ES2566344T3 - VEGF-A para inducir regeneración del tejido miocárdico - Google Patents

Abstract

Un método ex vivo o in vitro para inducir miocardiogenesis que comprende administrar a los cardiomiocitos un vector plasmídico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el sitio activo de un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A).

Description

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DESCRIPCION

VEGF-A para inducir regeneracion del tejido miocardico Descripcion tecnica de la invencion

Metodo para inducir la formacion neovascular y la regeneracion tisular utilizando el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (VEGF-A en sus siglas inglesas). Mas concretamente, un metodo para induccion localizada de formacion neovascular in vivo y la regeneracion de tejidos en mairnferos que utilizan VEGF-A.

Campo tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de terapia genica para estimular la revascularizacion y la regeneracion del tejido.

Antecedentes de la invencion

La cardiopatfa isquemica es la principal causa de morbilidad y mortalidad. El impacto epidemiologico y socio- economico de la enfermedad coronaria es notable. Esta enfermedad causa millones de muertes en todo el mundo. Vease Murray, et al., Lancet, 349:269-276 (1997). En los pafses desarrollados, se ha estimado que se produjeron 5,3 millones de muertes atribuibles a enfermedades cardiovasculares en 1990, mientras que la cifra correspondiente para los pafses en desarrollo oscilo entre 8 y 9 millones (mostrando un exceso relativo de 70%). Vease Reddy, et al., Circulation, 97: 96-601 (1998). En Argentina, la cardiopatfa isquemica es la primera causa de mortalidad mostrando una incidencia de alrededor de 30%, tendencia que tiende a mantenerse estable desde 1980. Para la poblacion mayor de 65 anos, esta tasa alcanza casi 40%. Vease el Programa Nacional de Estadfsticas de Salud, Serie 5, Numero 38, Ministerio de Salud y Accion Social, Republica Argentina (Diciembre de 1995).

A pesar de los recientes avances en la prevencion y tratamiento de la enfermedad isquemica del corazon, hay muchos pacientes que todavfa son sintomaticos y no pueden beneficiarse de la terapia convencional. La administracion de factores de crecimiento que promueven la formacion y el crecimiento neovascular, tales como factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y VEGF, aparecen como una alternativa novedosa y prometedora para estos pacientes. Este modo de tratamiento se denomina angiogenesis terapeutica. Vease Henry, B. M. J., 318:15361539 (1999).

El VEGF es una protema expresada por las celulas de musculo esqueletico, las celulas de musculo liso, las celulas del cuerpo luteo del ovario, las celulas tumorales, los fibroblastos y los cardiomiocitos. A diferencia de otros mitogenos, el VEGF es un factor de crecimiento secretado. Veanse Thomas, J. Biol. Chem., 271:603-606 (1996); Leung, et al., Science, 246:1306-1309 (1989). El gen VEGF humano se expresa en diferentes isoformas, secundarias al corte y empalme alternativo post-transcripcional. En los tejidos humanos no malignos, se expresan cuatro isoformas de VEGF, con diferente numero de aminoacidos (121, 165, 189, 206) y con un peso molecular que oscila de 34 a 46 kD. Veanse Tischer, et al., J. Biol Chem., 266: 11947-11954 (1991); Ferrara, et al., J. Cell. Biochem., 47: 211-218(1991).

Los receptores espedficos de VEGF son VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (KDR/flk-1) y VEGFR-3 (Flt-4). Veanse De Vries, et al., Science, 254: 989-991(1992); Terman, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1579-1586 (1992); Gallant, et al., Genomics, 13: 475-478 (1992). Debido a la localizacion restringida y confinada aparente de los receptores de VEGF para las celulas endoteliales vasculares, este factor de crecimiento ha sido descrito como el mitogeno mas espedfico para estas celulas. Se ha propuesto que el VEGF no es bioactivo en celulas no endoteliales. Veanse Jakeman, et al., J. Clin. Invest., 89:244-253 (1992); Ferrara, et al., Endocr. Rev., 18:4-25

(1997); Thomas, et al., supra (1996). Sin embargo, estudios recientes han informado de efectos mitogenicos de VEGF en algunos tipos de celulas no endoteliales, tales como las celulas del epitelio pigmentario de la retina, celulas de los conductos pancreaticos y celulas de Schwann. Veanse Guerring et al., J. Cell. Phisiol, 164:385-394 (1995); Oberg-Welsh et al., Mol. Cell. Endocrinol, 126:125-132 (1997); Sundell et al., J. Neurosci., 19:5731-5740 (1999). Por otra parte, los receptores de VEGF se han encontrado en otras celulas, tales como celulas madre hematopoyeticas, celulas endocardicas e incluso cardiomiocitos de rata cultivados, donde se ha demostrado que VEGF activa la cascada de la protema quinasa activada por mitogeno. Veanse Asahara et al., Scieface, 275:964-967 (1997); Partanen et al., Circulation, 100:583-586 (1999); Takahashi et al., Circ. Res., 84:1194-1202 (1999).

La administracion terapeutica de VEGF es un reto importante. VEGF se puede administrar como una protema recombinante (terapia con protema) o mediante transferencia genica de codificacion de VEGF (terapia genica). Veanse Safi, et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 29: 2311-2325 (1997); Simons, et al., Circulation, 102: E73-E86 (2000).

La terapia con protemas tiene desventajas importantes. La vida media extremadamente corta de las protemas angiogenicas (por ejemplo, VEGF) condiciona la terapia para la administracion de dosis altas o repetidas para lograr

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un efecto notable. Veanse Simons, et al., supra (2000); Takeshita, et al, Circulation, 90:11228-234 (1994). Ademas, se sabe que la administracion intravenosa de altas dosis de la protema VEGF induce hipotension grave o refractaria. Veanse Henry, et al., J. Am. Coll. Cardiol., 31:65A (1998); Horowitz, et al., Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol., 17:27932800 (1997); Lopez, et al., Am. J. Phisiol, 273: H1317-1323 (1997). Para evitar estos inconvenientes, se ha propuesto la terapia genica (p. ej., ADN que codifica VEGF). Veanse Mack, et al., J. Thorac. Candiovasc. Surg 115: 168-177 (1998); Tio, et al., Hum. Gene Ther., 10:2953-2960 (1999).

La terapia genica puede ser comparada con un sistema de liberacion lenta de farmaco. El gen que codifica el agente de interes es transportado a las celulas en vehmulos denominados vectores (p. ej., plasmidos, virus, liposomas). Los mecanismos celulares especializados en la smtesis de protemas llevan a cabo la produccion y liberacion localizada del producto final. Vease Crystal, Science, 270:404-410 (1995). Ademas, cabe senalar que en el caso de plasmidos el producto genico se sintetiza durante un penodo de tiempo discreto. Este tiempo es por lo general de aproximadamente dos semanas. De acuerdo con estudios experimentales, la expresion sostenida durante este penodo de tiempo limitado es necesaria y suficiente para activar el proceso angiogenico. Basandose en estas ventajas, varios grupos de investigacion han estudiado los efectos terapeuticos de la terapia genica utilizando factores angiogenicos en modelos experimentales de isquemia del corazon y las extremidades. Estos enfoques han dado resultados prometedores. Veanse Magovem, Ann. Thorac. Surg., 62:425-434 (1996); Mack, et al., supra

(1998) ; Tio, et al., supra (1999); Walder, et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 27: 91-98 (1996); Takeshita, et al., Lab. Invest, 75:487-501 (1996); Mack, et al., Gen. Vasc. Surg., 27:699-709 (1998); Tsurumi, et al., Circulation, 94: 32813290 (1996). La terapia genica ha logrado los efectos esperados sin los inconvenientes asociados con la terapia con protemas. Sin embargo, la terapia genica adenoviral puede inducir reacciones inflamatorias o inmunitarias, especialmente despues de dosis repetidas. Este tipo de terapia se ha relacionado tambien con el smdrome de respuesta inmunitaria sistemica de alto riesgo. Estas circunstancias limitan significativamente el uso clmico de esta terapia. Veanse Gilgenkrantz, et al., Hum. Gene Ther., 6:1265-1274 (1995); Dewey, et al., Nat.Med., 5:1256-1263

(1999) ; Werston, et al., J. Virol., 72:9491-9502 (1998); Hollon, Nat. Med., 6:6 (2000), Chang, et al., Nat. Med., 5:1143-1149 (1999); Byrnes, et al., J. Nerosci., 16: 3045-3055 (1996). De acuerdo con estudios recientes, la terapia genica con plasmidos no tiene estas desventajas y puede ser administrada con seguridad en dosis repetidas. Vease Simons, et al., supra (2000).

