ADN en cada region cromosomica se dedujo utilizando software dChip (Lin et al. (2004) Bioinformatics 20, 1233-1240).

[0124] La lesion o lesiones de reparacion del ADN que hacen las celulas sensibles al cisplatino pueden inducir preferencialmente alteraciones cromosomicas de un tipo especlfico o con un intervalo de tamanos especlficos. En las seis llneas celulares, se analizo la asociacion entre la sensibilidad al cisplatino y cada una de las cuatro mediciones de alteraciones cromosomicas. Las cuatro mediciones fueron (1) el numero de regiones cromosomicas con AI (Nai), (2) el numero de aberraciones en el numero de copias (Ncna), (3) el numero de regiones con ganancia del numero de copias, y (4) el numero de regiones con disminucion del numero de copias (figura 3). De estas cuatro mediciones, la NAI se correlaciono mas fuertemente con la sensibilidad a cisplatino (R2 = 0,5).

[0125] Los defectos conocidos en la reparacion de roturas del ADN de doble cadena, incluyendo la perdida de BRCA1 o mutaciones en la helicasa Bloom, causa la formation espontanea de estructuras cromosomicas triradiales y cuadriradiales, que son indicios citologicos de recombination aberrante (Silver et al. (2007) Cell 128, 991-1002; Luo et al (2000) Nat Genet 26, 424-429; Xu et al (1999) Mol Cell 3, 389-395). La resolution de estos reordenamientos cromosomicos en la mitosis puede dar lugar a la perdida de fragmentos cromosomicos distales (telomericos) y grandes regiones de AI (Luo et al (2000) Nat Genet 26, 424-429; Vrieling (2001) Nat Genet. 28, 101102). Por lo tanto, las regiones de AI telomerico e intersticial (no telomerico) se compararon y se encontro que la correlacion entre la sensibilidad al cisplatino y el AI era mas fuerte cuando se limita a regiones de AI que implican telomeros, mientras que solo se observo una asociacion debil entre la sensibilidad a cisplatino y el numero de regiones de AI intersticial (figura 4).

[0126] A continuation, se determino si las correlaciones podrlan mejorarse entre la sensibilidad a cisplatino y las mediciones de las aberraciones genomicas mediante el analisis de un intervalo de tamanos de segmento mlnimos,

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en ilneas celulares de TNBC (Figura 1B y figuras 5A-5C). Se observo una correlacion significativa con la sensibilidad a cisplatino usando puntos de corte del tamano mlnimo de segmento de AI telomerico entre 5 y 25 Mb observandose el nivel de correlacion mas alto para el numero total de segmentos con AI telomerico (NtAi) de al menos 12 MB (R2 = 0,8 ; P = 0,016; Figura 1C). El analisis del tamano de segmento mlnimo optimo no mejoro sensiblemente la correlacion entre la sensibilidad a cisplatino y las mediciones de las aberraciones del numero de copias, que permanecio como no significativa (Figuras 5D-5F).

[0127] Tambien se investigo si misma asociacion entre NtAi y la sensibilidad a cisplatino estaba presente en muestras de tumores cllnicos utilizando el punto de corte optimo del tamano de segmento de 12 MB (NtAi,12). Se comparo el NtAi,12 con la respuesta a quimioterapia en pacientes con TNBC tratados con monoterapia de cisplatino preoperatoria (Silver et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28, 1145-1153). Las secciones de tejido de criostato de biopsias centrales previas al tratamiento se enriquecieron en celulas tumorales mediante microdiseccion con aguja, y se extrajo el ADN para el genotipado. Los genotipos de 42.000 SNP se determinaron con el sistema de genotipado dirigido a la Sonda de Inversion Molecular (MIP) (Affymetrix, Inc.) (Wang et al. (2007) Genome Biol. 8, R246). El grado de contaminacion de celulas normal se estimo a partir de los datos de genotipo de MIP tal como se ha descrito (Figura 2B; Li et al (2008) Bioinformatics 9, 204). No se observo ninguna asociacion entre el grado de contaminacion normal y la respuesta a cisplatino (R2 = 0,004, P = 0,75).

[0128] Se evaluaron los datos del genotipo de MIP de 21 casos con un contenido de celulas tumorales de al menos el 75% mediante el analisis de MCP para definir las regiones de AI telomerico, intersticial, o todo el cromosoma en todo el genoma (Figura 6A y Figura 7). Se observo una correlacion entre el NtAI,12 y la tasa de respuesta, tal como se cuantifica por la puntuacion de Miller-Payne (R2 = 0,5; P = 0,00032; Figura 6B; Ogston et al (2003) Breast 12, 320327), con un mayor numero de regiones tAI asociadas con una mayor sensibilidad a cisplatino. El analisis de la curva caracterlstica de operacion del receptor (ROC) revelo que el NtAI,12 se asociaba significativamente con la respuesta patologica completa a cisplatino (Miller-Payne 5) mediante el area bajo la curva (AUC = 0,85; P = 0,017; Figura 6C). No hubo asociacion aparente entre el numero de segmentos de AI intersticial (Figura 6 A) o el nivel de AI de todo el cromosoma (Figura 7) y la respuesta al cisplatino.

