ES2564161T3

ES2564161T3 - Polipéptidos de anticuerpos artificiales

Info

Publication number: ES2564161T3
Application number: ES01955812.1T
Authority: ES
Inventors: Shohei Koide
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2016-03-18
Anticipated expiration: 2021-07-11
Also published as: EP1301538B1; CA2416219A1; AU7786701A; AU2001277867B2; WO2002004523A3; JP4578768B2; JP2004502451A; JP2009045065A; EP2385067A1; US20030027319A1; WO2002004523A2; US20130267676A1; US20170369555A1; US20180346551A1; EP1301538A2; US8263741B2; CA2416219C

Abstract

Un monocuerpo polipeptídico de fibronectina de tipo III (Fn3) que comprende una pluralidad de secuencias del dominio de la hebra ß de Fn3 que están unidas a una pluralidad de secuencias de la región bucle, en el que una o más secuencias de la región bucle del monocuerpo varían mediante la deleción, la inserción o la sustitución de al menos dos aminoácidos procedentes de las secuencias correspondientes de la región bucle en Fn3 natural; en el que el monocuerpo polipeptídico Fn3 comprende una mutación estabilizante de al menos un resto de aminoácido en comparación con una molécula de Fn3 natural, en el que la mutación estabilizante es una sustitución de al menos un resto de aminoácido que está implicado en una interacción electrostática desfavorable, en el que la mutación estabilizante es una sustitución de al menos una Asp 7, Asp23 o Glu 9 por otro resto de aminoácido, en el que dicha mutación estabilizante aumenta el punto de fusión del monocuerpo polipeptídico Fn3 en más de 0,1 ºC en comparación con un monocuerpo polipeptídico Fn3 que es idéntico excepto por el cambio.

Description

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en los bucles BC y FG, lo que sugiere que los bucles no son cruciales para la estabilidad. Los estudios de RMN han revelado que el bucle FG es muy flexible; se ha implicado la flexibilidad en la unión específica del 10º Fn3 a la integrina α5β1 mediante el motivo Arg-Gly-Asp (RGD). En la en la estructura cristalina del complejo de la hormona del crecimiento humana (de Vos et al., 1992), el segundo dominio Fn3 del receptor interactúa con la hormona mediante los bucles FG y BC, lo que sugiere que es factible construir un sitio de unión utilizando los dos bucles.

El décimo módulo de tipo III de la fibronectina tiene un pliegue similar al de los dominios de la inmunoglobulina, con siete hebras β formando dos láminas β antiparalelas, que se empaquetan entre sí (Main et al., 1992). La estructura del módulo de tipo II consiste en siete hebras β, que forman un sándwich de dos láminas β antiparalelas, conteniendo una tres hebras (ABE) y la otra cuatro hebras (C'CFG) (Williams et al., 1988). Las láminas β de triple hebra consisten en los restos Glu-9-Thr-14 (A), Ser-17-Asp-23 (B), y Thr-56-Ser-60 (E). La mayoría de los restos conservados contribuyen al núcleo hidrófobo, donde los restos hidrófobos invariantes Trp-22 y Try-6S se dirigen hacia los extremos N y extremos C del núcleo, respectivamente. Las hebras β son mucho menos flexibles y parecen proporcionar un marco rígido tras el cual construyen los bucles flexibles funcionales. La topología es similar a la de los dominios de la inmunoglobulina C.

Construcción génica y mutagénesis

Se diseñó un gen sintético para el décimo Fn3 de la fibronectina humana (Fig. 2) que incluye sitios de restricción convenientes para facilitar la mutagénesis y utiliza codones específicos para la expresión de la proteína a alto nivel (Gribskov et al., 1984).

El gen se ensambló como sigue: (1) la secuencia del gen se dividió en cinco partes con límites en los sitios de restricción previstos (Fig.); (2) para cada parte, se sintetizó una pareja de oligonucleótidos que codifican hebras opuestas y tienen solapamientos complementarios de ∼ 15 bases; (3) los dos oligonucleótidos se hibridaron y se llenaron las regiones monocatenaria utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa; (4) se clonaron los oligonucleótidos bicatenarios en el vector pET3a (Novagen) utilizando sitios de la enzima de restricción en los extremos del fragmento y se confirmó su secuencia mediante un secuenciador de ADN de Applied Biosystems utilizando el protocolo de terminación didesoxi proporcionado por el fabricante, (5) se repitieron las etapas 2-4 para obtener el gen completo (plásmido pAS25) (Fig. 7).

Aunque el presente método tarda más tiempo en ensamblar un gen que el del método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sandhu et al., 1992), no se producen mutaciones en el gen. Las mutaciones se habrían introducido probablemente debido a la replicación de baja fidelidad por la polimerasa Taq y habrían requerido una edición del gen con pérdida de tiempo. El gen se clonó también en el vector pET15b (Novagen) (pEW1). Ambos vectores expresaron el gen Fn3 bajo el control del promotor del bacteriófago T7 (Studler et al. 1990); pAS25 expreso solamente la proteína Fn3 de 96 restos, mientras que pEW1 expresó Fn3 como una proteína de fusión con el péptido poli-histidina (His•tag). Se llevaron a cabo manipulaciones del ADN recombinante de acuerdo con Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989), salvo que se indique de otra forma.

