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ES2562499T3 - Modulación de la expresión de HSP47 - Google Patents

Modulación de la expresión de HSP47 Download PDF

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ES2562499T3
ES2562499T3 ES10836656.8T ES10836656T ES2562499T3 ES 2562499 T3 ES2562499 T3 ES 2562499T3 ES 10836656 T ES10836656 T ES 10836656T ES 2562499 T3 ES2562499 T3 ES 2562499T3
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ES
Spain
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nucleic acid
nucleotide
seq
modified
nucleotides
Prior art date
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Active
Application number
ES10836656.8T
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English (en)
Inventor
Xiaomei Jin
Lei Yu
Hirokazu Takahashi
Yasunobu Tanaka
Yoshiro Niitsu
Elena Feinstein
Sharon Avkin-Nachum
Hagar Kalinski
Igor Mett
Shai Erlich
Elizabeth C. Squiers
Ning Chen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Denko Corp
Original Assignee
Nitto Denko Corp
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Publication date
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico bicatenaria que tiene la estructura (A2) expuesta a continuación: (A2) 5' N1-(N)x- Z 3' (hebra anticodificante) 3' Z'-N2-(N')y-z" 5' (hebra codificante) en la que cada uno de N2, N y N' es un ribonucleótido no modificado o modificado o un resto no convencional; en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleótido en que cada N o N' consecutivo está unido al N o N' adyacente por un enlace covalente; en la que cada uno de x e y es independientemente un entero entre 17 y 39; en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x y (N)x tiene complementariedad con una secuencia consecutiva en un ARNm de hsp47 (SEQ ID NO: 1); en la que N1 está unido covalentemente a (N)x y está desapareado con el ARNm de hsp47 o es un resto de ADN complementario del ARNm de hsp47; en la que N1 es un resto seleccionado del grupo consistente en uridina, desoxirribouridina, ribotimidina, desoxirribotimidina, adenosina o desoxiadenosina naturales o modificadas; en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si está presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y; en la que cada uno de Z y Z' está independientemente presente o ausente, pero si está presente es independientemente 1-5 nucleótidos consecutivos, restos no nucleotídicos consecutivos o una combinación de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que está presente; y en la que la hebra anticodificante comprende una secuencia anticodificante de SEQ ID NO: 127.

Description

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DESCRIPCION
Modulacion de la expresion de HSP47 SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de EE.UU. n° de serie 61/372.072, presentada el 9 de agosto de 2010, 61/307.412, presentada el 23 de febrero de 2010 y 61/285.149, presentada el 9 de diciembre de 2009, tituladas cada una “Modulacion de la expresion de HSP47”.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se titula 220-PCT1_ST25_07-Dec-10.txt, estando creada dicha copia ASCII el 7 de diciembre de 2010 y teniendo 533 kb de tamano.
CAMPO DE LA INVENCION
Se proporcionan en la presente memoria composiciones y procedimientos para modular la expresion de hsp47. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Sato, Y., et al. dan a conocer la administracion de liposomas acoplados a vitamina A para suministrar ARN interferente pequeno (ARNip) contra gp46, el homologo de rata de la protema de choque termico 47 humana, en modelos animales en rata de cirrosis hepatica. Sato, Y., et al., Nature Biotechnology, vol. 26 (4), pag. 431-442 (2008).
Chen, J-J., et al. dan a conocer la transfeccion de muestras de queloides humanos con ARNhp de HSP47 (ARN de horquilla pequeno) para examinar la proliferacion de fibroblastos de queloides. Chen, J-J., et al., British Journal of Dermatology, vol. 156, pag. 1188-1195 (2007).
La publicacion de patente PCT n° WO 2006/068232 da a conocer un portador farmacologico espedfico de astrocitos que incluye un derivado retinoide y/o un analogo de vitamina A.
La actual invencion se define, entre otros, mediante los siguientes apartados:
1. Una molecula de acido nucleico bicatenaria que tiene la estructura (A2) expuesta a continuacion:
(A2) 5' N1-(N)x- Z 3' (hebra anticodificante)
3' Z'-N2-(N')y-z" 5' (hebra codificante)
en la que cada uno de N2, N y N' es un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional; en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleotido en que cada N o N' consecutivo esta unido al N o N' adyacente por un enlace covalente;
en la que cada uno de x e y es independientemente un entero entre 17 y 39;
en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x y (N)x tiene complementariedad con una secuencia consecutiva en un ARNm de hsp47 (SEQ ID NO: 1);
en la que N1 esta unido covalentemente a (N)x y esta desapareado con el ARNm de hsp47 o es un resto de ADN complementario del ARNm de hsp47;
en la que N1 es un resto seleccionado del grupo consistente en uridina, desoxirribouridina, ribotimidina, desoxirribotimidina, adenosina o desoxiadenosina naturales o modificadas;
en la que z” puede estar presente o ausente, pero si esta presentes es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 nucleotidos consecutivos, restos no nucleotidicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y en la que la hebra anticodificante comprende una secuencia anticodificante de SEQ ID NO: 127.
2. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 1, en la que x= y= 18.
3. La molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de los apartados 1-2, en la que la hebra codificante y la hebra no codificante son el oligonucleotido descrito como SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127).
La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 3, que tiene la estructura
(hebra anticodificante de SEQ ID NO: 127)
UAUAGCACCCAUGUGUCUC -Z 3'
ill
III
Z'-AUAUCGUGGGUACACAGAG - z'
(hebra codificante de SEQ ID NO: 60)
5
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en la que cada “|” representa un apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G y U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 nucleotidos o restos no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de la hebra codificante.
5. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 1, en la que la hebra codificante comprende adicionalmente Z' y en la que Z' incluye opcionalmente un resto C3OH o un resto C3Pi.
6. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 5, en la que cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos alquilo ligados covalentemente con el extremo 3' de la hebra anticodificante o la hebra codificante a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato y ligados covalentemente entre sf a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato, y en la que opcionalmente Z' y/o Z' es C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH.
7. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 3, en la que x= y= 18 y N1-(N)x comprende ribonucleotidos modificados con 2'-O-metil-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5,9, 11, 13, 15 y 17.
8. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 4, en la que la hebra anticodificante comprende una o mas pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'-OMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' en posicion 5, 6, 7 u 8, y un saliente nucleotidico o no nucleotfdico 3'-terminal.
9. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 4, en la que la hebra codificante comprende 4 o 5 nucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3'-terminal o penultima; un resto nucleotidico o no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'.
10. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 4, en la que z'' esta presente y comprende un resto
de caperuza conectado covalente con el extremo 5' de la hebra codificante, en la que el resto de caperuza se selecciona opcionalmente del grupo consistente en un resto de ribosa abasico, un resto de ribosa abasico invertido, un resto de desoxirribosa abasico invertido, un resto de desoxirribosa abasico y modificaciones de los mismos; C6- imino-Pi; un nucleotido espejo; 5'-OMe-nucleotido; 4',5'-metilenonucleotido; 1-(P-D-eritrofuranosil)nucleotido; 4'- tionucleotido, nucleotido carbodclico; fosfato de 5'-aminoalquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3- aminopropilo, fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo, 1,5- anhidrohexitolnucleotido; a-nucleotido; treopentofuranosilnucleotido; 3',4'-seconucleotido adclico; 3,4-
dihidroxibutilnucleotido; 3,5-dihidroxipentilnucleotido, resto abasico invertido 5'-5'; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino y restos metilfosfonato y 5'-mercapto de puente y no de puente.
11. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 1, en la que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'oMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' en al menos una de las posiciones 1, 5, 6 o 7 y un resto no nucleotfdico 3'-terminal conectado covalentemente con el extremo 3', y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye al menos un ribonucleotido 2'-5' o ribonucleotido modificado con 2'OMe, un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'.
12. La molecula de acido nucleico bicatenaria del apartado 4, en la que la hebra anticodificante comprende ribonucleotidos modificados con 2'-O-metil-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'5' en posicion (5'>3') 7 y un resto no nucieotidico C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3', y en la que la hebra codificante comprende 5 ribonucleotidos 2'5' consecutivos en las posiciones 3'- terminales (5'>3') 15, 16, 17, 18 y 19, un resto no nucleotidico C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
13. La molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de los apartados 1-12 para uso en el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad asociada a hsp47, en la que dicha enfermedad comprende opcionalmente fibrosis.
14. Una composicion que comprende la molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de los apartados 1-12 y un portador farmaceuticamente aceptable.
SUMARIO DE LA INVENCION
Se proporcionan en la presente memoria composiciones, procedimientos y kits para modular la expresion de genes diana. En diversos aspectos y realizaciones, las composiciones, procedimientos y kits proporcionados en la presente memoria modulan la expresion de la protema de choque termico 47 (hsp47), tambien conocida como SERPINH1. Las composiciones, procedimientos y kits pueden implicar el uso de moleculas de acido nucleico (por ejemplo, acido
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nucleico interferente corto (ANic), ARN interferente corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), microARN (miRNA) o ARN de horquilla corto (ARNhc)) que se unen a una secuencia nucleotfdica (tal como una secuencia de ARNm) que codifica hsp47, por ejemplo la secuencia de codificacion por ARNm de hsp47 humana ejemplificada por la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones, procedimientos y kits dados a conocer en la presente memoria inhiben la expresion de hsp47. Por ejemplo, se proporcionan moleculas de ANic (p.ej., moleculas de ANbc de longitud de RISC o moleculas de ANbc de longitud de Dicer) que reducen o inhiben la expresion de hsp47. Se proporcionan tambien composiciones, procedimientos y kits para tratar y/o prevenir enfermedades, afecciones o trastornos asociados a hsp47, tales como fibrosis qmstica, cirrosis, fibrosis pulmonar incluyendo fibrosis de pulmon (incluyendo FPI), fibrosis renal resultante de cualquier afeccion (p.ej., ERC incluyendo ERET), fibrosis peritoneal, dano hepatico cronico, fibrillogenesis, enfermedades fibroticas en otros organos, cicatrizacion anormal (queloides) asociada a todos los posibles tipos de lesion cutanea accidental y yatrogenica (por operaciones); escleroderma, cardiofibrosis, fracaso de operacion de filtracion de glaucoma y adhesiones intestinales.
En un aspecto, se proporcionan moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) en que (a) la molecula de acido nucleico incluye una hebra codificante y una hebra anticodificante; (b) cada hebra de la molecula de acido nucleico es independientemente de 15 a 49 nucleotidos de longitud; (c) una secuencia de 15 a 49 nucleotidos de la hebra anticodificante es complementaria de un ARNm que codifica hsp47 humana (p.ej., SEQ ID NO: 1) y (d) una secuencia de 15 a 49 nucleotidos de la hebra codificante es complementaria de una secuencia de la hebra anticodificante e incluye una secuencia de 15 a 49 nucleotidos de un ARNm que codifica hsp47 humana (p.ej., SEQ ID NO: 1).
En ciertas realizaciones, la secuencia de la hebra anticodificante que es complementaria de una secuencia de un ARNm que codifica hsp47 humana incluye una secuencia complementaria de una secuencia entre los nucleotidos 600-800 o 801-899 o 900-1000 o 1001-1300 de SEQ ID NO: 1; o entre los nucleotidos 650-730 o 900-975 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante incluye una secuencia que es complementaria de una secuencia de un ARNm que codifica hsp47 humana correspondiente a los nucleotidos 674-693 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 698-716 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 698-722 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 701-720 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 920-939 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 963-982 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 947-972 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 948-966 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma; o a los nucleotidos 945-969 de SEQ ID NO: 1 o una porcion del a misma o a los nucleotidos 945-963 de SEQ ID NO: 1 o una porcion de la misma.
En ciertas realizaciones, la hebra anticodificante de la molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 4 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 6 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 8 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 10 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 12 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 14 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 16 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 18 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 20 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 22 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 24 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 26 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 28 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 30 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 32 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 34 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 36 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 38 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 40 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 42 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 44 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 46 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 48 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 50 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 52 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 54 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 56 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 58 o una porcion de la misma. En ciertas realizaciones, la hebra codificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 3 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 5 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 7 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 9 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 11 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 13 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 15 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 17 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 19 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 21 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 23 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 25 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 27 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 29 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 31 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 33 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 35 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 37 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 39 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 41 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 43 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 45 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 47 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 49 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 51 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 53 o una porcion de la misma; o la SEQ ID NO: 55 o una porcion de la misma o la SEQ ID NO: 57 o una porcion de la misma.
En ciertas realizaciones preferidas, la hebra anticodificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias anticodificantes mostradas en la Tabla A-19. En ciertas realizaciones preferidas, la hebra anticodificante y la hebra se seleccionan de los pares de secuencias mostrados en la Tabla A-19. En algunas
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realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 y SERPINH1_88. En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 y 220), SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 y 221), SERPINH1_30 (SEQ ID NO: 199 y 224) y SERPINH1_58 (SEQ ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluyen los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 y 220). En algunas realizaciones de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, se incluyen las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 y 221). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluyen los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_30 (SEQ ID NO: 199 y 224). En algunas realizaciones de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, se incluyen las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencia expuestos en SERPINH1_58 (SEQ ID NO: 208 y 233).
En ciertas realizaciones, la hebra anticodificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias anticodificantes mostradas en una cualquiera de las Tablas B o C.
En ciertas realizaciones preferidas, la hebra anticodificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias anticodificantes mostradas en la Tabla A-18. En ciertas realizaciones preferidas, la hebra anticodificante y la hebra se seleccionan de los pares de secuencias mostrados en la Tabla A-18. En algunas realizaciones de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, se incluyen las hebras anticodificante y codificante seleccionadas de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130), SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 y 135), SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 y 136), SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 y 164), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168), SERPINH1_52 (SEQ ID NO: 102 y 169) o SERPINH1_86 (SEQ ID NO: 123 y 190). En algunas realizaciones preferidas, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130). SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165) y SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168).
En algunas realizaciones preferidas de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, se incluyen las hebras anticodificante y codificante seleccionadas de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante incluyen los pares de secuencia expuestos en SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130). En algunas realizaciones de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, se incluyen las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 y 135). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 y 136). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 y 164). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERpINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168).
En ciertas realizaciones, la hebra anticodificante de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se da a conocer en la presente memoria incluye una secuencia correspondiente a una cualquiera de las secuencias anticodificantes mostradas en una cualquiera de las Tablas D o E.
En diversas realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la hebra anticodificante puede ser de 15 a 49 nucleotidos de longitud (p.ej., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49
nucleotidos de longitud); o de 17-35 nucleotidos de longitud; o de 17-30 nucleotidos de longitud; o de 15-25
nucleotidos de longitud; o de 18-25 nucleotidos de longitud; o de 18-23 nucleotidos de longitud; o de 19-21
nucleotidos de longitud; o de 25-30 nucleotidos de longitud; o de 26-28 nucleotidos de longitud. En algunas
realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la hebra anticodificante puede ser de 19 nucleotidos de longitud. De forma similar, la hebra codificante de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria puede ser de 15 a 49 nucleotidos de longitud (p.ej., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleotidos de longitud); o de 17-35 nucleotidos de longitud; o de 17-30 nucleotidos de longitud; o de 15-25 nucleotidos de longitud; o de 18-25 nucleotidos de longitud; o de 18-23 nucleotidos de longitud; o de 19-21 nucleotidos de longitud; o de 25-30 nucleotidos de longitud; o de 26-28 nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la hebra codificante puede ser de 19 nucleotidos de longitud. En algunas
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realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la hebra anticodificante y la hebra codificante pueden ser de 19 nucleotidos de longitud. La region de duplex de las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria puede ser de 15-49 nucleotidos de longitud (p.ej., aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleotidos de longitud), 15-35 nucleotidos de longitud; o 15-30 nucleotidos de longitud; o de aproximadamente 15-25 nucleotidos de longitud; o 1725 nucleotidos de longitud; o 17-23 nucleotidos de longitud; o 17-21 nucleotidos de longitud; o 25-30 nucleotidos de longitud o 25-28 nucleotidos de longitud. En diversas realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la region de duplex puede ser 19 nucleotidos de longitud.
En ciertas realizaciones, las hebras codificante y anticodificante de un acido nucleico (p.ej., una molecula de acido nucleico de ANic) como se proporciona en la presente memoria son hebras polinucleotidicas separadas. En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante separadas forman una estructura bicatenaria mediante enlace de hidrogeno, por ejemplo apareamiento de bases de Watson-Crick. En algunas realizaciones, las hebras codificante y anticodificante son dos hebras separadas que se ligan covalentemente entre sr En otras realizaciones, las hebras codificante y anticodificante son parte de una sola hebra polinucleotfdica que tiene tanto una region codificante como anticodificante; en algunas realizaciones preferidas, la hebra polinucleotidica tiene estructura de horquilla.
En ciertas realizaciones, la molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) es una molecula de acido nucleico bicatenaria (ANbc) que es simetrica con respecto a los salientes y tiene un extremo romo en ambos extremos. En otras realizaciones, la molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) es una molecula de ANbc que es simetrica con respecto a los salientes y tiene un saliente en ambos extremos de la molecula de ANbc; preferiblemente la molecula tiene salientes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleotidos; preferiblemente la molecula tiene salientes de 2 nucleotidos. En algunas realizaciones, los salientes son salientes 5'; en realizaciones alternativas, los salientes son salientes 3'. En ciertas realizaciones, los nucleotidos del saliente se modifican con modificaciones como se dan a conocer en la presente memoria. En algunas realizaciones, los nucleotidos de saliente son 2'- desoxinucleotidos.
En ciertas realizaciones preferidas, la molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) es una molecula de ANbc que es asimetrica con respecto a los salientes y tiene un extremo romo en un extremo de la molecula y un saliente en el otro extremo de la molecula. En ciertas realizaciones, el saliente es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleotidos; preferiblemente el saliente es de 2 nucleotidos. En algunas realizaciones preferidas, una molecula de ANbc asimetrica tiene un saliente 3' (por ejemplo, un saliente 3' de 2 nucleotidos) en un lado de un duplex que aparece en la hebra codificante y un extremo romo en el otro lado de la molecula. En algunas realizaciones preferidas, la molecula de ANbc asimetrica tiene un saliente 5' (por ejemplo, un saliente 5' de 2 nucleotidos) en un lado de un duplex que aparece en la hebra codificante y un extremo romo en el otro lado de la molecula. En otras realizaciones preferidas, una molecula de ADNbc asimetrica tiene un saliente 3' (por ejemplo, un saliente 3' de 2 nucleotidos) en un lado de un duplex que aparece en la hebra anticodificante y un extremo romo en el otro lado de la molecula. En algunas realizaciones preferidas, una molecula de ADNbc asimetrica tiene un saliente 5' (por ejemplo, un saliente 5' de 2 nucleotidos) en un lado de un duplex que aparece en la hebra anticodificante y un extremo romo en el otro lado de la molecula. En ciertas realizaciones preferidas, los salientes son 2'-desoxinucleotidos.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) tiene una estructura de horquilla (que tiene la hebra codificante y hebra anticodificante en un polinucleotido) con una estructura de bucle en un extremo y un extremo romo en el otro extremo. En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico tiene una estructura de horquilla con una estructura de bucle en un extremo y un extremo saliente en el otro extremo (por ejemplo, un saliente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleotidos); en ciertas realizaciones, el saliente es un saliente 3'; en ciertas realizaciones, el saliente es un saliente 5'; en ciertas realizaciones, el saliente esta en la hebra codificante; en ciertas realizaciones, el saliente esta en la hebra anticodificante.
En algunas realizaciones preferidas, la molecula de acido nucleico se selecciona de las moleculas de acido nucleico mostradas en la Tabla I.
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) dadas a conocer en la presente memoria pueden incluir una o mas modificaciones o nucleotidos modificados tales como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) como se proporciona en la presente memoria puede incluir un nucleotido modificado que tiene un azucar modificado; un nucleotido modificado que tiene una nucleobase modificada o un nucleotido modificado que tiene un grupo fosfato modificado. De forma similar, una molecula de acido nucleico (p.ej., molecula de ANic) como se proporciona en la presente memoria puede incluir un esqueleto de fosfodiester modificado y/o puede incluir un grupo fosfato terminal modificado.
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan pueden tener uno o mas nucleotidos que incluyen un resto de azucar modificado, por ejemplo como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones preferidas, el resto de azucar modificado se selecciona del grupo consistente en 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxilo, 2'-desoxilo, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4'-tio, puente 4'-(CH2)2-O-2', acido nucleico 2'-bloqueado y 2'-O-(N-metilcarbamato).
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Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan pueden tener una o mas nucleobases modificadas, por ejemplo como se describe en la presente memoria, que pueden ser preferiblemente una seleccionada del grupo consistente en xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alqmlicos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alqmlicos de adenina y guanina, 5-halogenouracilo y - citosina, 5-propiniluracilo y -citosina, 6-azouracilo, -citosina y -timina, 5-uracilo (seudouracilo), 4-tiouracilo, 8- halogeno-, -amino-, -tiol-, -tioalquil-, -hidroxil- y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y aciclonucleotidos.
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan pueden tener una o mas modificaciones del esqueleto fosfodiester, por ejemplo como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones preferidas, el enlace fosfodiester se modifica sustituyendo el enlace fosfodiester por un fosforotioato, 3'-(o -5')-desoxi-3'-(o -5')-tiofosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleniatos, 3'-(o -5')-desoxifosfinatos, boranofosfatos, 3'-(o -5')-desoxi-3'-(o -5'-)aminofosforamidatos, hidrogenofosfonatos, esteres de boranofosfato, fosforamidatos, alquil- o arilfosfonatos y fosfotriester o ligamientos de fosforo.
