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TWI897843B - 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物 - Google Patents

結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物

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TWI897843B
TWI897843B TW107114893A TW107114893A TWI897843B TW I897843 B TWI897843 B TW I897843B TW 107114893 A TW107114893 A TW 107114893A TW 107114893 A TW107114893 A TW 107114893A TW I897843 B TWI897843 B TW I897843B
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formulation
myostatin
polypeptide
seq
histidine
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TW107114893A
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威秀 Ｃ 那席
拉許凱許 Ｋ 帕特爾
Original Assignee
美商必治妥美雅史谷比公司
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Abstract

本發明大體上係關於包含結合至肌肉生長抑制素之具有10 Fn3結構域之多肽的穩定液體調配物及其單位劑型，其用於經由包括皮下(SC)之多種途徑投與來治療肌肉消瘦及代謝病症。

Description

結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物
本發明大體上係關於包含結合肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物，包括凍乾及液體調配物，其用於治療肌肉消瘦疾病及代謝病症之治療應用。
肌肉生長抑制素(亦稱為生長及分化因數-8 (GDF-8))係分泌生長因數之轉形生長因數-β (TGF-β)超家族的成員。肌肉生長抑制素表現係主要限於骨骼肌及脂肪組織，其中顯示其係骨骼肌發育之負調控因數(Lee LS,Immunol Endocr Metab Agents Med Chem . 2010;10:183-194)。遺傳及藥理學研究結果均指示肌肉生長抑制素調節能量代謝，及其抑制作用可顯著減弱包括肥胖及糖尿病在內之代謝疾病的進展。例如，當與同齡野生型小鼠比較時，肌肉生長抑制素無效小鼠呈現體脂肪累積減少(McPherron及Lee，J. JCI 109:595, 2002)。此體脂肪減少係脂肪細胞數量及尺寸減少的表現形式，其表明肌肉生長抑制素在脂肪生成以及在肌肉生成中的重要作用。此外，骨骼肌質量及強度之增加係與代謝適應相關聯，代謝適應對身體組成、能量消耗、葡萄糖穩態及胰島素需求有正面影響。
在過去二十年間，重組DNA技術已導致發現大量蛋白質療法。例如，已描述在活體外及活體內有效抑制肌肉生長抑制素活性之抗肌肉生長抑制素黏附素(Adnectin) (US專利8,933,199；8,993,265；8,853,154；及9,493,546)。此等抗肌肉生長抑制素黏附素係適用於治療其中抑制肌肉生長抑制素活性將獲益之病症、疾病及病狀，包括(例如)肌肉消瘦疾病、代謝病症及導致肌肉萎縮之病狀。
遞送蛋白質藥物之最習知途徑為靜脈內(IV)投與，原因係大多數其他途徑之不良生物利用度、臨床投與期間之更強控制及更快之醫藥開發。對於需要頻繁且長期投與之產品而言，諸如肌肉消瘦疾病及代謝病症，交替皮下(SC)遞送途徑更具吸引力。當與預填充注射器及自動注射裝置技術相結合時，SC遞送允許居家投與及改良之投與順應性。
涉及皮下遞送之治療通常需要開發可以小體積(＜1.5 ml)遞送之蛋白質調配物。對於具有聚集傾向之蛋白質而言，達成穩定調配物係一項發展挑戰。儘管添加賦形劑可防止聚集體之形成，但提供蛋白質穩定性所需之賦形劑的數量及濃度可導致滲透壓度及/或黏度增加，此不適合用於藉由皮下遞送來快速投與小體積。
控制蛋白質溶解度之原理係比小合成分子之彼等原理更複雜，且因此克服蛋白質溶解度問題需要採取不同之策略。在操作上，蛋白質之溶解度可由在共溶質之存在下蛋白質之最大含量來描述，藉此溶液保持可見澄清(即，不顯示蛋白質沉澱物、晶體或凝膠)。Arakawa等人，Theory of protein solubility, Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985，；Schein，Solubility as a function of protein structure and solvent components, BioTechnology 8(4):308-317, 1990；Jenkins，Three solutions of the protein solubility problem, Protein Science 7(2):376-382, 1998；及其他，藉由本體水表面張力之變化及蛋白質結合至水及離子對比自締合，從機理上解釋蛋白質溶解度對離子強度、鹽形式、pH值、溫度及特定賦形劑之依賴性。蛋白質與特定賦形劑或鹽之結合通過改變蛋白質構象或掩蔽參與自我相互作用之特定胺基酸來影響溶解度。蛋白質亦優先經特定鹽、胺基酸及糖水合(並穩定為更緊湊的構象)，從而導致其等之溶解度改變。
預期需要雙分子碰撞之聚集為蛋白質溶液中之主要降解途徑。濃度與聚集體形成之關係取決於聚集體之大小以及締合機制。蛋白質聚集可導致共價(例如，二硫鍵結)或非共價(可逆或不可逆)締合。通過非共價締合之不可逆聚集通常經由藉由改變蛋白質之天然構象的熱、機械或化學過程而曝露的疏水區而發生。蛋白質聚集可影響蛋白質活性、藥物動力學及安全性，例如，歸因於免疫原性。
由於蛋白質構象之不穩定性質以與其自身、表面及特定溶質相互作用之傾向，確定蛋白質濃度以及賦形劑之類型、數量及濃度以獲得適於皮下遞送之穩定調配物仍然係經驗性練習。例如，雖然野生型10 Fn3係非常穩定且可溶，但10 Fn3之標靶結合變異體(其含有來自野生型序列之大約4至31個突變)在穩定性及可溶性方面變化很大。
因此，需要抑制肌肉生長抑制素之含有以纖維連接蛋白為主之分子的穩定醫藥調配物來治療及/或預防將受益於肌肉質量、肌肉強度及/或代謝之增加之病症或病狀(例如，肌肉營養不良、脆弱、不用性萎縮及惡病質)、與肌肉消瘦相關聯之病症(例如，腎臟疾病、心臟衰竭或疾病、及肝臟疾病)、及代謝病症(例如，II型糖尿病、代謝症候群、肥胖及骨關節炎)。
本發明提供含有一定濃度之抑制肌肉生長抑制素活性之黏附素分子的醫藥調配物，且其中該等黏附素分子保持穩定且不形成聚集體或顆粒。此等調配物代表適用於增加有此需要之患者(例如，肌肉消瘦及代謝病症)中之肌肉質量、肌肉強度及/或代謝之安全且方便的可注射治療劑(例如，每週一次，皮下)。
在一態樣中，提供穩定醫藥調配物，其包含(i)至少10 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，其包含III型纖維連接蛋白第十(10 Fn3)結構域；(ii)濃度為至少5%之雙醣；(iii)濃度在約20與約60mM之間之組胺酸緩衝液；及(iv)醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物具有約6.5至約7.8之pH範圍。
在一實施例中，該調配物包含結合至肌肉生長抑制素之多肽，其包含III型纖維連接蛋白第十(10 Fn3)結構域，其中該10 Fn3結構域之BC、DE及FG環中的至少一個環相對於SEQ ID NO：5、6及7之各自BC、DE及FG環各自具有0、1、2或3個胺基酸取代。在一實施例中，該10 Fn3結構域之BC、DE及FG環中的至少一者相對於來自SEQ ID NO：5、6及7之BC、DE及FG環中的一個環各自具有1個胺基酸取代。在一實施例中，該10 Fn3結構域相對於SEQ ID NO：5、6及7之各自BC、DE及FG環各自具有1個胺基酸取代。在一實施例中，該10 Fn3結構域之BC、DE及FG環各自包含SEQ ID NO：5、6及7之胺基酸序列。
在一相關實施例中，該10 Fn3結構域包含與SEQ ID NO：8、9或10之非BC、DE及FG環區至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在另一相關實施例中，該10 Fn3結構域包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
在某些實施例中，該調配物中之多肽包含Fc區。在一些實施例中，該Fc為人類IgG。在一些實施例中，該Fc為人類IgG1。在某些實施例中，該多肽包含與SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：70至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一實施例中，該調配物中之該多肽包含SEQ ID NO：78。在一實施例中，該調配物中之該多肽係由SEQ ID NO：78組成。在某些實施例中，包含10 Fn3結構域之該多肽為二聚體。
在一些實施例中，該調配物中之結合至肌肉生長抑制素之包含III型纖維連接蛋白第十(10 Fn3)結構域之該多肽的濃度係在約10 mg/mL與200 mg/mL之間。在一些實施例中，該調配物中之該多肽的濃度係在約10 mg/mL與約140 mg/mL之間，或在約10 mg/mL與約85 mg/mL之間。在其他實施例中，該調配物中之該多肽之蛋白質濃度為約10.7 mg/mL、21.4 mg/mL、50 mg/mL或71.4 mg/mL。
在一些實施例中，該雙醣係以蛋白質比糖至少5:1之重量(w/w)比存在。在一些實施例中，該蛋白質:糖重量比係在約5:1至10:1之間。在一些實施例中，該蛋白質:糖重量比為約10:1。在一些實施例中，該蛋白質:糖重量比為約6.75:1。
在一些實施例中，該調配物包含約5%至約30%、約15%至約25%、或約20%至約25%之雙醣。在一些實施例中，該雙醣之濃度為約150至約800 mM或約300至約700 mM。在一些實施例中，該雙醣之濃度為約600 nM。在一些實施例中，該雙醣為海藻糖。在某些實施例中，該雙醣為海藻糖二水合物。在一些實施例中，該雙醣為濃度為約600 mM之海藻糖二水合物。
在一些實施例中，該組胺酸係以至少20 mM之濃度存在於該調配物中。在一些實施例中，該組胺酸係以在約20 mM與約40 mM之間之濃度存在。在一些實施例中，該組胺酸係以約20 mM之濃度存在。在一些實施例中，該組胺酸含於該調配物中之濃度為約25 nM。在一些實施例中，該組胺酸係以約30 mM之濃度存在。
在一些實施例中，該醫藥調配物進一步包含濃度在約0.01%與0.5%之間之介面活性劑。在一些實施例中，該介面活性劑為聚山梨醇酯。在一些實施例中，該介面活性劑為聚山梨醇酯80。在一實施例中，該介面活性劑為0.02% PS80。
在一些實施例中，該醫藥調配物進一步包含濃度在約0.01 mM與0.1 mM之間之螯合劑。可接受螯合劑包括(但不限於) EDTA、DTPA及EGTA。在一實施例中，該螯合劑為DPTA。在一實施例中，該調配物包含0.05 mM DTPA。
在一些實施例中，該調配物之黏度為約5至20 cps。在一些實施例中，該調配物之黏度為約5至15 cps。在一些實施例中，該調配物之黏度為約7至12 cps。在一些實施例中，該調配物之黏度為低於約8 cps。
在一些實施例中，該醫藥調配物係呈體積在約0.3 mL至1 mL之間之單位劑型提供。在一些實施例中，該醫藥調配物係呈體積為約0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL或1.0 mL之單位劑型提供。在一些實施例中，該調配物係呈0.7 mL之單位劑型提供。
在相關實施例中，該單位劑型包含在5 mg與200 mg之間之蛋白質。在一些實施例中，該單位劑量包含約5 mg、7.5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、35 mg、45 mg、50 mg、90 mg或180 mg之蛋白質。
在一些實施例中，該醫藥調配物係經調配用於靜脈內、肌肉內或皮下注射。
在另一態樣中，本發明提供藉由投與有效量之上述醫藥調配物來減弱或抑制個體中之肌肉生長抑制素相關疾病或病症的方法。在一些實施例中，該肌肉生長抑制素相關疾病或病症係與個體中之肌肉退化或消瘦相關聯。在一些實施例中，該肌肉生長抑制素相關疾病或病症為代謝病症。
在某些實施例中，該醫藥調配物係用於治療選自肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、貝克氏肌肉營養不良(Becker's Muscular Dystrophy，BMD)、及杜興氏肌肉營養不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)、脊髓性肌肉萎縮症(SMA)、以及老年人群中之高發生率病狀諸如肌肉減少症及II型糖尿病的病狀。在某些實施例中，該醫藥調配物係用於治療杜興氏肌肉營養不良(DMD)。
在一些實施例中，該個體為人類。在某些實施例中，該個體為21歲或更小之兒科患者。在某些實施例中，該個體為在約6歲與12歲之間之兒科患者。
在一些實施例中，結合至肌肉生長抑制素之包含III型纖維連接蛋白第十(10 Fn3)結構域的該多肽係以約5 mg至200 mg之劑量進行投與。在一些實施例中，結合至肌肉生長抑制素之包含III型纖維連接蛋白第十(10 Fn3)結構域的該多肽係以約5 mg、7.5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、35 mg、45 mg、50 mg、90 mg或180 mg之劑量進行投與。在某些實施例中，該多肽係以7.5、15、35或50 mg之劑量進行投與。在一些實施例中，該調配物係每週進行投與。在一些實施例中，該個體係少於約45 kg且係經投與約7.5 mg至約35 mg之劑量。在其他實施例中，該個體係高於約45 kg且係經投與約15 mg至約50 mg之劑量。
在相關態樣中，本發明提供包括上述醫藥調配物及使用說明書之套組。
I. 定義
除非另有定義，否則文中所用之所有技術及科技術語具有熟習此項技術者通常理解的相同含義。儘管在本發明實務或測試中可使用與本文所述之彼等相似或等效之任何方法及組合物，但本文描述較佳方法及組合物。
除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指代物。
術語「約」，尤其在提及給定量或數字時，意欲涵蓋在加上或減去百分之十(± 10%，例如，± 5%)內之偏差。
「穩定」調配物或藥品係指其中之抗肌肉生長抑制素黏附素在儲存後基本上保持其物理及化學穩定性及完整性之調配物或藥品。可在選定時段後在選定溫度下量測抗肌肉生長抑制素黏附素分子調配物之穩定性。例如，凍乾及儲存後聚集體形成之增加係凍乾抗肌肉生長抑制素黏附素分子調配物之不穩定性的指標。除聚集體形成外，在整個貨架期保持原始澄清度、顏色及氣味為用於監測抗肌肉生長抑制素黏附素分子溶液之穩定性的指標。HMW物質係多聚體(即，四聚體、六聚體等)，其具有比抗肌肉生長抑制素黏附素分子單體或二聚體更高之分子量。「穩定」藥品通常可為其中當調配物在2至8℃下儲存一年時，如藉由高分子量物質之百分比(HMW%)增加所量測之聚集增加係小於約5%，且較佳小於約3%之藥品。較佳地，所製造之藥品包含少於約25%之HMW物質，較佳少於約15%之HMW物質，更佳少於約10%之HMW物質，最佳少於約5%之HMW物質。
醫藥產品(例如，包含抗肌肉生長抑制劑黏附素之蛋白質)之「貨架期」係產品在分解發生之前儲存的時間長度。例如，貨架期可經定義為針對0.1%、0.5%、1%、5%或10%之產品分解的時間。
術語「凍乾」及「冷凍乾燥」在本文中可互換使用，且係指材料藉由首先冷凍然後降低周圍壓力以使材料中之冷凍水昇華而脫水。
「復水的」調配物係指藉由將凍乾調配物溶解於水性載劑中來製備之調配物，使得抗肌肉生長抑制素黏附素分子溶解於該復水的調配物中。復水的調配物係適用於靜脈內投與(IV)或皮下(SC)投與至有此需要之患者。
「等滲」調配物係指一種具有基本上與人類血液相同滲透壓之調配物。等滲調配物通常具有約250至350 mOsmol/KgH2O之滲透壓。術語「高滲」係用於描述滲透壓高於人類血液滲透壓之調配物。例如，可使用蒸汽壓力或冰凍式滲透壓力計量測等滲性。
術語「緩衝劑」係指當添加至水溶液中時，能夠在添加酸或鹼時或在經溶劑稀釋時保護溶液免於pH變化之一或多種組分。醫藥上可接受之緩衝劑包括(但不限於)組胺酸、TRIS® (三(羥甲基)胺基甲烷)、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽及其類似者，如本文所述。
術語「pKa」係指酸之電離(酸解離)常數(Ka )的負對數(p)，其等於存在等濃度之酸及共軛鹼形式的緩衝液下之pH值(其中一半酸分子離子化)。當緩衝劑之p值等於待緩衝之溶液的pH值時，緩衝體系係最有效的。
「酸」係在水溶液中產生氫離子之物質。「醫藥上可接受之酸」包括無機酸及有機酸，其在所調配濃度及方式下係無毒的。
「鹼」係在水溶液中產生氫氧根離子之物質。「醫藥上可接受之鹼」包括無機鹼及有機鹼，其在所調配濃度及方式下係無毒的。
「防腐劑」係減少細菌作用且可視情況添加至本文調配物中之試劑。防腐劑之添加可(例如)有助於製造多用途(多劑量)調配物。潛在防腐劑之實例包括十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六甲雙銨、苯紮氯銨(烷基甲基苄基二甲基氯化銨之混合物，其中烷基基團係長鏈化合物)及苄索氯銨(benzethonium chloride)。其他類型之防腐劑包括芳族醇(諸如苯酚、丁醇及苯甲醇)、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚。
「介面活性劑」係含有疏水部分(例如，烷基鏈)及親水部分(例如，羧基及羧酸酯基團)之表面活性分子。適於在本發明調配物中使用之介面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)；山梨糖醇酯及衍生物；特裡同(Triton)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂基-磺基甜菜鹼；月桂基-、亞麻油基-或硬脂基-肌胺酸；亞麻油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-、可哥胺丙基-、肉豆蔻醯胺基丙基-、亞麻油醯胺基丙基-、棕櫚醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如月桂醯胺基丙基)；肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉；及MONAQUATTM 系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇及丙二醇之共聚物(例如泊洛尼克(Pluronic)、PF68等)。
