ES2578370T3 - Métodos para detectar fusiones génicas - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la presencia de una fusión génica en una muestra aislada obtenida de un sujeto que comprende: poner en contacto la muestra con una primera sonda complementaria con un primer ácido nucleico 5' con respecto a un punto de fusión entre el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en condiciones suficientes para que la primera sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico; poner en contacto la muestra con una segunda sonda complementaria con el primer ácido nucleico 3' con respecto al punto de fusión entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la segunda sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico; poner en contacto la muestra con una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios; detectar la presencia de la primera sonda y la segunda sonda; determina una relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda; y detectar la presencia de fusión génica si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es significativamente diferente de 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para detectar fusiones génicas.

CAMPO 5

Esta divulgación se refiere a métodos para detectar fusiones génicas, particularmente fusiones génicas oncogénicas.

ANTECEDENTES

10

Muchos cánceres se caracterizan por alteraciones en las rutas de señalización celular que conducen a un control aberrante de los procesos celulares, o a un crecimiento no controlado y la proliferación de células. Estas alteraciones a menudo están causadas por cambios genéticos (también denominados mutaciones) que afectan a la actividad de proteínas de señalización particulares. Un gen de fusión es un tipo de mutación que es un gen híbrido formado a partir de dos genes separados previamente o de regiones no contiguas previamente del mismo gen. Por ejemplo, 15 esto puede ocurrir como resultado de una translocación, deleción intersticial o inversión cromosómica.

Entre otros ejemplos conocidos, se ha indicado que los genes de tirosina cinasa, que codifican enzimas importantes que regulan directamente el crecimiento celular, contienen mutaciones oncogénicas. La actividad de la cinasa puede activarse, por ejemplo, por la sustitución o deleción en las secuencias aminoacídicas y, por lo tanto, provocan 20 carcinogénesis o contribuyen a cánceres agresivos frente a cánceres menos agresivos, o conducen a una propensión a la metástasis, o causan sensibilidad a fármacos o resistencia a fármacos. Aunque hay muchos ejemplos, la fusión génica de BCR-ABL es una que se ha asociado durante mucho tiempo con el cáncer; en particular, leucemia mielógena crónica (CML) y en algunos casos leucemia mielógena aguda (AML) o leucemia linfobástica aguda (ALL). Otros ejemplos incluyen transposiciones de genes que implican EML4/ALK (por ejemplo, 25 cáncer de pulmón), TMPRSS2/ERG (por ejemplo, cáncer de próstata), IgH/MYC (por ejemplo, linfoma de Burkitt), MYB/NFIB (por ejemplo, carcinomas del pecho y de cabeza y cuello), TMPRSS2/ETV4 (por ejemplo, cáncer de próstata), EWSR1/FLI1 (por ejemplo, sarcoma de Ewing), y muchos otros conocidos por los expertos en la técnica o aún por descubrir.

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En el contexto de la transformación neoplásica, es sabe que algunos genes son altamente prolíficos ya que pueden recombinarse con muchas parejas diferentes, por ejemplo, en las mismas entidades tumorales, por ejemplo, MLL en leucemias agudas (Collins y Rabbitts, Trends in Molecular Medicine, 8(9): 436-442 2002), EWSR1 en tumores óseos y de tejido blando (Helman y Meltzer, Nature Reviews Cancer, 3(9): 685-694, 2003), y RET en carcinomas de tiroides (Pierotti, Nature Reviews Cancer, 1(3): 245-250, 2001). Sin embargo, el mismo de gen de fusión también 35 puede dar lugar a tumores de derivaciones totalmente diferentes, y se ha descrito un gen de fusión particular, ETV6-NTRK3, en cánceres tan diversos como leucemia mieloide aguda, fibrosarcoma infantil, nefroma mesoblástico y carcinoma de mama (Tognon y col., Cancer Cell, 2(5): 367-376, 2002). También hay varios ejemplos en los que las aberraciones cromosómicas aparentemente idénticas producen diferentes genes de fusión. Una de las translocaciones más comunes en leucemia linfobástica aguda pre-B, t(1;19)(q23;p13) que conducen a una fusión de 40 TCF3/PBX1, puede dar como resultado una transcripción quimérica que consiste en dos genes completamente diferentes, MEF2D en 1q23 y DAZAP1 en 19q13 (Yuki y col., Cancer Science, 95 (6): 503-507, 2004). Se desvelan ensayos para la detección de productos de fusión en Scheidel Petrovic y col. (1998) y Clark (1988). Scheidel Petrovic y col. (1998) desvelan ensayos de protección de nucleasa para estudiar fusiones génicas en linfoma, y Clark y col., 1988 utilizan ensayos de protección de nucleasa para estudiar fusiones génicas indicativas de leucemia 45 mielógena crónica y leucemia linfocítica aguda usando una sonda específica para abarcar una unión de fusión.

Las fusiones génicas pueden ser marcadores de diagnóstico o dianas terapéuticas, así como útiles para predecir el pronóstico de los pacientes y/o la respuesta a los fármacos. Además, es evidente que pueden surgir múltiples fusiones en el mismo tumor o sujeto y/o que cada sujeto puede tener fusiones génicas médicamente relevantes que 50 difieren de otros sujetos afectados. Por consiguiente, las nuevas tecnologías para detectar fusiones génicas son sumamente importantes para hacer avances en la ciencia y la medicina.

RESUMEN

55

Se desvelan en el presente documento métodos para detectar la presencia de una fusión génica (tal como una fusión génica oncogénica) en una muestra de un sujeto. Los métodos desvelados pueden usarse para detectar fusiones génicas conocidas (tales como una translocación génica conocida, una deleción intersticial o inversión) y en algunos ejemplos, también pueden usarse para detectar fusiones génicas previamente desconocidas, por ejemplo una fusión entre dos genes en un punto de fusión previamente no identificado, o una fusión entre dos genes previamente desconocidos para participar en una fusión génica. Los métodos son altamente sensibles y específicos, opcionalmente pueden usarse para cuantificar fusiones génicas detectadas, y pueden usarse para detectar una fusión génica en cualquier molécula de ácido nucleico, tal como ADN o ARN. Los métodos desvelados también son responsables de la multiplexación, para detectar múltiples fusiones génicas en una muestra procedente de un sujeto, 5 o para detectar el mismo conjunto de fusiones génicas (o conjunto de genes, incluyendo algunas fusiones génicas) en muestras procedentes de múltiples sujetos.

Las anteriores y otras características de la divulgación se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas. 10

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra genes de tipo silvestre ejemplares (Genes 1 y 2) y un gen de fusión y una sonda de fusión ejemplar. Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión 15 hibrida y se detecta tras un tratamiento de nucleasa (línea continua). Cuando la fusión génica no está presente en una muestra, la sonda de fusión únicamente hibrida parcialmente en los Genes 1 y 2 y al menos la porción no hibridada se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (líneas discontinuas).

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra genes de tipo silvestre ejemplares (Genes 1 y 2) y un gen de 20 fusión y una sonda de fusión marcada directa ejemplar que tiene un solapamiento de cuatro nucleótidos con la porción 5' del gen de fusión. La etiqueta (biotina en este ejemplo) se localiza en el extremo 5' de la sonda. Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión hibrida y la etiqueta se detecta tras un tratamiento de nucleasa (panel superior). La sonda de fusión no hibrida en el Gen 1 y se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (panel central). La sonda de fusión hibrida en el Gen 2; sin embargo, el extremo 5' que incluye la etiqueta no hibrida 25 y se escinde por el tratamiento de nucleasa (panel inferior). Por lo tanto, la sonda etiquetada se detecta únicamente en muestras en las que está presente la fusión génica.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra genes de tipo silvestre de longitud completa ejemplares (Genes 1 y 2) y un gen de fusión y sondas flanqueantes ejemplares y una sonda de fusión ejemplar. El gen de fusión 30 incluye una porción 5' del Gen 1 y una porción 3' del Gen 2. La sonda 5' 1 y la sonda 3' 1 flanqueantes hibridan en el Gen 1 de longitud completa y se detectan tras un tratamiento de nucleasa. La sonda 5' 1 flanqueante también hibrida en el gen de fusión y se detecta tras un tratamiento de nucleasa; sin embargo la sonda 3' 1 flanqueante no hibrida en el gen de fusión y se hidroliza por tratamiento de nucleasa. La sonda 5' 2 y la sonda 3' 2 flanqueantes pueden incluirse opcionalmente en el ensayo; estas hibridan en el gen 2 de longitud completa y se detectan tras un 35 tratamiento de nucleasa. La sonda 3' 2 también hibrida en el gen de fusión y se detecta tras un tratamiento de nucleasa; sin embargo la sonda 5' 2 flanqueante no hibrida en el gen de fusión y se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (línea discontinua). Una sonda de fusión que abarca el punto de fusión también puede incluirse opcionalmente en el ensayo. Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión hibrida y se detecta tras un tratamiento de nucleasa (línea continua). Cuando la fusión génica no está presente en una muestra, 40 la sonda de fusión únicamente hibrida parcialmente en los Genes 1 y 2 y al menos la porción no hibridada se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (líneas discontinuas).

La figura 4 es un diagrama que muestra un ensayo en damero que detecta dianas de fusión transcritas de Bcr-Abl in vitro con sondas de fusión de Bcr-Abl (Tabla 4, a continuación). "Sí" indica señal detectable, "No" indica falta de 45 señal detectable.

Las figuras 5A y B son diagramas esquemáticos de métodos ejemplares de captura de una o más sondas de fusión y/o sondas flanqueantes en una matriz para detectar la presencia de uno o más genes de fusión en una única muestra. La figura 5A muestra la hibridación de una sonda de fusión o flanqueante marcada de forma detectable 50 (biotinilada en este caso) con un ácido nucleico diana (etapa 1), tratamiento de nucleasa (etapa 2), disociación de la sonda del ácido nucleico diana (etapa 3), hibridación de la sonda marcada de forma detectable en una micromatriz que incluye un ácido nucleico complementario a la sonda (etapa 4), y detección de la sonda marcada (etapas 5 y 6). La figura 5B muestra la hibridación de una sonda de fusión o flanqueante con un ácido nucleico diana (etapa 1), tratamiento de nucleasa (etapa 2), disociación de la sonda del ácido nucleico diana (etapa 3), hibridación de la sonda 55 en una micromatriz que incluye un enlazador de programación que es complementario a una porción de la sonda (etapa 4), hibridación con un enlazador de detección, cuya porción es complementaria a una porción diferente de la sonda (etapa 5), hibridación con un ácido nucleico marcado de forma detectable (biotinilado en este caso) que es complementario a una porción diferente del enlazador de detección (etapa 6), y detección del ácido nucleico marcado (etapa 7).Las figuras 6A-H son una serie de paneles que muestran la titulación de sondas de fusión para EML4-ALK-v1 (figura 6A), EML4-ALK-v2 (figura 6B), EML4-ALK-v3a (figura 6C), EML4-ALK-v3b-3 (figura 6D), EML4-ALK-v4 (figura 6E), EML4-ALK-v5a (figura 6F), EML4-ALK-v5b-3 (figura 6G) y EML4-ALK-v6 (figura 6H) con cantidades en aumento de los ARN transcritos (IVT) de EML4-ALK in vitro correspondientes.

5

Las figuras 7A y B son gráficos que muestran una señal obtenida usando las sondas flanqueantes de ALK identificadas con ALK IVT de longitud completa (figura 7A) o un ALK IVT truncado (figura 7B).

LISTA DE SECUENCIAS

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Cualquier secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos enumeradas en el presente documento o en la lista de secuencias adjunta se muestran usando abreviaturas de letras estándares para bases nucleotídicas, y un código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. En al menos algunos casos, únicamente se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. 15

Las SEQ ID NO: 1-32 son secuencias de ácidos nucleicos de sondas de fusión ejemplares.

Las SEQ ID NO: 33-132 son secuencias de ácidos nucleicos de sondas flanqueantes ejemplares.

20

Las SEQ ID NO: 133-146 son secuencias de ácidos nucleicos de la sonda de fusión de Bcr-Abl.

Las SEQ ID NO: 147-160 son secuencias de ácidos nucleicos del enlazador de programación de Bcr-Abl.

Las SEQ ID NO: 161-174 son secuencias de ácidos nucleicos del enlazador de detección de Bcr-Abl. 25

La SEQ ID NO: 175 es una secuencia de ácidos nucleicos de la región de fusión de Bcr-Abl E1A2 ejemplar.

La SEQ ID NO: 176 es una secuencia de ácidos nucleicos de la sonda de fusión de Bcr-Abl de "solapamiento corto" ejemplar. 30

Las SEQ ID NO: 177-184 son secuencias de ácidos nucleicos diana de la sonda de fusión EML4-ALK ejemplar.

Las SEQ ID NO: 185-192 son secuencias de ácidos nucleicos diana de la sonda flanqueante de 5'-ALK ejemplar.

35

Las SEQ ID NO: 193-200 son secuencias de ácidos nucleicos diana de la sonda flanqueante de 3'-ALK ejemplar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. Introducción 40

Se desvelan en el presente documento métodos para detectar una o más fusiones génicas en una muestra biológica. En algunas realizaciones, los métodos para detectar la presencia de un gen de fusión en una muestra procedente de un sujeto utilizan una sonda de fusión que abarca el punto de fusión entre dos ácidos nucleicos o genes. En realizaciones particulares, los métodos incluyen detectar la presencia de un ARNm del gen de fusión en 45 una muestra procedente de un sujeto. Los métodos pueden incluir poner en contacto una muestra procedente de un sujeto (tal como una muestra que incluye ácidos nucleicos) con una sonda de fusión. La sonda de fusión incluye una porción 5' complementaria a un primer ácido nucleico y una porción 3' complementaria a un segundo ácido nucleico, donde la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. La sonda de fusión se incuba con la muestra en condiciones suficientes para que la sonda de fusión hibride específicamente 50 en una fusión génica. La muestra se pone en contacto con una nucleasa especifica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa), y se detecta la presencia de la sonda de fusión. El gen de fusión se identifica como presente en la muestra cuando se detecta la sonda de fusión.

En algunos ejemplos, la sonda de fusión incluye una etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano 55 picante) y la detección de la presencia de la sonda de fusión incluye detectar la etiqueta detectable. En otros ejemplos, la sonda de fusión se detecta indirectamente, por ejemplo por hibridación con un ácido nucleico marcado complementario a toda o una porción de la sonda de fusión (por ejemplo, un "enlazador de programación"). En algunos ejemplos, la sonda de fusión se detecta usando una micromatriz, por ejemplo, una micromatriz que incluye un ácido nucleico que es complementario a la sonda de fusión (véase, por ejemplo, la figura 5A). En otros ejemplos, la sonda de fusión se detecta usando una micromatriz que incluye un enlazador de programación complementario a una porción de la sonda de fusión y que se incuba posteriormente con un enlazador de detección, cuya porción es complementaria a una porción separada de la sonda de fusión. El enlazador de detección puede marcarse de forma detectable, o una porción separada del enlazador de detección puede ser complementaria a un ácido nucleico 5 adicional que incluye una etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano picante). Véase, por ejemplo, la figura 5B.

En algunos ejemplos, los métodos incluyen detectar la presencia de más de un gen de fusión en una muestra procedente del sujeto. Los métodos pueden incluir poner en contacto una muestra procedente de un sujeto (tal como 10 una muestra que incluye ácidos nucleicos) con al menos dos sondas de fusión. Cada sonda de fusión incluye una porción 5' complementaria a un primer ácido nucleico y una porción 3' complementaria a un segundo ácido nucleico, donde la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico de una fusión génica particular (diferente). Las al menos dos sondas de fusión se incuban con la muestra en condiciones suficientes para que las sondas de fusión hibriden específicamente en la fusión génica. La muestra se pone en 15 contacto con una nucleasa especifica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa) y después la muestra se pone en contacto con una superficie que incluye al menos dos regiones espacialmente discretas que incluyen al menos un anclaje, donde cada anclaje está en asociación con un enlazador bifuncional que tiene una primera porción específica para (por ejemplo, complementaria a) el anclaje y una segunda porción específica para (por ejemplo, complementaria a) una de las al menos dos sondas de fusión, en condiciones suficientes para que las 20 sondas de fusión se unan (por ejemplo, hibriden en) el enlazador bifuncional, detectando las sondas de fusión hibridadas, e identificando la presencia de la fusión génica por la región espacialmente distinta a la que está unida la sonda de fusión.

En algunas realizaciones, las sondas de fusión de uso en los métodos desvelados tienen aproximadamente 10-25 200 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, la sonda de fusión incluye aproximadamente números equivalentes de nucleótidos de cada uno de los primeros y segundos ácidos nucleicos. En otros ejemplos, la sonda de fusión incluye un pequeño número de nucleótidos de uno de los dos ácidos nucleicos y un mayor número de nucleótidos del otro ácido nucleico. Por ejemplo, la porción 5' de la sonda puede tener aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud y la porción 3' de la sonda puede tener aproximadamente 10 nucleótidos o más de longitud, 30 o la porción 5' de la sonda puede tener aproximadamente 10 nucleótidos o más de longitud y la porción 3' de la sonda puede tener aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud.

