ES2557810T3 - Métodos y composiciones para tratar neuropatías - Google Patents

Abstract

El uso de un agente para el tratamiento o la prevención de una axonopatía en un mamífero que lo necesite, en el que el agente es NaMN, NMN, NmR, un ácido nucleico que codifica una NMNAT o resveratrol.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para tratar neuropatfas.

Campo

Esta invencion se refiere al uso de un agente para tratar o prevenir axonopatfas.

Antecedentes

La degeneracion de los axones aparece en una diversidad de enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson y de Alzheimer, asf como despues de lesiones traumaticas, toxicas o isquemicas en las neuronas. Estas enfermedades y trastornos estan asociados con axonopatfas que incluyen la disfuncion axonal. Un ejemplo de axonopatfa es la degeneracion walleriana (Waller, Philos. Trans. R. Soc. Lond., 140:423-429, 1850), que aparece cuando la porcion distal del axon se separa del cuerpo celular. El axon separado sucumbe con rapidez a la degeneracion. Por tanto, la axonopatfa puede ser una caracterfstica crftica de las enfermedades y trastornos neuropaticos, y los deficits axonales pueden ser un componente importante de la discapacidad de un paciente.

Sumario

Por consiguiente, los presentes inventores han logrado descubrir que la degeneracion axonal puede disminuir o prevenirse aumentando la actividad NAD en neuronas enfermas y/o danadas. Se cree que la mayor actividad NAD puede actuar aumentando la actividad sirtuina que, a su vez, produce una disminucion en la degeneracion axonal de celulas neuronales danadas. Asf, una estrategia para prevenir la denegeracion axonal puede ser activando las moleculas de situina, concretamente SIRT1, en axones de mamffero danados. La activacion de SIRT1 puede realizarse a traves de una accion directa sobre la molecula de SIRT1 o aumentando el suministro de nicotinamida adenina dinucleotido (NAD), que actua como sustrato para la actividad histona/protefna desacetilasa de SIRT1. La activacion de SIRT1 produce una disminucion en la gravedad de la degeneracion axonal o la prevencion de la degeneracion axonal. Tambien se cree que es posible que el aumento en la actividad NAD pueda actuar a traves de otros mecanismos que no impliquen a la sirtuina. Asf, el aumento en la actividad NAD, que puede actuar aumentando la actividad SIRT1 o a traves de otro mecanismo o mecanismos, o de ambas formas, puede disminuir o prevenir la degeneracion axonal en axones de mamffero danados.

Asf, en diversas realizaciones, la presente invencion se dirige al uso de un agente para el tratamiento o la prevencion de una axonopatfa en un mamffero que lo necesite, en el que el agente es NaMN, NMN, NmR, un acido nucleico que codifica una NMNAT o resveratrol.

El agente puede aumentar la actividad SIRT1 aumentando la actividad NAD. Se cree que un aumento en la actividad NAD puede aumentar la actividad sirtuina porque el NAD puede actuar como sustrato de SIRT1. Estos agentes pueden incluir NAD o NADH, un precursor de nAd, un intermedio en la via de reciclaje de NAD o una sustancia que genere NAD, tal como una nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa (NMNAT), o un acido nucleico que codifique una nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa. La nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa puede ser una protefna NMNAT 1.

En una realizacion, el agente puede ser resveratrol.

Este agente puede ser NAD o NADH, nicotinamida mononucleotido, acido nicotfnico mononucleotido o nicotinamida ribosido o sus derivados, o una enzima que genere NAD, tal como nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa, o un acido nucleico que codifique una enzima que genere NAD, tal como un acido nucleico que codifique una nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa, o un agente que aumente la expresion de un acido nucleico que codifica una enzima en la via que genera NAD, o un agente que aumente la actividad y/o la estabildad de una enzima en la via que genera NAD, o un agente que aumente la actividad NAD. La nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa puede ser una protefna NMNAT1 o una protefna NMNAT3.

En la presente invencion, la neuropatfa asociada con la degradacion axonal puede ser cualquiera de una serie de neuropatfas tales como, por ejemplo, las que son hereditarias o congenitas o que estan asociadas con la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la infeccion por herpes, la diabetes, la esclerosis lateral amiotrofica, una enfermedad desmielinizante, isquemia o ictus, lesiones qufmicas, lesiones termicas, SIDA y similares. Ademas, otras enfermedades neurodegenerativas que no se han mencionado anteriormente, asf como cualquier subconjunto de las enfermedades mencionadas anteriormente, tambien pueden ser tratadas con el agente de la presente invencion. Estos subconjuntos de enfermedades pueden incluir la enfermedad de Parkinson o enfermedades no parkinsonianas, la enfermedad de Alzheimer o enfermedades que no son Alzheimer, etc.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 indica que la actividad NMNAT1 en la protefna de fusion Wlds produce un retraso en la degeneracion de axones danados, y muestra:

A) Una degeneracion walleriana in vitro en cultivos de explantes neuronales de ganglios de la rafz dorsal (DRG)

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infectados con lentivirus que expresan la protefna Wlds o EGFP, en la que se muestran las neuritas inmunorreactivas a tubulina pill antes de la transeccion y 12, 24, 48 y 72 hr despues de la transeccion (escala de las barras = 1 mm, y “*” indica la localizacion de los cuerpos celulares antes de la extirpacion); y

B) Una degeneracion walleriana in vitro en neuronas DRG infectadas con lentivirus que expresan solo EGFP, la protefna Wlds, la porcion Ufd2a (70 restos) de la protefna Wlds condensada con EGFP (Ufd2a(1-70)-EGFP), Ufd2a(1-70)-EGFP con una senal de localizacion nuclear C-terminal, la porcion NMNAT1 de la protefna Wlds condensada con EGFP, Ufd2a dominante-negativa (Ufd2a(P1140A)), o una construccion de ARNmc de Ufd2a, en la que se muestran imagenes representativas de neuritas y los datos del analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes (porcentaje de neuritas remanentes con relacion a la pretranseccion + D.E.) en el momento indicado con cada construccion (parte inferior izquierda), y “*” indica una diferencia significativa (p < 0,0001) con neuronas infectadas con EGFP; tambien muestra la senal de EGFP antes de la transfeccion, que confirma la expresion del transgen (fila inferior; escala de las barras = 50 pm) y un analisis de la inmunotransferencia que confirma la expresion de la protefna por la transferencia genica lentivfrica y la infrarregulacion del ARNmc de la protefna Ufd2a (paneles en la parte inferior derecha).

La figura 2 indica que un mayor suministro de NAD protege a los axones frente a la degeneracion despues de sufrir danos, y muestra:

A) La actividad enzimatica de las protefnas Wlds y NMNAT1 de tipo salvaje y mutantes, en la que lisados preparados a partir de celulas HEK293 que expresan la protefna indicada se ensayaron para la produccion de NAD utilizando nicotinamida mononucleotido como sustrato; la cantidad de NAD generado en 1 h se convirtio en NADH, se cuantifico mediante la intensidad de fluorescencia y se normalizo a la concentracion total de protefnas para demostrar que ambos mutantes fundamentalmente no presentan actividad enzimatica; y

B) Una degeneracion walleriana in vitro en neuronas DRG infectadas con lentivirus que expresan la protefna NMNAT1 o Wlds, los mutantes de estas protefnas que carecen de actividad de sfntesis de NAD NmNAT1(W170A) y Wlds(W258A), o EGFP, en la que el diagrama de barras muestra los datos del analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes en el momento indicado para cada construccion (porcentaje de neuritas remanentes con relacion a la pretranseccion + D.E.), y “*” indica una diferencia significativa (p < 0,0001) con neuronas infectadas con EGFP;

C) La expresion de protefnas en celulas infectadas con lentivirus detectadas mediante un analisis de inmunotransferencia empleando anticuerpos contra el marcador 6XHis; y

D) Un explante neuronal de DRG que expresa NMNAT1 o EGFP (control) cultivado con vinscristina 0,5 pM, en la que se muestran imagenes representativas de neuritas (por contraste de fase; Barra = 1 mm) en los momentos indicados despues de la adicion de vincristina y se representa graficamente la cuantificacion del efecto protector en los momentos indicados como el area cubierta por las neuritas con relacion a la cubierra por las neuritas antes del tratamiento.

La figura 3 indica que la proteccion axonal requiere el pretratamiento de las neuronas con NAD antes de los danos, y muestra:

A) Una degeneracion walleriana in vitro que emplea explantes de DRG cultivados en presencia de diversas concentraciones de NAD anadido 24 hr antes de la transeccion axonal; y

B) Explantes de DRG preincubados con NAD 1 mM durante 4, 8, 12, 24 o 48 hr antes de la transeccion, en la que el diagrama de barras muestra el numero de neuritas remanentes en cada experimento (porcentaje de neuritas remanentes con relacion a la pretranseccion + D.E.) en cada uno de los momentos indicados, y “*” indica una proteccion axonal significativa comparado con el control (p < 0,0001).

La figura 4 indica que la proteccion axonal dependiente de NAD es inducida por la activacion de SIRT1, y muestra:

A) Una degeneracion walleriana in vitro que emplea cultivos de explantes de DRG preincubados con NAD 1 mM solo (control) o en presencia de sirtinol 100 pM (un inhibidor de Sir2) o 3-aminobenzimida 20 mM (3AB, un inhibidor de PARP);

B) Una degeneracion walleriana in vitro que emplea explantes de DRG incubados con resveratrol (10, 50 o 100 pM); y

C) izquierda: Una degeneracion walleriana in vitro que emplea cultivos de explantes de DRG infectados con lentivirus que expresan ARNmc especffico para cada miembro de la familia SIRT (SIRT1-7), en la que el diagrama de barras muestra el analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes (porcentaje de neuritas remanentes con relacion a la pretranseccion + D.E.) en los momentos indicados para cada condicion, y “*” indica puntos significativamente diferentes del control (<0,0001);

tabla intermedia: La eficacia de cada ARNmc de SIRT (expresada como el porcentaje del nivel de ARNm de tipo

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salvaje) empleando qRT-PCR en celulas NIH3T3 infectadas; y

derecha: Una inmunotransferencia que emplea anticuerpos contra SIRT1 para demostrar la menor expresion de SIRT1 en presencia de ARNmc de SIRT1, que bloquea con eficacia la proteccion axonal dependiente de NAD.