「原料藥」係指用於調配最終藥品之原料。典型抗肌肉生長抑制素黏附素原料藥組合物包含10 mg/mL至200 mg/mL之蛋白質濃度，6.6至7.6之pH值及＜ 5%之HMW物質%。
「經調配之本體溶液」係指在填充容器之前的最終調配物，諸如在填充用於凍乾之小瓶之前的調配溶液，或在填充用於IV及/或SC注射之注射器之前的調配溶液。
「藥品」係指包裝在容器中之最終調配物，其可在使用前進行復水，例如凍乾藥品；在使用前進行進一步稀釋，例如液體藥品；或如原樣使用，例如SC溶液藥品。
如本文所用，「全長肌肉生長抑制素」係指McPherron等人(1997)前述中所描述之全長多肽序列以及相關全長多肽，包括對偶基因變異體及種間同系物。術語「肌肉生長抑制素」或「成熟肌肉生長抑制素」係指生物活性成熟肌肉生長抑制素之片段，以及相關多肽，包括對偶基因變異體、接合變異體及融合肽及多肽。據報導，成熟C端蛋白質在包括人類、小鼠、雞、豬、火雞及大鼠之許多物種中具有100%之序列一致性(Lee等人，PNAS 2001;98:9306)。人類前原肌肉生長抑制素(prepromyostatin)之序列為： MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：1)。 人類原肌肉生長抑制素(pro-myostatin)之序列為： NENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：2)。 成熟肌肉生長抑制素(在人類、小鼠、大鼠、雞、火雞、狗、馬及豬中保守)之序列為： DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：3)。
如本文所用，「以纖維連接蛋白為主之支架」或「FBS」蛋白質或部分係指基於III型纖維連接蛋白(「Fn3」)重複序列之蛋白質及部分。纖維連接蛋白具有18個Fn3重複序列，且儘管該等重複序列之間之序列同源性低，但其等全部共有三級結構之高度相似性。欲回顧，參見Bork等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89(19):8990-8994 (1992)；Bork等人，J. Mol. Biol. , 242(4):309-320 (1994)；Campbell等人，Structure , 2(5):333-337 (1994)；Harpez等人，J. Mol. Biol. , 238(4):528-539 (1994))。Fn3結構域係小型、單體、可溶且穩定。其缺乏二硫鍵，並因此係在還原條件下穩定。Fn3結構域按從N端至C端之順序包含β或β樣股，A；環，AB；β或β樣股，B；環，BC；β或β樣股，C；環，CD；β或β樣股，D；環，DE；β或β樣股，E；環，EF；β或β樣股，F；環，FG；及β或β樣股，G。該等七個反平行β股排列成兩個形成穩定核心之β褶板，同時產生包括連接β或β樣股之環組的兩個「面」。環AB、CD及EF位於一個面(「南極」)，環BC、DE及FG位於相對面(「北極」)。
黏附素係一類具有高親和力及特異性靶標結合特性之治療性FBS蛋白質，其係衍生自第十人類III型纖維連接蛋白結構域(10 Fn3)： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP ISINYRT (SEQ ID NO：4) (BC、DE及FG環加底線)。
因此，如本文所用，「10 Fn3結構域」或「10 Fn3部分」或「10 Fn3分子」係指野生型10 Fn3及其生物活性變異體，例如特異性結合至靶標(諸如靶蛋白)之生物活性變異體。
本文所用，10 Fn3結構域(或部分或分子)之「區域」係指環(AB、BC、CD、DE、EF及FG)、β-股(A、B、C、D、E、F及G)、N端(對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至7)或C端(對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基93至94)。
「支架區」係指人類10 Fn3結構域之任何非環區。支架區包括A、B、C、D、E、F及G β股以及N端區(對應於SEQ ID NO：1之殘基1至7的胺基酸)及C端區(對應於SEQ ID NO：1之殘基93至94的胺基酸)。
術語「抗肌肉生長抑制素黏附素」係指結合並拮抗肌肉生長抑制素且包含至少一個衍生自人類野生型10 Fn3結構域(SEQ ID NO：1)之10 Fn3結構域的蛋白質分子。抗肌肉生長抑制素黏附素可進一步包含額外蛋白結構域(例如，Fc結構域)，且亦可係指多肽之多聚體形式，諸如二聚體、四聚體及六聚體。
如本文所用，「多肽」係指兩個或更多個胺基酸之任何序列，無關於長度、轉譯後修飾或功能。「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用。多肽可包括天然胺基酸及非天然胺基酸，諸如在美國專利第6,559,126號中所述之彼等，以引用之方式併入本文中。多肽亦可以多種標準化學方式中之任一種進行修飾(例如，胺基酸可經保護基修飾；羧基端胺基酸可製成末端醯胺基；胺基端殘基可經基團修飾以(例如)增強親脂性；或多肽可經化學糖基化或以其他方式進行修飾以增加穩定性或活體內半衰期)。多肽修飾可包括將另一結構(諸如環狀化合物或其他分子)連接至該多肽，且亦可包括含有呈改變構型(即，R或S；或L或D)之一或多種胺基酸的多肽。本發明肽係衍生自纖維連接蛋白之第十III型結構域的蛋白質，其係經修飾以結合至肌肉生長抑制素，且在本文中稱為「抗肌肉生長抑制素黏附素」或「肌肉生長抑制素黏附素」。
如本文所用，「多肽鏈」係指其中之每個結構域均藉由肽鍵(與非共價相互作用或二硫鍵相對)與其他結構域連接之多肽。
「單離」多肽係指一種業經自其天然環境之組分中加以鑑別且分離及/或回收之多肽。其天然環境之污染物組分為幹擾多肽之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳實施例中，將使多肽純化至：(1)大於95重量%之多肽，如藉由勞立法(Lowry method)所測定，且最佳大於99重量%；(2)足以藉由使用旋杯式定序儀至少得到N端或內部胺基酸序列之殘基之程度；或(3)在還原或非還原條件下藉由SDS-PAGE，使用考馬斯藍(Coomassie blue)或(較佳地)銀染色為均質性。單離多肽包括原位在重組細胞內的多肽，因為該多肽之天然環境的至少一種組分係不存在的。然而，通常單離多肽要藉由至少一個純化步驟才能製備。
本文將「百分比(%)胺基酸序列一致性」定義為在比對序列並引入間隔(若有必要)以達成最大百分比序列一致性，且未考慮任何保守性取代為序列一致性之一部分後，候選序列中胺基酸殘基與所選序列之胺基酸殘基相同之百分比。為確定百分比胺基酸序列一致性之目的，可以各種此項技術中之方法達成比對，例如，利用公開可用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR™)軟體。熟習此項技術者可輕易確定用於測量比對之適宜參數，包括為達成所比較序列之全長中之最大比對所必需之任何演算法。例如，給定胺基酸序列A相對於(與或針對)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (或者，可以表述為具有或包含相對於(與或針對)給定胺基酸序列B相同之特定%胺基酸序列之胺基酸序列A)係如下計算：100乘以分數X/Y，其中X為以序列比對程式ALIGN-2進行A及B之程式比對，經評分為相同匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A對B之胺基酸序列一致性%將不會等於B對A之胺基酸序列一致性%。
如本文所用，「保守性取代」表示胺基酸殘基經另一個胺基酸殘基置換，而不改變肽之整體構象及功能，包括(但不限於)胺基酸經具有相似性質(諸如例如，極性、氫鍵結電位、酸性、鹼性、形狀、疏水性、芳族性及其類似者)之胺基酸置換。例示性保守性取代包括滿足Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure , 5:345-352 (1978 and Supp.)中對公認點突變所定義之標準的彼等。保守性取代之實例包括在以下群組內之取代：(a)纈胺酸、甘胺酸；(b)甘胺酸、丙胺酸；(c)纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸；(d)天冬胺酸、麩胺酸；(e)天冬醯胺、麩胺醯胺；(f)絲胺酸、蘇胺酸；(g)離胺酸、精胺酸、甲硫胺酸；及(h)苯丙胺酸、酪胺酸。本發明「取代」或「修飾」包括已經從天然胺基酸改變或修飾之彼等胺基酸。因此應瞭解，在本發明內文中，在此項技術中認為保守性取代係一個胺基酸經具有相似性質之另一個胺基酸取代。
如本文所用，術語「黏附素結合位點」係指與特定黏附素相互作用或與之結合之蛋白質(例如，肌肉生長抑制素)的位元點或部分(例如，如由抗體所識別之抗原決定基)。黏附素結合位點可係形成自鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並列的非鄰接胺基酸。由鄰接胺基酸形成之黏附素結合位點通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級折疊形成之黏附素結合位點通常在變性溶劑之處理下喪失。
在本文中可互換使用之術語「特異性結合」及「選擇性結合」係指顯示對肌肉生長抑制素之親和力且不顯著結合(例如，少於約10%結合)至不同多肽之黏附素，如藉由此項技術中可用之技術所量測，諸如(但不限於)斯克伽分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合檢定(例如，競爭性ELISA、BIACORE檢定)。該術語亦適用於其中(例如)本發明黏附素之結合結構域對肌肉生長抑制素具有特異性之情況。
如本文所用，術語「優先結合」係指其中本發明黏附素結合肌肉生長抑制素比結合不同多肽大至少約20%之情況，如藉由此項技術中可用之技術所量測，諸如(但不限於)斯克伽分析及/或競爭性結合檢定(例如，競爭性ELISA、BIACORE檢定)。
如本文所用，術語「交叉反應性」係指結合至具有相同或非常相似之黏附素結合位點之一個以上獨特蛋白質的黏附素。
如本文所用，術語「KD 」旨在係指特定黏附素-蛋白質(例如，肌肉生長抑制素)相互作用之解離平衡常數或黏附素對蛋白質(例如，肌肉生長抑制素)之親和力，如使用表面電漿子共振檢定或細胞結合檢定所量測。如本文所用，「所需KD 」係指對於所設想目的而言係足夠之黏附素的KD 。例如，所需KD 可係指在活體外檢定(例如基於細胞之螢光素酶檢定)中引起功能性作用所需之黏附素的KD 。
如本文所用，術語「kass 」旨在係指黏附素締合至黏附素/蛋白質複合體中之締合速率常數。
如本文所用，術語「kdiss 」旨在係指黏附素自黏附素/蛋白質複合體中解離之解離速率常數。
如本文所用，術語「IC50 」係指在活體外或活體內檢定中抑制反應至為最大抑制反應之50% (即，在最大抑制反應與未處理反應之間的中間)之水準的黏附素濃度。
如本文所用，術語「肌肉生長抑制素活性」係指與活性肌肉生長抑制素蛋白質與ActRIIb之結合及Alk4或Alk5之後續募集相關聯的生長調節或形態發生活性中之一或多者。例如，活性肌肉生長抑制素為骨骼肌質量之負調節劑。活性肌肉生長抑制素亦可調節肌肉特異性酶(例如，肌酸激酶)之生產，刺激成肌細胞增殖，及調節前脂肪細胞分化成脂肪細胞。可使用技術公認之方法(諸如本文所述之彼等方法)來確定肌肉生長抑制素活性。
片語「抑制肌肉生長抑制素活性」或「拮抗肌肉生長抑制素活性」或「拮抗肌肉生長抑制素」可互換使用，係指本發明抗肌肉生長抑制素黏附素在活體內或活體外中和或拮抗肌肉生長抑制素之活性的能力。如本文所用，關於本發明黏附素之活性的術語「抑制」或「中和」係指實質上拮抗、防止、預防、局限、減緩、破壞、消除、停止、減少或逆轉(例如)正在被抑制之進展或嚴重程度，包括(但不限於)生物活性或性質、疾病或病狀。抑制或中和較佳為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高。
例如，醫藥調配物中之抗肌肉生長抑制素黏附素可降低在通常在脊椎動物個體中發現之生物活性肌肉生長抑制素的循環水準，或降低在患有導致肌肉生長抑制素循環水準升高之病症的個體中生物活性肌肉生長抑制素之循環水準。如本文所述，可使用活體外檢定(例如結合檢定)來測定肌肉生長抑制素活性之降低。或者，肌肉生長抑制素活性之降低可導致體重增加、肌肉質量增加、肌肉強度增加、肌肉與脂肪之比率改變、無脂肪肌肉質量增加、肌肉細胞之大小及/或數量增加、及/或體脂含量減少。
術語「PK」為「藥物動力學」之首字母縮寫詞，且包括化合物之性質，包括(例如)個體之吸收、分佈、代謝及消除。如本文所用，「PK調節蛋白」或「PK部分」係指當融合至生物活性分子或與之一起投與時影響該生物活性分子之藥物動力學性質的任何蛋白、肽或部分。PK調節蛋白或PK部分之實例包括PEG、人類血清白蛋白(HSA)結合劑(如美國公開案號2005/0287153及2007/0003549、PCT公開案號WO 2009/083804及WO 2009/133208中揭示)、人類血清白蛋白、Fc或Fc片段及其變異體、及糖(例如，唾液酸)。
胺基酸序列或化合物之「半衰期」通常可定義為多肽之血清濃度在活體內減少50%(例如歸因於序列或化合物之降解及/或序列或化合物藉由天然機制清除或螯合)所花之時間。半衰期可以以本身已知之任何方式來確定，諸如藉由藥物動力學分析。合適技術對於熟習此項技術者而言係清楚的，且可例如通常涉及以下步驟：適當地向個體投與合適劑量之本發明胺基酸序列或化合物；定期收集個體之血液樣本或其他樣本；測定該血液樣本中本發明胺基酸序列或化合物之水準或濃度；及根據如此獲得之資料(圖)計算本發明胺基酸序列或化合物之水準或濃度達到與給藥時之初始水準相比降低50%的時間。例如，參考標準手冊，諸如Kenneth, A.等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)。亦參考Gibaldi, M.等人，Pharmacokinetics，第2修訂版，Marcel Dekker (1982)。
可使用諸如t1/2 -α、t1/2 -β、HL_λ_z及曲線下面積(AUC)之參數來表示半衰期。在本說明書中，「半衰期增加」係指此等參數中之任意一個、此等參數中之任意兩個、此等參數中之任意三個或此等參數中之全部四個的增加。特定言之，「半衰期增加」係指t1/2 -β及/或HL_λ_z增加，無論t1/2 -α及/或AUC或兩者是否增加。
符號「mpk」或「mg/kg」係指毫克每千克。所有符號在本發明中可互換使用。
在本文中可互換使用之術語「個體(individual/subject)」及「患者」係指動物，較佳哺乳動物(包括非靈長類動物及靈長類動物)或鳥類，包括(但不限於)鼠類、類人猿、人類、哺乳動物農場動物(例如，牛、豬、羊)、哺乳動物競技動物(例如，馬)及哺乳動物寵物(例如，犬及貓)；較佳地，該術語係指人類。該術語亦係指鳥類，包括(但不限於)雞及火雞。在某些實施例中，個體，較佳哺乳動物，較佳人類，其特徵還在於患有受益於肌肉生長抑制素水準降低或生物活性降低之疾病或病症或病狀。在另一實施例中，個體，較佳哺乳動物，較佳人類，其特徵還在於係處於發展受益於肌肉生長抑制素水準降低或生物活性降低之病症、疾病或病狀的風險中。
術語「治療有效量」係指對於向個體賦予治療益處所必需之至少最小劑量且小於毒性劑量之藥劑。例如，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之治療有效量為在哺乳動物(較佳人類)中導致以下一或多項之量：肌肉體積及/或肌肉強度增加、身體脂肪減少、胰島素敏感性增加、或其中肌肉生長抑制素之存在引起或導致非所欲病理效應或肌肉生長抑制素水準降低導致有益治療效果之病狀的治療。
如本文所用，術語「脆弱的」或「脆弱」係指可以選自無力、體重減輕、運動減慢、疲勞、活動水準低、耐力差及對感官暗示之行為反應受損之兩種或更多種症狀為特徵的病狀。脆弱的一個標誌為「肌肉減少症」，或年齡相關肌肉質量損失。
如本文所用，術語「惡病質」係指可由多種疾病導致之加速肌肉消瘦及瘦體質量損失的病狀。
本發明之多個態樣係以下子部分中進一步詳細描述。II. 肌肉生長抑制素結合黏附素分子
可在本文所提供之調配物中使用的抗肌肉生長抑制素黏附素分子包含衍生自人類III型纖維連接蛋白結構域之野生型第十模組(10 Fn3) (SEQ ID NO：1)的Fn3結構域。