Se introdujeron mutaciones en el gen Fn3 utilizando técnicas de mutagénesis de casete o técnicas de mutagénesis de oligonucleótidos dirigidas al sitio (Deng y Nickoloff, 1992). Se llevó a cabo la mutagénesis de casete utilizando el mismo protocolo para la construcción de genes descrito anteriormente; se clonó un fragmento de ADN bicatenario que codificaba una nueva secuencia en un vector de expresión (pAS25 y/o pEW1). Pueden realizarse muchas mutaciones combinando una hebra recién sintetizada (mutaciones codificantes) y un oligonucleótido utilizado para la síntesis de genes. Los genes resultantes se secuenciaron para confirmar que se introdujeron las mutaciones diseñadas, y no otras mutaciones, mediante las reacciones de mutagénesis.

Diseño y síntesis de mutantes Fn3 con anticuerpos dirigidos contra las CDR

Se identificaron dos bucles candidatos (FG y BC) para el injerto. Se examinaron anticuerpos con estructuras cristalinas conocidas para identificar candidatos para las fuentes de bucles a injertar en Fn3. Se seleccionó el anticuerpo D1.3 contra la lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) (Bhat et al., 1994) como la fuente del bucle de una CDR. Los motivos para esta elección fueron: (1) están disponibles estructuras cristalinas de alta resolución de los estados libres y complejados (Fig. 4 A; Bhat et al., 1994), (2) están disponibles los datos termodinámicos de la unión (Tello et al., 1993), (3) se ha utilizado D1.3 como paradigma en el análisis estructural del Ab y el diseño mediante ingeniería del Ab (Verhoeyen et al., 1988; McCafferty et al., 1990), (4) los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio han mostrado que la CDR3 de la cadena pesada (VH-CDR3) realiza una contribución a la afinidad mayor que el resto de CDR (Hawkins et al., 1993), y (5) el ensayo de la unión se lleva a cabo fácilmente. El objetivo de este ensayo era injertar VH-CDR3 de D1.3 sobre la estructura principal de Fn3 sin pérdida significativa de estabilidad.

Un análisis de la estructura de D 1.3 (Fig. 4) reveló que solo los restos 99-102 ("RDYR") (SEC ID Nº:120) entran en contacto directo con la lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) (Fig. 4 B), aunque VH-CDR3 se define como más largo (Bhat et al., 1994). Debe señalarse que la mitad del extremo C de VH-CDR3 (restos 101-104) entra en contacto significativo con el dominio VL (Fig. 4 B). También resulta evidente que D1.3 VH-CDR3 (Fig. 4 C) tiene una

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vuelta más corta entre las hebras F y G que el bucle FG de Fn3 (Fig. 4 D). Por tanto, se diseñaron secuencias mutantes utilizando RDYR (99-102) (SEC ID Nº:120) de D1.3 como el núcleo y se establecieron diferentes límites y longitudes de bucles (Tabla 1). Bucles más cortos pueden imitar mejor la conformación de D1.3 CDR3, dando como resultado por tanto una mayor afinidad, pero también pueden reducir significativamente la estabilidad al eliminar las interacciones naturales de Fn3.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de D1.3 VH CDR3, Bucles VH8 CDR3 y bucle Fn3 FG y lista de mutantes planificados.

D1.3: (SEC ID Nº:1)

VH8: A R G A V V S Y Y A M D Y W G Q G (SEC ID Nº:2)

Fn3: (SEC ID Nº:3)

Mutante: Secuencia

D1.3-1: Y A E R D Y R L D Y ----P I (SEC ID Nº:4)

D 1.3-2: Y A V R D Y R L D Y ----P I (SEC ID Nº:5)

D 1.3-3: Y A V R D Y R L D Y A S S K P I (SEC ID Nº:6)

D1.3-4: Y A V R D Y R L D Y ---K P I (SEC ID Nº:7)

D1.3-5: Y A V R D Y R -----S K P I (SEC ID Nº:8)

D 1.3-6: Y AV T R D YR L --S S K P I (SEC ID Nº:9)

D1.3-7: Y A V T E R D YR L -S S K P I (SEC ID Nº:10)

VH8-1: Y A V A V V S Y Y A M D Y -P I (SEC ID Nº:11)

Mutante: Secuencia

VH8-2: Y AV T A V V S Y Y A S S K P I (SEC ID Nº:12)

Los subrayados indican restos en las hebras β. Los caracteres en negrita indican restos sustituidos.