La figura 5 ilustra la via biosintetica de NAD de mamffero, en la que se ilustra la biosfntesis de NAD de mamffero prevista basandose en el analisis de la expresion enzimatica y en estudios en levaduras y eucariotas inferiores (abreviaturas utilizadas: QPRT, quinolinato fosforribosiltransferasa; NaPRT, acido nicotfnico fosforribosiltransferasa; NmPRT, nicotinamida fosforribosiltransferasa; Nrk nicotinamida ribosido quinasa; NMNAT, nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa; QNS, NAD sintasa).

La figura 6 muestra el analisis de la expresion de la enzimas biosinteticas de NAD en mamfferos, que muestra (A) la determinacion de los niveles de ARNm de enzimas biosinteticas de NAD despues de 1, 3, 7 y 14 dfas despues de la transeccion de los nervios en DRG de rata mediante qRT-PCR, en la que el nivel de expresion se normalizo a la expresion de gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa en cada muestra, y se indica con relacion al nivel de expresion en DRG no axotomizados; (B) la degeneracion de las neuritas introducida incubando DRG en rotenona 1 o 0,1 pM durante el tiempo indicado, y la determinacion de los niveles de ARNm de las enzimas sinteticas de NAD mediante qRT-PCR segun se describe en el texto.

La figura 7 ilustra la localizacion subcelular de las enzimas NMNAT y su capacidad para proteger los axones, que muestra (A) un ensayo de degeneracion walleriana in vitro empleando cultivos de explantes neuronales dRg infectados con lentivirus que expresan NMNAT1, cytNMNAT1, NMNAT3 o nucNMNAT3, en la que se muestran fotograffas representativas tomadas a las 12 y 72 horas despues de la transeccion; (B) la localizacion subcelular de NMNAT1, cytNMNAT1, NMNAT3 o nucNMNAT3 en celulas HEK 293T empleando una inmunohistoqufmica con un anticuerpo contra el marcador 6xHis para detectar cada una de las protefnas y una tincion de las celulas con un tinte marcador nuclear (bisbenzimida) para la comparacion, para determinar la localizacion nuclear o citoplasmica de cada protefna (escala de las barras = 25 pm); (C) actividad enzimatica de NMNAT1 y NMNAT3 de tipo salvaje y mutante, en la que cada protefna marcada con 6xHis se purifico a partir de un lisado de celulas hEk 293t que expresan NMNAT1, cytNMNAT1, NMNAT3 o nucNMNAT3, en la que la cantidad de NAD generado despues de 1 hora a 37 °C se convirtio en NADH, se cuantifico y se normalizo a la concentracion de protefnas; (D) la expresion de protefnas de NMNAT1, cytNMNAT1, NMNAT3 y nucNMNAT3 mediante una transferencia genica de lentivirus confirmada mediante un analisis de inmunotransferencia de celulas HEK 293T infectadas con cada uno de los virus; y (E) un ensayo de la degeneracion walleriana in vitro que emplea cultivos de explantes neuronales DRG infectados con lentivirus que expresan NMNAT1, cytNMNAT1, NmNaT3 o nucNMNAT3, y muestra los datos del analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes a las 12, 24, 48 y 72 horas despues de la axotomfa.

La figura 8 muestra la aplicacion exogena de sustratos biosinteticos de NAD y su capacidad para proteger a los axones, que muestra (A) un ensayo de la degeneracion walleriana in vitro que emplea cultivos de explantes neuronales DRG despues de la aplicacion exogena de NAD, NmR, en la que se muestran fotograffas representativas tomadas a las 12, 24, 48 y 72 horas despues de la transeccion; (B) un ensayo de la degeneracion walleriana in vitro que emplea cultivos de explantes neuronales DRG despues de la aplicacion exogena de Na, Nam, NaMN, NMN, NaAD, NAD y NmR, que muestra los datos del analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes a las 12, 24, 48 y 72 horas despues de la axotomfa; (C) explantes neuronales DRG infectados con lentivirus que expresan NaPRT e incubados con o sin Na 1 mM durante 24 horas antes de la axotomfa, en un ensayo de la degeneracion walleriana in vitro que muestra los datos del analisis cuantitativo del numero de neuritas remanentes a las 12, 24, 48 y 72 horas despues de la axotomfa.

La figura 9 ilustra la transeccion del nervio optico despues de una inyeccion intravitreal de los sustratos biosinteticos de NAD, NMN, NmR o Nam en el compartimento intravitreal del ojo izquierdo de ratas. Se permitio que se incorporasen a las celulas ganglionares retinianas durante 24 horas, tras lo cual se transecciono el nervio optico izquierdo mediante enucleacion del ojo, y los nervios opticos derecho e izquierdo se recogieron a los 4 dfas despues de la transeccion y se analizaron mediante una transferencia Western, en la cual se emplearon los nervios opticos transeccionados de los ratones sin ningun tratamiento anterior a la axotomfa como controles negativos; en la figura se muestran los datos del analisis cuantitativo del porcentaje de inmunorreactividad de los neurofilamentos remanantes del nervio optico transeccionado con relacion al no transeccionado + D.E.

Descripcion detallada

La presente invencion implica el uso de un agente para el tratamiento o la prevencion de una axonopatfa en un mamffero que lo necesite, en el que el agente es NaMN, NMN, NmR, un acido nucleico que codifica una NMNAT o resveratrol. Se cree que un aumento en la actividad NAD puede aumentar la actividad sirtuina que, a su vez, produce una disminucion en la degeneracion axonal de celulas neuronales danadas, comparado con la degeneracion axonal que aparece en celulas neuronales danadas no tratadas con el agente. Esta disminucion en la degeneracion axonal puede incluir una mejora completa o parcial de los danos en la neurona. Tambien se cree que es posible que el aumento en la actividad NAD pueda actuar a traves de otros mecanismos que no impliquen a moleculas de sirtuina para producir o contribuir a la produccion de una disminucion en la degneracion axonal.

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Siete moleculas de sirtuina conocidas, denominadas SIRT, forman la familia Sir2 de histona/protefna desacetilasas en mamfferos, y todas estas moleculas de sirtuinas se incluyen dentro del alcance de la presente invencion. Las siete sirtuinas humanas, SIRT1-SIRT7, son histona/protefna desacetilasas dependientes de NAD que se describen con mas detalle en NCBI LocusLink ID NO:23411, 22933, 23410, 23409, 23408, 51548 y 51547, respectivamente (vease
http://www.ncbi.nlm.hih.gov/LocusLink/).

Las composiciones pueden aumentar la actividad de una o mas de las sirtuinas y, en particular, diversos agentes de la presente invencion aumentan la actividad de SIRT1.

Cuando se indica la actividad de una sustancia, se hace referencia a la concentracion de la sustancia concreta o la eficacia funcional de la sustancia. La concentracion de una sustancia puede aumentar por medio de numerosos factores que incluyen, por ejemplo, un aumento de la sfntesis, una disminucion de la degradacion, un aumento de la biodisponibilidad de la sustancia, o una disminucion de la union de la sustancia, o bien un aumento de la cantidad disponible de la sustancia libre. El aumento en la eficacia funcional puede generarse, por ejemplo, a partir de un cambio en la conformacion molecular, un cambio en las condiciones en las que actua la sustancia, un cambio en la sensibilidad a la sustancia, y similares. Un aumento en la actividad con respecto a las moleculas de sirtuina significa un aumento en la concentracion o una potenciacion de la eficacia funcional o un aumento en la disponibilidad de NAD o un aumento en el flujo a lo largo de una o mas vfas biosinteticas para el NAD, o cualquiera de sus combinaciones.

Los danos axonales pueden ser provocados por lesiones traumaticas o por lesiones no mecanicas debidas a enfermedades o trastornos, y el resultado de estos danos puede ser la degeneracion o la disfuncion del axon y la perdida de la actividad neuronal funcional. Las enfermedades y los trastornos que producen o que estan asociados con dichos danos axonales estan englobados en un gran numero de enfermedades y trastornos neuropaticos. Estas neuropatfas pueden incluir neuropatfas perifericas, neuropatfas centrales, y sus combinaciones. Ademas, las manifestaciones neuropaticas perifericas pueden ser producidas por enfermedades centradas principalmente en el sistema nervioso central, y las enfermedades fundamentalmente perifericas o sistemicas pueden producir manifestaciones en el sistema nervioso central.

Las neuropatfas perifericas implican danos en los nervios perifericos, y estos pueden ser provocados por enfermedades de los nervios o como resultados de enfermedades sistemicas. Algunas de estas enfermedades pueden incluir diabetes, uremia, enfermedades infecciosas, tales como SIDA o lepra, deficiencias nutricionales, trastornos vasculares o del colageno, tales como aterosclerosis, y enfermedades autoinmunologicas, tales como lupus eritematoso sistemico, escleroderma, sarcoidosis, artritis reumatoide y poliarteritis nodosa. La degeneracion de los nervios perifericos tambien puede ser el resultado de danos traumaticos, concretamente mecanicos, en los nervios, asf como de danos qufmicos o termicos en los nervios. Los trastornos que lesionan los nervios perifericos incluyen lesiones de compresion o atrapamiento, tales como glaucoma, sfndrome del tunel carpiano, traumatismos directos, lesiones penetrantes, contusiones, fracturas o huesos dislocados; una presion que implique a los nervios superficiales (ulnar, radial o peroneal) que pueden ser el resultado del uso prolongado de muletas o por mantener una posicion durante mucho tiempo, o por un tumor; hemorragia intraneural; isquemia; exposicion al frfo o a radiacion o a ciertas medicinas o sustancias toxicas, tales como herbicidas o plaguicidas. En particular, los danos en los nervios pueden ser el resultado de lesiones qufmicas debidas a un agente anticancer citotoxico tal como, por ejemplo, un vinca-alcaloide, tal como vincristina. Los sfntomas tfpicos de estas neuropatfas perifericas incluyen debilidad, entumecimiento, parestesia (sensaciones anomales, tales como quemazon, cosquilleo, pinchazos u hormigueo) y dolor en los brazos, manos, piernas y/o pies. La neuropatfa tambien puede estar asociada con una disfuncion mitocondrica. Estas neuropatfas pueden mostrar unos menores niveles de energfas, es decir, unos menores niveles de NAD y ATP.