La administracion sistemica de VEGF se ha asociado con la angiogenesis no deseada en los tejidos perifericos. Veanse Folkman, Nat. Med., 1:27-31 (1995); Liotta, et al., Cell, 64:327-336 (1991); Lazarous, et al., Circulation, 94:1074-1082 (1996); Ferrara, Breast Cancer Res. Treat., 36:127-137 (1995); Ferrara, Lab. Invest., 72:615-618 (1995); Aiello, et al., N. Eng. J. Med., 331:1480-1485 (1994); Adams, et al., Am. J. Ophthalmol, 118:445-450 (1994); Inoue, et al., Circulation, 98:2108-2116 (1998); Simons, et al., supra (2000). El riesgo de exposicion sistemica esta probablemente mas relacionado con la via de administracion que con la naturaleza de la terapia (gen o protema) utilizada. En comparacion con la liberacion intravascular, (p. ej. intramiocardica) la administracion local reduce el riesgo de exposicion sistemica y angiogenesis periferica no deseada. Vease Simons, et al., supra (2000).

En la actualidad, se ha demostrado que el VEGF induce la angiogenesis in vivo. No se ha informado hasta ahora de que el VEGF induzca la formacion de vasos sangumeos con la capa de musculatura lisa. Vease Mack, et al., supra (1998); Tio, et al., supra (1999). Por otra parte, se ha postulado que el VEGF impide la neoformacion de musculatura lisa vascular. Vease Asahara, et al., Circulation, 91:2793-2801 (1995). La musculatura lisajuega un papel importante en la regulacion de la funcion vascular. Su presencia en la capa media de los vasos sangumeos representa una ventaja adaptativa, ya que esta implicada en la regulacion del tono vasomotor. La musculatura lisa vascular mantiene un tono vascular basal y permite la autorregulacion de las variaciones del flujo y la presion sangumeos. Se ha sugerido que la ausencia de capa de musculatura lisa esta relacionada con el colapso del vaso. Vease "Angiogenesis and Cardiovascular Disease", Ware, Ed. (Oxford University Press Inc., Nueva York, USA., 1999), pags. 258-261.

El infarto de miocardio agudo es la consecuencia de la enfermedad coronaria con el peor pronostico a corto y largo plazo. Veanse Bolognese, et al., Am. Heart J., 138:S79-83 (1999); Mehta, et al., Herz, 25:47-60 (2000); Hesse, et al., Cardiovasc. Clin., 20:283-318 (1989); Jacoby, et al., J. Am. Coll. Cardiol, 20:736-744 (1992); Rosenthal, et al., Am. Heart J., 109:865-876 (1985). Esta afeccion da como resultado frecuentemente una perdida significativa de las celulas del miocardio, reduccion de la masa muscular contractil. Es conocido en la tecnica que los cardiomiocitos de seres humanos y de especies similares a la humana conservan su capacidad para replicar el ADN. Vease Pfizer, et al., Curr. Top. Pathol., 54: 125-168 (1971). Recientemente, se ha informado de que algunos cardiomiocitos humanos pueden entrar en la fase M (mitotica). Sin embargo, este fenomeno se produce en una proporcion muy pequena de la poblacion total de cardiomiocitos y en ciertas condiciones patologicas. Hasta ahora, este fenomeno solo se ha observado en el infarto de miocardio y la insuficiencia cardiaca terminal. Veanse Beltrami et al., N. Eng. J. Med., 344: 1750-1757 (2001); Kajsutra, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8801-8805 (1998). No existe evidencia concluyente en todos estos casos de que los cardiomiocitos se dividan en celulas hijas.

La incapacidad de los cardiomiocitos para replicar adecuadamente se opone a la sustitucion del tejido miocardico despues de una lesion en las especies animales superiores. En este escenario, la funcion del miocardio se ve

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disminuida debido a que el area infartada es reemplazado por tejido fibrotico sin capacidad contractil. Ademas, los cardiomiocitos restantes se convierten en hipertroficos y desarrollan nucleos poliploides. Veanse Herget, et al., Cardiovasc. Res. 36:45-51 (1997); "Textbook of Medical Physiology", 9a Ed., Guyton et al., Eds. (W. B. Saunders Co, USA, 1997).

Se han realizado intentos para restaurar la perdida de celulas del miocardio con otras celulas, tales como celulas satelite autologas y mioblastos alogenicos. Los resultados de estos intentos no son concluyentes. Vease Dorfman, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116:744-751 (1998); Murry, et al., J. Clin. Invest., 98: 2512-2523 (1996);Leor, et al., Circulation, 94 Suppl. II: N-332-N-336 (1996); Ren-Ke, et al., Circ. Res, 78: 283-288 (1996.). Mas recientemente, se ha sugerido que las celulas madre pluripotentes y angioblastos derivadas de medula de hueso pueden restaurar el tejido miocardico infartado e inducir incluso formacion neovascular. Sin embargo, la eficacia de estos metodos en los mairnferos superiores no se ha demostrado todavfa. Vease Orlic, et al., Nature, 410: 701-705 (2001); Kocher, et al., Nat. Med., 7: 430-436 (2001). Un metodo ideal debena inducir la division de las celulas hijas de los cardiomiocitos y la formacion neovascular en el tejido del miocardio de origen. Este procedimiento restaurana la perdida de tejido autologo con el tejido miocardico y aumentana la perfusion miocardica de forma simultanea. Un metodo como este podna reducir las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas con la remodelacion ventricular izquierda, el infarto de miocardio y la enfermedad isquemica del corazon. Vease Bolognese, et al., supra (1999).

Del mismo modo, el fracaso de los cardiomiocitos para replicar correctamente dificulta la hiperplasia (es decir, el aumento de numero de celulas) adaptativa como respuesta a otras condiciones patologicas. En estos casos, la respuesta adaptativa de los cardiomiocitos humanos y porcinos consiste en aumentar el volumen celular y el contenido de ADN nuclear. Por lo tanto, en ciertas patologfas (por ejemplo, enfermedad cardfaca hipertensiva, miocardiopatfa dilatada) los cardiomiocitos tambien son marcadamente hipertroficos y poliploides. Vease Pfizer, Curr. Parte superior. Pathol., 54:125-168 (1971); Adler, et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 18:39-53 (1986). En la mayona de los casos, la adaptacion de las celulas es insuficiente. Ademas, la demanda celular de oxfgeno y nutrientes aumenta a medida que progresa la hipertrofia miocardica. En consecuencia, el aumento de las demandas deteriora la perfusion subendocardica incluso en ausencia de oclusion coronaria. Finalmente, la combinacion de estos factores conduce al detrimento de la funcion miocardica. Vease " Textbook of Medical Physiology", 9a Ed, supra. Un metodo ideal debena inducir la mitosis en las celulas hipertroficas y poliploides. Este metodo debe dar lugar a celulas hijas mas pequenos y mejor perfundidas, reduciendo de ese moco la progresion de la miocardiopatfa a insuficiencia cardfaca.

Diagramas

La Fig. 1 ilustra el mdice de tolerancia al estres para la zona de riesgo. Se comparan los valores medios de pre- y post-tratamiento para el Grupo I-T (VEGF) y el Grupo I-P (placebo). El valor de post-tratamiento del Grupo I-T es superior al valor de pre-tratamiento de un mismo grupo. El valor de post-tratamiento del Grupo I-T es mayor que el valor de post-tratamiento del Grupo I-P. Las comparaciones pareadas intra-grupo muestran: 1) ausencia de diferencias estadfsticamente significativas entre indices de pre- y post-tratamiento para el Grupo I-P y 2) la presencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los indices de pre- y post-tratamiento para el Grupo I-T. Las comparaciones no pareadas entre los grupos muestran: 1) la ausencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los indices de pre-tratamiento para el Grupo IT y el Grupo I-P y 2) la presencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los indices de post- tratamiento para el Grupo I-T y el Grupo I-P.

La Fig. 2 ilustra el mdice de mejora de perfusion para la zona de riesgo. Se comparan los valores medios para el Grupo I-T (VEGF) y el Grupo I-P (placebo). El valor para el Grupo I-T es significativamente mayor que el valor para el Grupo I-P.