Además, se seleccionó un único dominio VH dirigido contra HEL denominado VH8 (Ward et al., 1989) como plantilla. Se seleccionó VH8 mediante cribado de una biblioteca y, a pesar de la ausencia del dominio VL, VH8 tenía una afinidad por HEL de 27 nM, debido probablemente a su VH-CDR3 más larga (Tabla 1). Por tanto, su VH-CDR3 se injertó sobre Fn3. Bucles más largos pueden ser ventajosos en el marco de Fn3 ya que pueden proporcionar mayor afinidad y también están cercanos a la longitud del bucle del Fn3 natural. La estructura 3D de VH8 no era conocida y de esta manera la secuencia de VH8 CDR3 se alineó con la de D1.3 VH-CDR3; se diseñaron dos bucles (Tabla 1).

Construcción y producción de mutantes

Se llevaron a cabo experimentos de mutagénesis dirigida a sitio para obtener las secuencias diseñadas. Se obtuvieron dos mutantes Fn3s, D1.3-1 y D1.3-4 (Tabla 1) y ambos se expresaron como proteínas de fusión His•tag solubles. D1.3-4 se purificó y la porción His•tag se eliminó mediante escisión de trombina. D1.3-4 es soluble hasta al menos 1 mM a pH 7,2. No se ha observado agregación de la proteína durante la preparación y adquisición de datos mediante RMN de la muestra.

Expresión y purificación de proteínas

Se transformaron E. coli BL21 (DE3) (Novagen) con un vector de expresión (pAS25, pEW1 y sus derivados) que contienen un gen natural o un gen mutante. Las células se hicieron crecer en medio mínimo M9 y se suplementó el medio M9 con Bactotrypton (Difco) que contenía ampicilina (200 µg/ml). Para el marcado isotópico, 15N NH4Cl y/o 13C glucosa sustituyó a los componentes no marcados. 500 ml de medio en un matraz de 2 litros provisto de deflectores se inocularon con 10 ml de cultivo durante la noche y se agitaron a 37 ºC. Se añadió isopropiltio-βgalactósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM para iniciar la expresión de la proteína cuando la DO (600 nm) alcanza el valor de la unidad. Se recogieron las células mediante centrifugación 3 horas después de la adición de IPTG y se mantuvieron congeladas a -70 ºC hasta que se utilizaron.

Fn3 sin His•tag se purificó como sigue. Se suspendieron las células en 5 ml/(g de célula) de Tris (50 mM, pH 7,6) que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 1 mM) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM). Se añadió HEL a una concentración final de 0,5 mg/ml. Tras incubar la solución durante 30 minutos a 37 ºC, se sometió tres veces a ultrasonido durante 30 segundos en hielo. Los residuos celulares se eliminaron mediante centrifugación. Se añadió sulfato de amonio a la solución y el precipitado se recuperó mediante centrifugación. El aglomerado se disolvió en 5

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aminoácidos de regiones definidas de Fn3 utilizando una secuencia de nucleótidos degenerada, construyendo de esta forma una biblioteca. Los mutantes Fn3 que expresan fagos con las capacidades de unión deseadas se seleccionaron in vitro, se recuperaron y amplificaron. Se puede identificar fácilmente la secuencia de aminoácidos de un clon seleccionado secuenciando el gen Fn3 del fago seleccionado. Se siguieron los protocolos de Smith (Smith y Scott, 1993) con modificaciones menores.

El objetivo era producir monocuerpos que tuvieran una elevada afinidad por ligandos de proteínas pequeñas. HEL y el dominio B1 de la proteína G estafilocócica (denominado a partir de ahora en el presente documento como proteína G) se utilizaron como ligandos. La proteína G es pequeña (56 aminoácidos) y muy estable (Minor y Kim, 1994; Smith et al., 1994). Su estructura se determinó mediante espectroscopia de RMN (Gronenborn et al., 1991), y resultó ser una hélice empaquetada contra a una lámina β de cuatro hebras. Los complejos de FnAb-proteína G (∼ 150 restos) resultantes es uno de los complejos proteína-proteína más pequeños producidos hasta la fecha, bien comprendido en el intervalo de los métodos de RMN directos. El tamaño pequeño, la elevada estabilidad y solubilidad de ambos componentes y la capacidad de marcar cada uno de ellos con isótopos estables (13C y 15N; véase más adelante para la proteína G) hace de los complejos un sistema modelo ideal para los estudios de RMN sobre las interacciones entre proteínas.

La sustitución satisfactoria del bucle de Fn3 (el mutante D1.3-4) demuestra que al menos diez restos pueden estar mutados sin pérdida del pliegue global. Basándose en esto, se construyó en primer lugar una biblioteca en la que se aleatorizaron solamente los restos del bucle FG. Una vez obtenidos los resultados de los experimentos de sustitución de bucle en el bucle BC, se extendieron sitios de mutación hasta incluir el bucle BC y otros sitios.

