[go: up one dir, main page]

SK500652015A3 - Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie - Google Patents

Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie Download PDF

Info

Publication number
SK500652015A3
SK500652015A3 SK50065-2015A SK500652015A SK500652015A3 SK 500652015 A3 SK500652015 A3 SK 500652015A3 SK 500652015 A SK500652015 A SK 500652015A SK 500652015 A3 SK500652015 A3 SK 500652015A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mrna
specific
sequence
fusion
oligonucleotides
Prior art date
Application number
SK50065-2015A
Other languages
English (en)
Inventor
Filip Rázga
Veronika Némethová
Original Assignee
Ústav Polymérov Sav
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Polymérov Sav filed Critical Ústav Polymérov Sav
Priority to SK50065-2015A priority Critical patent/SK500652015A3/sk
Priority to LTEPPCT/SK2016/060002T priority patent/LT3362098T/lt
Priority to ES16845348T priority patent/ES2920887T3/es
Priority to PL16845348.8T priority patent/PL3362098T3/pl
Priority to EP16845348.8A priority patent/EP3362098B1/en
Priority to RU2018117650A priority patent/RU2724485C2/ru
Priority to PCT/SK2016/060002 priority patent/WO2017065696A2/en
Priority to SM20220319T priority patent/SMT202200319T1/it
Priority to US15/768,586 priority patent/US11371038B2/en
Priority to DK16845348.8T priority patent/DK3362098T3/da
Priority to SI201631562T priority patent/SI3362098T1/sl
Priority to NZ742493A priority patent/NZ742493B2/en
Priority to JP2018539222A priority patent/JP7053473B2/ja
Priority to KR1020187010701A priority patent/KR102307184B1/ko
Priority to CA3001994A priority patent/CA3001994A1/en
Priority to PT168453488T priority patent/PT3362098T/pt
Priority to AU2016336851A priority patent/AU2016336851B2/en
Priority to HRP20220968TT priority patent/HRP20220968T1/hr
Priority to HUE16845348A priority patent/HUE058829T2/hu
Priority to RS20220639A priority patent/RS63354B1/sr
Publication of SK500652015A3 publication Critical patent/SK500652015A3/sk
Priority to JP2022059685A priority patent/JP7657756B2/ja
Priority to CY20221100395T priority patent/CY1125386T1/el
Priority to JP2024209657A priority patent/JP2025027114A/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/331—Universal or degenerate base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Opisuje sa spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej nukleovej kyseliny umožňujúci jej špecifické a selektívne rozpoznanie a následnú selektívnu manipuláciu, intervenciu, detekciu, kvantifikáciu, značenie, pre-targetovanie a sortovanie, pričom sa táto nukleová kyselina podrobí zacieleniu konštruktom tvoreným aspoň dvomi sekvenčne-špecifickými oligonukleotidmi vzájomne prepojenými veľkostne špecifickým polymérnym linkerom vymedzujúcim ich vzájomnú vzdialenosť, pričom každým sekvenčne špecifickým oligonukleotidom sa zacieli vopred definovaná cieľová sekvencia úseku nukleovej kyseliny za vzniku stabilného heteroduplexu.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka úpravy funkčného stavu ľubovoľnej nukleovej kyseliny umožňujúceho jej špecifické a selektívne rozpoznanie a následnú selektívnu manipuláciu. Predkladané riešenie je plne univerzálne a využiteľné v odvetviach, ako napr. biotechnológia, molekulárna biológia, virológia, medicína, atď. Vynález má priamu aplikovateľnosť a rozsiahly terapeutický potenciál predovšetkým v oblasti onkológie, pričom sa však na túto oblasť nevymedzuje.
Doterajší stav techniky
V kontexte doterajšieho stavu techniky je riešenie opísané v predmetnom vynáleze, na rozdiel od iných, z chemického hľadiska podobných konštruktov, navrhnuté na diametrálne odlišný účel.
Bivalentný systém obsiahnutý v spise WO 2011/117353 (Moeller, Udesen, 2011) predstavuje multifunkčný konštrukt, ktorý je zameraný na simultánnu interakciu jednotlivých oligonukleotidov s dvomi nezávislými cieľovými nukleovými kyselinami s primárnou snahou vysýtiť ich interferenčné miesta za účelom modulácie ich biologickej funkcie. Tým, že každý oligonukleotid rozpoznáva inú cieľovú nukleovú kyselinu, samotný konštrukt principiálne funguje ako štandardný antisense oligonukleotid (s ohľadom na jednotlivé cieľové nukleové kyseliny) a nijakým spôsobom nezvyšuje selektivitu ich rozpoznania.
Analogicky, konjugát antisense oligonukleotidov opísaný v spise WO 2011/031520 (Agrawal a kol., 2011) je účelovo navrhnutý na rozpoznávanie dvoch nukleových kyselín (či už dvoch identických alebo dvoch rôznych), pričom podobne ako v spise WO 2011/117353 (Moeller, Udesen, 2011), rozpoznáva jednotlivé nukleové kyseliny individuálne (t. j. pomocou jedného antisense oligonukleotidu). Tým pádom nijakým spôsobom nerieši problém ich selektívneho rozpoznania.
Ďalšie chemicky podobné konštrukty opísané v spisoch WO 2009/023819 (Kandimalla a kol., 2009), WO 2005/111238 (Epstein a kol., 2005), WO 2005/078096 (Zamore a kol., 2005), WO 2004/064782 (Agrawal a kol., 2004) sú navrhnuté na účely imunoregulácie, zlepšenia transportu do buniek, rekrutovania miRNA resp. na účely imunostimulácie. Žiaden z nich však nerieši problém selektívneho rozpoznania cieľových nukleových kyselín.
Vo všetkých týchto prípadoch predstavujú opísané konštrukty len akúsi „výhodnú“, multifunkčnú podobu interagujúcej molekuly, navyše navrhnutú na riešenie diametrálne odlišného a s predmetným riešením nesúvisiaceho problému. Zásadné rozdiely teda spočívajú v tom, že kým t · · · ·· dodnes opísané konštrukty nijakým spôsobom neriešia problém promiskuity antisense oligonukleotidov, predmetný vynález toto riešenie prináša.
Pokiaľ sú súčasné poznatky vedy v tejto oblasti zamerané na liečenie nádorových ochorení je potrebné uviesť, že fúzne gény charakteristické výlučne pre nádorové bunky predstavujú kauzálnu príčinu mnohých nádorových ochorení (napr. leukémií, lymfómov, sarkómov, atd’.), a možno ich nepochybne považovať za perspektívny cieľ pre protinádorovú terapiu. Jedinečná sekvencia fúznej nukleovej kyseliny umožňuje špecificky a selektívne zacieliť nádorovú bunku, pričom zdravé bunky zostanú mimo terapeutický zásah. Protinádorové terapie opierajúce sa o interferenciu terapeutika s nukleovými kyselinami tak možno nasmerovať na interferenciu s fúznou nukleovou kyselinou a docieliť tak efekt terapeutika výlučne v nádorových bunkách. V kontexte antisense stratégií to znamená účelové umlčanie fúznych génov väzbou na fuzne mRNA, a tým zabránenie vzniku kauzálnych fúznych proteínov.
Problém nedostatočnej špecificky týchto stratégií (v zmysle špecificky väzby terapeutika k cieľovej sekvencii mRNA, jeho väzbovej afinity k cieľovej mRNA a energie väzby s cieľovou mRNA) bol a je riešený predovšetkým chemickými úpravami samotných terapeutických látok, napr. chemickou modifikáciou ribózy a/alebo fosfodiesterovej väzby [Pirollo, Rait a kol., 2003; Stahel, Zangmeister-Wíttke, 2003; Jansen, Zangemeister-Wittke, 2002]. Napriek tomu, konečné riešenie zatiaľ nebolo identifikované, nakoľko ani modifikované terapeutiká nie sú dostatočne špecifické, resp. selektívne, a spôsobujú utíšenie génov aj mimo terapeutický zámer [Burnett, Rossi, 2012]. Následne je tak ovplyvnená expresia necielených proteínov, čo spôsobuje klinicky závažné vedľajšie účinky s negatívnym dopadom na kvalitu života pacientov.
S ohľadom na princíp rozpoznávania cieľovej mRNA bola a je dodnes bežne zaužívaným štandardom antisense stratégií aplikácia jedného terapeutického, sekvenčne špecifického oligonukleotidu, ktorý sa viaže na jedinečné miesto cieľovej mRNA. V prípade fúznej mRNA je toto interferenčné miesto obvykle miestom priamej fúzie jednotlivých iúznych partnerov [Diakos a kol., 2007; Rangatia, Bonnet, 2006; Rapozzi a kol., 2006; Scherr a kol., 2005; Scherr a kol., 2003; Tanaka a kol., 1997]. Publikované dáta však jasne poukazujú na fakt, že i napriek výrazne zlepšeným fyzikálno-chemickým vlastnostiam antisense teraputík, aplikácia jedného interferujúceho oligonukleotidu nepriniesla do dnešného dňa želaný progres v otázke nešpecifickej väzby antisense oligonukleotidov k mRNA mimo terapeutický zámer [Summerton, 2007].
Súčasný stav techniky teda stále čelí tej najzásadnejšej výzve a tou je špecificita a selektivita terapeutického účinku výlučne na primárny cieľ. Skutočný progres v protinádorových stratégiách teda neleží ani tak na vývoji nových terapeutických molekúl, ale na vývoji systémov, ktoré umožnia ich selektívne terapeutické pôsobenie.
• ···
Limitácia v podobe nedostatočnej špecificity a selektivity protinádorových stratégií je riešená predkladaným vynálezom, ktorý predstavuje univerzálne riešenie pre ľubovoľnú liečebnú stratégiu založenú na interferencii s nukleovými kyselinami. Princíp špecifického a selektívneho rozpoznávania cieľovej nukleovej kyseliny, spolu s princípom selektívneho pôsobenia je opísaný a vysvetlený na príklade cielenej intervencie kauzálnych fúznych génov, priamou implementáciou predkladaného vynálezu do protinádorových antisense stratégií.