En diversas realizaciones, las moleculas de acido nucleico proporcionadas (p.ej., moleculas de ANic) pueden incluir una o mas modificaciones en la hebra codificante pero no en la hebra anticodificante. En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico proporcionadas (p.ej., moleculas de ANic) incluyen una o mas modificaciones en la hebra anticodificante pero no en la hebra codificante. En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico proporcionadas (p.ej., moleculas de ANic) incluyen una o mas modificaciones tanto en la hebra codificante como la hebra no codificante.
En algunas realizaciones en que las moleculas de acido nucleico proporcionadas (p.ej., moleculas de ANic) tienen modificaciones, la hebra codificante incluye un patron de nucleotidos modificados y no modificados alternados y/o la hebra anticodificante incluye un patron de nucleotidos modificados y no modificados alternados; en algunas versiones preferidas de dichas realizaciones, la modificacion es un resto de 2'-O-metil- (2'-metoxi-o 2'OMe)-azucar. El patron de nucleotidos modificados y no modificados alternados puede empezar con un nucleotido modificado en el extremo 5' o el extremo 3' de una de las hebras; por ejemplo el patron de nucleotidos modificados y no modificados alternados puede empezar con un nucleotido modificado en el extremo 5 o extremo 3' de la hebra codificante y/o el patron de nucleotidos modificados y no modificados alternados puede empezar con un nucleotido modificado en el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra anticodificante. Cuando las dos hebras anticodificante y codificante incluyen un patron de nucleotidos modificados alternados, el patron de nucleotidos modificados puede configurarse de tal modo que los nucleotidos modificados en la hebra codificante esten enfrente de los nucleotidos modificados en la hebra anticodificante, o puede haber un desplazamiento de fase en el patron de tal modo que los nucleotidos modificados de la hebra codificante esten enfrente de los nucleotidos no modificados en la hebra anticodificante y viceversa.
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan en la presente memoria pueden incluir 1-3 (concretamente 1,2 o 3) desoxinucleotidos en el extremo 3' de la hebra codificante y/o anticodificante.
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan en la presente memoria pueden incluir un grupo fosfato en el extremo 5' de la hebra codificante y/o anticodificante.
En un aspecto, se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias que tienen la estructura (A1):
(A1) 5' (N)x-Z 3' (hebra anticodificante)
3' Z'-(N')y-z" 5' (hebra codificante)
en la que cada uno de N y N' es un nucleotido que puede estar no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleotido en que cada N o N' consecutivo esta unido al siguiente N o N' por un enlace covalente;
en la que cada Z y Z' esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente incluye independientemente 1-5 nucleotidos o restos no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente;
en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de (N')y;
en la que cada uno de x e y es independientemente un entero entre 18 y 40;
en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x; y en la que (N)x incluye una secuencia anticodificante de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, (N)x incluye un oligonucleotido anticodificante presente en la Tabla A-19. En otras realizaciones, (N)x se selecciona de un oligonucleotido anticodificante presente en las Tablas B o C.
En algunas realizaciones, el enlace covalente que une cada N o N' consecutivo es un enlace fosfodiester.
En algunas realizaciones, x= y cada uno de x e y es 19, 20, 21, 22 o 23. En diversas realizaciones, x= y= 19.
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En algunas realizaciones de moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se da a conocer en la presente memoria, la molecula de acido nucleico bicatenaria es un ARNic, ANic o miARN.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 y 220), SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 y 221), SERPINH1_30 (SEQ ID NO: 199 y 224) y SERPINH1_58 (SEQ ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 y 220). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 y 221). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_30 (SEQ ID NO: 199 y 224). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_58 (SEQ ID NO: 208 y 233).
En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico bicatenarias comprenden un resto de ADN o un desapareamiento con la diana en posicion 1 de la hebra anticodificante (extremo 5'). Dicha estructura se describe en la presente memoria. Segun una realizacion, se proporcionan moleculas de acido nucleico modificadas que tienen la estructura (A2) expuesta a continuacion:
(A2) 5' N1-(N)x-Z 3' (hebra anticodificante)
3' Z'-N2-(N')y-z" 5' (hebra codificante)
en la que cada uno de N2, N y N' es un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional; en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleotido en que cada N o N' consecutivo esta unido al N o N' adyacente por un enlace covalente;
en la que cada uno de x e y es independientemente un entero entre 17 y 39;
en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x y (N)x tiene complementariedad con una secuencia consecutiva en un ARN diana;
en la que N1 esta unido covalentemente a (N)x y esta desapareado con el ARN diana o es un resto de ADN complementario del ARN diana;
en la que N1 es un resto seleccionado del grupo consistente en uridina, desoxirribouridina, ribotimidina, desoxirribotimidina, adenosina o desoxiadenosina naturales o modificadas;
en la que z” puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y; y
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero sin esta presente es independientemente 1-5 nucleotidos consecutivos, restos no nucleotidicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3’ de la hebra en que esta presente.
En algunas realizaciones, la secuencia de (N')y es totalmente complementaria de la secuencia de (N)x. En diversas realizaciones, la secuencia de N2-(N')y es complementaria de la secuencia de N1-(N)x. En algunas realizaciones, (N)x comprende una anticodificante que es totalmente complementaria de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleotidos consecutivos en un ARN diana. En otras realizaciones, (N)x comprende una anticodificante que es sustancialmente complementaria de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleotidos consecutivos en un ARN diana.
En algunas realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases de Watson-Crick. En algunas realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases no de Watson-Crick. En algunas realizaciones, el par de bases se forma entre un ribonucleotido y un desoxirribonucleotido.
En algunas realizaciones, x= y= 18, x= y= 19 o x= y= 20. En realizaciones preferidas, x= y= 18. Cuando x= 18 en N1- (N)x, N1 hace referencia a la posicion 1 y las posiciones 2-19 estan incluidas en (N)18. Cuando y= 18 en N2-(N')y, N2 hace referencia a la posicion 19 y las posiciones 1-18 estan incluidas en (N')18.
En algunas realizaciones, N1 esta unido covalentemente a (N)x y esta desapareado con el ARN diana. En diversas realizaciones, N1 esta unido covalentemente a (N)x y es un resto de ADN complementario del ARN diana.
En algunas realizaciones, se sustituye una uridina en posicion 1 de la hebra anticodificante por un N1 seleccionado de adenosina, desoxiadenosina, desoxiuridina (dU), ribotimidina o desoxitimidina. En diversas realizaciones, N1 se selecciona de adenosina, desoxiadenosina o desoxiuridina.
En algunas realizaciones, se sustituye una guanosina en posicion 1 de la hebra anticodificante por un N1 seleccionado de adenosina, desoxiadenosina, uridina, desoxiuridina, ribotimidina o desoxitimidina. En diversas realizaciones, N1 se selecciona de adenosina, desoxiadenosina, uridina o desoxiuridina.
En algunas realizaciones, se sustituye una citidina en posicion 1 de la hebra anticodificante por un N1 seleccionado de adenosina, desoxiadenosina, uridina, desoxiuridina, ribotimidina o desoxitimidina. En diversas realizaciones, N1 se selecciona de adenosina, desoxiadenosina, uridina o desoxiuridina.
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En algunas realizaciones, se sustituye una adenosina en posicion 1 de la hebra anticodificante por un N1 seleccionado de desoxiadenosina, desoxiuridina, ribotimidina o desoxitimidina. En diversas realizaciones, N1 se selecciona de desoxiadenosina o desoxiuridina.
En algunas realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases entre uridina o desoxiuridina y adenosina o desoxiadenosina. En otras realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases entre desoxiuridina y adenosina.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria es un ARNic, ANic o miARN. Se hace tambien referencia en la presente memoria a las moleculas de acido nucleico bicatenarias como se proporcionan en la presente memoria como “duplex”.
En algunas realizaciones, (N)x incluye un oligonucleotido anticodificante presente en la Tabla A-18. En algunas realizaciones, x= y= 18 y N1-(N)x incluye un oligonucleotido anticodificante presente en la Tabla A-18. En algunas realizaciones, x= y= 19 o x= y= 20. En ciertas realizaciones preferidas, x= y= 18. En algunas realizaciones, x= y-18 y las secuencias de N1-(N)x y N2-(N')y se seleccionan del par de oligonucleotidos expuesto en la Tabla A-18. En algunas realizaciones, x= y-18 y las secuencias de N1-(N)x y N2-(N')y se seleccionan del par de oligonucleotidos expuestos en las Tablas D y E. En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130), SERPINH1_11 (SEQ ID NO: 68 y 135), SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 y 136), SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 y 164), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168), SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172), SERPINH1_52 (SEQ ID NO: 102 y 169) o SERPINH1_86 (SEQ ID NO: 123 y 190). En algunas realizaciones preferidas, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168) y SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172).
En algunas realizaciones preferidas, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en sErPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_11
(SEQ ID NO: 68 y 135). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de
secuencias expuestos en SERPINH1_13 (SEQ ID NO: 69 y 136). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_45 (SEQ ID NO: 97 y 164). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en
SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en
SERPINH1_52 (SEQ ID NO: 102 y 169). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante son los pares de secuencias expuestos en (SEQ ID NO: 123 y 190). En algunas realizaciones preferidas, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168) y SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172).
En algunas realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases de Watson-Crick. En otras realizaciones, N1 y N2 forman
un par de bases no de Watson-Crick. En algunas realizaciones, N1 es una riboadenosina modificada o una
ribouridina modificada.
En algunas realizaciones, N1 y N2 forman un par de bases de Watson-Crick. En otras realizaciones, N1 y N2 forman
un par de bases no de Watson-Crick. En ciertas realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en
riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenosina y desoxirriboadenosina modificada. En otras realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en ribouridina, desoxirribouridina, ribouridina modificada y desoxirribouridina modificada.
En ciertas realizaciones, la posicion 1 de la hebra anticodificante (extremo 5') incluye desoxirribouridina (dU) o adenosina. En algunas realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenosina, desoxirriboadenosina modificada y N2 se selecciona del grupo consistente en ribouridina, desoxirribouridina, ribouridina modificada y desoxirribouridina modificada. En ciertas realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en riboadenosina y riboadenosina modificada y N se selecciona del grupo consistente en ribouridina y ribouridina modificada.
En ciertas realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en ribouridina, desoxirribouridina, ribouridina modificada y desoxirribouridina modificada y N2 se selecciona del grupo consistente en riboadenosina, riboadenosina modificada, desoxirriboadenosina y desoxirriboadenosina modificada. En ciertas realizaciones, N1 se selecciona del grupo consistente en ribouridina y desoxirribouridina y N se selecciona del grupo consistente en riboadenosina y riboadenosina modificada. En ciertas realizaciones, N1 es ribouridina y N2 es riboadenosina. En ciertas realizaciones, N es desoxirribouridina y N es riboadenosina.
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En algunas realizaciones de la estructura (A2), N1 incluye ribouracilo modificado con 2'OMe-azucar o riboadenosina modificada con 2'OMe-azucar. En ciertas realizaciones de la estructura (A), N2 incluye un ribonucleotido o desoxirribonucleotido modificado con 2'OMe-azucar.
En algunas realizaciones de la estructura (A2), N1 incluye ribouracilo modificado con 2'OMe-azucar o ribocitosina modificada con 2'OMe-azucar. En ciertas realizaciones de la estructura (A), N2 incluye un ribonucleotido modificado con 2'OMe-azucar.
En algunas realizaciones, cada uno de N y N' es un nucleotido no modificado. En algunas realizaciones, al menos uno de N o N' incluye un nucleotido qmmicamente modificado o un resto no convencional. En algunas realizaciones, el resto no convencional se selecciona de un nucleotido espejo, un resto de ribosa abasico y un resto de desoxirribosa abasico. En algunas realizaciones, el resto no convencional es un nucleotido espejo, preferiblemente un resto de L-ADN. En algunas realizaciones, al menos uno de N o N' incluye un ribonucleotido modificado con 2'OMe-azucar.
En algunas realizaciones, la secuencia de (N')y es totalmente complementaria de la secuencia de (N)x. En otras realizaciones, la secuencia de (N')y es sustancialmente complementaria de la secuencia de (N)x.
En algunas realizaciones, (N)x incluye una secuencia anticodificante que es totalmente complementaria de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleotidos consecutivos en un ARNm diana. En otras realizaciones, (N)x incluye una anticodificante que es sustancialmente complementaria de aproximadamente 17 a aproximadamente 39 nucleotidos consecutivos en el ARNm diana.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, el compuesto tiene extremos romos, por ejemplo en la que ambos Z y Z' estan ausentes. En una realizacion alternativa, esta presente al menos uno de Z o Z'. Z y Z' incluyen independientemente uno o mas nucleotidos ligados covalentemente modificados y/o no modificados, incluyendo desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos, o un resto no convencional, por ejemplo un resto de desoxirribosa abasico invertido o un resto de ribosa abasico; un resto C3, C4 o C5 no nucleotidico, un resto 6-amino, un nucleotido espejo y similares. En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' incluye independientemente un resto C3 o un resto amino-C6. En algunas realizaciones, Z' esta ausente y Z esta presente e incluye un resto C3 no nucleotidico. En algunas realizaciones, Z esta ausente y Z' esta presente e incluye un resto C3 no nucleotfdico.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, cada N consiste en un ribonucleotido no modificado. En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, cada N' consiste en un nucleotido no modificado. En realizaciones preferidas, al menos uno de N y N' es un ribonucleotido modificado o un resto no convencional.
En otras realizaciones, el compuesto de la estructura A1 o la estructura A2 incluye al menos un ribonucleotido modificado en el residuo de azucar. En algunas realizaciones, el compuesto incluye una modificacion en la posicion 2' del residuo de azucar. En algunas realizaciones, la modificacion en la posicion 2' incluye la presencia de un resto amino, fluoro, alcoxilo o alquilo. En ciertas realizaciones, la modificacion en 2' incluye un resto alcoxilo. En realizaciones preferidas, el resto alcoxilo es un resto metoxilo (tambien conocido como 2'-O-metilo; 2'OMe; 2-OCH3). En algunas realizaciones, el compuesto de acido nucleico incluye ribonucleotidos alternados modificados con 2'OMe-azucar en una o ambas de las hebras anticodificante y codificante. En otras realizaciones, el compuesto incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en la hebra anticodificante, (N)x o N1-(N)x, solo. En ciertas realizaciones, el ribonucleotido intermedio de la hebra anticodificante, p.ej. el ribonucleotido en posicion 10 en un oligomero de 19 unidades, no esta modificado. En diversas realizaciones, el compuesto de acido nucleico incluye al menos 5 ribonucleotidos alternados modificados con 2'OMe y no modificados. En realizaciones adicionales, el compuesto de la estructura A1 o la estructura A2 incluye ribonucleotidos modificados en posiciones alternadas en las que cada ribonucleotido en los extremos 5' y 3' de (N)x o N1-(N)x esta modificado en sus residuos de azucar y cada ribonucleotido en los extremos 5' y 3 de (N')y o N2-(N)y esta no modificado en los residuos de azucar.
En algunas realizaciones, la molecula bicatenaria incluye una o mas de las siguientes modificaciones:
a) N en al menos una de las posiciones 5, 6, 7, 8 o 9 desde el extremo 5' de la hebra anticodificante se selecciona de un nucleotido 2'-5' o un nucleotido espejo;
b) N' en al menos una de las posiciones 9 o 10 desde el extremo 5' de la hebra codificante se selecciona de un nucleotido 2'-5' y una seudouridina; y
c) N' en 4, 5 o 6 posiciones consecutivas en las posiciones 3'-terminales de (N')y comprende un nucleotido 2'5'.
En algunas realizaciones, la molecula bicatenaria incluye una combinacion de las siguientes modificaciones:
a) La hebra anticodificante incluye un nucleotido 2'-5' o un nucleotido espejo en al menos una de las posiciones 5, 6, 7, 8 o 9 desde el extremo 5'; y
b) la hebra codificante incluye al menos uno de un nucleotido 2'-5' y una seudouridina en las posiciones 9 o 10 desde el extremo 5'.
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En algunas realizaciones, la molecula bicatenaria incluye una combinacion de las siguientes modificaciones:
a) la hebra anticodificante incluye un nucleotido 2'-5' o un nucleotido espejo en al menos una de las posiciones 5, 6, 7, 8 o 9 desde el extremo 5'; y
c) la hebra codificante incluye 4, 5 o 6 nucleotidos 2-5' consecutivos en las posiciones 3' penultima o 3' terminal.
En algunas realizaciones, la hebra codificante [(N)x o N1-(N)x] incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 y 19. En otras realizaciones, la hebra anticodificante incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En otras realizaciones, la hebra anticodificante incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe en las posiciones 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante incluye una o mas pirimidinas modificadas con 2'OMe-azucar. En algunas realizaciones, todos los nucleotidos de pirimidina en la hebra anticodificante estan modificados con 2'OMe-azucar. En algunas realizaciones, la hebra codificante incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe-azucar.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, ni la hebra codificante ni la hebra anticodificante estan fosforiladas en los extremos 3' y 5'. En otras realizaciones, una o ambas de la hebra codificante o la hebra anticodificante estan fosforiladas en el extremo 3'.
En algunas realizaciones de la estructura A1 y la estructura A2, (N)y incluye al menos un resto no convencional seleccionado de un nucleotido espejo, un nucleotido 2'-5' y un ATN. En algunas realizaciones, el resto no convencional es un nucleotido espejo. En diversas realizaciones, el nucleotido espejo se selecciona de un L- ribonucleotido (L-ARN) y un L-desoxirribonucleotido (L-ADN). En realizaciones preferidas, el nucleotido espejo es L- ADN. En ciertas realizaciones, la hebra codificante comprende un resto no convencional en la posicion 9 o 10 (desde el extremo 5'). En realizaciones preferidas, la hebra codificante incluye un resto no convencional en la posicion 9 (desde el extremo 5'). En algunas realizaciones, la hebra codificante es de 19 nucleotidos de longitud y comprende 4, 5 o 6 restos no convencionales consecutivos en las posiciones 15 (desde el extremo 5'). En algunas realizaciones, la hebra codificante incluye 4 ribonucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 15, 16, 17 y 18. En algunas realizaciones, la hebra codificante incluye 5 ribonucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19. En diversas realizaciones, la hebra codificante comprende adicionalmente Z'. En algunas realizaciones, Z' incluye un resto C3OH o un resto C3Pi.
En algunas realizaciones de la estructura A1, (N')e incluye al menos un resto L-ADN. En algunas realizaciones, x= y= 19 y (N')y consiste en ribonucleotidos no modificados en las posiciones 1-17 y 19 y un L-ADN en la penultima posicion 3' (posicion 18). En otras realizaciones, x= y= 19 y (N')y consiste en ribonucleotidos no modificados en las posiciones 1-16 y 19 y 2 L-ADN consecutivos en la penultima posicion 3' (posiciones 17 y 18). En diversas realizaciones, el resto no convencional es un nucleotido unido a un nucleotido adyacente por un ligamiento fosfato internucleotfdico 2'-5'. Segun diversas realizaciones, (N')y incluye 2, 3, 4, 5 o 6 ribonucleotidos consecutivos en el extremo 3' ligados por ligamientos internucleotfdicos 2'-5'. En una realizacion, 4 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' de (N')y estan unidos por tres enlaces fosfodiester 2'-5', en los que uno o mas de los nucleotidos 2'-5' que forman los enlaces fosfodiester 2'-5' incluyen adicionalmente una modificacion de 3'-O-metil(3'OMe)-azucar. Preferiblemente, el nucleotido 3' terminal de (N')y incluye una modificacion de 2'OMe-azucar. En ciertas realizaciones, x= y= 19 y (N')y incluye 2 o mas nucleotidos consecutivos en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19 que incluyen un nucleotido unido a un nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'-5' (nucleotido 2'-5'). En diversas realizaciones, el nucleotido que forma el enlace internucleotfdico 2'-5' incluye un nucleotido de 3'- desoxirribosa o un 3'-metoxinucleotido (3'-H o 3'-OMe en lugar de 3' OH). En algunas realizaciones, x= y= 19 y (N')y incluye nucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16 y 17 de tal modo que los nucleotidos adyacentes estan ligados por un enlace internucleotfdico 2'-5' entre las posiciones 15-16, 16-17 y 17-18; o en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19 de tal modo que los nucleotidos adyacentes estan ligados por un enlace internucleotfdico 2'-5' entre las posiciones 1516, 16-17, 17-18 y 18-19 y esta disponible un 3'OH en el nucleotido 3'-terminal o en las posiciones 16, 17 y 18, de tal modo que los nucleotidos adyacentes estan ligados por un enlace internucleotfdico 2'-5' entre las posiciones 16-17, 17-18 y 18-19. En algunas realizaciones, x= y= 19 y (N')y incluye nucleotidos 2'-5' en las posiciones 16 y 17 o en las posiciones 17 y 18 o en las posiciones 15 y 17 de tal modo que lo nucleotidos adyacentes estan ligados por un enlace internucleotfdico 2'-5' entre las posiciones 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 17-18 y 18-19 o entre las posiciones 15-16 y 17-18, respectivamente. En otras realizaciones, se sustituyen los ribonucleotidos de pirimidina (rU, rC) en (N')y por nucleotidos unidos al nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'-5'. En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88, y x= y= 19 y (N')y comprende 5 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' unidos por 4 ligamientos 2'-5', espedficamente los ligamientos entre los nucleotidos en posicion 15-16, 16-17, 17-18 y 18-19.