Construcción del sistema de expresión de fagos de Fn3

Se ha construido un vector pASM1 de expresión basado en el fago M13 como sigue: un oligonucleótido que codifica el péptido de señalización de OmpT se clonó en el extremo 5' del gen Fn3; se preparó un fragmento del gen que codifica el dominio del extremo C de M 13 pIII a partir del gen III del gen de M 13 mp18 utilizando la PCR (Corey et al., 1993) y el fragmento se insertó en el extremo 3' del gen OmpT-Fn3; se insertó una secuencia separadora entre Fn3 y pIII. El fragmento resultante (OmpT-Fn3-pIII) se clonó en el sitio de clonación múltiple de M13 mp18, donde el gen de fusión está bajo el control del promotor lac. Este sistema producirá la proteína de fusión Fn3-pIII así como la proteína pIII natural. Se espera que la expresión simultánea de pIII natural reduzca el número de proteínas pIII de fusión, aumentando por tanto la infectividad del fago (Corey et al., 1993) (cinco copias de pIII están presentes en las partículas del fago). Además, un número más pequeño de proteínas pIII de fusión puede ser ventajoso en la selección de proteínas de unión estrechas, porque el efecto quelante debido a los múltiples sitios de unión debe ser más pequeño que con las cinco copias de fusión pIII (Bass et al., 1990). Este sistema ha expresado satisfactoriamente la serina proteasa tripsina (Corey et al., 1993). Los fagos se produjeron y purificaron utilizando E. coli K91kan (Smith y Scott, 1993) de acuerdo con un método normalizado (Sambrook et al., 1989) excepto que las partículas del fago se purificaron mediante una segunda precipitación con polietilenglicol y precipitación ácida.

Se ha confirmado la expresión satisfactoria de Fn3 sobre los fagos de fusión mediante ELISA utilizando un Ab contra fibronectina (Sigma), indicando claramente que es factible construir bibliotecas utilizando este sistema.

Se puede usar también un sistema alternativo que utiliza fUSE5 (Parmley y Smith, 1988). El gen Fn3 se inserta en fUSE5 utilizando los sitios de restricción SfiI introducidos en los extremos 5' y 3' del gen Fn3 mediante la PCR. Este sistema expresa solamente la proteína pIII de fusión (hasta cinco copias) sobre la superficie de un fago. Los fagos se producen y se purifican como se describe (Smith y Scott, 1993). Este sistema se ha utilizado para expresar muchas proteínas y es sólido. La ventaja de fUSE5 es su baja toxicidad. Esto se debe al bajo número de copias de la forma de replicación (RF) en el hospedador, que a su vez dificulta preparar una suficiente de RF cantidad para la construcción de una biblioteca (Smith y Scott, 1993).

Construcción de bibliotecas

La primera biblioteca se construyó para el dominio Fn3 presentado sobre la superficie del fago M13 en el que se aleatorizaron siete restos (77-83) del bucle FG (Fig. 4D). Se consiguió la aleatorización mediante el uso de un oligonucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos degenerada. Se preparó un nucleótido bicatenario mediante el mismo protocolo que para la síntesis de genes (véase anteriormente) excepto que una hebra tenía una secuencia (NNK)6(NNG) en los sitios de mutación, donde N corresponde a una mezcla equimolar de A, T, G y C y K corresponden a una mezcla equimolar de G y T. Se requirió el codón (NNG) del resto 83 para conservar el sitio de restricción SacI (Fig. 2). El codón (NNK) codifica los 20 aminoácidos, mientras que el codón NNG codifica 14. Por tanto, esta biblioteca contenía ∼ 109 secuencias independientes. La biblioteca se construyó uniendo el nucleótido bicatenario al vector de fagos natural, pASM1, y transfectando E. coli XL1 blue (Stratagene) mediante electroporación. XL1 blue tiene el fenotipo lacIq y, por tanto, suprime la expresión de la proteína de fusión Fn3-pIII en ausencia de los inductores de lac. La biblioteca inicial se propagó de esta manera, para evitar la selección frente a los clones Fn3-pIII tóxicos. Se prepararon fagos que expresaban la proteína de fusión Fn3-pIII aleatorizada propagando fagos con K91kan como hospedador. K91kan no suprime la producción de la proteína de fusión, porque no tiene lacIq. Se generó también otra biblioteca en la que se aleatorizó el bucle BC (restos 26-20).

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Selección de monocuerpos expresados

Se llevó a cabo el cribado de las bibliotecas de fagos Fn3 utilizando el protocolo de la técnica de selección por afinidad de biopanning (Smith y Scott, 1993); un ligando se biotinila y se la fuerte interacción biotina-estreptavidina se utilizó para inmovilizar el ligando sobre una placa revestida con estreptavidina. Los experimentos se llevaron a cambio a temperatura ambiente (-22 ºC). Para la recuperación inicial de fagos de una biblioteca, se inmovilizaron 10 µg de un ligando biotinilado en una placa de poliestireno revestida con estreptavidina (35 mm, Falcon 1008) y a continuación se añadió una solución de fagos (que contenía ∼ 10" ufp (unidad formadora de placas)). Tras lavar la placa con un tampón adecuado (normalmente TBST, Tris-HCl (50 mM, pH 7,5), NaCl (150 mM) y Tween 20 (0,5 %)), los fagos unidos se eluyeron mediante una o combinaciones de las siguientes condiciones: pH bajo, una adición de un ligando libre, urea (hasta 6 M) y, en el caso de monocuerpos dirigidos contra proteína G, escisión del enlazador proteína G-biotina mediante trombina. Los fagos recuperados se amplificaron utilizando el protocolo normalizado usando K91kan como hospedador