Vo všetkých konfrontovaných patentoch a publikáciách sa výraz „špecifická“ vymedzuje výlučne v súvislosti s kompiementaritou väzby oligonukleotidu a cieľovej sekvencie nukleovej kyseliny, t. j. špecifická = komplementarita; zatiaľ čo v predkladanom vynáleze sa slovíčko „špecifická“ vymedzuje na komplementárne rozpoznanie a väzbu jedinej definovanej cieľovej nukleovej kyseliny, t.j. špecifická = selektivita rozpoznania cieľovej nukleovej kyseliny.
Predkladaný vynález sa teda jasne odlišuje od existujúcich antisense systémov navrhnutých na kontrolovanú intervenciu nukleových kyselín. Inými slovami, predkladaný vynález predstavuje principiálne inovatívne riešenie.
Podstata vynálezu
Nedostatočná špecifická prameniaca z existencie sekvenčnej homológie k cielenej nukleovej kyseline, napr. k cielenej mRNA, je efektívne riešená úpravou funkčného stavu cielenej mRNA umožňujúcou jej selektívne a špecifické rozpoznanie a následne jej selektívnu intervenciu, manipuláciu, detekciu, kvantifikáciu, značenie, pre-targetovanie a sortovanie, pričom táto mRNA sa podrobí zacieleniu konštruktom tvoreným aspoň dvomi sekvenčne-špecifickými oligonukleotidmi vzájomne prepojenými veľkostne-špecifickým polymémym linkerom vymedzujúcim ich vzájomnú vzdialenosť, pričom každým sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom sa zacieli vopred definovaná cieľová sekvencia úseku mRNA za vzniku stabilného heteroduplexu a na základe tejto úpravy je táto mRNA selektívne a špecificky rozpoznaná. Špecifické a selektívne rozpoznanie nukleovej kyseliny je následne možné využiť na selektívnu terapeutickú intervenciu, čím sa zabráni prenosu genetickej informácie kódovanej touto nukleovou kyselinou alebo na diagnostické a vedecké účely.
Takouto úpravou sú špecificky rozpoznávané definované sekvencie nukleovej kyseliny, pričom tieto sekvencie musia byť od seba vzdialené presne definovanú vzdialenosť. Ak dôjde k simultánnemu rozpoznaniu definovaných sekvencii v definovanej vzdialenosti od seba, interferujúci systém nadizajnovaný na dané konkrétne priestorové rozloženie cieľových sekvencii vytvorí termodynamicky preferovanú a energeticky stabilnú väzbu s danou nukleovou kyselinou. Tento princíp rozpoznania minimalizuje pravdepodobnosť nešpecifickej a stabilnej väzby na • · « necielenú nukleovú kyselinu, čím sa dramaticky zníži neželaná interferencia s nukleovými kyselinami mimo primárny cieľ.
Opísaný princíp rozpoznania nukleovej kyseliny dramaticky zvyšuje špecifícitu a selektivitu interferencie s jednou konkrétnou vybranou definovanou nukleovou kyselinou. Opísaný princíp je plne univerzálny a nie je vymedzený na vzájomné prepojenie iba dvoch sekvenčne špecifických oligonukleotidov, t. j. umožňuje účelové prepojenie ľubovoľného počtu oligonukleotidov (n > 2) prostredníctvom zodpovedajúceho počtu neinterferujúcich polymérnych linkerov (n > 1), všetko s ohľadom na finálny aplikačný zámer.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu, kedy je cielenou mRNA fúzna mRNA, sa vyšpecifikované sekvencie nachádzajú každá na prislúchajúcom fúznom partnerovi, a cielenie interferujúceho systému je výlučne na fúznu nukleovú kyselinu, čo v priamom dôsledku zabezpečuje selektívne terapeutické pôsobenie exkluzívne v nádorových bunkách. Navyše, keďže antisense systémy majú schopnosť pôsobiť vo všetkých bunkách obsahujúcich cieľovú mRNA, opísaný vynález so sebou prináša kuratívny potenciál, nakoľko jeho implementáciou je možné selektívne terapeuticky cieliť aj zdrojové bunky nádoru. Inými slovami, opísaná inovácia prináša nádej na úplné a trvalé vyliečenie z onkologického ochorenia.
V kontexte protinádorových antisense stratégií zameraných na intervenciu fúznych génov, takýto princíp umožňuje stabilnú interferenciu s cieľovou fúznou mRNA výlučne len v prípade, keď dôjde k rozpoznaniu oboch komplementárnych sekvencii jednotlivých fúznych partnerov, ktoré navyše musia byť od seba vzdialené presne definovanú vzdialenosť. Týmto spôsobom sa výrazne zvyšuje špecifická a selektivita interferencie, pričom sa takmer vylučuje pravdepodobnosť nešpecifickej stabilnej väzby k čiastočne homológnym sekvenciám. V prípade, že nedôjde k súčasnému naviazaniu oboch komplementárnych sekvencii, t. j. v prípade neželanej väzby na mRNA mimo terapeutický zámer, je čiastočná/parciálna väzba takéhoto systému s necielenou mRNA energeticky veľmi nestabilná a dochádza k jej spontánnemu rozrušeniu [Dias, Stein, 2002],
Aplikácia predmetného vynálezu do oblasti medicíny je demonštrovaná na antisense systémoch pre protinádorovú terapiu, s priamym zameraním na selektívnu intervenciu kauzálnych fúznych génov. V kontexte nádorových ochorení charakterizovaných prítomnosťou fúznych génov to znamená selektívne cielenie výlučne poškodených buniek, čo úplne revolučným spôsobom maximalizuje intervenčný účinok na primáme ciele. V tejto oblasti vynález predstavuje revolučný nástroj na pôsobenie výlučne v nádorových bunkách (t.j. bez intervencie v zdravých bunkách).
Podrobný opis vynálezu
Predložené riešenie, ktorým je spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie a následne selektívnu intervenciu, manipuláciu, detekciu, kvantifikáciu, značenie, pre-targetovanie a sortovanie tejto mRNA, navrhnuté na zvýšenie špecificity a selektivity cielenia konkrétnej nukleovej kyseliny, spolu s vyšpecifikovanou aplikačnou oblasťou (napr. kontrolovaná inhibícia kauzálnych fuznych génov; detekcia prítomnosti a kvantifikácia nukleových kyselín; značenie nukleových kyselín; pre-targeting a sorting nukleových kyselín) tvorí integrálny a neoddeliteľný celok, ktorým je jednoznačne definovaný predmet vynálezu. Predmet vynálezu teda zahrnuje špecifické a selektívne cielenie ľubovoľnej konkrétnej nukleovej kyseliny prostredníctvom simultánneho rozpoznania jej dvoch (prípadne viacerých) vyšpecifikovaných sekvenčných úsekov, ktoré navyše musia byť od seba vzdialené vo vopred zvolenej definovanej vzdialenosti.
Z pohľadu inovatívnosti predmetný vynález prináša revolučný nástroj zvyšujúci selektivitu a špecifickú rozpoznania cieľových nukleových kyselín, umožňujúci Ich selektívnu intervenciu, manipuláciu, detekciu, kvantifikáciu, značenie, pre-targetovanie a sortovanie.
Selektívne rozpoznanie konkrétnej nukleovej kyseliny (preferenčne mRNA) opísaným spôsobom je možné následne využiť na selektívnu terapeutickú intervenciu do jej pôvodnej biologickej funkcie, kedy sa zmenou jej funkčného stavu zabráni prenosu ňou kódovanej genetickej informácie. Týmto spôsobom sa vyradí mechanizmus prenosu genetickej informácie z nukleovej kyseliny do proteínu, čo v prípade fúznej mRNA znamená priame potlačenie expresie kauzálnych fúznych onkoproteínov.
Analogicky, selektívne rozpoznanie konkrétnej nukleovej kyseliny (preferenčne mRNA) opísaným spôsobom, kedy dochádza k zmene jej funkčného stavuje možné následne využiť pre rôzne diagnostické či vedecké účely:
na priamu detekciu, vizualizáciu, lokalizáciu a kvantifikáciu rozpoznanej nukleovej kyseliny (preferenčne mRNA), kedy sa do primárnej štruktúry sekvenčne-špecifických olígonukleotidov cieľavedome inkorporuje detekovateľná značka, napr. FITC, RITC, izotop P32. Použitie takto značených sekvenčne-špecifických olígonukleotidov umožňuje kvantifikáciu rozpoznanej mRNA v analytickej vzorke in situ, in vitro, in vivo a ex-vivo, na purifikáciu a sorting rozpoznanej mRNA od ostatných nukleových kyselín prítomných v analytickej vzorke, na funkčnú analýzu konkrétnych génov, kedy sa do primárnej štruktúry sekvenčne-špecifických olígonukleotidov cieľavedome inkorporuje foto-labilná funkčná skupina umožňujúca reverzibilnú zmenu funkčného stavu rozpoznanej mRNA.
Termíny a definície
Antisense systémy. V porovnaní so súčasne používanými antisense systémami na kontrolované umlčanie cieľových mRNA [Guo a kol., 2013; Bumett, Rossi, 2012; Vaishnaw a kol., 2010; Missalidis, 2008; Wang a kol., 2003; Clark, 2000], predkladaný vynález eliminuje ich najzásadnejšiu limitáciu, ktorou je nedostatočná špecifická a selektivita rozpoznania primárneho cieľa (t. j. promiskuita antisense oligonukleotidov). Promiskuita štandardných antisense systémov, ktorá je úzko prepojená s dĺžkou antisense oligonukleotidu je efektívne vyriešená simultánnou interferenciou dvoch (alebo viacerých) antisense oligonukleotidov, komplementárne rozpoznávajúcich cieľové sekvencie v presne definovanej vzdialenosti od seba. V oblasti protinádorových terapií a špeciálne pre kontrolovanú inhibíciu kauzálnych fúznych génov predmetný vynález predstavuje svojim dizajnom a mechanizmom rozpoznania cieľovej mRNA pilotný (dodnes neaplikovaný) antisense systém.