En algunas realizaciones, los ligamientos incluyen enlaces fosfodiester. En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88, x= y= 19 y (N')y comprende 5 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' unidos por 4 ligamientos 2'-5' y opcionalmente ademas incluye Z' y z'
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independientemente seleccionados de un resto abasico invertido y una caperuza de alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol]. La caperuza de alquilo C3 se liga covalentemente al nucleotido 3' o 5' terminal. En algunas realizaciones, la caperuza C3 3'-terminal comprende adicionalmente un 3'-fosfato. En algunas realizaciones, la caperuza C3 3'-terminal comprende adicionalmente un grupo hidroxilo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88 y x= y= 19 y (N')y incluye un L-ADN en posicion 18; y (N')y incluye opcionalmente ademas Z' y z' independientemente seleccionados de un resto abasico invertido y una caperuza de alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1,3- propanodiol].
En algunas realizaciones, (N')y incluye un fosfato 3'-terminal. En algunas realizaciones, (N')y incluye un hidroxilo 3'- terminal.
En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 o SERPINH1_88 y x= y= 19 y (N)x incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_4, SERPINH1_12, SERPINH1_18, SERPINH1_30, SERPINH1_58 y SERPINH1_88 y x= y= 19 y (N)x incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe- azucar. En algunas realizaciones, todas las pirimidinas en (N)x incluyen la modificacion de 2'OMe-azucar.
En algunas realizaciones, se seleccionan las hebras anticodificante y codificante de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a,
SERPINH1_51, SERPINH51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18 y N2 es un resto de riboadenosina.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45. SERPINH1_45a,
SERPINH1_51. SERPINH51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N2-(N')y incluye 5 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' unidos por 4 ligamientos 2'-5', espedficamente los ligamientos entre los nucleotidos en posicion 15-16, 16-17, 17-18 y 18-19. En algunas realizaciones, los ligamientos incluyen enlaces fosfodiester.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a,
SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N2-(N')y incluye 5 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' unidos por 4 ligamientos 2'-5' e incluye opcionalmente ademas Z' y z'
independientemente seleccionados de un resto abasico invertido y una caperuza alquilo C3 [C3; mono(hidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol].
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N2-(N')y incluye un L-ADN en posicion 18 y (N')y incluye opcionalmente ademas Z' y z' independientemente seleccionados de un resto abasico invertido y una caperuza alquilo C3 [C3; mono(dihidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol].
En algunas realizaciones N2-(N')y comprende un fosfato 3'-terminal. En algunas realizaciones, N2-(N')y comprende un hidroxilo 3'-terminal.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N1-(N)x incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 1, 3,5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19. En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N1-(N)x incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 11, 13, 15, 17 y 19 (desde el extremo 5'). En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45. SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N1'(N)x incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 o en las posiciones 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19. En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N1- (N)x incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19.
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En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares de secuencias expuestos en SERPINH1_2, SERPINH1_6, SERPINH1_11, SERPINH1_13, SERPINH1_45, SERPINH1_45a, SERPINH1_51, SERPINH1_51a, SERPINH1_52 o SERPINH1_86 y x= y= 18, y N1-(N)x incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe-azucar. En algunas realizaciones, todas las pirimidinas en (N)x incluyen la modificacion de 2'OMe-azucar. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante incluye adicionalmente un L-ADN o un nucleotido 2'-5' en posicion 5, 6 o 7 (5'>3'). En otras realizaciones, la hebra anticodificante incluye adicionalmente un ribonucleotido que genera un ligamiento internucleotfdico 2'-5' entre los ribonucleotidos en posiciones 5-6 o 6-7 (5'>3').
En realizaciones adicionales, N1-(N)x incluye adicionalmente Z, en la que Z incluye un saliente no nucleotfdico. En algunas realizaciones, el saliente no nucleotfdico es C3-C3 [mono(dihidrogenofosfato) de 1,3-propanodiol]2.
En algunas realizaciones de la estructura A2, (N)y incluye al menos un resto L-ADN. En algunas realizaciones, x= y= 18 y (N')y consiste en ribonucleotidos no modificados en las posiciones 1-16 y 18 y un L-ADN en la penultima posicion 3' (posicion 17). En otras realizaciones, x= y= 18 y (N')y consiste en ribonucleotidos no modificados en las posiciones 1-15 y 18 y 2 L-ADN consecutivos en la penultima posicion 3' (posiciones 16 y 17). En diversas realizaciones, el resto no convencional es un nucleotido unido a un nucleotido adyacente por un ligamiento fosfato internucleotfdico 2'-5'. Segun diversas realizaciones, (N')y incluye 2, 3, 4, 5 o 6 ribonucleotidos consecutivos en el extremo 3' ligados por ligamientos internucleotfdicos 2'-5'. En una realizacion, se unen 4 nucleotidos consecutivos en el extremo 3' de (N')y por 3 enlaces fosfodiester 2'-5', en la que uno o mas de los nucleotidos 2'-5' que forman los enlaces fosfodiester 2'-5' incluyen adicionalmente una modificacion de 3'-O-metil (3'OMe)-azucar. Preferiblemente, el nucleotido 3'-terminal de (N')y incluye una modificacion de 2'OMe-azucar. En ciertas realizaciones, x= y= 18 y en (N')y 2 o mas nucleotidos consecutivos en las posiciones 14, 15, 16, 17 y 18 incluyen un nucleotido unido a un nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'-5'. En diversas realizaciones, el nucleotido que forma el enlace internucleotfdico 2'-5' incluye un nucleotido de 3'-desoxirribosa o un 3'-metoxinucleotido. En algunas realizaciones, x= y= 18 y (N')y incluye nucleotidos unidos al nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'5' entre las posiciones 15-16, 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 16-17 y 17-18. En algunas realizaciones, x= y= 18 y (N')y incluye nucleotidos unidos al nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'-5' entre las posiciones 14-15, 15-16, 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 15-16, 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 16-17 y 17-18 o entre las posiciones 17-18 o entre las posiciones 15-16 y 17-18. En otras realizaciones, se sustituyen los ribonucleotidos de pirimidina (rU, rC) en (N')y por nucleotidos unidos al nucleotido adyacente por un enlace internucleotfdico 2'-5'.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares oligonucleotfdicos expuestos en la Tabla A-18 e identificados en la presente memoria como SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127), SERPINH1_6 (SEQ ID NO: 63 y 130), SERPINH1_45a (SEQ ID NO: 98 y 165), SERPINH1_51 (SEQ ID NO: 101 y 168) y SERPINH1_51a (SEQ ID NO: 105 y 172).
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 127 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 60; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_2. En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria tiene la estructura 5' UAUAGCACCCAUGUGUCUC -Z 3' (anticodificante, SEQ ID NO: 127)
I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I
3r Z' -AUAUCGUGGGUACACAGAG z" (codificante, SEQ ID NO: 60)
en la que cada “|” representa un apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 nucleotidos o restos no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3’ de la hebra en que esta presente; y
en la que z” puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’ de N2-(N')y.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye una o mas piridinas y/o purinas modificadas con 2'OMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' en las posiciones 5, 6, 7 u 8 y un saliente nucleotidico o no nucleotidico 3'-terminal. En algunas realizaciones, la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye 4 o 5 nucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3’- terminal o penultima, un resto nucleotidico o no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’. En otras realizaciones, la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye una o mas 2'OMe-pirimidinas, un resto nucleotidico o no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’, y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) se selecciona de una hebra codificante que incluye
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a) ribonucleotidos 2-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19, un saliente no nucleotidico C3OH 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; o
b) ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19, un fosfato 3-terminal y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; o
c) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 5, 7, 13, y 16; un ribonucleotido 2'5' en la posicion 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; o
d) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 13, 16 y 18; un ribonucleotido 2'5' en la posicion 9; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; o
e) ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19; un resto C3-Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19: un saliente C3 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un saliente C3Pi-C3OH 3'-terminal; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19, un fosfato 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 5, 7, 13 y 16; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 13, 16 y 18; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19; un resto C3-Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y un saliente C3-C3 3'-terminal; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 9, 13, 16 y 18 y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 60) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19, un fosfato 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 127) incluye una hebra anticodificante seleccionada de uno de
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 18 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria que incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 130 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 63; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_6. En algunas realizaciones, el duplex comprende la estructura
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(anticodificante, SEQ ID NO: 130)
(codificante, SEQ UD NO: 63) en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotidicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
en la que z’’ puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye una o mas pirimidinas modificadas con 2’OMe-azucar; un saliente nucleotfdico o no nucleotfdico 3’-terminal y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) incluye una o mas pirimidinas modificadas con 2'OMe- azucar, un resto nucleotfdico o no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3OH o C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3'; y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un
ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; o
b) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 y 17; un
ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; o
c) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un
ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; o
d) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un dU en la posicion 1; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula oligonucleotfdica en duplex en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18 y opcionalmente en la posicion 2; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 y 17; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3:Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula oligonucleotfdica en duplex en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo
3’; o
b) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13 y 17; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) incluye ribonucleotidos modificados
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con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7; y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 63) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 130) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un saliente C3Pi-C3OH 3'-terminal.
En algunas realizaciones, el duplex incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 165 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 98; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_45a. En algunas realizaciones, el duplex comprende la estructura
5' AGGAAGUUGAUCUUGGAGU -Z 3' (anticodificante, SEQ ID NO: 165)
lllllllllllllllllll
3' Z'-UCCUUCAACUAGAACCUCA -z" 5' (codificante, SEQ ID NO: 98)
en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotfdicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y.
En algunas realizaciones, la hebra codificante (SEQ ID NO: 98) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones (5'>3') 15, 16, 17, y 18 o 15, 16, 17, 18 y 19, un resto nucleotidico o no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 165) incluye pirimidinas o purinas modificadas con 2'OMe-azucar, un nucleotido 2'-5' en la posicion 5, 6, 7 u 8 (5'>3'); y un resto nucleotidico o no nucleotidico ligado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones la hebra codificante (SEQ ID NO:98) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones (5'>3') 15, 16, 17, 18 y 19; un resto no nucleotidico C3Pi o C3-OH 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 165) incluye una hebra anticodificante seleccionada de una de
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 y 19; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un saliente C3Pi-C3Pi o c3Pi-C3OH 3'-terminal; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 y 19 y un saliente C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH 3'-terminal;
c) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un saliente C3Pi-C3Pi o c3Pi-C3OH 3'-terminal; o
d) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 y un saliente C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH 3'-terminal.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO:98) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones (5'>3') 15, 16, 17, 18, y 19, un resto C3-OH 3'- terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 165) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 y 19; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un saliente C3Pi-COH 3'-terminal.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 168 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 101; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_51. En algunas realizaciones, el duplex comprende la estructura
5' (JCACCCAUGIJGUCUCAGGA -z V (anticodificante, SEQ ID NO: 168)
;-i' Z' - AG' TG GGGA G AG AG ? C- L' G C U >: " ' (codificante SEQ ID NO: 101)
en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z' esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotidicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
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en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9 o 10; un resto nucleotidico o no nucleotidico conetado covalentemente con el extremo 3' y opcionalmente un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) incluye pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'OMe-azucar, un nucleotido 2'-5' en la posicion 5, 6, 7 u 8 (5'>3') y un resto nucleotidico o no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13 y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9 o 10, un resto no nucleotidico C3Pi o C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 8, y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 o 7 y un saliente C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 13 y 15, un ribonucleotido
2'-5' en la posicion 6 o 7 y un saliente C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
c) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido
2'-5' en la posicion 6 y un saliente C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
d) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 8, 12, 13, y 15; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotidico C3-OH conectado covalentemente con 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 8, y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotidico C3-OH conectado covalentemente con 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 13 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotidico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 101) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 168) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 8, 12, 13, y 15; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 172 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 105; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_51a. En algunas realizaciones, el duplex comprende la estructura 5' ACACCCAUGUGUCUCAGGA -% V (anticodificante, SEQ ID NO: 172)
3' Z'-UGUGGGUACACAGAGUCCU -z" 5'
(codificante, SEQ ID NO: 105)
en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
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en la que cada uno de A, C, Gy U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotidicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
en la que z’’ puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de la hebra codificante.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9 o 10; un resto nucleotfdico o no nucleotfdico ligado covalentemente con el extremo 3' y opcionalmente un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'. En algunas realizaciones la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) incluye pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'OMe-azucar, un nucleotido 2'-5' en la posicion 5, 6, 7 u 8 (5'>3') y un resto nucleotfdico o no nucleotfdico ligado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye pirimidinas modificadas con 2'OMe en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9 o 10, un resto no nucleotfdico C3Pi o C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 8, y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 o 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 8, 13 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 o 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
c) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
d) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 8, 12, 13 y 15; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3-OH conectado covalentemente con 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 8 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, opcionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3-OH conectado covalentemente con 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 8, 13 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 105) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13, y 17, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 172) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3") 3, 8, 12, 13, y 15; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, las hebras anticodificante y codificante se seleccionan de los pares oligonucleotfdicos expuestos en la Tabla A-19 e identificados en la presente memoria como SERPINH1_4 (SEQ ID NO: 195 y 220) y SERPINH1_12 (SEQ ID NO: 196 y 221).
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En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 220 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 194; identificadas en la presente menona como SERPINH1_4. En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico bicatenaria tiene la estructura 5' AAUAGCACCCAUGUGUCUC ~Z 3' (anticodificante, SEQ ID NO: 220)
3' Z' -UUAUCGUGGGUACACAGAG - z" 5' (codificante, SEQ ID NO 195) en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotidicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3’ de la hebra en que esta presente; y
en la que z’’ puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5’ de N2-(N')y.
En algunas realizaciones se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7, y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) se selecciona de una hebra codificante que incluye
a) ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19, un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; o
b) ribonucleotidos 2’-5’ en las posiciones 15, 16, 17, 18 y 19, un fosfato 3-terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; o
c) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 5, 7, 13 y 16; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 18; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; o
d) ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 13, 16 y 18 un ribonucleotido 2’5’ en la posicion 9; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’; o
e) ribonucleotidos 2’-5’ en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19, un resto C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos 2’-5’ en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19; un resto C3 conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos 2’-5’ en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19; un fosfato 3’- terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 5, 7, 13, y 16; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 18; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17, 19, un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 13, 16 y 18; un ribonucleotido 2’-5’ en la posicion 9; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2’OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 15, 17 y 19, un ribonucleotido en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3’; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos 2’-5’ en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19; un resto C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3’ y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5’.
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15
20
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En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante (SEQ ID NO: 195) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 9, 13, 16 y 18 y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ iD NO: 195) incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones 15, 16, 17, 18, y 19, un fosfato 3'-terminal y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye una hebra anticodificante seleccionada de una de
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 17 y 18 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria que incluye la hebra anticodificante expuesta en la SEQ ID NO: 130 y la hebra codificante expuesta en la SEQ ID NO: 63; identificadas en la presente memoria como SERPINH1_12. En algunas realizaciones, el duplex comprende la estructura:
5' AACUCGUCUCGCMJCUUGU -Z 3' (anticodificante, SEQ ID N° 221)
lllllllllllllllllll
3' 2'-UUGAGCAGAGCGUAGAACA -2" 5' (codificante, SEQ ID NO: 196) en la que cada “|” representa apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
en la que cada uno de A, C, G, U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado, o un resto no convencional;
en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 restos nucleotidicos o no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye una o mas pirimidinas modificadas con 2'OMe-azucar; un saliente nucleotidico o no nucleotidico 3'-terminal y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'. En algunas realizaciones, la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 221) incluye una o mas pirimidinas modificadas con 2'OMe- azucar, un resto nucleotidico o no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 221) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un
ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 7, 9, 12, 13 y 17; un
ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 221) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un ribonucleotido en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones, se proporciona una molecula oligonucleotfdica en duplex en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18 y opcionalmente en la posicion 2; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 221) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 7, 9, 12, 13, y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
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En algunas realizaciones, se proporciona una molecula oligonucleotfdica en duplex en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 221) se selecciona de una hebra anticodificante que incluye
a) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un
ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; o
b) ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 7, 9, 12, 13 y 17; un
ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante
(SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
Se proporciona en la presente memoria una molecula de acido nucleico bicatenaria en la que la hebra codificante (SEQ ID NO: 196) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 14 y 18; un resto C3-OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante (SEQ ID NO: 220) incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13, y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En realizaciones adicionales de las estructuras A1 y A2, (N')y incluye 1-8 ribonucleotidos modificados en los que el ribonucleotido modificado es un nucleotido de ADN. En ciertas realizaciones, (N')y incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o hasta 8 restos de ADN.
En algunas realizaciones, esta presente cualquiera de Z o Z' e incluye independientemente dos restos no nucleotidicos.
En realizaciones adicionales, Z y Z' estan presentes y cada uno incluye independientemente dos restos no nucleotidicos.
En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' incluye un resto abasico, por ejemplo un resto desoxirriboabasico (al que se hace referencia en la presente memoria como “dAb”) o un resto riboabasico (al que se hace referencia en la presente memoria como “rAb”). En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos abasicos ligados covalentemente y es, por ejemplo, dAb-dAb o rAb-rAb o dAb-rAb o rAb-dAb, en los que cada resto esta conectado covalentemente con un resto adyacente, preferiblemente a traves de un enlace basado en fosforo. En algunas realizaciones, el enlace basado en fosforo incluye un enlace fosforotioato, fosfonoacetato o fosfodiester. En realizaciones preferidas, el enlace basado en fosforo incluye un enlace fosfodiester.
En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye independientemente un resto alquilo, opcionalmente un resto propano [(CH2)3] (C3) o un derivado del mismo incluyendo propanol (C3-OH) y derivados fosforicos del propanodiol (“C3-3'Pi”). En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos alquilo ligados covalentemente con el extremo 3' de la hebra anticodificante o la hebra codificante a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato y ligados covalentemente entre sf a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato y, en algunos ejemplos, es C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH. El extremo 3' de la hebra anticodificante y/o el extremo 3' de la hebra codificante estan conectados covalentemente con el resto C3 a traves de un enlace basado en fosforo y el resto C3 esta conjugado covalentemente con un resto C3-OH a traves de un enlace basado en fosforo. En algunas realizaciones, los enlaces basados en fosforo incluyen un enlace fosforotioato, fosfonoacetato o fosfodiester. En realizaciones preferidas, el enlace basado en fosforo incluye un enlace fosfodiester.
En diversas realizaciones de la estructura A1 o la estructura A2, Z y Z' estan ausentes. En otras realizaciones, Z o Z' esta presente. En algunas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye independientemente un resto alquilo C2, C3, C4, C5 o C6, opcionalmente un resto C3 [propano, -(CH2)3-] o un derivado de mismo incluyendo propanol (C3- OH/C3OH), propanodiol y un derivado fosfodiester de propanodiol (“C3Pi”). En realizaciones preferidas, cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos hidrocarburos y, en algunos ejemplos, es C3Pi-C3OH o C3pi-C3Pi. Cada C3 esta conjugado covalentemente con un C3 adyacente a traves de un enlace covalente, preferiblemente un enlace basado en fosforo. En algunas realizaciones, el enlace basado en fosforo es un enlace fosforotioato, fosfonoacetato o fosfodiester.
En realizaciones espedficas, x= y= 19 y Z comprende al menos un saliente alquilo C3. En algunas realizaciones, el saliente C3-C3 esta conectado covalentemente con el extremo 3' de (N)x o (N')y a traves de un ligamiento covalente, preferiblemente un ligamiento fosfodiester. En algunas realizaciones, el ligamiento entre el primer C3 y el segundo C3 es un ligamiento fosfodiester. En algunas realizaciones, el saliente no nucleotfdico 3' es C3Pi-C3Pi. En algunas
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realizaciones, el saliente no nucleotfdico 3' es C3Pi-C3Ps. En algunas realizaciones, el saliente no nucleotidico 3' es C3Pi-C3OH (OH es hidroxilo). En algunas realizaciones, el saliente no nucleotidico 3' es C3Pi-C3OH.
En diversas realizaciones, el resto alquilo comprende un derivado de alquilo que incluye restos alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5 o alquilo C6 que comprende un hidroxilo terminal, un amino terminal o un grupo fosfato terminal. En algunas realizaciones, el resto alquilo es un resto alquilo C3 o derivado de alquilo C3. En algunas realizaciones, el resto alquilo C3 comprende propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo o una combinacion de los mismos. El resto alquilo C3 esta ligado covalentemente con el extremo 3' de (N')y y/o el extremo 3' de (N)x a traves de un enlace fosfodiester. En algunas realizaciones, el resto alquilo comprende propanol, fosfato de propilo o fosforotioato de propilo. En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de propanol, fosfato de propilo y fosforotioato de propilo, combinaciones de los mismos o multiplos de los mismos, en particular 2 o 3 de propanol, fosfato de propilo o fosforotioato de propilo ligados covalentemente o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, fosfato de propilo-propanol; fosfato de propilo-fosforotioato de propilo; fosfato de propilo-fosfato de propilo; (fosfato de propilo)3, (fosfato de propilo)2-propanol, (fosfato de propilo)2-fosforotioato de propilo. Puede incluirse en Z o Z' cualquier resto conjugado con propano o propanol.
imagen2
En algunas realizaciones cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de propanol, fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, combinaciones de los mismos o multiplos de los mismos.
En algunas realizaciones, cada uno de Z y Z' se selecciona independientemente de fosfato de propilo, fosforotioato de propilo, fosfato de propilo-propanol, fosfato de propilo-fosforotioato de propilo; fosfato de propilo-fosfato de propilo; (fosfato de propilo)3, (fosfato de propilo)2-propanol y (fosfato de propilo)2-fosforotioato de propilo. Puede incluirse en Z o Z' cualquier resto conjugado con propano o propanol.