En otras realizaciones, los métodos para detectar la presencia de un gen de fusión en una muestra procedente de un sujeto utilizan dos o más sondas que flanquean el punto de fusión entre dos ácidos nucleicos o genes. Los métodos 35 pueden incluir poner en contacto una muestra procedente de un sujeto con una primera sonda complementaria con un primer ácido nucleico 5' con respecto a un punto de fusión entre el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la primera sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico y poner en contacto la muestra con una segunda sonda complementaria con el primer ácido nucleico 3' con respecto al punto de fusión entre el primer y segundo ácidos nucleicos en condiciones suficientes para que la segunda sonda 40 hibride especialmente en el primer ácido nucleico. La muestra se pone en contacto con una nucleasa especifica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa), la presencia de la primera sonda y la segunda sonda se detecta, y se determina una relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda. El gen de fusión se identifica como presente en la muestra cuando la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es diferente de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente diferente de uno). En algunos ejemplos, la fusión 45 génica se detecta y no incluye una porción 3' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es mayor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor de uno). En otros ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 5' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es menor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente menos de uno). En algunos ejemplos, la primera sonda y la segunda sonda tienen cada una aproximadamente 10-50 200 ácidos nucleicos de longitud.

En algunos ejemplos, las primeras y/o segundas sondas (por ejemplo, las sondas flanqueantes) incluyen una etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano picante) y la detección de la presencia de la sonda o las sondas incluye detectar la etiqueta detectable. En algunos ejemplos, las sondas flanqueantes se marcan con la 55 misma etiqueta detectable. En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se marcan con diferentes etiquetas detectables. En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan indirectamente, por ejemplo por hibridación con un ácido nucleico marcado complementario a toda o una porción de la sonda de fusión (por ejemplo, un "enlazador de programación"). En algunos ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan usando una micromatriz, por ejemplo, una micromatriz que incluye ácidos nucleicos que son complementarios a las sondas flanqueantes (véase, por ejemplo, la figura 5A). En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan usando una micromatriz que incluye enlazadores de programación complementarios a una porción de cada una de las sondas flanqueantes y que se incuban posteriormente con enlazadores de detección, cuya porción es complementaria a una porción separada de las sondas flanqueantes. Los enlazadores de detección pueden marcarse de forma detectable, o una porción 5 separada de los enlazadores de detección es complementaria a ácidos nucleicos adicionales que incluyen una etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano picante). Véase, por ejemplo, la figura 5B.

En realizaciones adicionales, los métodos incluyen determinar el porcentaje de fusión génica en la muestra relativa al primer ácido nucleico o el segundo ácido nucleico. Estos métodos incluyen adicionalmente poner en contacto la 10 muestra con una sonda de fusión que incluye una porción 5' complementaria a un primer ácido nucleico y una porción 3' complementaria a un segundo ácido nucleico, en los que la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, en condiciones suficientes para que la sonda de fusión hibride específicamente en una fusión génica, además de poner en contacto la muestra con la primera sonda y la segunda sonda como anteriormente. Los métodos pueden incluir adicionalmente detectar la presencia de la sonda de fusión y 15 determinar una relación de la sonda de fusión con respecto a la primera sonda y/o una relación de la sonda de fusión con respecto a la segunda sonda.

En otras realizaciones, los métodos incluyen poner en contacto una muestra de un sujeto (tal como una muestra que incluye ácidos nucleicos) con dos o más sondas que flanquean el punto de fusión entre dos ácidos nucleicos o 20 genes. Los métodos pueden incluir poner en contacto una muestra procedente de un sujeto con una primera sonda complementaria con un primer ácido nucleico 5' con respecto a un punto de fusión entre el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la primera sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico y poner en contacto la muestra con una segunda sonda complementaria con el primer ácido nucleico 3' con respecto al punto de fusión entre el primer y segundo ácidos nucleicos en condiciones suficientes para que la 25 segunda sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico. La muestra se pone en contacto con una nucleasa especifica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa) y después la muestra se pone en contacto con una superficie que incluye al menos dos regiones espacialmente discretas que incluyen al menos un anclaje, donde cada anclaje está en asociación con un enlazador bifuncional que tiene una primera porción específica para (por ejemplo, complementaria a) el anclaje y una segunda porción específica para (por ejemplo, 30 complementaria a) una de las al menos sondas flanqueantes, en condiciones suficientes para que las sondas flanqueantes se unan a (por ejemplo, hibriden en) el enlazador bifuncional, detectando las sondas flanqueantes hibridadas, y determinando una relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda. La fusión génica se identifica como presente en la muestra cuando la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es diferente de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente diferente de uno). 35

En algunos ejemplos, una etapa de protección con nucleasa puede reducir la necesidad de una amplia manipulación de los ácidos nucleicos, particularmente ARN, que pueden ser sensibles a la degradación contaminando las nucleasas y, por lo tanto, con los que es difícil trabajar. Además, las realizaciones en las que no se requiere purificación de los ácidos nucleicos (antes o después de la hibridación de las sondas) disminuyen la variabilidad 40 inter-ensayo introducida por las etapas de extracción de ácidos nucleicos. Además, las realizaciones únicamente de lisis permiten la capacidad de medir tanto ácidos nucleicos solubles, así como ácidos nucleicos entrecruzados (por ejemplo, en secciones FFPE).

La protección de la nucleasa de una muestra puede permitir mayor sensibilidad y reproducibilidad en un ensayo. En 45 algunas realizaciones, los métodos dan como resultado un fondo disminuido, por ejemplo, ya que el tratamiento de nucleasa destruye la mayor parte de los ácidos nucleicos no específicamente hibridados. Por lo tanto, los ensayos desvelados pueden ser lo suficientemente sensibles de tal forma que la amplificación de la fusión génica no es necesaria para detectar una señal. Las realizaciones del método particular no incluyen específicamente una etapa de amplificación (por ejemplo, amplificación por PCR). Esto reduce los inconvenientes de una etapa de 50 amplificación, tal como artefactos específicos de secuencia o un intervalo dinámico limitado parcial, y la necesidad de usar ácidos nucleicos purificados e intactos. El aumento de la sensibilidad de los métodos desvelados permite realizar múltiples ensayos en una única muestra (por ejemplo, una única sección FFPE puede dividirse en múltiples ensayos). Además, el aumento de la sensibilidad del ensayo permite una detección génica de una única copia en tan sólo 1000 células. 55

Finalmente, los métodos desvelados son susceptibles de multiplexación, por ejemplo, usando una micromatriz. Las realizaciones de micromatrices particulares se analizan en la Sección V, a continuación. Esto permite la exploración o detección de múltiples fusiones génicas simultáneamente (tal como la detección de la misma fusión en muchas muestras, o la detección de múltiples fusiones génicas diferentes en una única muestra), por ejemplo al menos 10, al menos 25, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 750, al menos 1000, o más fusiones génicas en un único ensayo. La realización de micromatriz de multiplexación da como resultado la captura de sondas de fusión en ubicaciones espacialmente distintas, por lo tanto, las sondas de fusión pueden detectarse usando la misma etiqueta detectable y pueden distinguirse en base a 5 su posición en la micromatriz.

II. Términos

A menos que se indique otra cosa, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las 10 definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes VII, pubicado por Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); y George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2ª Edición, 2003 15 (ISBN: 0-471-26821-6).

Las siguientes explicaciones de términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente divulgación y para guiar a los expertos en la técnica para poner en práctica la presente divulgación. Las formas singulares "un", "una", y "el/la" se refieren a uno o más de uno, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, la 20 expresión "que comprende una célula" incluye células individuales o múltiples y se considera equivalente a la frase "que comprende al menos una célula". El término "o" se refiere a un único elemento de elementos alternativos indicados o una combinación de dos o más elementos, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Como se usa en el presente documento, "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, "que comprende A o B", significa "que incluye A, B o A y B", sin excluir elementos adicionales. 25

Los métodos y materiales adecuados para poner en práctica y ensayar la tecnología desvelada se describen a continuación; no obstante, pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

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Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Complementariedad: Capacidad para formar pares de bases entre ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos y sus análogos hibridan por enlace de hidrógeno, que incluye unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o 35 Hoogsteen inverso, entre bases complementarias. Generalmente, las moléculas de ácido nucleico consisten en bases nitrogenadas que son pirimidinas (citosina (C), uracilo (U) y timina (T)) o purinas (adenina (A) y guanina (G)). Estas bases nitrogenadas forman enlaces hidrógeno entre una pirimidina y una purina, y el enlace de la pirimidina con la purina se denomina como "emparejamiento de bases". Más específicamente, A será un enlace hidrógeno a T o U, y G se unirá a C. "Complementariedad" se refiere al emparejamiento de bases que se produce entre dos ácidos 40 nucleicos distintos o dos regiones distintas del mismo ácido nucleico.

"Específicamente hibridable" y "específicamente complementario" son expresiones que indican un grado suficiente de complementariedad de tal forma que se produce una unión estable y específica entre la sonda (o su análogo) y la diana de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN). La sonda o el análogo puede, pero no necesariamente, tener 45 una complementariedad del 100 % con respecto a su secuencia diana para ser hibridable específicamente. Una sonda o análogo es hibridable específicamente cuando hay suficiente grado de complementariedad para evitar la unión no específica de la sonda o el análogo a secuencias no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, por ejemplo en los métodos desvelados en el presente documento. Dicha unión se denomina hibridación específica. 50

Contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto forma sólida como líquida. Por ejemplo, el contacto puede producirse in vitro con una sonda de ácido nucleido y una sonda biológica en solución o sobre una superficie.

Detectar: Determinar si un agente (tal como una señal, nucleótido particular, aminoácido, molécula de ácido 55 nucleico y/u organismo) está presente o ausente, por ejemplo, un ácido nucleico de fusión génica. En algunos ejemplos, esto puede incluir adicionalmente cuantificación. Por ejemplo, el uso de los métodos desvelados y las sondas en ejemplos particulares permite la detección de una fusión génica en una muestra.

Etiqueta detectable: Un compuesto o composición que se conjuga directa o indirectamente en otra molécula (tal como una molécula de ácido nucleico, por ejemplo una sonda de fusión, una sonda flanqueante, o una sonda de detección) para facilitar la detección de esta molécula. Los ejemplos no limitantes específicos de etiquetas incluyen restos fluorescentes o fluorogénicos, restos cromogénicos, haptenos, etiquetas de afinidad e isótopos radioactivos. La etiqueta puede detectarse directamente (por ejemplo, ópticamente detectable) o indirectamente (por ejemplo, a 5 través de interacción con una o más moléculas adicionales que, a su vez, son detectables). Las etiquetas ejemplares en el contexto de las sondas desveladas en el presente documento se describen a continuación. Los métodos para etiquetar ácidos nucleicos, y orientación en la elección de etiquetas útiles para diversos fines, se analizan, por ejemplo, en Sambrook y Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) y Ausubel y col., en Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-10 Intersciences (1987, incluyendo actualizaciones).

Fusión génica: Un gen híbrido formado a partir de dos o más genes separados previamente. Las fusiones génicas pueden producirse como resultado de una transposición cromosómica, tal como una translocación, deleción intersticial o inversión cromosómica. El "punto de fusión" o "interrupción" de una fusión génica es el punto de 15 transición entre la secuencia del primer gen en la fusión a la secuencia del segundo gen en la fusión.

Las expresiones "fusión génica" y "gen de fusión" se usan de forma intercambiable e indican los productos de una transposición cromosómica, incluyendo, pero sin limitación, ADN (tal como ADN o ADNc genómico), ARN, (incluyendo ARNm), o una proteína. 20

Hibridación: La capacidad de ADN monocatenario complementario, ARN o híbridos de ADN/ARN para formar una molécula dúplex (también denominada un complejo de hibridación). Pueden usarse técnicas de hibridación de ácidos nucleicos para formar complejos de hibridación entre una sonda de ácido nucleico, y el gen está diseñado con respecto a una diana. En ejemplos no limitantes particulares, las sondas de ácidos nucleicos se optimizan para dirigir 25 los genes individuales o fusiones génicas que se enumeran en la Tabla 1.

Las condiciones de hibridación que dan como resultado grados particulares de astringencia variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación y la composición y la longitud de las secuencias de ácido nucleico de hibridación. Generalmente, la temperatura de la hibridación y la resistencia iónica (tal como la concentración de Na+) 30 del tampón de hibridación determinarán la astringencia de la hibridación. Los cálculos con respecto a las condiciones de hibridación para conseguir grados particulares de astringencia se analizan en Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (capítulos 9 y 11).

Nucleasa: Una enzima que escinde un enlace fosfodiéster. Una endonucleasa es una enzima que escinde un 35 enlace fosfodiéster interno en una cadena nucleotídica (a diferencia de las exonucleasas, que escinden un enlace fosfodiéster en el extremo de una cadena nucleotídica). Algunas nucleasas tienen tanto actividad endonucleasa como exonucleasa. Las endonucleasas incluyen endonucleasas de restricción u otras endonucleasas específicas de sitio (que escinden ADN en sitios específicos de secuencia), DNasa I, Bal 31 nucleasa, S1 nucleasa, nucleasa de soja verde, Ribonucleasa A, Ribonucleasa T1, RNasa I, RNasa PhyM, RNasa U2, RNasa CLB, nucleasa 40 microcócica, y endonucleasas apurínicas/apirimidínicas. Las exonucleasas incluyen exonucleasa III y exonucleasa VII. En ejemplos particulares, una nucleasa es específica para los ácidos nucleicos monocatenarios, tal como S1 nucleasa, nucleasa de soja verde, Ribonucleasa A o Ribonucleasa T1.

Ácido nucleico: Un polímero desoxirribonucleótido o de ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria, y a 45 menos que se limite de otro modo, que incluye análogos de nucleótidos naturales que hibridan en ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos de origen natural. El término "nucleótido" incluye, pero sin limitación, un monómero que incluye una base (tal como una pirimidina, purina o análogos sintéticos de las mismas) unida a un azúcar (tal como ribosa, desoxirribosa o análogos sintéticos de las mismas), o una base unida a un aminoácido, como un ácido nucleico peptídico (PNA). Un "nucleótido" también incluye un ácido nucleico bloqueado (LNA). Un 50 nucleótido es un monómero en un polinucleótido. Una secuencia nucleotídica se refiere a la secuencia de bases en un polinucleótido.

Sonda: Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, molécula de ácido nucleico diana de ADN genómico, ADNc, ARN o ARNm) y, después de la hibridación en 55 la diana, es capaz de detectarse directa o indirectamente. Por lo tanto, las sondas permiten la detección, y en algunos ejemplos cuantificación, de una molécula de ácido nucleico diana, tal como una molécula de ácido nucleico de fusión génica o una molécula de ácido nucleico que está implicado en un evento de fusión génica. En algunos ejemplos, una sonda incluye una etiqueta detectable. En algunos ejemplos, las sondas pueden incluir uno o más ácidos nucleicos peptídicos y/o uno o más ácidos nucleicos bloqueados.

Una sonda es capaz de hibridar con secuencias que incluyen una o más variantes de una secuencia "de tipo silvestre" o una porción de una secuencia (por ejemplo en una fusión génica). Por ejemplo, una sonda puede incluir una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad (tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 5 97 %, 98 %, 99 %, o más de identidad) con una secuencia génica de "tipo silvestre".

En algunos ejemplos, una "sonda de fusión" es una sonda que incluye secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridar con secuencias de dos genes separados cuando dos genes son parte de una fusión génica. Una sonda de fusión incluye una porción 5' capaz de hibridar con un primer ácido nucleico (por ejemplo, de un primer gen) y una 10 porción 3' capaz de hibridar con un segundo ácido nucleico (por ejemplo, de un segundo gen), donde la sonda de fusión abarca el punto donde el primer gen y el segundo gen se condensan (el "punto de fusión").

En otros ejemplos, una "sonda flanqueante" es una sonda que incluye secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridar con un único ácido nucleico y se sitúa 5' o 3' con respecto a un punto de fusión. Una sonda 5' flanqueante 15 incluye una sonda capaz de hibridar con una porción de un ácido nucleico 5' en un punto de fusión y una sonda 3' flanqueante incluye una sonda capaz de hibridar con una porción de un ácido nucleico 3' con respecto a un punto de fusión.

Muestra: Un especimen biológico que contiene ADN (por ejemplo, ADN genómico o ADNc), ARN (incluyendo 20 ARNm), proteína, o combinaciones de los mismos, obtenido de un sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, células, lisados celulares, preparaciones cromosómicas, sangre periférica, orina, saliva, biopsia tisular (tal como una biopsia tumoral o biopsia de nódulos linfáticos), especimen quirúrgico, médula ósea, muestras de amniocentesis y material de autopsia. En un ejemplo, una muestra incluye ARN, tal como ARNm. En ejemplos particulares, las muestras se usan directamente (por ejemplo, frescas o congeladas), o pueden manipularse antes del uso, por 25 ejemplo, por fijación (por ejemplo, usando formalina) y/o embebidas en cera (tal como muestras tisulares embebidas en parafina fijadas en formalina (FFPE)).