Konštrukt. Opísaný konštrukt sa skladá z dvoch (prípadne viacerých) sekvenčne-špecifických oligonukleotidov vzájomne prepojených veľkostne-špecifickým polymérnym linkerom.
Sekvenčne-špecifické oligonukleotidy. Oligonukleotidy predstavujú sekvencie komplementárne voči cieľovej nukleovej kyseline (preferenčne mRNA), prípadne voči derivátom nukleových kyselín. Cieľové nukleové kyseliny sú preferenčne ľudského pôvodu.
Oligonukleotidy môžu byť tvorené ľubovoľnými nukleotidmi, prípadne ich chemickými derivátmi/analógmi napr. DNA, RNA, 2’-O-(2-methoxyethyl)-RNA, 2’O-methyl-RNA, 2’0-fluoroRNA, LNA, PNA, morpholino, INA, FANA, ANA, UNA, HNA, atd’., a v rámci predkladaného vynálezu môžu byť vzájomne nakombinované či už ako celé oligonukleotidové bloky s danou chemickou modifikáciou alebo ako jednotlivé oligonukleotidy pozostávajúce z rôzne modifikovaných nukleotidov. Chemické modifikácie sa môžu týkať rovnako nukleobáz ako cukorfosfátovej väzby.
• «
Príklady RNA derivátov
A: modifikácie cukru; B: modifikácie fosfátovej väzby; C: modifikácie cukru aj fosfátovej väzby.
V predmetnom vynáleze prvý oligonukleotid, druhý oligonukleotid, prípadne ďalší oligonukleotid predstavujú súvislú sekvenciu minimálne 3 nukleotidov, ktorá je schopná tvoriť väzbový pár s komplementárnou sekvenciou cieľovej nukleovej kyseliny (preferenčne mRNA), kde jednotlivé nukleotidy môžu byť A, I, U, T, C, G, prípadne ich deriváty jednotlivé oligonukleotidy môžu byť tvorené ľubovoľnou vzájomnou kombináciou jednotlivých nukleotidov, prípadne ich derivátov.
Ďalšie preferované sekvencie oligonukleotidov sú aspoň 4, aspoň 5, aspoň 6, aspoň 7, aspoň 8, aspoň 9, aspoň 10, aspoň 11, aspoň 12, aspoň 13, aspoň 14, aspoň 15, aspoň 16, aspoň 17, aspoň 18, aspoň 19, aspoň 20, aspoň 21, aspoň 22, aspoň 23, aspoň 24, aspoň 25, aspoň 26, aspoň 27, aspoň 28, aspoň 29, aspoň 30, nie viac ako 30, nie viac ako 29, nie viac ako 28, nie viac ako 27, nie viac ako
26, nie viac ako 25, nie viac ako 24, nie viac ako 23, nie viac ako 22, nie viac ako 21, nie viac ako
20, nie viac ako 19, nie viac ako 18, nie viac ako 17, nie viac ako 16, nie viac ako 15, nie viac ako
14, nie viac ako 13, nie viac ako 12, nie viac ako 11, nie viac ako 10, nie viac ako 9, nie viac ako 8, nie viac ako 7, nie viac ako 6, nie viac ako 5, nie viac ako 4, nie viac ako 3 nukleotidy dlhé.
Preferovaná dĺžka jednotlivých oligonukleotidov je v rozpätí medzi 10 a 25 nukleotidov.
Všetky oligonukleotidy v rámci jedného konštruktu komplementárne rozpoznávajú rozdielne sekvencie ľubovoľnej, avšak jedinej danej cieľovej nukleovej kyseliny (preferenčne mRNA).
Dĺžka oligonukleotidov v rámci predmetného konštruktu môže varírovať s ohľadom na konkrétnu aplikáciu. Predĺžením dĺžky jednotlivých oligonukleotidov možno dosiahnuť silnejšiu interakciu s cieľovou nukleovou kyselinou. Na druhej strane, predĺženie oligonukleotidov môže nepriaznivo ovplyvniť ich biologickú dostupnosť a prestup do buniek. Nakoľko však predmetný vynález využíva dva (prípadne viac) oligonukleotidov v kombinácii (kooperatívna väzba na cieľovú nukleovú kyselinu), je možné použiť aj kratšie oligonukleotidy, preferenčne kratšie ako 17 nukleotidov.
Veľkostne-špecifický polymérny linker. Sekvenčne-špecifické oligonukleotidy sú vzájomne prepojené veľkostne-špecifickým polymémym linkerom prostredníctvom kovalentnej väzby, pričom sa zachováva 5‘ - 3‘ orientácia všetkých prepojených oligonukleotidov. Polymérny linker sa viaže na 5‘ koniec jedného oligonukleotidu a na 3‘ koniec druhého oligonukleotidu, ktoré tento linker spája.
Polymérny linker môže pozostávať z ľubovoľnej sekvencie a počtu nukleotidov (alebo ich derivátov/analógov), preferenčne však medzi 3 až 50 nukleotidov (v ich ľubovoľnej vzájomnej kombinácii). Takisto môže polymérny linker pozostávať z cukor-fosfátovej alebo ľubovoľne chemicky modifikovanej kostry bez nukleobáz.
Polymérny linker sa môže kovalentne naviazať na nukleobázu, prípadne na cukor-fosfátovú kostru oligonukleotidov.
Polymérny linker môže byť ďalej polypeptid, polysacharid, nasýtený alebo nenasýtený uhľovodík (C2-C40), preferenčne však vodorozpustný prírodný alebo syntetický polymér.
Polymérny linker je preferenčne tvorený ne-nukleotidovým polymérom ako poly(met)akrylát alebo modifikovaný poly(met)akrylát (preferenčne poly(etylénoxy) a 2-(A,/V-dimetylamino)etyl (met)akrylát), polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, polyetylénglykol, polyakrylamid, polyoxazolín, polyetyléminín, polyalkylénoxid, polymér na báze laktónu, kyselina polyakrylová, kyselina polymliečna, kyselina polyglykoiová, polypropylén, polystyrén, polyolefín, polyamid, polykyanoakrylát, polyimid, polyetyléntereftalát, polytetrametylénglykol, polyuretán, a ich vzájomnou kombináciou, prípadne kombináciou s inými prírodnými či syntetickými polymérmi [Kadajji a Betageri, 2011].
Dĺžka polymérneho linkera môže byť uspôsobená potrebám finálnej aplikácie konštruktu. Dĺžka polymérneho linkera je však prednostne prispôsobená vzdialenosti medzi cieľovými sekvenciami cielenej nukleovej kyseliny, preferenčne mRNA. V prípade, že komplementárne sekvencie sa nachádzajú od seba vo vzdialenosti do 20 nukleotidov, výsledná dĺžka veľkostnešpecifického polymérneho linkera môže byť v rozpätí 10 - 100 Angstrômov, s ohľadom na vzdialenosť medzi jednotlivými nukleotidmi lineárnej, plne natiahnutej nukleovej kyseliny. Veľkosť polymérneho linkera však nie je obmedzená a môže byť ľubovoľne adjustovateľná pre potreby finálnej aplikácie. Vo všeobecnosti je preferovaná dĺžka polymérneho linkera nie väčšia ako 1000 Angstrômov, nie väčšia ako 900, 800,700,600, 500,400, 300,200, alebo 100 Angstrômov. Je takisto • · « preferované, aby dĺžka polymémeho linkera bola aspoň 5 Angstrômov, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, alebo 45 Angstrômov.
Preferovaná dĺžka veľkostne-špecifického polymémeho linkera je medzi 5 a 1000 Angstrômov, medzi 10 a 800 Angstrômov, medzi 20 a 500 Angstrômov, medzi 20 a 200 Angstrômov, medzi 10 a 1000 Angstrômov a medzi 20 a 80 Angstrômov.
Syntéza
Sekvenčne-špecifické oligonukleotidy. Chemická syntéza sekvenčne-špecifických oligonukleotidov prebieha na pevnej fáze za použitia fosforoamiditovej metódy oligomerizáciou základných stavebných monomérov odvodených od ochránených 2-deoxynukleozidov (dA, dC, dG, dT), ribonukleozidov (A, C, G, U), prípadne iných už uvedených chemicky modifikovaných nukleozidov, pričom ich konkrétny výber a poradie závisí od finálnej aplikácie. Syntetický cyklus zahŕňa postupné pripájanie jednotlivých nukleozidov k rastúcemu reťazcu v poradí zodpovedajúcemu komplementárnej sekvencii k cieľovej nukleovej kyseline (preferenčne mRNA). Po ukončení syntetického cyklu sa sekvenčne-špecifický oligonukleotid uvoľní z pevnej fázy do roztoku a pripraví sa na konjugáciu s veľkostne-špecifickým linkerom.
Syntéza RNA, DNA oligonukleotidov.
Syntetický cyklus. Syntéza veľkostne-špecífických oligonukleotidov sa vykonáva postupným pridávaním nukleozidových zvyškov na 5'-konci rastúceho reťazca, pokiaľ sa nedosiahne požadovaná sekvencia [Greco a Tor, 2007].
• · 9 9 9
9 999 999 99
Reakcia 1: De-tritylácia (odstránenie ochrannej skupiny)
Ochranná skupina dimethoxytrityl (DMT) sa odstráni roztokom kyseliny, napr. 2% roztokom kyseliny trichlóroctovej alebo 3% roztokom kyseliny dichlóroctovej, v inertnom rozpúšťadle (dichlórmetán alebo toluén).
Reakcia 2 a 3: Aktivácia a Coupling (spájanie nukleozidov)
0,02-0,2M roztok fosforoamiditu nukleozidu v acetonitrile sa aktivuje 0,2-0,7M roztokom kyslého azolu, 177-tetrazolu, 2-etyltiotetrazolu, 2-benzyltiotetrazolu, 4,5-dikyanoimidazolu, prípadne podobnými zlúčeninami [Wei, 2013]. Aktivovaný fosforoamidit v 1,5-2,0-násobnom nadbytku vzhľadom na pevnú fázu sa následne privedie ku kontaktu s pevnou fázou (prvý coupling) alebo ku kontaktu s prekurzorom oligonukleotidu (nasledujúci coupling), ktorý už je naviazaný na pevnú fázu, pričom jeho 5'-hydroxy skupina reaguje s aktivovanou fosforamiditovou skupinou prichádzajúceho nukleozidu za vzniku fosfit triesterovej väzby. Po ukončení couplingu sa všetky nenaviazané činidlá a vedľajšie produkty odstránia premytím.
Reakcia 4·. Oxidácia
Novovytvorená tri-koordinovaná fosfit triesterová väzba sa následne oxiduje jódom a vodou v prítomnosti slabých zásad (pyridín, lutidín alebo kolidín) na tetra-koordinovaný fosfát triester. Oxidácia môže prebiehať aj v bezvodých podmienkach použitím tert-Butyl hydroperoxidu [Alul a kol., 1991], prípadne (lS)-(+)-(10-kamforsulfonyl)-oxaziridínu [Manoharan a kol., 2000].
Reakcia 5: Capping
Materiál naviazaný na pevnú fázu je ošetrený zmesou anhydridu kyseliny octovej a 1metylimidazolu.