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En realizaciones adicionales, cada uno de Z y/o Z' incluye una combinacion de un resto abasico y un desoxirribonucleotido o ribonucleotido no modificado o una combinacion de un resto hidrocarburo y un desoxirribonucleotido o ribonucleotido no modificado o una combinacion de un resto abasico (desoxirribo o ribo) y un resto hidrocarburo. En dichas realizaciones, cada uno de Z y/o Z' incluye C3-rAb o C3-dAb, en las que cada resto esta unido covalentemente al resto adyacente a traves de un enlace basado en fosforo, preferiblemente un enlace fosfodiester, fosforotioato o fosfonoacetato.
En ciertas realizaciones, las moleculas de acido nucleico como se dan a conocer en la presente memoria incluyen una secuencia oligonucleotfdica codificante seleccionada de una cualquiera de los oligonucleotidos n° 2-67 o 68-92, mostrados a continuacion en las Tablas A-18 y A-19, respectivamente.
En ciertas realizaciones preferidas, los compuestos proporcionados incluyen Compuesto_1, Compuesto_2, Compuesto_3, Compuesto_4, Compuesto_5, Compuesto_6, Compuesto_7, Compuesto_8 y Compuesto_9 como se describen en la presente memoria.
En algunas realizaciones (tales como por ejemplo el Compuesto_1, Compuesto_5 y Compuesto_6 como se describen en la presente memoria), se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra anticodificante es la sEq ID NO: 127 y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60. En ciertas realizaciones, se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar, un ribonucleotido 2'5' en al menos una de las posiciones 1, 5, 6 o 7 y un resto no nucleotfdico 3'-terminal conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye al menos un ribonucleotido 2'-5' o ribonucleotido modificado con 2'OMe-azucar, un resto no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'. En algunas realizaciones, se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (5'>3'), un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto no nucleotfdico C3OH 3'-terminal conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye 5 ribonucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 y 19 (5'>3'), un resto no nucleotfdico C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_1, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (5'>3'), un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto no nucleotfdico c3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye 5 ribonucleotidos 2-'5' consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 y 19 (5'>3'), un resto no nucleotfdico C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y que incluye adicionalmente un ribonucleotido modificado con 2'OMe-azucar en la posicion 1 de la hebra anticodificante.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_6 que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (5'>3'), un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto no nucleotfdico c3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye 5 ribonucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3'-terminales 15, 16, 17, 18 y 19 (5'>3'), un resto no nucleotfdico C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y que incluye adicionalmente un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 1 de la hebra anticodificante.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_5, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (5'>3'), un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto no nucleotfdico C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 7, 13, 16 y 18, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotfdico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
En algunas realizaciones (tales como por ejemplo Compuesto_2 y Compuesto_7 como se describen en la presente memoria), se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 63 y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones, se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 63 e incluye ribonucleotidos de pirimidina modificados con 2'OMe-azucar; un resto no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 130 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar; un ribonucleotido 2'5' en la posicion 7 y un resto no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3'. En algunas realizaciones,
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se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 63 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar, un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 130 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar; un ribonucleotido en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7 y un resto no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_2, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 63 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 130 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 12, 13 y 17; un ribonucleotido 2'-5' en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7 y un resto no nucleotidico C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_7, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 63 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones (5'>3') 2, 14 y 18; un resto C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 130 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13 y 17; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un resto no nucleotidico C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones (tales como por ejemplo el Compuesto_3 como se describe en la presente memoria), se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 98 y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 165. En algunas realizaciones, se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO:98 e incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones del extremo 3'; un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 165 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar; un ribonucleotido 2'-5' en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7 y un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3'. En una realizacion, se proporciona el Compuesto_3 que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 98 e incluye ribonucleotidos 2'-5' en las posiciones (5'>3') 15, 16, 17, 18 y 19; un resto C3-OH 3' conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 165 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 y 19; un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 7 y un C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En algunas realizaciones (tales como por ejemplo, Compuesto_4, Compuesto_8 y Compuesto_9 descritos en la presente memoria), se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 101 y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 168. En algunas realizaciones se proporcionan moleculas de acido nucleico bicatenarias de 19 unidades en las que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 101 e incluye ribonucleotidos de pirimidina modificados con 2'OMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' opcional en una de las posiciones 9 o 10, un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 168 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' en al menos una de las posiciones 5, 6 o 7 y un resto no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_4, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 101 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13 y 17, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 9, un resto no nucleotidico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 168 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un saliente 3' C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_8, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 101 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones (5'>3') 4, 11, 13 y 17, un resto no nucleotidico C3OH conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 168 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 13 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un saliente 3' C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
En una realizacion, se proporciona el Compuesto_9, que es una molecula de acido nucleico bicatenaria de 19 unidades en la que la hebra codificante es la SEQ ID NO: 101 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe- azucar en las posiciones (5'>3') 2, 4, 11, 13, y 17, un resto no nucleotfdico C3OH conectado covalentemente con el
extremo 3' y un resto desoxirribonucleotidico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'; y la hebra anticodificante es la SEQ ID NO: 168 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar en las posiciones (5'>3') 1, 4, 8, 11 y 15, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion 6 y un resto no nucleotfdico 3' C3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3'.
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En otro aspecto, se proporcionan procedimientos para reducir la expresion de hsp47 en una celula mediante la introduccion en una celula de una molecula de acido nucleico como se proporciona en la presente memoria en una cantidad suficiente para reducir la expresion de hsp47. En una realizacion, la celula es una celula estrellada hepatocelular. En otra realizacion, la celula es una celula estrellada en tejido renal o pulmonar. En ciertas 10 realizaciones, el procedimiento se efectua in vitro, en otras realizaciones, el procedimiento se efectua in vivo.
En aun otro aspecto, se proporcionan procedimientos para tratar un individuo que padece una enfermedad asociada a hsp47. Los procedimientos incluyen administrar al individuo una molecula de acido nucleico tal como se proporciona en la presente memoria en una cantidad suficiente para reducir la expresion de hsp47. En ciertas 15 realizaciones, la enfermedad asociada a hsp47 es una enfermedad seleccionada del grupo consistente en fibrosis hepatica, cirrosis, fibrosis pulmonar incluyendo fibrosis de pulmon (incluyendo FPI), cualquier afeccion que cause fibrosis renal (p.ej., ERC incluyendo ERET), fibrosis peritoneal, dano hepatico cronico, fibrillogenesis, enfermedades fibroticas en otros organos, cicatrizacion anormal (queloides) asociada a todos los tipos posibles de lesion cutanea accidental y yatrogenica (operaciones), escleroderma, cardiofibrosis, fracaso de operacion de filtracion de glaucoma 20 y adhesiones intestinales. En algunas realizaciones, los compuestos pueden ser utiles para tratar indicaciones espedficas de organo, por ejemplo indicaciones que incluyen aquellas mostradas en la Tabla 2 siguiente:
Tabla 2
Organo
Indicacion
Piel
Cicatrizacion patologica como queloides y cicatriz hipertrofica Cicatrizacion quirurgica Cicatrizacion por lesion Queloides o dermopatfa fibrosante nefrogenica
Peritoneo
Fibrosis peritoneal Adhesiones Esclerosis peritoneal asociada a una dialisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA)
Hfgado
Cirrosis incluyendo cirrosis despues de hepatitis C, cirrosis biliar primaria Fibrosis hepatica, p.ej. prevencion de la fibrosis hepatica en portadores de hepatitis C Esquistomasomiasis Colangitis Cirrosis hepatica debida a hepatitis C despues de trasplante de hugado o esteatohepatitis no alcoholica (EHNA)
Pancreas
Fibrosis inter(peri)lobular (como en pancreatitis cronica alcoholica), fibrosis periductal (como en pancreatitis hereditaria), fibrosis periductal e interlobular (como en pancreatitis autoinmunitaria), fibrosis interlobular e intralobular (como en pancreatitis obstructiva cronica)
Rinon
Enfermedad renal cronica (ERC) de cualquier etiologfa. Tratamiento de ERC de etapa temprana (SCr elevado) en pacientes diabeticos (“previene” un deterioro adicional de la funcion renal) Fibrosis renal asociada a glomeruloesclerosis por lupus Nefropatfa diabetica
Corazon
Insuficiencia cardiaca congestiva Fibrosis endomiocardica Cardiofibrosis Fibrosis asociada a infarto de miocardio
Pulmon
Asma, fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) Fibrosis intersticial de pulmon (FIP) Neumonitis por radiacion que conduce a fibrosis pulmonar (p.ej., debida a radiacion de tratamiento de cancer )
Medula osea
Trastornos mieloproliferativos: mielofibrosis (MF), policitemia vera (PV), trombocitopenia esencial (TE) Mielofibrosis idiopatica Mielofibrosis inducida por farmacos
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Ojo
Segmento anterior: opacificacion de cornea, p.ei. despues de distrofias heredadas, queratitis herpetica o pterigia; glaucoma Segmento posterior: Fibrosis y desprendimiento de retina por traccion, una complicacion de la retinopatfa diabetica avanzada (RD); cicatrizacion fibrovascular y gliosis de retina Baio la retina: Fibrosis, por eiemplo posterior a hemorragia subrretiniana asociada a DME neovascular Fibrosis retroorbital, cirugfa postcaratatas, vitreorretinopatfa proliferativa Penfigoide cicatricial ocular
Intestino
Fibrosis intestinal, enfermedad de Crohn
Cuerdas vocales
Cicatrizacion de cuerdas vocales, fibrosis de la mucosa de cuerdas vocales, fibrosis larmgea
Vasculatura
Aterosclerosis, reestenosis arterial posangioplastia
Multisistemico
Esclerosis sistemica por escleroderma; fibroesclerosis multifocal; enfermedad del hospedador contra el injerto escleroderma toso en receptores de trasplante de medula osea y fibrosis sistemica nefrogenica (exposicion a agentes de contraste basados en gadolinio (ACGA), 30 % de los IRM)
Malignidades de diversos ongenes
Cancer metastasico e invasivo al inhibir la funcion de miofibroblastos asociados a tumor activados
En algunas realizaciones, las indicaciones preferidas incluyen cirrosis hepatica debida a hepatitis C despues de trasplante de tngado, cirrosis hepatica debida a esteatohepatitis no alcoholica (EHNA), fibrosis pulmonar idiopatica, neumonitis por radiacion que conduce a fibrosis pulmonar, nefropatfa diabetica, esclerosis peritoneal asociada a dialisis peritoneal continua ambulatoria (DPCA) y penfigoide cicatricial ocular.
Las indicaciones hepaticas fibroticas incluyen cirrosis alcoholica, cirrosis por hepatitis B, cirrosis por hepatitis C, cirrosis por hepatitis C (Hep C) despues de trasplante de tngado ortotopico (OLTx), EHNA/EGHNA, cirrosis biliar primaria (CBP), colangitis esclerosante primaria (CEP), atresia biliar, deficiencia de a1-antitripsina (A1AD), enfermedades de almacenamiento de cobre (enfermedad de Wilson), fructosemia, galactosemia, enfermedades de almacenamiento de glicogeno (especialmente los tipos III, IV, VI, IX y X), smdromes de sobrecarga de hierro (hemocromatosis), anormalidades lipfdicas (p.ej., enfermedad de Gaucher), trastornos peroxisomicos (p.ej., smdrome de Zellweger), tirosinemia, fibrosis hepatica congenita (p.ej., brucelosis), parasitarias (p.ej., equinococcosis) y smdrome de Budd-Chiari (enfermedad veno-oclusiva hepatica).
Las indicaciones pulmonares incluyen fibrosis pulmonar idiopatica, silicosis, neumoconiosis, displasia broncopulmonar en el recien nacido despues de smdrome de dificultad respiratoria neonatal, lesion de pulmon por bleomicina/quimioterapia, bronquiolitis obliterante (SBO) despues de trasplante de pulmon, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EpOC), fibrosis qrnstica y asma.
Las indicaciones cardiacas incluyen cardiomiopatfa, aterosclerosis (enfermedad de Bergers, etc.), fibrosis endomiocardica, fibrilacion auricular y cicatrizacion despues de infarto de miocardio (IM).
Otras indicaciones toracicas incluyen reacciones del tejido de la capsula inducidas por radiacion alrededor de implantes de mama texturizados y fibrosis de la submucosa oral.
Las indicaciones renales incluyen enfermedad renal poliqrnstica dominante autosomica (ERPDA), nefropatfa diabetica (glomeruloesclerosis diabetica), GEFS (colapsante frente a otras variantes histologicas), nefropatfa de IgA (enfermedad de Berger), nefritis lupica, enfermedad de Wegner, escleroderma, smdrome de Goodpasture, fibrosis tubulointersticial: nefropatfa inducida por los farmacos (protectores) penicilinas, cefalosporinas y analgesicos, glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP), purpura de Henoch-Schonlein, nefropatfas congenitas: enfermedad qrnstica medular, smdrome onicorrotuliano y smdrome de Alport.
Las indicaciones de medula osea incluyen linfangioleiomiomatosis (LAM), enfermedad cronica de injerto contra el hospedador, policitemia vera, trombocitopenia esencial y mielofibrosis.
Las indicaciones oculares incluyen retinopatfa de prematuridad (RP), penfigoide cicatricial ocular, fibrosis de glandulas lacrimales, cirugfa de desprendimiento de retina, opacidad corneal, queratitis herpetica, pterigia, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad (DME/DMRE), retinopatfa por diabetes sacarina (DS) asociada a fibrosis retinal.
Las indicaciones ginecologicas incluyen adicion para endometriosis a la terapia hormonal para la prevencion de cicatrizacion, fibrosis/salpingitis despues de ETS.
Las indicaciones sistemicas incluyen enfermedad de Dupuytren, fibromatosis palmar, enfermedad de Peyronie, enfermedad de Ledderhose, queloides, fibroesclerosis multifocal, fibrosis sistemica nefrogenica y mielofibrosis nefrogenica (anemia).
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Las enfermedades fibroticas asociadas a lesiones incluyen cicatrizacion y contraccion de piel y tejido blando inducidas por quemaduras (incluidas qmmicas), cicatrizacion de piel y organos inducida por radiacion despues de tratamiento con radiacion terapeutica del cancer y queloides (piel).
Las indicaciones quirurgicas incluyen fibrosis peritoneal despues de cateter de dialisis peritoneal, implante de cornea, implante coclear, otros implantes, implantes de silicona en los senos, sinusitis cronica, adhesiones, hiperplasia de la seudomtima o injertos de dialisis.
Otras indicaciones incluyen pancreatitis cronica.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que padece fibrosis hepatica que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria, tratando asf la fibrosis hepatica. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hngado debida a hepatitis. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hngado debida a EHNA.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria para la fabricacion de un medicamento para tratar la fibrosis hepatica. En algunas realizaciones, la fibrosis hepatica es debida a hepatitis. En algunas realizaciones, la fibrosis hepatica es debida a EHNA.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para la remodelacion de tejido cicatricial que comprende administrar a un sujeto necesitado de ello una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria, efectuando asf la remodelacion del tejido cicatricial. En algunas realizaciones, el tejido cicatricial esta en el hngado. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hngado debida a hepatitis. En algunas realizaciones, el sujeto padece cirrosis del hngado debido a EHNA.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para efectuar la regresion de la fibrosis que comprende administrar a un sujeto necesitado de ello una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria, efectuando asf la regresion de la fibrosis.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para la reduccion del tejido cicatricial en un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria para reducir el tejido cicatricial. En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para reducir el tejido cicatricial en un sujeto que comprende la etapa de aplicar por via topica al tejido cicatricial una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria para reducir el tejido cicatricial.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para mejorar la apariencia del tejido cicatricial que comprende la etapa de aplicar por via topica al tejido cicatricial una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria para mejorar la apariencia del tejido cicatricial.
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un sujeto que padece fibrosis de pulmon que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria, tratando asf la fibrosis de pulmon. En algunas realizaciones, el sujeto padece fibrosis de pulmon intersticial (FPI). En algunas realizaciones, el sujeto padece neumonitis por radiacion que conduce a fibrosis pulmonar. En algunas realizaciones, el sujeto padece fibrosis de pulmon inducida por farmacos.
En algunas realizaciones, se proporciona el uso de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria para la fabricacion de un medicamento para tratar fibrosis de pulmon. En algunas realizaciones, la fibrosis de pulmon es FPI. En algunas realizaciones, la fibrosis de pulmon es una fibrosis de pulmon inducida por farmacos o radiacion.
En un aspecto, se proporcionan composiciones farmaceuticas que incluyen una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria en un portador farmaceuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la formulacion farmaceutica incluye, o implica, un sistema de suministro adecuado para suministrar moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) a un individuo tal como un paciente, por ejemplo sistemas de suministro descritos con mas detalle a continuacion.
En un aspecto relacionado, se proporcionan composiciones o kits que incluyen una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) empaquetada para uso por un paciente. El paquete puede estar etiquetado o incluir una etiqueta o prospecto de paquete que indica el contenido del paquete y proporciona cierta informacion sobre como la molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) debena o puede usarse por un paciente, por ejemplo, la etiqueta puede incluir informacion de dosificacion y/o indicaciones para uso. En ciertas realizaciones, el contenido de la etiqueta portara un aviso en una forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo la Direccion federal de farmacos y alimentos de Estados Unidos. En ciertas realizaciones, la etiqueta puede indicar que la molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) es adecuada para uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada a hsp47; por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la molecula de acido
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nucleico (p.ej., una molecula de ANic) es adecuada para uso en el tratamiento de fibroides; o por ejemplo la etiqueta puede indicar que la molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) es adecuada para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en fibrosis, fibrosis hepatica, cirrosis, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis peritoneal, dano hepatico cronico y fibrillogenesis.
Como se usan en la presente memoria, los terminos “protema de choque termico 47” o “hsp47” o “HSP47” se usan intercambiablemente y hacen referencia a cualquier protema de choque termico 47, peptido o polipeptido que tenga cualquier actividad de protema hsp47. La protema de choque termico 47 es un inhibidor de serinproteasa (serpina) tambien conocido, por ejemplo, como inhibidor de serpinpeptidasa, clado H, miembro 1 (SERPINH1), SERPINH2, protema de union a colageno 1 (CBP1), CBP2, gp46; protema transactivada por arsenico 3 (AsTP3); HSP47; gen inductor de la proliferacion 14 (PIG14); PPROM; antfgeno A-47 de artritis reumatoide (RA-A47); coligina 1 y coligina 2. En ciertas realizaciones preferidas, “hsp47” hace referencia a hsp47 humana. La protema de choque termico 47 (o mas particularmente hsp47 humana) puede tener una secuencia aminoaddica que es la misma, o sustancialmente la misma, que la SEQ ID NO. 2 (FIG. 7).
Como se usa en la presente memoria, el termino “secuencia nucleotidica que codifica hsp47” significa una secuencia nucleotfdica que codifica una protema hsp47 o porcion de la misma. El termino “secuencia nucleotfdica que codifica hsp47” pretende incluir tambien secuencias de codificacion de hsp47 tales como isoformas de hsp47, genes de hsp47 mutantes, variantes de corte y empalme de genes de hsp47 y polimorfismos genicos de hsp47. Una secuencia de acido nucleico que codifica hsp47 incluye secuencias de ARNm que codifican hsp47, a las que puede hacerse referencia tambien como “ARNm de hsp47”. Es una secuencia ejemplar de ARNm de hsp47 la SEQ ID. NO. 1.
Como se usan en la presente memoria, los terminos “molecula de acido nucleico” o “acido nucleico” se usan intercambiablemente y hacen referencia a un oligonucleotido, nucleotido o polinucleotido. Las variaciones de “molecula de acido nucleico” se describen con mas detalle en la presente memoria. Una molecula de acido nucleico engloba tanto moleculas de acido nucleico modificadas como moleculas de acido nucleico no modificadas como se describen en la presente memoria. Una molecula de acido nucleico puede incluir desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, nucleotidos modificados o analogos nucleotfdicos en cualquier combinacion.