La neuropatfa periferica tambien puede ser una neuropatfa metabolica y endocrina que incluye un amplio espectro de trastornos de nervios perifericos asociados con enfermedades sistemicas de origen metabolico. Estas enfermedades, algunas de las cuales se han mencionado anteriormente, incluyen diabetes mellitus, hipoglucemia, uremia, hipotiroidismo, insuficiencia hepatica, policitemia, amiloidosis, acromegalia, porfiria, trastornos del metabolismo de lfpidos/glicolfpidos, deficiencias nutricionales/de vitaminas, y trastornos mitocondricos, entre otros. La caracterfstica distintiva de estas enfermedades es la implicacion de los nervios perifericos por medio de la alteracion de la estructura o la funcion de la mielina y los axones debido a la desregulacion de la via metabolica.

Las neuropatfas tambien incluyen neuropatfas opticas, tales como glaucoma; la degeneracion de ganglios retinianos, tal como la asociada con la retinitis pigmentosa y las neuropatfas retinianas externas; la degeneracion y/o neuritis del nervio optico, que incluye la asociada con la esclerosis multiples; lesiones traumaticas en el nervio optico que pueden incluir, por ejemplo, lesiones durante la retirada de un tumor; neuropatfas opticas hereditarias, tales como la enfermedad de Kjer y la neuropatfa optica hereditaria de Leber; neuropatfas opticas isquemicas, tales como las que aparecen despues de una arteritis de celulas gigantes; neuropatfas opticas metabolicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, que incluyen la neuropatfa de Leber mencionada anteriormente, deficiencias nutricionales, tales como deficiencias en la vitamina B12 o acido folico, y toxicidades, tales como las debidas a etambutol o cianuro; neuropatfas provocadas por reacciones adversasa a farmacos y neuropatfas provocadas por una deficiencia en vitaminas. Las neuropatfas opticas isquemicas tambien incluyen la neuropatfa optica isquemica anterior no arterftica.

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Las enfermedades neurodegenerativas que estan asociadas con la axonopatfa en el sistema nervioso central incluyen una diversidad de enfermedades. Estas enfermedades incluyen las que implican una demencia progresiva tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, la enfermedad de Pick, y la enfermedad de Huntington; enfermedades del sistema nervioso central que afectan a la funcion muscular tales como, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, enfermedades de neuronas motoras y ataxias progresivas, tales como la esclerosis lateral amiotrofica; enfermedades desmielinizantes tales como, por ejemplo, esclerosis multiples; encefalitis vfricas tales como, por ejemplo, las provocadas por enterovirus, arbovirus y virus del herpes simplex; y enfermedades prionicas. Las lesiones mecanicas, tales como el glaucoma o lesiones traumaticas en la cabeza y la columna vertebral tambien pueden provocar lesiones nerviosas y degeneracion en el cerebro y la medula espinal. Ademas, la isquemia y el ictus, ademas de trastornos tales como una deficiencia nutricional y una toxicidad qufmica, tal como la que producen agentes quimioterapeuticos, pueden provocar neuropatfas del sistema nervioso central.

El termino “tratamiento”, tal como se emplea en la presente, incluye la intervencion antes o despues de la aparicion de las lesiones neuronales. Como tal, un tratamiento puede evitar las lesiones neuronales mediante su administracion antes de que se produzca un primer ataque a las neuronas, y tambien puede mejorar las lesiones neuronales mediante su administracion despues de que se produzca un primer ataque a las neuronas. Este primer ataque a las neuronas puede incluir o puede ser el resultado de cualquier enfermedad o trastorno asociado con una neuropatfa. Un “tratamiento” tambien incluye la prevencion del avance de una lesion neuronal. Un “tratamiento”, tal como se emplea en la pesente, puede incluir la administracion de farmacos y/o sustancias sinteticas, la administracion de sustancias biologicas, tales como protefnas, acidos nucleicos, vectores vfricos y similares, asf como la administracion de sustancias, tales como neutraceuticos, aditivos alimentarios o alimentos funcionales.

Los agentes de la presente invencion son utiles para tratar mamfferos. Estos mamfferos incluyen seres humanos, asf como mamfferos no humanos. Los mamfferos no humanos incluyen, por ejemplo, animales de companfa, tales como perros y gatos, animales agrfcolas, tales como ganado, que incluye vacas, caballos y similares, y animales exoticos, tales como animales de zoologico.

Las sustancias que pueden aumentar la actividad sirtuina en mamfferos pueden incluir polifenoles, algunos de los cuales han sido descritos anteriormente (vease, por ejemplo, Howitz et al., Nature, 425:191-196, 2003, y la informacion suplementaria incluida en el artfculo). Estos compuestos pueden incluir estilbenos, tales como resveratrol, piceatanol, deoxirrapontina, trans-estilbeno y rapontina; chalconas, tales como butefna, isoliquiritigeno y 3,4,2',4',6'-pentahidroxichalcona y chalcona; flavonas, tales como fisetina, 5,7,3',4',5'-pentahidroxiflavona, luteolina, 3,6,3',4'-tetrahidroxiflavona, quercetina, 7,3',4',5'-tetrahidroxiflavona, kaempferol, 6-hidroxiapigenina, apigenina, 3,6,2',4'-tetrahidroxiflavona, 7,4'-dihidroxiflavona, 7,8,3',4'-tetrahidroxiflavona, 3,6,2',3'-tetrahidroxiflavona, 4'-

hidroxiflavona, 5,4'-dihidroxiflavona, 5,7-dihidroxiflavona, morina, flavona y 5-hidroxiflavona; isoflavonas, tales como daidzefna y genistefna; flavanonas, tales como naringenina, 3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavanona, y flavanona o catequinas, tales como (-)-epicatequina, (-)-catequina, (-)-gallocatequina, (+)-catequina y (+)-epicatequina.

Pueden identificarse otros polifenoles u otras sustancias que aumenten la actividad sirtuina desacetilasa empleando sistemas de ensayo descritos en la presente, asf como en ensayos disponibles en el mercado, tales como ensayos de enzimas fluorescentes (Biomol International L.P., Plymouth Meeting, Pensilvania). Sinclair et al. tambien describen sustancias que pueden aumentar la actividad sirtuin (Sinclair et al., documento WO2005/02672).

Otras sustancias pueden aumentar la actividad sirtuina de modo indirecto aumentando la actividad NAD como resultado de que la sirtuina concreta actue a traves de una actividad histona/protefna desacetilasa dependiente de NAD. La actividad NAD puede aumentar mediante la administracion de NAD o NADH, asf como por la sfntesis de NAD. El NAD puede sintetizarse por medio de tres vfas principales: la via de novo, en la que el NAD se sintetiza a partir del triptofano; la via de reciclaje del NAD, en la que el NAD se genera recirculando productos de NAD degradados, tales como nicotinamida (Lin et al., Current Opin. Cell Biol., 15:241-246, 2003; Magni et al., Cell Mol. Life. Sci., 61:19-34, 2004); y la via de la nicotinamida ribosido quinasa, en la que la nicotinamida ribosido es convertida en nicotinamida mononucleotido por la nicotinamida ribosido quinasa (Bieganowski et al., Cell, 117:495502, 2004). Asf, la administracion a neuronas danadas de un precursor de NAD en la via de novo tal como, por ejemplo, triptofano o nicotinato y/o sustancias en la via de reciclaje del NAD tales como, por ejemplo, nicotinamida, acido nicotfnico, acido nicotfnico mononucleotido o desamido-NAD y/o sustancias en la via de la nicotinamida ribosido quinasa tales como, por ejemplo, nicotinamida ribosido o nicotinamida mononucleotido, puede aumentar potencialmente la actividad NAD. Tal como se muestra a continuacion, la nicotinamida mononucleotido, el acido nicotfnico mononucleotido o la nicotinamida ribosido, ademas del NAD, protegen frente a la degeneracion axonal en un grado similar al NAD, pero el acido nicotfnico y la nicotinamida no producen este efecto. La mayor actividad NAD despues puede aumentar la actividad histona/protefna desacetilasa de la sirtuina en las neuronas danadas y disminuir o prevenir la degeneracion axonal. Ademas, se cree que otras sustancias pueden actuar aumentando la actividad enzimatica o aumentado los niveles de NAD, nicotinamida mononucleotido, acido nicotfnico mononucleotido, nicotinamida ribosido o enzimas de sirtuina, o disminuyendo la degradacion de NAD, nicotinamida mononucleotido, acido nicotfnico mononucleotido, nicotinamida ribosido o enzimas de sirtuina.

El NAD puede aumentar en las neuronas danadas mediante la administracion de enzimas que sintetizan NAD, o acidos nucleicos que comprenden enzimas que sintetizan NAD. Estas enzimas pueden incluir una enzima en la via de novo para sintetizar nAd, una enzima de la via de reciclaje del NAD, o una enzima de la via de la nicotinamida

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ribosido quinasa, o un acido nucleico que codifique una enzima en la via de novo para sintetizar NAD, una enzima de la via de reciclaje del NAD o una enzima de la via de la nicotinamida ribosido quinasa y, en concreto, una enzima de la via de reciclaje del NAD tal como, por ejemplo, una nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa (NMNAT), tal como NMNAT1. Asf, en un ejemplo no limitante, la administracion de una NMNAT, tal como NMNAT1 o NMNAT3, o un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una NMNAT, tal como NMNAT1 o NMNAT3, puede disminuir o prevenir la degeneracion axonal en neuronas danadas.

La enzima NMNAT1 humana (E.C.2.7.7.18) esta representada por el numero de registro de GenBank para el gen/protefna NMNAT1 humano: NP_073624; NM_022787; AAL76934; AF459819; y NP_073624; AF314163. Un variante de este gen es NMNAT-2 (KIAA0479), cuya version humana puede encontrarse en los numeros de registro de GenBank NP_055854 y NM_015039.