Po ukončení couplovacej a oxidačnej reakcie totiž malé percento 5’-hydroxy skupín naviazaných na pevnú fázu (0,1 až 1%) zostáva nezreagovaných a vyžadujú si permanentné vysýtenie, napr. acetyláciou, aby sa zabránilo formovaniu oligonukleotidov s internou deléciou báz, tzv. vznik (n-l) shortmerov.
Reakcia 6: Štiepenie
Odštiepenie oligonukleotidu z pevnej fázy a odstránenie ochranných skupín použitím koncentrovaného hydroxidu amónneho.
Syntéza RNA, DNA oligonukleotidov s fosforotioátovou väzbou.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je jeden atóm kyslíka vo fosfodiesterovej väzbe nahradený atómom síry, sa syntetizujú analogicky ako klasické RNA a DNA oligonukleotidy (pre detaily pozri kapitolu Syntetický cyklus). Rozdiel spočíva v zámene oxidačného kroku sulfurizáciou.
Syntéza LNA oligonukleotidov.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je ribóza modifikovaná kovalentným premostením 2’-0 s 4’-C sa syntetizujú podľa prác Obika a kol., 1997 a Koshkin a kol. 1998.
Syntéza PNA oligonukleotidov.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je cukor-fosfátová kostra tvorená opakujúcimi sa N(2-aminoethyl)-glycínovými jednotkami prepojenými peptidickou väzbou sa syntetizujú podľa práce Nielsen a kol., 1991.
Syntéza Morpholino oligonukleotidov.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je nukleobáza naviazaná na morfolínový kruh a prepojená fosforodiamidátovou väzbou sa syntetizuje podľa prác Summerton a Weller, 1991,1993b a 1997.
Syntéza GNA oligonukleotidov.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je cukor-fosfátová kostra tvorená opakujúcimi sa glykolovými jednotkami prepojenými fosfodiesterovou väzbou sa syntetizujú podľa prác Ueda a kol., 1971 a Cook a kol., 1995 a 1999.
Syntéza TNA oligonukleotidov.
Modifikované oligonukleotidy, v ktorých je cukor-fosfátová kostra tvorená namiesto ribózy treózou sa syntetizujú podľa práce Chaput a Szostak, 2003.
Veľkostne-špecifický polymérny linker. Chemická syntéza veľkostne-špecifického linkera prebieha použitím metód polymérnej a organickej chémie, ktoré umožňujú kontrolovať výslednú molekulovú hmotnosť a teda aj výslednú dĺžku polymémeho reťazca, napr. atóm-transfer radikálová polymerizácia [Matyjaszewski a Xia, 2001]. Veľkostne-špecifický polymérny linker je bifunkčný (t.j. funkčne modifikovateľný na oboch jeho koncoch) aby umožňoval následnú konjugáciu oboch sekvenčne-špecifických oligonukleotidov do výsledného, 5’- 3‘ orientovaného konštruktu.
Bifunkčný veľkostne-špecifický polymérny linker je preferenčne tvorený ne-nukleotidovým polymérom ako napr. polyetylén glykol (PEG), avšak výsledný konjugát nie je týmto typom polymémeho linkeru nijako vymedzený (pre detailný opis a možné štrukturálne variácie pozri kapitolu Podrobný opis). PEGylácia nukleotidov a metódy prípravy PEGylovaných nukleotidov boli opísané v prácach Jäschke a kol., 1994 a Fischer a kol., 2008.
V prípade, že veľkostne-špecifický polymérny linker nebude priamo syntetizovaný, je možné použiť komerčne dostupné polyméme linkre ako 17-O-DMT-hexaetylenoxid-l-O-fbsforoamidit, 811
DMT-O-trietylenoxid-l-O-fosforoamidit, 6-DMT-O-hexandiol-l-O-fosforoamidit či DMT-1,3 propándiol-fosforoamidit a iné.
Konštrukt. Syntéza výsledného konštruktu je realizovaná postupnou konjugáciou veľkostnešpecifického polymémeho linkera s prvým sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom a následnou konjugáciou vzniknutého prekurzoru s druhým sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom, napr. využitím „klik“ chémie [Presolski a kol. 2011; Besanceney-Webler a kol., 2011; Bowman a Hoyle, 2010].
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 je schematické znázornenie všeobecného princípu vysoko špecifickej väzby interferujúceho systému s cieľovou sekvenciou nukleovej kyseliny pomocou dvoch sekvenčne špecifických oligonukleotidov vzájomne prepojených veľkostne špecifickými linkerom. Predkladaný princíp je univerzálny a modulovateľný a tak umožňuje cieľavedome prepojiť ľubovoľné množstvo sekvenčne špecifických oligonukleotidov (n > 2) zodpovedajúcim počtom neinterferujúcich veľkostne špecifických linkerov (n > 1).
Na obrázku 2 je schematické znázornenie vysoko špecifickej väzby interferujúceho systému na cieľovú sekvenciu fúznej mRNA pomocou dvoch sekvenčne špecifických oligonukleotidov vzájomne prepojených veľkostne-špecifickým linkerom. Jednotlivé sekvenčne-špecifické oligonukleotidy sa viažu na prislúchajúce sekvencie fúznych partnerov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Riešenie opísané v tomto vynáleze je možné považovať za univerzálne aplikovateľné pre selektívne a špecifické rozpoznanie ľubovoľnej cieľovej nukleovej kyseliny, preferenčne fúznej mRNA. V kontexte antisense systémov, kedy cielená nukleová kyselina je fúzna mRNA (ich prítomnosť jednoznačne charakterizuje a odlišuje nádorovú bunku od zdravej), je možné predkladaným vynálezom selektívne rozpoznať a cieliť exkluzívne nádorové bunky. Inovácia vo forme zvýšenej selektivity a špecificky rozpoznania výlučne cieľovej nukleovej kyseliny, preferenčne fúznej mRNA, umožňuje kontrolovane intervenovať cieľové fúzne gény.
Príklad 1. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej BCR-ABL mRNA u chronickej myeloidnej leukémie, prípadne Ph+ akútnej lymfoblastickej leukémie, či iného nádorového ochorenia kde je prítomná BCR-ABL fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
Predkladaný konštrukt selektívne a špecificky rozpoznáva BCR-ABL mRNA spôsobom, kedy sa jedným sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom zacieli sekvencia BCR a druhým sekvencia ABL, pričom sú oba oligonukleotidy vzájomne prepojené veľkostne-špecifickým polymérnym ··<· · * · ««·«» »· · · · * r • · · · · · « • · · · · » • · · · · ··· ·· ··· ··· linkerom. Je možné aplikovať aj viac ako dva sekvenčne-špecifícké oligonukleotidy, z ktorých každý cieli prislúchajúcu sekvenciu buď BCR alebo ABL, pričom však každý z fúznych partnerov je cielený aspoň jedným oligonukleotidom. Sekvenčne-špecifícké oligonukleotidy sú vzájomne prepojené zodpovedajúcim počtom polymérnych linkerov. Pevná, termodynamicky a energeticky preferovaná komplementárna väzba medzi konštruktom a cieľovou BCR-ABL mRNA vznikne len za predpokladu, že dôjde k plnému rozpoznaniu jednotlivých cieľových sekvencií, ktoré navyše sú od seba vzdialené definovanú vzdialenosť vymedzenú veľkostne-špecifíckým polymérnym linkerom. Tým je minimalizovaná pravdepodobnosť vzniku stabilnej väzby konštruktu so sekvenčne čiastočne homológnymi mRNA, čo zabraňuje stabilnej intervencii s nedelenými mRNA molekulami. S ohľadom na fakt, že fúzna BCR-ABL mRNA je exkluzívne prítomná len v nádorových bunkách, opísaný princíp rozpoznania BCR-ABL mRNA má za následok preferenčnú a stabilnú intervenciu len v nádorových bunkách, čím sa nádorové bunky selektívne rozpoznajú a zacielia.
Sekvencie jednotlivých sekvenčne-špecifických oligonukleotidov konštruktu sú komplementárne k cieľovým sekvenciám jednotlivých fúznych partnerov BCR, ABL. Cieľové sekvencie BCR, ABL môžu byť ľubovoľné s ohľadom na celkovú primárnu sekvenciu fúznej BCRABL mRNA, avšak preferenčne nachádzajúce sa nie viac ako 100 nukleotidov od miesta samotnej fúzie, a to pre všetky možné varianty fúznej BCR-ABL mRNA.
5' acgttcc tgatctcctc tgactatgag cgtgcagagt ggagggagaa catccgggag cagcagaaga agtgtttcag aagcttctcc ctgacatccg tggagctgca gatgctgacc aactcgtgtg tgaaactcca gactgtccac agcattccgc tgaccatcaa taaggaagaa q c c c t t cag c ggccagtagc atct g a c t L t a a g c c t: c .a q q q i c t g a g g a a g a c tíc t c tí t t g g a a c t c c. a a g g a a a a c a t. t c a c g a t g g a a a a a g ľ; g a a a a a g a a c a c a. a a t; aa11, a g a í:
s-j 'í, X£... aj í... í.d í. í »..· l- t.. t.t/ i., ·.. . í. j ’ .3 i., .j '.j tU f. J a. 'U d tU '... L. '..· i., d tU 'U '..· d i- d tU '... i.. tU d ÍU !U ' U G. ’.1 tU tU ÍU ÍU './
Parciálna primárna sekvencia fiiznej BCR-ABL mRNA (GenBank: AJ131467.1); BCR - čierna farba, ABL - šedá farba;
cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
línker (medzera 8 nt)
3' CTGGTAGTTATTCCTTC----------------GTCGC<;GGTCATC(tľAG 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie BCR-ABL mRNA. Komplementárny oligonukleotid k BCR (17 nt) je znázornený čiernou farbou, \nABL (17 nt) šedou farbou.
Analogicky ako Príklad 7 sú v skrátenej forme uvedené Príklady 2-7 & zoznam ďalších fúznych mRNA.
Príklad 2. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej AML1-ETO mRNA u akútnej myeloidnej leukémie M2 či iného nádorového ochorenia kde je prítomná AML1-ETO fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
··· ·«