Como se usa en la presente memoria, el termino “nucleotido” hace referencia a un resto qmmico que tiene un azucar (o un analogo del mismo o un azucar modificado), una base nucleotidica (o un analogo de la misma o una base modificada) y un grupo fosfato (o analogo del mismo o un grupo fosfato modificado). Un nucleotido engloba tanto nucleotidos modificados como nucleotidos no modificados como se describen en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, los nucleotidos pueden incluir desoxirribonucleotidos (p.ej., desoxirribonucleotidos no modificados), ribonucleotidos (p.ej., ribonucleotidos no modificados) y analogos nucleotfdicos modificados incluyendo, entre otros, acidos nucleicos bloqueados y acidos nucleicos no bloqueados, acidos peptidonucleicos, L- nucleotidos (a los que se hace tambien referencia como nucleotidos espejo), acido nucleico con puente de etileno (ANE), arabinosido, PACE, nucleotidos con un azucar de 6 carbonos asf como analogos nucleotidicos (incluyendo nucleotidos abasicos) a menudo no considerados nucleotidos. En algunas realizaciones, los nucleotidos pueden estar modificados en el azucar, base nucleotidica y/o en el grupo fosfato con cualquier modificacion conocida en la materia, tales como las modificaciones descritas en la presente memoria. Un “polinucleotido” u “oligonucleotido” como se usa en la presente memoria hace referencia a una cadena de nucleotidos ligados; los polinucleotidos y oligonucleotidos pueden tener igualmente modificaciones en el azucar nucleotidico, bases nucleotfdicas y esqueletos de fosfato como es bien conocido en la materia y/o se da a conocer en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, el termino “acido nucleico interferente corto”, “ANic” o “molecula de acido nucleico interferente corto” hace referencia a cualquier molecula de acido nucleico capaz de modular la expresion genica o la replicacion vmca. Preferiblemente, el ANic inhibe o regula negativamente la expresion genica o replicacion vmca. Los ANic incluyen sin limitacion moleculas de acido nucleico que son capaces de mediar la iARN espedfica de secuencia, por ejemplo ARN interferente corto (ARNic), ARN bicatenario (ARNbc), microARN (miARN), aRn de horquilla corto (ARNhc), oligonucleotido interferente corto, acido nucleico interferente corto, oligonucleotido interferente corto modificado, ARNic modificado qmmicamente, ARN silenciador genico postranscripcional (ARNsgps) y otros. Como se usa en la presente memoria, “acido nucleico interferente corto”, “ANic” o “molecula de acido nucleico interferente corto” tiene el significado descrito con mas detalle en otro lugar de la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, el termino “complementario” significa que un acido nucleico puede formar un enlace o enlaces de hidrogeno con otra secuencia de acido nucleico por Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Con referencia a las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria, la energfa libre de union para una molecula de acido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que prosiga la funcion relevante del acido nucleico, p.ej., la actividad de iARN. La determinacion de las energfas libres de union para moleculas de acido nucleico es bien conocida en la materia (veanse, p.ej., Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pag. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109: 3783-3785). El porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molecula de acido nucleico que pueden formar enlaces de hidrogeno (p.ej., apareamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de acido nucleico (p.ej., 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos de un total de 10
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nucleotidos en el primer oligonucleotido en que se este basando apareado con una segunda secuencia de acido nucleico que tiene 10 nucleotidos que representan un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % de complementariedad respectivamente). “Totalmente complementario” significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de acido nucleico formaran enlace de hidrogeno con el mismo numero de residuos contiguos en una segunda secuencia de acido nucleico. En una realizacion, una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria incluye de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 o mas (p.ej., aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 o mas) nucleotidos que son complementarios de una o mas moleculas de acido nucleico diana o una porcion de las mismas.
Como se usa en la presente memoria, el termino “region codificante” hace referencia a una secuencia nucleotidica de una molecula de ANic complementaria (parcial o totalmente) de una region anticodificante de la molecula de ANic. La hebra codificante de una molecula de ANic puede incluir una secuencia de acido nucleico que tiene homologfa con una secuencia de acido nucleico diana. Como se usa en la presente memoria, “hebra codificante” hace referencia a una molecula de acido nucleico que incluye una region codificante y puede incluir tambien nucleotidos adicionales.
Como se usa en la presente memoria, el termino “region anticodificante” hace referencia a una secuencia nucleotidica de una molecula de ANic complementaria (parcial o totalmente) de una secuencia de acido nucleico diana. La hebra anticodificante de una molecula de ANic puede incluir opcionalmente una secuencia de acido nucleico complementaria de una region codificante de la molecula de ANic. Como se usa en la presente memoria, “hebra anticodificante” hace referencia a una molecula de acido nucleico que incluye una region anticodificante y puede incluir tambien nucleotidos adicionales.
Como se usa en la presente memoria, el termino “ARN” hace referencia a una molecula que incluye al menos un residuo ribonucleotfdico.
Como se usa en la presente memoria, el termino “region de duplex” hace referencia a la region en dos oligonucleotidos complementarios o sustancialmente complementarios que forma pares de bases entre sf, por apareamiento de bases de Watson-Crick o de cualquier otra manera que permita un duplex entre hebras oiigonucleotfdicas que son complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una hebra oligonucleotfdica que tiene 21 unidades nucleotfdicas puede aparearse por bases con otro oligonucleotido de 21 unidades nucleotfdicas aunque solo 19 bases en cada hebra sean complementarias o sustancialmente complementarias, de tal modo que la “region de duplex” consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden existir, por ejemplo, como salientes 5' y 3'. Adicionalmente, en la region de duplex, no se requiere un 100 % de complementariedad, es admisible una complementariedad sustancial en la region de duplex. Complementariedad sustancial hace referencia a una complementariedad entre las hebras tal que sean capaces de reasociarse en condiciones biologicas. As tecnicas para determinar empmcamente si dos hebras son capaces de reasociarse en condiciones biologicas son bien conocidas en la materia. Como alternativa, pueden sintetizarse dos hebras y anadirse conjuntamente en condiciones biologicas para determinar si se reasocian entre sf.
Como se usa en la presente memoria, el termino “analogo nucleotfdico sin apareamiento” significa un analogo nucleotfdico que incluye un resto sin apareamiento de bases incluyendo, pero sin limitacion: 6-desaminoadenosina (nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me- dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC y N3-Me dC. En algunas realizaciones, el analogo nucleotfdico sin apareamiento de bases es un ribonucleotido. En otras realizaciones, es un desoxirribonucleotido.
Como se usa en la presente memoria, el termino “grupo funcional terminal” incluye sin limitacion grupos halogeno, alcohol, amina, carboxflico, ester, amida, aldehfdo, cetona y eter.
Puede hacerse referencia tambien a menudo en la presente memoria y en la materia a un “nucleotido abasico” o “analogo nucleotfdico abasico”, como se usa en la presente memoria, como un seudonucleotido o un resto no convencional. Aunque un nucleotido es una unidad monomerica de acido nucleico consistente generalmente en un azucar de ribosa o desoxirribosa, un fosfato y una base (adenina, guanina, timina o citosina en ADN; adenina, guanina, uracilo o citosina en ARN), un nucleotido abasico o seudonucleotido carece de base, y por tanto no es estrictamente un nucleotido como se usa generalmente el termino en la materia. Los restos de desoxirribosa abasicos incluyen, por ejemplo, 3'-fosfato de desoxirribosa abasico; 3-fosfato de 1,2-didesoxi-D-ribofuranosa y 3- fosfato de 1,4-anhidro-2-desoxi-D-ribitol. Los restos de desoxirribosa abasicos invertidos incluyen desoxirriboabasico invertido y 5'-fosfato de 3',5'-desoxiabasico invertido.
El termino “resto de caperuza” (z'') como se usa en la presente memoria incluye un resto que puede estar ligado covalentemente con el extremo 5' de (N')y e incluye un resto de ribosa abasico, un resto de desoxirribosa abasico, modificaciones de restos de ribosa abasica y desoxirribosa abasica incluyendo modificaciones de 2'O-alquilo; restos de ribosa abasica y desoxirribosa abasica invertidos y modificaciones de los mismos; C6-imino-Pi; un nucleotido espejo que incluye L-ADN y L-ARN; 5'OMe-nucleotidos y analogos nucleotfdicos que incluyen 4',5'- metilenonucleotido; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleotido; 4'-tionucleotido, nucleotido carbodclico; fosfato de 5'- aminoalquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-
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aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; 1,5-anhidrohexitolnucleotido; a-nucleotido; treopentofuranosilnucleotido; 3',4'-seconucleotido adclico; 3,4-dihidroxibutilnucleotido; 3,5-dihidroxipentilnucleotido, resto abasico 5'-5'-invertido; fosfato de 1,4-butanodiol; 5-amino y restos metilfosfonato y 5'-mercapto de puente o no de puente.
Ciertos restos de caperuza pueden ser restos de ribosa abasicos o desoxirribosa abasicos; restos de ribosa abasicos invertidos o de desoxirribosa abasicos; C6-amino-Pi; un nucleotido espejo que incluye L-ADN y L-ARN. Las moleculas de acido nucleico como se dan a conocer en la presente memoria pueden sintetizarse usando uno o mas nucleotidos invertidos, por ejemplo timidina invertida o adenina invertida (por ejemplo, vease Takei, et al., 2002. JBC 277 (26) 23800-06).
El termino “resto no convencional”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a restos no nucleotidicos que incluyen un resto abasico, un resto abasico invertido, un resto hidrocarburo (alquilo) y derivados del mismo, e incluye adicionalmente un desoxirribonucleotido, un desoxirribonucleotido modificado, un nucleotido espejo (L-ADN o L-ARN), un analogo nucleotfdico sin apareamiento de bases y un nucleotido unido a un nucleotido adyacente por un enlace fosfato internucleotfdico 2-5'; acidos nucleicos de puente que incluyen ANB y acidos nucleicos con puente de etileno, nucleotidos de ligamiento modificado (p.ej. PACE) y de base modificada asf como restos adicionales dados a conocer explfcitamente en la presente memoria como restos no convencionales.
Como se usan en la presente memoria, los terminos “inhibir”, “regular negativamente” o “reducir” con respecto a la expresion genica significan que la expresion del gen, o el nivel de moleculas de ARN o moleculas de ARN equivalentes que codifican una o mas protemas o subunidades proteicas (p.ej., ARNm), o actividad de una o mas protemas o subunidades proteicas, se reduce por debajo de lo observado en ausencia de un factor inhibidor (tal como una molecula de acido nucleico, p.ej., un ANic, por ejemplo que tiene rasgos estructurales como se describen en la presente memoria); por ejemplo la expresion puede reducirse a un 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos que la observada en ausencia de un inhibidor.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 es un grafico de barras que muestra el efecto de ANic de GFP sobre diversas lmeas celulares indicadoras. Las lmeas celulares se establecieron por induccion lentivmca de un constructo de ADNc-GFP de HSP47 humana o ADNc-GFP de GP46 de rata en HEK293, lmea celular de fibrosarcoma humana HT1080, lmea humana de HSC hTERT o lmea celular NRK. Se introdujo ANic de control negativo o ANic contra GFP en las celulas y se midio la fluorescencia de GFP. Los resultados mostraron que el ANic contra GFP desactiva genicamente la fluorescencia en diferentes grados en diferentes lmeas celulares. Se seleccionaron las lmeas celulares 293_HSP47-GFP y 293_GP46-GFP para cribado de siHsp47 debido a su facilidad de transfeccion y sensibilidad ante la desactivacion genica de la fluorescencia.
La FIG. 2 es una serie de graficos de barras que muestran la citotoxicidad y eficacia de la desactivacion genica de diversos siHsp47 en las lmeas celulares 293_HsP47-GFP y 293_GP46-GFP. El resultado mostraba que siHsp47-C, siHsp47-2 y siHsp47-2d desactivan genicamente de forma eficaz tanto la HSP4 humana como la GP46 de rata (el homologo de hsp47 humana) sin citotoxicidad sustancial. siGp46A frente a GP46 no desactiva genicamente la HSP47 humana. Adicionalmente, los siHsp47 recien disenados superaban a siGp46A en la desactivacion genica de GP46 de rata.
La FIG. 3 es un grafico de barras que muestra el efecto de desactivacion genica de diversos siHsp47 sobre ARNm de hsp47, medido por PCRc TaqMan® usando la lmea celular humana de HSC hTERT. El eje Y representa el nivel
de ARNm restante de hsp47. HSP47-C era el mas eficaz entre todos los ANic de hsp47 ensayados.
La FIG. 4 es un grafico de barras que muestra el efecto de diferentes ANic de hsp47 sobre la expresion de colageno I en celulas hTERT. Se midieron los niveles de ARNm de colageno I mediante PCR cuantitativa instantanea usando la sonda TaqMan®. El eje Y representa el nivel de expresion de ARNm restante de colageno I. El resultado mostraba que el nivel de ARNm de colageno I se reduce significativamente en las celulas tratadas con algunos de los candidatos (siHsp47-2, siHsp47-2d y su combinacion con siHsp47-1).
La FIG. 5 muestra la disminucion de las zonas fibroticas del tngado en animales tratados con siHSP47.
La FIG. 6 es una secuencia de acido nucleico ejemplar de ADNc de ARNm de hsp47 humana (SEQ ID NO: 1; basado en al ADNc dado a conocer en el numero de acceso a GenBank: NM_001235).
La FIG. 7 es una secuencia aminoaddica ejemplar de hsp47 humana (SEQ ID NO: 2).
La FIG. 8 es una secuencia de acido nucleico codificante de protema de ADNc de hsp47 humana (SEQ ID NO: 59),
que corresponde a los nucleotidos 230-1486 de SEQ ID NO: 1.
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Las FIG. 9A-9I muestran la estabilidad plasmatica de Compuesto_1, Compuesto_2, Compuesto_3, Compuesto_4, Compuesto_5, Compuesto_6, Compuesto_7, Compuesto_8 y Compuesto_9, respectivamente, como se detecta por tincion con bromuro de etidio.
Las FIG. 10A-10I muestran la actividad en la diana/fuera de la diana de Compuesto_1, Compuesto_2, Compuesto_3, Compuesto_4, Compuesto_5, Compuesto_6, Compuesto_7, Compuesto_8 y Compuesto_9, respectivamente. AS_CM muestra la actividad de la hebra anticodificante del compuesto frente a un plasmido que comprende un inserto totalmente coincidente; AS_SM muestra la actividad de la hebra anticodificante del compuesto frente a un plasmido que comprende un inserto de secuencia de semilla; S_CM muestra la actividad de la hebra codificante del compuesto frente a un plasmido que comprende un inserto totalmente coincidente. Se efectuaron todos los ensayos en celulas humanas, excepto para los datos mostrados en la FIG. 10F, que se efectuo en celulas REF52 de rata.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Interferencia de ARN y moleculas de acido nucleico ANic
La interferencia de ARN hace referencia al proceso de silenciamiento genico postranscripcional especlfico de secuencia en animales mediado por ARN interferentes cortos (ARNic) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13: 139-141 y Strauss, 1999, Science, 286, 886). Se hace referencia a menudo al correspondiente proceso en plantas (Heifetz et al., publication internacional PCT n° WO 99/61631) como silenciamiento genico postranscripcional (SGPT) o silenciamiento de ARN. Se cree que el proceso de silenciamiento genico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente usado para prevenir la expresion de genes ajenos (Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358). Dicha protection de la expresion de genes ajenos puede haber evolucionado en respuesta a la production de ARN bicatenarios (ARNbc) derivados de infection vlrica o de la integration aleatoria de elementos de transposon en un genoma hospedador a traves de una respuesta celular que destruye especlficamente el ARN monocatenario homologo o ARN genomico vlrico. La presencia de ARNbc en celulas desencadena la respuesta de iARN a traves de un mecanismo que ha de caracterizarse totalmente todavla. Este mecanismo parece ser diferente de otros mecanismos conocidos que implican ribonucleasas especlficas de ARN bicatenario, tales como la respuesta de interferon que es el resultado de la activation mediada por ARNbc de la protelna cinasa PKR y la 2',5'-oligoadenilato sintetasa, dando como resultado una escision no especlfica de ARNm por la ribonucleasa L (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 6.107.094; 5.898.031; Clemens et al., 1997, J. Interferon & Cytokine Res., 17, 503-524; Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189).
La presencia de ARNbc largos en celulas estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III a la que se hace referencia como Dicer (Bass, 2000, Cell, 101, 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Dicer esta implicada en el procesamiento del ARNbc en trozos cortos de ARNbc conocidos como ARN interferentes cortos (ARNic) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Los ARN interferentes cortos derivados de la actividad de Dicer son tlpicamente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleotidos de longitud e incluyen duplex de aproximadamente 19 pares de bases (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Dicer se ha implicado tambien en la extraction de ARN temporales pequenos de 21 y 22 nucleotidos (ARNtp) de ARN precursor de estructura conservada que estan implicados en el control traduccional (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). La respuesta de iARN presenta tambien un complejo de endonucleasa, al que se hace referencia comunmente como complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que media la escision de ARN monocatenario que tiene complementariedad de secuencia con la hebra anticodificante de duplex de ARNic. La escision del ARN diana tiene lugar en medio de la region complementaria de la hebra anticodificante del duplex de ARNic (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).
La iARN se ha estudiado en una variedad de sistemas. Fire et al., 1998, Nature, 391, 806, fueron los primeros en observar iARN en C. elegans. Bahramian y Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 y Wianny y Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, describen iARN mediada por ARNbc en sistemas de mamlferos. Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, describen iARN en celulas de Drosophila transfectadas con ARNbc. Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 y Tuschl et al., publicacion internacional PCT n° WO 01/75164, describen iARN inducida por la introduction de duplex de ARN de 21 nucleotidos sinteticos en celulas de mamlfero cultivadas, incluyendo celulas de rinon embrionario humanas y HeLa. Recientes trabajos en lisados embrionarios de Drosophila (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 y Tuschl et al., publicacion internacional PCT n° WO 01/75164) han revelado ciertos requisitos de la longitud, estructura, composition qulmica y secuencia de ARNic que son esenciales para mediar una actividad de iARN eficaz.
Las moleculas de acido nucleico (por ejemplo, que tienen rasgos estructurales como se dan a conocer en la presente memoria) pueden inhibir o regular negativamente la expresion genica o la replication vlrica mediando la interferencia de ARN “iARN” o silenciamiento genico de manera especlfica de secuencia; veanse, p.ej., Zamore et al., 2000, CeJ], 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498 y Kreutzer
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et al., publicacion internacional PCT n° WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., publicacion internacional PCT n° WO 01/36646; Fire, publicacion internacional PCT n°WO 99/32619; Plaetinck et al., publicacion internacional PCT n°WO 00/01846; Mello y Fire, publicacion internacional PCT n° WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, publicacion internacional PCT n° WO 99/07409 y Li et al., publicacion internacional PCT n° WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218 y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner y Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626 y Reinhart y Bartel, 2002, Science, 297, 1831).
Una molecula de acido nucleico ANic puede ensamblarse a partir de dos hebras polinucleotidicas separadas, en que una hebra es la hebra codificante y la otra es la hebra anticodificante, en la que las hebras anticodificante y codificante son autocomplementarias (concretamente, cada hebra incluye una secuencia nucleotidica que es complementaria de la secuencia nucleotidica de la otra hebra); tal como cuando la hebra anticodificante y hebra codificante forman un duplex o estructura bicatenaria que tiene cualquier longitud y estructura como se describe en la presente memoria para moleculas de acido nucleico como se proporcionan, por ejemplo, en las que la region bicatenaria (region de duplex) es de aproximadamente 15 a aproximadamente 49 (p.ej., de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 pares de bases); la hebra anticodificante incluye una secuencia nucleotidica que es complementaria de la secuencia nucleotidica en una molecula de acido nucleico diana (concretamente, ARNm de hsp47) o una porcion de la misma y la hebra codificante incluye una secuencia nucleotidica correspondiente a la secuencia de acido nucleico diana o una porcion de la misma (p.ej., de aproximadamente 17 a aproximadamente 49 o mas nucleotidos de las moleculas de acido nucleico de la presente memoria son complementarias del acido nucleico diana o una porcion del mismo).
En ciertos aspectos y realizaciones, una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) proporcionada en la presente memoria puede ser una molecula de “longitud de RISC” o puede ser un sustrato de Dicer como se describe con mas detalle a continuacion.
Una molecula de acido nucleico ANic puede incluir secuencias o regiones codificantes y anticodificantes separadas en que las regiones codificantes y anticodificantes se ligan covalentemente por moleculas ligadoras nucleotfdicas o no nucleotfdicas como es conocido en la materia, o se ligan como alternativa no covalentemente mediante interacciones ionicas, enlaces de hidrogeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofobas y/o interacciones de apilado. Las moleculas de acido nucleico pueden incluir una secuencia de acido nucleico que es complementaria de la secuencia nucleotidica de un gen diana. Las moleculas de acido nucleico pueden interaccionar con la secuencia nucleotidica de un gen diana de manera que cause la inhibicion de la expresion del gen diana.
Como alternativa, se ensambla una molecula de acido nucleico ANic a partir de un solo polinucleotido, en que las regiones codificante y anticodificante autocomplementarias de las moleculas de acido nucleico se ligan mediante un ligador o ligadores basados en acido nucleico o no en acido nucleico, concretamente la hebra anticodificante y la hebra codificante son parte de un solo polinucleotido que tiene una region anticodificante y una region codificante que se pliegan formando una region de duplex (por ejemplo, formando una estructura de “horquilla” como es bien conocido en la materia). Dichas moleculas de acido nucleico ANic pueden ser un polinucleotido con un duplex, un duplex asimetrico, estructura secundaria de horquilla u horquilla asimetrica que tiene regiones codificantes y anticodificantes autocomplementarias, en la que la region anticodificante incluye una secuencia nucleotidica que es complementaria de la secuencia nucleotidica de una molecula de acido nucleico diana separada o una porcion de la misma, y la region codificante tiene una secuencia nucleotidica correspondiente a la secuencia de acido nucleico diana (p.ej., una secuencia de ARNm de hsp47). Dichas moleculas de acido nucleico ANic pueden ser un polinucleotido monocatenario circular que tiene dos o mas estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones codificantes y anticodificantes autocomplementarias, en las que la region anticodificante incluye una secuencia nucleotidica que es complementaria de la secuencia nucleotidica de una molecula de acido nucleico diana o una porcion de la misma y la region codificante tiene una secuencia nucleotidica correspondiente a la secuencia de acido nucleico diana o una porcion de la misma, y en las que el polinucleotido circular puede procesarse in vivo o in vitro generando una molecula de acido nucleico activa capaz de mediar la iARN.