Tal como se emplean en la presente, las expresiones “porcentaje identico”, “porcentaje de identidad” o “% de identidad” se refieren a la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de nucleotidos. La identidad puede determinarse comparando una posicion en cada secuencia que puede ser alineada para la comparacion. Cuando una posicion equivalente en las secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son identicas en esa posicion; cuando el sitio equivalente esta ocupado por el mismo resto aminoacido u otro similar (por ejemplo, similar segun su naturaleza esterica y/o electronica), entonces las moleculas se pueden denominar homologas (similares) en esa posicion. La expresion como un porcentaje de homologfa, similitud o identidad se refiere a una funcion del numero de aminoacidos identicos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Pueden utilizarse diversos programas y/o algoritmos de alineamiento, que incluyen FASTA, BLAST, o ENTREZ. FASTA y BLAST estan disponibles como parte del paquete de analisis de secuencias GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.) y pueden utilizarse, por ejemplo, con los parametros por defecto. ENTREZ esta disponible en the National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. El porcentaje de identidad de dos secuencias puede determinarse mediante el programa GCG con una ponderacion de hueco de 1, por ejemplo, cada hueco de aminoacido se pondera como si fuera un unico desapareamiento de aminoacido o nucleotido entre las dos secuencias. Otras tecnicas para el alinemamiento se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una division de Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., EEUU. Preferiblemente, se utiliza un programa de alineamiento que permita huecos en la secuencia para alinear las secuencias. El algoritmo de Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en los alineamientos de las secuencias. Vease Meth. Mol. Biol., 70: 173-187 (1997). Ademas puede utilizarse el programa GAP que emplea el metodo de alineamiento de Needleman y Wunsch para alinear secuencias. Una estrategia de busqueda alternativa emplea el software MPSRCH, que se desarrolla en un ordenador MASPAR. MPSRCH emplea un algoritmo de Smith-Waterman para puntuar las secuencias en un ordenador masivamente en paralelo. Esta estrategia mejora la capacidad para detectar apareamientos lejanamante relacionados, y es especialmente tolerante con huecos pequenos y errores en la secuencia de nucleotidos. Las secuencias de aminoacidos codificados por acidos nucleicos pueden emplearse para buscar en bases de datos de protefnas y de ADN. Las bases de datos con secuencias individuales se describen en Methods in Enzymology, ed. Doolittle, supra. Las bases de datos incluyen Genbank, EMBL, y las bases de datos de ADN de Japon (DNA Database of Japan, DDBJ).

Un “variante” de un polipeptido se refiere a un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos del polipeptido pero esta alterada en uno o mas restos aminoacidos. El variante puede presentar cambios “conservativos”, en los que un aminoacido sustituido tiene propiedades estructurales o qufmicas similares (por ejemplo, la sustitucion de leucina por isoleucina). Un variante puede presentar cambios “no conservativos” (por ejemplo, la sustitucion de glicina por triptofano). Otras variaciones pequenas analogas pueden incluir deleciones o inserciones de aminoacidos, o ambos. Pueden encontrarse directrices para determinar cuales son los restos aminoacidos que pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin abolir la actividad biologica o inmunologica empleando programas informaticos muy conocidos en la tecnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR).

El termino “variante”, cuando se emplea en el contexto de una secuencia polinucleotfdica, puede incluir una secuencia polinucleotfdica relacionada con la de un gen concreto o su secuencia codificadora. Esta definicion tambien puede incluir, por ejemplo, variantes “alelicos”, “de corte y empalme”, “de especie” o “polimorficos”. Un variante de corte y empalme puede presentar una identidad significativa con una molecula de referencia, pero en general presentara un numero mayor o menor de polinucleotidos debido al corte y empalme alternativo de exones durante el procesamiento del ARNm. El correspondiente polipeptido puede presentar dominios funcionales adicionales o pueden faltar dominios. Los variantes de especie son secuencias polinucleotfdicas que varfan de una especie a otra. Los polipeptidos resultantes generalmente presentaran una significativa identidad de aminoacidos entre si. Una variacion polimorfica es una variacion en la secuencia polinucleotfdica de un gen concreto entre individuos de una especie concreta. Los variantes polimorficos tambien pueden incluir los “polimorfismos de un unico nucleotido” (SNP), en los que la secuencia polinucleotfdica varfa en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa, por ejemplo, de una cierta poblacion, un estado de enfermedad, o una propension para desarrollar un estado de enfermedad.

Un agente que puede utilizarse para tratar o prevenir una neuropatfa segun la presente invencion puede estar formado por un polinucleotido que codifique una NMNAT. En particular, el agente puede ser una enzima que tenga

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actividad NMNAT y al menos 50% de identidad con una NMANT1 humana o al menos 50% de identidad con una NMNAT3 humana, o al menos 60% de identidad con una NMANT1 humana o al menos 60% de identidad con una NMNAT3 humana, o al menos de identidad con una NMANT1 humana o al menos 70% de identidad con una NMNAT3 humana, o al menos 80% de identidad con una NMANT1 humana o al menos 80% de identidad con una

NMNAT3 humana, o al menos 90% de identidad con una NMANT1 humana o al menos 90% de identidad con una

NMNAT3 humana, o al menos 95% de identidad con una NMANT1 humana o al menos 95% de identidad con una

NMNAT3 humana. Ademas, el agente puede estar formado por una NMNAT1 humana, una NMNAT3 humana o uno

de sus variantes sustituidos de modo conservativo.

El agente tambien puede estar formado por un polinucleotido que tenga al menos 50% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 50% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana, un polinucleotido que tenga al menos 60% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 60% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana, un polinucleotido que tenga al menos 70% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 70% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana, un polinucleotido que tenga al menos 80% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 80% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana, un polinucleotido que tenga al menos 90% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 90% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana, un polinucleotido que tenga al menos 95% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT1 humana o un polinucleotido que tenga al menos 95% de identidad con un acido nucleico que codifique una NMNAT3 humana. El agente tambien puede ser un polinucleotido que codifique una NMNAT1 humana, una NMNAT3 humana o uno de sus variantes.

La administracion puede realizarse mediante cualquier via de administracion adecuada, que incluye bucal, dental, endocervical, intramuscular, inhalacion, intracraneal, intralinfatica, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrapleural, intratecal, intratraqueal, intrauterina, intravascular, intravenosa, intravesical, intranasal, oftalmica, oral, otica, perfusion biliar, perfusion cardfaca, periodontal, rectal, espinal, subcutanea, sublingual, topica, intravaginal, transdermica, ureteral, o uretral. Las formas de dosficacion pueden ser aerosoles, que incluyen un aerosol dosimetrico, barras masticables, capsulas, capsulas que contienen granulos revestidos, capsulas que contienen granulos de liberacion retrasada, capsulas que contienen granulos de liberacion extendida, concentrados, cremas, cremas aumentadas, cremas de supositorios, discos, vendas, elixires, emulsiones, enemas, fibras de liberacion extendida, pelfculas de liberacion extendida, gases, geles, geles dosimetricos, granulos, granulos de liberacion retrasada, granulos efervescentes, gomas de mascar, implantes, inhalantes, inyectables, complejos de lfpidos inyectables, liposomas inyectables, insertos, insertos de liberacion extendida, dispositivos intrauterinos, gelatinas, lfquidos, lfquidos de liberacion extendida, lociones, lociones aumentadas, lociones de champu, aceites, unguentos, unguentos aumentados, pastas, pastillas, granulos, polvos, polvos de liberacion extendida, polvos dosimetricos, anillos, champus, disoluciones de jabon, disoluciones para barros, disoluciones/gotas, disoluciones concentradas, disoluciones/gotas formadoras de gel, esponjas, pulverizados, pulverizados dosimetricos, supositorios, suspensiones, suspensiones/gotas, suspensiones de liberacion extendida, torundas, jarabes, comprimidos, comprimidos masticables, comprimidos que contienen partfculas revestidas, comprimidos de liberacion retrasada, comprimidos dispersables, comprimidos efervescentes, comprimidos de liberacion extendida, comprimidos de disgregacion oral, tampones, cintas o trociscos/pastillas para chupar.

La administracion intraocular puede incluir la administracion mediante inyeccion, que incluye una inyeccion intravitreal, mediante colirio y mediante administracion transescleral.

La administracion tambien puede realizarse mediante la inclusion en la dieta del mamffero, tal como en un alimento funcional para seres humanos o animales de companfa.

Tambien se contempla que ciertas formulaciones que contienen las composiciones que aumentan la actividad sirtuina se administren por via oral. Estas formulaciones preferiblemente se encapsulan y se formulan con vehfculos adecuados en formas de dosificacion solidas. Algunos ejemplos de vehfculos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfato de calcio, alginatos, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, gelatina, jarabe, metilcelulosa, metil- y propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, agua, aceite mineral, y similares. Las formulaciones tambien pueden incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulgentes y suspensores, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes aromatizantes. Las composiciones pueden formularse para proporcionar una liberacion rapida, sostenida o retrasada de los ingredientes activos despues de su administracion al paciente empleando procedimientos muy conocidos en la tecnica. Las formulaciones tambien pueden contener sustancias que disminuyan la degradacion proteolftica y estimulen la absorcion tales como, por ejemplo, agentes tensioactivos.

La dosis especffica puede calcularse segun el peso corporal aproximadao o la superficie especffica corporal del paciente o el volumen del espacio corporal que va a ser ocupado. La dosis tambien dependera de la via de administracion concreta seleccionada. Los expertos en la tecnica normalmente pueden refinar aun mas los calculos necesarios para determinar la dosificacion apropiada para el tratamiento. Los expertos en la tecnica pueden realizar

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estos calculos sin experimentacion innecesaria a la luz de la actividad en las preparaciones de ensayo, tal como se se ha descrito en otros documentos para ciertos compuestos (vease, por ejemplo, Howitz et al., Nature, 425:191196, 2003, y la informacion suplementaria que acompana al artfculo). Las dosificaciones exactas pueden determinarse junto con estudios de respuesta a la dosis convencionales. Se entendera que la cantidad de composicion que realmente se administra sera determinada por un medico, a la luz de las circunstancias pertinentes, que incluyen el trastorno o trastornos que se van a tratar, la composicion elegida para ser administrada, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los sfntomas del paciente, y la via de administracion elegida.