5' atcaaaa tcacagtgga tgggccccga gaacctcgaa ;;-ί· '-·:'·'··-'* Í... ΑΛ... L. Cj L. -J U :J. U '..U :J íj.kj :3/..31... d rJ G,:... <, ó 3 3 ... i.. 3 d !... G. G··,.. L, g. d d L-d d g 3
C C 3 CCC CCC C C C C C C 3 C L C 3 303300 g C C 3 3333 CC 30 P C C 3 C C C -C C 3 (ľ'C O 3 O 3 3 C·'.! C C -3
Parciálna primárna sekvencia fúznej AMLI-ETO mRNA (GenBank: S78158.1); AMLl - čierna farba, ETO- šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker (medzera 17 nt)
3' TAGTGTCACCTACCCG ---------------- GCäTGAGTCTTCGTGAGG; 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie AMLI-ETO mRNA. Komplementárny oligonukleotid k AMLl (16 nt) je znázornený čiernou farbou, k ETO (18 nt) šedou farbou.
Príklad 3. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej CBFB-MYH11 mRNA u akútnej myeloidnej leukémie M4 či iného nádorového ochorenia kde je prítomná CBFB-MYH11 fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
5' tttgaag atagagacag gtctcatcgg gaggaaatgg ag f 1 ' „ j .
íiaagggarga * ' 1 /a ! í ] ,ccatG;aagc r.ggccaagga cgr,ggcgíaaa c t: cacctt ccc a; G a aa a f , a
Parciálna primárna sekvencia fúznej CBFB-MYHI 1 mRNA (AF249897.1); CBFB - čierna farba, MYHII - šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker (medzera 12 nt)
3' TATCTCTGTCCAGAGTAGCC ---------------- TTACTTCAACTCTCG 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie CBFB-MYHI I mRNA. Komplementárny oligonukleotid k CBFB (20 nt) je znázornený čiernou farbou, k MYHl 1 (15 nt) šedou farbou.
Príklad 4. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej RBM15-MKL1 mRNA u akútnej myeloidnej leukémie či iného nádorového ochorenia kde je prítomná RBM15-MKL1 fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
5' tccctgt ggggggcaac aaagacaagg aaaacaccgg ggtccttcat gccttcccac cttgtgagtt ctcccagcag ttcctggatt cccctgccaa ggcactggcc aaatctgaag aagattacct ggtcatgatc attgtccgtg ctttcjaaaag Cccaqccgíca. 1ttcat: cgagc , J i i j , > > . I ’ , ' ' !
'31 a G a * a a a G * - a G a a G G a ... a ..... c.. j q a a g ·.,3 .rj '-.c·..· c j ca c.,
Parciálna primárna sekvencia fúznej RBMI5-MKLI mRNA (AF364035.1); RBMI5 - čierna farba, MKLI - šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker (medzera 8 nt) linker (medzera 12 nt)
3' CGGTTTAGACTTCT --------- ACCAGTACTAGTAACAG --------- TCAGGTCGGCGTAAAG 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie RBMI5-MKLI mRNA. Komplementárne oligonukleotidy k RBM15 (14 nt, 17 nt) sú znázornené čiernou farbou, k MKLI (17 nt) šedou farbou.
Príklad 5. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej MOZ-CBP mRNA u akútnej myeloidnej leukémie či iného nádorového ochorenia kde je prítomná MOZ-CBP fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
·«*· ··· ··· · • · · · · • v · · ··>
• · · ···· · « • · · · · · · ··» ··· ··· ·· ··· ···
5' aaatgaa cttttcccta gagaatactt ccgtcgtttg tcttcgcagg atgtactcag gtgtcagtcc tcttctaaga ggaagtctaa agatgaagaa gaagatgaag agtcagatga tgctgatgat gggaat a ac ť: g g g a ·η c a caa g t: cc a t: t: ΐ gg acagcect: 11 agr c-^acíctg aaĽgggagcc act.ggagt.ga acceccagu;. agccagcaaa cagagcat.gg l. cici C. ;j.g i., i. í.. g C. t :i ‘-..A... L. í.. t. ;:iC. ;:i c. d. L. '... cid 1 j d d L. d L. I. d G c. d d ... :.j i.. U a z:j
Parciálna primárna sekvencia fúznej MOZ-CBP mRNA (GenBank: AJ251844.1); MOZ - čierna farba, CBP - šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker {medzera 15 nt) linker (medzera 13 nt)
3' TACTTCTCAGTCTACTAC------TGACCCTTGTGTTCAGGTA-------ATCAGTtCG-\í/CTGC 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie MOZ-CBP mRNA. Komplementárne oligonukleotidy k MOZ (18 nt, 19 nt) sú znázornené čiernou farbou, k CBP (15 nt) šedou farbou.
Príklad 6. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej TAF2N-TEC mRNA u myxoidného chondrosarkómu či iného nádorového ochorenia kde je prítomná TAF2N-TEC fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
5' ttatgat cagcagcatg attcctatag tcaaaaccag cagtcctatc attcacaaag ggaaaactac agccaccaca cacaagat at q c c c t g c y t: c c a a g c c a a -a t a t: a g c c c 11: c í..a..a.. t.. ΑΑΑϋΙ G l'G ‘-^g A'... a ... a a g;... g g a cí !...a a·... a. a ‘ g g a q ct ... a. a ..
g-a.
Parciálna primárna sekvencia fúznej TAF2N-TEC mRNA (GenBank: AJ245932.1); TAF2N - čierna farba, TEC - šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker (medzera 9 nt) 3' TCGGTGGTGTGTGTTC------C a linker (medzera 13 nt) iG ’G 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie TAF2N-TEC mRNA. Komplementárny oligonukleotid k TAF2N (16 nt) je znázornený čiernou farbou, k TEC (17 nt, 16 nt) šedou farbou.
Príklad 7. Selektívne a špecifické rozpoznanie fúznej BRD4-NUT mRNA u mediastinálneho karcinómu či iného nádorového ochorenia kde je prítomná BRD4-NUT fúzna mRNA aplikovaním predmetného vynálezu.
5’ gagcgct gatgtgattg agtgagtcca atgtcacctc ctgtttgcgg aagaaaagga ccggctcctc caagatgaag ggcttctcgt g c t c c t ctga cagcgaagac tccgaaa ca g aacctcaagc tgagaaagtt cctcagagtc ggagagctcc
Parciálna primárna sekvencia fúznej BRD4-NUT mRNA (GenBank: AY166680.1); BRD4 - čierna farba, NUT- šedá farba; cieľové sekvencie sú podtrhnuté.
linker (medzera 7 nt) linker (medzera 7 nt) linker (medzera 8 nt)
3' TCTCGAGGTCACTCAGGT ---- ACTGTCGCTTCTGAGGCT ---- ---: 5'
Príklad konštruktu navrhnutého na selektívne a špecifické rozpoznanie BRD4-NUT mRNA. Komplementárne oligonukleotidy k BRD4 (18 nt, 18 nt) sú znázornené čiernou farbou, k NUT (18 nt, 18 nt) šedou farbou.
·«·* ·««·
Analogickým postupom je možné selektívne a špecificky rozpoznať nasledujúce fúzne mRNA:
fúzna PML-RARA mRNA fúzna TEL-AML1 mRNA fúzna TCR-RBTN2 mRNA fúzna TMPRSS2-ETS mRNA fúzna NPM-ALK mRNA fúzna PLZF-RARA mRNA fúzna MLL-AF9 mRNA fúzna DEK-CAN mRNA fúzna FUS-ERG mRNA fúzna AML1-MTG mRNA fúzna AML1-EAP mRNA fúzna NUP98-PMX1 mRNA fúzna MLL-AFP1 mRNA fúzna EA2-HLF mRNA fúzna MOZ-P300 mRNA fúzna TEL-PDGFRB mRNA fúzna MLL-AFX1 mRNA fúzna E2A-PBX1 mRNA fúzna MLL-AF6 mRNA fúzna NUP98-HOXA9 mRNA fúzna MLL-AF4 mRNA fúzna NUP98-RAP1GDS1 mRNA fúzna FUS-CHOP mRNA fúzna SľT-S&VmRNA fúzna TCF12-TEC mRNA fúzna ASPL-TFE3 mRNA fúzna TPM4-ALK mRNA fúzna BCM-IL2 mRNA fúzna CEV14-PDGFRB mRNA fúzna RBM15-MKL mRNA fúzna ETV6-NTRK3 mRNA fúzna TFE3-PRCC mRNA fúzna TFE3-ASPSCR1 mRNA fúzna PAX8-PPARG mRNA fúzna TET1-TP53 mRNA fúzna TFEB-ALPHA mRNA fúzna TFE3-PSF mRNA fúzna CHOP-EWS mRNA fúzna PAX3-FKHR mRNA fúzna JAZF1-JJAZ1 mRNA fúzna FUS-CREB312 mRNA fúzna ZPW-ÁZKmRNA fúzna CLTC-ALK mRNA fúzna RPNl-EVll mRNA fúzna EWS-FLI1 mRNA fúzna AML1-EVL-1 mRNA fúzna ETV6-MN1 mRNA fúzna MLL-ENL mRNA fúzna CALM-AF10 mRNA fúzna PAX7-FKHR mRNA fúzna EWS-CHN mRNA fúzna EWS-WT1 mRNA fúzna COL1A1-PDGFB mRNA
Ďalšie možnosti aplikácie predmetného vynálezu sú demonštrované na Príkladoch 8-11.
Príklad 8. Selektívna a špecifická terapeutická intervencia do pôvodnej biologickej funkcie ľubovoľnej mRNA, kedy sa po aplikovaní predmetného vynálezu a zmene funkčného stavu rozpoznanej mRNA zabráni prenosu ňou kódovanej genetickej informácie. Týmto spôsobom sa vyradí mechanizmus prekladu genetickej informácie z mRNA do proteínu, čo v prípade fúznej mRNA, napr. Príklad 1-7, znamená priame potlačenie expresie kauzálnych fúznych onkoproteínov.
Príklad 9. Selektívna a špecifická detekcia ľubovoľných mRNA a ich následná kvantifikácia spôsobom, kedy sa do sekvenčne-špecifických oligonukleotidov cieľavedome inkorporuje detegovateľná značka, napr. FITC, RITC, izotop P32, ktorá po aplikovaní predmetného vynálezu a zmene funkčného stavu rozpoznanej mRNA emituje detegovateľný signál prislúchajúci stabilnému heteroduplexu.
Príklad 10. Purifikácia a sorting selektívne a špecificky rozpoznanej mRNA od ostatných nukleových kyselín prítomných v analytickej vzorke spôsobom, kedy po aplikovaní predmetného vynálezu dochádza k zmene funkčného stavu rozpoznanej mRNA, t.j. vznikne stabilný heteroduplex odlišnej
·« · · • · • ·· elektroforetickej mobility. V dôsledku toho je možné aplikovaním externého elektrického poľa odseparovať rozpoznané mRNA od ostatných nukleových kyselín. Analogicky, cieľavedomou modifikáciou sekvenčne-špecifických oligonukleotidov primárnymi protilátkami je možné po aplikovaní predmetného vynálezu sortovať rozpoznané mRNA na základe jeho interakcie so sekundárymi protilátkami.
Príklad 11. Funkčná analýza jednotlivých génov spôsobom, kedy sa do primárnej štruktúry sekvenčne-špecifických oligonukleotidov cieľavedome inkorporuje foto-labilná funkčná skupina umožňujúca reverzibilnú zmenu funkčného stavu rozpoznanej mRNA. Po aplikovaní predmetného vynálezu a zmene funkčného stavu rozpoznanej mRNA je možné tento jav zvrátiť aplikovaním žiarenia požadovanej vlnovej dĺžky. Takýmto spôsobom je možné selektívne a špecificky študovať dôsledky potlačenia expresie konkrétnych génov in situ a in vivo.