Identidad/similitud de secuencia: La identidad/similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o dos o más secuencias aminoacídicas, se expresa en cuanto a la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de 30 secuencia puede medirse en cuanto al porcentaje de identidad; cuanto mayor es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de ácido nucleico o aminoacídicas poseen una grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia al alinearse usando métodos convencionales.

Se conocen bien en la técnica métodos de alineación de secuencias para fines de comparación. Se describen 35 diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3,1989; Corpet y col., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988; Huang y col. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson y col., Meth. Mol. Bio. 24: 307-31, 1994. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990, presentan una consideración detallada de métodos de 40 alineación de secuencias y cálculos de homología.

La herramienta de búsqueda de alineación local básica del NCBI (BLAST) (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) y en Internet, para su uso junto con los 45 programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se usa blastn para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que se usa blastp para comparar secuencias aminoacídicas. Puede encontrarse información adicional en el sitio web del NCBI.

Una vez alineadas, se determina el número de coincidencias contando el número de posiciones donde se presenta 50 un nucleótido o residuo aminoacídico idéntico en ambas secuencias. Se determina el porcentaje de identidad de secuencia dividiendo el número de coincidencias entre la longitud de la secuencia expuesta en la secuencia identificada, o entre una longitud articulada (tal como 100 nucleótidos o residuos aminoacídicos consecutivos de una secuencia expuesta en una secuencia identificada), seguido de la multiplicación del valor resultante por 100.

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Una indicación de que dos moléculas de ácido nucleico están estrechamente relacionadas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones de astringencia. Las condiciones de astringencia dependen de la secuencia y son diferentes en condiciones ambientales diferentes.

Las sondas de ácido nucleico desveladas en el presente documento no se limitan a las secuencias exactas mostradas, ya que los expertos en la técnica apreciarán que pueden hacerse cambios a una secuencia, y no afectan sustancialmente a la capacidad de una sonda para funcionar como se desee. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan secuencias que tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93%, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 5 97 %, al menos el 98%, o al menos el 99 %, tal como el 100 % de identidad de secuencia con respecto a las sondas desveladas. Un experto en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan únicamente como orientativos; es posible que puedan usarse sondas que estén fuera de estos intervalos.

Sujeto: Cualquier organismo que tiene un genoma, incluyendo virus, organismos unicelulares (tales como bacterias 10 o levadura), u organismos invertebrados o vertebrados multicelulares (tales como mamíferos humanos y no humanos). En un ejemplo, se sabe o se sospecha que un sujeto tiene un tumor asociado a una fusión génica.

III. Métodos para detectar fusiones génicas usando una sonda de fusión

15

En algunas realizaciones, los métodos utilizan una sonda de fusión que abarca el punto de fusión entre dos ácidos nucleicos o genes. En algunos ejemplos, una muestra se pone en contacto con la sonda de fusión y se trata con una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios. Únicamente la sonda que se hibrida y forma de esta manera un dúplex con el gen diana (por ejemplo, un ácido nucleico que tiene la fusión génica diana) sobrevivirá al tratamiento con nucleasa y se detectará posteriormente. La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra genes 20 de tipo de silvestre y de fusión ejemplares y una sonda de fusión ejemplar. Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión hibrida y se detecta tras un tratamiento de nucleasa (línea continua). Cuando la fusión génica no está presente en una muestra, la sonda de fusión únicamente hibrida parcialmente en los Genes 1 y 2 y cualquier porción de la sonda de fusión que no está sometida a duplexación con una diana se hidroliza por el tratamiento con nucleasa. En algunos ejemplos, la porción de la sonda de fusión que se somete a duplexación en el 25 Gen 1 o el Gen 2 sobrevive al tratamiento con nucleasa, pero no se detecta (por ejemplo, ya que la porción detectable de la sonda está hidrolizada).

Los métodos pueden incluir poner en contacto una muestra (tal como una muestra que incluye ácidos nucleicos, por ejemplo una muestra de un sujeto) con una sonda de fusión que tiene una porción 5' complementaria a un primer 30 ácido nucleico y una porción 3' complementaria a un segundo ácido nucleico donde la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. La sonda se incuba con la muestra en condiciones suficientes para que la sonda de fusión hibride específicamente en una fusión génica. La muestra se pone en contacto con una nucleasa especifica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa), y se detecta la presencia de la sonda de fusión. El gen de fusión se identifica como presente en la muestra cuando se 35 detecta la sonda de fusión. En ejemplos particulares, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son ARNm (por ejemplo, el ácido nucleico de fusión génica detectado es ARNm).

Los métodos desvelados son susceptibles a multiplexación. Esto permite la exploración o detección de múltiples fusiones génicas simultáneamente (tal como la detección de la misma fusión en muchas muestras, o la detección de 40 múltiples fusiones génicas diferentes en una única muestra), por ejemplo al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 750, al menos 1000, o más fusiones génicas en un único ensayo. En algunos ejemplos, pueden incluirse sondas de fusión específicas para dos o más fusiones génicas distintas (por ejemplo, fusiones génicas que implican una combinación diferente de genes o fusiones génicas que implican los mismos genes, pero diferentes puntos de 45 fusión) en el ensayo. En otros ejemplos, se usa la misma sonda para múltiples muestras y la identidad de la muestra se basa en la misma ubicación (por ejemplo, la posición en una micromatriz). Las sondas de fusión pueden marcarse (directa o indirectamente) con diferentes etiquetas detectables con el fin de identificar las fusiones génicas. Como alternativa, las sondas de fusión pueden marcarse (directa o indirectamente) con la misma etiqueta y su identidad puede determinarse basándose en su posición espacial (por ejemplo en una micromatriz). 50

Un experto en la técnica puede identificar condiciones suficientes para que una sonda de fusión hibride específicamente en una fusión génica, tal como una fusión génica presente en una muestra procedente de un sujeto. Por ejemplo, un experto en la técnica puede determinar experimentalmente las características (tal como la longitud, composición de la base y grado de complementariedad) que permitirán que un ácido nucleico (por ejemplo, una 55 sonda de fusión) hibride en otro ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico de fusión génica) en condiciones de astringencia seleccionada, minimizando al mismo tiempo la hibridación no específica en otras sustancias o moléculas. Típicamente, la secuencia de ácido nucleico de una sonda de fusión tendrá una complementariedad suficiente con respecto a la fusión génica correspondiente para permitirle hibridar en condiciones de hibridación astringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de fusión) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal 5 como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, aproximadamente de 100 pM a aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaHastringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de fusión) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal 5 como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, aproximadamente de 100 pM a aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaHastringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de fusión) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal 5 como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, aproximadamente de 100 pM a aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaHastringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de fusión) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal 5 como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, aproximadamente de 100 pM a aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaHastringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda de fusión) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal 5 como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, aproximadamente de 100 pM a aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaH

Los ácidos nucleicos en la muestra se desnaturalizan (por ejemplo de aproximadamente 95 ºC a aproximadamente 105 ºC durante aproximadamente 5-15 minutos) y se hibridan en una fusión génica entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 24 horas (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 hora a 20 horas, o de 15 aproximadamente 6 horas a 16 horas) a una temperatura que varía de aproximadamente 4 ºC a aproximadamente 70 ºC (por ejemplo, de aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 65 ºC, de aproximadamente 45 ºC a aproximadamente 60 ºC, o de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 60 ºC). En algunos ejemplos, la sonda de fusión se incuba con la muestra a una temperatura de al menos aproximadamente 40 ºC, al menos aproximadamente 45 ºC, al menos aproximadamente 50 ºC, al menos aproximadamente 55 ºC, al menos 20 aproximadamente 60 ºC, al menos aproximadamente 65 ºC, o al menos aproximadamente 70 ºC. En un ejemplo, la sonda de fusión se incuba con la muestra a aproximadamente 60 ºC. En otro ejemplo, la sonda de fusión se incuba con la muestra a aproximadamente 50 ºC. Estas temperaturas de hibridación son ejemplares, y un experto en la técnica puede seleccionar una temperatura de hibridación apropiada dependiendo de factores tales como la longitud y la composición nucleotídica de la sonda de fusión. 25

En algunas realizaciones, los métodos no incluyen la purificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la purificación de ácido nucleico no se realiza antes de poner en contacto la muestra con la sonda de fusión y/o la purificación de ácido nucleico no se realiza tras poner en contacto la muestra con la sonda de fusión). En algunos ejemplos, no se requiere ningún procesamiento previo de la muestra excepto para la lisis celular. En algunos ejemplos, la lisis celular 30 y la puesta en contacto de la muestra con la sonda de fusión se producen secuencialmente. En otros ejemplos, la lisis celular y la puesta en contacto de la muestra con la sonda de fusión se producen simultáneamente, en algunos ejemplos no limitantes sin ninguna etapa intermedia.

Tras la hibridación de la sonda de fusión y los ácidos nucleicos en la muestra, la muestra se somete a un 35 procedimiento de protección de nucleasa. Las sondas de fusión que han hibridado en una fusión génica no se hidrolizan por la nucleasa y pueden detectarse posteriormente.

El tratamiento con una o más nucleasas destruirá las moléculas de ácido nucleico distintas de las sondas de fusión que han hibridado en un ácido nucleico de fusión génica presente en la muestra. Por ejemplo, si la muestra incluye 40 un extracto o lisado celular, los ácidos nucleicos no deseados, tales como ADN genómico, ADNc, ARNt, ARNr y ARNm distintos de la fusión génica de interés y porciones de la fusión génica de interés que no se hibridan en secuencias de sonda complementarias, pueden destruirse sustancialmente en esta etapa. Puede usarse cualquiera de una diversidad de nucleasas, incluyendo, RNAsa pancreática, nucleasa de soja verde, S1 nucleasa, RNAsa A, Ribonucleasa T1, Exonucleasa III, Exonucleasa VII, RNAsa CLB, RNAsa PhyM, RNAsa U2, o similares, 45 dependiendo de la naturaleza de los complejos hibridados y de los ácidos nucleicos no deseados presentes en la muestra. Un experto en la técnica puede seleccionar una nucleasa apropiada, por ejemplo en base a si se detecta ADN o ARN. En un ejemplo particular, la nucleasa es específica para ácidos nucleicos monocatenarios, por ejemplo S1 nucleasa. Una ventaja de usar una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios en algunas realizaciones del método desveladas en el presente documento es eliminar dichas moléculas monocatenarias 50 ("cohesivas") de las etapas de reacción posteriores donde pueden conducir a antecedentes innecesarios o reactividad cruzada. La S1 nucleasa está disponible en el mercado, por ejemplo, en Promega, Madison, WI (cat. Nº M5761); Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad, CA (cat. Nº 18001-016); Fermentas, Glen Burnie, MD (cat. Nº EN0321), y otros. Las condiciones de reacción para estas enzimas se conocen bien en la técnica y pueden optimizarse empíricamente. 55

En algunos ejemplos, se añade S1 nucleasa diluida en un tampón apropiado (tal como acetato sódico 0,25 M, pH 4,5, NaCl 1,4 M, ZnSO4 0,0225 M, KATHON al 0,05 %) a la mezcla de sonda hibridada y se incuba a aproximadamente 50 ºC durante aproximadamente 30-120 minutos (por ejemplo, aproximadamente 60-90 minutos) para digerir el ácido nucleico sin hibridar y la sonda de fusión.

Las muestras se tratan opcionalmente para eliminar de otro modo el material sin hibridar y/o para inactivar o eliminar las enzimas residuales (por ejemplo, por extracción de fenol, precipitación, filtración de columna, etc.). En algunos ejemplos, las muestras se tratan opcionalmente para disociar el ácido nucleico diana (tal como una fusión génica 5 diana o un gen diana de longitud completa o de tipo silvestre) de la sonda (por ejemplo, usando hidrólisis de base y calor). Después de la hibridación, la diana hibridada puede degradarse, por ejemplo, por nucleasas o por tratamientos químicos, dando la sonda de fusión en proporción directa a la cantidad de sonda que se ha hibridado en diana. Como alternativa, la muestra puede tratarse para dar la porción hibridada (monocatenaria) de la diana, o el dúplex formado por la diana hibridada y la sonda, que se analizará adicionalmente. 10

Después, se detecta la presencia de la sonda de fusión. Puede usarse cualquier método adecuado para detectar la sonda de fusión tras la hibridación y el tratamiento con nucleasa. En algunos ejemplos, la sonda de fusión incluye una etiqueta detectable y la detección de la presencia de la sonda de fusión incluye detectar indirectamente la etiqueta detectable. En otros ejemplos, la sonda de fusión se detecta indirectamente, por ejemplo por hibridación con 15 un ácido nucleico marcado. En algunos ejemplos, la sonda de fusión se detecta usando una micromatriz, por ejemplo, una micromatriz que incluye un ácido nucleico marcado de forma detectable (por ejemplo marcado con biotina o peroxidasa de rábano picante) que es complementario a la sonda de fusión (véase, por ejemplo, la figura 5A). En otros ejemplos, la sonda de fusión se detecta usando una micromatriz que incluye un enlazador de programación complementario a una porción de la sonda de fusión y que se incuba posteriormente con un enlazador 20 de detección, cuya porción es complementaria a una porción separada de la sonda de fusión. El enlazador de detección puede marcarse de forma detectable, o una porción separada del enlazador de detección es complementaria a un ácido nucleico adicional que incluye una etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano picante). Véase, por ejemplo, la figura 5B. Los métodos de detección de las sondas se proporcionan en más detalle en la Sección V a continuación. 25

En algunas realizaciones, las sondas de fusión de uso en los métodos desvelados tienen aproximadamente 10-200 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, las sondas de fusión de uso en los métodos desvelados son de no más de 500, no más de 400, no más de 300, o no más de 200 nucleótidos de longitud, tal como de 20 a 100 nucleótidos de longitud. En algunos ejemplos, la sonda de fusión incluye aproximadamente números iguales de 30 nucleótidos de cada uno de los primeros y segundos ácidos nucleicos. Las sondas de fusión se analizan en más detalle en la Sección VIB, a continuación.

En otros ejemplos, la sonda de fusión incluye un pequeño número de nucleótidos complementarios a uno de los dos ácidos nucleicos (un "solapamiento corto") y un número mayor de nucleótidos del otro ácido nucleico. En ejemplos 35 particulares, la porción de "solapamiento corto" de la sonda de fusión también incluye una etiqueta detectable (tal como biotina, fluoresceína u otras moléculas fluorescentes, digoxigenina o dinitrofenol). La sonda de fusión puede marcarse terminalmente (por ejemplo, la etiqueta detectable se incluye en el extremo 5' o 3' de la sonda) o la etiqueta detectable puede incluirse en una o más posiciones internas de la sonda de fusión. La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra genes de tipo de silvestre y de fusión ejemplares y una sonda de fusión 40 marcada directa ejemplar que tiene un solapamiento de cuatro nucleótidos con la porción 5' del gen de fusión. La etiqueta (biotina en este ejemplo) se sitúa en o cerca del extremo 5' de la sonda (por ejemplo en el extremo 5' o en la porción de "solapamiento corto" de la sonda). Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión hibrida y la etiqueta se detecta tras un tratamiento de nucleasa (panel superior). La sonda de fusión no hibrida en el Gen 1 y se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (panel central). La sonda de fusión hibrida en el Gen 2, sin 45 embargo, el extremo 5' que incluye la etiqueta no hibrida y se escinde por el tratamiento de nucleasa (panel inferior). Por lo tanto, la sonda etiquetada se detecta únicamente en muestras en las que está presente la fusión génica.

En algunos ejemplos, la porción 5' de la sonda puede tener aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud y la porción 3' de la sonda puede tener aproximadamente 10-200 nucleótidos o más de longitud, o la porción 5' de la 50 sonda puede tener aproximadamente 10-200 nucleótidos o más de longitud y la porción 3' de la sonda puede tener aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud. Las sondas de fusión de solapamiento corto se analizan en más detalle en la Sección VIB, a continuación.