La invencion se entendera mas a fondo haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que axones transeccionados de neuronas transfectadas con un vector que expresa la protefna Wlds muestran una degeneracion retrasada, comparado con neuronas control.

En ratones witf, se ha demostrado que la degeneracion walleriana en respuesta a danos axonales se retrasa (Gillingwater, et al., J. Physiol., 534:627-639, 2001). Los analisis geneticos han demostrado que la mutacion wid comprende una triplicacion en tandem de 85 kb, que resutla en la sobreexpresion de una molecula nuclear quimerica (protefna Wlds). Esta protefna esta compuesta por 70 aa N-terminales de Ufd(protefna de degradacion de fusion de ubiquitina)2a, un factor de ensamblaje de la cadena de ubiquitina, condensado con la secuencia completa de la nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa-1 (NMNAT1), una enzima en la via de reciclaje del NAD que genera NAD dentro del nucleo. La protefna Wlds tiene actividad NMNAT, pero carece de funcion ubiquitina ligasa, lo cual sugiere que la proteccion axonal se deriva de una mayor actividad NMNAT1 o de una inhibicion “dominante negativa” de la funcion Ufd2a.

Para identificar el mecansimo de la degeneracion axonal retrasada mediada por la protefna Wlds, los inventores emplearon un modelo de degeneracion walleriana in vitro. Se infectaron neuronas de explantes de DRG primarios con lentivirus que expresan las protefnas apropiadas, y los axones se danaron mediante la eliminacion del cuerpo celular neuronal (transeccion) o mediante el crecimiento en vincristina (toxica).

Las construcciones de expresion lentivfricas fueron un amable regalo de D. Baltimore (Lois, et al., Science, 295:86872, 2002). Los inventores modificaron el vector FUGW para generar un vector lanzadera de expresion general FUIV (YFP potenciado con IRES-gen de interes-promotor de ubiquitina (Venus)) que permite la expresion potenciada de YFP en celulas que expresan el gen de interes. Se clonaron las siguientes protefnas, cada una con un marcador de hexahistidina en el C-terminal, en el vector FUIV: protefna mutante quimerica Wlds; Ufd2a que contiene una mutacion puntual (P1140A), que previamente ha demostrado inhibir la funcion de Ufd2a de tipo salvaje como un “dominante-negativo” (Ufd2a(P1140)). Los siguientes genes se clonaron en el vector FUGW: 1) los primeros 70 aa de Ufd2a (la porcion contenida en la protefna Wlds) condensados con el N-terminal de EGFP (Ufd2a(1-70)-EGFP) o EGFP con una senal de localizacion nuclear en el C-terminal (Ufd2a(1-70)-nucEGFP); 2) la porcion NMNAT1 de la protefna Wlds condensada con el C-terminal de EGFP (EGFP-NMNAT1).

El ADNc murino para Ufd2a/Ube4b (mKIAA0684) fue proporcionado por Kazusa DNA Research Institute. Los ADNc murinos para NMNAT1 (n.° de registro: BC038133) se adquirieron en ATCC. Se empleo una mutagenesis mediada por PCR para generar mutaciones puntuales en Ufd2a, NMNAT 1 y Wlds.

Los inventores generaron construcciones de ARNmc en el vector FSP-si generado a partir del esqueleto de FUGW mediante la sustitucion del promotor de ubiquitina y el ADNc de GFP por el promotor U6 humano y la senal de terminacion Po1 I, seguido del promotor de SV40-gen de la puromicina-N-acetiltransferasa. La clonacion de la construccion de ARNsi se realizo como se ha sido descrito previamente, de modo que el ARNmc se transcribe a partir del promotor U6 (Castanotto, et al., RNA, 8:1454-60, 2002). Las secuencias utilizadas para la infrarregulacion del ARNmc de la expresion de protefnas fueron 1692-1710 de SIRT1, 1032-1050 de SIRT2, 538-556 de SIRT3, 1231-1249 de SIRT4, 37-55 de SIRT5, 1390-1408 de SIRT6, y 450-468 de SIRT7. La integridad de cada construccion de expresion lentivfrico y de ARNmc se confirmo mediante secuenciacion de ADN.

Se cultivaron explantes de DRG de raton a partir de embriones E12.5 en presencia del factor de crecimiento nervioso 1 nM. Las celulas no neuronales se retiraron de los cultivos anadiendo 5-fluorouracilo al medio de cultivo. La transeccion de las neuritas se realizo a 10-20 DIV utilizando una aguja de calibre 18 para retirar los cuerpos celulares neuronales. Se realizo una incubacion con p-nicotinamida adenina dinucleotido (Sigma) o sirtinol (Calbiochem) utilizando las condiciones indicadas en el texto o en las figuras.

Se generaron vectores de expresion lentivfricos utilizando celulas HEK293T segun se describio anteriormente. Para la confirmacion de la expresion de protefnas derivadas de lentivirus, las celulas HEK293T se infectaron con lentivirus y las celulas se lisaron 3 dfas despues de la infeccion. Estos lisados se analizaron mediante una inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal anti-marcador de His (Qiagen) para detectar la expresion de las respectivas protefnas marcadas con hexahistidina. La infeccion lentivfrica de las neuronas DRG se realizo incubando aproximadamente 106-107 pfu/ml de virus con el explante de DRG durante 24 h, comenzando 3-7 dfas antes de la transeccion axonal. Las neuronas infectadas se estudiaron en un microscopio fluorescente invertido para

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asegurar la expresion del transgen mediada por lentivirus detectable en >95% de las neuronas.

Se realizo un analisis cuantitativo de la degeneracion axonal como se ha descrito previamente (Zhai, et al., Neuron, 39:217-25, 2003). Brevemente, los cultivos se estudiaron utilizando microscopfa de contraste de fase en los momentos indicados. Los axones con aspecto fragmentado, no refractantes, se denominaron “degenerados”. En cada uno de los momentos, al menos 200 axones distinguibles individualmente fueron puntuados de modo ciego a partir de varias imagenes tomadas aleatoriamente de cada clutivo. Cada condicion se ensayo en explantes por triplicado en cada experimento. Se obtuvieron resultados de 2-4 experimentos independientes para cada condicion. Se realizo un analisis estadfstico mediante un ensayo de la t de Student. Para los calculos del area cubierta por neuritas, se analizaron imagenes capturadas de modo digital procedentes de muestras por cuadruplicado de dos experimentos independientes utilizanod un software de analisis 3.1 (Soft Imaging System, Lakewood, CO).

Los inventores descubrieron que los axones transfectados de neuronas que expresn la protefna Wlds se degeneraron con la cinetica retrasada caracterfstica de las neuronas derivadas de ratones wld (Buckmaster, et al., Eur. J. Neurosci., 7:1596-602, 1995), segun se muestra en la figura 1A.

Despues, los inventores compararon la degneracion axonal despues de la transeccion en neuronas que sobreexpresan la protefna Wlds, con las que expresan las porciones Ufd2a o NMNAT1 que forman la protefna Wlds unida a EGFP. Los resultados se muestran en la figura 1B.

Los inventores descubrieron que la expresion de EGFP-NMNAT1 retrasa la degeneracion axonal de una manera comparable a la propia protefna Wlds, mientras que los 70 aa N-terminales de Ufd2a (condensados con EGFP), dirigidos al nucleo o al citoplasma, no afectaron a la degeneracion axonal. La cuantificacion de estos efectos se realizo contando el porcentaje de neuritas remanentes en diversos momentos despues de la retirada de los cuerpos celulares neuronales. Este analisis muestra que EGFP-NMNAT1, al igual que la propia protefna Wlds, produce un aumento en mas de 10 veces en las neuritas intactas 72 h despues del dano. Para excluir tambien la implicacion directa de UPS en la proteccion axonal mediada por la protefna Wlds, los inventores estudiaron el efecto de la inhibicion de Ufd2a utilizando un mutante Ufd2a dominante-negativo o una construccion de ARNmc de Ufd2a. Sin embargo, ninguno de estos metodos produce una degradacion axonal retrasada en respuesta a una axotomfa. Juntos, estos experimentos demuestran que la porcion NMNAT1 de la protefna Wlds es responsable de la degeneracion axonal retrasada observada en ratones wltf.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que las mutaciones en la protefna NMNAT1 de longitud completa y en Wlds abolen los efectos protectores axonales de las protefnas.

La NMNAT1 es una enzima en la via de reciclaje del NAD nuclear que cataliza la conversion de nicotinamida mononucleotido (NMN) y nicotinato mononucleotido (NaMN) en NAD y nicotinato adenina mononucleotido (NaAD), respectivamente. La proteccion axonal observada en neuronas que sobreexpresan NMNAT1 puede estar inducida por su capacidad para sintetizar NAD (es decir, su actividad enzimatica) o quiza por otras funciones desconocidas de esta protefna. Para tratar esta cuestion, los inventores utilizaron la estructura crtistalina de NMNAT1 para identificar varios restos que se piensa que participan en la union al sustrato. Se introdujo una mutacion en uno de estos restos (W170A) en la protefna NMNAT1 de longitud completa y en Wlds. Los ensayos enzimaticos in vitro confirmaron que en ambas protefnas mutantes se limito enormemente su capacidad para sintetizar NAD (figura 2A). Cada uno de estos mutantes y sus respectivos homologos de tipo salvaje se introdujeron en neuronas para evaluar su capacidad para proteger a los axones frente a la degradacion. Los inventores descubrieron que las neuronas que expresan estos mutantas enzimaticamente inactivos no presentaban efectos protectores axonales (figura 2A), lo cual indica que la produccion de NAD/NaAD es responsable de la capacidad de NMNAT1 para prevenir la degradacion axonal.

Ejemplo 3

Este ejemplo muestra que una mayor actividad NMNAT en neuronas danadas con vinscristina tambien produce una degradacion axonal retrasada.