在一些實施例中，該醫藥調配物中之抗肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中該BC環包含1、2或3個胺基酸取代，諸如允許抗肌肉生長抑制素黏附素維持結合至肌肉生長抑制素之保守性胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中該10 Fn3結構域之BC、DE及FG環中的至少一個環相對於SEQ ID NO：5、6及7之各自BC、DE及FG環具有1個胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中該10 Fn3結構域之BC、DE或FG環中的一個環相對於SEQ ID NO：5、6及7之各自BC、DE或FG環具有1個胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) BC環(SEQ ID NO：5)之3位置上的絲胺酸係經選自由A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(ii) BC環(SEQ ID NO：5)之4位置上的亮胺酸係經選自M或V之胺基酸取代；(iii) BC環(SEQ ID NO：5)之5位置上的脯胺酸係經選自由A、C、D、E、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V或Y組成之群的胺基酸取代；(vi) BC環(SEQ ID NO：5)之6位置上的組胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(vii) BC環(SEQ ID NO：5)之7位置上的麩胺醯胺係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(viii) BC環(SEQ ID NO：5)之8位置上的甘胺酸係經胺基酸S取代；(ix) BC環(SEQ ID NO：5)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(x) BC環(SEQ ID NO：5)之10位置上的丙胺酸係經選自由C、G、L、M、S或T組成之群的胺基酸取代；或(xi) BC環(SEQ ID NO：5)之11位置上的天冬醯胺係經選自由A、C、F、H、P、Q、R、S或Y組成之群的胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) BC環(SEQ ID NO：5)之3位置上的絲胺酸係經選自由C、F、I、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(ii) BC環(SEQ ID NO：6)之6位置上的組胺酸係經選自C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) BC環(SEQ ID NO：5)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iv) BC環(SEQ ID NO：5)之10位置上的丙胺酸係經選自由G、L、M或S組成之群的胺基酸取代；或(v) BC環(SEQ ID NO：5)之11位置上的天冬醯胺係經選自由C、H、Q、S或Y組成之群的胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) BC環(SEQ ID NO：5)之3位置上的絲胺酸係經胺基酸F或W取代；(ii) BC環(SEQ ID NO：5)之6位置上的組胺酸係經選自由C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) BC環(SEQ ID NO：5)之7位置上的麩胺醯胺係經選自由A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) BC環(SEQ ID NO：5)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、H、L、M、N、R、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iv) BC環(SEQ ID NO：5)之10位置上的丙胺酸係經胺基酸G或L取代；或(v) BC環(SEQ ID NO：5)之11位置上的天冬醯胺係經胺基酸H或Q取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中DE環(SEQ ID NO：7)之5位置上的纈胺酸係經選自由A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S或T組成之群的胺基酸取代。在一些實施例中，DE環(SEQ ID NO：7)之5位置上的纈胺酸係經選自由C、E、I、L、M、Q或T組成之群的胺基酸取代。在一些實施例中，DE環(SEQ ID NO：7)之5位置上的纈胺酸係經選自由C、E、I、L或M組成之群的胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) FG環(SEQ ID NO：7)之2位置上的纈胺酸係經選自由A、C、F、I、L、M、Q、T、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) FG環(SEQ ID NO：7)之3位置上的蘇胺酸係經選自由A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iv) FG環(SEQ ID NO：7)之4位置上的天冬胺酸係經選自由A、C、E、F、G、H、I、K、L、 M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(v) FG環(SEQ ID NO：7)之5位置上的蘇胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、 L、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(vi) FG環(SEQ ID NO：7)之6位置上的甘胺酸係經選自由A、C、D、E、F、H、I、K、L、 M、N、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(vii) FG環(SEQ ID NO：7)之7位置上的酪胺酸係經選自由A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W組成之群的胺基酸取代；(viii) FG環(SEQ ID NO：7)之8位置上的亮胺酸係經選自由A、C、E、F、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(ix) FG環(SEQ ID NO：7)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(x) FG環(SEQ ID NO：7)之10位置上的酪胺酸係經胺基酸F或W取代；或(xi) FG環(SEQ ID NO：7)之11位置上的離胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、L、 M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) FG環(SEQ ID NO：7)之2位置上的纈胺酸係經選自由A、C、I、L或M組成之群的胺基酸取代；(ii) FG環(SEQ ID NO：7)之3位置上的蘇胺酸係經選自由C、F、H、I、L、M、Q、R、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) FG環(SEQ ID NO：7)之4位置上的天冬胺酸係經選自由A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iv) FG環(SEQ ID NO：7)之5位置上的蘇胺酸係經選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(v) FG環(SEQ ID NO：7)之6位置上的甘胺酸係經選自由A、D、E、F、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(vi) FG環(SEQ ID NO：7)之7位置上的酪胺酸係經選自由C、F、I、L、M、P、T、V或W組成之群的胺基酸取代；(vii) FG環(SEQ ID NO：7)之8位置上的亮胺酸係經選自由C、F、H、I、K、M、N、Q、R、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(viii) FG環(SEQ ID NO：7)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(ix) FG環(SEQ ID NO：7)之10位置上的酪胺酸係經胺基酸W取代；或(x) FG環(SEQ ID NO：7)之11位置上的離胺酸係經選自由A、C、D、E、G、H、L、M、N、P、Q、R、S、T或V組成之群的胺基酸取代。
在一些實施例中，該調配物中之肌肉生長抑制素黏附素包含各自如SEQ ID NO：5、6及7中所述之BC、DE及FG環，其中(i) FG環(SEQ ID NO：7)之2位置上的纈胺酸係經胺基酸I取代；(ii) FG環(SEQ ID NO：7)之3位置上的蘇胺酸係經選自由C、F、I、L、M、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(iii) FG環(SEQ ID NO：7)之4位置上的天冬胺酸係經選自由A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T或V組成之群的胺基酸取代；(iv) FG環(SEQ ID NO：7)之5位置上的蘇胺酸係經選自由A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(v) FG環(SEQ ID NO：7)之6位置上的甘胺酸係經選自由A、S、T或W組成之群的胺基酸取代；(vi) FG環(SEQ ID NO：7)之7位置上的酪胺酸係經選自由F、I、V或W組成之群的胺基酸取代；(vii) FG環(SEQ ID NO：7)之8位置上的亮胺酸係經選自由F、H、I、M、V、W或Y組成之群的胺基酸取代；(viii) FG環(SEQ ID NO：7)之9位置上的離胺酸係經選自由A、C、F、G、I、L、M、T、V或W組成之群的胺基酸取代；或(x) FG環(SEQ ID NO：7)之11位置上的離胺酸係經選自由A、G、L、M、P、Q或R組成之群的胺基酸取代。
在某些實施例中，該抗肌肉生長抑制素黏附素包含與SEQ ID NO：8中所述之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列： EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT (SEQ ID NO：8)
在一些實施例中，該調配物中之多肽包含結合肌肉生長抑制素之10 Fn3結構域，該結構域包含與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10之非BC、DE及FG環區至少90%、95%、98%、99%或100%之相同的胺基酸序列。例如，在一些實施例中，10 Fn3之非配位體結合序列(即，「10 Fn3支架」)亦可改變，限制條件為10 Fn3保留配位體結合功能及/或結構穩定性。已報導多種突變體10 Fn3支架。在一些實施例中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者係經另一個胺基酸(諸如(例如)非負電荷胺基酸殘基(例如，Asn、Lys等))取代。據報導，與野生型相比，此等突變具有促進突變體10 Fn3在中性pH下更穩定之作用(參見，例如，PCT公開案號WO 02/04523)。已揭示10 Fn3支架中有益或中性之各種其他改變。參見，例如，Batori等人，Protein Eng., 15(12):1015-1020 (2002年12月)；Koide等人，Biochemistry, 40(34): 10326-10333 (2001年8月28日)。
在某些實施例中，該調配物中之多肽的10 Fn3結構域包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。在一實施例中，該調配物中之該多肽的10 Fn3結構域包含SEQ ID NO：10。延伸序列
在某些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素分子係經修飾以包含N端延伸序列及/或C端延伸序列。例如，可將MG序列放置於由SEQ ID NO：4限定之10 Fn3的N端。通常將M切除，在N端留下G。在一些實施例中，該抗肌肉生長抑制素黏附素包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，及如表1中所示之N端延伸序列。此外，M、G或MG亦可放置於表1所示之任一N端延伸之N端。在一些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素可在對應於SEQ ID NO：4之T94的蘇胺酸處截短。或者，可在SEQ ID NO：8之C端殘基後添加C端延伸。例示性C端延伸序列係顯示於表1中。表 1
在某些實施例中，該等C端延伸序列(亦稱為「尾部」)包含E及D殘基，且其長度可在8與50、10與30、10與20、5與10、及2與4個胺基酸之間。在一些實施例中，尾部序列包括基於ED之連接子，其中該序列包含ED之串聯重複序列。在例示性實施例中，該尾部序列包含2至10個、2至7個、2至5個、3至10個、3至7個、3至5個、3個、4個或5個ED重複序列。在某些實施例中，該等基於EC之尾部序列亦可包括其他胺基酸殘基，諸如，例如：EI、EID、ES、EC、EGS及EGC。此等序列係(部分)基於已知之黏附素尾部序列，諸如EIDKPSQ (SEQ ID NO：20)，其中殘基D及K業經移除。在例示性實施例中，該基於ED之尾部在ED重複序列之前包含E、I或EI殘基。 抗肌肉生長抑制素黏附素免疫球蛋白 Fc 融合
在一態樣中，提供含有包含融合至免疫球蛋白Fc結構域或其片段或變異體之抗肌肉生長抑制素黏附素的調配物。如本文所用，「功能性Fc區」為保留結合FcRn之能力的Fc結構域或其片段。在一些實施例中，功能性Fc區結合至FcRn，但不具有效應子功能。Fc區或其片段結合至FcRn之能力可藉由此項技術中已知之標準結合檢定來測定。在其他實施例中，Fc區或其片段結合至FcRn並具有至少一種天然Fc區之「效應子功能」。例示性「效應子功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)；吞噬；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。此類效應子功能通常需要Fc區與結合結構域(例如，抗肌肉生長抑制素黏附素)組合，且可使用此項技術中已知之用於評估此類抗體效應子功能之各種檢定進行評估。
「天然序列Fc區」包含與自然中所發現之Fc區的胺基酸序列相同之胺基酸序列。「變異體Fc區」包含憑藉至少一個胺基酸修飾與天然序列Fc區之胺基酸序列不同的胺基酸序列。較佳地，與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，變異體Fc區在天然序列Fc區或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如，約1個至約10個胺基酸取代，且較佳約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異體Fc區較佳與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%之序列一致性，且最佳與其具有至少約90%之序列一致性，更佳與其具有至少約95%之序列一致性。
在例示性實施例中，Fc結構域係衍生自IgG1亞類，然而，亦可使用其他亞類(例如，IgG2、IgG3及IgG4)。下文所示為人類IgG1免疫球蛋白Fc結構域之序列：DKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：39)
核心鉸鏈序列加底線，而CH2及CH3區為常規文本。應理解，C端離胺酸視情況係可選的。
融合可通過將抗肌肉生長抑制素黏附素連接至Fc分子之任一端而形成，即，Fc-抗肌肉生長抑制素黏附素或抗肌肉生長抑制素黏附素-Fc排列。在某些實施例中，Fc及抗肌肉生長抑制素黏附素經由連接子融合。例示性連接子序列包括GAGGGGSG (SEQ ID NO：40)、EPKSSD (SEQ ID NO：41)、D、ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO：42)、ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO：43)、GQPDEPGGS (SEQ ID NO：44)、GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO：45)、ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO：46)、GSGSG (SEQ ID NO：47)、GSGC (SEQ ID NO：48)、AGGGGSG (SEQ ID NO：49)、GSGS (SEQ ID NO：50)、QPDEPGGS (SEQ ID NO：51)、GSGSGS (SEQ ID NO：52)、TVAAPS (SEQ ID NO：53)、KAGGGGSG (SEQ ID NO：54)、KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO：55)、KQPDEPGGS (SEQ ID NO：56)、KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO：57)、KTVAAPS (SEQ ID NO：58)、KAGGGGSGG (SEQ ID NO：59)、KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO：60)、KQPDEPGGSG (SEQ ID NO：61)、KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO：62)、KTVAAPSG (SEQ ID NO：63) AGGGGSGG (SEQ ID NO：64)、AGGGGSG (SEQ ID NO：65)、GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO：66)、QPDEPGGSG (SEQ ID NO：67)及TVAAPSG (SEQ ID NO：68)。
在一些實施例中，用於抗肌肉生長抑制素黏附素融合之Fc區包含Fc分子之鉸鏈區。如本文所用，「鉸鏈」區包含跨越IgG1 Fc區之SEQ ID NO：39之1至16位置的核心鉸鏈殘基(DKTHTCPPCPAPELLG；SEQ ID NO：69)。
在某些實施例中，該調配物中之抗肌肉生長抑制素黏附素-Fc融合採用多聚體結構(例如，二聚體)，部分歸因於鉸鏈區內SEQ ID NO：39之6及9位置處的半胱胺酸殘基。在其他實施例中，如本文所用之鉸鏈區可進一步包含衍生自如SEQ ID NO：39中所示之核心鉸鏈序列側邊之CH1及CH2區的殘基。在其他實施例中，該鉸鏈序列為GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO：70)。
在一些實施例中，該鉸鏈序列可包含賦予所需藥物動力學、生物物理學及/或生物學性質之取代。一些例示性鉸鏈序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG GPS (SEQ ID NO：71；核心鉸鏈區加底線)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLG GSS (SEQ ID NO 72；核心鉸鏈區加底線)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLG GSS (SEQ ID NO：73；核心鉸鏈區加底線)、DKTHTCPPCPAPELLG GPS (SEQ ID NO：74；核心鉸鏈區加底線)及DKTHTCPPCPAPELLG GSS (SEQ ID NO：75；核心鉸鏈區加底線)。在一實施例中，SEQ ID NO：39之18位置處的殘基P係經S取代以消除Fc效應子功能；此取代係例示於具有SEQ ID NO：72、73或75中任一者之鉸鏈中。在另一實施例中，SEQ ID NO：39之1至2位置處的殘基DK係經GS取代以移除潛在剪輯位點；此取代係例示於SEQ ID NO：73中。在另一實施例中，對應於人類IgG1之重鏈恆定區(即，結構域CH1至CH3)之SEQ ID NO：76之103位置處的C係經S取代以在不存在輕鏈的情況下防止不合適之半胱胺酸鍵形成；此取代係例示於SEQ ID NO：71至73中。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：76)