La Fig. 3 muestra la densidad lineal para la zona de riesgo. Se ilustran los valores medios para los vasos sangumeos, oscilando la capa de musculatura lisa entre 8 y 50 pm. El valor para el Grupo I-T (VEGF) es significativamente mayor que el valor para el Grupo I-P (placebo).

La Fig. 4 muestra la densidad numerica para la zona de riesgo. Se ilustran los valores medios de los vasos sangumeos, oscilando la capa de musculatura lisa entre 8 y 50 pm. El valor para el Grupo I-T (VEGF) es significativamente mayor que el valor para el Grupo I-P (placebo).

La Fig. 5 muestra la densidad lineal para la zona de riesgo. Se ilustran Los valores medios de los vasos sangumeos oscilando la capa de musculatura lisa entre 8 a 30 pm. El valor para el Grupo I-T (VEGF) es significativamente mayor que el valor para el Grupo I-P (placebo).

La Fig. 6 ilustra el efecto de la isquemia y el tratamiento sobre nucleos de cardiomiocitos positivos para Ki67 y la mitosis. El panel (a) muestra el mdice de nucleos de cardiomiocitos positivos para Ki67. No existen diferencias significativas entre individuos del Grupo I-T (VEGF) y del Grupo I-P (placebo). El panel (b) muestra individuos del Grupo I-T (VEGF) con un mdice mitotico de cardiomiocitos significativamente superior para la zona de riesgo (zona isquemica) y el tejido miocardico (zona no isquemica) circundante en comparacion con los individuos del Grupo I-P. El valor para el Grupo I-T (VEGF) es significativamente mayor que el valor para el Grupo I-P (placebo).

La Fig. 7 representa la curva de transcripcion de ARNm de VEGF de los individuos del Grupo II-T. La curva

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muestra un pico el dfa 10 despues de la inyeccion del plasmido pUVEK15.

La Fig. 8 ilustra la metafase de un cardiomiocito de un individuo del Grupo I-T. Los cromosomas metafasicos y el huso mitotico son claramente visibles.

La Fig. 9 ilustra la telofase de un cardiomiocito de un individuo del Grupo I-T. Son claramente visibles las estriaciones sarcomericas.

La Fig. 10 ilustra el proceso mitotico de dos cardiomiocitos adyacentes. El lfmite entre los cardiomiocitos es distinguible. Se observa claramente la integridad de ambos cardiomiocitos.

La Fig. 11 muestra la citocinesis no convencional de un cardiomiocito de un individuo del Grupo I-T. Se observan placas cromosomicas opuestas en dos cardiomiocitos adyacentes. La flecha indica una posible division en celulas hijas. Barra = 10 pm.

Las Figs. 12 y 13 ilustran los vasos sangumeos con capa de musculatura lisa en el tejido del miocardio de un individuo del Grupo I-T. La musculatura lisa vascular se identifico con tincion inmunohistoqmmica de alfa-actina.

Deposito

El plasmido PUVEK15 se deposito el 13 de Noviembre de 2000, bajo el numero de acceso DSM 13833 en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Republica Federal de Alemania.

Descripcion de la invencion

La presente invencion se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Una ventaja de la presente invencion es la induccion segura y eficiente de la formacion neovascular en los tejidos hipoperfundidos y normoperfundidos. Mediante la utilizacion del metodo reivindicado, es posible estimular la neoformacion, el desarrollo, la proliferacion y crecimiento de los vasos. El metodo reivindicado es eficaz tambien para la neoformacion, el desarrollo, la proliferacion y crecimiento de las celulas musculares lisas y estriadas. El metodo es particularmente util para inducir la revascularizacion en pacientes con enfermedad cardfaca isquemica. La presente invencion tambien se puede utilizar en el tratamiento de pacientes con enfermedad arterial periferica o isquemia grave de las extremidades. La presente invencion se puede utilizar como terapia unica de enfermedades isquemicas o asociada a procedimientos de revascularizacion convencionales. El procedimiento reivindicado se caracteriza por la ausencia de efectos secundarios adversos relacionados con la exposicion sistemica a los factores angiogenicos en dosis altas.

Otra ventaja de la presente invencion es la regeneracion de tejido miocardico (miocardiogenesis). El metodo reivindicado induce la mitosis de cardiomiocitos. De esta manera, el metodo reivindicado reemplaza el tejido infartado por musculo cardfaco autologo. La presente invencion tambien se revierte el desarrollo natural de miocardiopatfas hipertroficas y dilatadas de cualquier etiologfa induciendo el proceso mitotico en cardiomiocitos hipertroficos poliploides y mediante la mejora de la perfusion del tejido (es decir, induciendo la formacion neovascular). Esta circunstancia da como resultado un mayor numero de celulas hijas normales. Estas celulas hijas tienen una mejor perfusion en comparacion con las celulas hipertroficas. Todas estas ventajas indican que la presente invencion mejora los resultados clmicos e histofisiologicos a corto, medio y largo plazo de las enfermedades del corazon.

Otra ventaja potencial de esta invencion es su uso en la medicina de trasplantes. La invencion reivindicada puede ser particularmente util en pacientes trasplantados con rechazo cronico del injerto y enfermedad coronaria difusa. La revascularizacion miocardica inducida por el metodo reivindicado restaurana la perfusion alterada y la funcion en estos pacientes. Estos pacientes a menudo no son elegibles para los metodos convencionales de revascularizacion (CABG, ACTP). La presente invencion representa una estrategia de revascularizacion alternativa eficaz para estos pacientes.

Una ventaja potencial adicional de la presente invencion es su uso para aumentar la perfusion en los tejidos isquemicos de pacientes con micro y macroangiopatfa relacionada con la diabetes. El metodo reivindicado puede revertir o reducir las complicaciones cronicas asociadas con la diabetes tales como la neuropatfa diabetica, la enfermedad de vasa-vasorum, la enfermedad cardiaca isquemica, la enfermedad arterial periferica y la isquemia severa de las extremidades, entre otras. Veanse Schratzberger, et al., J. Clin. Invest., 107:1083-1092 (2001); Rivard, et al., Circulation 96 Suppl. I: 175 (1997); Rivard, et al., Am. J. Pathol 154:355-363 (1999).

Una de las ventajas del metodo reivindicado es su mayor seguridad cuando se utiliza junto con procedimientos mmimamente invasivos de administracion intramiocardica-transendocardica percutanea. Esta administracion se logra mediante el acceso a la camara ventricular izquierda a traves de un enfoque endovascular mediado por cateter. Este tipo de administracion podra estar asistido por un mapeo electromecanico del ventnculo izquierdo. De esta manera la morbilidad y la mortalidad asociadas a la cirugfa a torax abierto se reduce significativamente.

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La presente invention se refiere a un metodo para inducir la formation neovasculary regeneration de los tejidos que se caracteriza por la administration de una secuencia de nucleotidos que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de VEGF-A. En una realization de la presente invencion, se administra una secuencia nucleotfdica que codifica un polipeptido cuya secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO. 1. En otra realizacion de la presente invencion, se administra el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO. 1. La secuencia de nucleotidos utilizada de acuerdo con la presente invencion puede ser ADN genomico, ADNc y ARN mensajero. Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos es ADN genomico. El SEQ ID NO: 1 es

Ala

Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin Asn

His

His

Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val

Tyr

Gin Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu

Thr

Leu Val Asp He Phe Gin Glu Tyr Pro

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Glu lie Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser

Cys

Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly

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Cys

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Thr

Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gin lie

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Lys Pro Arg Arg

De acuerdo con la presente invencion, el agente inductor se administra al tejido compuesto de celulas eucariotas, tal como el tejido compuesto por celulas de mamiferos, a saber, cardiomiocitos. Preferiblemente, las celulas de mamifero son de origen porcino y humano. Mas preferiblemente, las celulas son de origen humano.

De acuerdo con el procedimiento reivindicado, las celulas eucariotas son celulas musculares. Preferiblemente, las celulas musculares utilizadas de acuerdo con la presente invencion son cardiomiocitos, celulas de la musculatura estriada esqueletica de tipo I y tipo II, celulas de la musculatura lisa vascular y celulas de la musculatura lisa no vascular y celulas mioepiteliales. Mas preferiblemente, las celulas musculares utilizadas son cardiomiocitos.

El metodo reivindicado se caracteriza por la induction de la formacion neovascular. Preferiblemente, la formacion neovascular inducida se localiza en el sitio de administracion del agente inductor. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio.