Claims (12)

1. Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie a následne jej selektívnu intervenciu, manipuláciu, detekciu, kvantifikáciu, značenie, pre-targetovanie a sortovanie, vyznačujúci sa tým, že sa táto mRNA podrobí zacieleniu konštruktom tvoreným aspoň dvomi sekvenčne-špecifickými oligonukleotidmi vzájomne prepojenými veľkostne-špecifickým polymémym linkerom vymedzujúcim ich vzájomnú vzdialenosť, pričom každým sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom sa zacieli vopred definovaná cieľová sekvencia úseku mRNA za vzniku stabilného heteroduplexu a na základe tejto úpravy je táto mRNA selektívne a špecificky rozpoznaná.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ľubovoľnou mRNA je fúzna mRNA.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že každý z fúznych partnerov cielenej fúznej mRNA sa podrobí zacieleniu aspoňjedným sekvenčne-špecifickým oligonukleotidom.
4. Spôsob podľa nároku 2, v y z n a č uj ú c i sa t ý m, že cieľové sekvencie sa nachádzajú menej ako 100 nukleotidov od miesta samotnej fúzie.
5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sekvencie jednotlivých sekvenčnešpecifických oligonukleotidov konštruktu sú zacielené na základe komplementarity k jednotlivým vopred definovaným úsekom mRNA.
6. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že mRNA sa podrobí zacieleniu konštruktom tvorený najmenej 3 oligonukleotidmi, z ktorých každý oligonukleotid zacieli vopred definovanú cieľovú sekvenciu jednotlivých úsekov mRNA, pričom oligonukleotidy sú vzájomne prepojené zodpovedajúcim počtom veľkostne-špecifických polymérnych línkerov.
7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že dĺžka veľkostne špecifického polymérneho linkera je v rozpätí 5 - 1000 Angstrômov.
8. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že veľkostne špecifický polymérny linker sa viaže na 5‘ koniec jedného oligonukleotidu a na 3‘ koniec druhého oligonukleotidu.
9. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že veľkostne špecifický polymérny linker pozostáva z
9 ···· <4 *· ·· · «· « · • ··· · · ·
9 999
9 9 9
999 ··
a) ľubovoľnej sekvencie a počtu nukleotidov alebo ich derivátov/analógov, preferenčne však medzi 1 až 50 nukleotidov v ich ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, pričom polymémy linker môže pozostávať z cukor-fosfátovej alebo ľubovoľne chemicky modifikovanej kostry bez nukleobáz
b) polypeptidu ľubovoľnej sekvencie
c) polysacharidu
d) nasýteného alebo nenasýteného uhľovodíku (C2-C40)
e) ne-nukleotidového polyméru ako poly(met)akrylát alebo modifikovaný poly(met)akrylát (preferenčne poly(etylénoxy) a 2-(A,A-dimetylamino)etyl (met)akrylát), polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, polyetylénglykol, polyakrylamid, polyoxazolín, polyetyléminín, polyalkylénoxid, polymér na báze laktónu, kyselina polyakrylová, kyselina polymliečna, kyselina polyglykolová, polypropylén, polystyrén, polyolefín, polyamid, polykyanoakrylát, polyimid, polyetyléntereftalát, polytetrametylénglykol, polyuretán, polyméru vzniknutého ich vzájomnou kombináciou, prípadne kombináciou s inými prírodnými či syntetickými polymérmi.
10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvenčne-špecifické oligonukleotidy sú aspoň 3 nukleotidy dlhé, pričom sú tvorené ľubovoľnými nukleotidmi, prípadne ich chemickými derivátmi/analógmi a môžu byť vzájomne nakombinované či už ako celé oligonukleotidové bloky s danou chemickou modifikáciou alebo ako jednotlivé oligonukleotidy pozostávajúce z rôzne modifikovaných nukleotidov.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sekvenčne-špecifické oligonukleotidy sú tvorené DNA, RNA, 2’-O-(2-methoxyethyl)-RNA, 2’0-methyl-RNA, 2Όfluoro-RNA, LNA, PNA, morpholino, INA, FANA, ANA, UNA alebo HNA, prípadne ich kombináciou.
12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že dĺžka sekvenčne-špecifických oligonukleotidov je v rozpätí medzi 10 a 25 nukleotidov.
SK50065-2015A 2015-10-15 2015-10-15 Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie SK500652015A3 (sk)