在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附素-Fc融合可具有以下構型：1)抗肌肉生長抑制素黏附素-鉸鏈-Fc或2)鉸鏈-Fc-抗肌肉生長抑制素黏附素。因此，根據此等構型，本發明之任何抗肌肉生長抑制素黏附素可與包含鉸鏈序列之Fc區融合。在一些實施例中，連接子可用於將抗肌肉生長抑制素黏附素與鉸鏈-Fc部分連接，例如，例示性融合蛋白可具有構型抗肌肉生長抑制素黏附素-連接子-鉸鏈-Fc或鉸鏈-Fc-連接子-抗肌肉生長抑制素黏附素。此外，視產生融合多肽之系統而定，可將前導序列置於融合多肽之N端。例如，若融合係在哺乳動物系統中產生，則可將諸如METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO：77)之前導序列添加至融合分子之N端。若融合係在大腸桿菌(E. coli )中產生，則融合序列前面為甲硫胺酸。
在一實施例中，該調配物含有包含以下胺基酸序列之Fc-抗肌肉生長抑制素黏附素構築體：DKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESAAEAQEGELE GVSDVPRDL EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT EI (SEQ ID NO：78)。 鉸鏈區為加底線，連接子為斜體，前導序列為粗體，抗肌肉生長抑制素黏附素序列為底線且斜體。
在一實施例中，該調配物含有包含以下胺基酸序列之Fc-抗肌肉生長抑制素黏附素構築體： GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：79)
該Fc結構域包含如下之人類IgG1 CH2及CH3區： VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO：80) 及鉸鏈序列DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO：69)。III. 用於表現抗肌肉生長抑制素黏附素之核酸分子及載體
編碼抗肌肉生長抑制素黏附素之核酸可以化學、酶促或重組方式進行合成。可選擇密碼子使用以改良在細胞中之表現。此類密碼子使用將取決於所選之細胞類型。已針對大腸桿菌及其他細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞開發專用密碼子使用模式。參見例如：Mayfield等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 100(2):438-442 (2003年1月21日)；Sinclair等人，Protein Expr. Purif. , 26(1):96-105 (2002年10月)；Connell, N.D.,Curr. Opin. Biotechnol. , 12(5):446-449 (2001年10月)；Makrides等人，Microbiol. Rev. , 60(3):512-538 (Sep. 1996)；及Sharp等人，Yeast , 7(7):657-678 (1991年10月)。
用於核酸操作之一般技術係描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第二版，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，或Ausubel, F.等人，Current Protocols in Molecular Biology , Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)及定期更新，以引用的方式併入本文中。編碼多肽之DNA與源自哺乳動物、病毒或昆蟲基因之合適轉錄或轉譯調控元件以可操作方式連結。此類調控元件包括轉錄啟動子、控制轉錄之任選操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結合位點之序列、及控制轉錄及轉譯終止之序列。額外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製的能力及促進轉化體識別之選擇基因。
因此，在該調配物中使用之抗肌肉生長抑制素不但可以直接方式重組性產生，亦可生成具有異種多肽之融合多肽，該異種多肽較佳為信號序列或其他在成熟蛋白或多肽之N端具有特異性裂解位點之多肽。所選之異種信號序列較佳係一種可為受宿主細胞識別及處理(即被信號肽酶裂解)之序列。用於在哺乳動物系統中產生多肽之例示性N端前導序列為：METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO：81)，其在表現後被宿主細胞移除。就無法識別及處理天然信號序列之原核宿主細胞而言，信號序列可經例如選自由鹼性磷酸酯酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列組成之群之原核信號序列取代。就酵母分泌而言，天然信號序列可係經(例如)酵母轉化酶前導序列、因數前導序列(包括酵母屬(Saccharomyces)及克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α-因數前導序列)或PCT公開案號WO 90/13646中所述之酸性磷酸酯酶前導序列、白色念珠菌(C. albicans )葡萄糖澱粉酶前導序列或信號取代。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如，單純皰疹gD信號。用於此種前驅物區域之DNA可為以閱讀框架連接編碼蛋白質之DNA。
表現載體及選殖載體兩者皆包含可使載體在一或多種所選宿主細胞中複製之核酸序列。一般而言，在選殖載體中，該序列係一種可使載體獨立於宿主染色體DNA進行複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。此等序列對各種細菌、酵母及病毒而言係眾所周知的。質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌，2微米質體起點適用於酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)係適用於哺乳動物細胞之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不一定要使用複製起點組分(通常僅會使用SV40起點，因為其包含早期啟動子)。
表現載體及選殖載體可包含選擇基因，亦稱為選擇性標記。典型選擇基因編碼蛋白質，該蛋白質(a)賦予針對抗生素或其他毒素，例如，安比西林(ampicillin)、新黴素、甲胺蝶呤或四環素之耐藥性，(b)補充營養缺陷，或(c)提供無法自複合培養基獲得之關鍵營養素，例如，編碼桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶之基因。
適合用於酵母之選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之trp1基因(Stinchcomb等人，Nature , 282:39 (1979))。trp1基因針對缺乏在色胺酸中生長能力之突變體酵母株(例如，ATCC® No. 44076或PEP4-1。Jones,Genetics , 85:12 (1977))提供選擇標記。酵母宿主細胞基因組中trp1損傷之存在則提供用於偵測藉由在缺乏色胺酸下生長之轉形作用的有效環境。類似地，Leu2-缺陷酵母株(ATCC® 20,622或38,626)可由已知帶有Leu2基因之質體互補。
表現載體及選殖載體通常含有由宿主生物體識別之啟動子，且係以可操作方式與編碼本發明蛋白質(例如，以纖維連接蛋白為主之支架蛋白質)之核酸連結。適用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酯酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tan啟動子)。然而，其他已知細菌啟動子亦係適合的。用於細菌系統之啟動子亦包含以可操作方式與編碼本發明蛋白質之DNA連結的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。
已知真核生物之啟動子序列。實質上，所有真核基因皆具有富集AT區，其位於距離轉錄引發之位點上游約25至30個鹼基處。另一種在距離許多基因之轉錄開始之上游70至80個鹼基處發現之序列為CNCAAT區，其中N可以為任何核苷酸。大多數真核基因之3'端係AATAAA序列，其可為在編碼序列之3'端添加poly A尾部之信號。所有此等序列皆可適當地插入真核表現載體中。
適合併與酵母宿主使用之啟動子序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激酶)之啟動子。其他酵母啟動子(其係具有轉錄受生長條件控制之額外優點的誘導型啟動子)係醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酯酶、與氮素代謝相關之降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及負責利用麥芽糖及半乳糖之酶之啟動子區。適用於酵母表現之載體及啟動子係進一步描述於歐洲專利公開案第73,657號及PCT公開案號WO 2011/124718及WO 2012/059486中。酵母增強子亦可有利地與酵母啟動子一起使用。
哺乳動物宿主細胞中載體之轉錄係可受例如以下啟動子控制：獲自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨大細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿猴病毒40 (SV40))之基因組之啟動子；來自異種哺乳動物啟動子之啟動子(例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、來自熱激(heat-shock)啟動子之啟動子，限制條件為此等啟動子係與宿主細胞系統相容。
高等真核生物轉錄編碼本發明蛋白質之DNA通常藉由將增強子序列插入至載體中來增強。許多增強子序列現在係自哺乳動物基因已知(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常亦使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點後側之SV40增強子(bp 100-270)、巨大細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點後側之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。亦參見Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)，其係關於使真核啟動子活化之增強元件。增強子可接合至載體中之肽-編碼序列之5'或3'位置處，但較佳係位於啟動子之5'位點處。
用於真核宿主細胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物之有核細胞)之表現載體亦包含終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此等序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'非轉譯區。此等區域含有在編碼本發明蛋白質之mRNA之非轉譯部分作為聚腺苷酸化片段轉錄的核苷酸片段。一種可用轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
重組DNA亦可包括可適用於純化蛋白質之任何類型的蛋白質標記序列。蛋白質標記之實例包括(但不限於)組胺酸標記、FLAG標記、myc標記、HA標記或GST標記。用於併與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主使用之適當選殖載體及表現載體可見於Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985))，其相關揭示內容係以引用之方式併入本文中。
如熟習此項技術者所明瞭，使用適合宿主細胞之方法來將表現構築體引入至宿主細胞中。用於將核酸引入至宿主細胞之多種方法係在此項技術中已知，其包括(但不限於)電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖或其他物質轉染；微粒撞擊；脂質體轉染；及感染(其中載體為感染性因數)。
合適宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。合適細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌屬。亦可使用酵母(較佳來自酵母菌屬物種，諸如釀酒酵母菌(S. cerevisiae ))產生多肽。亦可使用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白之桿狀病毒系統由Luckow等人(Bio/Technology, 6:47 (1988))回顧。合適哺乳動物宿主細胞系之實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人類胎腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞系。純化多肽係藉由培養合適宿主/載體系統以表現重組蛋白質來製備。對於許多應用而言，本文所揭示之許多多肽的小尺寸將作為較佳表現方法在大腸桿菌中表現。隨後從培養基或細胞提取物中純化蛋白質。IV. 蛋白質生產
宿主細胞係經本文所述之用於蛋白質生產的表現或選殖載體轉化，並在經修飾成針對誘導啟動子、挑選轉化體或擴增編碼所需序列之基因而言適當之習知營養培養基中進行培養。可在各種培養基中培養用於生產抗肌肉生長抑制素黏附素之宿主細胞。市售培養基(諸如漢姆氏(Ham's) F10 (Sigma)、最低要求培養基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM)，Sigma))係適用於培養宿主細胞。另外，可使用Ham等人，Meth. Enzymol., 58:44 (1979)；Barites等人，Anal. Biochem., 102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號、第5,122,469號、第6,048,728號、第5,672,502號或美國專利號RE 30,985中所述之許多培養基作為宿主細胞之培養基。任何此等培養基可在必要時以激素及/或其他生長因數(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因數)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健他黴素(Gentamycin)藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源進行補充。亦可以熟習此項技術者所知之適宜濃度包含任何其他必要補充劑。培養條件(諸如溫度、pH等)為彼等經選擇用於表現之宿主細胞先前所採用之條件，且為一般技術者所明瞭。
本文所揭示之蛋白質亦可使用細胞轉譯系統來生產。為了此類目的，必須修飾編碼多肽之核酸以允許活體外轉錄產生mRNA及允許mRNA在所利用之特定無細胞系統(真核生物，諸如哺乳動物或酵母無細胞轉譯系統，或原核生物，諸如細菌無細胞轉譯系統)中進行無細胞轉譯。
本發明蛋白質亦可藉由化學合成(例如，藉由Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)中所述之方法)來生產。對蛋白質之修飾亦可藉由化學合成來產生。
可藉由蛋白質化學領域中通常已知之蛋白質分離/純化方法來純化蛋白質。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析(例如，使用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、逆相層析、過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、逆流分佈或此等之任何組合。純化後，可將多肽交換至不同緩衝液中及/或藉由此項技術已知之多種方法中的任一種進行濃縮，該等方法包括(但不限於)過濾及透析。
純化多肽較佳至少85%純，或較佳至少95%純，且最佳至少98%純。無論純度之確切數值如何，多肽均係足夠純以用作醫藥產品。
抗肌肉生長抑制素黏附素分子之單體、二聚體及HMW物質可藉由尺寸排除層析(SEC)分離。SEC基於分子大小來分離分子。當分子沿著管柱長度遷移時，藉由差分分子排除或包含達成分離。因此，解析度隨著柱長增加而增加。抗肌肉生長抑制素黏附素分子樣品可使用配備有串聯TSK Gel G3000SWxL (300 mm.x7.8 mm，5微米)及TSK Gel SWxL (40 mm x 6.0 mm，7微米)柱(Tosoh Bioscience, Montgomery, Pa.)之2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, Mass.)進行分離。使用由40 mM NaH2 PO4 、60 mM Na2 HPO4 、0.1 M Na2 SO4 ，pH 6.8組成之流動相以0.5 ml/min之流速分離具有200 μg注入重量之純樣品。使用Water之2487雙波長檢測器以280 nm之吸光度監測樣品。使用此系統，HMW物質具有16.0 min ± 1.0 min之滯留時間。各峰均針對峰下麵積進行積分。藉由HMW峰面積除以總峰面積來計算HMW物質%。V. 抗肌肉生長抑制素黏附素活性之量測
可根據平衡常數(例如，解離常數，KD )及根據動力學常數(例如，結合速率常數，kon 及解離速率常數，koff )來評估本發明抗肌肉生長抑制素黏附素與靶分子(例如，肌肉生長抑制素)之結合。先前已描述用於評估在本文所提供之醫藥調配物中的抗肌肉生長抑制素黏附素之結合活性的例示性活體外及活體內檢定(例如，美國專利8,933,199；8,993,265；8,853,154；及9,493,546)，且包括(但不限於)液相法，諸如動力學排除檢定(KinExA)(Blake等人，JBC 1996;271:27677-85；Drake等人，Anal Biochem 2004;328:35-43)、配有Biacore系統(Uppsala, Sweden)之表面電漿子共振(SPR) (Welford等人，Opt. Quant. Elect 1991;23:1；Morton及Myszka，Methods in Enzymology 1998; 295:268)、均相時差式螢光(HTRF)檢定(Newton等人，J Biomol Screen 2008;13:674-82；Patel等人，Assay Drug Dev Technol 2008;6:55-68)、及使用Biacore表面電漿子共振系統(Biacore, Inc.)。應瞭解，上文所述之該等檢定係例示性的，及此項技術中已知用於測定蛋白質之間之結合親和力的任何方法(例如，基於螢光之轉移(FRET)、酶聯免疫吸附檢定及競爭性結合檢定(例如，放射免疫測定法))可用於評估本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之結合親和力。