[0129] El carcinoma de ovario seroso se trata a menudo con terapias a base de platino. Se investigo un conjunto de datos de SNP disponibles publicamente gama de carcinomas de ovario tratados con cisplatino o carboplatino mas un taxano (Etemadmoghadam et al., (2009) Clin Cancer Res. 15, 1417-1427) y se identificaron 33 casos del subtipo seroso tratados despues optima de la citorreduccion quirurgica (tumor residual <1 cm) y pureza de tumor razonable (> 75%, estimada a partir de datos de SNP). El NtAI,12 se determino mediante analisis de MCP. En estos casos de cancer de ovario tratado con platino, se encontro una asociacion entre los niveles mas altos de AI telomerico en tumores y la ausencia de recalda en menos de un ano (Figura 8A). Se utilizo el analisis ROC en la cohorte de TNBC para definir un punto de corte de NtAI,12 de al menos 13 sucesos, lo que proporciono la mayor sensibilidad para la clasificacion de pCR a la terapia de platino en la cohorte de TNBC. Este punto de corte se utilizo para clasificar la cohorte del cancer ovarico en grupos de NtAI,12 altos y bajos y se encontro una mayor supervivencia libre de enfermedad, un indicador indirecto de la mayor sensibilidad al platino, en el grupo de NtAI,12 alto (Figura 8B).

[0130] Por lo tanto, la inestabilidad cromosomica, que se manifiesta por altos niveles de AI telomerico, caracterizan subconjuntos de TNBC y cancer de ovario, y, ademas, los niveles mas altos de estos cambios predicen vulnerabilidades terapeuticas especlficas. Aunque el TNBC esporadico parece similar al cancer de mama asociado a BRCA1 en los patrones de alteraciones cromosomicas y otros inmunofenotipos y caracterlsticas histologicas, el defecto o defectos moleculares precisos en el mantenimiento de la estabilidad cromosomica en estos tumores son desconocidos. Los resultados de los ejemplos descritos en este documento indican que la carga de reordenamientos cromosomicos resultantes de las roturas de la cadena de ADN reparadas incorrectamente son indicadores de los defectos de reparacion del ADN que sensibilizan las celulas a ciertas quimioterapias (Figura 9). Por tanto, los niveles de desequilibrio alelica proporcionan un biomarcador preciso para predecir la sensibilidad del tumor al tratamiento con agentes genotoxicos, independientemente del conocimiento de la lesion causante de la reparacion del ADN.

Claims (19)