El metodo reivindicado se caracteriza por la induccion de la angiogenesis localizada tanto in vivo como ex vivo. Preferiblemente, la angiogenesis se localiza en el sitio de administracion del agente inductor. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la angiogenesis se induce en el tejido normoperfundido, ya sea in vivo, in vitro o ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la angiogenesis se induce en el tejido isquemico, ya sea in vivo, in vitro o ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce la angiogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido, ya sea in vivo, in vitro y ex vivo. El tejido miocardico hipoperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, infartado, no viable, fibrosado y necrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce angiogenesis in vivo en el tejido miocardico hipoperfundido.

El metodo reivindicado tambien se caracteriza por la induccion de la arteriogenesis in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, la arteriogenesis se localiza en el sitio de administracion. Mas preferiblemente, el sitio de

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administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la arteriogenesis es inducida en el tejido normoperfundido in vivo, in vitro y ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la arteriogenesis es inducida en el tejido isquemico, in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce arteriogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido in vivo, in vitro y ex vivo. El tejido miocardico hipoperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, infartado, no viable, fibrosado y necrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce arteriogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido in vivo.

El metodo reivindicado tambien se caracteriza por la induccion de la vasculogenesis in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, la vasculogenesis esta en el sitio de administracion. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la vasculogenesis es inducida en el tejido normoperfundido in vivo, in vitro y ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la vasculogenesis es inducida en el tejido isquemico, in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce la vasculogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido, in vivo, in vitro y ex vivo. El tejido miocardico hipoperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, no viable, infartado, necrosado y fibrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce vasculogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido in vivo.

El metodo reivindicado tambien se caracteriza por la induccion de linfangiogenesis in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, la linfangiogenesis se localiza en el sitio de administracion. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la linfangiogenesis es inducida en el tejido normoperfundido, in vivo, in vitro y ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la linfangiogenesis es inducida en el tejido isquemico, in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce linfangiogenesis en tejido miocardico hipoperfundido, in vivo, in vitro y ex vivo. El tejido miocardico hipoperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, no viable, infartado, necrosado y fibrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce linfangiogenesis en el tejido miocardico hipoperfundido in vivo.

El metodo reivindicado tambien se caracteriza por la induccion de mitosis in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, la mitosis es inducida localmente en el sitio de administracion. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la mitosis es inducida en el tejido normoperfundido, in vivo, in vitro y ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la mitosis es inducida en el tejido isquemico in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce mitosis en tejido miocardico hipoperfundido, in vivo, in vitro y ex vivo. El tejido miocardico hiperperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, no viable, infartado, necrosado y fibrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce mitosis en tejido miocardico hipoperfundido in vivo.

El metodo reivindicado tambien se caracteriza por la induccion de regeneracion de tejido in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, la regeneracion de tejido es inducida a nivel local en el sitio de administracion. Mas preferiblemente, el sitio de administracion es el miocardio. En una realizacion de la presente invencion, la regeneracion de tejido se induce en territorios normoperfundidos, in vivo, in vitro y ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, la regeneracion de tejidos es inducida en territorios isquemicos, in vivo, in vitro y ex vivo. Preferiblemente, el metodo reivindicado induce la regeneracion de tejidos en territorios de miocardio hipoperfundidos, in vivo, in vitro y ex vivo. El territorio miocardico hipoperfundido puede ser isquemico, viable, hibernado, aturdido, previamente acondicionado, lesionado, no viable, infartado, necrosado y fibrosado. Mas preferiblemente, el metodo reivindicado induce la regeneracion de tejidos en territorios miocardicos hipoperfundidos in vivo.

En una realizacion de la presente invencion, la secuencia de nucleotidos codificante esta conectada operablemente a un vector. En una realizacion del metodo reivindicado, el vector es un vector viral, tal como adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus y lentivirus. En otra realizacion del presente metodo, el vector es un vector plasmfdico. Mas preferiblemente, el vector plasmfdico es pUVEK15. En otra realizacion de la presente invencion, la secuencia de nucleotidos es transportada por un liposoma. En una realizacion de la presente invencion, el agente inductor esta contenido en un compuesto farmaceutico adecuado. El compuesto farmaceutico que contiene el agente inductor se administra al receptor en dosis suficientes.

El compuesto farmaceutico utilizado de acuerdo con la presente invencion se puede administrar por via intravenosa, intracoronaria, intra-aortica, intrafemoral, intrapopliteal, intrapedialis, tibial intra-posterior, intracarotidea e intra-radial. El compuesto farmaceutico puede ser tambien administrado por via, intrapericardica, intra-saco amniotico, intrapleural, intramiocardica-transepicardica, intramiocardica-transendocardica, intra-muscular periferica, subcutanea, intramedular, e intracardiaca (intra-auricular e intraventricular). Ademas, el agente inductor puede ser administrado por via sublingual, por inhalacion, oral, rectal, periadventicia, perivascular, epicardica topica, epidermica topica, transdermica, oftalmica o a traves de las mucosas conjuntiva, nasofaringea, bucofaringea, laringofarmgea, vaginal, colonica, uretral y vesical. Preferiblemente, el agente inductor se administra por medio de inyecciones intramiocardicas-transepicardicas y intramiocardicas-transendocardicas. Mas preferiblemente, el agente

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inductor se administra por medio de inyeccion intramiocardica-transepicardica.

En una realizacion de la presente invencion, el agente inductor se inyecta perpendicular al plano de la zona de inyeccion. En otra realizacion de la presente invencion, el agente inductor se inyecta en paralelo al plano de la zona de inyeccion. En otra realizacion de la presente invencion, el agente inductor se inyecta en un angulo oblicuo en relacion con el plano de la zona de inyeccion. Preferiblemente, el agente inductor se inyecta en un angulo de 45 grados en relacion al plano de la zona de inyeccion. Preferiblemente, las inyecciones se distribuyen homogeneamente en la zona de inyeccion.

Segun se utiliza en la presente memoria, "zona de inyeccion" se define como el territorio de tejido que incluye la zona hipoperfundida, la zona de transicion y la zona normoperfundida que rodea la zona de transicion. La "zona de inyeccion" tambien se puede definir como tejido normal.

Segun se utiliza en la presente memoria, "zona en riesgo", significa la zona del miocardio irrigada por la arteria coronaria circunfleja.

Segun se utiliza en la presente memoria, "arteriogenesis" se define como la formacion, el crecimiento o el desarrollo de los vasos sangumeos con la capa media de la musculatura lisa.

Segun se utiliza en la presente memoria, "inducir", asf como el termino correlacionado "induccion", se refiere a la accion de generar, promover, formar, regular, activar, potenciar o acelerar un fenomeno biologico. Un ejemplo de la induccion es la accion de VEGF como estimulador proliferacion vascular.

En la presente memoria, "agente inductor" se define como ADN genomico, ADNc o ARN mensajero que codifica el sitio activo de VEGF-A. "Agente inductor" tambien incluye cualquier vector que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica el VEGF-A. "Agente inductor" tambien se define como cualquier polipeptido que incluye el sitio activo VEGF-A.

En la presente memoria, "mdice de nucleos de cardiomiocitos positivos para Ki67" se refiere a un parametro disenado para evaluar la densidad de celulas en ciclo (no quiescentes) en una muestra de tejido. Este parametro se refiere al numero de celulas positivas para Ki67 por 106 nucleos de cardiomiocitos en una zona analizada.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mdice de densidad lineal" se refiere a un parametro calculado para evaluar una vascularizacion del tejido. Este parametro fue disenado para cuantificar los vasos dispuestos en cualquier variedad de orientacion. El metodo de calculo de este mdice es conocido en la tecnica. Veanse Anversa et al., Am. J. Physiol., 260: H1552-H1560 (1991); Adair et al., Am. J. Physiol., 266: H1434-H1438 (1994); Anversa et al., Am. J. Physiol., 267: H1062-H1073 (1994).

Segun se utiliza en la presente memoria, "localizada" se define como una respuesta restringida a la zona o tejido de interes.