可使用各種活體外檢定輕易地測定抗肌肉生長抑制素黏附素拮抗肌肉生長抑制素活性之能力。較佳地，該等檢定為允許同時篩選多種候選黏附素之高通量檢定。在一些實施例中，可在基於細胞之活化素響應元件(ARE)-螢光素酶報告子檢定中測定抗肌肉生長抑制素黏附素對肌肉生長抑制素活性之拮抗作用，如實例3中所述。在某些實施例中，相對於在用混合物刺激細胞之前將肌肉生長抑制素與抗肌肉生長抑制素黏附素共同培育時之對照而言，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素使肌肉生長抑制素誘導之ARE-螢光素酶活性減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。例示性對照反應涉及使用肌肉生長抑制素單獨處理或使用經過量基準肌肉生長抑制素抑制劑(諸如人類活化素RIIB Fc嵌合體(R&D Systems)或ActRIIb-Fc，如Morrison等人(Experimental Neurology 2009; 217:258-68)中所述)預培育之肌肉生長抑制素處理。在其他實施例中，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素以500 nM或更少、400 nM或更少、300 nM或更少、200 nM或更少、100 nM或更少、50 nM或更少、10 nM或更少、5 nM或更少、1 nM、0.5 nM或更少、0.4 nM或更少、0.3 nM或更少、0.2 nM或更少或0.10 nM或更少之IC50抑制ARE-螢光素酶報告子活性，如實例3中所述。
在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附素對肌肉生長抑制素活性之拮抗作用可藉由量測經肌肉生長抑制素處理之細胞中SMAD磷酸化的程度來確定，如美國專利8,933,199；8,993,265；8,853,154；及9,493,546中所述。例示性對照反應涉及使用肌肉生長抑制素單獨處理或使用經過量基準肌肉生長抑制素抑制劑(諸如人類活化素RIIB Fc嵌合體(R&D Systems)或ActRIIb-Fc，如Morrison等人(Experimental Neurology 2009; 217:258-68)中所述)預培育之肌肉生長抑制素處理。在一些實施例中，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素在12-點或4-點抑制反應中以1 nM或更少、0.8 nM或更少、0.6 nM或更少、0.4 nM或更少、0.3 nM或更少、0.2 nM或更少或0.1 nM更少之IC50抑制SMAD磷酸化，如實例5中所述。在其他實施例中，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素在10 nM下抑制藉由肌肉生長抑制素之SMAD磷酸化至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%或更多。
另外，已知使用細胞、組織培養及組織學方法來研究運動神經元疾病之一些活體外模型系統。例如，經歷麩胺酸興奮性毒性之大鼠的脊髓器官切片係適用作測試抗肌肉生長抑制素黏附素在預防運動神經元退化中之有效性的模型系統。Corse等人，Neurobiol. Dis. (1999) 6:335 346。關於研究ALS中所使用之活體外系統的討論，參見，例如Bar, P. R., Eur. J. Pharmacol. (2000) 405:285 295；Silani等人，J. Neurol. (2000) 247 增刊1:128 36；Martin等人，Int. J. Mol. Med. (2000) 5:3 13。
應瞭解，本文所述之該等檢定係例示性的，及此項技術中已知可充作讀出肌肉生長抑制素活性之任何方法係適用於測試本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之肌肉生長抑制素拮抗作用(例如，SMAD標靶基因(例如，Smad 7；Ciarmela等人，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011;96;755-65)之mRNA或含ARE基因之mRNA的實時RT-PCR)。VI. 調配物
對於皮下投與而言，需要以小體積(＜ 1.5 mL)遞送所需蛋白質濃度之劑量。因此，本文提供之SC調配物包含在水性載劑中之蛋白質濃度為至少10 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素與穩定水準之雙醣及緩衝劑組合。在一些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素之蛋白質濃度係在約10 mg/mL與200 mg/mL之間。在一些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素之蛋白質濃度係在約10 mg/mL與140 mg/mL之間。
在一些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素之蛋白質濃度為至少約10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50、mg/mL、60 mg/mL、65 mg/mL、70 mg/mL、75 mg/mL、80 mg/mL、85 mg/mL、90 mg/mL、95 mg/mL或更高。在某些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素之蛋白質濃度為至少約110 mg/mL、115 mg/mL、120 mg/mL、125 mg/mL、130 mg/mL、135 mg/mL、140 mg/mL或145 mg/mL。在某些實施例中，該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素之蛋白質濃度為約10.7 mg/mL、21.4 mg/mL、50.0 mg/mL或71.4 mg/mL。
該調配物中之穩定用糖(stabilizing sugar)為呈蛋白質比糖至少5:1之重量(w/w)比的雙醣。在一些實施例中，該蛋白質:糖重量比係在約5:1至10:1之間。在一些實施例中，該蛋白質:糖比為約6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些實施例中，該蛋白質:糖重量比為約6.75:1。
在一些實施例中，該調配物包含約5%至約30%之雙醣。在一些實施例中，該調配物包含約10%至約28%之雙醣。在一些實施例中，該調配物包含約15%至約25%之雙醣。在一些實施例中，該調配物包含約20%至約25%之雙醣。在一些實施例中，該調配物包含約18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或約25%之雙醣。
在一些實施例中，該調配物中之該糖之濃度為約150 mM至約800 nM。在一些實施例中，該調配物中之該糖之濃度為約300至約700 nM。在其他實施例中，該調配物中之該糖之濃度為約150 mM、約200 mM、約250 mM、約300 mM、約350 mM、約400 mM、約450 mM、約500 mM、約550 mM、約575 mM、約600、約625 mM、約650 mM、約675 mM或約700 mM。
在一些實施例中，該雙醣為海藻糖。在一些實施例中，該調配物包含約5至約30%之海藻糖。在一些實施例中，該調配物包含約5%至約28%之海藻糖。在一些實施例中，該調配物包含約15%至約25%之海藻糖。在一些實施例中，該調配物包含約20%至約25%之海藻糖。在一些實施例中，該調配物包含約18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或約25%之海藻糖。在一實施例中，該調配物包含22%海藻糖。在另一實施例中，該調配物包含23%海藻糖。
在一些實施例中，該雙醣為海藻糖二水合物。在一些實施例中，該調配物中之海藻糖二水合物之濃度為約150 mM至約800 nM。在一些實施例中，該調配物中之該海藻糖二水合物之濃度為約300至約700 nM。在其他實施例中，該調配物中之該海藻糖二水合物之濃度為約150 mM、約200 mM、約250 mM、約300 mM、約350 mM、約400 mM、約450 mM、約500 mM、約550 mM、約575 mM、約600、約625 mM、約650 mM、約675 mM或約700 mM。在一實施例中，該調配物中之該海藻糖二水合物之濃度為600 nM。
該調配物中之穩定用糖係以不大於可導致對於經由SC注射器投與而言不合需要或不適合之黏度的量進行使用。在一些實施例中，該調配物之黏度為約5至20 cps。在一些實施例中，該調配物之黏度為約7至12 cps。在一些實施例中，該黏度為約7至10 cps。在一些實施例中，該調配物之黏度係低於8 cps。
該調配物中之緩衝劑係以至少20 mM，且較佳在約20 mM與約40 mM之間之量存在。在一些實施例中，該緩衝劑係濃度為約20 mM、約25 mM、約30 mM或約35 mM之組胺酸。在一實施例中，該調配物包含約30 mM之組胺酸。
該調配物之pH值係維持在約6.5至約7.8之範圍。在某些實施例中，該pH值係維持在約6.6至7.6之pH範圍。在一些實施例中，該調配物之pH值為約6.8至7.4。在一些實施例中，該調配物之pH值為約7.0至7.3。在一些實施例中，該調配物之pH值為6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。在一些實施例中，該調配物之pH值為約7.1。
本文中在該等調配物中使用之水性載劑為一種醫藥上可接受(對於投與至人類而言係安全且無毒性)且係適用於製備液體調配物之載劑。說明性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽-緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。
該等調配物可進一步包含介面活性劑以進一步減少可見微粒之形成。較佳介面活性劑包括濃度為在約0.01%與0.5%之間之泊洛沙姆及聚山梨醇酯。在一些實施例中，該介面活性劑之濃度係在約0.02%與約0.1%之間。在一實施例中，該介面活性劑為泊洛沙姆188。在一些實施例中，該介面活性劑為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一實施例中，該介面活性劑為聚山梨醇酯80。
該等調配物可進一步包含濃度在約0.01 mM與約0.5 mM之間，較佳在約0.05 mM與0.2 mM之間之螯合劑。較佳螯合劑包括(但不限於)DPTA、EDTA及EGTA。在一些實施例中，該調配物中之螯合劑係濃度為0.05 mM之DPTA。
可視情況將防腐劑添加至本文調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可(例如)有助於製造多用途(多劑量)調配物。
在一些實施例中，本文所提供之調配物包含：(i)約10至140 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約5至25%之海藻糖二水合物；及 (iii)約20至30 mM之組胺酸， 其中該調配物之pH值為約6.8至7.3。
在一些實施例中，本文所提供之調配物基本上由以下組分組成：(i)約10至140 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約5至25%之海藻糖二水合物；及 (iii)約20至30 mM之組胺酸， 其中該調配物之pH值為約6.8至7.3。
在某些實施例中，本文所提供之調配物包含：(i)約10至140 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約5至25%之海藻糖二水合物； (iii)約20至30 mM之組胺酸； (iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；及 (v)約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80 其中該調配物之pH值為約6.8至7.3。
在某些實施例中，本文所提供之調配物基本上由以下組分組成：(i)約10至140 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約5至25%之海藻糖二水合物； (iii)約20至30 mM之組胺酸； (iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；及 (v)約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80 其中該調配物之pH值為約6.8至7.3。
在一些實施例中，該調配物包含：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (i)約600 mM之海藻糖二水合物；及 (iii)25至30 mM之組胺酸， 其中該調配物之pH值為約7.0至7.3。
在一些實施例中，該調配物基本上由以下組分組成：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (i)約600 mM之海藻糖二水合物；及 (iii)25至30 mM之組胺酸， 其中該調配物之pH值為約7.0至7.3。
在一些實施例中，該調配物包含：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)25至30 mM之組胺酸； (iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；及 (v)約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.0至7.3。
在一些實施例中，該調配物基本上由以下組分組成：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)25至30 mM之組胺酸； (iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；及 (v)約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.0至7.3。
在一些實施例中，該調配物包含：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
在一些實施例中，該調配物基本上由以下組分組成：(i)約10至75 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
在一實施例中，該調配物包含或基本上由以下組分組成： (i)約10.7 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
在一實施例中，該調配物包含或基本上由以下組分組成： (i)約21.4 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
在一實施例中，該調配物包含或基本上由以下組分組成： (i)約50 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
在一實施例中，該調配物包含或基本上由以下組分組成： (i)約71.4 mg/mL之抗肌肉生長抑制素黏附素； (ii)約600 mM之海藻糖二水合物； (iii)約30 mM之組胺酸； (iv)約0.05 mM之DTPA；及 (v)約0.02%之聚山梨醇酯80， 其中該調配物之pH值為約7.1。
該液體調配物之推薦儲存條件為2至8℃，推薦貨架期為至少12個月。
為了確保醫藥組合物在貨架期時程內之功效及安全性，對該組合物進行穩定性測試。通常，穩定性測試包括但不限於關於組合物之識別、純度及效能的測試。在預期儲存溫度及升高溫度下測試穩定性。純度測試可包括但不限於SDS-PAGE、CE-SDS、等電聚焦、免疫電泳、西方墨點、逆相層析、尺寸排除層析(SEC)、離子交換及親和層析。其他測試可包括(但不限於)：視覺外觀(諸如顏色及透明度)、顆粒、pH值、蛋白質濃度量測、濕度及復水時間。
在穩定時程期間特定言之關於純度及效能之降解特性係與醫藥產品之組合物及/或調配物密切相關。特定言之，適當選擇調配物可顯著改變降解特性。衍生自FBS之蛋白質分子產品的典型降解特性包括形成共價及非共價高分子量聚集體、片段、脫醯胺及氧化產物。特定言之，脫醯胺及氧化產物以及其他酸性物質通常在穩定性測試之時程期間發展。在一些情況下，該等酸性物質限制醫藥組合物之可接受貨架期。歸因於(例如)脫醯胺之酸性物質的形成可藉由(例如)成像毛細管等電聚焦(icIEF)來測試。在其他情況下，高分子量聚集體之形成限制醫藥組合物之可接受貨架期。可藉由例如SEC (尺寸排除層析)、DLS、MFI、SDS-PAGE或CE-SDS來測試聚集體之形成。
例如，具有醫藥上可接受之穩定性的抗肌肉生長抑制素黏附素調配物可為一種調配物，其中當在約5 ± 3℃或25 ± 2℃之溫度下儲存持續至少約3個月，較佳約6個月，且更佳約12個月或更長，諸如18個月或更長，諸如至少24或甚至36個月之一段時期時，聚集體之百分比在使用SEC分析進行測定時係小於約10%，較佳小於約5%，更佳小於約2%。此外或替代地，本發明穩定抗肌肉生長抑制素黏附素調配物可為一種調配物，其中當在約5 ± 3℃或25 ± 2℃之溫度下儲存持續至少約3個月，較佳約6個月，且更佳約12個月或更長之一段時期時，主要同功異型物之變化在使用icIEF分析進行測定時係小於15%，較佳小於10%，更佳小於8%，最佳小於5%。
本文提供之實例描述SC調配物之穩定性研究，其證實在該SC調配物中抗肌肉生長抑制素黏附素分子之穩定性在海藻糖之存在下係高於在蔗糖存在下之穩定性。海藻糖之穩定作用係在蛋白質:海藻糖比小於10:1時更佳。基於此等研究，以提供最佳穩定性而不導致SC溶液具有過度高滲性或黏度之比率選擇海藻糖作為穩定劑。
亦觀察到，在25℃及37℃下儲存後，含有組胺酸作為緩衝劑之調配物在7.0至7.1之pH下顯示比磷酸鹽緩衝劑更佳之穩定性(即，更低HMW %) (數據未顯示)。鑑於組胺酸之pKa (pka = 6.0)，此觀察結果係特別令人驚訝，且似乎係至少部分基於意想不到之發現：抗肌肉生長抑制素黏附素具有固有緩衝能力。此允許調配物之生產能夠偏離緩衝液之pKa，同時利用蛋白質之緩衝能力來達成在產品之製造及貨架期期間所需之pH穩定性。VII. SC 調配物之製備
針對SC調配物開發之製造製程通常涉及與糖、螯合劑及介面活性劑混合，其後接著進行無菌過濾滅菌並填充至小瓶或注射器中，視情況進行透濾(緩衝液交換)及使用超濾單元之原料藥濃縮。蛋白質純化為在發酵生物反應器生產後之第一階段。使用多個管柱及過濾步驟純化蛋白質，並使用切向流過濾將其濃縮至調配物緩衝液中。用調配物緩衝液將經濃縮之藥物稀釋至目標濃度，並無菌過濾此溶液並將其填充至無菌小瓶/注射器中供患者使用。熟習此項技術者將知曉，需要過度填充容器，以便補償在製備及注射期間之小瓶、針頭、注射器滯留。例如，將5至10%過量之藥品併入至每瓶液體調配物中以解決取用損失並保證可從小瓶中取出藥品之所需劑量(標示量)。