Ademas de la transeccion mecanica, tambien se observo proteccion axonal en ratones wld frente a otros agentes causantes de dano, tales como isquemia y toxinas (Coleman, et al., Trends Neurosci., 25:532-37, 2002; Gillingwater, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab., 24:62-66, 2004). Los inventores intentaron determinar si una mayor actividad NMNAT tambien retrasarfa la degradacion axonal en respuesta a otros tipos de lesiones axonales, tales como vincristina, un reactivo quimioterapeutico del cancer con toxicidad axonal bien caracterizada. Se cultivaron neuronas que expresaban NMNAT1 o EGFP (control) en vincristina 0,5 pM hasta 9 dfas. Los inventores descubrieron que los axones de las neuronas que expresan NMNAT1 mantienen su longitud y refractibilidad original, mientras que los axones que emanan de neuronas que expresan EGFP gradualmente se retrajeron y en gran parte se habfan degenerado para el dfa 9 (figura 2B). Estos resultados indican que la actividad NMNAT por sf sola puede proteger a los axones frente a una serie de ataques e induce los efectos protectores observados en ratones wltf.

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Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que el NAD administrado de forma exogena puede proteger a las neuronas danadas frente a la degeneracion axonal.

Experimented previos han demostrado que las celulas neuronales expresan protefnas de membrana que se pueden unir a NAD y transportar el NAD extracelular hacia el interior de la celula (Bruzzone, et al., Faseb J., 15:10-12, 2001). Esto animo a los inventores a investigar si el NAD administrado de forma exogena podrfa prevenir la degeneracion axonal. Se anadieron diversas concentraciones de NAD a cultivos neuronales antes de la transeccion axonal y se estudio el grado de degradacion axonal. Se descubrio que NAD 0,1-1 mM anadido 24 horas antes de la axotomfa retrasa significativamente la degeneracion axonal, aunque el NAD aplicado de forma exogena resultaba ligeramente menos eficaz para proteger a los axones que la expresion de NMNAT1 inducida por lentivirus (figura 3A). Estos resultados proporcionan un apoyo directo a la idea de que un mayor suministro de NAD puede prevenir la degradacion axonal.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que es necesario NAD antes de la eliminacion de los cuerpos celulares neuronales para proteger a las neuronas danadas frente a la degeneracion axonal.

Para aumentar la comprension del mecanismo de la proteccion axonal dependiente de NAD (NDAP), los inventores indagaron en si era necesario el NAD antes de la eliminacion de los cuerpos celulares neuronales, o si la exposicion directa de los axones seccionados a unos niveles altos de NAD resultaba suficiente para proporcionar proteccion (figura 3B). Se prepararon cultivos neuronales y se anadio NAD 1 mM al medio de cultivo en el momento de la transeccion axonal o en diversos momentos (4 a 48 hr) antes de producir los danos.

Los inventores descubrieron que la administracion de NAD en el momento de la transeccion axonal o hasta 8 hr antes de los danos no tenia efectos protectores sobre los axones. Sin embargo, se observo una significativa proteccion de los axones cuando las neuronas fueron incubadas con NAD durante periodos de tiempo mas largos antes de los danos, produciendose los mayores efectos despues de al menos 24 h de pretratamiento con NAD. Estos resultados indican que la proteccion axonal dependiente de NAD no es inducida por una modificacion postraduccional rapida dentro de los propios axones.

La necesidad de una exposicion prolongada a NAD de las nueronas intactas para prevenir la degradacion axonal en respuesta a danos sugiere que el proceso protector requiere acontecimientos transcripcionales y/o traduccionales de novo. De modo interesante, tanto la proteina Wlds como NMNAT1 estan localizadas dentro del nucleo (los datos no se muestran). De modo similar, la mayorfa de las enzimas que forman la via de reciclaje del NAD en levaduras tambien estan compartimentalizadas en el nucleo. Los inventores compararon los niveles de NAD en neuronas DRG que expresan NMNAT1 y el tipo salvaje utilizando ensayos enzimaticos a microescala sensibles (Szabo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1753-58, 1996), aunque no se descubrieron cambios en los niveles globales de NAD celular (los datos no se muestran). Esto resulta similar a las observaciones en levaduras, en las que la activacion de esta via nuclear no cambia los niveles globales de NAD (Anderson, et al., J. Biol. Chem., 277:18881-90, 2002; Huh, et al., Nature, 425:686-91, 2003). Ademas, los niveles del NAD tisular en el cerebro de ratones de tipo salvaje y wlds son similares a pesar de los mayores niveles de actividad NMNAT en ratones wlds (Mack, et al., Nat. Neurosci., 4:1199206, 2001). Estos datos sugieren que es probable que una actividad enzimatica dependiente de NAD en el nucleo, en oposicion a procesos dependientes del NAD citoplasmicos, induzca la proteccion axonal observada en respuesta a una mayor actividad NMNAT.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que la inhibicion de Sir2 esta implicada en la proteccion axonal dependiente de NAD.

La familia Sir2 de proteina desacetilasas y poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) desarrolla la principal actividad enzimatica nuclear dependiente de NAD. Sir2 es una desacetilasa de histonas y otras protefnas dependiente de NAD, y su activacion es fundamental para estimular una mayor longevidad en levaduras y C. elegans ((Bitterman, et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67:376-99, 2003; Hekimi, et al., Science, 299: 1351-54, 2003). PARP es activada por danos en el ADN y esta implicada en la reparacion del ADN (S.D. Skaper, Ann. NY Acad. Sci., 993:217-28 y 287-88, 2003). Estas enzimas, en particular las protefnas Sir2, han generado un gran interes en anos recientes, puesto que proporcionan una conexion potencial entre la restriccion calorica y sus efectos sobre el proceso de envejecimiento. La importancia de estas enzimas dependientes de NAD en la regulacion de la actividad genica empujo a los inventores a investigar su papel en el proceso autodestructivo de la degradacion axonal. Por tanto, los inventores estudiaron si los inhibidores de Sir2 (sirtinol) y PARP (3-aminobenzamida (3AB)) podrfan afectar a la proteccion axonal dependiente de NAD (NDAP) (figura 4A). Se cultivaron neuronas en presencia de NAD 1 mM y sirtinol (100 pM) o 3AB (20 mM). Se realizo la transeccion axonal mediante la eliminacion de los cuerpos celulares neuronales y se evaluo el grado de degradacion axonal de 12 a 72 horas despues. Se descubrio que el sirtinol bloqueaba la NADP con eficacia, lo cual indica que es probable que las protefnas Sir2 sean efectores de este proceso. Por contraste, 3AB no produjo ningun efecto sobre NDAP, los cual indica que PARP no desempena un papel en la proteccion axonal. Para estudiar mas a fondo el papel de las protefnas Sir2 en NDAP, los inventores ensayaron los

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efectos de resveratrol (10-100 pM), un compuesto de polifenol que potencia la actividad Sir2 (Howitz, et al., Nature, 425:191-96, 2003). Se descubrio que las neuronas tratadas con resveratrol antes de la axotomfa mostraban una disminucion en la degradacion axonal que era comparable a la obtenida utilizando NAD (figura 4A), lo cual proporciona aun mas apoyo a la idea de que las protefnas Sir2 son efectores de la proteccion axonal inducida por una mayor actividad NMNAt.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra que SIRT1 esta implicada en la proteccion axonal dependiente de NAD.

En seres humanos y roedores se han identificado siete moleculas que comparten el dominio conservado Sir2 (sirtuina(SIRT)1 a 7), aunque algunas de estas protefnas no parecen tener actividad histona/protefna desacetilasa (Buck, et al., J. Leukoc. Biol., S0741-5400, 2004). SIRT1 esta localizada en el nucleo y esta implicada en la remodelacion de la cromatina y en la regulacion de factores de la transcripcion, tales como p53 (J. Smith, Trends Cell. Biol., 12:404-406, 2002). La localizacion celular de otras protefnas SIRT no esta tan clara, pero se han encontrado algunas en el citoplasma y en mitocondrias. Para determinar cuales de las protefnas SIRT estan implicadas en la proteccion axonal dependiente de NAD, los inventores realizaron experimentos de inactivacion empleando construcciones de ARNmc dirigidas especfficamente a cada miembro de la familia SIRT. Se infectaron neuronas con lentivirus que expresaban construcciones de ARNmc de SIRT especfficas que suprimen con eficacia la expresion de su diana prevista (figura 4B). Las neuronas infectadas se cultivaron en NAD 1 mM y se realizo la transeccion axonal eliminando los cuerpos celulares. Se descubrio que la construccion de ARNmc de SIRT1 era tan eficaz para bloquear los efectos protectores axonales de NAD como el inhibidor sirtinol. Por contraste, la inhibicion de las otras protefnas SIRT no produjo efectos significativos sobre NDAP (figura 4B). Estos resultados indican que SIRT1 es el principal efector del mayor suministro de NAD que evita, de modo eficaz, la autodestruccion axonal. Aunque SIRT 1 puede desacetilar las protefnas directamente implicadas en la estabilidad axonal, su localizacion predominantemente nuclear, junto con la necesidad de la presencia de NAD aproximadamente 24 horas antes de los danos para lograr una proteccion eficaz, sugiere que SIRT1 regula un programa genetico que conduce a la proteccion axonal.

La degeneracion axonal es un fenomeno autodestructivo activo observado no solo despues de los danos y en respuesta a la quimioterapia, sino tambien asociado con el envejecimiento, enfermedades metabolicas tales como la neuropatfa diabetica, y enfermedades neurodegenerativas. Los resultados de los inventores indican que el mecanismo molecular de la proteccion axonal en ratones wlds es debido al mayor sumninistro de NAD que resulta de una mayor actividad de la via de reciclaje del NAD y la consecuente activacion de la histona/protefna desacetilasa SIRT1.

Ejemplos 8-11

En los ejemplos 8-11 se emplearon los siguientes materiales y metodos.