IV. Métodos para detectar fusiones génicas usando la relación de las sondas flanqueantes 55

En otras realizaciones, los métodos para detectar la presencia de un gen de fusión en una muestra procedente de un sujeto utilizan dos o más sondas que flanquean el punto de fusión entre dos ácidos nucleicos o genes. La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra genes de tipo silvestre y de fusión ejemplares y sondas flanqueantes ejemplares y (una sonda de fusión ejemplar opcional). El gen de fusión incluye una porción 5' del Gen 1 y una porción 3' del Gen 2 (panel central). La sonda 5' 1 y la sonda 3' 1 flanqueantes hibridan en el Gen 1 de longitud completa (por ejemplo, de tipo silvestre) y se detectan tras un tratamiento de nucleasa (panel superior). La sonda 5' 1 flanqueante también hibrida en el gen de fusión y se detecta tras un tratamiento de nucleasa (panel central); sin embargo, la sonda 3' 1 flanqueante no hibrida en el gen de fusión y se hidroliza por tratamiento de nucleasa (panel 5 central). La sonda 5' 2 y la sonda 3' 2 flanqueantes pueden incluirse opcionalmente en el ensayo; estas hibridan en el Gen 2 de longitud completa (por ejemplo, de tipo silvestre) y se detectan tras un tratamiento de nucleasa (panel inferior). La sonda 3' 2 también hibrida en el gen de fusión y se detecta tras un tratamiento de nucleasa; sin embargo, la sonda 5' 2 flanqueante no hibrida en el gen de fusión y se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (panel central). Una sonda de fusión que abarca el punto de fusión puede incluirse también opcionalmente en el ensayo. 10 Cuando la fusión génica está presente en una muestra, la sonda de fusión hibrida y se detecta tras un tratamiento de nucleasa (línea continua). Cuando la fusión génica no está presente en una muestra, la sonda de fusión únicamente hibrida parcialmente en los Genes 1 y 2 y se hidroliza por el tratamiento de nucleasa (líneas discontinuas). En algunos ejemplos, la porción de la sonda de fusión que se somete a duplexación en el Gen 1 o el Gen 2 se mantiene, pero no se detecta (por ejemplo, porque la porción detectable de la sonda está hidrolizada). 15

Los métodos pueden incluir poner en contacto una muestra procedente de un sujeto con una primera sonda complementaria con un primer ácido nucleico 5' con respecto a un punto de fusión entre el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la primera sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico, poner en contacto la muestra con una segunda sonda complementaria con el primer ácido nucleico 3' 20 con respecto al punto de fusión entre el primer y segundo ácidos nucleicos en condiciones suficientes para que la segunda sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico, poner en contacto la muestra con una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, S1 nucleasa), detectar la presencia de la primera sonda y la segunda sonda, y determinar una relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda. El gen de fusión se identifica como presente en la muestra cuando la relación de la primera sonda con respecto a la 25 segunda sonda es diferente de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente diferente de uno). En algunos ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 3' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es mayor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor de uno). En otros ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 5' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es menor de uno (por ejemplo, estadísticamente 30 significativamente menos de uno). En ejemplos particulares, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son ARNm (por ejemplo, el ácido nucleico de fusión génica detectado es ARNm). En otros ejemplos, los métodos incluyen determinar una relación de la segunda sonda con respecto a la primera sonda. En algunos ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 5' del primer ácido nucleico si la relación de la segunda sonda con respecto a la primera sonda es mayor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor de uno). En 35 otros ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 3' del primer ácido nucleico si la relación de la segunda sonda con respecto a la primera sonda es menor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente menos de uno). En algunos ejemplos, la primera sonda y la segunda sonda tienen cada una aproximadamente 10-200 ácidos nucleicos de longitud. En algunos ejemplos, la muestra se pone en contacto con dos o más sondas que son complementarias al primer ácido nucleico 5' con respecto al punto de fusión y/o se pone en contacto con dos o 40 más sondas que son complementarias al primer ácido nucleico 3' con respecto al punto de fusión. En otros ejemplos, la muestra se pone en contacto con una o más sondas que son complementarias al primer ácido nucleico en la fusión génica (por ejemplo al menos una sonda 5' flanqueante y al menos una sonda 3' flanqueante) y una o más sondas que son complementarias al segundo ácido nucleico en la fusión génica (por ejemplo, al menos una sonda 5' flanqueante y al menos una sonda 3' flanqueante). Aún en ejemplos adicionales, la muestra se pone en contacto con 45 una o más sondas 5' y 3' flanqueantes complementarias a un primer o segundo ácido nucleico en una fusión génica y una o más sondas 5' y 3' flanqueantes complementarias a un primer o segundo ácido nucleico en una fusión génica diferente. Las sondas pueden marcarse con diferentes etiquetas detectables o pueden marcarse con la misma etiqueta detectable y distinguirse en base a información espacial (por ejemplo, usando una micromatriz).

50

Los métodos desvelados son susceptibles a multiplexación. Esto permite la exploración o detección de múltiples fusiones génicas simultáneamente (tal como la detección de la misma fusión en muchas muestras, o la detección de múltiples fusiones génicas diferentes en una única muestra), por ejemplo al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 750, al menos 1000, o más fusiones génicas en un único ensayo. En algunos ejemplos, pueden incluirse las 55 sondas 5' y 3' flanqueantes específicas para dos o más fusiones génicas distintas (por ejemplo, fusiones génicas que implican una combinación diferente de genes o fusiones génicas que implican los mismos genes, pero diferentes puntos de fusión) en el ensayo. En otros ejemplos, se usa el mismo conjunto de sondas flanqueantes para múltiples muestras y la identidad de la muestra se basa en la misma ubicación (por ejemplo, la posición en una micromatriz). Las sondas flanqueantes pueden marcarse (directa o indirectamente) con diferentes etiquetas detectables con el fin de identificar las fusiones génicas. Como alternativa, las sondas flanqueantes pueden marcarse (directa o indirectamente) con la misma etiqueta y su identidad puede determinarse basándose en su posición espacial (por ejemplo en una micromatriz).

5

Un experto en la técnica puede identificar condiciones suficientes para una sonda (tal como una sonda 5' flanqueante y una sonda 3' flanqueante) para hibridar específicamente en un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico de longitud completa y/o de fusión génica presente en una muestra de un sujeto. Por ejemplo, un experto en la técnica puede determinar experimentalmente las características (tal como la longitud, composición de la base y grado de complementariedad) que permitirán que un ácido nucleico (por ejemplo, una sonda flanqueante) hibride en 10 otro ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico de longitud completa o de fusión génica) en condiciones de astringencia seleccionada, minimizando al mismo tiempo la hibridación no específica en otras sustancias o moléculas. Típicamente, la secuencia de ácido nucleico de una sonda flanqueante tendrá suficiente complementariedad con el gen de longitud completa correspondiente y la fusión génica para permitirle hibridar en condiciones de hibridación astringente seleccionadas, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 37 ºC o más (tal 15 como aproximadamente 37 ºC, 42 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC, o más). Entre los parámetros de reacción de hibridación que pueden variarse se encuentran la concentración de sal, tampón, pH, temperatura, tiempo de incubación, cantidad y tipo de desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, puede añadirse ácido nucleico (por ejemplo, una sonda flanqueante) a una muestra a una concentración que varía de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 10 nM (tal como de aproximadamente 30 pM a 5 nM, de aproximadamente 100 pM a 20 aproximadamente 1 nM), en un tampón tal como, por ejemplo, 6X SSPE-T (NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM, y Triton X-100 al 0,05 %) o tampón de lisis (descrito a continuación). En un ejemplo, la sonda se añade a la muestra a una concentración final de aproximadamente 30 pM. En otro ejemplo, la sonda se añade a la muestra a una concentración final de aproximadamente 167 pM. En un ejemplo adicional, la sonda se añade a la muestra a una concentración final de aproximadamente 1 nM. 25

Los ácidos nucleicos en la muestra se desnaturalizan (por ejemplo de aproximadamente 95 ºC a aproximadamente 105 ºC durante aproximadamente 5-15 minutos) y se hibridan en una fusión génica entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 24 horas (por ejemplo, al menos aproximadamente 1 hora a 20 horas, o de aproximadamente 6 horas a 16 horas) a una temperatura que varía de aproximadamente 4 ºC a aproximadamente 30 70 ºC (por ejemplo, de aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 65 ºC, de aproximadamente 45 ºC a aproximadamente 60 ºC, o de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 60 ºC). En algunos ejemplos, las sondas flanqueantes se incuban con la muestra a una temperatura de al menos aproximadamente 40 ºC, al menos aproximadamente 45 ºC, al menos aproximadamente 50 ºC, al menos aproximadamente 55 ºC, al menos aproximadamente 60 ºC, al menos aproximadamente 65 ºC, o al menos aproximadamente 70 ºC. En un ejemplo, las 35 sondas flanqueantes se incuban con la muestra a aproximadamente 60 ºC. En otro ejemplo, las sondas flanqueantes se incuban con la muestra a aproximadamente 50 ºC. Estas temperaturas de hibridación son ejemplares, y un experto en la técnica puede seleccionar una temperatura de hibridación apropiada dependiendo de factores tales como la longitud y la composición nucleotídica de las sondas flanqueantes.

40

En algunas realizaciones, los métodos no incluyen la purificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la purificación de ácido nucleico no se realiza antes de poner en contacto la muestra con las sondas flanqueantes y/o la purificación del ácido nucleico no se realiza tras poner en contacto la muestra con las sondas flanqueantes). En algunos ejemplos, no se requiere ningún procesamiento previo de la muestra excepto para la lisis celular. En algunos ejemplos, la lisis celular y la puesta en contacto de la muestra con las sondas flanqueantes se producen 45 secuencialmente. En otros ejemplos, la lisis celular y la puesta en contacto de la muestra con las sondas flanqueantes se producen simultáneamente, en algunos ejemplos no limitantes sin ninguna etapa intermedia.

Tras la hibridación de la una o más sondas flanqueantes y ácidos nucleicos en la muestra, la muestra se somete a un procedimiento de protección de nucleasa. Las sondas flanqueantes que han hibridado en un ácido nucleico de 50 longitud completa o una fusión génica no se hidrolizan por la nucleasa y pueden detectarse posteriormente.

El tratamiento con una o más nucleasas destruirá las moléculas de ácido nucleico distintas de las sondas flanqueantes que han hibridado en un ácido nucleico de longitud completa o de fusión génica presente en la muestra. Por ejemplo, si la muestra incluye un extracto o lisado celular, los ácidos nucleicos no deseados, tales 55 como ADN genómico, ADNc, ARNt, ARNr y ARNm distintos del gen o la fusión génica de interés y porciones de la fusión génica de interés que no se hibridan en secuencias de sonda complementarias, pueden destruirse sustancialmente en esta etapa. Puede usarse cualquiera de una diversidad de nucleasas, incluyendo, RNAsa pancreática, nucleasa de soja verde, S1 nucleasa, RNAsa A, Ribonucleasa T1, Exonucleasa III, Exonucleasa VII, RNAsa CLB, RNAsa PhyM, RNAsa U2, o similares, dependiendo de la naturaleza de los complejos hibridados y de los ácidos nucleicos no deseados presentes en la muestra. En un ejemplo particular, la nucleasa es específica para ácidos nucleicos monocatenarios, por ejemplo S1 nucleasa. Una ventaja de usar una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios en algunas realizaciones del método desveladas aquí es eliminar dichas moléculas monocatenarias ("cohesivas") de las etapas de reacción posteriores donde pueden conducir a antecedentes 5 innecesarios o reactividad cruzada. La S1 nucleasa está disponible en el mercado, por ejemplo, en Promega, Madison, WI (cat. Nº M5761); Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad, CA (cat. Nº 18001-016); Fermentas, Glen Burnie, MD (cat. Nº EN0321), y otros. Las condiciones de reacción para estas enzimas se conocen bien en la técnica y pueden optimizarse empíricamente.

10

En algunos ejemplos, se añade S1 nucleasa diluida en un tampón apropiado (tal como un tampón que incluye acetato sódico, cloruro sódico, sulfato de cinc, y detergente, por ejemplo, acetato sódico 0,25 M, pH 4,5, NaCl 1,4 M, ZnSO4 0,0225 M, KATHON al 0,05 %) a la mezcla de sonda hibridada y se incuba a aproximadamente 50 ºC durante aproximadamente 30-120 minutos (por ejemplo, aproximadamente 60-90 minutos) para digerir sondas de ácido nucleico sin hibridar y no unidas. 15

Las muestras se tratan opcionalmente para eliminar de otro modo material sin hibridar y/o para inactivar o eliminar enzimas residuales (por ejemplo, por extracción de fenol, precipitación, filtración de columna, etc.). En algunos ejemplos, las muestras se tratan opcionalmente para disociar el ácido nucleico diana (tal como una fusión génica diana o un gen diana de longitud completa o de tipo silvestre) de la sonda (por ejemplo, usando hidrólisis de base y 20 calor). Después de la hibridación, la diana hibridada puede degradarse, por ejemplo, por nucleasas o por tratamientos químicos, dando las sondas flanqueantes en proporción directa a la cantidad de sonda que se ha hibridado en diana. Como alternativa, la muestra puede tratarse para dar la porción hibridada (monocatenaria) de la diana, o el dúplex formado por la diana hibridada y la sonda, que se analizará adicionalmente.

25

Después, la presencia de las sondas flanqueantes en la muestra se detecta y se determina una relación de la primera sonda (sonda 5' flanqueante) con respecto a la segunda sonda (sonda 3' flanqueante). La presencia de una fusión génica en la muestra se detecta si la relación de la sonda 5' flanqueante con respecto a la sonda 3' flanqueante es diferente de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente diferente de uno). Como se muestra en la figura 3, el efecto de una fusión génica en la relación de las sondas 5' y 3' flanqueantes depende de si 30 las sondas flanqueantes son complementarias al gen 5' en la fusión (Gen 1 en la figura 3) o el gen 3' en la fusión (Gen 2 en la figura 3).

En un ejemplo, la primera y segunda sondas (las sondas 5' y 3' flanqueantes, respectivamente) son complementarias al gen 5' en la fusión. En este ejemplo, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 3' del 35 ácido nucleico (Gen 1) si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es mayor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor de uno). En algunos ejemplos, la fusión génica está presente y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación es de aproximadamente al menos 1,1, tal como al menos 1,5, al menos 1,8, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10 o al menos 20, por ejemplo de 1,1 a 20 o de 1,1 a 60, tal como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 40 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 330, 40, 50, 60, o más. En ejemplos particulares, una fusión génica está presente y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación es de aproximadamente al menos 1,5. En otros ejemplos, una fusión génica está presente y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación es de aproximadamente al menos 1,8. En otros ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 5' del ácido nucleico (gen 1) si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda 45 sonda es menor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente menos de uno). En algunos ejemplos, la fusión génica está presente y no incluye una porción 5' del ácido nucleico si la relación es no más de 0,95, tal como no más de 0,9, no más de 0,8, no más de 0,7, no más de 0,6, no más de 0,5, o no más de 0,1, por ejemplo 0,05 a 0,95, tal como aproximadamente 0,95, 0,9, 0,85, 0,8, 0,75, 0,7, 0,65, 0,6, 0,55, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, o menor. 50

En otro ejemplo, la primera y segunda sondas (las sondas 5' y 3' flanqueantes, respectivamente) son complementarias al gen 3' en la fusión. En este ejemplo, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es mayor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente mayor de uno). En algunos ejemplos, la fusión génica está presente y no incluye 55 una porción 3' del ácido nucleico (gen 2) si la relación es al menos 1,1, tal como al menos 1,5, al menos 1,8, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10 o al menos 20, por ejemplo de 1,1 a 20 o de 1,1 a 60, tal como aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, o más. En ejemplos particulares, una fusión génica está presente y no incluye una porción 5' del ácido nucleico si la relación es de aproximadamente al menos 1,5. En otros ejemplos, una fusión génica está presente y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación es de aproximadamente al menos 1,8. En otros ejemplos, la fusión génica se detecta y no incluye una porción 5' del ácido nucleico (gen 2) si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es menor de uno (por ejemplo, estadísticamente significativamente menos de uno). En algunos ejemplos, la 5 fusión génica está presente y no incluye una porción 3' del ácido nucleico si la relación es no más de 0,95, tal como no más de 0,9, no más de 0,8, no más de 0,7, no más de 0,6, no más de 0,5, o no más de 0,1, por ejemplo 0,05 a 0,95, tal como aproximadamente 0,95, 0,9, 0,85, 0,8, 0,75, 0,7, 0,65, 0,6, 0,55, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, o menor.

10

En algunas realizaciones, la fusión génica está presente si la relación de las sondas flanqueantes (por ejemplo, la relación de una sonda 5' flanqueante con respecto a una sonda 3' flanqueante o la relación de una sonda 3' flanqueante con respecto a una sonda 5' flanqueante) difiere de un control (tal como una relación promedio en una muestra de tipo silvestre) por al menos dos desviaciones estándares (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, o más desviaciones estándares). En algunos ejemplos, el control es la relación (por ejemplo la relación promedio) de las 15 sondas flanqueantes en una muestra que no incluye una fusión génica.

En algunos ejemplos, por ejemplo en el caso de un ARN o ARNm que se expresa normalmente a altos niveles, la relación de sonda flanqueante cuando está presente una fusión génica puede ser menor que cuando el ARN o el ARNm se expresa normalmente a niveles inferiores. Un experto en la técnica puede determinar el nivel al que se 20 expresa normalmente el ARN o el ARNm en una célula y determinar el intervalo de relaciones que se expresan para reflejar la presencia de una fusión génica en la muestra.

En realizaciones adicionales, los métodos incluyen determinar el porcentaje de fusión génica en la muestra relativa al primer ácido nucleico o el segundo ácido nucleico. Los métodos incluyen poner en contacto la muestra con una 25 sonda de fusión que incluye una porción 5' complementaria a un primer ácido nucleico y una porción 3' complementaria a un segundo ácido nucleico (tal como se ha analizado en la Sección III, anteriormente) en condiciones suficientes para que la sonda de fusión hibride específicamente en una fusión génica, donde la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico además de poner en contacto la muestra con la primera sonda y la segunda sonda anterior. Los métodos incluyen adicionalmente 30 detectar la presencia de la sonda de fusión y determinar una relación de la sonda de fusión con respecto a la primera sonda y/o una relación de la sonda de fusión con respecto a la segunda sonda.