Segun se utiliza en la presente memoria, "linfangiogenesis" se define como la formacion, crecimiento, desarrollo o proliferacion de vasos linfaticos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mairnfero" se define como un animal vertebrado de sangre caliente cuya progenie se alimenta con leche secretada por sus glandulas mamarias. El termino "mam^fero" incluye, pero no se limita a, ratas, ratones, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, vacas, cerdos, primates y seres humanos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mitosis" se refiere al proceso de division celular completo.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mdice mitotico" se refiere a un parametro disenado para evaluar la densidad de mitosis en una muestra de tejido. Este parametro se refiere al numero de mitosis por 106 nucleos de cardiomiocitos en una zona analizada.

Segun se utiliza en la presente memoria, "formacion neovascular" se define como la creacion, crecimiento, desarrollo o proliferacion de vasos sangumeos. La proliferacion neovascular incluye arteriogenesis, vasculogenesis y linfangiogenesis.

Segun se utiliza en la presente memoria, "comparacion no pareada" se refiere a la comparacion estadfstica entre los dos grupos diferentes de individuos al mismo tiempo.

Segun se utiliza en la presente memoria, "comparacion pareada" se refiere a la comparacion estadfstica de un mismo grupo de individuos en diferentes momentos.

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Segun se utiliza en la presente memoria, "mdice de mejora de la perfusion" se refiere a un parametro disenado para evaluar la mejora general de la perfusion miocardica ventricular izquierda. Este mdice se calcula por medio de la diferencia aritmetica entre el mdice de tolerancia al estres post-tratamiento y el mdice de tolerancia al estres pre- tratamiento.

Segun se utiliza en la presente memoria, "compuesto farmaceutico" se refiere a un disolvente, coadyuvante o excipiente utilizado para administrar un agente inductor. El "compuesto farmaceutico" incluye cualquier disolvente, medio de dispersion, soluciones acuosas, gaseosas, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos, ya sea agentes aceleradores o retardadores de la absorcion, o sustancias similares. El uso de dichas sustancias en la administracion de compuestos activos farmaceuticos se conoce en la tecnica. Tambien se pueden incorporar ingredientes activos complementarios al compuesto farmaceutico utilizado en la presente invencion. "Compuestos farmaceuticos" incluyen, pero no se limitan a, cargas solidas inertes o disolventes, soluciones acuosas esteriles y disolventes organicos no toxicos. El "compuesto farmaceutico" no debena reaccionar con o reducir de cualquier otra manera la eficacia o la estabilidad del agente inductor. Los vefuculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, etanol, polietileneglicol, aceite mineral, vaselina, propilenglicol, lanolina y agentes similares. Los "compuestos farmaceuticos" para inyectables incluyen soluciones esteriles acuosas (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de dispersiones o soluciones inyectables esteriles. En todos los casos, la formulacion debe ser esteril. La formulacion puede ser fluida para facilitar la dispensacion de la jeringa. La formulacion tambien debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y de almacenamiento y debe ser preservada de la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias, virus y hongos.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mdice de tolerancia al estres post-tratamiento" se refiere a un parametro disenado para evaluar la perfusion miocardica ventricular izquierda en condiciones de post-tratamiento. Este mdice se calcula por la diferencia aritmetica entre el valor porcentual de perfusion post-tratamiento durante la sensibilizacion farmacologica (estres) y el valor porcentual de perfusion post-tratamiento en reposo.

En la presente memoria, "mdice de tolerancia al estres pre-tratamiento" se refiere a un parametro disenado para evaluar la perfusion miocardica ventricular izquierda en condiciones de pre-tratamiento. Este mdice se calcula por la diferencia aritmetica entre el valor porcentual de perfusion pre-tratamiento durante la sensibilizacion farmacologica (estres) y el valor porcentual de perfusion pre-tratamiento en reposo.

Segun se utiliza en la presente memoria, "mdice de tolerancia al estres" se define como la diferencia aritmetica entre el valor porcentual de perfusion durante la exposicion farmacologica (estres) y el valor porcentual de perfusion en reposo. Este mdice se calcula en situaciones de post-tratamiento y pre-tratamiento.

Segun se utiliza en la presente memoria, "dosis suficiente" se define como una cantidad del agente inductor, o del compuesto farmaceutico que incluye el agente inductor, adecuada para lograr la funcion especificada. En el contexto de la presente invencion, "dosis suficiente" se refiere a una cantidad del agente inductor, o del compuesto farmaceutico que incluye el agente inductor, adecuada para producir uno o mas de los siguientes resultados: 1) la induccion de la arteriogenesis, vasculogenesis, linfangiogenesis en celulas eucariotas, 2) la activacion del ciclo celular en celulas eucariotas, o 3) la induccion o la aceleracion del proceso mitotico en celulas eucariotas.

Segun se utiliza en la presente memoria, "vasculogenesis" se define como la formacion, crecimiento, desarrollo o proliferacion de vasos sangumeos derivados de celulas no diferenciadas o poco diferenciadas.

Segun se utiliza en la presente memoria, "VEGF" define cualquier factor de crecimiento endotelial vascular. "VEGF" incluye VEGF A. Veanse Hamawy, et al., Curr. Opin. Cardiol., 14:515-522 (1999); Neufeld, et al., Prog. Growth Factor Res., 5:89-97 (1994); Olofsson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581 (1996); Chilov, et al., J. Biol. Chem., 272:25176-25183 (1997); Olofsson, et al., Curr. Opin. Biotechnol., 10:528-535 (1999). La variante de VEGF A incluye, pero no se limita a, las isoformas de VEGF1-121, VEGF1-145, VEGF-i-w, VEGF1-165, VEGF1-189 y VEGF1-206. El SEQ ID NO. 1 ilustra un ejemplo de la isoforma CVB1-165. Veanse Tischer, et al., J. Biol. Chem., 266:11947-11954 (1991); Poltorak, et al., J. Biol. Chem., 272:7151-7158 (1997). El termino "VEGF" incluye tambien el factor de permeabilidad vascular o vasculotropina (VPF). Vease Keck, et al., Science 246:1309-1312 (1989); Senger, et al., Science, 219:983-985 (1983). El VPF se conoce actualmente en la tecnica como VEGF A.

En la presente memoria, "celulas poco diferenciadas" se definen como celulas con un perfil fenotfpico caractenstico pero con la capacidad originar celulas con un perfil fenotfpico diferente. Las "celulas poco diferenciadas" incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, mioblastos, osteoblastos, celulas precursoras endoteliales, celulas satelite de musculo esqueletico, y celulas gliales de tejido neural.

La presente invencion emplea un plasmido denominado pWEK15 de aproximadamente 3086 pares de bases (pb). El plasmido pUVEK15 se caracteriza por incluir un promotor de citomegalovirus (CMV), un intron quimerico, un fragmento de ADN que contiene la secuencia que codifica el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y una

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secuencia de ADN de aproximadamente 1290 pb, que confiere resistencia a kanamicina. El plasmido pUVEK15 se deposito bajo el numero de acceso DSM 13833 en DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Republica Federal de Alemania.

Habiendo descrito la invencion en terminos generales, esta se entendera mas facilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos que se presentan como una ilustracion y no estan destinados a limitar la presente invencion, excepto cuando se indique espedficamente.

Ejemplo 1

Induccion de la isquemia

Ochenta cerdos Landrace un peso aproximado de 25 kg (aprox. 3 meses de edad) se sometieron al siguiente protocolo: 1) cada individuo se sometio a evaluacion clmica y de laboratorio de buena salud; 2) se realizo una ioracotoirna esteril en el 4o espacio intercostal izquierdo bajo anestesia general (induccion: 20 mg/kg de tiopental sodico; mantenimiento: enflurano al 2%) y la arteria coronaria circunfleja se disecciono libre del tejido circundante en su porcion proximal; 3) se coloco un constrictor Ameroide abrazando el origen de la arteria coronaria circunfleja; y 4) se reparo la toracotomfa.

Ejemplo 2

Estudios de pre-tratamiento basal

Tres semanas despues de la primera cirugfa indicada en el ejemplo anterior, se llevaron a cabo estudios basales (pre-tratamiento) de los individuos. Los estudios se realizaron bajo sedacion con suficientes dosis de tiopental sodico por via intravenosa y bajo control electrocardiografico. Se llevaron a cabo estudios de perfusion miocardica basales de cada individuo. La perfusion del ventnculo izquierdo se cuantifico mediante tomograffa computarizada de emision monofotonica (SPECT) utilizando un Sistema de Camara Detectora Dual Vertex ADAC (ADAC Healthcare Information Systems Inc., EE.UU.). Como contraste se utilizo Sestamibi marcado con 99mTc.