(Sambrook et al., 1989). Se repitieron los procesos de selección 3-5 veces para concentrar los clones positivos. A partir del segundo ciclo, las cantidades del ligando se disminuyeron gradualmente (hasta ∼ 1 µg) y los ligandos biotinilados se mezclaron con una solución de fagos antes de transferirlos a una placa (G. P. Smith, comunicación personal). Tras el ciclo final, se repicaron 10-20 clones, y se determinó su secuencia de ADN. Se midieron las afinidades por el ligando de los clones, en primer lugar, mediante el método de fagos-ELISA (véase a continuación).

Para suprimir la unión potencial del marco de Fn3 (unión del fondo) a un ligando, se puede añadir a los tampones Fn3 natural como competidor. Además, se pueden usar proteínas no relacionadas (por ejemplo, albúmina de suero bovino, citocromo c y ARNasa A) como competidores para seleccionar monocuerpos muy específicos.

Ensayo de unión

Se caracterizó semicuantivamente la afinidad de unión de los monocuerpos sobre la superficie del fago utilizando la técnica ELISA de fagos (Li et al., 1995). Los pocillos de las placas de microvaloración (Nunc) se revistieron con una proteína de ligando (o con estreptavidina seguido por la unión de un ligando biotinilado) y se bloquearon con la solución Blotto (Pierce). Se añadieron fagos purificados (-1010 ufp) originantes de placas (M13)/colonias (fUSE5) únicas a cada pocillo y se incubaron durante la noche a 4 ºC. Tras lavar los pocillos con un tampón adecuado (véase anteriormente), se detectaron los fagos unidos mediante el protocolo ELISA normalizado utilizando Ab dirigido contra M13 (conejo, Sigma) y anticuerpo dirigido contra Ig de conejo conjugado con peroxidasa (Pierce) o utilizando anticuerpo peroxidasa contra M13 conjugado con peroxidasa (Pharmacia). Se llevaron a cabo ensayos colorimétricos utilizando TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Pierce). La elevada afinidad de la proteína G por las inmunoglobulinas presenta un problema especial; Los Ab no se pueden usar en la detección. Por tanto, para detectar los monocuerpos dirigidos contra la proteína G, se inmovilizaron fagos de fusión en pocillos y a continuación se midió la unión utilizando proteína G biotinilada seguida por detección utilizando conjugado de estreptavidinaperoxidasa.

Producción de monocuerpos solubles

Tras la caracterización preliminar del mutante Fn3s utilizando el ELISA de fagos, los genes mutantes se subclonaron en el vector de expresión pEW1. Las proteínas mutantes se produjeron como proteínas de fusión His•tag y se purificaron, y se caracterizaron su conformación, estabilidad y afinidad por el ligando.

III. Estabilidad aumentada de las estructuras de Fn3

La definición de "mayor estabilidad" de una proteína es la capacidad de una proteína de retener su estructura tridimensional necesaria para la función a una temperatura mayor (en el caso de la desnaturalización térmica), y en presencia de una concentración superior de un reactivo químico desnaturalizante tal como clorhidrato de guanidina. Este tipo de "estabilidad" se denomina generalmente "estabilidad conformacional". Se ha mostrado que la estabilidad conformacional está correlacionada con la resistencia contra la degradación proteolítica, es decir, la rotura de la proteína en el cuerpo (Kamtekar et al. 1993).

Mejorar la estabilidad conformacional es una meta principal en la ingeniería de proteínas. Aquí, el inventor ha desarrollado mutaciones que potencian la estabilidad del dominio de tipo III de la fibronectina (Fn3). El inventor ha desarrollado una tecnología en la que se ha usado Fn3 como estructura principal para diseñar de proteínas de unión artificiales (Koide et al., 1998). Se ha mostrado que muchos restos de las regiones bucle superficiales de Fn3 se pueden mutar sin perturbar la estructura global de la molécula de Fn3, y que se pueden diseñar variantes de Fn3 con función de unión novedosa utilizando un cribado de bibliotecas combinatorias (Koide et al., 1998). El inventor ha descubierto que, aunque Fn3 es una excelente estructura principal, las variantes de Fn3 que contienen gran cantidad de mutaciones se desestabilizan frente a la desnaturalización química, en comparación con la proteína Fn3 natural (Koide et al., 1998). De esta manera, como el número de posiciones mutadas está mutado para diseñar una nueva función de unión, la estabilidad de dichas variantes de Fn3 disminuye adicionalmente, dando lugar en última instancia a proteínas muy poco estables. Como las proteínas de unión artificiales deben mantener su estructura