En algunos ejemplos, el porcentaje de la fusión génica con respecto al gen de longitud completa (por ejemplo, el gen de tipo silvestre o de no fusión) puede determinarse determinando la relación de la sonda de fusión con respecto a la 35 primera sonda (por ejemplo, la sonda 5' flanqueante) o la relación de la sonda de fusión con respecto a la segunda sonda (por ejemplo, la sonda 3' flanqueante). Por ejemplo, si la porción 5' del gen está presente en la fusión génica, la relación de la sonda de fusión con respecto a la sonda 5' flanqueante será el porcentaje del ácido nucleico de fusión génica presente en la muestra con respecto al ácido nucleico de longitud completa. Asimismo, si la porción 3' del gen está presente en la fusión génica, la relación de la sonda de fusión con respecto a la sonda 3' flanqueante 40 será el porcentaje del ácido nucleico de fusión génica presente en la muestra con respecto al ácido nucleico de longitud completa.

Puede usarse cualquier método adecuado para detectar las sondas. En algunos ejemplos, la primera y/o la segunda sonda (las sondas flanqueantes) incluye una etiqueta detectable y la detección de la presencia de la sonda o las 45 sondas incluye detectar la etiqueta detectable. En algunos ejemplos, las sondas flanqueantes se marcan con la misma etiqueta detectable. En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se marcan con diferentes etiquetas detectables. En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan indirectamente, por ejemplo por hibridación con un ácido nucleico marcado. En algunos ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan usando una micromatriz, por ejemplo, una micromatriz que incluye ácidos nucleicos que son complementarios a las sondas flanqueantes (véase, 50 por ejemplo, la figura 5A). En otros ejemplos, las sondas flanqueantes se detectan usando una micromatriz que incluye enlazadores de programación complementarios a una porción de cada una de las sondas flanqueantes y que se incuban posteriormente con enlazadores de detección, cuya porción es complementaria a una porción separada de las sondas flanqueantes. Los enlazadores de detección pueden marcarse de forma detectable, o una porción separada de los enlazadores de detección es complementaria a ácidos nucleicos adicionales que incluyen una 55 etiqueta detectable (tal como biotina o peroxidasa de rábano picante). Véase, por ejemplo, la figura 5B. Se proporcionan en más detalle métodos para detectar las sondas en la Sección V a continuación.

V. Métodos para detectar la hibridación de las sondas

Puede utilizarse en los métodos desvelados cualquier método adecuado para detectar la presencia de un ácido nucleico (tal como una sonda) en una muestra. Un experto en la técnica puede seleccionar métodos de detección apropiados. En algunos ejemplos, las sondas desveladas (tales como una o más sondas de fusión o flanqueantes) 5 se marcan directamente. En otros ejemplos, las sondas desveladas se detectan por hibridación con una sonda de detección, que tiene una secuencia complementaria al menos a una porción de la sonda de fusión o flanqueante y una etiqueta detectable. Se conocen en la técnica etiquetas detectables y métodos para incorporar dichas etiquetas en una molécula de ácido nucleico, tal como una sonda. En ejemplos no limitantes, se marcan las sondas de ácido nucleico con dNTP unidos covalentemente a moléculas de hapteno (tal como un compuesto nitro-aromático (por 10 ejemplo, dinitrofenilo (DNP)), biotina, fluoróforos (tal como fluoresceína), digoxigenina, etc.). Se conocen en la técnica métodos para conjugar haptenos y otras etiquetas con nucleótidos (por ejemplo, para facilitar la incorporación en sondas marcadas). Para ejemplos de procedimientos, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.258.507, 4.772.691, 5.328.824 y 4.711.955. Una etiqueta puede unirse directa o indirectamente a un dNTP en cualquier ubicación en el dNTP, tal como un fosfato (por ejemplo, α, β o γ fosfato) o un azúcar. 15

En un ejemplo, cuando la etiqueta es un hapteno, la detección de las moléculas de ácido nucleico marcadas puede realizarse poniendo en contacto las moléculas de ácido nucleico marcadas con hapteno unidas a la secuencia diana genómica con un anticuerpo anti-hapteno primario. En un ejemplo, el anticuerpo anti-hapteno primario (tal como un anticuerpo anti-hapteno de ratón) se marca directamente con una enzima. En otro ejemplo, se usa un anticuerpo 20 secundario (tal como un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra) conjugado con una enzima para la amplificación de señal. En un ejemplo, la etiqueta es biotina y la detección se realiza poniendo en contacto la muestra con peroxidasa de avidina-rábano picante.

En ejemplos adicionales, una etiqueta detectable incluye diversas enzimas, grupos protésicos, materiales 25 fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radioactivos. Los ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa. Las etiquetas detectables adicionales incluyen sondas de Raman (dispersión de luz).

En ejemplos adicionales, las sondas se marcan con moléculas fluorescentes (o fluorocromos). Se conocen 30 numerosos fluorocromos por los expertos en la técnica, y pueden seleccionarse, por ejemplo de Life Technologies (anteriormente Invitrogen), por ejemplo, véase, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Se proporcionan ejemplos de fluoróforos particulares que pueden unirse (por ejemplo, conjugados químicamente) a una molécula de ácido nucleico (tal como una región de unión únicamente específica) en la Patente de Estados Unidos Nº 5.866.366. Otros fluoróforos adecuados incluyen quelatos de europio reactivos con tiol que 35 emiten en aproximadamente 617 nM (Heyduk y Heyduk, Anal. Biochem. 248: 216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274: 3315-22, 1999), así como GFP, Lissamine™, dietilaminocoumarina, fluoresceína clorotriazinilo, naftofluoresceína, 4,7-diclororodamina y xanteno (como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.800.996 de Lee y col.) y derivados de los mismos. También pueden usarse otros fluoróforos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo los disponibles en Life Technologies (Invitrogen; Molecular Probes (Eugene, OR)) y que incluyen la serie de 40 colorantes ALEXA FLUOR® (por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.696.157, 6.130.101 y 6.716.979), la serie de colorantes BODIPY (colorantes de difluoruro de dipirrometenoboro, por ejemplo como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.774.339, 5.187.288, 5.248.782, 5.274.113, 5.338.854, 5.451.663 y 5.433.896), Cascade Blue (un derivado amina reactivo del pireno sulfonado descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.132.432) y Marina Blue (patente de Estados Unidos Nº 5.830.912). Una etiqueta fluorescente 45 puede ser una nanopartícula fluorescente, tal como un nanocristal semiconductor, por ejemplo, QUANTUM DOT™ (obtenido, por ejemplo, en Life Technologies (QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, OR); véanse también las patentes de Estados Unidos Nº 6.815.064; 6.682.596; y 6.649.138).

En algunos ejemplos, las sondas están diseñadas de tal forma que la hibridación de cada sonda y el tratamiento con 50 nucleasa posterior producen un fragmento de un tamaño específico. Después, las sondas pueden detectarse (directa o indirectamente) utilizando técnicas de separación por tamaño, tal como electroforesis en gel (por ejemplo, electroforesis en gel en plancha o capilar) o cromatografía líquida (por ejemplo, HPLC). En algunos ejemplos, las sondas pueden marcarse con diferentes etiquetas detectables (por ejemplo diferentes flúors) con el fin de discriminar fragmentos que son similares en tamaño. Las sondas pueden detectarse utilizando métodos de espectrometría de 55 masas.

En algunos ejemplos, las sondas de fusión o flanqueantes desveladas pueden marcarse con diferentes etiquetas detectables o pueden ponerse en contacto con diferentes sondas de detección, con el fin de detectar por separado cada sonda si está presente más de una sonda en una mezcla de reacción. En otros ejemplos, la presencia de una o más sondas se detecta usando una micromatriz. En dichos ejemplos, las sondas de fusión y/o flanqueantes pueden marcarse con la misma etiqueta detectable, y las sondas se distinguen en base a la ubicación espacial de la señal en la micromatriz.

5

En algunos ejemplos, las sondas se detectan en una micromatriz usando una técnica de ensayo de protección con nucleasa cuantitativa, por ejemplo, como se describe en las publicaciones de patente internacionales WO 99/032663; WO 00/037683; WO 00/037684; WO 00/079008; WO 03/002750; y WO 08/121927; y la pat. de Estados Unidos Nº 6.238.869; 6.458.533; y 7.659.063. Véase también, Martel y col., Assay and Drug Development Technologies. 2002, 1 (1-1): 61-71; Martel y col., Progress in Biomedical Optics and Imaging, 2002, 3: 35-43; Martel 10 y col., Gene Closing and Expression Technologies, Q. Lu y M. Weiner, Eds., Eaton Publishing, Natick (2002); Seligmann, B. PharmacoGenomics, 2003, 3: 36-43; Martel y col., "Array Formats" en "Microarray Technologies and Applications", U.R. Muller y D. Nicolau, Eds, Springer-Verlag, Heidelberg; Sawada y col., Toxicology in Vitro, 20: 1506-1513; Bakir, y col., Biorg. & Med. Chem Lett, 17: 3473-3479; Kris, y col., Plant Physiol. 144: 1256-1266; Roberts, y col., Laboratory Investigation, 87: 979-997; Rimsza, y col., Blood, 15 de octubre de 2008, 112 (8): 3425-15 3433; Pechhold, y col., Nature Biotechnology, 27, 1038-1042.

En resumen, en un ejemplo no limitante, tras la hibridación y el tratamiento con nucleasa, la solución se neutraliza y se transfiere en una micromatriz, tal como una ARRAYPLATE programada (HTG Molecular, Tucson, AZ; cada elemento de la ARRAYPLATE está programada para capturar una sonda específica, por ejemplo, utilizando un 20 anclaje unido a la placa y un enlazador de programación asociado al anclaje), y las sondas se capturan durante una incubación (por ejemplo, durante una noche a aproximadamente 50 ºC). En su lugar, la plataforma puede ser una micromatriz NIMBLEGEN (Roche Nimblegen, Madison, WI) o las sondas pueden capturarse en perlas X-MAP (Luminex, Austin, TX), un ensayo denominado como el ensayo QBEAD, o procesarse adicionalmente, incluyendo reacciones de amplificación por PCR o ligación según se desee, y, por ejemplo, medirse después por secuenciación, 25 o por métodos tales como NANOSTRING). El medio se elimina y se añade un cóctel de enlazadores de detección específicos de sonda, en el caso de los ensayos ARRAYPLATE y QBEAD, que hibridan en su sondas respectivas (capturadas) durante una incubación (por ejemplo, 1 hora a aproximadamente 50 ºC). Véase, por ejemplo, la figura 5B. Esta etapa se omite en el caso de los ensayos NIMBLEGEN de micromatriz porque las sondas están biotiniladas directamente, y no se usa ningún enlazador de detección (por ejemplo, figura 5A). Específicos para los ensayos 30 ARRAYPLATE y QBEAD, la matriz o las perlas se lavan y después se añade un enlazador de biotina (un oligonucleótido que hibrida en una secuencia común en cada enlazador de detección, con biotina incorporada en éste) y se incuba (por ejemplo, 1 hora a aproximadamente 50 ºC). Para la ARRAYPLATE (ensayo de ARNm), se añade avidina marcada con HRP (avidina-HRP) y se incuba (por ejemplo, a aproximadamente 37 ºC durante 1 hora), después se lava para eliminar la avidina-HRP no unida. Se añade un sustrato y la placa se forma por imagen para 35 medir la intensidad de cada elemento en la placa. En el caso de QBEAD se añade Avidina-PE, las perlas se lavan, y después se miden por citometría de flujo usando Luminex 200, FLEXMAP 3D, u otro instrumento apropiado. En el caso de las matrices NIMBLEGEN, después de la adición de avidina-HRP se realiza opcionalmente una etapa de amplificación de señal de tiramida en presencia de un sustrato, dando como resultado la deposición de la sonda marcada con Cy3, los portamuestras se lavan, se secan y se exploran en un escáner de micromatriz estándar. Se 40 proporcionan enlazadores de programación y enlazadores de detección ejemplares en la Tabla 6 (Ejemplo 1). Un experto en la técnica puede diseñar enlazadores de programación, enlazadores de detección y otros reactivos adecuados para su uso en un ensayo de protección de nucleasa cuantitativo en base a las sondas de fusión y/o las sondas flanqueantes utilizadas en los métodos desvelados en el presente documento.

45

Un experto en la técnica puede identificar otros métodos adecuados para detectar las sondas utilizadas en los métodos desvelados en el presente documento.

VI. Fusiones génicas y sondas ejemplares

50

Un experto en la técnica puede identificar fusiones génicas y sondas apropiadas para su uso en los métodos desvelados en el presente documento. Por ejemplo, las bases de datos que proporcionan fusiones génicas o que identifican los genes implicados en las fusiones génicas están disponibles públicamente. Véase, por ejemplo, HYBRIDdb (primate.or.kr/hybriddb); ChimerDB (ercsb.ewha.ac.kr:8080/FusionGene/index.jsp); Cancer Genome Anatomy Project Recurrent Chromosome Aberrations in Cancer 55 (cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/RecurrentAberrations); Cancer Genome Project, Sanger Institute (sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/); COSMIC (sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic); Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (atlasgeneticsoncology.org). Véase también, Hahn y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 13257-13261, 2004; Futreal y col., Nature Rev. Cancer 4: 177-183, 2004.

En algunos ejemplos, los métodos desvelados incluyen la etapa de seleccionar una fusión génica particular, denominada en el presente documento como una fusión génica diana. En base a la fusión génica diana, las sondas de fusión y/o las sondas flanqueantes pueden diseñarse para usarse en los métodos desvelados usando los criterios expuestos en el presente documento en combinación con el conocimiento de un experto en la técnica. En algunos 5 ejemplos no limitantes, las fusiones génicas son fusiones génicas oncogénicas. Por ejemplo, si se conoce un sujeto o se sospecha que tiene un tipo particular de tumor, tal como leucemia mielógena crónica o leucemia mielógena aguda, la fusión génica seleccionada puede ser una que está asociada a ese tumor (tal como una fusión génica de Bcr-Abl). Las fusiones génicas ejemplares y tumores asociados se muestran en la Tabla 1. Las fusiones génicas adicionales incluyen cambios no oncogénicos (por ejemplo, fusiones génicos no transformantes) y genómicos que 10 proporcionan una ventaja selectiva (por ejemplo, en patógenos tales como virus y bacterias).

Se conocen bien por un experto en la técnica los criterios para el diseño de sondas. Los factores que afectan a la especificidad de hibridación de sonda-diana incluyen la longitud de sonda, la temperatura de fusión, la auto-complementariedad, y la presencia de una secuencia repetitiva o no única. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 15 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (y Suplementos de 2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4ª ed., Wiley & Sons, 1999.

20

La especificidad de una sonda aumenta con la longitud. Por lo tanto, por ejemplo, una sonda que incluye 30 nucleótidos consecutivos hibridan en una secuencia diana con una especificidad mayor que una sonda correspondiente de únicamente 15 nucleótidos. Por lo tanto, las sondas de fusión y flanqueantes desveladas en el presente documento pueden seleccionarse para incluir al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 25 70 o nucleótidos más consecutivos complementarios a una fusión génica o complementarios a una molécula de ácido nucleico particular. En algunos ejemplos, las sondas de fusión o flanqueantes desveladas en el presente documento tienen no más de 500 nucleótidos, tal como no más de 400, no más de 300, no más de 250, no más de 200, no más de 100, o incluso no más de 50 nucleótidos consecutivo complementarios a una fusión génica o complementarios a una molécula de ácido nucleico particular tal como de 10 a 500 nucleótidos, de 10 a 400 30 nucleótidos, de 10 a 250 nucleótidos, de 10 a 200 nucleótidos, de 10 a 100 nucleótidos, de 10 a 75 nucleótidos, de 10 a 60 nucleótidos, de 40 a 80 nucleótidos, de 100 a 200 nucleótidos, o de 10 a 50 nucleótidos consecutivos complementarios a una fusión génica o complementarios a una molécula de ácido nucleico particular (por ejemplo, un primer o segundo ácido nucleico que es parte de una fusión génica). En ejemplos particulares, una sonda tiene al menos 10 nucleótidos de longitud, tal como al menos 10 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de 35 ácido nucleico, tal como una secuencia que flanquea un punto de fusión génica o secuencias de ácido nucleico de fusión génica desveladas en el presente documento. Las longitudes particulares de sondas que pueden usarse para poner en práctica los métodos de la presente divulgación incluyen sondas que tienen al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, o más nucleótidos 40 contiguos complementarios a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo un primer o segundo ácido nucleico que es parte de una fusión génica. En un ejemplo particular, cada sonda de ácido nucleico tiene al menos 30 nucleótidos de longitud. En un ejemplo no limitante, cada sonda de ácido nucleico tiene aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En un ejemplo particular, cada sonda de ácido nucleico tiene aproximadamente 50 nucleótidos de longitud.