Los estudios se realizaron en reposo y bajo sensibilizacion farmacologica con dosis progresivas de dobutamina intravenosa. La infusion de dobutamina fue interrumpida cuando la frecuencia cardfaca fue al menos 50% superior a los valores basales (reposo).

Se seleccionaron los individuos que cumplfan el criterio de inclusion (hipoperfusion en un territorio compatible con el lecho de la arteria coronaria circunfleja). De los sujetos considerados, veintiseis individuos desarrollaron isquemia miocardica cronica y fueron seleccionados por satisfacer el criterio de inclusion.

Ejemplo 3

Administracion de plasmido de VEGF y plasmido placebo

Los veintiseis individuos del ejemplo anterior se distribuyeron en dos grupos: A primer grupo que consistio en 16 individuos (Grupo I) y un segundo grupo que consistio en 10 individuos (Grupo II). Los individuos del Grupo I se utilizaron para llevar a cabo estudios histopatologicos y fisiologicos. Los individuos del Grupo II se utilizaron para evaluar la presencia y la expresion del plasmido de VEGF.

Los individuos del Grupo I se distribuyeron aleatoriamente en dos subgrupos (Grupo I-T y Grupo I-P) con el mismo numero de miembros (4 hembras y 4 machos por cada subgrupo). El grupo tratado se designo Grupo I-T. El grupo de placebo fue designado Grupo I-P.

Los individuos del Grupo II fueron divididos aleatoriamente en dos subgrupos (Grupo II-T y Grupo II-P). Ocho individuos se asignaron asignados al Grupo II-T. Dos individuos se asignaron al Grupo II-P. El grupo tratado se designo Grupo II-T. El grupo de placebo se designo Grupo II-P.

Se realizo una reapertura esteril de la toracotomfa anterior a cada individuo tanto del Grupo I como del Grupo II (reoperacion) bajo anestesia general (induccion: 20 mg/kg de tiopental sodico, mantenimiento: enflurano al 2%).

Cada individuo de los Grupos I-T y II-T recibio 10 inyecciones de una solucion que contema plasmido pUVEK15 que codificaba el factor de crecimiento endotelial vascular (1,9 mg de pUVEK15 en 1 ml de solucion salina). Cada inyeccion contema 200 pl de la solucion de plasmido. Cada individuo recibio una dosis total de 3,8 mg del plasmido pUVEK15.

Cada individuo de los Grupos I-P y II-P recibio 10 inyecciones de una solucion que contema plasmido pUVEK15-VEGF sin la region que codifica el factor de crecimiento endotelial vascular (1,9 mg de pUVEK15-VEGF en 1 ml de solucion

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salina). Cada inyeccion contema 200 ^l de la solution de plasmido. Cada individuo recibio una dosis total de 3,8 mg del plasmido pUVEK15-VEGF.

Cada aKcuota se inyecta intramiocardicamente, partiendo del territorio de la arteria descendente anterior izquierda normoperfundida (2-3 alrauotas) y abarcando las zonas basal y media de la pared anterolateral del ventriculo izquierdo. La zona de inyeccion incluye la zona hipoperfundida, la zona de transition y el tejido normoperfundido que rodea inmediatamente la zona de transicion. Las inyecciones se administran en un angulo de 45 grados en relation con el plano de la zona de miocardio, evitando la administration intraventricular de la solucion. Las inyecciones se distribuyeron homogeneamente en la zona de inyeccion. La toracotomia fue reparada en cada individuo despues de la administracion.

Ejemplo 4

Estudios post-tratamiento

1. Estudios histopatologicos y fisiologicos

Cinco semanas despues de la segunda cirugia (reoperacion), se realizaron estudios de post-tratamiento en los individuos del Grupo I. Los individuos fueron sedados con suficientes dosis de tiopental sodico por via intravenosa. Se evaluo para cada individuo la perfusion ventricular izquierda siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 2.

Los individuos se sometieron a eutanasia utilizando una sobredosis de tiopental sodico seguido de una inyeccion letal de cloruro de potasio. El corazon, los rinones, el higado, los pulmones, los musculos esqueleticos, los ojos y las gonadas fueron extirpados para la evaluation histopatologica, incluyendo determinaciones de la neoangiogenesis y la mitosis. Se realizaron los estudios histopatologicos en tejidos de miocardio y perifericos de acuerdo con los siguientes protocolos.

Para los estudios miocardicos, se retiraron el pericardio, la grasa adherente, las auriculas y la pared libre del ventriculo derecho. En cada animal, la arteria coronaria circunfleja izquierda se examino en el sitio del Ameroide para evaluar la oclusion. Con posterioridad, el ventriculo izquierdo, incluyendo el septo, se corto transversalmente a un tercio de la distancia entre el apice y el anillo mitral. Posteriormente, una section de 5 mm de espesor se corto del extremo distal de la tercera parte superior, se enjuago en solucion de Ringer y se fijo plana durante 48 horas en una solucion de formaldehido tamponado al 10%. Esta portion fue elegida con el fin de: l) limitar el analisis a zonas claramente perfundidas por un solo vaso (arteria coronaria descendente anterior, arteria coronaria circunfleja izquierda o arteria coronaria derecha), sin alimentation mixta de mas de una arteria, y 2) adaptar la histologia a los datos de perfusion.

Despues de la fijacion, la seccion se dividio en 6 bloques, correspondiendo, del 1 al 6 a: la mitad posterior del septum, la pared posterior, la pared posterolateral, la pared lateral, la pared anterior y la mitad anterior del septum. Estos 6 bloques se embebieron en Histowax™, y secciones de 5 ^m de espesor se montaron en portaobjetos previamente humedecidos en una solucion acuosa polilisina 0,01% (Sigma Chemical Co., EE.UU.) y se seco a 37°C. Las secciones se tineron con hematoxilina-eosina. La identification de los vasos intramiocardicos se realizo bajo un microscopio optico. El endotelio fue identificado mediante inmunohistoqmmica empleando la tecnica de biotina- estreptavidina y un anticuerpo monoconal contra el factor de von Willebrand. La capa de musculatura lisa fue identificada mediante inmunohistoqmmica para evaluar la arteriogenesis. Para este proposito se utilizo un anticuerpo monoclonal contra alfa-actina (Biogenex Labs. Inc., U.S.A.).

Para el analisis cuantitativo de la circulation colateral se empleo un sistema de analisis digital (Vidas Kontron,

Alemania). El analisis se centra en los vasos de las arteriolas (tamano de entre 8 y 50 ^m de diametro maximo) con

capa de musculatura lisa. El estudio morfometrico se realizo sobre la superficie total de la seccion. Se determino la

densidad numerica y lineal de los vasos colaterales. La densidad numerica se calculo como el numero de colaterales ' 2

(n) por milimetro cuadrado (n/mm ). La densidad lineal colateral (Lc) Se calculo con la metodologia conocida en la tecnica para vasos dispuestos en cualquier variedad de orientation. Veanse Anversa et al., Am. J Physiol., 260: H1552-H1560 (1991); Adair et al., Am. J. Physiol., 266: H1434-H1438 (1994); Anversa et al., Am. J. Physiol., 267: H1062-H1073 (1994). Para n vasos encontrados en un area A, Lc, expresada en milimetros por unidad de volumen de miocardio (mm/mm3), es igual a la suma de la razon R del eje largo al corto de cada vaso.

n

Lc = 1 / Aj]R' = (i?, + R2 + R, +K Rn)/A

i=i

Ademas, tambien se analizo la densidad lineal para los vasos intramiocardicos que oscilan de 8 a 30 micras de diametro maximo.

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Ambos indices numericos (densidad y longitud) se promediaron para las zonas isquemicas (paredes posterolateral, lateral y antero-lateral) y no isquemicas (pared septal, anterior y posterior).