製備用於包含結合肌肉生長抑制素之含有10 Fn3結構域的多肽(在本文中也可互換地稱為「抗肌肉生長抑制素黏附素」)之調配物注射器的單位劑型涉及重組細胞系中之蛋白質產生、純化小瓶多重柱步驟、濃縮及使用切向流過濾將緩衝液交換至調配物緩衝液中。用於切向流過濾之濃縮蛋白質藉由用調配物緩衝液稀釋至目標蛋白質濃度來進一步處理，並在過濾後將稀釋產物填充至1 mL注射器(例如，胰島素注射器、結核菌素注射器、BioPak注射器、NeoPak注射器)中。在一實施例中，該等注射器係隨後配備UltraSafe Passive護針器。
調配物之單位劑型通常含有約0.3至1.5 mL之調配物。在某些實施例中，該單位劑型含有0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2、1.4或1.4 mL之體積。在某些實施例中，該單位劑型係呈0.7 mL之體積提供。在一些實施例中，該單位劑型含有5至100 mg之多肽，該多肽包含結合肌肉生長抑制素之10 Fn3結構域。在一些實施例中，該單位劑型包含7.5 mg、15 mg、35 mg或50 mg之抗肌肉生長抑制素黏附素。
在一些實施例中，該等調配物係如本文所揭示般進行製備並在-60℃下以85至150 mg/mL之多肽濃度批量儲存於(例如)12L FFTp袋中。在一些實施例中，該等調配物係在-60℃下以85 mg/mL之多肽濃度儲存。隨後將批量調配物解凍並稀釋至適當多肽濃度用於製備單位劑型。在一些實施例中，該調配物在單位劑型中之多肽濃度為約10 mg/mL至140 mg/mL。在一些實施例中，該調配物在單位劑型中之多肽濃度為約10 mg/mL至75 mg/mL。在某些實施例中，該調配物在單位劑型中之多肽濃度為10.7 mg/mL、20.4 mg/ml、50 mg/mL或71.4 mg/mL。VIII. 投與
包含本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之醫藥調配物可投與至處於如本文所述之病理的風險或表現出該病理之個體。本文所提供之調配物係特別適用於藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射進行之外周系統遞送。在較佳實施例中，該等調配物係藉由皮下注射進行遞送。
治療有效劑量係指產生投與其所要達到之治療效果的劑量。待治療使用之醫藥組合物的有效量將取決於(例如)治療背景及目標。熟習此項技術者將明瞭，用於治療之合適劑量水準將因此(部分)取決於所遞送之分子、使用結合劑分子所針對之適應症、投與途徑、及患者之大小(體重、體表或器官大小)及狀況(年齡及一般健康狀況)。
確切劑量將根據與需要治療之個體相關的因素來判定，且可使用標準技術來確定。調整劑量及投與以提供足夠水準之活性化合物或維持所需效果。可考慮之因素包括疾病狀態之嚴重程度、個體之一般健康狀況、個體之年齡、體重及性別、投與時間及頻率、藥物組合、反應靈敏度及對療法之反應。
一般而言，該抗肌肉生長抑制素黏附素係以皮下投與約5至200 mg，更佳約5至50 mg之每週劑量。在某些實施例中，該抗肌肉生長抑制素黏附素調配物係以皮下投與7.5、15、35及50 mg之每週劑量。劑量水準係基於患者體重帶及肌肉生長抑制素之經預測抑制作用。在某些實施例中，少於45 kg之患者係經7.5 mg劑量給藥對應70%抑制肌肉生長抑制素，且大於45 kg體重之患者係經15 mg給藥以達到相同水準之肌肉生長抑制素抑制。在某些實施例中，少於45 kg體重之患者係經35 mg劑量給藥對應90%抑制肌肉生長抑制素，且大於45 kg體重之患者係經15 mg給藥以達到相同水準(90%)之肌肉生長抑制素抑制。
給藥頻率將取決於所用調配物中之結合劑分子的藥物動力學參數。通常，投與組合物直至達到達成所需效果之劑量。因此，該組合物可隨著時間推移以單劑量或多劑量(以相同或不同濃度/劑量)進行投與。進一步優化適當劑量是常規性進行。通過使用適當劑量-反應數據可確定適當劑量。例如，該抗肌肉生長抑制素黏附素之頻率可較低(例如，每兩週或每月一次)。此外，如此項技術已知，針對年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、藥物間相互作用及疾病之嚴重程度進行調整係必要的，且係由熟習此項技術者使用常規實驗可判定。該抗肌肉生長抑制素黏附素係適於一次性或在一系列治療中投與至患者。IX. 套組及製品
本發明抗肌肉生長抑制素黏附素可呈套組提供，該套組為用於本發明之治療或診斷方法中之預定量試劑與說明書的包裝組合。
例如，在本發明之一實施例中，提供含有適用於治療或預防上述病症或病狀之物質的製品。該製品包括容器及標籤。適合容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。該容器可由諸如玻璃、塑膠或金屬之各種材料形成。
該容器容納本文提供之液體調配物。在該容器上或與之相關聯之標籤可指示存儲及/或使用之指導。該標籤可進一步指示，SC調配物係適用於或旨在用於皮下投與。容納該調配物之容器可為多次使用小瓶，其允許(例如)皮下調配物之重複投與(例如投與2至6次)。或者，該容器可為包含(例如)呈單位劑形之皮下調配物的預填充注射器。
該製品可進一步包括從商業及使用者角度看理想之其他材料，包括稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之包裝插頁。X. 使用方法
在一態樣中，本發明提供適用於治療肌肉生長抑制素相關疾病或病症(例如，肌肉消瘦病症、肌肉萎縮、代謝病症及骨退化性病症)之抗肌肉生長抑制素黏附素的穩定調配物。因此，在某些實施例中，本發明提供用於減弱或抑制個體中之肌肉生長抑制素相關疾病或病症的方法，其包括向個體投與有效量之肌肉生長抑制素結合多肽，即，抗肌肉生長抑制素黏附素。在一些實施例中，該個體為人類。在一些實施例中，該抗肌肉生長抑制素黏附素對於哺乳動物(特定言之人類)而言係醫藥上可接受。「醫藥上可接受」之多肽係指投與至動物而無顯著不利醫學後果(諸如基本上不含內毒素或內毒素含量極低)之多肽。
本發明抗肌肉生長抑制素黏附素可用於治療與肌肉消瘦及/或肌肉萎縮相關聯之肌肉、神經及代謝病症。例如，體內肌肉生長抑制素過度表現誘發惡病質之徵兆及症狀特徵，而肌肉生長抑制素結合劑可部分地解決肌肉生長抑制素之肌肉消瘦效應(Zimmers等人，Science 2002; 296: 1486-8)。與未患有AIDS之患者或與未顯示重量損失之AIDS患者相比，患有AIDS之患者亦顯示肌肉生長抑制素免疫反應物質之血清水準增加(Gonzalez-Cadavid et. al.,PNAS 1998; 95:14938-43)。亦觀察到在患有心臟衰竭之小鼠中肌肉生長抑制素之心臟特異性消除減少骨骼肌萎縮，且相反地，特別是在心臟中過度表現肌肉生長抑制素足以誘發肌肉消瘦(Breitbart等人，AJP-Heart ; 2011;300:H1973-82)。相反，與野生型小鼠對應體相比，肌肉生長抑制素敲除小鼠顯示肌肉質量增加，及脂肪累積之年齡依賴性降低(McPherron等人，J. Clin. Invest. 2002;109:595-601)。
可根據本發明方法進行治療之例示性病症包括肌病及神經病變，其包括(例如)運動神經元疾病、神經肌肉及神經病症。
例如，抗肌肉生長抑制素黏附素可用於治療遺傳性肌病及神經肌肉病症(例如，肌肉營養不良(Gonzalez-Kadavid等人，PNAS , 1998; 95: 14938-43)、運動神經元病症、先天性肌病、發炎性肌病及代謝性肌病)，以及獲得性肌病(例如，藥物誘發之肌病、毒素誘發之肌病、感染誘發之肌病、副腫瘤性肌病及與危重疾病相關之其他肌病)。
此類疾病包括(但不限於)杜興氏肌肉營養不良、進行性肌肉營養不良、貝克氏型肌肉營養不良、德-蘭二氏(Dejerine-Landouzy)肌肉營養不良、厄爾布氏(Erb)肌肉營養不良、埃氏(Emery Dreifuss)肌肉營養不良、肢帶型肌肉營養不良、眼咽型肌肉營養不良(OPMD)、面肩胛肱型肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良、新生兒神經軸索性肌肉營養不良、肌強直性營養不良(施泰納特氏病，Steinert's disease)、遠端型肌肉營養不良、纖維狀肌病、家族性週期性麻痺、非營養不良型肌強直、週期性麻痺、脊髓性肌肉萎縮、脊髓性肌肉萎縮(SMA)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、原發性側索硬化(PLS)、進行性肌肉萎縮(PMA)、遠端型肌病、肌管/中央核肌病、纖維狀肌病、微軸空疾病、中心軸空疾病、結蛋白病(desminopathy)、包涵體肌炎、皮肌炎、多肌炎、線粒體肌病、先天性肌無力症候群、重症肌無力、脊髓灰質炎後肌功能障礙、類固醇肌病、酒精性肌病、手術期間肌肉萎縮及ICU神經肌病。
可用抗肌肉生長抑制素黏附素治療之遺傳性及獲得性神經病變及神經根病變包括(但不限於)強直性脊柱症候群、肌肉-眼-腦疾病、遺傳性運動及感覺神經病變、卡-瑪-圖三氏(Carcot-Marie-Tooth)疾病、慢性炎症性神經病變、進行性肥厚性神經病變、伴有壓迫性麻痹之遺傳性神經病變(tomaculous neuropathy)、狼瘡、格-巴二氏(Guillain-Barre)症候群、慢性發炎性脫髓鞘多神經病變、多發性硬化、結節病、糖尿病性神經病變、酒精性神經病變、疾病相關神經病變(例如，HIV/AIDS、萊姆病)、毒素相關神經病變(例如，重金屬、化學療法)、壓迫性神經病變(例如，腫瘤、截留神經病變)、及與損傷或創傷相關聯之神經病變(例如，馬尾症候群、截癱、四肢癱瘓)。
在一些實施例中，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素可用於治療肌肉營養不良(例如，杜興氏肌肉營養不良、貝克氏型肌肉營養不良)、ALS及肌肉減少症。
可使用本發明抗肌肉生長抑制素黏附素治療之與肌肉消瘦相關聯的其他病症包括惡病質、消瘦症候群、肌肉減少症、充血性阻塞性肺病、囊性纖維化(肺惡病質)、心臟疾病或衰竭(心臟惡病質)、癌症、歸因於AIDS之消瘦、歸因於腎衰竭之消瘦、腎臟疾病、跛行、與透析相關聯之惡病質、尿毒癥、類風濕性關節炎、肌肉損傷、手術、受損肌肉修復、脆弱、不用性萎縮、骨質疏鬆症、骨關節炎、韌帶生長及修復。
本發明方法亦可用於增加罹患歸因於不用之肌肉萎縮之個體的肌肉體積。不用性萎縮可起因於多種原因，包括導致長期不動或不用之任何病症或狀態，包括(但不限於)長期臥床、輪椅綁定、肢體固定、經由機械通氣卸載隔膜、實體器官移植、關節替換、中風、CNS損傷相關無力、脊髓損傷、自嚴重燒傷恢復、久坐慢性血液透析、創傷後恢復、敗血症後恢復及暴露至微重力(Powers等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R337-44)。
此外，脂肪比肌肉比率之年齡相關增加及年齡相關肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素有關。例如，青年組(19至35歲)、中年組(36至75歲)及老年組(76至92歲)男性及女性之平均血清肌肉生長抑制素免疫反應蛋白隨年齡增加，同時此等組之平均肌肉質量及去脂體重隨年齡下降(Yarasheski等人，J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002))。因此，患有歸因於衰老之肌肉萎縮的個體及/或因(例如)肌肉減少症而脆弱之個體亦將受益於使用本發明抗肌肉生長抑制素黏附素進行治療。
亦涵蓋藉由向食用動物投與有效劑量之抗肌肉生長抑制素黏附素來增加此等動物之肌肉質量的方法。由於成熟C端肌肉生長抑制素多肽係在所有物種中皆相同，因此預期抗肌肉生長抑制素黏附素能夠在所有農業上重要之物種(例如，但不限於，牛、雞、火雞及豬)中有效增加肌肉質量並減少脂肪。
抗肌肉生長抑制素黏附素在治療肌肉消瘦病症或肌肉萎縮中之功效可(例如)藉由量測肌肉質量或體積增加、肌肉細胞數量增加(增生)、肌肉細胞大小增加(肥大)及/或肌肉強度增加之一或多種方法來測定。例如，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之肌肉體積增加效果在下文所述之實例中得到證實。測定「肌肉質量增加」之方法係在此項技術中所熟知。例如，可在投與本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之前及之後使用標準技術來量測肌肉含量，諸如水下稱重(參見，例如，Bhasin等人，New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7)及雙重能量x射線吸光測定法(參見，例如，Bhasin等人，Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162)。可藉由增重至少約5至10%，較佳至少約10至20%或更多來證明肌肉尺寸之增加。 代謝病症
降低肌肉生長抑制素活性及/或信號傳導之本發明抗肌肉生長抑制素黏附素係適用於治療代謝病症，諸如肥胖、II型糖尿病、糖尿病相關病症、代謝症候群及高血糖症。
肌肉生長抑制素參與II型糖尿病之發病機制。肌肉生長抑制素係在脂肪組織中表現，且肌肉生長抑制素缺陷小鼠顯示隨著年齡增長而減少脂肪積累。此外，在肌肉生長抑制素缺乏之刺豚鼠致死黃色及肥胖(Lepob/ob )小鼠中，葡萄糖負荷、脂肪累積及總體重減少(Yen等人，FASEB J. 8:479, 1994；McPherron等人，2002)。如US2011/0008375中所揭示，肌肉生長抑制素拮抗劑可降低老年小鼠模型中之脂肪比肌肉比率，保持骨骼肌質量及瘦體質量，並減輕STZ誘發之糖尿病小鼠中的腎肥大。
如本文所用，「肥胖」係一種病狀，其中過量身體脂肪累積至健康可能受到不利影響之程度。通常將其定義為體重指數(BMI)為30 kg/m2或更高，此使其與由BMI為25 kg/m2或更高所定義之超重區別(參見，例如，世界衛生組織(2000) (PDF).技術報告系列894：Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Geneva: World Health Organization)。過量體重係與多種疾病相關聯，特定言之心血管疾病、II型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、特定類型之癌症及骨關節炎。
患有肥胖之個體可(例如)藉由測定BMI (BMI係藉由將個體之質量除以其身高之平方來計算)、腰圍及腰-臀比率(絕對腰圍(男性＞102 cm及女性＞88 cm)及腰-臀比率(腰圍除以臀圍，男性＞0.9及女性＞0.85)) (參見，例如，Yusuf S等人，(2004). Lancet 364: 937–52)及/或身體脂肪百分比(總身體脂肪表示為總體重百分比：身體脂肪超過25%之男性及身體脂肪超過33%之女性為肥胖；身體脂肪百分比可藉由以下公式自個體之BMI來估算：身體脂肪% = (1.2 * BMI) + (0.23 * 年齡) − 5.4 − (10.8 * 性別)，其中女性性別為0及男性為1)來識別。身體脂肪百分比量測技術包括(例如)電腦斷層(CT掃描)、磁共振成像(MRI)及雙重能量X射線吸光測定法(DEXA)。
術語「II型糖尿病」係指當身體之胰島素不能有效工作時產生之慢性終身疾病。II型糖尿病之主要組分為「胰島素抵抗」，其中由胰腺產生之胰島素不能與脂肪及肌肉細胞連接來允許內部葡萄糖產生能量，此引起高血糖症(高血糖)。為了補償，胰腺產生更多的胰島素，而感測此胰島素泛溢之細胞變得更加耐受，此導致高葡萄糖水平及通常高胰島素水準之惡性循環。
如本文所用，片語「與糖尿病相關聯之病症」或「糖尿病相關病症」係指通常與糖尿病相關聯或有關之病狀及其他疾病。與糖尿病相關聯之病症的實例包括(例如)高血糖症、高胰島素血症、高脂血症、胰島素抵抗、葡萄糖代謝受損、肥胖、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、白內障、糖尿病性腎病、腎團塊硬化症、糖尿病性神經病變、勃起功能障礙、經前症候群、血管再狹窄、潰瘍性結腸炎、冠心病、高血壓、心絞痛、心肌梗塞、中風、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍、代謝性酸中毒、關節炎及骨質疏鬆症。
抗肌肉生長抑制素黏附素在治療代謝病症中之功效可(例如)藉由量測胰島素敏感度增加、個體細胞對葡萄糖攝取增加、血糖水準降低、及身體脂肪減少之一或多種方法來測定。
例如，在患有II型糖尿病之個體或處於發展糖尿病之風險的個體中，可監測HbA1c水準。如本文所用，術語「血紅蛋白1AC」或「HbA1c」係指血紅蛋白B鏈之非酶促糖化產物。根據美國糖尿病協會(ADA)指南(即，Standards of Medical Care in Diabetes (Diabetes Care 2012;35(增刊1):S511-563))可測定糖尿病患者之HbA1c水準的所需目標範圍。糖尿病患者目前之HbA1c目標水準通常為＜7.0%，而未患有糖尿病之個體通常具有低於6%之HbA1c值。因此，本發明抗肌肉生長抑制素黏附素之功效可藉由在個體中所觀察到之HBA1c水準的降低來確定。
本發明方法進一步包括單獨或與此項技術中已知之用於血糖控制(例如，胰島素、GLP1)或用於治療技術公認之糖尿病相關併發症的其他藥劑組合投與抗肌肉生長抑制素黏附素。參引合併
本文所述之所有檔及參考文獻(包括專利檔及網站)係個別地以引用之方式併入本檔中，其引用程度如同其等係全文或部分地寫入本檔中。
現參考以下實例描述本發明，該等實例僅係說明性而不旨在限制本發明。儘管已參考其特定實施例詳細地描述本發明，但熟習此項技術者將明瞭，不脫離本發明之精神及範圍下可對其作出各種改變及改良。實例 1 A. 抗肌肉生長抑制素黏附素之表現及純化
先前已描述用於選殖、表現及純化不溶性及可溶性抗肌肉生長抑制素黏附素之方法(美國專利8,933,199；8,993,265；8,853,154；及9,493,546)。簡而言之，將編碼抗肌肉生長抑制素黏附素之核酸選殖至pET9d載體中，並在大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中表現。使用二十ml接種物培養物(產自單一接種菌落)接種含有50 μg/ml康黴素(Kanamycin)及34 μg/ml氯黴素(chloramphenicol)之1公升LB培養基或TB-過夜表現培養基(自動誘導)。在37℃下培養LB培養基中之培養物直至A600 0.6-1.0，並隨後用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘發並在30℃下生長4小時。在37℃下培育生長於TB-過夜表現培養基中之培養物5小時，此時使溫度降至18℃並生長19小時。藉由在4℃下以≥10,000 g離心30分鐘來收穫培養物。在-80℃下冷凍細胞團塊。解凍後，使用Ultra-turrax勻漿器(IKA製造)在冰上使細胞團塊重新懸浮於25 ml裂解緩衝液(20 mM NaH2 PO4 ，0.5 M NaCl，1x完全Ô蛋白酶抑制劑混合物-不含EDTA (Roche)，pH 7.4)中。使用Model M-110S微射流均質機(Microfluidics)藉由高壓均質化(≥18,000 psi)來達成細胞裂解。