Priority Applications (23)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK50065-2015A SK500652015A3 (sk) 2015-10-15 2015-10-15 Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie
JP2018539222A JP7053473B2 (ja) 2015-10-15 2016-10-12 ｍＲＮＡの機能状態を変化させてその選択的かつ特異的な認識を可能にする方法
NZ742493A NZ742493B2 (en) 2015-10-15 2016-10-12 A method for altering the functional state of mrna allowing its selective and specific recognition
PL16845348.8T PL3362098T3 (pl) 2015-10-15 2016-10-12 Sposób zmiany stanu funkcjonalnego mrna pozwalający na jego selektywne i swoiste rozpoznawanie
EP16845348.8A EP3362098B1 (en) 2015-10-15 2016-10-12 A method for altering the functional state of mrna allowing its selective and specific recognition
RU2018117650A RU2724485C2 (ru) 2015-10-15 2016-10-12 Способ изменения функционального состояния мРНК, обеспечивающий ее избирательное и специфическое распознавание
PCT/SK2016/060002 WO2017065696A2 (en) 2015-10-15 2016-10-12 A method for altering the functional state of mrna allowing its selective and specific recognition
SM20220319T SMT202200319T1 (it) 2015-10-15 2016-10-12 Un metodo per alterare lo stato funzionale di mrna consentendone il riconoscimento selettivo e specifico
KR1020187010701A KR102307184B1 (ko) 2015-10-15 2016-10-12 선택적 특정 인식을 허용하는 mRNA의 관능상태 전환방법
ES16845348T ES2920887T3 (es) 2015-10-15 2016-10-12 Un método para alterar el estado funcional del ARNm que permite su reconocimiento selectivo y específico
SI201631562T SI3362098T1 (sl) 2015-10-15 2016-10-12 Postopek za spreminjanje funkcionalnega stanja mRNA, ki omogoča njeno selektivno in specifično prepoznavanje
LTEPPCT/SK2016/060002T LT3362098T (lt) 2015-10-15 2016-10-12 Mrnr funkcinės būsenos keitimo būdas, įgalinantis jos selektyvų ir specifinį atpažinimą
DK16845348.8T DK3362098T3 (da) 2015-10-15 2016-10-12 Fremgangsmåde til ændring af den funktionelle tilstand af mrna, der muliggør selektiv og specifik genkendelse deraf
US15/768,586 US11371038B2 (en) 2015-10-15 2016-10-12 Method for altering the functional state of mRNA allowing its selective and specific recognition
CA3001994A CA3001994A1 (en) 2015-10-15 2016-10-12 A method for altering the functional state of mrna allowing its selective and specific recognition
PT168453488T PT3362098T (pt) 2015-10-15 2016-10-12 Método para alteração do estado funcional de arnm permitindo o seu reconhecimento seletivo e específico
AU2016336851A AU2016336851B2 (en) 2015-10-15 2016-10-12 A method for altering the functional state of mRNA allowing its selective and specific recognition
HRP20220968TT HRP20220968T1 (hr) 2015-10-15 2016-10-12 Postupak za promjenu funkcionalnog stanja mrnk koji omogućuje njeno selektivno i specifično prepoznavanje
HUE16845348A HUE058829T2 (hu) 2015-10-15 2016-10-12 Az MRNS funkcionális állapotának módosítására szolgáló módszer, amely lehetõvé teszi a szelektív és a specifikus felismerést
RS20220639A RS63354B1 (sr) 2015-10-15 2016-10-12 Postupak za modifikaciju irnk koji omogućava njeno selektivno i specifično prepoznavanje
JP2022059685A JP7657756B2 (ja) 2015-10-15 2022-03-31 ｍＲＮＡの機能状態を変化させてその選択的かつ特異的な認識を可能にする方法
CY20221100395T CY1125386T1 (el) 2015-10-15 2022-06-07 Μεθοδος για μεταβολη λειτουργικης καταστασης toy mrna που επιτρεπει εκλεκτικη και ειδικη αναγνωριση αυτου
JP2024209657A JP2025027114A (ja) 2015-10-15 2024-12-02 ｍＲＮＡの機能状態を変化させてその選択的かつ特異的な認識を可能にする方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK50065-2015A SK500652015A3 (sk) 2015-10-15 2015-10-15 Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK500652015A3 true SK500652015A3 (sk) 2017-05-03