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Se ha utilizado la fluoresceína como diana en la selección de anticuerpos procedentes de bibliotecas combinatorias (Barbas, et al. 1992). Se obtuvo NSH-fluoresceína de Pierce y se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para preparar conjugados con BSA (Sigma). Se prepararon dos tipos de conjugados de fluoresceína-BSA con relaciones molares aproximadas de 17 (fluoresceína) a uno (BSA). 5 Se repitió el proceso de selección 5-6 veces para concentrar los clones positivos. En este experimento, la biblioteca de fagos se incubó con una mezcla de proteínas (BSA, citocromo C (Sigma, Caballo) y ARNasa (Sigma, Bovino), 1 mg/ml de cada uno) a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de la adición a pocillos revestidos con ligando. Los fagos unidos se eluyeron en TBS que contenía fluoresceína soluble 10 µM, en lugar de una elución con 10 ácido. Tras el ciclo final, los clones individuales se repicaron (véase más adelante) y se determinaron sus afinidades de unión y las secuencias de ADN.

Tabla 5. Clones de la biblioteca nº 2

BC: FG

WT: AVTVR (SEC ID Nº:47) RGDSPAS (SEC ID Nº:48)

pLB24.1: CNWRR (SEC ID Nº:49) RAYRYRW (SEC ID Nº:50)

pLB24.2: CMWRA (SEC ID Nº:51) RWGMLRR (SEC ID Nº:52)

pLB24.3: ARMRE (SEC ID Nº:53) RWLRGRY (SEC ID Nº:54)

pLB24.4: CARRR (SEC ID Nº:55) RRAGWGW (SEC ID Nº:56)

pLB24.5: CNWRR (SEC ID Nº:57) RAYRYRW (SEC ID Nº:58)

pLB24.6: RWRER (SEC ID Nº:59) RHPWTER (SEC ID Nº:60)

pLB24.7: CNWRR (SEC ID Nº:61) RAYRYRW (SEC ID Nº:62)

pLB24.8: ERRVP (SEC ID Nº:63) RLLLWQR (SEC ID Nº:64)

pLB24.9: GRGAG (SEC ID Nº:65) FGSFERR (SEC ID Nº:66)

pLB24.11: CRWTR (SEC ID Nº:67) RRWFDGA (SEC ID Nº:68)

pLB24.12: CNWRR (SEC ID Nº:69) RAYRYRW (SEC ID Nº:70)

Clones de la biblioteca nº 4

WT: AVTVR (SEC ID Nº:71) GRGDS (SEC ID Nº:72)

pLB25.1: GQRTF (SEC ID Nº:73) RRWWA (SEC ID Nº:74)

pLB25.2: GQRTF (SEC ID Nº:75) RRWWA (SEC ID Nº:76)

pLB25.3: GQRTF (SEC ID Nº:77) RRWWA (SEC ID Nº:78)

pLB25.4: LRYRS (SEC ID Nº:79) GWRWR (SEC ID Nº:80)

pLB25.5: GQRTF (SEC ID Nº:81) RRWWA (SEC ID Nº:82)

pLB25.6: GQRTF (SEC ID Nº:83) RRWWA (SEC ID Nº:84)

pLB25.7: LRYRS (SEC ID Nº:85) GWRWR (SEC ID Nº:86)

pLB25.9: LRYRS (SEC ID Nº:87) GWRWR (SEC ID Nº:88)

pLB25.11: GQRTF (SEC ID Nº:89) RRWWA (SEC ID Nº:90)

pLB25.12: LRYRS (SEC ID Nº:91) GWRWR (SEC ID Nº:92)

15 Se llevó a cabo la caracterización preliminar de las afinidades de unión de los clones seleccionados usando el ELISA de fagos y el ELISA de fagos de competición (véase la Fig. 12 (Fluoresceína-1) y la Fig. 13 (Fluoresceína-2)). Los cuatro clones sometidos a ensayo mostraron una unión específica a los pocillos revestidos con ligando, y las reacciones de unión se inhibieron mediante fluoresceína soluble (véase la Fig. 13).

20 Ejemplo XIII

Monocuerpo de unión a digoxigenina

Se usó ácido digoxigenina-3-O-metil-carbonilo-aminocaproico-NHS (Boehringer Mannheim) para preparar un 25 conjugado de digoxigenina-BSA. La reacción de acoplamiento se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del

fabricante. El conjugado de digoxigenina-BSA se inmovilizó en los pocillos de una placa de microvaloración que se

usó para la adsorción. Se repitió la adsorción 5 a 6 veces para enriquecer los clones de unión. Como la digoxigenina

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manera la superficie de unión. Se midieron las tasas de HX para los monocuerpos del complejo permitiendo que HX apareciera durante un tiempo variable tras la transferencia del complejo a D2O; el complejo se disoció disminuyendo el pH y se registró el espectro HSQC a pH bajo cuando la amida HX es lenta. Fn3 es estable y soluble a pH bajo, lo que satisface el prerrequisito de los experimentos.