Para evidenciar cardiomiocitos que experimentan ciclo celular y mitosis, se utilizaron dos tecnicas inmunohistoqmmicas dobles en las secciones de tejido de los individuos del Grupo I. Se realizaron los siguientes protocolos:

(a) Se incubaron secciones de tejido con un anticuerpo monoclonal contra el antfgeno Ki67 (Novocastra Labs., Reino Unido). El Ki67 es una protema expresada exclusivamente en el ciclo celular que identifica nucleos que experimentan las fases G1, S y G2-M y decora cromosomas mitoticos condensados. El patron de expresion de Ki67 no se ve afectado por el deterioro del ADN o por la apoptosis. Veanse Brown et al., Histopatology., 17:489-503 (1990); Gerdes et al., J. Immunol, 133:1710-1715 (1984); Ross et al., J. Clin. Pathol., 48:M113-117 (1995). Con posterioridad, las secciones se post-trataron con un antisuero anti- inmunoglobulina de raton biotinilado (Biogenex, EE.UU.), seguido de avidina marcada con peroxidasa y revelada con AEC como cromogeno. Despues de eso, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-a- actina sarcomerica (Dako, EE.UU.) para identificar las celulas musculares estriadas. Posteriormente, las secciones se sometieron a post-tratamiento con el antisuero biotinilado seguido de estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina (Biogenex, EE. UU.) y Fast Red como cromogeno.

(b) Las secciones de tejido se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra el antfgeno Ki67 (Novocastra Labs., Reino Unido). Las secciones se sometieron a post-tratamiento con anticuerpos biotinilados y se revelaron con estreptavidina marcada con fluorescema (Vector, EE. UU.). Posteriormente, las secciones se incubaron con faloidina marcada con rodamina (Sigma, EE. UU.), una protema de union a actina F, con el fin de identificar las celulas musculares estriadas.

Las secciones de tejido tratadas con avidina marcada con enzima se examinaron con microscopio optico con optica Nomarski. Las secciones de tejido tenidas con reaccionantes fluorescentes se examinaron con microscopio confocal (Zeiss, Republica Federal de Alemania).

La densidad de nucleos de cardiomiocitos (CMN) (CMN por mm2) se determino contando el numero de CMN en las celulas orientadas longitudinalmente que conteman a-actina sarcomerica en un area de 5 mm2 del mesocardio de la pared lateral. El numero de CMN positivos para Ki67 y el numero de mitosis de cardiomiocitos se determinaron en toda la zona de la seccion de tejido ventricular de cada individuo (area escaneada total, "TSA en sus siglas inglesas). El TSA de los individuos del Grupo I promediaron 1345,7 ± 289,7 mm2.

El mdice de CMN positivos para Ki67 se calculo como: [nucleos positivos para Ki67/(TSA * densidad CMN)] * 106. El mdice mitotico se calculo como: [mitosis/(TSA * densidad CMN)] * 106. Los datos se expresaron como el numero de nucleos positivos para Ki67 y el numero de mitosis de cardiomiocitos por 106 CMN. Ambos indices se promediaron para las zonas isquemica (paredes posterolateral, lateral y antero-lateral) y no isquemica (paredes septal, anterior y posterior) para cada individuo.

Para los estudios perifericos, los tejidos se fijaron en una solucion tamponada de formaldetudo al 10%, se cortaron en bloques y se incluyeron en parafina Histowax™. Se obtuvieron cortes de tejido de 5 pm de espesor a partir de los bloques y se tineron con hematoxilina-eosina. Se realizo una evaluacion histopatologica de los posibles efectos toxicos en los tejidos remotos mediante microscopfa optica.

2. Presencia y transcripcion de plasmido de VEGF en el tejido miocardico

Despues de la segunda cirugfa (reoperacion) los individuos del Grupo II fueron sacrificados utilizando una sobredosis de tiopental sodico seguido de una inyeccion letal de cloruro de potasio, de acuerdo con el siguiente cronograma: 2 individuos de Grupo II-T en el plazo de 3 dfas despues de la reoperacion, 2 individuos de Grupo II-T y 2 individuos de Grupo II-P en el plazo de 10 dfas despues de la reoperacion, 2 individuos del Grupo II-T en el plazo de 16 dfas despues de la reoperacion y 2 individuos del Grupo II-T en el plazo de 35 dfas despues de la reoperacion. Se realizaron necropsias en cada individuo sacrificado. El tejido miocardico de la zona de riesgo se obtuvo de cada individuo.

La evaluacion molecular se realizo para detectar la presencia de ADN plasirndico y su transcrito (ARNm). La presencia de ADN plasirndico y ARNm se determino mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), respectivamente. Veanse Mullis, et al., Meth. Enzymol., 55:335-350 (1987); Belyavsky, et al., Nucleic. Acids Res., 17: 2919 (1989).

El ARN total fue aislado de las muestras de tejido utilizando el reactivo Trizol (Gibco BRL Life Technologies, EE.UU.) y se trato con ADNasa I (Promega, EE.UU.). El ARN se cuantifico mediante espectrofotometna a A260/280 nm. Un pg de ARN total se sometio a transcripcion inversa utilizando hexameros aleatorios (Perkin Elmer, EE.UU.). A continuacion se amplifico VEGF humano a partir de ADNc utilizando polimerasa Tag (Perkin Elmer, EE.UU.) con los

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10

15

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45

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cebadores oligonucleotidicos 5'CAACATCACCATGCAGATT3' y 5'GCAGGAATTCATCGATTCA3' en condiciones del ciclo de 95°C durante 15 s, 52°C durante 30 segundos y 65°C durante 30 segundos, durante 35 ciclos. La amplificacion no competitiva de GAPDH constitutiva se utilizo para demostrar la presencia de ARNm intacto en cada muestra de ARN total. Se realizo una RT-PCR en tejido miocardico de individuos del Grupo II-T sin transcriptasa inversa para evaluar la posible contaminacion con ADN plasirndico o ADN genomico. Los resultados de esta reaccion de control fueron negativos, excluyendo la posibilidad de contaminacion.

Resultados

1. Analisis histopatologico y fisiologico

Los estudios de perfusion e histopatologicos mostraron formacion y el crecimiento vascular en el tejido miocardico de los individuos tratados. El estudio histopatologico revelo tambien la induccion de la mitosis en cardiomiocitos, celulas endoteliales y celulas de la musculatura lisa de individuos del Grupo I-T.

El mdice de tolerancia al estres y el mdice de mejora de la perfusion se determinaron para cada segmento de miocardio de todos los individuos del Grupo I con el fin de evaluar la perfusion del ventnculo izquierdo. Los valores medios de ambos indices se calcularon para la zona de riesgo y el tejido circundante para cada individuo. Por ultimo, se calcularon los valores medios para cada grupo.

El analisis de la perfusion en la zona de riesgo revelo que:

(a) Grupo I-P: ausencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los indices de tolerancia al estres de pretratamiento y postratamiento (comparacion pareada intra-grupo). Este resultado indica que la tolerancia a la perfusion y al estres no mejoro en los individuos del Grupo I-P despues del tratamiento con placebo.

(b) Grupo I-T: presencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los indices de tolerancia al estres pretratamiento y postratamiento (comparacion pareada intra-grupo). El valor medio de post- tratamiento fue significativamente mas alto que el valor medio de pre-tratamiento. Este resultado indica que la tolerancia a la perfusion y al estres mejoro significativamente en los individuos del Grupo I-T despues del tratamiento con pUVEK15.

(c) indices de tolerancia al estres pre-tratamiento: ausencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los valores medios de pre-tratamiento de los individuos del Grupo I-T e individuos del Grupo I-P de (comparacion no pareada inter-grupo). Este resultado demuestra que la perfusion fue homogenea para ambos subgrupos antes del tratamiento.

(d) indices tolerancia al estres post-tratamiento: presencia de diferencias estadfsticamente significativas entre los valores medios de post-tratamiento de los individuos del Grupo I-T e individuos del Grupo I-P (comparacion no pareada inter-grupo). El valor medio de post-tratamiento del Grupo I-T fue significativamente mas alto que el valor medio de post-tratamiento del Grupo I-P. Este resultado indica que la tolerancia a la perfusion y al estres de los individuos del Grupo I-T fue mas alta que en los individuos del Grupo I-P despues del tratamiento con pUVEK15.

(e) indices de mejora de la perfusion: presencia de diferencias estadfsticamente significativas entre ambos subgrupos. El valor medio para los individuos del Grupo I-T fue significativamente mas alto que el valor medio para los individuos del Grupo I-P (comparacion no pareada inter-grupo). Este resultado indica que la perfusion de los individuos del Grupo I-T mejoro notablemente en comparacion con la perfusion de los individuos del Grupo I-P. Ademas, la perfusion en los individuos del grupo I-P mostro una tendencia al deterioro.

El estudio fisiologico demostro una mejora general de la perfusion y la tolerancia al estres de los individuos del Grupo I-T cuando se trataron con pUVEKl5. Veanse Las Tablas 1 y 2; Figs. 1 y 2.