45

Las condiciones que dan como resultado grados particulares de hibridación (astringencia) variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación y la composición y longitud de las secuencias de ácido nucleico de hibridación. Generalmente, la temperatura de hibridación y la resistencia iónica (tal como la concentración de Na+) del tampón de hibridación determinarán la astringencia de la hibridación. En algunos ejemplos, las sondas utilizadas en los métodos desvelados tienen una temperatura de fusión (Tm) de al menos aproximadamente 37 ºC, al menos 50 aproximadamente 42 ºC, al menos aproximadamente 45 ºC, 50 ºC, al menos aproximadamente 55 ºC, al menos aproximadamente 60 ºC, al menos aproximadamente 65 ºC, al menos aproximadamente 70 ºC, al menos aproximadamente 75 ºC, al menos aproximadamente 80 ºC, tal como aproximadamente 37 ºC-80 ºC (por ejemplo, aproximadamente 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o 80 ºC). Los métodos para calcular la Tm de una 55 sonda se conocen por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Press, 2001, Capítulo 10).

También se proporcionan sondas que se degeneran en una o más posiciones (tales como 1, 2, 3, 4, 5, o más posiciones), por ejemplo, una sonda que incluye una mezcla de nucleótidos (tal como 2, 3 o 4 nucleótidos) en una posición especificada en la sonda. En algunos ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen una o más bases sintéticas o bases alternativas (tal como inosina). En otros ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen uno o más nucleótidos modificados o análogos de ácidos nucleicos, tal como uno o más ácidos nucleicos bloqueados (véase, por ejemplo, pat. de Estados Unidos Nº 6.794.499) o uno o más ácidos 5 nucleicos peptídicos. En algunos ejemplos, el uso de uno o más ácidos nucleicos bloqueados o ácidos nucleicos peptídicos en la sonda puede aumentar la Tposiciones), por ejemplo, una sonda que incluye una mezcla de nucleótidos (tal como 2, 3 o 4 nucleótidos) en una posición especificada en la sonda. En algunos ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen una o más bases sintéticas o bases alternativas (tal como inosina). En otros ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen uno o más nucleótidos modificados o análogos de ácidos nucleicos, tal como uno o más ácidos nucleicos bloqueados (véase, por ejemplo, pat. de Estados Unidos Nº 6.794.499) o uno o más ácidos 5 nucleicos peptídicos. En algunos ejemplos, el uso de uno o más ácidos nucleicos bloqueados o ácidos nucleicos peptídicos en la sonda puede aumentar la Tposiciones), por ejemplo, una sonda que incluye una mezcla de nucleótidos (tal como 2, 3 o 4 nucleótidos) en una posición especificada en la sonda. En algunos ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen una o más bases sintéticas o bases alternativas (tal como inosina). En otros ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen uno o más nucleótidos modificados o análogos de ácidos nucleicos, tal como uno o más ácidos nucleicos bloqueados (véase, por ejemplo, pat. de Estados Unidos Nº 6.794.499) o uno o más ácidos 5 nucleicos peptídicos. En algunos ejemplos, el uso de uno o más ácidos nucleicos bloqueados o ácidos nucleicos peptídicos en la sonda puede aumentar la Tposiciones), por ejemplo, una sonda que incluye una mezcla de nucleótidos (tal como 2, 3 o 4 nucleótidos) en una posición especificada en la sonda. En algunos ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen una o más bases sintéticas o bases alternativas (tal como inosina). En otros ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen uno o más nucleótidos modificados o análogos de ácidos nucleicos, tal como uno o más ácidos nucleicos bloqueados (véase, por ejemplo, pat. de Estados Unidos Nº 6.794.499) o uno o más ácidos 5 nucleicos peptídicos. En algunos ejemplos, el uso de uno o más ácidos nucleicos bloqueados o ácidos nucleicos peptídicos en la sonda puede aumentar la Tposiciones), por ejemplo, una sonda que incluye una mezcla de nucleótidos (tal como 2, 3 o 4 nucleótidos) en una posición especificada en la sonda. En algunos ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen una o más bases sintéticas o bases alternativas (tal como inosina). En otros ejemplos, las sondas desveladas en el presente documento incluyen uno o más nucleótidos modificados o análogos de ácidos nucleicos, tal como uno o más ácidos nucleicos bloqueados (véase, por ejemplo, pat. de Estados Unidos Nº 6.794.499) o uno o más ácidos 5 nucleicos peptídicos. En algunos ejemplos, el uso de uno o más ácidos nucleicos bloqueados o ácidos nucleicos peptídicos en la sonda puede aumentar la T

A. Fusiones génicas ejemplares 10

Los métodos desvelados pueden usarse para detectar la presencia de una fusión génica en una muestra de un sujeto. Se conocen bien por un experto en la técnica fusiones génicas. Las fusiones génicas pueden producir un producto génico con una función nueva o diferente a la de cualquiera de las dos parejas de fusión. En otros ejemplos, una fusión génica incluye una secuencia génica intacta o intacta en su mayor parte condensada a un 15 promotor de otro gen, por ejemplo, un promotor fuerte que regula en ascenso la expresión de la secuencia génica. En algunos ejemplos, una fusión génica es un oncogen. La Tabla 1 proporciona genes ejemplares implicados en fusiones génicas y fusiones génicas ejemplares. Pueden detectarse otras fusiones génicas, incluyendo las aún no identificadas, por un experto en la técnica utilizando los métodos desvelados en el presente documento.

20

Tabla 1. Genes y fusiones génicas ejemplares

Gen de fusión

Gen 1 Nº de acceso Gen 2 Nº de acceso Fusión Nº de acceso Tumor asociado

ABL1/BCR

ABL1 BCR CML, ALL,

BCR/ABL1

BCR Hs.446394 ABL1 Hs.446504 AF113911, AJ131466, AJ131467, AY043457, M13096, M25946 ALL, CML,

DDX5/ PRKCB

DDX5 Hs.279806 PRKCB Hs.349845 CD683976 Nasofaringe

CCDC134 /ZNF75A

CCDC134 Hs.474991 ZNF75A Hs.513292 CD691174

COL3A1/GRSF1

COL3A1 Hs.443625 GRSF1 Hs.309763 AW081998 Esófago, carcinoma de células escamosas

IREB2/OXR 1

IREB2 Hs.370324 OXR1 Hs.432398 AK127563 Lengua

MYB/NFIB

MYB NFIB FJ969915, FJ969916, FJ969917 Cabeza y cuello, mama

TMPRSS2/ ERG

TMPRSS2 ERG DQ831521, DQ204772, DQ204773 Próstata TMPRSS2

TMPRSS2/ETV4

TMPRSS2 ETV4 DQ396625 Próstata

EWSR1/FLI1

EWSR1 Hs.374477 FLI1 Hs.257049 AF327066 Sarcoma de Ewing

EML4/ALK

EML4 NM_01906 3 ALK NM_00430 4 Carcinoma de pulmón

B. Sondas de fusión

25

En algunas realizaciones, la sonda es una sonda de fusión, que hibrida en una porción de cada gen incluido en la fusión génica y abarca el punto de fusión. La sonda de fusión incluye al menos dos partes, de tal forma que la porción 5' de la sonda es capaz de hibridar en el primer gen y la porción 3' de la sonda es capaz de hibridar en el segundo gen. En algunos ejemplos, una sonda de fusión tiene aproximadamente 10-200 nucleótidos de longitud (incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 20-100, 25-50 o 30-45 nucleótidos de longitud y otros como se ha 30 descrito anteriormente). En otros ejemplos, una sonda de fusión tiene al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 14, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más nucleótidos de longitud.

En algunos ejemplos, la porción 5' y la porción 3' de la sonda de fusión tienen la misma o una longitud similar (por ejemplo, la porción 5' tiene al menos 9 nucleótidos de longitud, tal como aproximadamente 9-25 nucleótidos de longitud y la porción 3' tiene al menos 9 nucleótidos de longitud, tal como aproximadamente 9-25 nucleótidos de 5 longitud). En ejemplos particulares, la porción 5' de la sonda tiene 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos de longitud, y la porción 3' de la sonda tiene el mismo número de nucleótidos. En otros ejemplos, la porción 5' y la porción 3' no tienen la misma o una longitud similar. En algunos ejemplos, la porción 5' de la sonda tiene 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos de longitud, y la porción 3' de la sonda es aproximadamente 1-20 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 10 19, o 20) nucleótidos más corta o más larga que la porción 5' de la sonda.

En ejemplos adicionales, la porción 5' de la sonda o la porción 3' de la sonda es muy corta, por ejemplo aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud, mientras que la otra porción de la sonda tiene una longitud similar a la que se ha descrito anteriormente (por ejemplo al menos 9 nucleótidos de longitud, tal como aproximadamente 9-15 50 nucleótidos de longitud). En ejemplos particulares, la porción 5' de la sonda tiene al menos aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud (tal como al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 nucleótidos de longitud) y la porción 3' de la sonda tiene aproximadamente al menos 9 nucleótidos de longitud, tal como al menos aproximadamente 9-50 nucleótidos de longitud (tal como al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 20 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos). En otros ejemplos, la porción 3' de la sonda tiene al menos aproximadamente 1-10 nucleótidos de longitud (tal como al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 nucleótidos de longitud) y la porción 5' de la sonda tiene aproximadamente al menos 9 nucleótidos de longitud, tal como al menos aproximadamente 9-50 nucleótidos de longitud (tal como al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos). En un ejemplo, la porción 5' de la sonda tiene aproximadamente 1-3 bases de largo y la porción 3' de la sonda tiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud (tal como al menos aproximadamente 10-200, al menos aproximadamente 10-100, o al menos aproximadamente 10-50 nucleótidos de longitud) o viceversa. En otros ejemplos, la porción 5' de la sonda tiene aproximadamente 3-10 bases de largo y la porción 3' de la sonda tiene al 30 menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud (tal como aproximadamente 25-200, al menos aproximadamente 25-100, o al menos aproximadamente 25-50 nucleótidos de longitud).

En algunos ejemplos, las fusiones génicas diferentes pueden contener una porción común (por ejemplo, las fusiones génicas distintas pueden incluir la misma o una porción 5' similar, pero diferentes porciones 3', o viceversa), y la 35 diferencia en el punto de fusiones que varía puede variar únicamente en unas pocas bases (por ejemplo, 20 o menor, tal como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 base). En algunos ejemplos, la sonda de fusión está diseñada para discriminar las fusiones, por ejemplo desplazando ligeramente la sonda de tal forma que las bases que son diferentes entre las fusiones son internas con respecto a la secuencia que se captura o hibrida en el enlazador de programación, de tal forma que las bases de sonda no correspondiente o las bases de 40 diana no correspondiente se hidrolizarán por la nucleasa, y después la región emparejada corta restante se fundirá y se hidrolizará, impidiendo así que la sonda no correspondiente se capture. De esta manera, los enlazadores de programación pueden utilizarse para distinguir las fusione génicas (por ejemplo, en base a la ubicación espacial en una matriz). Como alternativa, la sonda puede diseñarse de manera que tenga únicamente unas pocas bases que cubran la secuencia que difiere entre fusiones, con la etiqueta situada en ese extremo de tal forma que está 45 protegida cuando la secuencia se hibrida, y se hidroliza de otro modo y, por lo tanto, no se detecta, y se captura por la secuencia génica común, de tal forma que todas las sondas se capturan, pero únicamente las sondas emparejadas correctamente producen una señal detectable.

Las sondas de fusión ejemplares incluyen las mostradas en la Tabla 2. Se muestran otras sondas de fusión 50 ejemplares en las Tablas 4, 7 y 8 (a continuación). Un experto en la técnica puede diseñar sondas de fusión para cualquier fusión génica donde se conoce el punto de fusión de los dos genes, por ejemplo las proporcionadas en la Tabla 1, a continuación.

Tabla 2. Sondas de fusión ejemplares

Gen 1 (5')

Gen 2 (3') Gen de fusión Nº de acceso Secuencia de la sonda de fusión (5'-> 3')* Tm SEQ ID NO:

DDX5

PRKCB CD683976 gggaccgagggtCATGCTTTCAGAACG 61,3 1

CCDC134

ZNF75A CD691174 gcctggagatctCATTGTTTGTGC 53,8 2

COL3A1

GRSF1 AW081998 gaaatgcttcttgcTTCACCCTTAGC 54,8 3

IREB2

OXR1 AK127563 ctaaacttggcaccaAGTATGAGATATAG 52,7 4

CRTC1

MAML2 AY040324 gccgcgcggCTCCAGGGTTCC 62,6 5

MYB

NFIB var. 1 FJ969915 gcgagccccttgcagCTGAGGATT 60 6

cgagccccUgcagCTGAGGA TIT

58,2 7

gagccccttgcagCTGAGGATTTG

57 8

agccccttgcagCTGAGGATTTGT

57,6 9

gccccttgcagCTGAGGATTTGTG

57,5 10

ccccttgcagCTGAGGATTTGTGA

56,3 11

cccttgcagCTGAGGATTTGTGAC

55,5 12

MYB

NFIB var. 2 FJ969916 cgagccccttgcagTCCTGGTACC 60 13

gagccccttgcagTCCTGGTACCT

58 14

agccccttgcagTCCTGGTACCTG

59,1 15

gccccttgcagTCCTGGTACCTGG

59,9 16

ccccttgcagTCCTGGTACCTGGG

59,6 17

MYB

NFIB var. 3 FJ969917 gcgagccccttgcagCCTAACGGC 62,7 18

cgagccccttgcagCCTAACGGCA

61,9 19

gagccccttgcagCCTAACGGCAG

60,5 20

agccccttgcagCCTAACGGCAGT

61,1 21

gccccttgcagCCTAACGGCAGTG

61 22

ccccttgcagCCTAACGGCAGTGG

60,7 23

TMPRSS2

ERG EU090248 tggagcgcggcagGTTATTCCAGG 60 24

ggagcgcggcagGTTATTCCAGGA

59,8 25

gagcgcggcagGTTATTCCAGGAT

58,1 26

TMPRSS2

ETV4 EU693079 ttgaactcagtctCGGCCCCCGCT 60,8 27

tgaactcagtctCGGCCCCCGCTT

60,8 28

gaactcagtctCGGCCCCCGCTTG

60,5 29

EWSR1

FLI1 JF290489 tacgggcagcagaACCCTTCTTAT 54,8 30

acgggcagcagaACCCTTCTTATG

56,2 31

cgggcagcagaACCCTTCTTATGA

56 32

*Minúscula, gen 1; mayúscula, gen 2

C. Sondas flanqueantes 5

En algunas realizaciones, la sonda es una sonda "flanqueante", que hibrida en una porción del gen de longitud completa, cuya porción se incluye en la fusión génica. Las sondas flanqueantes son complementarias a la secuencia presente en el gen de tipo silvestre y también pueden se complementarias a la secuencia presente en el gen de fusión. Esto se presenta esquemáticamente en la figura 3. Una "sonda 5' flanqueante" es una sonda que es 10 complementaria a una secuencia que está 5' de un punto de fusión o de ruptura en el gen de tipo silvestre (de no fusión) (por ejemplo, sonda 5' 1 o sonda 5' 2 en la figura 3). Una "sonda 3' flanqueante" es una sonda que es complementaria a una secuencia que está 3' de un punto de fusión o una ruptura en el gen de tipo silvestre (de no fusión) (por ejemplo, sonda 3' 1 o sonda 3' 2 en la figura 3). En algunos ejemplos, una sonda de fusión tiene aproximadamente 10-200 nucleótidos de longitud (incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 20-100, 25-50 o 15 30-45 nucleótidos de longitud y otros como se ha descrito anteriormente). En otros ejemplos, una sonda de fusión tiene al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 14, 150, 160, 170, 180, 190, 200, o más nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, se sabe que se produce una fusión entre dos genes y también se conoce el punto de 20 fusión. Las sondas flanqueantes pueden diseñarse para ser complementarias al gen 5' en la fusión (Gen 1 en la figura 3) en los puntos 5' y 3' con respecto al punto de fusión conocido. Asimismo, las sondas flanqueantes pueden diseñarse para ser complementarias al gen 3' en la fusión (Gen 2 en la figura 3) en los puntos 5' y 3' con respecto al punto de fusión. Las sondas flanqueantes ejemplares se proporcionan en las Tablas 3 y 8.

En otras realizaciones, se sabe que se produce una fusión entre dos genes, o se sabe que se produce una fusión, pero no se conoce el punto de fusión. En dichos casos, es deseable diseñar las sondas flanqueantes tan cerca como 5 al extremo 5' y el extremo 3' del gen de interés, para aumentar la probabilidad de que el punto de fusión esté entre las sondas flanqueantes.