5 Ejemplo XVI

Construcción y análisis del sistema de expresión de Fn3 específico de ubiquitina

10 Se diseñó y sintetizó un sistema de expresión de Fn3, se aislaron los clones de unión a ubiquitina, y se caracterizó biofísicamente un mutante Fn3 principal en estos clones.

La construcción de genes y la expresión en fagos de Fn3 se llevó a cabo como en los Ejemplos I y II anteriores. La proteína de fusión pIII del fago Fn3 se expresó a partir de un vector de expresión de fagémidos, mientras que el

15 resto de componentes del fago M13, incluyendo el pIII natural, se produjeron utilizando un fago auxiliar (Bass et al., 1990). Por tanto, un fago producido mediante este sistema debe incluir menos de una copia de Fn3 expresada sobre la superficie. Se detectó la expresión superficial de Fn3 sobre el fago mediante ELISA utilizando un anticuerpo dirigido contra Fn3. Solamente los fagos que contenían del vector de fusión Fn3-pIII reaccionaron con el anticuerpo.

20 Tras confirmar que la superficie del fago expresaba Fn3, se construyó una biblioteca de expresión en fagos de Fn3 como en el Ejemplo III. Las secuencias aleatorias se introdujeron en los bucles BC y FG. En la primera biblioteca se aleatorizaron cinco restos (77-81) y se eliminaron tres restos (82-84) del bucle FG. Se pretende que la deleción reduzca la flexibilidad y aumente la afinidad por la unión del bucle FG. Se aleatorizaron también cinco restos (26-30) en el bucle BC para proporcionar una superficie de contacto más grande con la molécula diana. Por tanto, la

25 biblioteca resultante contiene cinco restos aleatorizados en cada uno de los bucles BC y FG (Tabla 7). Esta biblioteca contenía aproximadamente 108 clones independientes.

Cribado de bibliotecas

30 Se llevó a cabo el cribado de bibliotecas utilizando ubiquitina como molécula diana. En cada ciclo de adsorción se absorbieron fagos-Fn3 en una superficie revestida con ubiquitina, y los fagos unidos se eluyeron competitivamente con ubiquitina soluble. La relación de recuperación mejoró de 4,3 × 10-7 en el segundo ciclo a 4,5 × 10-6 en el quinto ciclo, lo que sugiere un enriquecimiento de los clones de unión. Tras cinco ciclos de adsorción, se determinaron las secuencias de aminoácidos de los clones individuales (Tabla 7).

35 Tabla 7. Secuencias de los bucles variados de clones enriquecidos

Nombre: BC bucle Bucle FG Frecuencia

Tipo natural: GCAGTTACCGTGCGT (SEC ID Nº:93) AlaValThrValArg (SEC ID Nº:94) GGCCGTGGTGACAGCCCAGCGAGC (SEC ID Nº:95) GlyArgGlyAspSerProAlaSer (SEC ID Nº:96) -

Bibliotecaa: NNKNNKNNKNNKNNK X X X X X NNKNNKNNKNNKNNK---------X X X X X (deleción) -

clon 1 (Ubi4): TCGAGGTTGCGGCGG (SEC ID Nº:97) SerArgLeuArgArg (SEC ID Nº:98) CCGCCGTGGAGGGTG (SEC ID Nº:99) ProProTrpArgVal (SEC ID Nº:100) 9

clon 2: GGTCAGCGAACTTTT (SEC ID Nº:101) GlyGlnArgThrPhe (SEC ID Nº:102) AGGCGGTGGTGGGCT (SEC ID Nº:103) ArgArgTrpTrpAla (SEC ID Nº:104) 1

clon 3: GCGAGGTGGACGCTT (SEC ID Nº: 105) AlaArgTrpThrLeu (SEC ID Nº: 106) AGGCGGTGGTGGTGG (SEC ID Nº: 107) ArgArgTrpTrpTrp (SEC ID Nº: 108) 1

a N denota una mezcla equimolar de A, T, G y C; K denota una mezcla equimolar de G y T.

Un clon, apodado Ubi4, dominó el combinado enriquecido de variantes de Fn3. Por tanto, la investigación adicional se centró en este clon Ubi4. Ubi4 contiene cuatro mutaciones en el bucle BC (se conservó Arg 30 en el bucle BC) y cinco mutaciones y tres deleciones en el bucle FG. De esta manera, el 13 % (12 de 94) de los restos se alteraron en

40 Ubi4 con respecto a la secuencia natural.

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La Figura 15 muestra un análisis ELISA de fagos de Ubi4. El fago Ubi4 se une a la molécula diana, ubiquitina, con una afinidad significativa, mientras que un fago que expresa el dominio Fn3 natural o una fase sin moléculas expresadas muestra poca unión detectable a la ubiquitina (Figura 15a). Además, el fago Ubi4 mostró un nivel algo elevado de unión de fondo a la superficie de control que carece de revestimiento de ubiquitina. Experimentos ELISA de competición muestran que la CI50 (concentración del ligando libre que produce una inhibición del 50 % de la unión) de la reacción de unión es aproximadamente de 5 µM (Fig. 15b). BSA, ribonucleasa A de bovino y citocromo C muestran poca inhibición de la reacción de unión a la ubiquitina Ubi4 (Figura 15c), lo que indica que la reacción de unión de Ubi4 a ubiquitina resulta de la unión específica.