Se usa la siguiente nomenclatura a menudo en la materia para describir las longitudes y salientes de moleculas de ANic, y puede usarse a lo largo de la memoria descriptiva y los ejemplos. Los nombres dados a los duplex indican la longitud de los oligomeros y la presencia o ausencia de salientes. Por ejemplo, un duplex “21+2” contiene dos hebras de acido nucleico, siendo ambas de 21 nucleotidos de longitud, tambien denominado un duplex de ARNic de 21 unidades o un acido nucleico de 21 unidades, que tiene un saliente 3' de 2 nucleotidos. Un diseno “21-2” hace referencia a un duplex de acido nucleico de 21 unidades con un saliente 5' de 2 nucleotidos. Un diseno 21-0 es un duplex de acido nucleico de 21 unidades sin salientes (romo). Un “21+2UU” es un duplex de 21 unidades con un saliente 3' de 2 nucleotidos y los 2 nucleotidos terminales en los extremos 3' son ambos residuos de U (que pueden dar como resultado desapareamiento con la secuencia diana). La nomenclatura anteriormente mencionada puede aplicarse a moleculas de ANic de diversas longitudes de hebras, duplex y salientes (tales como 19-0, 21+2, 27+2 y similares). En una nomenclatura alternativa, pero similar, un “25/27” es un duplex asimetrico que tiene una hebra
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codificante de 25 bases y una hebra anticodificante de 27 bases con un saliente 3' de 2 nucleotidos. Un “27/25” es un duplex asimetrico que tiene una hebra codificante de 27 bases y una hebra anticodificante de 25 bases.
Modificaciones qmmicas
En ciertos aspectos y realizaciones, las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) como se proporcionan en la presente memoria incluyen una o mas modificaciones (o modificaciones qmmicas). En ciertas realizaciones, dichas modificaciones incluyen cualquier cambio en una molecula de acido nucleico o polinucleotido que hana a la molecula diferente de un ribonucleotido o molecula de ARN estandar (concretamente, que incluye restos de adenosina, citosina, uracilo o guanosina estandares); a los que puede hacerse referencia como un ribonucleotido “no modificado” o acido ribonucleico no modificado. Puede hacerse referencia a las bases y polinucleotidos de ADN tradicionales que tienen un 2'-desoxiazucar representado por restos de adenosina, citosina, timina o guanosina como un “desoxirribonucleotido no modificado” o “acido desoxirribonucleico no modificado”, por consiguiente, el termino “nucleotido no modificado” o “acido nucleico no modificado” como se usa en la presente memoria hace referencia a un “ribonucleotido no modificado” o “acido ribonucleico no modificado”, a menos que haya una indicacion clara de lo contrario. Dichas modificaciones pueden ser en el azucar nucleotidico, base nucleotidica, grupo fosfato nucleotidico y/o el esqueleto de fosfato de un polinucleotido.
En ciertas realizaciones, pueden usarse modificaciones como se dan a conocer en la presente memoria para aumentar la actividad de iARN de una molecula y/o para aumentar la estabilidad in vivo de las moleculas, particularmente la estabilidad serica, y/o para aumentar la biodisponibilidad de las moleculas. Los ejemplos no limitantes de modificaciones incluyen, sin limitacion, ligamientos internucleotfdicos o internucleosfdicos; desoxinucleotidos o didesoxirribonucleotidos en cualquier posicion y hebra de la molecula de acido nucleico; acido nucleico (p.ej., acido ribonucleico) con una modificacion en la posicion 2' seleccionada preferiblemente de amino, fluoro, metoxilo, alcoxilo y alquilo; 2-desoxirribonucleotidos, 2-O-metilrribonucleotidos, 2'-desoxi-2'- fluororribonucleotidos, nucleotidos de “base universal”, nucleotidos “adclicos”, 5-C-metilnucleotidos, grupo biotina y glicerilo terminal y/o la incorporacion de residuos desoxiabasicos invertidos, moleculas estericamente impedidas tales como moleculas fluorescentes y similares. Otros modificadores nucleotfdicos podnan incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'- dideshidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleotidos monofosfatados de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'- didesoxi-3-tiacitidina (3TC) y 2',3'-dideshidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T). Se describen con mas detalle a continuacion detalles adicionales sobre diversas modificaciones.
Los nucleotidos modificados incluyen aquellos que tienen una conformacion Northern (p.ej., ciclo de seudorrotacion Northern, vease por ejemplo Saenger, “Principles of Nucleic Acid Structure”, Springer-Verlag ed., 1984). Los ejemplos no limitantes de nucleotidos que tienen configuracion Northern incluyen nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB) (p.ej., 2'-O,4'-C-metileno-(D-ribofuranosil)nucleotidos); 2-metoxietoxinucleotidos (MOE); 2'- metiltioetil-, 2-desoxi-2-fluoronucleotidos, 2'-desoxi-2'-cloronucleotidos, 2'-azidonucleotidos y 2-O-metilnucleotidos. Los acidos nucleicos bloqueados o ANB se describen, por ejemplo, en Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch y Corey, 2001; Bondensgaard et al., 2000; Wahlestedt et al., 2000 y las publicaciones internacionales de patente n° WO 00/47599, WO 99/14226, y WO 98/39352 y WO 2004/083430. En una realizacion, se incorpora un ANB a extremo 5' de la hebra codificante.
Las modificaciones qmmicas incluyen tambien acidos nucleicos no bloqueados, o ANNB, que son analogos adclicos no nucleotfdicos en que no esta presente el enlace C2'-C3' (aunque los ANNB no son verdaderamente nucleotidos, se incluyen expresamente en el alcance de los nucleotidos “modificados” o acidos nucleicos modificados como se contemplan en la presente memoria). En realizaciones particulares, las moleculas de acido nucleico con un saliente pueden modificarse para tener ANNB en las posiciones de saliente (concretamente, saliente de 2 nucleotidos). En otras realizaciones, se incluyen ANNB en los extremos 3' o 5'. Un ANNB puede localizarse en cualquier lugar a lo largo de una hebra de acido nucleico, concretamente en la posicion 7. Las moleculas de acido nucleico pueden contener uno o mas ANNB. Se dan a conocer ANNB ejemplares en “Nucleic Acids Symposium Series” n° 52 pag. 133-134 (2008). En ciertas realizaciones, una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria incluye uno o mas ANNB o un ANNB. En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria que tiene un saliente 3' incluye uno o mas ANNB en el saliente 3'. En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria incluye un ANNB (por ejemplo un ANNB) en la hebra anticodificante; por ejemplo en posicion 6 o posicion 7 de la hebra anticodificante. Las modificaciones qmmicas incluyen tambien analogos nucleotidicos sin apareamiento, por ejemplo como se dan a conocer en la presente memoria. Las modificaciones qmmicas incluyen adicionalmente restos no convencionales como se dan a conocer en la presente memoria.
Las modificaciones qmmicas incluyen tambien modificaciones terminales en la parte 5' y/o 3' de los oligonucleotidos y son tambien conocidas como restos de caperuza. Dichas modificaciones terminales se seleccionan de un nucleotido, un nucleotido modificado, un lfpido, un peptido y un azucar.
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Las modificaciones qmmicas incluyen tambien “analogos nucleotfdicos de anillo de 6 miembros” de 6 miembros. Se dan a conocer ejemplos de analogos nucleotidicos de anillo de 6 miembros en Allart, et al. (Nucleosides & Nucleotides. 1998, 17: 1523-1526; y Perez-Perez, et al., 1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6: 1457-1460). Se dan a conocer oligonucleotidos que incluyen analogos nucleotfdicos de anillo de 6 miembros que incluyen monomeros nucleotfdicos de hexitol y altritol en la publicacion de solicitud de patente internacional n° WO 2006/047842.
Las modificaciones qmmicas incluyen tambien nucleotidos “espejo” que tienen una quiralidad invertida en comparacion con los nucleotidos de origen natural, es decir, un nucleotido espejo puede ser un analogo “L- nucleotfdico” de D-nucleotidos de origen natural (vease la patente de EE.UU. n° 6.602.858). Los nucleotidos espejo pueden incluir adicionalmente al menos una modificacion en azucar o base y/o una modificacion en esqueleto, por ejemplo como se describe en la presente memoria, tal como un resto fosforotioato o fosfonato. La patente de EE.Uu. n° 6.602.858 da a conocer catalizadores de acido nucleico que incluyen al menos una sustitucion L-nucleotidica. Los nucleotidos espejo incluyen, por ejemplo, L-ADN (3'-fosfato de L-desoxirriboadenosina (espejo de dA); 3'-fosfato de L-desoxirribocitidina (espejo de dC); 3'-fosfato de L-desoxirriboguanosina (espejo de dG); 3'-fosfato de L- desoxirribotimidina (imagen especular de dT)) y L-ARN (3'-fosfato de L-riboadenosina (espejo de rA); 3'-fosfato de L- ribocitidina (espejo de rC); 3'-fosfato de L-riboguanosina (espejo de rG); 3'-fosfato de L-ribouracilo (espejo de dU).
En algunas realizaciones, los ribonucleotidos modificados incluyen desoxirribonucleotidos modificados, por ejemplo 5'OMe-ADN (3'-fosfato de 5-metildesoxirriboguanosina) que pueden ser utiles como nucleotidos en posicion 5'- terminal (posicion numero 1); PACE (3'-fosfonoacetato de desoxirriboadenosina, 3'-fosfonoacetato de desoxirribocitidina, 3'-fosfonoacetato de desoxirriboguanosina y 3'-fosfonoacetato de desoxirribotimidina.
Pueden estar presentes modificaciones en una o mas hebras de una molecula de acido nucleico dada a conocer en la presente memoria, p.ej., en la hebra codificante, la hebra anticodificante o ambas hebras. En ciertas realizaciones, la hebra anticodificante puede incluir modificaciones y la hebra codificante puede incluir solo ARN no modificado.
Nucleobases
Las nucleobases del acido nucleico dado a conocer en la presente memoria pueden incluir ribonucleotidos no modificados (purinas y pirimidinas) tales como adenina, guanina, citosina y uracilo. Las nucleobases en una o ambas hebras pueden modificarse con nucleobases naturales y sinteticas tales como timina, xantina, hipoxantina, inosina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alqmlicos de adenina y guanina, cualquier nucleotido “de base universal”; derivados de 2-propilo y otros alqmlicos de adenina y guanina, 5-halogenouracilo y -citosina, 5- propiniluracilo y -citosina, 6-azouracilo, -citosina y -timina, 5-uracilo (seudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo-, -amino-, - tiol-, -tioalquil-, -hidroxil- y otras adeninas y guaninas 8-sustitiuidas, 5-trifluorometil- y otros uracilos y citosinas 5- sustituidos, 7-metilguanina, desazapurinas, analogos heterodclicos sustituidos de purinas y pirimidinas, p.ej., derivados de aminoetiloxifenoxazina de purinas y pirimidinas (p.ej., derivados de 1-alquilo, 1-alquenilo, heteroaromaticos y 1-alquinilo) y tautomeros de los mismos, 8-oxo-N-6-metiladenina, 7-diazaxantina, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-(1-propinil)uracilo, 5-(1-propinil)citosina y 4,4-etanocitosina). Otros ejemplos de bases adecuadas incluyen bases no purmicas y no pirimidmicas tales como 2-aminopiridina y triazinas.
Restos de azucar
Los restos de azucar en los acidos nucleicos dados a conocer en la presente memoria pueden incluir un resto de azucar 2'-hidroxipentofuranosilo sin ninguna modificacion. Como alternativa, los restos de azucar pueden estar modificados tales como resto de azucar 2'-desoxipentofuranosilo, D-ribosa, hexosa, modificacion en la posicion 2' del resto de azucar pentofuranosilo tal como 2'-O-alquilo (incluyendo 2-O-metilo y 2-O-etilo), concretamente 2'- alcoxilo, 2'-amino, 2'-O-alilo, 2'-S-alquilo, 2'-halogeno (incluyendo 2'-fluoro, -cloro y -bromo), 2'-metoxietoxilo, 2'-O- metoxietilo, 2'-O-2-metoxietilo, 2'-aliloxilo (-OCH2CH=CH2), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, etenilo, propenilo, CF, ciano, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior C1 a C10, alquilo, alcarilo o aralquilo inferiores sustituidos, OCF3, OCN, O-, S- o N-alquilo; O-, S o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino o sililo sustituido como, entre otros, por ejemplo como se describen en las patentes europeas EP 0.586.520 B1 o EP 0.618.925 B1.
Grupo alquilo incluye grupos alifaticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal (p.ej., metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (isopropilo, terc-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloalquilo (alidclicos) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En ciertas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o cadena ramificada tiene 6 o menos atomos de carbono en su esqueleto (p.ej., C1-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada), y mas preferiblemente 4 o menos. Igualmente, los cicloalquilos preferidos pueden tener 3-8 atomos de carbono en su estructura de anillo, y mas preferiblemente tienen 5 o 6 carbonos en la estructura de anillo. El termino C1-C6 incluye grupos alquilo que contienen de 1 a 6 atomos de carbono. El grupo alquilo puede ser un grupo alquilo sustituido tal como restos alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan a un hidrogeno en uno o mas carbonos del esqueleto hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquenilo, alquinilo, halogeno, hidroxilo, alquilcarboniloxilo, arilcarboniloxilo, alcoxicarboniloxilo,
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ariloxicarboniloxilo, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoMo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoflo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromatico o heteroaromatico.
El grupo alcoxilo incluye grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos ligados covalentemente a un atomo de oxfgeno. Los ejemplos de grupos alcoxilo incluyen grupos metoxilo, etoxilo, isopropiloxilo, propoxilo, butoxilo y pentoxilo. Los ejemplos de grupos alcoxilo sustituidos incluyen grupos alcoxilo halogenados. Los grupos alcoxilo pueden sustituirse por grupos tales como restos alquenilo, alquinilo, halogeno, hidroxilo, alquilcarboniloxilo, arilcarboniloxilo, alcoxicarboniloxilo, ariloxicarboniloxilo, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoMo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoflo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o aromaticos o heteroaromaticos. Los ejemplos de grupos alcoxilo sustituidos con halogeno incluyen, pero sin limitacion, fluorometoxilo, difluorometoxilo, trifluorometoxilo, clorometoxilo, diclorometoxilo, triclorometoxilo, etc.
En algunas realizaciones, el anillo de pentafuranosilo puede reemplazarse por derivados adclicos que carecen del enlace C2'-C3' del anillo de pentafuranosilo. Por ejemplo, los aciclonucleotidos pueden sustituir con un grupo 2- hidroxietoximetilo el azucar de 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMP.
Los halogenos incluyen fluor, bromo, cloro y yodo.
Esqueleto
Las subunidades nucleosfdicas del acido nucleico dado a conocer en la presente memoria pueden ligarse entre sf por un enlace fosfodiester. El enlace fosfodiester puede estar opcionalmente sustituido por otros ligamientos. Por ejemplo, ligamientos de fosforotioato, entidades de tiofosfato-D-ribosa, triester, tioato, esqueleto de puente 2'-5' (al que puede hacerse referencia tambien como nucleotido 5-2' o 2'-5' o ribonucleotido 2'-5'), PACE, 3'-(o -5')desoxi-3'- (o -5')tiofosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleniatos, 3'-(o -5')desoxifosfinatos, boranofosfatos, 3'-(o -5')desoxi-3'- (o 5'-)aminofosforamidatos, hidrogenofosfonatos, fosfonatos, esteres de boranofosfato, fosforamidatos, alquil- o arilfosfonatos y modificaciones de fosfotriester tales como alquilfosfotriesteres, ligamientos de fosforo de fosfotriester, 5'-etoxifosfodiester, P-alquiloxifosfotriester, metilfosfonato y ligamientos que no contienen fosforo, por ejemplo, carbonato, carbamato, sililo, azufre, sulfonato, sulfonamida, formacetal, tioformacetilo, oxima, metilenimino, metilenometilimino, metilenhidrazo, metilenodimetilhidrazo y metilenoximetilimino.
Las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden incluir un esqueleto de acido peptidonucleico (APN). El esqueleto de APN incluye unidades de W-(2-aminoetil)glicina repetidas ligadas por enlaces peptfdicos. Las diversas bases tales como purina, pirimidina, bases naturales y sinteticas estan ligadas al esqueleto por enlaces de metilenocarbonilo.
Fosfatos terminales
Pueden hacerse modificaciones en los grupos fosfato terminales. Pueden usarse ejemplos no limitantes de diferentes qrnmicas de estabilizacion, p.ej. para estabilizar el extremo 3' de las secuencias de acido nucleico, incluyendo (l) desoxirribosa [3-3']-invertida; (2) desoxirribonucleotido; (3) [5'-3']-3'-desoxirribonucleotidoo; (4) [5'-3']- ribonucleotido; (5) [5'-3']-3'-O-metilrribonucleotido; (6) 3'-glicerilo; (7) [3'-5']-3'-desoxirribonucleotido; (8) [3'-3']- desoxirribonucleotido; (9) [5'-2']-desoxirribonucleotido y (10) [5-3']-didesoxirribonucleotido. Ademas, las qrnmicas de esqueleto no modificado pueden combinarse con una o mas modificaciones de esqueleto diferentes descritas en la presente memoria.
Los grupos fosfato terminales modificados qmmicamente ejemplares incluyen aquellos mostrados a continuacion:
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imagen3
O-P-CHi----
JO
SB
o-
-NE ■
. 1 o-p-o*
U-
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0~F—0*
I
H
S
o—p-o----
I
H
o—^—o-
a
Equivalente de acido sulfonico o equivalente de vanadilo con cualquier combinacion de otras modificaciones de la presente memoria
Coniuaados
Los nucleotidos y moleculas de acido nucleico modificados (p.ej., moleculas de ANic) proporcionados en la presente memoria pueden incluir conjugados, por ejemplo, un conjugado conectado covalentemente con la molecula de acido nucleico modificada qmmicamente. Los ejemplos no limitantes de conjugados incluyen conjugados y ligandos descritos en Vargeese et al., documento de EE.UU. n° de serie 10/427.160. El conjugado puede estar conectado covalentemente con una molecula de acido nucleico (tal como una molecula de ANic) a traves de un ligador biodegradable. La molecula conjugada puede estar conectada con el extremo 3' de cualquiera de la hebra codificante, la hebra anticodificante o ambas hebras de la molecula de acido nucleico modificada qmmicamente. La molecula de conjugado puede estar conectada con el extremo 5' de cualquiera de la hebra codificante, la hebra anticodificante o ambas hebras de la molecula de acido nucleico modificada qmmicamente. La molecula de conjugacion puede estar conectada a traves de ambos extremos 3' y 5' de cualquiera de la hebra codificante, hebra anticodificante o ambas hebras de la molecula de acido nucleico modificada qmmicamente o cualquier combinacion de las mismas. En una realizacion, una molecula conjugada puede incluir una molecula que facilita el suministro de una molecula de acido nucleico modificada qmmicamente a un sistema biologico tal como una celula. En otra realizacion, la molecula conjugada conectada con la molecula de acido nucleico modificada qmmicamente es un polietilenglicol, seroalbumina humana o un ligando de un receptor celular que puede mediar la captacion celular. Los ejemplos de moleculas conjugadas espedficas contemplados por la presente invencion que pueden conectarse con moleculas de acido nucleico modificadas qmmicamente se describen en Vargeese et al., documento de EE.UU. n° de serie 10/201.394.
Ligadores
Una molecula de acido nucleico proporcionada en la presente memoria (p.ej., un ANic) puede incluir un ligamiento nucleotidico, no nucleotidico o mixto nucleotfdico/no nucleotfdico que une la region codificante del acido nucleico con la region anticodificante del acido nucleico. Un ligador nucleotidico puede ser un ligador de ^ 2 nucleotidos de longitud, por ejemplo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos de longitud. El ligador nucleotidico puede ser un aptamero de acido nucleico. Se hace referencia como “aptamero” o “aptamero de acido nucleico” como se usa en la presente memoria a una molecula de acido nucleico que se une espedficamente a una molecula diana, en el que la molecula de acido nucleico tiene una secuencia que incluye una secuencia reconocida por la molecula diana en su entorno natural. Como alternativa, el aptamero puede ser una molecula de acido nucleico que se une a una molecula diana (tal como ARNm de hsp47), en que la molecula diana no se une naturalmente a un acido nucleico. Por ejemplo, puede usarse un aptamero para unirse a un dominio de union a ligando de una protema, previniendo asf la interaccion del ligando de origen natural con la protema. Este es un ejemplo no limitante y los especialistas en la materia reconoceran que pueden generarse facilmente otras realizaciones usando tecnicas generalmente conocidas en la materia. Veanse, p.ej., Gold et al.; 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody y Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann y Patel, 2000, Science, 287, 820 y Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628.
Un ligador no nucleotidico puede incluir un nucleotido abasico, polieter, poliamina, poliamida, peptido, carbohidrato, lfpido, polihidrocarburo u otros compuestos polimericos (p.ej. polietilenglicoles tales como aquellos que tienen entre
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2 y 100 unidades de etilenglicol). Los ejemplos espedficos incluyen aquellos descritos por Seela y Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18: 6353 y Nucleic Acids Res. 1987, 15: 3113; Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2585 y Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18: 6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10: 287; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34: 301; Ono et al., Biochemistry 1991, 30: 9914; Arnold et al., publicacion internacional n° WO 89/02439; Usman et al., publicacion internacional n° WO 95/06731; Dudycz et al., publicacion internacional n° WO 95/11910 y Ferentz y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 4000.
Extremos 5', extremos 3' y salientes
Las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria (p.ej., moleculas de ANic) pueden ser de extremos romos por ambos lados, tener salientes en ambos lados o una combinacion de extremos romos y salientes. Los salientes pueden aparecer en cualquier de los extremos 5' o 3' de la hebra codificante o anticodificante.