Family

ID=58267152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK50065-2015A SK500652015A3 (sk) 2015-10-15 2015-10-15 Spôsob úpravy funkčného stavu ľubovoľnej mRNA umožňujúci jej selektívne a špecifické rozpoznanie

Country Status (20)

Country Link
US (1) US11371038B2 (sk)
EP (1) EP3362098B1 (sk)
JP (3) JP7053473B2 (sk)
KR (1) KR102307184B1 (sk)
AU (1) AU2016336851B2 (sk)
CA (1) CA3001994A1 (sk)
CY (1) CY1125386T1 (sk)
DK (1) DK3362098T3 (sk)
ES (1) ES2920887T3 (sk)
HR (1) HRP20220968T1 (sk)
HU (1) HUE058829T2 (sk)
LT (1) LT3362098T (sk)
PL (1) PL3362098T3 (sk)
PT (1) PT3362098T (sk)
RS (1) RS63354B1 (sk)
RU (1) RU2724485C2 (sk)
SI (1) SI3362098T1 (sk)
SK (1) SK500652015A3 (sk)
SM (1) SMT202200319T1 (sk)
WO (1) WO2017065696A2 (sk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11419947B2 (en) 2017-10-30 2022-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
US12018315B2 (en) * 2019-05-30 2024-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Peptide nucleic acid functionalized hydrogel microneedles for sampling and detection of interstitial fluid nucleic acids
EP3981436A4 (en) * 2019-06-05 2024-06-19 Fukuoka University Stable target-editing guide rna having chemically modified nucleic acid introduced thereinto

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
WO1992022303A1 (en) * 1991-06-18 1992-12-23 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides
JPH06501610A (ja) * 1991-08-01 1994-02-24 シティ・オブ・ホープ Ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子発現のリボザイム阻害
EP0674707A4 (en) * 1992-12-04 1998-01-14 Apollon Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF LEUCOMA.
US5556752A (en) * 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5747248A (en) * 1994-12-05 1998-05-05 Chiron Corporation Discontinuous probe design using hybritope mapping
US6458940B2 (en) * 1995-06-06 2002-10-01 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
EP0991777A1 (en) * 1997-06-18 2000-04-12 Ulrich J. Krull Nucleic acid biosensor diagnostics
FR2781802B1 (fr) * 1998-07-31 2001-05-11 Bio Merieux Derives satures ou insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif
AU4948801A (en) * 2000-03-27 2001-10-08 Univ Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
JP3728463B2 (ja) 2001-10-11 2005-12-21 学校法人慶應義塾 新規マキシザイム
DE10202419A1 (de) * 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US7851453B2 (en) 2003-01-16 2010-12-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
KR20060015505A (ko) * 2003-04-13 2006-02-17 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 올리고뉴클레오타이드 전구약물
US20050256072A1 (en) 2004-02-09 2005-11-17 University Of Massachusetts Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression
WO2005111238A2 (en) 2004-04-19 2005-11-24 Archemix Corporation Aptamer-mediated intracellular delivery of therapeutic oligonucleotides
MX2010001785A (es) 2007-08-15 2010-03-10 Idera Pharmaceuticals Inc Moduladores de receptores tipo larga distancia.
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
EP2550360B1 (en) 2010-03-24 2017-08-30 Mirrx Therapeutics A/s Bivalent antisense oligonucleotides
KR101590586B1 (ko) * 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
WO2013006195A1 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting gene fusions
US10605810B2 (en) * 2013-12-30 2020-03-31 University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University Pincers comprising antibody and aptamer conjugated via a linker which binds to the same target material and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
SI3362098T1 (sl) 2022-08-31
KR20180084748A (ko) 2018-07-25
JP7657756B2 (ja) 2025-04-07
WO2017065696A3 (en) 2017-07-06
EP3362098A2 (en) 2018-08-22
JP2022097486A (ja) 2022-06-30
WO2017065696A2 (en) 2017-04-20
AU2016336851B2 (en) 2020-06-18
KR102307184B1 (ko) 2021-10-01
SMT202200319T1 (it) 2022-09-14
NZ742493A (en) 2021-09-24
EP3362098B1 (en) 2022-05-04
PT3362098T (pt) 2022-06-06
CA3001994A1 (en) 2017-04-20
JP7053473B2 (ja) 2022-04-12
CY1125386T1 (el) 2024-09-20
AU2016336851A1 (en) 2018-06-07
LT3362098T (lt) 2022-06-27
RU2018117650A (ru) 2019-11-15
PL3362098T3 (pl) 2022-07-18
RU2018117650A3 (sk) 2019-11-15
HUE058829T2 (hu) 2022-09-28
HRP20220968T1 (hr) 2022-10-28
RU2724485C2 (ru) 2020-06-23
US20180291366A1 (en) 2018-10-11
DK3362098T3 (da) 2022-07-18
JP2025027114A (ja) 2025-02-26
JP2018534945A (ja) 2018-11-29
RS63354B1 (sr) 2022-07-29
ES2920887T3 (es) 2022-08-11
US11371038B2 (en) 2022-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Anderson et al. Towards next generation antisense oligonucleotides: mesylphosphoramidate modification improves therapeutic index and duration of effect of gapmer antisense oligonucleotides
JP7657756B2 (ja) ｍＲＮＡの機能状態を変化させてその選択的かつ特異的な認識を可能にする方法
US20120190732A1 (en) Multifunctional Aptamer-Nucleic Acid Nanostructures for Tumor-Targeted Killing
WO2011129494A1 (en) Nucleolin specific aptamer and use thereof
Kundu et al. Synthesis of phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides using trityl and fmoc chemistry in an automated oligo synthesizer
KR20240031947A (ko) Fn3 도메인-시르나 접합체 및 이의 용도
IL316071A (en) Fn3 domain-sirna conjugates with enzyme replacement therapy
ES3030929T3 (en) Arnatar compounds and methods for enhanced cellular uptake
Ghosh et al. A unified phosphoramidite platform for the synthesis of morpholino oligonucleotides and diverse chimeric backbones
Seth et al. The medicinal chemistry of RNase H-activating antisense oligonucleotides
Gogoi et al. Synthesis and RNA binding selectivity of oligonucleotides modified with five-atom thioacetamido nucleic acid backbone structures
KR20100120293A (ko) 양이온성 ｓｉＲＮＡ, 합성 및 ＲＮＡ 간섭을 위한 용도
Dysko et al. Covalently attached intercalators restore duplex stability and splice-switching activity to triazole-modified oligonucleotides
Banerjee et al. Glycine-Linked Nucleoside-β-Amino Acids: Polyamide Analogues of Nucleic Acids
NZ742493B2 (en) A method for altering the functional state of mrna allowing its selective and specific recognition
JP6491233B2 (ja) ハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法、アンチセンス核酸医薬品及びｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤
Valluru The Template-Directed EDC-Mediated Ligation of Oligonucleotides Using a Diamino Nucleoside
Taskova Novel tools for ultra-specific targeting of nucleic acids
JP2023127484A (ja) 塩基部修飾ヌクレオシドを含む新規アンチセンス核酸
Hsieh Synthesis and Biomedical Applications of Gamma Peptide Nucleic Acid
Menzi Properties of polyamine-conjugated oligonucleotides
Nici STUDIES ON OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: FROM DRUG CANDIDATES TO COMPONENTS FOR HIGH-ORDERED SUPRAMOLECULAR STRUCTURES

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A General correction or change

Free format text: PATENT APPLICANT'S REPRESENTATION (UNDER COURT DECISION): USTAV POLIMEROV SAV, SK

FA9A Suspended patent application procedure at request of an applicant