Caracterización de una proteína de Fn3 mutante

El sistema de expresión dio como resultado 50-100 de proteína de Fn3 por litro de cultivo. Se observó un nivel de expresión de la proteína similar para el clon Ubi4 y otras proteínas de Fn3 mutantes.

Ubi4-Fn3 se expresó como una proteína independiente. Aunque la mayoría de Ubi4 se expresó en E. coli en forma de proteína soluble, se ha descubierto que su solubilidad era significativamente reducida en comparación de la de Fn3 natural. Ubi4 era soluble hasta -20 µM a pH bajo, con una solubilidad mucho menor a pH neutro. Esta solubilidad no era suficientemente alta para la caracterización estructural detallada utilizando la espectroscopia de RMN o la cristalografía de rayos X.

Se mejoró la solubilidad de Ubi4 añadiendo una cola de solubilidad, GKKGK (SEC ID Nº:109), como extensión del extremo C. Se subclonó el gen de Ubi4-Fn3 en el vector de expresión pAS45 utilizando la PCR. Se incorporó la etiqueta de solubilización del extremo C, GKKGK (SEC ID Nº:109), en esta etapa. E. coli BL21(DE3) (Novagen) se transformó con el vector de expresión (pAS45 y sus derivados). Las células se hicieron crecer en medio mínimo M9 y se suplementó el medio M9 con Bactotryptone (Difco) que contenía ampicilina (200 µg/ml). Para el marcado isotópico, 15N NH4Cl sustituyó NH4Cl sin marcar en el medio. 500 ml de medio en un matraz de 2 litros provisto de deflectores se inocularon con 10 ml de cultivo durante la noche y se agitaron a 37 ºC. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para iniciar la expresión de la proteína cuando la DO (600 nm) alcanza el valor de la unidad. Se recogieron las células mediante centrifugación 3 horas después de la adición de IPTG y se mantuvieron congeladas a -70 ºC hasta que se utilizaron.

Las proteínas se purificaron como sigue. Se suspendieron las células en 5 ml/(g de célula) de Tris (50 mM, pH 7,6) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM). Se añadió lisozima de huevo de gallina (Sigma) a una concentración final de 0,5 mg/ml. Tras incubar la solución durante 30 minutos a 37 ºC, se sometió tres veces a ultrasonido durante 30 segundos en hielo. Los residuos celulares se eliminaron mediante centrifugación. Se añadió cloruro sódico concentrado a la solución hasta una concentración final de 0,5 M. La solución se aplicó a una columna quelante Hi-Trap (Pharmacia) precargada con níquel y equilibrada en tampón Tris que contenía cloruro de sodio (0,5 M). Tras lavar la columna con el tampón, se eluyó histag-Fn3 con el tampón que contenía imidazol 500 mM. La proteína se purificó adicionalmente utilizando una columna ResourceS (Pharmacia) con un gradiente de NaCl en un tampón acetato de sodio (20 mM, pH 4,6).

Con la cola GKKGK (SEC ID Nº:109) se aumentó la solubilidad de la proteína Ubi4 hasta aproximadamente 1 mM a pH bajo y hasta -50 µM a pH neutro. Por tanto, se llevaron a cabo análisis adicionales sobre Ubi4 con esta extensión en el extremo C (denominada a partir de ahora como Ubi4-K). Se ha notificado que podría mejorarse significativamente la solubilidad de un minicuerpo mediante la adición de tres restos Lys en los extremos N o C (Bianchi et al., 1994). En el caso de la proteína Rop, una cola en el extremo C no estructurada es fundamental para mantener su solubilidad (Smith et al., 1995).

Se determinaron los estados de oligomerización de la proteína Ubi4 utilizando una columna de exclusión por tamaño. La proteína Fn3 natural era monomérica a pH bajo y neutro. Sin embargo, el pico de la proteína Ubi4-K era significativamente más amplio que el del Fn3 natural y se eluyó después de la proteína natural. Esto sugiere interacciones entre Ubi4-K y el material de la columna, que impide el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el estado de oligomerización de Ubi4. Los estudios de RMN sugieren que la proteína es monomérica a pH bajo.

La proteína Ubi4-K retuvo una afinidad de unión con la ubiquitina que se resolvió por ELISA (Figura 15d). Sin embargo, un intento de determinar la constante de disociación utilizando un biosensor (Affinity Sensors, Cambridge, Reino Unido) fracasó debido a la elevada unión de fondo de Ubi4-K-Fn3 a la matriz del sensor. Esta matriz consiste principalmente en dextrano, que es consistente con la observación de que interacciones entre Ubi4-K interactúan con el dextrano reticulado de la columna de exclusión por tamaño.

Ejemplo XVII

Medidas de estabilidad de monocuerpos

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Claims

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