Tabla 3. Sondas flanqueantes ejemplares

10

Gen

Nº de Acceso Secuencia de sonda flanqueante (5' -> 3') Tm SEQ ID NO:

DDX5

NM_004396

DDXS 5' flanqueante

77,9 33

74,4 34

76,2 35

DDX5 3' flanqueante

77 36

67,6 37

70,8 38

PRKCB

NM_002738

PRKCB 5' flanqueante

77,4 39

73,2 40

75,5 41

PRKCB 3' flanqueante

71,9 42

71,9 43

72,1 44

CCDC134

NM_024821

CCDC134 5' flanqueante

72,2 45

78,2 46

78,1 47

CCDC134 3' flanqueante

76,2 48

78,3 49

77,3 50

ZNF75A

NM_153028

ZNF75A 5' flanqueante

76,3 51

73,9 52

74,8 53

ZNF75A 3' flanqueante

70,5 54

68,1 55

67,7 56

COL3A1

NM_000090

COL3A1 5' flanqueante

74,9 57

70,4 58

72,3 59

COL3AI 3' flanqueante

73,2 60

73,8 61

71,9 62

GRSF1

NM 002092

GRSF1 5' flanqueante

77,8 63

71,1 64

73,8 65

GRSF1 3' flanqueante

72,1 66

74,5 67

74,1 68

IREB2

NM 004136

IREB2 5' flanqueante

74,8 69

74,8 70

75,5 71

IREB2 3'flanqueante

71,5 72

72,1 73

70,4 74

OXR1

NM 018002

OXR1 5' flanqueante

69,5 75

74,9 76

70,8 77

OXR1 3' flanqueante

66,7 78

66,2 79

67,4 80

CRTC1

NM_015321

CRTC1 5' flanqueante

75,3 81

73,2 82

75,2 83

CRTC1 3' flanqueante

77,8 84

79,4 85

74,2 86

MAML2

NM 032427

MAML2 5' flanqueante

73,4 87

736. 88

74,1 89

MAML2 3' flanqueante

62,9 90

65,4 91

68,7 92

MYB

NM 005375

MYB 5' flanqueante

74,9 93

70,7 94

73 95

MYB 3' flanqueante

69,7 96

70,6 97

71,6 98

NFIB

NM 001190737

NFIB 5' flanqueante

70,8 99

70,8 100

71,5 101

NFIB 3' flanqueante

72,1 102

68,8 103

70,5 104

EWSR1

NM_013986

EWSR1 5' flanqueante

74,4 105

75,5 106

EWSR1 3' flanqueante

76,5 107

70,7 108

67,8 109

FLI1

NM_002017

FLI1 5' flanqueante

71,2 110

74,7 111

73,8 112

FLI1 3' flanqueante

64,8 113

66,1 114

67,5 115

TMPRSS2

NM_005656

TMPRSS2 5' flanqueante

80,8 116

69,9 117

TMPRSS2 3' flanqueante

73,9 118

66 119

72 120

ETV4

NM 001079675

ETV4 5' flanqueante

82,7 121

73,9 122

76,3 123

ETV4 3' flanqueante

73,7 124

75,4 125

72,1 126

ERG

NM_004449

ERG 5' flanqueante

74,9 127

74,6 128

75,3 129

ERG 3' flanqueante

73,7 130

77,3 131

75,2 132

VII. Muestras

Las muestras de uso en los métodos desvelados incluyen cualquier especimen que incluye ácido nucleico (tal como ADN genómico, ADNc, ADN vírico o ARN, ARNr, ARNt, ARNm, oligonucleótidos, fragmentos de ácido nucleico, 5 ácidos nucleicos modificados, ácidos nucleicos sintéticos, o similares). En ejemplos particulares, la muestra incluye ARNm. En algunos ejemplos, los métodos desvelados incluyen obtener la muestra antes del análisis de la muestra. En algunos ejemplos, los métodos desvelados incluyen seleccionar un sujeto que tiene un tumor, y después en algunos ejemplos seleccionar adicionalmente la fusión génica diana para la detección en base al tumor del sujeto (por ejemplo, véase la Tabla 1). 10

Las muestras apropiadas incluyen cualquier muestra del entorno o biológica convencional, incluyendo muestras clínicas obtenidas a partir de un sujeto humano o veterinario. Las muestras ejemplares incluyen, sin limitación, células, lisados celulares, frotis de sangre, preparaciones de citocentrífuga, frotis de citología, fluidos corporales (por ejemplo, sangre, plasma, suero, saliva, esputo, orina, lavado broncoalveolar, semen, etc.), biopsias tisulares (por 15 ejemplo, biopsias tumorales), aspirados con aguja fina, y/o secciones tisulares (por ejemplo, secciones tisulares de criostato y/o secciones tisulares embebidas en parafina). En otros ejemplos, la muestra incluye células tumorales circulantes o células fetales circulantes en sangre materna. En ejemplos particulares, las muestras se usan directamente (por ejemplo, frescas o congeladas), o pueden manipularse antes del uso, por ejemplo, por fijación (por ejemplo, usando formalina) y/o incrustación en cera (tal como muestras tisulares embebidas en parafina y fijadas en formalina (FFPE)).

En ejemplos adicionales, una muestra incluye un especimen que incluye ácidos nucleicos bacterianos o víricos, por 5 ejemplo, una muestra de un sujeto infectado con un virus o bacteria. Una muestra también puede incluir especimenes ambientales, por ejemplo, agua, aire, suelo, polvo, madera o alimentos u otros materiales que pueden contener o contaminarse con un patógeno.

Se conocen en la técnica métodos para obtener una muestra de un sujeto. Por ejemplo, los métodos para obtener 10 muestras tisulares o celulares son rutinarios. Pueden obtenerse muestras ejemplares de células o tejidos normales, o de células o tejidos neoplásicos. La neoplasia es una condición biológica en la que una o más células han experimentado una anaplasia característica con pérdida de diferenciación, un aumento de la tasa de crecimiento, invasión del tejido circundante, y cuyas células pueden ser capaces de metastatizar. En ejemplos particulares, una muestra biológica incluye una muestra tumoral, tal como una muestra que contiene células neoplásicas. 15

Las células o tejidos neoplásicos ejemplares pueden incluirse en o aislarse a partir tumores sólidos, incluyendo cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como carcinoma de células escamosas de pulmón), carcinomas de mama (por ejemplo, carcinomas lobular y conductual), cáncer adrenocortical, ameloblastoma, cáncer ampular, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer cervical, colangioma, cáncer colorrectal, 20 cáncer endometrial, cáncer de esófago, cáncer gástrico, glioma, tumor de células granulares, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, mola hidatiforme, linfoma, melanoma, mesotelioma, mieloma, neuroblastoma, cáncer oral, osteocondroma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, pilomatricoma, cáncer de próstata, cáncer de células renales, tumor de glándulas salivales, tumores de tejido blando, nevus de Spitz, cáncer de células escamosas, cáncer teratoideo y cáncer de tiroides. Las células neoplásicas ejemplares también pueden incluirse en 25 o aislarse a partir de cánceres hematológicos que incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tal como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolente y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de 30 Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico y mielodisplasia.

Por ejemplo, una muestra de un tumor que contiene material celular puede obtenerse por escisión quirúrgica de todo o parte del tumor, recogiendo un aspirado de agua fina del, así como otros métodos conocidos en la técnica. En algunos ejemplos, se aplica una muestra tisular o celular a un sustrato y se analiza para determinar la presencia de 35 una fusión génica. Un soporte sólido útil en un método desvelado necesita únicamente llevar la muestra biológica y, opcionalmente, pero ventajosamente, permite la detección conveniente de componentes (por ejemplo, proteínas y/o secuencias de ácidos nucleicos) en la muestra. Los soportes ejemplares incluyen portamuestras de microscopio (por ejemplo, portamuestras de microscopio de vidrio o portamuestras de microscopio de plástico), cubreobjetos (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio o cubreobjetos de plástico), placas de cultivo tisular, placas multi-pocilo, membranas 40 (por ejemplo, nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF)) o chips BIACORE.

Las muestras descritas en el presente documento pueden prepararse usando cualquier método conocido actualmente o desarrollado de ahora en adelante en la técnica. En algunos ejemplos, las células en la muestra se lisan o se permeabilizan en una solución acuosa (por ejemplo usando un tampón de lisis). La solución acuosa o el 45 tampón de lisis incluye detergente (tal como dodecil sulfato sódico) y uno o más agentes caotrópicos (tal como formamida, HCl guanidinio, isotiocianato de guanidinio, o urea). La solución también puede contener un tampón (por ejemplo SSC). En algunos ejemplos, el tampón de lisis incluye de aproximadamente el 15 % al 25 % de formamida (v/v), SDS de aproximadamente 0,01 % al 0,1 %, y SSC aproximadamente 0,5-6X (por ejemplo, aproximadamente 3X SSC). El tampón puede incluir opcionalmente ARNt (por ejemplo, de aproximadamente 0,001 a 50 aproximadamente 2,0 mg/ml) o una ribonucleasa. El tampón de lisis también puede incluir un indicador de pH, tal como Rojo de Fenol. En un ejemplo particular, el tampón de lisis incluye formamida al 20 %, SSC 3X (79,5 %), SDS al 0,05 %, 1 µg/ml de ARNt, y 1 mg/ml de Rojo de Fenol.

Las células (u otros tipos de muestra) se incuban en la solución acuosa durante un periodo de tiempo suficiente (tal 55 como de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos, por ejemplo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 10 minutos) y a una temperatura suficiente (tal como de aproximadamente 22 ºC a aproximadamente 115 ºC, por ejemplo, de aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 105 ºC, o de aproximadamente 90 ºC a aproximadamente 100 ºC) para lisar o permeabilizar la célula. En algunos ejemplos, la lisis se realiza a aproximadamente 95 ºC, si el ácido nucleico de la fusión génica a detectar es ARN. En otros ejemplos, la lisis se realiza a aproximadamente 105 ºC, si el ácido nucleico de fusión génica a detectar es ADN. En algunos ejemplos, las condiciones de lisis pueden ser de tal forma que el ADN genómico no es accesible a las sondas mientras que el ARN (por ejemplo, ARNm) es, o de tal forma que el ARN se destruye y únicamente el ADN es accesible para la hibridación de la sonda. En algunos ejemplos, la etapa de lisis incluye incubar la muestra a 5 aproximadamente 95 ºC durante aproximadamente 5-15 minutos para desnaturalizar el ARN en la muestra, pero no el ADN genómico. En otros ejemplos, la etapa de lisis incluye incubar la muestra a aproximadamente 105 ºC durante aproximadamente 5-15 minutos para desnaturalizar el ARN y el ADN genómico en la muestra.

En algunos ejemplos, el lisado celular en bruto se usa directamente sin purificación adicional. Las células pueden 10 lisarse en presencia o ausencia de una o más de las sondas desveladas. Si las células se lisan en ausencia de la sonda, la una o más sondas pueden añadirse posteriormente al lisado en bruto. En otros ejemplos, los ácidos nucleicos (tal como ADN y/o ARN) se aíslan a partir del lisado celular antes de entrar en contacto con una o más de las sondas desveladas.

15

En algunos ejemplos, las muestras tisulares se preparan fijando y embebiendo el tejido en un medio e incluyen una suspensión celular que se prepara como una monocapa sobre un soporte sólido (tal como un portaobjetos de vidrio), por ejemplo por frotis o centrifugación de las células sobre el soporte sólido. En ejemplos adicionales, puede usarse tejido congelado fresco (por ejemplo, sin fijar) o secciones de tejido en los métodos desvelados en el presente documento. Las secciones tisulares se usan en los métodos desvelados en el presente documento, por ejemplo 20 colocando toda o una porción de la sección en el tampón de lisis y avanzando como se describe para otros tipos de muestras.

En algunos ejemplos se usa un medio de embebido. Un medio de embebido es un material inerte en el que se embeben tejidos y/o células para ayudar a conservarlas para un análisis futuro. La incrustación también permite 25 muestras tisulares que se cortarán en secciones finas. Los medios de embebido incluyen parafina, celoidina, compuesto OCT™, agar, plástico o acrílico. Muchos medios de embebido son hidrófobos; por lo tanto, el material inerte puede necesitar recuperarse antes del análisis histológico o citológico, que utiliza reactivos hidrófilos primarios. Los términos de desparafinización o cera perdida se usan ampliamente en el presente documento para referirse a la eliminación parcial o completa de cualquier tipo de medio de embebido de una muestra biológica. Por 30 ejemplo, las secciones tisulares embebidas en parafina se desparafinan por paso a través de disolventes orgánicos, tales como tolueno, xileno, limoneno, u otros disolventes adecuados. En algunos ejemplos, una muestra embebida en parafina fijada en formalina no se desparafina antes de la lisis celular.

Los tejidos pueden fijarse mediante cualquier proceso adecuado, incluyendo perfusión o inmersión en un fijador. Los 35 fijadores pueden clasificarse como agentes de entrecruzamiento (tales como aldehídos, por ejemplo, formaldehído, paraformaldehído y glutaraldehído, así como agentes de entrecruzamiento sin aldehído), agentes de oxidación (por ejemplo, iones metálicos y complejos, tales como tetraóxido de osmio y ácido crómico), agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, ácido acético, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro mercúrico, acetona y ácido pícrico), reactivos de combinación (por ejemplo, fijador de Carnoy, metacarn, 40 fluido de Bouin, fijador B5, fluido de Rossman, y fluido de Gendre), microondas y fijadores diversos (por ejemplo, fijación en volumen excluido y fijación al vapor). También pueden incluirse aditivos en el fijador, tales como tampones, detergentes, ácido tánico, fenol, sales de metales (tales como cloruro de cinc, sulfato de cinc y sales de litio), y lántano.

45

El fijador más usado comúnmente en la preparación de muestras para IHC es formaldehído, generalmente en forma de una solución de formalina (formaldehído al 4 % en una solución de tampón, denominada como formalina tamponada al 10 %). En un ejemplo, el fijador es formalina tamponada neutra al 10 %.

La divulgación se ilustra adicionalmente por los siguientes Ejemplos no limitantes. 50

EJEMPLOS

Ejemplo 1

55

Detección de fusiones de Bcr-AbI

Este ejemplo describe sondas de fusión para la detección de fusiones de Bcr-Abl y su uso en la detección de ácidos nucleicos de fusión de Bcr-Abl.

Se diseñaron sondas de fusión que abarcaban fusiones de Bcr-Abl y se proporcionan en la Tabla 4. Se prepara ARNm transcrito in vitro (IVT) para dianas de fusión de Bcr-Abl (Tabla 5). La diana IVT específica se añadió y la señal de una matriz que contenía todas las sondas de fusión diana se midió en un ensayo en damero (figura 4). La diana IVT diluida con tampón de lisis se incubó con sondas de fusión a 95 ºC durante 10-15 minutos, y se incubó a 5 60 ºC durante 6-16 horas para permitir la hibridación de la sonda de ARN. La mezcla se trató con S1 nucleasa (dilución 1:40 en tampón S1 nucleasa) a 50 ºC durante 60-90 minutos para digerir el ARN no hibridado y las sondas. La reacción de nucleasa se detuvo (NaOH 1,6 N, EDTA 0,135 M, pH 8,0) durante 15-20 minutos a 95 ºC y después la mezcla se añadió a una placa que incluía enlazadores de programación específicos para las sondas de fusión (Tabla 6) y se incubó a 50 ºC durante 16-24 horas. Después, los enlazadores de detección (Tabla 6) se añadieron y 10 se incubaron a 60 ºC durante 60-90 minutos. Se añadió la sonda de detección y se incubó a 50 ºC durante 60-90 minutos, después se añadió la solución de detección y se incubó a 37 ºC durante 60 minutos. Se añadió una solución luminiscente y la placa se sometió a formación de imagen para detectar la sonda de fusión que se une a la placa.

15

Las sondas son específicas generalmente para la diana de interés (figura 4). La sonda para E12A2 se entrecruzó con la diana E13A2, y la sonda para E12A3 se entrecruzó con la diana E13A3. Las sondas pueden diseñarse de nuevo para eliminar esta reactividad cruzada, que se cree que surge porque las fusiones específicas están muy cercanas entre sí, con bases de solapamiento incorporadas en las secuencias de sonda.