El estudio histopatologico mostro diferencias estadfsticamente significativas en la densidad numerica, la densidad lineal y el mdice mitotico entre ambos subgrupos (comparaciones no pareadas inter-grupo). Los individuos del Grupo I-T presentaron valores medios mas altos para estos indices en comparacion con los individuos del Grupo I-P. Veanse las Tablas 3, 4, 5 y 6; Figs. 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 y 13.

Estos resultados confirmaron la formacion neovascular in vivo de tejido de miocardio en los individuos tratados con pUVEK15. La formacion y el crecimiento vascular implica un aumento del numero de celulas que toman parte de neovasos (celulas de musculo liso endoteliales y vasculares). Veanse las Figs. 12 y 13. La administracion del agente de induccion reforzo la mitosis de las celulas vasculares en los individuos tratados. El subgrupo de individuos tratados con pUVEK15 tambien mostro una proporcion de cardiomiocitos en proceso mitotico mas de 5 veces mayor que en el subgrupo no tratado. Veanse las Figs. 6, 8, 9, 10 y 11; Tabla 6.

La angiogenesis u otros efectos secundarios adversos no se detectaron en los tejidos perifericos de los individuos

tratados con pUVEK15.

2. Presencia y transcripcion del plasmido de VEGF

5 Los estudios moleculares mostraron la presencia de ADN del plasmido en el tejido miocardico inyectado de todos los individuos del Grupo II (tecnica de PCR). El ADN del plasmido que codifica el VEGF se encontro en el tejido del miocardio inyectado de individuos del Grupo II-T. El ADN del plasmido placebo se encontro en el tejido del miocardio inyectado de los individuos del Grupo II-P.

10 Se detecto un producto de RT-PCR positivo para pUVEK15 en el tejido miocardico inyectado de los individuos del Grupo II-T a los 3 (n = 1/2), 10 (n = 2/2) y 16 (n = 1/2) dfas post-tratamiento. Vease la Fig. 7. No se detecto producto de RT-PCR para pUVEK15 en el tejido del miocardio inyectado a los 35 dfas (n = 2) de la inyeccion de pUVEK15 ni en el tejido de miocardio que recibio plasmido que carecfa de gen (Grupo II-P).

15 Se obtuvo una curva de transcripcion (presencia de ARNm) que mostraba un pico el dfa 10 despues de la inyeccion de pUVEK15 en los individuos del Grupo II-T. Vease la Fig. 7. La presencia de ARNm en el Grupo II-P fue negativa.

Tabla 1

fndice de tolerancia al estres

Pre-tratamiento (1)

Post-tratamiento (2)

Media a Media a Valor P (1) vs (2)

Grupo I-P

-0,6 2,2 -1,2 1,3 0,9

Grupo I-T

-3,1 2,2 3,8 1,3 <0,01

Valor P I-T vs I-P

0,42 <0,02

20 Tabla 2

fndice de Mejora de la Perfusion

Media

a

Grupo I-P

-0,6 2,6

Grupo I-T

6,9 2,6

Valor P I-T vs I-P

0,058

Tabla 3

fndice de Densidad Numerica (8-50 pm)

Media

a

Grupo I-T

1 0,1

Grupo I-P

0,6 0,1

Valor P I-T vs I-P

<0,02

Tabla 4

fndice de Densidad Lineal (8-50 pm)

Media

a

Grupo I-T

2,4 0,4

Grupo I-P

1,3 0,3

Valor P I-T vs I-P

<0,02

Tabla 5

fndice de Densidad Longitud (8-30 pm)

Media

a

Grupo I-T

1 0,1

Grupo I-P

0,6 0,1

Valor P I-T vs I-P

<0,02

Tabla 6

fndice Mitotico

Media

a

Grupo I-T

187,1 49,6

Grupo I-P

35,4 9,1

Valor P I-T vs I-P

<0,04

5

La presente invencion se ha descrito con cierto detalle e ilustrado para facilitar su comprension y reproducibilidad. Cualquier experto en la tecnica puede realizar ciertos cambios en la forma y el detalle sin apartarse de la presente invencion.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo ex vivo o in vitro para inducir miocardiogenesis que comprende administrar a los cardiomiocitos un vector plasmidico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos del factor de crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A).
2. 2. Un vector plasmridico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de VEGF-A para su uso en un metodo de regeneration de tejido miocardico mediante la induction de miocardiogenesis en un sujeto mediante la administration a los cardiomiocitos o al miocardio, en donde dicho vector es para la administracion a una dosis suficiente para inducir la regeneracion del tejido miocardico por miocardiogenesis.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o un vector plasmidico para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, para la induccion de mitosis de los cardiomiocitos.
4. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o un vector plasmidico para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3, en donde la secuencia de nucleotidos codifica un polipeptido cuya secuencia de aminoacidos es el SEQ ID NO:

   1:

   Ala

   Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin Asn

   His

   His

   Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val

   Tyr

   Gin Arg Ser Tyr Cys His Pro He Glu

   Thr

   Leu Val Asp lie Phe Gin Glu Tyr Pro

   Asp

   Glu lie Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser

   Cys

   Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly

   Cys

   Cys

   Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

   Thr

   Glu Glu Ser Asn He Thr Met Gin He

   Met

   Arg lie Lys Pro His Gln Gly Gin His

   lie

   Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn

   Lys

   Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg

   Ala

   Arg Gin Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys

   Ser

   Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gin

   Asp

   Pro Gin Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys

   Asn

   Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gin

   Leu

   Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys

   Asp

   Lys Pro Arg Arg

5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o un plasmido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la miocardiogenesis comprende la induccion localizada de la regeneracion de tejidos.
6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o un vector plasmidico para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde la administracion es a un tejido que comprende cardiomiocitos.
7. 7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, o un vector plasmidico para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde los cardiomiocitos son porcinos o humanos.
8. 8. Un vector plasmidico para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la induccion es en territorios miocardicos normoperfundidos, isquemicos o hipoperfundidos.

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   40
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, o un vector plasmndico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en donde la secuencia de nucleotidos comprende ADN genomico, ADNc o ARN mensajero.
10. 10. Un metodo segun la reivindicacion 1, o un vector plasmfdico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39, en donde el vector plasmfdico es transportado por un liposoma.
11. 11. El uso de un vector plasmfdico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de VEGF-A para la fabricacion de un medicamento para la regeneracion de tejido miocardico mediante miocardiogenesis en un sujeto mediante la administracion a los cardiomiocitos o al miocardio, en donde dicho medicamento es para administracion en una dosis suficiente para inducir la regeneracion de tejido miocardico mediante miocardiogenesis.
12. 12. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o un vector plasmfdico para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en donde el vector o el medicamento se administran mediante administracion intracardfaca, que puede comprender administracion intra-atrial o intraventricular, o mediante administracion intramiocardica, que puede comprender la administracion transepicardica o transendocardica.
13. 13. Un uso de acuerdo con la reivindicacion 11 o un vector plasmfdico para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde el medicamento o vector plasmfdico es para la administracion mediante inyeccion intramiocardica- transepicardica bajo visualizacion directa o mediante inyeccion transendocardica.
14. 14. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, o un vector plasmfdico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en donde un sujeto que va a recibir la administracion tiene infarto de miocardio, isquemia miocardica cronica, miocardiopatfa dilatada, miocardiopatfa hipertrofica o cardiopatfa isquemica.
15. 15. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el sujeto es un ser humano.
16. 16. Un vector plasmfdico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de VEGF-A para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto con infarto de miocardio, isquemia miocardica cronica, miocardiopatfa dilatada, miocardiopatfa hipertrofica o enfermedades cardfaca isquemica, mediante (induciendo) regeneracion de tejido miocardico por medio de miocardiogenesis mediante la administracion a los cardiomiocitos o al miocardio en una dosis suficiente para inducir la regeneracion de tejido miocardico mediante miocardiogenesis.
17. 17. El uso de un vector plasmfdico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el sitio activo de un polipeptido que incluye la secuencia de aminoacidos de VEGF-A en la fabricacion de un medicamento para tratar a un sujeto con infarto de miocardio, isquemia miocardica cronica, miocardiopatfa dilatada, miocardiopatfa hipertrofica o cardiopatfa isquemica mediante la induccion de la regeneracion de tejido del miocardio por medio de la administracion a los cardiomiocitos o al miocardio en una dosis suficiente para inducir la regeneracion de tejido miocardico mediante miocardiogenesis.