Los extremos 5' y/o 3' de moleculas de acido nucleico bicatenarias (p.ej., ANic) pueden ser de extremos romos o tener un saliente. El extremo 5' puede ser de extremo romo y el extremo 3' tener un saliente en cualquiera de la hebra codificante o la hebra anticodificante. En otras realizaciones, el extremo 3' puede ser de extremo romo y el extremo 5' tiene un saliente en cualquiera de la hebra codificante o la hebra anticodificante. En aun otras realizaciones, ambos extremos 5' y 3' son de extremos romos o ambos extremos 5' y 3' tienen salientes.
El extremo 5' y/o 3' de una o ambas hebras del acido nucleico puede incluir un grupo hidroxilo libre. El extremo 5' y/o 3' de cualquier hebra de molecula de acido nucleico puede estar modificado para incluir una modificacion qmmica. Dicha modificacion puede estabilizar las moleculas de acido nucleico, p.ej., el extremo 3' puede tener una estabilidad aumentada debida a la presencia de la modificacion de la molecula de acido nucleico. Los ejemplos de modificaciones terminales (p.ej., caperuzas terminales) incluyen, pero sin limitacion, abasico, desoxiabasico, (desoxi)abasico invertido, glicerilo, dinucleotfdico, nucleotido adclico, amino, fluoro, cloro, bromo, CN, CF, metoxilo, imidazol, carboxilato, tioato, alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo, OCF3, OCN, O-, So N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino o sililo sustituido como se describen, entre otros, en las patentes europeas EP 586.520 y EP 618.925 y otras modificaciones dadas a conocer en la presente memoria.
Las moleculas de acido nucleico incluyen aquellas con extremos romos, concretamente extremos que no incluyen ningun nucleotido saliente. Una molecula de acido nucleico puede incluir uno o mas extremos romos. La molecula de acido nucleico de extremos romos tiene una serie de pares de bases igual al numero de nucleotidos presentes en cada hebra de la molecula de acido nucleico. La molecula de acido nucleico puede incluir un extremo romo, por ejemplo cuando el extremo 5' de la hebra anticodificante y el extremo 3' de la hebra codificante no tienen nucleotidos salientes. La molecula de acido nucleico puede incluir un extremo romo, por ejemplo cuando el extremo 3' de la hebra anticodificante y el extremo 5' de la hebra codificante no tienen nucleotidos salientes. Una molecula de acido nucleico puede incluir dos extremos romos, por ejemplo cuando el extremo 3' de la hebra anticodificante y el extremo 5' de la hebra codificante, asf como el extremo 5' de la hebra anticodificante y el extremo 3' de la hebra codificante, no tienen nucleotidos salientes. Otros nucleotidos presentes en una molecula de acido nucleico de extremos romos pueden incluir, por ejemplo, desapareamientos, protuberancias, bucles o pares de bases oscilantes para modular la actividad de la molecula de acido nucleico para mediar la interferencia de ARN.
En ciertas realizaciones de las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) proporcionadas en la presente memoria, al menos una de las moleculas tiene un saliente de al menos un nucleotido (por ejemplo, 1 a 8 nucleotidos salientes). Por ejemplo, una o ambas hebras de una molecula de acido nucleico bicatenaria dada a conocer en la presente memoria pueden tener un saliente en el extremo 5' o en el extremo 3' o en ambos. Puede estar presente un saliente en cualquiera o ambas de la hebra codificante y hebra anticodificante de la molecula de acido nucleico. La longitud del saliente puede ser tan pequena como de 1 nucleotido y tan larga como de 1 a 8 o mas nucleotidos (p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleotidos; en algunas realizaciones preferidas, el saliente es de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleotidos; por ejemplo un saliente puede ser de 2 nucleotidos. El nucleotido o nucleotidos que forman el saliente pueden incluir un desoxirribonucleotido o desoxirribonucleotidos, un ribonucleotido o ribonucleotidos, nucleobases naturales y no naturales o cualquier nucleotido modificado en el azucar, base o grupo fosfato tal como se da a conocer en la presente memoria. Una molecula de acido nucleico bicatenaria puede tener ambos salientes 5' y 3'. Los salientes en el extremo 5' y 3' pueden ser de diferentes longitudes. Un saliente puede incluir al menos una modificacion de acido nucleico que puede ser un desoxirribonucleotido. Pueden estar en el extremo 5' uno o mas desoxirribonucleotidos. El extremo 3' de la contrahebra respectiva de la molecula de acido nucleico puede no tener un saliente, mas preferiblemente no un saliente desoxirribonucleotidico. El uno o mas desoxirribonucleotidos pueden ser 3'-terminales. El extremo 5' de la contrahebra respectiva del ARNbc puede no tener un saliente, mas preferiblemente no un saliente desoxirribonucleotidico. El saliente en cualquiera de los extremos 5' o 3' de una hebra puede ser de 1 a 8 (p.ej., de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) nucleotidos no apareados, preferiblemente el saliente es de 2-3 nucleotidos no apareados, mas preferiblemente de 2 nucleotidos no apareados. Las moleculas de acido nucleico pueden incluir moleculas de acido nucleico de duplex con extremos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 (p.ej., de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19 o 20);
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preferiblemente de 1-8 (p.ej., de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) nucleotidos, por ejemplo, duplex de aproximadamente 21 nucleotidos con aproximadamente 19 pares de bases y salientes mononucleotidicos, dinucleotfdicos o trinucleotfdicos 3'-terminales. Las moleculas de acido nucleico de la presente memoria pueden incluir moleculas de acido nucleico de duplex con extremos romos en que ambos extremos son romos, o como alternativa, en que uno de los extremos es romo. Las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden incluir uno o mas extremos romos, concretamente cuando un extremo romo no tiene ningun nucleotido saliente. En una realizacion, la molecula de acido nucleico de extremos romos tiene una serie de pares de bases igual al numero de nucleotidos presentes en cada hebra de la molecula de acido nucleico. La molecula de acido nucleico puede incluir un extremo romo, por ejemplo cuando el extremo 5' de la hebra anticodificante y el extremo 3' de la hebra codificante no tienen ningun nucleotido saliente. La molecula de acido nucleico puede incluir un extremo romo, por ejemplo cuando el extremo 3' de la hebra anticodificante y el extremo 5' de la hebra codificante no tienen ningun nucleotido saliente. Una molecula de acido nucleico puede incluir dos extremos romos, por ejemplo cuando el extremo 3' de la hebra anticodificante y el extremo 5' de la hebra codificante, asf como el extremo 5' de la hebra anticodificante y el extremo 3' de la hebra codificante, no tienen ningun nucleotido saliente. En ciertas realizaciones preferidas, los compuestos de acido nucleico son de extremos romos. Otros nucleotidos presentes en una molecula de ANic de extremos romos pueden incluir, por ejemplo, desapareamientos, protuberancias, bucles o pares de bases oscilantes para modular la actividad de la molecula de acido nucleico para medir la interferencia de ARN.
En muchas realizaciones, uno o mas de, o todos, los nucleotidos salientes de una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria estan modificados tal como se describe en la presente memoria; por ejemplo, uno o mas, o todos, los nucleotidos pueden ser 2'-desoxinucleotidos.
Cantidad, localizacion y patrones de las modificaciones
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) dadas a conocer en la presente memoria pueden incluir nucleotidos modificados como un porcentaje del numero total de nucleotidos presentes en la molecula de acido nucleico. Como tal, la molecula de acido nucleico puede incluir de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 % de nucleotidos modificados (p.ej., aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de nucleotidos modificados). El porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en una molecula de acido nucleico dada dependera del numero total de nucleotidos presentes en el acido nucleico. Si la molecula de acido nucleico es monocatenaria, la modificacion porcentual puede estar basada en el numero total de nucleotidos presentes en la molecula de acido nucleico monocatenaria. Igualmente, si la molecula de acido nucleico es bicatenaria, la modificacion porcentual puede estar basada en el numero total de nucleotidos presentes en la hebra codificante, hebra anticodificante o ambas hebras codificante y anticodificante.
Las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden incluir ARN no modificado como un porcentaje del numero total de nucleotidos en la molecula de acido nucleico. Como tal, una molecula de acido nucleico puede incluir de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 % de nucleotidos modificados (p.ej., aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los nucleotidos totales presentes en una molecula de acido nucleico.
Una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) puede incluir una hebra codificante que incluye de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, espedficamente aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 ligamientos internucleotidicos de fosforotioato y/o uno o mas (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas) 2'-desoxi-, 2'-O-metil-, 2'-desoxifluoro- y/o uno o mas (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas) nucleotidos modificados de base universal, y opcionalmente una molecula de caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5' de la hebra codificante, y en la que la hebra anticodificante incluye de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o mas, espedficamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas ligamientos internucleotfdicos de fosforotioato y/o uno o mas (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) 2-desoxi-, 2-O-metil-, 2-desoxi-2-fluoro- y/o uno o mas (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) nucleotidos modificados de base universal, y opcionalmente una molecula de caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5' de la hebra anticodificante. Una molecula de acido nucleico puede incluir aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas nucleotidos de pirimidina de la hebra codificante y/o anticodificante del acido nucleico que estan modificados qmmicamente con 2'-desoxi-, 2'-O-metil- y/o 2'-desoxi-2-fluoronucleotidos, con o sin aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o mas, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas ligamientos internucleotfdicos de fosforotioato y/o una molecula de caperuza terminal en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5', que estan presentes en la misma o diferente hebra.
Una molecula de acido nucleico puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o mas (espedficamente aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o mas) ligamientos internucleotfdicos de fosforotioato en cada hebra de la molecula de acido nucleico.
Una molecula de acido nucleico puede incluir ligamientos internucleotfdicos 2'-5', por ejemplo en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5' de una o ambas de las hebras de secuencia de acido nucleico. Ademas, el
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ligamiento o ligamientos internucleotidicos 2'-5' pueden estar presentes en diversas otras posiciones en una o ambas de las hebras de la secuencia del acido nucleico, por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas, incluyendo que cada ligamiento internucleotfdico de un nucleotido pirimidmico en una o ambas hebras de la molecula de ANic puede incluir un ligamiento internucleotidico 2'-5', o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas, incluyendo que cada ligamiento internucleotfdico de un nucleotido purmico en una o ambas hebras de la molecula de ARNic puede incluir un ligamiento internucleotfdico 2-5'.
Una molecula de acido nucleico interferente corto (ANic) modificada qmmicamente puede incluir una region anticodificante, en la que cualquiera de (p.ej., uno o mas o todos) los nucleotidos pirimidmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina (p.ej., en la que todos los nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina o como alternativa una pluralidad de los nucleotidos de pirimidina son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina), y en la que cualquiera de (p.ej., uno o mas o todos) los nucleotidos purmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-desoxipurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-desoxipurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-desoxipurina).
Una molecula de acido nucleico interferente corto (ANic) modificada qmmicamente puede incluir una region anticodificante, en la que cualquiera de (p.ej., uno o mas o todos) los nucleotidos pirimidmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina (p.ej., en la que todos los nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina), y en la que cualquiera de (p.ej., uno o mas o todos) los nucleotidos purmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-O-metilpurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2-O-metilpurina).
Una molecula de acido nucleico interferente corto (ANic) modificada qmmicamente capaz de medir la interferencia de ARN (iARN) contra hsp47 dentro de una celula o sistema in vitro reconstituido puede incluir una region codificante, en la que uno o mas nucleotidos pirimidmicos presentes en la region codificante son nucleotidos de 2'- desoxi-2'-fluoropirimidina (p.ej., en la que todos los nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'- fluoropirimidina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'- fluoropirimidina), y uno o mas nucleotidos purmicos presentes en la region codificante son nucleotidos de 2'- desoxipurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-desoxipurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-desoxipurina), y una region anticodificante en la que uno o mas nucleotidos pirimidmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-desoxi-2'- fluoropirimidina (p.ej., en la que todos los nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos pirimidmicos son nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina), y uno o mas nucleotidos purmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-O-metilpurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina). La region codificante y/o la region anticodificante pueden tener una modificacion de caperuza terminal, tal como cualquier modificacion, que esta opcionalmente presente en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos 3' y 5' de la secuencia codificante y/o anticodificante. La region codificante y/o anticodificante puede incluir opcionalmente ademas un saliente nucleotfdico 3'-terminal que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3 o 4) 2'-desoxinucleotidos. Los nucleotidos salientes pueden incluir adicionalmente uno o mas de (p.ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4 o mas) ligamientos internucleotidicos fosforotioato, fosfonoacetato y/o tiofosfonoacetato. Los nucleotidos purmicos en la region codificante pueden ser como alternativa nucleotidos de 2-O-metilpurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina o como alternativa una pluralidad de los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina) y uno o mas nucleotidos purmicos presentes en la region anticodificante son nucleotidos de 2'-O-metilpurina (p.ej., en la que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina). Uno o mas nucleotidos purmicos en la region codificante pueden ser como alternativa ribonucleotidos purmicos (p.ej., en los que todos los nucleotidos purmicos son ribonucleotidos purmicos o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son ribonucleotidos purmicos) y cualquier nucleotido purmico presente en la region anticodificante es un nucleotido de 2'-O-metilpurina (p.ej., en los que todos los nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos son nucleotidos de 2'-O-metilpurina). Uno o mas nucleotidos purmicos en la region codificante y/o presentes en la region anticodificante pueden seleccionarse como alternativa del grupo consistente en 2'-desoxinucleotidos, nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), 2'- metoxietilnucleotidos, 4'-tionucleotidos y 2'-O-metilnucleotidos (en los que todos los nucleotidos purmicos se seleccionan del grupo consistente en 2'-desoxinucleotidos, nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), 2'- metoxietilnucleotidos, 4'-tionucleotidos y 2'-O-metilnucleotidos, o como alternativa una pluralidad de nucleotidos purmicos se seleccionan del grupo consistente en 2'-desoxinucleotidos, nucleotidos de acido nucleico bloqueado (ANB), 2'-metoxietilnucleotidos, 4'-tionucleotidos y 2'-O-metilnucleotidos).
En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico (p.ej., una molecula de ANic) como se describe en la presente memoria incluye un nucleotido modificado (por ejemplo, un nucleotido modificado) en la hebra anticodificante, por ejemplo en posicion 6 o posicion 7 de la hebra anticodificante.
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Patrones de modificacion y modificaciones alternativas
Las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) proporcionadas en la presente memoria pueden tener patrones de acidos nucleicos modificados y no modificados. Un patron de modificacion de los nucleotidos de un tramo contiguo de nucleotidos puede ser una modificacion contenida en un solo nucleotido o grupo de nucleotidos que estan ligados covalentemente entre sf a traves de enlaces fosfodiester estandares o, al menos parcialmente, a traves de enlaces fosforotioato. Por consiguiente, un “patron”, como se contempla en la presente memoria, no tiene que implicar necesariamente unidades repetidas, aunque puede. Los ejemplos de patrones de modificacion que pueden usarse junto con las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) proporcionadas en la presente memoria incluyen aquellos dados a conocer en Giese, patente de EE.UU. n° 7.452.987. Por ejemplo, las moleculas de acido nucleico (p.ej., moleculas de ANic) proporcionadas en la presente memoria incluyen aquellas que tienen patrones de modificacion tales como, similares a o iguales que los patrones mostrados en el diagrama de la FIG. 2 de la patente de EE.UU. n° 7.452.987 de Giese.
Un nucleotido modificado o grupo de nucleotidos modificados puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra codificante o no codificante y un nucleotido o grupo de nucleotidos flanqueante esta dispuesto en ambos lados del nucleotido o grupo modificado, estando el nucleotido o grupo flanqueante no modificado o no teniendo la misma modificacion que el nucleotido o grupo de nucleotidos precedente. Sin embargo, el nucleotido o grupo de nucleotidos modificado puede tener una modificacion diferente. Esta secuencia de nucleotido modificado o grupo de nucleotidos modificados, respectivamente, y nucleotido no modificado o modificado diferentemente o grupo de nucleotidos no modificados o modificados diferentemente puede repetirse una o mas veces.
En algunos patrones, el nucleotido 5'-terminal de una hebra es un nucleotido modificado, mientras que en otros patrones el nucleotido 5'-terminal de una hebra es un nucleotido no modificado. En algunos patrones, el extremo 5' de una hebra empieza con un grupo de nucleotidos modificados, mientras que en otros patrones el extremo 5'- terminal es un grupo no modificado de nucleotidos. Este patron puede estar en el primer tramo o el segundo tramo de la molecula de acido nucleico o ambos.
Los nucleotidos modificados de una hebra de la molecula de acido nucleico pueden ser complementarios en la posicion de los nucleotidos o grupos de nucleotidos no modificados de la otra hebra,
Puede haber un desplazamiento de fase entre modificaciones o patrones de modificaciones en una hebra respecto al patron de modificaciones de la otra hebra, de tal modo que los grupos de modificaciones no se solapen. En un caso, el desplazamiento es tal que el grupo modificado de nucleotidos de la hebra codificante corresponde al grupo no modificado de nucleotidos de la hebra anticodificante y viceversa.
Puede haber un desplazamiento parcial del patron de modificacion, de tal modo que los grupos modificados se solapen. Los grupos de nucleotidos modificados en cualquier hebra dada pueden ser opcionalmente de la misma longitud, pero pueden ser de longitudes diferentes. De forma similar, los grupos de nucleotidos no modificados en cualquier hebra dada pueden ser opcionalmente de la misma longitud o de longitudes diferentes.
En algunos patrones, el segundo (penultimo) nucleotido en el extremo de la hebra es un nucleotido no modificado o el comienzo de un grupo de nucleotidos no modificados. Preferiblemente, este nucleotido no modificado o grupo no modificado de nucleotidos esta localizado en el extremo 5' de cualquiera o ambas de las hebras codificante y anticodificante, y aun mas preferiblemente en el extremo de la hebra codificante. Un nucleotido no modificado o un grupo no modificado de nucleotidos pueden estar localizados en el extremo 5' de la hebra codificante. En una realizacion preferida, el patron consiste en alternar nucleotidos modificados y no modificados individuales.
En algunas moleculas de acido nucleico bicatenarias que incluyen un nucleotido modificado con 2-O-metilo y un nucleotido no modificado, preferiblemente un nucleotido que no esta modificado con 2'-O-metilo, se incorporan a ambas hebras de forma alternada, dando como resultado un patron alternado de nucleotidos modificados con 2'-O- metilo y nucleotidos que no estan modificados o al menos no incluyen una modificacion con 2'-O-metilo. En ciertas realizaciones, existe la misma secuencia de modificacion con 2'-O-metilo y no modificacion en la segunda hebra; en otras realizaciones, los nucleotidos modificados con 2'-O-metilo alternados estan solo presentes en la hebra codificante y no estan presentes en la hebra anticodificante; y en aun otras realizaciones, los nucleotidos modificados con 2'-O-metilo alternados estan solo presentes en la hebra codificante y no estan presentes en la hebra anticodificante. En ciertas realizaciones, hay un desplazamiento de fase entre las dos hebras, de tal modo que el nucleotido modificado con 2'-O-metilo en la primera hebra se aparea por bases con un nucleotido o nucleotidos no modificados en la segunda hebra y viceversa. Esta disposicion particular, concretamente apareamiento de bases de nucleotidos modificados con 2'-O-metilo y no modificados en ambas hebras, es particularmente preferida en ciertas realizaciones. En ciertas realizaciones, el patron de nucleotidos modificados con 2'-O-metilo alternados existe a lo largo de toda la molecula de acido nucleico, o toda la region de duplex. En otras realizaciones, el patron de nucleotidos modificados con 2'-O-metilo alternados existe solo en una porcion del acido nucleico o toda la region de duplex.
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En patrones “con desplazamiento de fase”, puede preferirse si la hebra anticodificante empieza con un nucleotido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 5', con lo que por consiguiente el segundo nucleotido no esta modificado y el tercero, quinto, septimo y demas nucleotidos estan de nuevo por tanto modificados con 2'-O-metilo, mientras que el segundo, cuarto, sexto, octavo y similares nucleotidos son nucleotidos no modificados.
Localizaciones y patrones de modificacion ejemplares
Aunque se proporcionan patrones ejemplares con mas detalle a continuacion, se contemplan todas las permutaciones de patrones con todas las caractensticas posibles de las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria y aquellas conocidas en la materia (p.ej., las caractensticas incluyen, pero sin limitacion, longitud de la hebra codificante, longitud de la hebra anticodificante, longitud de la region de duplex, longitud del saliente, si uno o ambos extremos de una molecula de acido nucleico bicatenaria es romo o tiene un saliente, localizacion del acido nucleico modificado, numero de acidos nucleicos modificados, tipos de modificaciones, si una molecula de acido nucleico con doble saliente tiene el mismo o diferente numero de nucleotidos en el saliente de cada lado, si se usa una o mas de un tipo de modificacion en una molecula de acido nucleico y el numero de nucleotidos modificados/no modificados contiguos). Con respecto a todos los ejemplos detallados proporcionados a continuacion, aunque se muestra que la region de duplex es de 19 nucleotidos, la moleculas de acido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden tener una region de duplex en el intervalo de 1 a 49 nucleotidos de longitud, ya que cada hebra de una region de duplex puede ser independientemente de 17-49 nucleotidos de longitud. Se proporcionan en la presente memoria patrones ejemplares.