20

Tabla 4. Dianas y sondas de fusión de Bcr-Abl

Sonda/diana de fusión

Secuencia de sonda de fusión (5'-> 3')* SEQ ID NO:

E1A2

gatgctactggccgctgaagggcttCTGCGTCTCCATGGAAGGCGCCCTC 133

E1A3

tagcctaagacccggagcttttcacCTGCGTCTCCATGGAAGGCGCCCTC 134

E6A2

gatgctactggccgctgaagggcttTTTTCCAGAGAGTTCTTGGTCGTTGG 135

E6A3

tagcctaagacccggagcttttcacTTTCCAGAGAGTTCTTGGTCGTTGG 136

E12A2

gatcctactggccgctgaagggcttACTTCTTCTGCTGCTCCCGGATGTT 137

E12A3

tagcctaagacccggagcttttcacACTTCTTCTGCTGCTCCCGGATGTT 138

E13A2

gatgctactggccgctgaagggcttCTTCCTTA/GTTGATGGTCAGCGGAAT 139

E13A3

tagcctaagacccggagcttttcacCTTCCTTA/GTTGATGGTCAGCGGAAT 140

E14A2

gatgctactggccgctgaagggcttTTGAACTCTGCTTAAATCCAGTGGC 141

E14A3

tagcctaagacccggagcttttcacTTGAACTCTGCTTAAATCCAGTGGC 142

E19A2

gatgctactggccgctgaagggcttTGACGTCGAAGGCTGCCTTCAGTGC 143

E19A3

tagcctaagacccggagcttttcacTGACGTCGAAGGCTGCCTTCAGTGC 144

E20A2

gatgctactggccgctgaagggcttCGATGCCCTCTGCGAAGTTGGGGTA 145

E20A3

tagcctaagacccggagcttttcacCGATGCCCTCTGCGAAGTTGGGGTA 146

*Minúscula, secuencia Abl; Mayúscula, secuencia Bcr; Subrayado, posición polimórfica

Tabla 5. Secuencias nucleotídicas incluidas en las dianas IVT Bcr-Abl

25

Fusión diana

Secuencia Bcr (posiciones de nucleótidos en NM_021574.2) Secuencia Abl (posiciones de nucleótidos en NM_007313.2)

E1A2

1736-1875 576-715

E1A3

1736-1875 750-900

E6A2

2378-2517 576-715

E6A3

2378-2517 750-900

E12A2

3059-3198 576-715

E12A3

3059-3198 750-900

E13A2

3164-3303 576-715

E13A3

3164-3303 750-900

E14A2

3239-3378 576-715

E14A3

3239-3378 750-900

E19A2

3647-3786 576-715

E19A3

3647-3786 750-900

E20A2

3782-3921 576-715

E20A3

3782-3921 750-900

Tabla 6. Enlazadores de programación y enlazadores de detección para el ensayo de Bcr-Abl

Fusión

Secuencia (5'-> 3')* SEQ ID NO:

Enlazadores de programación

E1A2

GCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCGGAGGGCGCCTTCCATGGAGACGCAG 147

E1A3

GCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCGGAGGGCGCCTTCCATGGAGACGCAG 148

E6A2

GGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGACCAACGACCAAGAACTCTCTGGAAA 149

E6A3

GGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGACCAACGACCAAGAACTCTCTGGAAA 150

E12A2

GCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGAAGT 151

E12A3

GCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGAAGT 152

E13A2

CCACGTCCCTTCCTAGAGACGCTTAATTCCGCTGACCATCAATAAGGAAG 153

E13A3

CCACGTCCCTTCCTAGAGACGCTTAATTCCGCTGACCATCAACAAGGAAG 154

E14A2

TGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTCGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA 155

E14A3

TGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTCGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA 156

E19A2

CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAGGCACTGAAGGCAGCCTTCGACGTCA 157

E19A3

CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAGGCACTGAAGGCAGCCTTCGACGTCA 158

E20A2

GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCGTACCCCAACTTCGCAGAGGGCATCG 159

E20A3

GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCGTACCCCAACTTCGCAGAGGGCATCG 160

Enlazador de detección

E1A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 161

E1A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 162

E6A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 163

E6A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 164

E12A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 165

E12A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 166

E13A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 167

E13A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 168

E14A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 169

E14A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 170.

E19A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 171

E19A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 172

E20A2

AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 173

E20A3

GTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTG 174 .

Ejemplo 2 5

Sondas de fusión de Bcr-Abl marcadas directamente

Este ejemplo describe métodos ejemplares para detectar un gen de fusión de Bcr-Abl en una muestra que utiliza una sonda de fusión marcada directamente. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que también pueden usarse 10 métodos que se desvían de estos métodos específicos para detectar con éxito la presencia de una fusión génica de Bcr-Abl en una muestra.

Se sintetiza una sonda de fusión se sintetiza que abarca el sitio de fusión de Bcr-Abl E1/A2, incluyendo cuatro nucleótidos de la secuencia Bcr y 40 nucleótidos de la secuencia Ab1 (Tabla 7). La sonda se marca con biotina en el 15 extremo 5' o de aproximadamente uno a dos nucleótidos del extremo 5'.

Tabla 7. Fusiones de Bcr-Abl E1A2 y secuencias de la sonda de fusión de "solapamiento corto"

Secuencia (5'-> 3')* SEQ ID NO:

Punto de fusión E1A2

acgatggcgagggcgccttccatggagacgcagAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGC ATCTGACTTTGAGCCTCA 175

Sonda de fusión

gcapAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCA 176

*Minúscula, secuencia Bcr; Mayúscula, secuencia Abl

Una muestra celular se lisa con tampón de lisis (por ejemplo como se ha descrito anteriormente) y la sonda (167 pM) 5 se hibrida en la muestra lisada. La muestra se trata con S1 nucleasa para eliminar ácidos nucleicos no hibridados como se ha descrito anteriormente. El tratamiento de S1 nucleasa también elimina la porción no hibridada de la sonda de fusión hibridada en el ácido nucleico Abl de tipo silvestre, incluyendo la etiqueta de biotina (por ejemplo, véase la figura 2). La sonda de fusión restante, que se hibrida en el ácido nucleico de fusión de Bcr-Abl se detecta utilizando peroxidasa de avidina-rábano picante o avidina-ficoeritrina. La detección de la señal indica la presencia de 10 una fusión génica de Bcr-Abl en la muestra.

Ejemplo 3

Detección de fusiones génicas de EML4-ALK utilizando sondas de fusión 15

Este ejemplo describe la detección de variantes de fusión de EML4-ALK con sondas de fusión.

Se añadieron variantes de fusión génica de EML4-ALK transcritas in vitro (IVT) a concentraciones finales de 167 pM de una o más sondas de fusión complementarias a las secuencias diana en la Tabla 8. La muestra se calienta a 20 95 ºC durante 10-15 minutos y después se incuba a 60 ºC durante 6-16 horas para la hibridación de la sonda de ARN. A la muestra se le añadió S1 nucleasa diluida 1:40 en tampón de S1 nucleasa (acetato sódico 0,25 M, pH 4,5, NaCl 1,4 M, ZnSO4 0,225 M, KATHON al 0,05 %). La muestra se incubó a 50 ºC durante 60-90 minutos para digerir los ácidos nucleicos no unidos.

25

Tabla 8. Secuencias diana de la sonda de fusión de EML-ALK

Variante

Secuencia diana (5'-> 3') SEQ ID NO:

EML4-ALK-v1

TAGAGCCCACACCTGGGAAAGGACCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAG 177

EML4-ALK-v2

CTAACTCGGGAGACTATGAAATATTGTACTTGTACCGCCGGAAGCACCAG 178

EML4-ALK-v3a

CAAGCATAAAGATGTCATCATCAACCAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAGG 179

EML4-ALK-v3b-3

TCAACTCGCGAAAAAAACAGCCAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCT 180

EML4-ALK-v4

CATGATCTGAATCCTGAAAGAGAAATAGAGATATGCTGGATGAGCCCTGA 181

EML4-ALK-v5a

AAAATCAGTCTCAAGTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCTGCAAG 182

EML4-ALK-v5b-3

CTCAAGTAAAGGTTCAGAGCTCAGGGGAGGATATGGAGATCCAGGGAGGC 183

EML4-ALK-v6

AACAGCTCTCTGTGATGCGCTACTCAATAGTGTACCGCCGGAAGCACCAG 184

Se preparó una ARRAYPLATE (HTG Molecular) que incluía enlazadores de programación que incluían una porción complementaria a una porción de la sonda de fusión en ubicaciones espacialmente distintas diluyendo una solución 30 de lavado 20X (SSC 20 X, TWEEN-20 al 0,95 %, KATHON al 0,05 %) calentada a 50 ºC en 1:20, añadiendo 250 µl por pocillo a la ARRAYPLATE, incubando durante 10-50 segundos y vaciando los pocillos. Esto se repitió seis ciclos. Después del último lavado, se añadieron 40 µl por pocillo de una solución de programación que incluía 5 nM de cada enlazador de programación y la placa se incubó a 60 ºC durante 60-90 minutos y después se lavó.

35

Se preparó una placa de parada con 10 µl de solución de parada S1 (NaOH 1,6 N, EDTA 0,135 M, pH 8,0) y toda la muestra se transfirió a la placa de parada tras la incubación de nucleasa. La placa de parada se incubó a 95 ºC durante 15-20 minutos para inactivar la S1 nucleasa e hidrolizar el ARN unido. La placa se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos y se añadieron 10 µl de una solución de neutralización (HEPES 1 M, pH 7,5, SSC 6X, HCl 1,6 N) a la fase acuosa inferior de la placa de parada y se mezcló.

5

La solución de lavado se eliminó de la ARRAYPLATE y se transfirieron 60 µl de la fase acuosa inferior de la placa de parada a la ARRAYPLATE. Los 70 µl restantes de la fase oleosa superior de la placa de parada se transfirieron a la ARRAYPLATE y la placa se incubó a 50 ºC durante 16-24 horas para permitir la hibridación de la sonda a la placa. Después, la ARRAYPLATE se lavó con una solución de lavado, se añadieron 40 µl de solución de enlazador de detección (5 nM) y se incubó durante 60-90 minutos a 60 ºC para permitir la hibridación del enlazador de detección. 10 Tras el lavado, a la placa se le añadieron 40 µl de sonda de detección (5 nM) y se incubó durante 60-90 minutos a 50 ºC. Tras el lavado, a la placa se le añaden 40 µl de una solución enzimática de detección y se incuba a 37 ºC durante 60 minutos. La placa se lavó y se incubó a temperatura ambiente con agitación durante 15-30 minutos. Después del lavado, se añadieron 50 µl de una solución luminiscente y se cubrieron con 100 µl de aceite de formación de imágenes (Norpar 15 al 99,9 %, colorante Oil Red O al 0,1 %) y se formó por imágenes usando un 15 dispositivo de formación de imagen OMIX, OMIX HD, CAPELLA o SUPERCAPELLA.

Se realizaron curvas de valoración con una cantidad en aumento de ARNm de fusión IVT con cada sonda EML4-ALK. Los resultados para cada sonda se muestran en la figura 6A-H. Todas las sondas proporcionaron una detección sensible de ARNm IVT. Las sondas EML4-ALK-v2 (figura 6B), EML4-ALK-v3a (figura 6C), EML4-ALK-v4 20 (figura 6E) y EML4-ALK-v5a (figura 6F) mostraron todas una respuesta lineal sobre la curva de valoración. Las diferencias observadas en las intensidades de señal pueden deberse a diferencias en la eficiencia de la hibridación de las sondas en su secuencia de fusión diana, la calidad de las IVT, u otros factores.

Ejemplo 4 25

Sondas flanqueantes ALK

Este ejemplo describe el diseño y el ensayo de las sondas ALK flanqueantes 5' y 3'.

30

Se utilizaron dos ARNm IVT en estos experimentos. Uno fue una IVT ALK de longitud completa generada a partir de un clon disponible en el mercado. La segunda IVT se diseñó para incluir únicamente las 16 secuencias diana (Tabla 9). Los experimentos se realizaron como se describió en el Ejemplo 3.

Tabla 9. Secuencias diana de las sondas ALK flanqueantes 5' y 3' 35

ID diana

Posición diana Secuencia diana (5'-> 3') SEQ ID NO:

Diana ALK 5' 1

56 185

Diana ALK 5' 2

262 186

Diana ALK 5' 3

337 187

Diana ALK 5' 4

595 188

Diana ALK 5' 5

1086 189

Diana ALK 5' 6

1349 190

Diana ALK 5' 7

1445 191

Diana ALK 5' 8

1528 192

Diana ALK 3' 1

4233 193

Diana ALK 3' 2

4578 194

Diana ALK 3' 3

4723 195

Diana ALK 3' 4

5125 196

Diana ALK 3' 5

5394 197

Diana ALK 3' 6

5557 198

Diana ALK 3' 7

5611 199

Diana ALK 3' 8

5665 200

Se seleccionaron ocho secuencias diana diferentes en la porción 5' del gen ALK que no está implicado en la construcción de fusión de EML y las sondas se diseñaron. También se seleccionaron ocho secuencias diana diferentes en la porción 3' del gen ALK que son parte de la construcción de fusión de EML y la sondas se diseñaron. Cada sonda se ensayó frente a la IVT ALK de longitud completa (figura 7A) y la ALK IVT truncada (figura 7B). En 5 base a estos resultados, se seleccionaron las siguientes secuencias diana para la detección de fusiones génicas de ALK: Diana ALK 5' 3, diana ALK 5' 5, diana ALK 5' 7, diana ALK 5' 8, diana ALK 3' 5, diana ALK 3' 6, diana ALK 3' 7 y diana ALK 3' 8.

Ejemplo 5 10

Métodos para detectar una fusión génica utilizando relaciones de sonda flanqueante

Este ejemplo describe métodos ejemplares de detección de la presencia de una fusión génica en una muestra utilizando sondas que flanquean la región de fusión. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que los 15 métodos que se desvían de estos métodos específicos también pueden usarse para detectar con éxito la presencia de una fusión génica en una muestra.

Una muestra, tal como una muestra tumoral o una muestra sanguínea se recoge de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una fusión génica diana. Las células en la muestra se lisan con tampón de lisis (descrito 20 anteriormente) a 60 ºC durante 6-16 horas en presencia de una sonda 5' flanqueante y una sonda 3' flanqueante para uno de los genes en la fusión génica diana (por ejemplo, las sondas flanqueantes mostradas en la Tabla 3 o la Tabla 8). La mezcla se trata con S1 nucleasa (dilución 1:40 en tampón de S1 nucleasa) a 50 ºC durante 60-90 minutos para digerir el ARN no hibridado y las sondas. La reacción de nucleasa se detiene (NaOH 1,6 N, EDTA 0,135 M pH 8,0) durante 15-20 minutos a 95 ºC y después la mezcla se añade a una placa que incluye enlazadores 25 de programación específicos para las sondas flanqueantes y se incuba a 50 ºC durante 16-24 horas. Después, se añaden enlazadores de detección y se incuban a 60 ºC durante 60-90 minutos. La sonda de detección se añade y se incuba a 50 ºC durante 60-90 minutos, después la solución de detección se añade y se incuba a 37 ºC durante 60 minutos. La solución luminiscente se añade y la placa se somete a formación de imágenes para detectar la sonda que se une a la placa. 30

Se calcula una relación de la intensidad de señal de la sonda 5' flanqueante con respecto a la sonda 3' flanqueante. Si la relación no es estadísticamente diferente de uno, entonces la fusión génica diana no está presente en la muestra. Si las sondas flanqueantes son complementarias al gen 5' en la fusión génica diana, entonces la fusión génica está presente en la muestra si la relación es estadísticamente significativamente mayor de uno. Si las sondas 35 flanqueantes son complementarias al gen 3' en la fusión génica diana, entonces la fusión génica está presente en la muestra si la relación es estadísticamente significativamente menos de uno.

40

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para detectar la presencia de una fusión génica en una muestra aislada obtenida de un sujeto que comprende:

   5

   poner en contacto la muestra con una primera sonda complementaria con un primer ácido nucleico 5' con respecto a un punto de fusión entre el primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, en condiciones suficientes para que la primera sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico;

   poner en contacto la muestra con una segunda sonda complementaria con el primer ácido nucleico 3' con respecto 10 al punto de fusión entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la segunda sonda hibride especialmente en el primer ácido nucleico;

   poner en contacto la muestra con una nucleasa específica para ácidos nucleicos monocatenarios;

   15

   detectar la presencia de la primera sonda y la segunda sonda;

   determina una relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda; y

   detectar la presencia de fusión génica si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es 20 significativamente diferente de 1.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que la fusión génica no comprende una porción 3' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es mayor de aproximadamente uno. 25
3. 3. El método de la reivindicación 1, en el que la fusión génica no comprende una porción 5' del primer ácido nucleico si la relación de la primera sonda con respecto a la segunda sonda es menos de aproximadamente uno.

   30
4. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la detección de la primera sonda y la segunda sonda comprende poner en contacto la muestra con una primera sonda de detección que es capaz de hibridar con la primera sonda y una segunda sonda de detección que es capaz de hibridar con la segunda sonda.
5. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la primera sonda comprende una 35 secuencia de ácido nucleico como se expone en una de las SEQ ID NO: 187, 189, 191 o 192 o el complemento de las mismas, la segunda sonda comprende una secuencia de ácido nucleico como se expone en una de las SEQ ID NO: 197-200 o el complemento de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas.
6. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente: 40

   poner en contacto la muestra con una sonda de fusión que comprende una porción 5' complementaria con el primer ácido nucleico y una porción 3' complementaria con el segundo ácido nucleico en condiciones suficientes para que la sonda hibride específicamente en la fusión génica, donde la sonda de fusión abarca un punto de fusión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, antes de poner en contacto la muestra con la nucleasa; 45

   detectar la presencia de la sonda de fusión;

   determinar una relación de la sonda de fusión con respecto a la primera sonda, determinando así un porcentaje de la fusión génica en la muestra con respecto al primer ácido nucleico o determinar una relación de la sonda de fusión 50 con respecto a la segunda sonda, determinando así un porcentaje de la fusión génica en la muestra con respecto al segundo ácido nucleico.
7. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que:

   55

   i) la primera sonda y la segunda sonda comprenden cada una adicionalmente una etiqueta detectable; o

   ii) la primera sonda y la segunda sonda comprenden cada una etiqueta detectable diferente o la misma etiqueta detectable.
8. 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la sonda de fusión, la primera sonda, y/o la segunda sonda tienen cada una de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de longitud.
9. 9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer ácido nucleico y el 5 segundo ácido nucleico son ARN o ARNm.
10. 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son ADN o ADNc.

    10
11. 11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la muestra comprende tejido, una biopsia tumoral, sangre o un fluido corporal.