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para predecir el resultado del tratamiento contra el cancer de un sujeto con un trastorno hiperproliferativo celular, que comprende determinar una puntuacion global de aberraciones cromosomicas (GCAS) mediante: (i) el analisis de una muestra biologica que comprende celulas tumorales obtenidas del sujeto para determinar si una pluralidad de loci cromosomicos distribuidos a lo largo del genoma muestran una aberracion cromosomica seleccionada del grupo que consiste en desequilibrio alelico (NAI), perdida de heterocigosidad (NLOH), aberraciones en el numero de copias (NCNA), ganancia del numero de copias (NCNG), disminucion del numero de copias (NCND) y combinaciones de los mismos, y (ii) la determination del recuento en todo el genoma de los loci cromosomicos que muestran aberraciones cromosomicas en la muestra biologica en relation a un control, en el que la suma de las aberraciones cromosomicas individuales en la muestra biologica predice el resultado del tratamiento contra el cancer del sujeto independientemente de la identification de aberraciones cromosomicas especlficas.
2. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el tratamiento contra el cancer es una terapia contra el cancer, tal como terapia que comprende inhibidores de la poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP), radioterapia, o tratamiento de quimioterapia que comprende agentes quimioterapeuticos basados en platino; preferiblemente, en el que los agentes quimioterapeuticos basados en platino se seleccionan del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino e iproplatino.
3. 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el sujeto es un humano.
4. 4. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el trastorno hiperproliferativo celular se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de ovario, cancer de vejiga de celulas transicionales, cancer de pulmon broncogenico, cancer de tiroides, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer de utero, cancer testicular, cancer gastrico, sarcomas de tejidos blandos y osteogenicos, neuroblastoma, tumor de Wilms, linfoma maligno (de Hodgkin y no Hodgkin), leucemia mieloblastica aguda, leucemia linfoblastica aguda, sarcoma de Kaposi, tumor de Ewing, mieloma multiple refractario, carcinomas de celulas escamosas de la cabeza, cuello, cuello del utero y vagina, cancer de colon y melanoma.
5. 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en celulas, llneas celulares, cortes histologicos, biopsias centrales congeladas, tejidos embebidos en parafina, tejidos fijados a formalina, biopsias, sangre completa, aspirado de pezon, suero, plasma, raspadura bucal, saliva, llquido cefalorraquldeo, orina, heces, y medula osea.
6. 6. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra biologica se enriquece en la presencia de celulas hiperproliferativas hasta al menos el 75% de la poblacion total de celulas; tal como, en el que el enriquecimiento se realiza segun al menos una tecnica seleccionada del grupo que consiste en microdiseccion con aguja, microdiseccion por laser, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia y clasificacion de celulas inmunologicas; y/o en el que una maquina automatizada realiza dicha al menos una tecnica para transformar as! la muestra biologica en una forma purificada enriquecida en la presencia de celulas hiperproliferativas.
7. 7. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la muestra biologica se obtuvo antes de que el sujeto haya recibido quimioterapia adyuvante, o en el que la muestra biologica se obtuvo despues de que el sujeto haya recibido quimioterapia adyuvante.
8. 8. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el control se determina a partir de una muestra de celulas no hiperproliferativas del paciente o miembro de la misma especie a la que pertenece el paciente, o en el que el control se determina a partir de la frecuencia media de aparicion del locus genomico de regiones cromosomicas del mismo grupo etnico dentro de la especie a la que pertenece el paciente; tal como, en el que el control proviene de tejido no canceroso que es el mismo tipo de tejido que dicho tejido canceroso del sujeto, o en el que el control proviene de tejido no canceroso que no es el mismo tipo de tejido que dicho tejido canceroso del sujeto.
9. 9. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que Nai se determina utilizando la proportion mayoritaria de copias (MCP); tal como, en el que Nai para una region genomica determinada se cuenta cuando MCP es superior a 0,70.
10. 10. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la pluralidad de loci cromosomicos se distribuye al azar a lo largo de todo el genoma al menos cada 100 kb de aDn.
11. 11. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la pluralidad de loci cromosomicos comprenden al menos un locus cromosomico en cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos; o en el que la pluralidad de loci cromosomicos comprenden al menos un locus cromosomico en cada uno de los brazos de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos.

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12. 12. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la pluralidad de loci cromosomicos comprenden al menos un locus cromosomico en al menos un telomero de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos; preferiblemente, en cada uno de los telomeros de cada uno de los 23 pares de cromosomas humanos.
13. 13. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la presencia de desequilibrio alelico (NAI) en regiones telomericas de los cromosomas predice el resultado del tratamiento contra el cancer del sujeto.
14. 14. Procedimiento, segun las reivindicaciones 1, 11 o 12, en el que las aberraciones cromosomicas tienen un tamano de segmento mlnimo de al menos 1 Mb o al menos 12 Mb.
15. 15. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la pluralidad de aberraciones cromosomicas comprende al menos 5 aberraciones cromosomicas o al menos 13 aberraciones cromosomicas.
16. 16. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que los loci cromosomicos se selecciona del grupo que consiste en polimorfismos de nucleotido unico (SNP), polimorfismos de longitud de fragmento de restriccion (RFLP) y repeticiones en tandem simples (STR).
17. 17. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que los loci cromosomicos se analizan usando al menos una tecnica seleccionada del grupo que consiste en sonda de inversion molecular (MIP), matriz de polimorfismos de nucleotido unico (SNP), hibridacion in situ, transferencia Southern, matrices de transcripcion, matriz de hibridacion genomica comparada (aCGH) y secuenciacion de proxima generacion.
18. 18. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el resultado del tratamiento se mide mediante al menos un criterio seleccionado del grupo que consiste en la supervivencia hasta la mortalidad, respuesta patologica completa, mediciones semicuantitativas de la respuesta patologica, remision cllnica completa, remision cllnica parcial, enfermedad cllnica estable, supervivencia libre de recurrencia, supervivencia libre de metastasis, supervivencia libre de enfermedad, disminucion de celulas tumorales circulantes, respuesta del marcador circulante y criterios RECIST.
19. 19. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que comprende ademas la determinacion de un regimen de tratamiento adecuado para el sujeto, tal como, en el que el dicho regimen de tratamiento adecuado comprende al menos un agente quimioterapeutico basado en platino cuando se determina una pluralidad de aberraciones cromosomicas genomicas o no comprende al menos un agente quimioterapeutico basado en platino cuando no se determina una pluralidad de aberraciones cromosomicas genomicas.