Construction de los plasmidos de expresion y mutagenesis. Lsa regiones codificadoras de las enzimas biosinteticas de NAD se amplificaron con PCR a partir de clones EST BC038133 para la NMNAT1 murina, y BC005737 para la nicotinamida mononucleotido adenililtransferasa-3 (NMNAT3) murina, utilizando herculasa (Stratagene). El ADNc de la NAD sintetasa humana (QNS) marcado con hexahistidina fue proporcionado amablemente por Dr. N. Hara (Shimane University, Shimane, Japon). El marcador de hexahistidina se anadio al extremo 3' de cada ADNc. El mutante citosolico de NMNAT1 (cytNMNAT1) se genero mediante una mutagenesis especffica dirigida a sitio por medio de PCR. La forma nuclear de NMNAT3 (nucNMNAT3) se genero anadiendo una senal de localizacion nuclear al extremo C-terminal de NMNAT3. Cada fragmento de la enzima sintetica de NAD amplificado por PCR se clono en un vector lanzadera lentivfrico FCIV segun se describio previamente. La totalidad de las construcciones se secuencio utilizando kits de secuenciacion de ciclos Taq DyeDeoxy Terminator (Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373.

Sustratos biosinteticos de NAD. Todos los sustratos para las enzimas biosinteticas de NAD se obtuvieron en Sigma (Na, Nam, NMN, NaMN, acido nicotfnico adenina dinucleotido (NaAD) y NAD). Se sintetizo NmR a partir de NMN. La conversion de NMN a NmR fue confirmada mediante HPLC (Waters) utilizando una columna de fase inversa LC-18T (Supelco). NmR eluye en 260 + 10 segundos, y NMN eluye en 150 + 10 segundos con un caudal de 1 ml/min de tampon que contiene K2HPO4 50 mM y KH2PO4 50 mM (pH 7,0). Se evaluo la actividad biologica de NmR tal como se describio previamente utilizando cepas de levadura proporcionadas amablemente por el Dr. Charles Brenner (Dartmouth Medical School, New Hampshire, EEUU).

Analisis de PCR de transcription inversa cuantitativo a tiempo real. Todos los procedimientos quirurgicos se realizaron segun las directrices de the National Institute of Health para el cuidado y el uso de animales de laborarotorio en Washington University. Para los analisis de expresion despues de los danos nerviosos, los nervios ciaticos de un raton C57BL/6 se cortaron y L4 a L5. Se recogieron los DRG en los momentos indicados y se reunieron para extraer el ARN. Se cultivaron explantes de DRG de rata a partir de un embrion E14.5 durante 14 dfas segun el metodo descrito y se cultivaron con medio que contenfa vincristina 10 nM durante el periodo indicado y se extrajo el ARN. Se preparo el ARN total de la fuente de tejidos reunidos o de los cultivos de explantes de DRG. Se

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prepararon moldes de ADNc de primera hebra a partir de 1 pg de cada ARN utilizando metodos convencionales. Se realizaron dos sfntesis de ADNc independientes para cada muestra de ARN. Se realizo una PCR-(RT) de transcripcion inversa cuantitativa controlando a tiempo real el aumento en la fluorescencia del tinte SYBR-GREEN en un sistema de deteccion de secuencias TaqMan 7700 (Applied Biosystems).

Cultivo celular, axotomfa in vitro, y cuantificacion de la degeneracion axonal. Se cultivaron explantes de DRG de raton a partir de embriones E12.5 en DMEM que contenfa FCS al 10% y factor de crecimiento nervioso 1 nM. Se retiraron las celulas no neuronales de los cultivos anadiendo 5-fluorouracilo al medio de cultivo. La transeccion de las neuritas se realizo en 14-21 DIV utilizando una aguja de calibre 18 para eliminar los cuerpos celulares neuronales. Se generaron vectores de expresion lentivfricos. La infeccion lentivfrica se realizo de 3-7 dfas antes de la transeccion axonal durante 24 horas. Se realizo un analisis cuantitativo de la degeneracion de las neuritas.

Determinacion de la expresion de protefnas y localizacion. Para la confirmacion de la expresion de las protefnas se infectaron celulas HEK293T con un virus que expresa cada una de las enzimas biosinteticas de NAD. Las celulas se lisaron 5 dfas despues de la inyeccion para ser analizadas mediante una inmunotransferencia para detectar la expresion de cada protefna con un marcador de hexahistidina por medio de un anticuerpo monoclonal anti-marcador de 6xHis (R&D Systems). Se analizo la localizacion subcelular de cada protefna utilizando celulas HEK293T transfectadas provisionalmente con un vector lanzadera vfrico para cada enzima biosintetica de NAD. Las celulas se fijaron en paraformaldehfdo al 4% en PBS que contenfa Tween-20 al 0,1% (PBS-T) y se incubaron con PBS-T que contenfa BSA al 5% durante 1 hora, y despues se cubrieron con anticuerpo anti-marcador de 6xHis diluido 1:1000 (R&D Systems) en PBS-T que contenfa BSA al 1% y durante 16 horas a 4 °C. Las celulas se lavaron con PBS-T y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) en TBS-T durante 1 hora y se estudiaron mediante microscopfa de fluorescencia (Nikon).

Sobreexpresion de la protefna NMNAT, purificacion por afinidad y ensayo enzimatico. Se transfectaron celulas HEK293T con un plasmido de expresion para cada enzima utilizando una precipitacion con fosfato de calcio. Tres dfas despues, las celulas se lavaron con PBS dos veces y despues se suspendieron en el tampon que contenfa fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0) y NaCl 300 mM (tampon A). Las celulas despues se homogeneizaron en un SONIFIRE 450 (BRANSON) y el sobrenadante se recogio mediante centrifugacion a 10.000 g durante 10 min. Un gel de afinidad de nfquel de seleccion de His (Sigma) se lavo con el tampon A y se anadio 0,1 ml de la suspension del gel al 50% a 1 ml del sobrenadante y se incubo durante 10 min a 4 °C y despues las esferas que se unieron a las protefnas marcadas con hexahistidina se lavaron a fondo con el tampon A. Las protefnas se eluyeron anadiendo 100 pl de la disolucion que contenfa fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, e imidazol 250 mM. Se midio la actividad enzimatica NMNAT relativa empleando protefnas purificadas por afinidad segun se describio anteriormente, se resto el valor obtenido de celulas transfectadas de modo simulado, y se normalizo a la cantidad de protefna recombinante determinada mediante densitometrfa.

Administracion de sustratos biosinteticos de NAD y transeccion del nervio optico. Se disolvio Nam, NMN, NmR o NAD en PBS a la concentracion de 100 mM o 1 M. Se inyectaron 5 pl de cada disolucion en el componente intravitreal izquierdo bajo anestesia a una velocidad de 0,5 pl ml por segundo. El nervio optico izquierdo se transecciono 24 horas despues de la inyeccion intravitreal y el nervio optico se recupero en el momento indicado. El tejido del nervio optico se homogeneizo en 100 pl de un tampon que contenfa Tris-HCl 100 mM (pH 6,8), SDS al 1% y DTT 1 mM. Se analizaron 50 pg de protefna para cada muestra mediante una transferencia Western empleando el anticuerpo anti-neurofilamentos 2H3 (Developmental Studies Hybridoma Center) y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch). Se calculo la velocidad de degeneracion a partir de la proporcion de inmunorreactividad de los neurofilamentos de los nervios transeccionados frente a los nervios contralaterales.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la via biosintetica de NAD y el analisis de la expresion de enzimas biosinteticas de NAD de mamffero.

El NAD se sintetiza mediante tres vfas principales en procariotas y eucariotas. En la via de novo, el NAD se sintetiza a partir del triptofano (figura 5). En la via de reciclaje, el NAD se genera a partir de vitaminas que incluyen el acido nicotfnico y la nicotinamida. Recientemente se ha descubierto una tercera via a partir de la nicotinamida ribosido, denominada via independiente de Preiss-Handler. La ultima reaccion enzimatica de la via de novo implica la conversion de quinolinato a NaMN por QPRT (EC 2.4.2.19). En este punto, la via de novo converge con la via de reciclaje. NaPRT (EC 2.4.2.11) convierte Na en NaMN, que despues es convertido en NaAD por NMNAT (EC 2.7.7.1). QNS1 (eC 6.3.5.1) convierte NaAD en NAD. NmPRT (EC 2.4.2.12; tambien denominado visfatina) convierte Nam en NMN. NMN tambien es convertido en NAD por NMNAT. La nicotinamidasa (PNC, EC 3.5.1.19), que convierte Nam en Na en la via de reciclaje de levaduras y bacterias, aun no ha sido identificada en mamfferos. En la via independiente de Preiss-Handler, Nrk (EC 2.7.1.22) convierte NmR en NMN y converge con la via de reciclaje. La mayorfa de estas enzimas de mamffero, que incluyen QPRT, NmPRT, QNS1, Nrk1/2 y NMNAT1/2/3, han sido previamente clonadas y caracterizas. Tambien se ha identificado un homologo de mamffero de NaPRT como una EST indicada como un homologo de mamffero de una NaPRT bacteriana.

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Para investigar la expresion de las enzimas biosinteticas de NAD de mamffero en el sistema nervioso, se realizo una RT-PCR cuantitativa empleando ARN procedente de cerebro, retina, medula espinal y DRG de raton a la edad de E14, P0, P7, P14 y P21. Todas las enzimas se expresan de forma ubicua en el sistema nervioso a lo largo del desarrollo y durante la etapa adulta, con la excepcion de Nrk2, cuya expresion sigue siendo muy baja en todos los tejidos estudiados (los datos no se muestran). Para identificar la inducibilidad de las enzimas que sintetizan NAD en respuesta a ataques neuronales, se comparo la expresion del ARN de cada enzima en DRG a 1, 3, 7 y 14 dfas despues de la transeccion del nervio ciatico frente a DRG no danados. Tal como se muestra en la figura 6A, la mayorfa de las enzimas se encontraban sobrerreguladas en 2 a 8 veces despues de los danos. Entre estas, la expresion de Nrk2 esta excepcionalmente inducida (en mas de 20 veces) a los 14 dfas despues de la axotomfa. Tambien se analizo la expresion de las enzimas sinteticas de NAD durante la degeneracion axonal provocada por neurotoxinas en neuronas DRG de rata cultivadas. Las neuronas DRG se trataron con rotenona 0,1 pM y 1 pM para provocar la degeneracion axonal y se recogio el ARN 24 horas despues de la adicion de rotenona. La expresion de Nrk2 habfa aumentado en mas de 6 veces despues del tratamiento con rotenona (figura 6B). Estos resultados sugieren que, aunque todas las actividades enzimaticas en la via de sfntesis del NAD estan presentes de forma ubicua, Nrk2 puede ser responsable de suministrar el sustrato sintetizador de NAD despues que se hayan producido ataques neuronales.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra que ambas enzimas Nmat nuclear y citoplasmica salvan a los axones de la degeneracion.