Las moleculas de acido nucleico pueden tener un extremo romo (cuando n es 0) en ambos extremos que incluye un conjunto contiguo de acidos nucleicos modificados. El acido nucleico modificado puede estar localizado en cualquier posicion a lo largo de la hebra codificante o anticodificante. Las moleculas de acido nucleico pueden incluir un grupo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleotidos modificados contiguos. Los acidos nucleicos modificados pueden constituir hasta un 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 100 % de una hebra de acido nucleico. Los acidos nucleicos modificados de los ejemplos inmediatamente a continuacion pueden estar solo en la hebra codificante, solo en la hebra anticodificante o en ambas hebras codificante y anticodificante.
Se muestran a continuacion patrones de acido nucleico en que X= nucleotido de hebra codificante en la region de duplex; Xa= nucleotido de saliente 5' en la hebra codificante; Xb= nucleotido de saliente 3' en la hebra codificante; Y= nucleotido de hebra anticodificante en la region de duplex; Ya= nucleotido de saliente 3' en la hebra anticodificante; Yb= nucleotido de saliente 5' en la hebra anticodificante y M= nucleotido modificado en la region de duplex. Cada a y b son independientemente de 0 a 8 (p.ej., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8). Cada X, Y, ay b estan independientemente modificados o no modificados. Las hebras codificante y anticodificante pueden ser cada una independientemente de 17-49 nucleotidos de longitud. Los ejemplos proporcionados a continuacion tienen una region de duplex de 19 nucleotidos, sin embargo, las moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden tener una region de duplex de cualquier tamano entre 17 y 49 nucleotidos y en que cada hebra es independientemente de entre 17 y 49 nucleotidos de longitud.
5’ X*XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXb
3' YbVYYYYYYYYYYYYYYYYYYYa
Se muestran a continuacion patrones de molecula de acido nucleico ejemplares adicionales en que X= nucleotidos de hebra codificante no modificados; x= un nucleotido de saliente no modificado en la hebra codificante; Y= nucleotidos de hebra anticodificante no modificados; y= un nucleotido de saliente no modificado en la hebra anticodificante y M= un nucleotido modificado. Las hebras codificante y anticodificante pueden ser cada una independientemente de 17-49 nucleotidos de longitud. Los ejemplos proporcionados a continuacion tienen una region de duplex de 19 nucleotidos, sin embargo, la moleculas de acido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden tener una region de duplex de cualquier tamano entre 17 y 49 nucleotidos y en que cada hebra es independientemente de entre 17 y 49 nucleotidos de longitud.
5' MnXXXXXXXXXMXXXXXXXXXMn
3' MnYYYYYYYYYYYYYYYYYYYM^
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
3' yyyyyyyyymyyyyyyyyy
XXXXXXXXMMXXXXXXXXX
YYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5'
3'
xxxxxxxxxxxxxxxxxxx
YYYYYYYYMMYYYYYYYYY
5'
3'
XXXXXXXXXMXXXXXXXXX
YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
5'
3'
XXXXXMXXXXXXXXXXXXX
YYYYYYYYYMYYYYYYYYY
5'
3'
MXXXXXXXXXXXXXXXXXX
YYYYYYYYYYYYMYYYYYY
5'
3'
XXXXXXXXXXXXXXXXXXM YYYYYMYYYYYYYYYYYYY
5' 3'
XXXXXXXXXMXXXXXXXX MY YYYYYYYYYYYYYYYY
5' 3'
XXXXXXXMXXXXXXXXXX
YYYYYYYYYYYYYYYYYM
5'
3'
XXXXXXXXXXXXXMXXXX
MYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' 3'
mmhmmmmmmmmmmmmmmm
MMMMMMMMMMMMMMMMMM
Las moleculas de acido nucleico pueden tener extremos romos en ambos extremos con acidos nucleicos modificados alternados. Los acidos nucleicos modificados pueden estar localizados en cualquier posicion a lo largo de la hebra codificante o anticodificante.
5' mxmxmxmxmxmxmxmxmxm
3' YMYMYMYMYMYMYMYMYMY
XMXMXMXMXMXMXMXMXMX
MYMYMYMYMYMYMYMYMYM
5
5
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5' MMXMMXMMXMMXMMXMMXM
3' YMMYMMYMMYMMYMMYMMY
5' XMMXMMXMMXMMKMMXMMX
3' MMYMMYMMYMMYMMYMMYM
5' MMMXMMMXMMMXMMMXMMM
3' YMMMY MMMY MMMYMMMYMM
5' XMMMXMMMXMMMXMMMXMM
3' MMMYMMMYMMMYMMMYMMM
Moleculas de acido nucleico con un extremo 5' romo y un saliente del extremo 3' con un solo acido nucleico modificado.
Moleculas de acido nucleico con un saliente del extremo 5' y un extremo 3' romo con un solo acido nucleico modificado.
Moleculas de acido nucleico con salientes en ambos extremos y todos los salientes son acidos nucleicos modificados. En el patron inmediatamente posterior, M es el numero n de acidos nucleicos modificados, en que n es un entero de 0 a 8 (concretamente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8).
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
3' MYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
Moleculas de acido nucleico con salientes en ambos extremos y algunos nucleotidos de saliente son nucleotidos modificados. En los patrones inmediatamente posteriores, M es el numero n de nucleotidos modificados, x es el numero n de nucleotidos de saliente no modificados en la hebra codificante e y es el numero n de nucleotidos de saliente no modificados en la hebra anticodificante, en que cada n es independientemente un entero de 0 a 8 (concretamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8), y en que cada saliente es como maximo de 20 nucleotidos, preferiblemente un maximo de 8 nucleotidos (modificados y/o no modificados).
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM
3' yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXM*
V yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMxM
3' yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMxMx
3' yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMxMxM
3' yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXMxMxMx
3' yYYYYYYYYYYYYYYYYYYY

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una molecula de acido nucleico bicatenaria que tiene la estructura (A2) expuesta a continuacion:
    (A2) 5' N1-(N)x- Z 3' (hebra anticodificante)
    3' Z'-N2-(N')y-z" 5' (hebra codificante)
    en la que cada uno de N2, N y N' es un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional; en la que cada uno de (N)x y (N')y es un oligonucleotido en que cada N o N' consecutivo esta unido al N o N' adyacente por un enlace covalente;
    en la que cada uno de x e y es independientemente un entero entre 17 y 39;
    en la que la secuencia de (N')y tiene complementariedad con la secuencia de (N)x y (N)x tiene complementariedad con una secuencia consecutiva en un ARNm de hsp47 (SEQ ID NO: 1);
    en la que N1 esta unido covalentemente a (N)x y esta desapareado con el ARNm de hsp47 o es un resto de ADN complementary del ARNm de hsp47;
    en la que N1 es un resto seleccionado del grupo consistente en uridina, desoxirribouridina, ribotimidina,
    desoxirribotimidina, adenosina o desoxiadenosina naturales o modificadas;
    en la que z” puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de N2-(N')y;
    en la que cada uno de Z y Z’ esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es
    independientemente 1-5 nucleotidos consecutivos, restos no nucleotidicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y en la que la hebra anticodificante comprende una secuencia anticodificante de SEQ ID NO: 127.
  2. 2. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 1 en la que x = y= 18.
  3. 3. La molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la hebra
    codificante y la hebra anticodificante son el oligonucleotido descrito como SERPINH1_2 (SEQ ID NO: 60 y 127).
  4. 4. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 3, que tiene la estructura
    (hebra anticodificante de SEQ ID NO: 127)
    (hebra codificante de SEQ ID NO: 60)
    imagen1
    en la que cada “|” representa un apareamiento de bases entre los ribonucleotidos;
    en la que cada uno de A, C, G y U es independientemente un ribonucleotido no modificado o modificado o un resto no convencional;
    en la que cada uno de Z y Z' esta independientemente presente o ausente, pero si esta presente es independientemente 1-5 nucleotidos o restos no nucleotfdicos consecutivos o una combinacion de los mismos conectados covalentemente con el extremo 3' de la hebra en que esta presente; y
    en la que z'' puede estar presente o ausente, pero si esta presente es un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de la hebra codificante.
  5. 5. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 1, en la que la hebra codificante comprende adicionalmente Z', y en la que opcionalmente Z' incluye un resto C3OH o un resto C3Pi.
  6. 6. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 5, en la que cada uno de Z y/o Z' incluye dos restos alquilo ligados covalentemente con el extremo 3' de la hebra anticodificante o hebra codificante a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato y ligados covalentemente entre sf a traves de un ligamiento fosfodiester o fosforotioato, y en la que opcionalmente Z y/o Z' es C3Pi-C3Pi o C3Pi-C3OH.
  7. 7. La molecula de acido nucleico bicatenario de la reivindicacion 3, en la que x= y= 18 y N1-(N)x comprende ribonucleotidos modificados con 2'-O-metilazucar en las posiciones (5'>3') 3, 5, 9, 11, 13, 15 y 17.
  8. 8. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 4, en la que la hebra anticodificante comprende una o mas pirimidinas y/o purinas modificadas con 2'-OMe-azucar, un ribonucleotido 2'-5' en posicion 5, 6, 7 u 8 y un saliente nucleotidico o no nucleotidico 3'-terminal.
  9. 9. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 4, en la que la hebra codificante comprende 4 o 5 nucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3'-terminal o penultima, un resto nucleotidico o no nucleotidico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'.
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    30
  10. 10. La molecula de acido nucleico bicatenaria de las reivindicacion 4, en la que z'' esta presente y comprende
    un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5' de la hebra codificante, en la que el resto de caperuza se selecciona opcionalmente del grupo consistente en un resto de ribosa abasico, un resto de ribosa abasico invertido, un resto de desoxirribosa abasico invertido, un resto de desoxirribosa abasico y modificaciones de los mismos; C6-imino-Pi; un nucleotido espejo; 5'OMe-nucleotido; 4',5-metilenonucleotido; 1-(P-D-
    eritrofuranosil)nucleotido; 4'-tionucleotido, nucleotido carbodclico; fosfato de 5'-aminoalquilo; fosfato de 1,3-diamino- 2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo, fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminodecilo; fosfato de hidroxipropilo, 1,5-anhidrohexitolnucleotido; a-nucleotido; treopentofuranosilnucleotido; 3',4'-seconucleotido adclico; 3,4- dihidroxibutilnucleotido; 3,5-dihidroxipentilnucleotido, resto abasico 5'-5'-invertido; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino y restos metilfosfonato y 5'-mercapto de puente y no de puente.
  11. 11. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 1, en la que la hebra anticodificante es la
    SEQ ID NO: 127 e incluye ribonucleotidos modificados con 2'OMe-azucar, un 2'-5' ribonucleotido en al menos una
    de las posiciones 1, 5, 6 o 7 y un resto no nucleotfdico 3-terminal conectado covalentemente con el extremo 3'; y la hebra codificante es la SEQ ID NO: 60 e incluye al menos un ribonucleotido 2'-5' o ribonucleotido modificado con 2'OMe, un resto no nucleotfdico conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza conectado covalentemente con el extremo 5'.
  12. 12. La molecula de acido nucleico bicatenaria de la reivindicacion 4, en la que la hebra anticodificante
    comprende ribonucleotidos modificados con 2'-O-metilazucar en las posiciones (5'>3') 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, un ribonucleotido 2'-5' en la posicion (5'>3') 7 y un resto no nucleotfdico 3Pi-C3OH conectado covalentemente con el extremo 3', y en la que la hebra codificante comprende 5 ribonucleotidos 2'-5' consecutivos en las posiciones 3'- terminales (5'>3') 15, 16, 17, 18 y 19, un resto no nucleotfdico C3Pi conectado covalentemente con el extremo 3' y un resto de caperuza desoxirribonucleotfdico abasico invertido conectado covalentemente con el extremo 5'.
  13. 13. La molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en el
    tratamiento de un individuo que padece una enfermedad asociada a hsp47, en la que dicha enfermedad comprende opcionalmente fibrosis.
  14. 14. Una composicion que comprende la molecula de acido nucleico bicatenaria de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un portador farmaceuticamente aceptable.
    FIGURA 1
    imagen2
    vy>tn vyh^ |vybt* N/Vb* vybfc vy*>fc s.'Vb^
    Tratamiento:
    1. celulas solo
  15. 2. RNAiMAX
  16. 3. RNAiMAX + ARNic aleatorizado
  17. 4. RNAiMAX + siGFP
    serial de fluorescencia restante %
    FIGURA 2
    B
    Linea celular 293 HSP47-GFP
    Linea celular 293 GP46-GFP
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    155
    aleatorizado
    siH$P47-C
    siHsp47-1
    siHsp47-2
    imagen6
    imagen7
    siHsp47-2d -
    siHsp47-1 + siHsp47-2
    'i-
    K>
    o
    _J_
    imagen8
    §
    o
    J________I_
    oo o
    o o
    _l______L_
    m
    sg
    _I cn CD 05
    siHsp47-1 + siHsp47-2d
    FIGURA3
    156
    imagen9
    imagen10
    o
    c
    2
    Area fibrotica (%)
    FIGURA5
    imagen11
    Rata enferma VA-Lip-si HS P47C VA-Lip-SfHSP47C VA-Ltp,siHSP47€ Tratamiento (giucosa ai 5 %) (1,5mg^Kg> (2,25kg;kg) (3,0mg<kg} ficticio
    Control sin tratamiento
    1
    61
    121
    181
    241
    301
    361
    421
    481
    541
    601
    661
    721
    781
    841
    901
    961
    1021
    10S1
    1141
    1201
    1261
    1321
    1301
    1441
    1501
    1561
    1621
    1681
    1741
    1801
    1861
    1921
    1981
    2041
    2101
    2161
    FIGURA 6 (ARNm basado en la secuencia de ADNc NM_001235) ucuuuggcuu uuuuuggcgg agcuggggcg cccuccggaa gcguuuccaa cuuuccagaa guuucucggg acgggcagga gggggugggg acugceauau auagaucccg ggagcagggg agcgggcuaa gaguagaauc gugucgcggc ucgagagcga gagucacguc ccggcgcuag cccagcccga cccaggccca ccguggugca cgcaaaccac uuccuggcca ugcgcucccu ccugcuucuc agcgccuucu gccuccugga ggcggcccug gccgccgagg ugaagaaacc ugcagccgca gcagcuccug gcacugcgga gaaguugagc cccaaggcgg ccacgcuugc cgagcgcagc gccggccugg ccuucagcuu guaccaggcc auggccaagg accaggcagu ggagaacauc cuggugucac ccgugguggu ggccucgucg cuagggcucg ugucgcuggg cggcaaggcg accacggcgu cgcaggccaa ggcagugcug agcgccgagc agcugcgcga cgaggaggug cacgccggcc ugggcgagcu gcugcgcuca cucagcaacu ccacggcgcg caacgugacc uggaagcugg gcagccgacu guacggaccc agcucaguga gcuucgcuga ugecuucgug cgcagcagca agcagcacua caacugcgag cacuccaaga ucaacuuccg cgacaagcgc agcgcgcugc aguccaucaa cgagugggcc gcgcagacca ccgacggcaa gcugcccgag gucaccaagg acguggagcg cacggacggc gcccugcuag ucaacgccau guucuucaag ccacacuggg augagaaauu ccaccacaag augguggaca accguggcuu cauggugacu cgguccuaua ccgugggugu caugaugaug caccggacag gccucuacaa cuacuacgac gacgagaagg aaaagcugca aaucguggag augccccugg cccacaagcu qucaagccuc aucauccuca ugcqqcauca cguggagccu cucgagcgcc uugaaaagcu gcuaaccaaa gagcagcuga agaucuggau ggggaagaug cagaagaagg cuguugccau cuccuugccc aagggugugg uggaggugac ccaugaccug cagaaacacc uggcugggcu gggccugacu gaggccauug acaagaacaa ggccgacuug ueacgcaugu caggcaagaa ggaccuguac cuggccagcg uguuccacgc caccgccuuu gaguuggaca cagauggcaa ccccuuugac caggacaucu acgggcgcga ggagcugcgc agccccaagc uguucuacgc cgaccacccc uucaucuucc uagugcggga cacccaaagc ggcucccugc uauucauugg gcgccugguc cggccuaagg gugacaagau gcgagacgag umauagggcc ucagggugca cacaggaugg caggaggcau ccaaaggcuc cugagacaca ugggugcuau ugggguuggg ggggagguga gguaccagcc uuggauacuc cauggggugg ggguggaaaa acagaccggg guucccgugu gccugagtgg accuucccag cuagaauuca cuccacuugg acaugggccc cagauaccau gaugcugage ccggaaacuc cacauccugu gggaccuggg ccauaguc.au ucugccugcc cugaaagucc cagaucaagc cugccucaau caguauucau auuuauagcc agguaceuuc ucaccuguga gaccaaauug agcuaggggg gucagccagc ccucuucuga cacuaaaaoa ccucagcugc cuccccagcu cuaucccaac cucucccaac uauaaaacua ggugcugcag qqqqugggac caggcacccc cagaaugacc uggccgcagu gaggcggauu gagaaggagc ucccaggagg ggcuucuggg cagacucugg ucaagaagca ucgugucugg cguugugggg augaacuuuu uguuuuguuu cuuccuuuuu uaguucuuca aagauaggga gggaaggggg aacaugagcc uuuguugcua ucaauccaag aacuuauuug uacauuuuuu uuuucaauaa aacuuuucca augacauuuu guuggagcgu ggaaaaaa (SEO ID HO: 1)
    FIGURA7 (secuencia de proteina NP_001226)
    L MRSLLLLSAF CLLEAALAAE VKKPAAAAAP GTAEKLSFKA ATLAERSAGL AFSLYQAMAK 61 DQAVENILVS PVWASSLGL VSLGGKATTA SQAKAVLSAE QLRDEEVHAG LGELLRSLSN 121 STARMVTWKL GSRLYGPSSV SFADDFVRSS KQHYNCEHSK TNFRDKRSAL QSINEWAAQT 181 TDGKLPEVTK DVERTDGALL VNAMFFKPHW DEKFHHKMVD NRGFMVTRSY TVGVMMMHRT 241 GLYNYYDDEK EKLQIVEMPL AHKLSSLIIL MPHHVEPLER LEKLLTKEQL KIWMGKMQKK 301 AVAISLPKGV VEVTHDLQKH LAGLGLTEAI DKNKADLSRM SGKKDLYLAS VFHATAFELD 361 TDGNPFDQDI YGREELRSFK LFYADHPFIF LVRDTQ5GSL LFIGRLVRPK GDKMRDEL <SEQ ID NO: 2)
    5
    FIGURA 8 (secuencia de codificacion de NP_001235)
    1 atgcgctccc tcctgcttct cagcgccttc tgcctcctgg aggcggccct 61 gtgasgaaac ctgcagccgc agcagctcct ggcactgcgg agaagttgag 121 gccacgcttg ccgagcgcag cgccggcctg gccttcagct tgtaccagge 131 gaccaggeag tggagaacat cctggtgtca cccgtggtgg tggcctcgtc 241 gtgtcgctgg gcggcaaggc gaccacggcg tcgcaggcca aggcagtgct 301 eagctgcgcg acgaggaggt gcacgccggc ctgggcgagc tgctgcgctc 361 tccacggcgc gcaacgtgac ctggaagctg ggcagccgac tgtacggacc 421 agcttcgctg atgacttcgt gcgcagcagc aagcagcact acaactgcga 481 atcaac^tcc gcgacaagcg cagcgcgctg cagtccatoa acgagtgggc 541 acogacggca agctgcccga ggtcaccaag gacgtggagc gcacggacgg 601 gtcaacgcca tgttcttcaa gccacactgg gatgagaaat tccaccacaa 661 aaccgtggct tcatggtgac tcggtcctat accgtgggtg tcatgatgat 721 ggcctctaca actactacga cgacgagaag gaaaagctgc aaatcgtgga 701 gcccacaagc tctccagcct catcatcctc atgccccatc acgtggagcc 841 cttgaaaagc tgctaaccaa agagcagctg aagatctgga tggggaagat 901 gctgttgcca tctccttgtc caagggtgtg gtggaggtga cccatgacct 961 ctggctgggc tgggcctgac tgaggccatt gacaagaaca aggccgactt 1021 tcaggcaaga aggacctgta ectggccagc gtgttccacg ccaccgcctt 10B1 acagatggea acccctttga ccaggacatc tacgggcgcg aggagctgcg 1141 ctgttctacg ccgaccaccc cttcatcttc ctagtgcggg acacccaaag 1201 ctattcattg ggcgcctggt ccggcctaag ggtgacaaga tgcgagacga (SEQ ID NO: 59>
    ggccgccgag
    ccccaaggcg
    catggccaag
    getagggetc
    gagcgccgag
    actcagcaac
    cagctcagtg
    gcactgcaag
    cgcgcagacc
    cgccctgcta
    gatggtggac
    gcaccggaca
    gatgcccctg
    tctcgagcgc
    gcagaagaag
    gcagaaacac
    gtcacgcatg
    tgagttggac
    cagccccaag
    cggctccctg
    gttatag
    5
    imagen12
    Plasma humano normal, horas
    imagen13
    FIGURA 9B
    Plasma humano normal, horas
    FIGURA 9C
    Plasma humano normal, horas
    ds 1 3 6 8 10 16 24 ds
    imagen14
    5
    imagen15
    FIGURA9D
    Plasma humano normal, horas
    3 6 8 10 16 24
    imagen16
    imagen17
    imagen18
    FIGURA9E
    Plasma humano normal, horas
    FIGURA 9F
    imagen19
    5
    imagen20
    imagen21
    FIGURA9G
    Plasma humano normal, horas
    FIGURA 9H
    Plasma humano normal, horas
    FIGURA 9I
    Plasma humano normal, horas
    ST 0 1 r 6 810 16 JA dT
    imagen22
    imagen23
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    imagen30
    imagen31
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