對於不溶性抗肌肉生長抑制素黏附素而言，藉由在4℃下以≥23,300 g離心30分鐘來分離不溶性部分。用20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl (pH 7.4)洗滌自離心裂解液回收之不溶性團塊。在超音波處理下將團塊重新溶解於含於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl (pH 7.4)之6M胍鹽酸鹽中，其後接著在37º度下培育1至2小時。用0.45 μm過濾器過濾重新溶解之團塊並裝載至經20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/6M胍(pH 7.4)緩衝液平衡之Histrap柱上。裝載後，使用相同之緩衝液洗滌管柱另外25倍柱體積。用含於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/6 M胍-HCl (pH 7.4)之50 mM咪唑洗脫結合蛋白質。藉由用50 mM乙酸鈉/150 mM NaCl (pH 4.5)或PBS (pH 7.2)進行透析使經純化之蛋白質再摺疊。
對於可溶性抗肌肉生長抑制素而言，使用0.45 μm過濾器使上清液變澄清。將經澄清之裂解液裝載至經20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl (pH 7.4)預平衡之Histrap柱(GE)上。隨後用25倍柱體積之相同緩衝液洗滌管柱，其後接著用20倍柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/25 mM咪唑(pH 7.4)及隨後35倍柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/40 mM咪唑(pH 7.4)。用15倍柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/500 mM咪唑(pH 7.4)洗脫蛋白質，基於A280 處之吸光度收集溶離份，並用1x PBS或50 mM Tris，150 mM NaCl (pH 8.5)或50 mM NaOAc，150 mM NaCl (pH 4.5)進行透析。藉由使用0.22 μm過濾器過濾來移除沉澱物。 B. Fc- 格式之抗肌肉生長抑制素黏附素的表現及純化
為了DNA產生，將編碼所選抗肌肉生長抑制素黏附素之核酸選殖至轉化大腸桿菌Top10細胞之pDV-16質體中。pDV-16係pTT5之修飾形式(Yves Durocher, NRC Canada)，其中已引入人類IgG1-Fc編碼序列，該序列之前為信號序列，且包括限制位點以允許在Fc之兩個末端處插入黏附素編碼序列。藉由接種含有100 μg/ml安比西林之1 L Luria培養液並在37℃下在旋轉培養箱中以225 rpm培育18小時來擴增轉形細胞。藉由在4℃下以＞10000g離心30分鐘來收穫細菌團塊。如製造商方案中所述般使用QIAGEN Plasmid Plus Mega套組(QIAGEN)分離經純化之質體DNA。在使用前，使用260 nm處之吸光度量化經純化之DNA並在-80℃下冷凍。
在10 L GE Healthcare Wave袋中，在37℃，5% CO2 下將HEK 293-EBNA1 (選殖6E) (Yves Durocher, NRC Canada)細胞在2 L F17培養基中擴增至2x106 個細胞/ml，並藉由以18 rpm在8度角度下旋轉來混合。
如下製備DNA用於轉染：使F17培養基升溫至37℃。使DNA及PEI轉染試劑在無菌生物安全罩中解凍。在無菌聚丙烯培養瓶中將DNA (2.25 mg)添加至100 ml經加熱之F17培養基中並藉由打旋輕輕地混合。在另一燒瓶中，將6.75 mg PEI (1 mg/ml)與100 ml經預熱之F17培養基合併並藉由打旋輕輕地混合。允許該等燒瓶靜置5分鐘，隨後藉由將PEI溶液添加至含有DNA之燒瓶中來合併內容物並藉由打旋輕輕地混合。
在室溫下於生物安全罩中培育15分鐘後，將含有DNA:PEI混合物之燒瓶的內容物添加至含有HEK 293-6E細胞之波袋中。在37℃，5% CO2 下培育含有經轉染之HEK 293-6E細胞的袋二十四小時，並藉由以18 RPM在8度角度下旋轉來混合。24小時後，將溶於F17培養基中之100 ml經無菌過濾的20%胰化蛋白腖N1 (Organotechnie, Canada)無菌地添加至培養物中。如上所述培養另外72小時後收穫細胞及培養基。或者，在搖瓶(0.5 L培養基含於2 L燒瓶)中之短暫HEK表現可以1:2之DNA:PEI比率來進行。藉由在4℃下以6000g離心30分鐘來從改良性培養基中分離細胞。保留改良性培養基，通過0.2 μM過濾器過濾，並在4℃下儲存。
將改良性培養基以5 ml/分鐘之速率施覆至含有在PBS中預平衡之GE MabSelect Sure樹脂的10 ml層析柱中。裝載經過濾之改良性培養基後，在室溫下用至少100 ml之PBS洗滌管柱。藉由施覆100 mM甘胺酸/100 mM NaCl (pH 3.0)將經純化之產物從柱中洗脫。藉由收集至含有1/6體積之1M Tris pH 8的管中或藉由根據A280吸光度收集其後接著添加1M Tris pH 8至100 mM來中和溶離份之pH。若蛋白質A (Protein A)洗脫後高分子量物質之含量大於5%，則藉由PBS中之Superdex 200 (26/60)管柱(GE Healthcare)進一步純化樣品。收集並濃縮含有單體之SEC溶離份。在4℃下用PBS充分透析所得蛋白質A或SEC混合液，並在-80℃下冷凍之前使用0.22 μm截止濾器無菌過濾。 C. 批量製造：哺乳動物表現及初次回收： UCOE CHO 系統
藉由在CHO-S細胞中轉染選殖至含有遍在染色質開放元件(UCOE)之pUCOE載體[來自Millipore之經修飾UCOE載體]中的抗肌肉生長抑制素黏附素-Fc融合來產生哺乳動物研究細胞庫(RCB)。藉由在含有12.5 μg/mL嘌呤黴素之選擇培養基(0.04% (v/v) L-穀胺醯胺(Invitrogen)及0.01% (v/v) HT補充劑(Invitrogen)含於CD CHO培養基(Invitrogen))中擴增細胞來建立RCB。經由離心無菌分離低繼代數細胞，使其重新懸浮於儲存培養基(0.04% (v/v) L-穀胺醯胺(Invitrogen)、0.01% (v/v) HT補充劑(Invitrogen)及7.5% (v/v) DMSO含於CD CHO培養基(Invitrogen))中至1 x 107 個細胞/mL之最終濃度。最初在-80℃下70%異丙醇浴中冷凍此等細胞過夜，並隨後在第二天轉移到液氮中長期保存。
藉由將單個RCB小瓶解凍至含有12.5 μg/mL嘌呤黴素之25 mL選擇培養基中來開始細胞培養，並在相同培養基中擴增培養物。允許細胞在分離回0.2 x 106 個細胞/mL之前達到1至2 x 106 個細胞/mL之間之濃度。在接種生物反應器之前，通常將細胞維持2至4週。使擴增培養物繼代最後一次，並允許其生長至其中含有8 L生產培養基(Invitrogen CD CHO培養基，含有0.01% (v/v) HT補充劑(Invitrogen)、0.04% (v/v)格錄特邁司(Glutamax)(Gibco)及0.005% (v/v)泊洛尼克(Pluronic) F-68 (Gibco))之15 L生物反應器可以0.2 x 106 個細胞/mL之最終密度接種的程度。每天監測生物反應器培養物之VCD (活細胞密度)、百分比活力、pH及葡萄糖濃度。在第3天及第6天向生物反應器培養物提供10%總體積推注添加之飼料培養基。在第7天及第9天之間以＞70%之活力百分比收穫培養物。在培養期間中，將生物反應器培養物控制在pH為7.1，溫度為37℃，%DO2為40%，及恆定RPM為100。
在收穫當天，使生物反應器培養物直接通過6.0/3.0 μm深過濾器，其後接著無菌0.8/0.2 μm過濾至無菌袋中。在2至8℃下儲存經澄清之無菌培養物過夜。隨後經由平板TFF使用30,000 kDa膜對經澄清之培養物進行濃縮。近似濃度為6x，取決於收穫效價。隨後將經濃縮之上清液無菌過濾至PETG瓶中，並直接進行處理或在-80℃下儲存。 D. 抗肌肉生長抑制素 - 黏附素 -Fc 融合純化
將收穫之培養物上清液(純或經濃縮)裝載至預先經PBS平衡之MabSelect Protein A柱上。用5CV之50mM Tris pH8.0、1M尿素、10% PG洗滌管柱。用100 mM甘胺酸pH 3.3洗脫黏附素-Fc融合，將峰收集至預先裝有1CV之200 mM乙酸鈉pH 4.5的容器中。峰洗脫係基於A280處之吸光度。
添加2M檸檬酸將蛋白質A洗脫液稀釋至pH 3.0，並在室溫下放置1小時，用於病毒滅活。隨後用200 mM磷酸三鈉稀釋樣品直至達到pH 4.5。若需要，用水將溶液進一步稀釋至低於10 ms/cm之較低電導率。
使經稀釋之蛋白質A洗脫液以負捕獲模式通過預先經50mM乙酸鈉pH 4.5調整之Tosoh Q 600C AR (Tosoh Bioscience)。基於A280處之吸光度收集溢流(flowthrough)峰。用50mM乙酸鈉洗滌管柱並用0.2N NaOH汽提。
使用採用30kD MWCO中空纖維膜(GE)之切向流過濾來配製Q 600C AR溢流，伴隨非常溫和地混合滯留物。將黏附素-Fc融合透濾至組胺酸(20至30 mM)及雙醣(300至600 mM) pH 7.1至7.8中達5至8倍體積倍數，並隨後濃縮至目標蛋白質濃度。在-60℃下將經純化之黏附素-Fc融合的總體積以85至140 mg/mL之濃度儲存於12L FFtp袋中。隨後解凍經純化之黏附素-Fc融合蛋白並稀釋至所需蛋白質濃度用於分析。實例 2
在此研究中，對含於含有蔗糖或海藻糖糖之25 mM組胺酸緩衝液(pH 6.9)中之抗肌肉生長抑制素黏附素研究HMW%形成及%LMW形成。表 1 ： 抗肌肉生長抑制素黏附素藥品 (DP) 性質 表 2 ： 材料 表 3 ：調配物 *pH調節至7.3A. 樣品製備
對於135 mg/mL蛋白質濃度之抗肌肉生長抑制素黏附素而言，在組胺酸緩衝液中透析時觀察到-0.4 pH單位之pH偏移。為了規避此問題並能夠評估調配物在接近中性pH下之穩定性，將緩衝液pH調節至pH 7.3使所得蛋白質溶液處於pH 6.9。表 4 ：緩衝液製備
將適量固體溶於1600 L Milli-Q水中(根據表)。使用6N HCl將pH調節至pH 7.3，並將最終體積調節至2 L。通過0.22 μm過濾器過濾溶液，並將所獲得之緩衝液的最終pH顯示於表5中。表 5 ： 在使用 6N HCl 調節前後之調配物 pH 的 pH 值
用不同調配物緩衝液將四十(40) mL之50 mg/mL抗肌肉生長抑制素黏附素DP透析5個循環，包括在5℃下之一個循環。表 6 ： 在透析及濃縮後之濃度調整
將經透析之溶液濃縮至130至140 mg/mL用於各條件，並在5℃、25℃及35℃下儲存樣品。B. 結果 時間零點 (T0) 之調配物特徵
在時間零點(T0)，藉由肉眼檢查未稀釋樣品之顆粒形成來評估各調配物之外觀。無樣品顯示存在可視微粒。
將各調配物之未稀釋樣品在室溫下平衡，並使用配備Thermo Ross pHerpect pH探針或Orion 3 Star (製造商：Thermo Electron Corporation)之Thermo pH計根據製造商關於儀器校準及樣品量測之說明書(校準斜率96.5%)量測pH。如表7所示，儘管對調配物緩衝液進行pH調節，但在T0時之樣品的最終pH仍在6.4至6.6之間，此指示蛋白質在調配物中起出乎意料的重要緩衝作用。表 7 ：在 T0 時之 pH 量測
將未稀釋調配物之樣品在室溫下平衡，並使用SoloVPE按照製造商之說明書進行蛋白質濃度量測。所有濃度均在135 mg/mL之目標濃度的5%以內。結果係描述於表8中。表 8 ： T0 時量測之濃度
使用基於蒸氣之滲透壓計(製造商：Wescor；型號5520)根據製造商之說明書對各調配物之未稀釋樣品進行滲透壓量測(樣品體積10 μL)。將其他樣品在其等各自之緩衝液中稀釋至終濃度為50 mg/mL，並重複滲透壓量測。結果顯示於表9中。表 9 ：調配物緩衝液及蛋白質樣品之滲透壓量測
與相同濃度水準之蔗糖相比，海藻糖顯示最低滲透壓。相對於調配物緩衝液本身，50及135 mg/mL之樣品顯示輕微增加之滲透壓，此指示蛋白質對滲透壓之作用。然而，50與135 mg/mL樣品之間之差異很小，此表明蛋白質濃度對調配物滲透壓之作用很小。 在25℃下使用m-VROC黏度計(製造商：Rheosense) (樣品體積為500 μL)以不同流量(從30至300 μL/min)進行黏度量測。具有10%醣濃度之調配物具有比其20%對應物更低之黏度。對於在各濃度下之醣的比較而言，顯示海藻糖具有比蔗糖更低之黏度。結果顯示於表10中。表 10 ：在 25 ℃ 下 135 mg/mL 蛋白質樣品之黏度量測 隨時間變化之調配物穩定性
為了量測聚集體隨時間之形成，在多個時間點對保持於5℃、25℃及35℃下之樣品進行SE-HPLC。含有20%醣之樣品顯示比其10%對應物更低之HMW%，此指示調配物中更高之醣含量有利於抗肌肉生長抑制素黏附素DP之穩定性。出乎意料地，含有海藻糖之調配物顯示與蔗糖相比甚至更高之抗肌肉生長抑制素黏附素DP的穩定性，特定言之在更高溫度(25℃及35℃)下。(圖2及3)。 pH 之作用
在25℃及35℃下儲存2週後，在pH為6.5及7.0之蔗糖或海藻糖的存在下，檢查含有80 mg/mL抗肌肉生長抑制素黏附素之調配物的HMWS%。圖5中所示之數據指示，在兩種溫度下，pH為7.0之調配物更穩定。
另外，觀察到組胺酸緩衝液出乎意料地顯示在pH 7.0下比含有磷酸鹽緩衝液之先前調配物(數據未顯示)更佳之穩定性質(更少HMWS)。 添加螯合劑之作用
亦研究在存在及不存在Fe2+ 下添加螯合劑對調配物之作用。證實50 μM DPTA之添加進一步使調配物穩定之數據亦檢測到在室溫(曝光)或35℃下在存在及不存在Fe下＞ 20%之HMW%的降低(例如，2.8% v. 3.6%；2.8% v. 3.3%)。實例 3
此實例中以厘泊為單位量測含有來自實例2之抗人類肌肉生長抑制素拮抗劑黏附素-Fc融合二聚體的特定調配物之黏度，如下表11及圖4所示(海藻糖(tre)及蔗糖(suc)係在圖例中指出)。量測係作為蛋白質濃度與溶液溫度之函數來進行。數據指示，含有高雙醣濃度(550 mM)之調配物通常顯示適於在廣泛之抗肌肉生長抑制素黏附素濃度範圍下皮下使用之黏度。數據亦指示含有海藻糖之溶液在相同溫度及蛋白質濃度下與含有蔗糖之溶液相比黏度較低。表 11 ： 實例 4
在此實例中，在30 mM組胺酸、600 mM海藻糖、0.05 mM DPTA、0.02% PS80，pH 7.1中以多種蛋白質濃度調配實例2中所用之抗肌肉生長抑制素-Fc融合二聚體。
在1 mL注射器中以0.7 mL之體積以10.7 mg/mL、21.4 mg/mL、50 mg/mL及71.4 mg/mL之蛋白質濃度製備單位劑量(總藥品各自為7.5 mg、15 mg、35 mg及50 mg)。在各種儲存條件下水準放置儲存注射器，並在第2週及/或第1個月藉由SE-HPLC進行分析。數據提供於表12至15中(H=水準；RH=相對濕度；RL=室內光線；E=曝露；P=保護)。表 12 ： 7.5 mg/ 注射器， 1 mL 1 型玻璃注射器之穩定性數據 表 13 ： 15.0 mg/ 注射器， 1-mL 1 型玻璃注射器之穩定性數據 表 14 ： 35.0 mg/ 注射器， 1-mL 1 型玻璃注射器之穩定性數據 表 15 ： 50.0 mg/ 注射器， 1-mL 1 型玻璃注射器之穩定性數據
亦檢查此調配物之黏度。圖6中所示之數據顯示，在所有溫度及蛋白質濃度下，調配物之黏度均保持低於8 cPs。
基於有利之黏度數據，量測呈單位劑型之調配物的動態力。在5℃下，5 mg/mL、50 mg/mL及75 mg/mL單位劑量之擠出(滑動)力(0.7/mL體積含於1.0 mL注射器；27G針頭)在120 mm/min之速度下係在2.528與2.704 N之間；且在450 mm/min之速度下係在5.696與6.123 N之間。在5℃下，此等單位劑量下120 mm/min速度下之流體動力係在0.922 N與1.098 N之間，且下450 mm/min之速度下係在3.042與3.509 N之間。結論
此等結果證實，具有高於10%之雙醣濃度的調配物對抗肌肉生長抑制素黏附素分子之穩定性有顯著貢獻，同時仍保持滲透壓及黏度，此允許產生適於快速皮下投與之小體積單位劑型。
該等結果進一步顯示，抗肌肉生長抑制素黏附素之固有緩衝能力出乎意料地允許在pH 6.9至7.3下(顯著偏離緩衝液之pKa)在組胺酸緩衝液中之調配產生在生理學上穩定之pH的調配物。
此等有利特性提供在較高溫度下(例如，高於25℃、高於30℃、高於35℃或至高40℃)穩定調配物持續顯著時段，此允許其在醫療設施外進行儲存及投與。該特性係特別有利的，因為其允許患者或其照護者在家中投與藥物而無需行至醫療設施。胺基酸及核酸序列之總結 人類前原肌肉生長抑制素： MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：1)人類原肌肉生長抑制素： NENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：2)成熟肌肉生長抑制素： DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO：3)野生型人類 III 型纖維連接蛋白結構域 (10 Fn3) ： VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP ISINYRT (SEQ ID NO：4) (BC、DE及FG環加底線)抗肌肉生長抑制素黏附素 BC 環： SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO：5)抗肌肉生長抑制素黏附素 DE 環： PGRGVT (SEQ ID NO：6)抗肌肉生長抑制素黏附素 FG 環： TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO：7)抗肌肉生長抑制素黏附素核心： EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT (SEQ ID NO：8)含有 N 端 (AdNT1)( 底線 ) 及具有 His6 標記之 C 端 (AdCT1)( 斜體 ) 末端序列的抗肌肉生長抑制素黏附素核心： MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEIDKPSQ HHHHHH (SEQ ID NO：9)其前為 N 端延伸序列 (GVSDVPRDL) 且其後為 C 端尾 (EI) 之抗肌肉生長抑制素黏附素核心序列： GVSDVPRDL EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEI (SEQ ID NO：10)抗肌肉生長抑制素黏附素 Fc 融合 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESAAEAQEGELEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEI (SEQ ID NO：78) TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGAGCTGCAGCTGGAGGAAAGCGCCGCTGAGGCTCAGGAAGGAGAACTGGAAGGCGTGAGCGACGTGCCACGGGATCTAGAAGTGGTGGCTGCTACCCCCACAAGCTTGCTGATCAGCTGGTCTCTGCCGCACCAAGGTAAAGCCAATTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTCGTGGTGTTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGTTACTGATACAGGGTACCTCAAGTACAAACCAATTTCCATTAATTACCGGACCGAAATT (SEQ ID NO：82)抗肌肉生長抑制素黏附素 Fc 融合 GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：79) GGCGTGAGCGACGTGCCCCGGGATCTAGAAGTGGTGGCTGCTACCCCCACAAGCTTGCTGATCAGCTGGTCTCTGCCGCACCAAGGTAAAGCCAATTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTCGTGGTGTTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGTTACTGATACAGGGTACCTCAAGTACAAACCAATTTCCATTAATTACCGGACCGAAATTGAGCCTAAGAGCTCCGACAAAACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCCCCCGAACTGCTGGGCGGCCCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAA (SEQ ID NO：83)