Para determinar si la localizacion nuclear de NMNAT1 es fundamental para proporcionar la proteccion axonal, se analizo el efecto de la distribucion subcelular de la enzima NMNAT en el ensayo de degeneracion walleriana in vitro y se comparo el grado de proteccion axonal entre la sobreexpresion de NMNAT citoplasmica y nuclear. NMNAT 1 tiene una senal de localizacion putativa PGRKRKW en los 211-217 aminoacidos de la protefna NMNAT1. Los inventores generaron una NMNAT1 mutante denominada cytNMNAT1, en la que esta senal de localizacion nuclear se altera como PGAAAAW y estudiaron la distribucion subcelular. Tal como se muestra en la figura 7B, la mayorfa de cytNMNAT1 se localiza en citosol, tal como se esperaba.

Despues se confirmo la actividad enzimatica de cytNMNAT1. NMNAT1 y su mutante cytNMNAT1 se purificaron de los lisado celulares que expresan cualquiera de las protefnas empleando un gel de afinidad. La actividad enzimatica de las protefnas purificadas por afinidad se midio segun se describio anteriormente y se descubrio que la actividad cytNMNAT1 no resulto alterada por su mutacion (figura 7C). Despues de la sobreexpresion de cytNMNAT1 en neuronas DRG, se observo una fuerte proteccion de las neuritas, como la NMNAT 1 nuclear salvaje (figura 7A, E). Este resultado tambien fue confirmado utilizando la isoenzima NMNAT1 que carece de la senal de localizacion nuclear. Entre las dos isoenzimas de NMNAT, previamente se habfa informado de que NMNAT3 se localizaba fuera del nucleo y las mitocondrias, y que tendrfa una actividad enzimatica comparable a NMNAT1. Los inventores anadieron la senal de localizacion nuclear KPKKIKTED de la topoisomerasa I humana al C-terminal de NMNAT3 para generar NMNAT3 nuclear. Se expreso NMNAT3 marcada con hexahistidina o nucNMNAT3 en celulas HEK293T y se analizo la localizacion subcelular y su actividad enzimatica. La NMNAT3 que se distribuye fuera del nucleo muestra una tincion de puntos brillantes, tal como se ha descrito anteriormente, y nucNMNAT3 se localizo principalmente en el nucleo, con algunos puntos tenidos en el citosol (figura 7B). La actividad enzimatica de NMNAT3 y nucNMNAT3 se midio y se determino que ambas protefnas presentaban una actividad enzimatica comparable, comparado con NMNAT1 (figura 7C). Despues se realizo el ensayo de degeneracion walleriana in vitro tras la sobreexpresion de estas dos enzimas NMNAT3, y se descubrio que la sobreexpresion de NMNAT3 y nucNMNAT3 mostraba el mismo grado de retraso en la degeneracion de las neuritas que NMNAT1 (figura 7A, E). La expresion mediada por lentivirus de cada enzima fue confirmada mediante un analisis de la transferencia Western (figura 7D). Estos experimentos confirmaron que la NMNAT dirigida al nucleo o al citosol protege a las neuritas frente a la degeneracion.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra que la aplicacion exogena de sustratos para las enzimas biosinteticas de NAD protege a los axones frente a la degeneracion.

Los inventores demostraron previamente que el NAD aplicado de forma exogena en el medio de cultivo muestra un efecto salvador axonal in vitro. En este ejemplo se demuestra que la expresion de NmPRT tambien produce proteccion axonal, lo cual sugiere que Nam se emplea como sustrato para la sfntesis de NAD en neuronas. Para determinar cual de los sustratos mostrados en la figura 5 se emplea para la sfntesis de NAD en neuronas y para identificar si cualquiera de los precursores de NAD puede salvar a los axones de modo similar o quiza mejor que el NAD, se aplico Na, Nam, NmR, NaMN, NMN o NaAD al medio de cultivo y se realizo un ensayo de degeneracion walleriana in vitro. Una aplicacion de NMN 1 mM durante 24 horas antes de la transeccion de las neuritas salvo a las neuritas de la degeneracion. Un analisis cuantitativo revelo que el tratamiento con NMN logra la proteccion de las neuritas en un grado similar al alcanzado por el NAD aplicado de modo exogeno (figura 8B). Estos resultados tambien sugieren la posibilidad de que un mayor suministro de otros sustratos biosinteticos de NAD tendrfa la capacidad de salvar a las neuritas de la degeneracion. Despues se aplico de forma exogena 1 mM de sustratos biosinteticos de NAD que incluyen Na, Nam, NaMN, NaAD, y NmR a las neuronas DRG durante 24 horas y se

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realizo la transeccion de las neuritas. Tal como se muestra en la figura 8A y B, el tratamiento con NaMN o NmR tambien salvo a las neuritas, como el NAD. NaAD muestra una ligera proteccion pero Na no salva a las neuritas, mientras que Na y Nam no tienen efecto. Un analisis cuantitativo revelo que la aplicacion exogena de NaMN, NMN, NmR o NAD 1 mM provoca un aumento comparable en las neuritas intactas a las 48 horas despues de la transeccion (figura 8B). Debido a que el efecto protector de NaMN es igual a NMN, una etapa de sfntesis de NAD a partir de NaAD por QNS serfa lo suficientemente activa como para salvar a las neuritas bajo un mayor suministro de NaAD. No obstante, la aplicacion exogena de NaAD muestra un aumento menor en las neuritas intactas a las 48 horas, comparado con NAD (figura 8B). Esto indica una incorporacion insuficiente a la celula o la inestabilidad del NaAD en esta condicion de ensayo. Estos experimentos sugieren que existen varias formas diferentes de salvar a las neuritas, que incluyen la aplicacion exogena de NMN, NaMN y NmR. Todos estos tratamientos parecen provocar un aumento en el suministro de NAD y esto resulta coherente con los experimientos previos que demuestran que la aplicacion de NAD o la sobreexpresion de NMNAT1 salva a las neuritas de la degeneracion.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que la aplicacion intravitreal de sustratos biosinteticos de NAD retrasa la degeneracion axonal en celulas de ganglios retinianos.

La transeccion del nervio optico es un modelo in vivo que puede emplearse para investigar los mecanismos que conducen a la degeneracion walleriana y que aparecen despues de la muerte de celulas ganglionares retinianas (RGC) observada en enfermedades humanas, tales como el glaucoma. En la raza de ratones C57BL/Wlds, la degeneracion del nervio optico durante la degeneracion walleriana despues de una axotomfa es notablemente lenta. Ademas, se emplea una inyeccon intravitreal para la seleccion de compuestos que protegen a los axones de RGC de la degeneracion in vivo y, por tanto, se puede evaluar el efecto protector de axones de cada uno de los sustratos biosinteticos de NAD in vivo mediante la inyeccion intraocular de compuestos, que incluyen NAD, NMN, NmR y Nam. A partir del ensayo de degeneracion walleriana in vitro se observa que 1 mM de NAD, NMN y NmR en el medio de cutlivo es suficiente para proteger frente a la degeneracion. En principio se inyectaron 5 pl de una disolucion de NAD 100 mM o 1 M en el compartimento intravitreal izquierdo. Despues de una incubacon durante 24 horas, el nervio optico izquierdo se transecciono, y se recogio el nervio optico control (derecho) y axotomizado (izquierdo) a los 3, 4 y 5 dfas despues de la transeccion. Se midio la inmunorreatividad de los neurofilamentos procedentes del nervio optico axotomizado y se normalizo frente al valor obtenido del lado derecho del nervio optico. Se descubrio que la inmunorreactividad a los 4 dfas despues de la transeccion era de 77 + 27% y 78 + 22% del nervio optico no axotomizado en ratas inyectadas con NAD 1 M y 100 mM, respectivamente, mientras que el animal control mostro solo 7 + 16% (figura 9).

Despues se inyectaron 5 pl de NMN, NmR y Nam 100 mM en el compartimento intravitreal izquierdo y se recogieron los nervios opticos 4 dfas despues de la transeccion del nervio optico izquierdo. La inmunorreactividad obtenida a partir del nervio optico inyectado con NMN y NmR fue de 60 + 25% y 72 + 19% del nervio no axotomizado. Los animales inyectados con Nam no mostraron ninguna diferencia con los animales control. Estos resultados son coherentes con el estudio in vitro que demuestra que NAD, NMN y NmR tienen actividad salvadora de axones, pero Nam no. El estudio in vivo de los inventores revelo que estas moleculas pequenas que estan implicadas en la via biosintetica de NAD son herramientas utiles para salvar a los axones de la degradacion.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. - El uso de un agente para el tratamiento o la prevencion de una axonopatfa en un mamffero que lo necesite, en el que el agente es NaMN, NMN, NmR, un acido nucleico que codifica una NMNAT o resveratrol.
2. 2. - El uso de la reivindicacion 1, en el que el agente es un acido nucleico que codifica una NMNAT.

   5 3.- El uso de la reivindicacion 1, en el que el agente es un acido nucleico que codifica una NMNAT1 humana o una

   NMNAT3 humana.
3. 4.- El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que la axonopatfa es hereditaria o congenita o esta asociada con enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de neuronas motoras, neoplasia, trastornos endocrinos, enfermedades metabolicas, deficiencias nutricionales, aterosclerosis, enfermedades autoinmunologicas, 10 lesiones mecanicas, lesiones inducidas por productos qufmicos o farmacos, lesiones termicas, lesiones por radiacion, compresion de nervios, trastornos retinianos o del nervio optico, disfuncion mitocondrial, demencia progresiva, enfermedades desmielinizantes, isquemia y/o ictus, enfermedades infecciosas, o enfermedades inflamatorias.