圖1A描繪結合肌肉生長抑制素之二價多肽的結構。圖1B描繪該二價分子之各多肽的胺基酸序列，其中粗體指示Fc部分之胺基酸序列，底線指示連接子之胺基酸，及斜體指示10 Fn3結構域之胺基酸序列。
圖2為在10% (左圖)及20% (右圖)之醣濃度下，儲存於5℃下之調配物中的高分子物質隨時間之百分比圖示。
圖3為以下之調配物中之高分子物質的百分比圖示：在10%之醣濃度下儲存於25℃下(左上圖)；在20%之醣濃度下儲存於25℃下(右上圖)；在10%之醣濃度下儲存於35℃下(左下圖)；在20%之醣濃度下儲存於35℃下(右下圖)。
圖4為在不同溫度下含有不同濃度之蔗糖或海藻糖之調配物的黏度圖示。
圖5為在蔗糖或海藻糖之存在下，在25℃及35℃下，在pH 6.5或pH 7.0下儲存2週後，高分子物質之百分比圖示。
圖6為含有30 mM組胺酸、600 mM海藻糖二水合物、0.05 mM DTPA、0.02% PS80，pH 7.1之調配物中黏度相對蛋白質濃度之圖示。

Claims (39)

  1. 一種穩定醫藥調配物，其包含：(i)在約10 mg/mL與200 mg/mL之間之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；(ii)濃度在約10%與30%之間之海藻糖；(iii)濃度在約20與約60mM之間之組胺酸緩衝液；及(iv)醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物具有約6.5至約7.8之pH範圍。
  2. 如請求項1之調配物，其中該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素多肽之濃度係在約10 mg/mL與150 mg/mL之間。
  3. 如請求項2之調配物，其中該調配物中之該抗肌肉生長抑制素黏附素多肽之濃度係在約10 mg/mL與85 mg/mL之間。
  4. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該海藻糖係以多肽比糖為至少5:1之重量比(w/w)存在。
  5. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該海藻糖之濃度為約150 mM至約800 mM。
  6. 如請求項5之調配物，其中該海藻糖之濃度為約300 mM至約700 mM。
  7. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該調配物包含約15%至約25%海藻糖。
  8. 如請求項7之調配物，其中該調配物包含約20%至約25%海藻糖。
  9. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該海藻糖為海藻糖二水合物，且該調配物中之該海藻糖二水合物之濃度為約150 mM至約800 mM。
  10. 如請求項9之調配物，其中該海藻糖二水合物之濃度為約300至約700 mM。
  11. 如請求項9之調配物，其中該海藻糖二水合物之濃度為約150 mM、約200 mM、約250 mM、約300 mM、約350 mM、約400 mM、約450 mM、約500 mM、約550 mM、約575 mM、約600、約625 mM、約650 mM、約675 mM或約700 mM。
  12. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該組胺酸係以至少20 mM之濃度存在。
  13. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該調配物之黏度係自約5至20 cps。
  14. 如請求項13之調配物，其中該調配物之黏度係自約5至15 cps。
  15. 如請求項13之調配物，其中該調配物之黏度係自約7至12 cps。
  16. 如請求項1至3中任一項之調配物，其中該pH為約6.6至7.6。
  17. 如請求項16之調配物，其中該pH為約6.8至7.4。
  18. 如請求項16之調配物，其中該pH為約7.0至7.3。
  19. 如請求項1至3中任一項之調配物，其包含濃度在約0.01%與0.05%之間之介面活性劑。
  20. 如請求項1至3中任一項之調配物，其包含螯合劑，其中該螯合劑之濃度係在約0.01 mM與約0.5 mM之間，及其中該螯合劑係選自由DPTA、EDTA及EGTA所組成之群。
  21. 如請求項20之調配物，其中該螯合劑之濃度係在約0.05 mM與0.2 mM之間。
  22. 一種穩定醫藥調配物，其包含：(a)  約10至 140 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約5至25%之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(b)  約10至140 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約5至25%之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(c)  約10至140 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；25至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約7.0至7.3；(d)  約10至140 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；25至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之pH值為約7.0至7.3；(e)  約10至75 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約5至25%之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(f)  約10至75 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約5至25%之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；或(g)  約10至75 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；約30 mM之組胺酸；約0.05 mM之DTPA；約0.02%之聚山梨醇酯80；醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約7.1。
  23. 一種單位劑型之醫藥組合物，其中該單位劑型包含1.0 mL或更少之調配物，該調配物包含：(i)約10至75 mg/mL之結合至肌肉生長抑制素之多肽，該多肽包含III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域，其中該10Fn3結構域包含SEQ ID NO：78；(ii)約5至25%之海藻糖二水合物；(iii)約20至30 mM之組胺酸；(iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；(v)約0.01至0.05%之聚山梨醇酯80；及(vi)醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  24. 一種如請求項1至22中任一項之醫藥調配物或如請求項23之醫藥組合物之用途，其係用於製備減弱或抑制個體中肌肉生長抑制素相關疾病或病症之醫藥品，其中該肌肉生長抑制素相關疾病或病症係肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、貝克氏肌肉營養不良(Becker's Muscular Dystrophy，BMD)、脊髓性肌肉萎縮症、杜興氏肌肉營養不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)、肌肉減少症或II型糖尿病。
  25. 如請求項24之用途，其中該醫藥品係用於投與約5 mg至200 mg之劑量之劑量的該結合至肌肉生長抑制素之III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域之多肽。
  26. 如請求項25之用途，其中該醫藥品係用於投與約5 mg至50 mg之劑量的該結合至肌肉生長抑制素之III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域之多肽。
  27. 如請求項25之用途，其中該醫藥品係用於投與約7.5 mg、約15 mg、約35 mg或約50 mg之劑量的該結合至肌肉生長抑制素之III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域之多肽。
  28. 如請求項25之用途，其中該醫藥品係用於投與少於約45 kg之兒科患者約7.5 mg至約35 mg之劑量的該結合至肌肉生長抑制素之III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域之多肽，或投與多於約45 kg之個體約15 mg至約50 mg之劑量的該結合至肌肉生長抑制素之III型纖維連接蛋白第十(10Fn3)結構域之多肽。
  29. 一種穩定醫藥調配物，其包含：(a)  約10至 140 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約5至25% (w/v)之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(b)  約10至140 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約5至25% (w/v)之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05% (w/v)之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(c)  約10至140 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；25至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約7.0至7.3；(d)  約10至140 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；25至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05% (w/v)之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之pH值為約7.0至7.3；(e)  約10至75 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約5至25% (w/v)之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；(f)  約10至75 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約5至25% (w/v)之海藻糖二水合物；約20至30 mM之組胺酸；約0.02至0.06 mM之DTPA；約0.01至0.05% (w/v)之聚山梨醇酯80；及醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3；或(g)  約10至75 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；約600 mM之海藻糖二水合物；約30 mM之組胺酸；約0.05 mM之DTPA；約0.02% (w/v)之聚山梨醇酯80；醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約7.1。
  30. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 10.7 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 20至25% (w/v)之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  31. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 21.4 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 20至25% (w/v)之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  32. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 50 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 20至25% (w/v)之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；及(d) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  33. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 71.4 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 20至25% (w/v)之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  34. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 10.7 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 600 mM之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  35. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 21.4 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 600 mM之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  36. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 50 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 600 mM之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  37. 如請求項29之醫藥調配物，其包含：(a) 71.4 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(b) 600 mM之海藻糖二水合物；(c) 20至30 mM之組胺酸；(d) 0.05 mM之DTPA；及(e) 醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  38. 一種單位劑型之醫藥組合物，其中該單位劑型包含1.0 mL或更少之調配物，該調配物包含：(i)約10至75 mg/mL之多肽，該多肽包含SEQ ID NO：78；(ii)約5至25% (w/v)之海藻糖二水合物；(iii)約20至30 mM之組胺酸；(iv)約0.02至0.06 mM之DTPA；(v)約0.01至0.05% (w/v)之聚山梨醇酯80；及(vi)醫藥上可接受之水性載劑，其中該調配物之該pH值為約6.8至7.3。
  39. 一種如請求項29至37中任一項之醫藥調配物或如請求項38之醫藥組合物之用途，其係用於製備減弱或抑制個體中肌肉生長抑制素相關疾病或病症之醫藥品，其中該肌肉生長抑制素相關疾病或病症係肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、貝克氏肌肉營養不良(Becker's Muscular Dystrophy，BMD)、脊髓性肌肉萎縮症、杜興氏肌肉營養不良(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)、肌肉減少症或II型糖尿病。
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