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ES2550099T3 - Antagonistas del receptor Nogo - Google Patents

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ES2550099T3
ES2550099T3 ES07762730.5T ES07762730T ES2550099T3 ES 2550099 T3 ES2550099 T3 ES 2550099T3 ES 07762730 T ES07762730 T ES 07762730T ES 2550099 T3 ES2550099 T3 ES 2550099T3
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ES
Spain
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polypeptide
nogo
receptor
amino acid
cells
Prior art date
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Active
Application number
ES07762730.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel H.S. Lee
Dingyi Wen
R. Blake Pepinsky
Jane K. Relton
Xinzhong Wang
Alexey Lugovskoy
Werner Meier
Ellen A. Garber
Laura Silvian
Paul H. Weinreb
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Biogen MA Inc
Original Assignee
Biogen MA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Un polipéptido aislado que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia excepto porque al menos un residuo de cisteína de dicha secuencia de aminoácidos de referencia está sustituido por un aminoácido diferente, en el que dicha secuencia de aminoácidos de referencia se elige de entre el grupo que consiste en: (i) los aminoácidos a hasta 445 del ID. SEC. Nº: 49, (ii) los aminoácidos 27 hasta b del ID. SEC. Nº: 49, y (iii) los aminoácidos a hasta b del ID. SEC. Nº: 49, en los que a es cualquier número entero desde 25 hasta 35 y b es cualquier número entero desde 300 hasta 450; y (b) un polipéptido heterólogo; en el que dicho polipéptido inhibe la inhibición del crecimiento de la neurita mediada por el receptor nogo en el que el uno o más residuos de cisteína que se van a sustituir se eligen de entre: el residuo de cisteína correspondiente al residuo de cisteína que se encuentra en el aminoácido 266 del ID. SEC. Nº: 49 (C266); el residuo de cisteína correspondiente al residuo de cisteína que se encuentra en el aminoácido 309 del ID. SEC. Nº: 49 (C309); el residuo de cisteína correspondiente al residuo de cisteína que se encuentra en el aminoácido 335 del ID. SEC. Nº: 49 (C335); o combinaciones de los mismos.

Description

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E07762730
09-10-2015
nucleico de la divulgación puede codificar para regiones codificantes heterólogas, tanto condensadas como no condensadas con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido o un fragmento de polipéptido del NgR de la presente divulgación. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido de señalización secretor o un dominio funcional heterólogo.
5 [0041] En ciertos casos, el polinucleótido o el ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido puede incluir normalmente un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o de la traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un
10 polipéptido, está asociada con una o más secuencias reguladoras de una forma tal que colocan el producto de la expresión del gen bajo la influencia o el control del (las) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de un polipéptido y un promotor asociado a la misma) están “asociados operativamente” si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción del ARNm que codifica para el producto génico deseado, y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las
15 secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto génico o para interferir en la capacidad del molde de ADN de ser transcrito. Por lo tanto, una región promotora estará asociada operativamente con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico celular que dirige la transcripción sustancial del ADN únicamente en unas células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, aparte de un promotor, por ejemplo,
20 potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden estar asociados operativamente con el polinucleótido para dirigir una transcripción específica celular. Algunos promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento.
[0042] Los expertos en la materia conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas
25 incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que aún funcionan en células de vertebrados, tales como, pero no se limitan a, segmentos promotores y potenciadores procedentes de citomegalovirus (el promotor temprano intermedio, junto con el intrón-A), virus 40 de simios (el promotor temprano) y retrovirus (tales como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones del control de la transcripción incluyen las obtenidas a partir de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona de crecimiento bovina y β-globina de conejo,
30 así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Algunas regiones de control de la transcripción adicionales adecuadas incluyen promotores y potenciadores específicos tisulares, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, los promotores inducibles por interferones o por interleucinas).
35 [0043] De forma análoga, los expertos habituales en la materia conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan, sitios de unión al ribosoma, codones de inicio y de terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma, o IRES, también denominado secuencia CITE).
40 [0044] En otros casos, un polinucleótido de la presente divulgación es un ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm).
[0045] Las regiones codificantes para los polinucleótidos y los ácidos nucleicos de la presente divulgación pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican para péptidos secretores o de 45 señalización, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente divulgación. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por las células de mamífero tienen un péptido de señalización o secuencia líder secretada que es escindida de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteínas en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos habituales en la materia son conscientes de que los polipéptidos secretados por las células de vertebrados tienen 50 generalmente un péptido de señalización condensado con el N-terminal del polipéptido, que es escindido del polipéptido completo para producir una forma secretada o “madura” del polipéptido. En ciertos casos, se usa un péptido de señalización nativo, por ejemplo, el péptido de señalización de una cadena ligera o de una cadena pesada de una inmunoglobulina, o un derivado funcional de esta secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está operativamente asociado con él. Alternativamente, puede usarse un péptido de
55 señalización heterólogo de mamífero, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural puede ser sustituida por la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular humano (TPA) o de la βglucuronidasa de ratón.
[0046] Según se usa en el presente documento el término "modificado" incluye la manipulación de moléculas 60 de un ácido nucleico o de un polipéptido a través de un medio sintético (por ejemplo, mediante técnicas
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[0069] A continuación se muestra el polipéptido de ratón NgR1 como el ID. SEC. Nº: 51. 5 [0070] NgR1 de ratón completo (ID. SEC. Nº: 51: )
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Anticuerpos
10 [0071] La presente divulgación se refiere adicionalmente a un anticuerpo o a un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al polipéptido del receptor Nogo-1 de la divulgación. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno se une a un polipéptido que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos elegida de entre el grupo que consiste en los ID. SEC. Nº: 1 -5, 26 -27, 29 -37 y 41 -45.
15 El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la presente divulgación puede ser producido in vivo o in vitro. La producción del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno se analiza a continuación.
[0072] Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la divulgación inhibe la unión del receptor Nogo-1 a un ligando (por ejemplo, NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) y disminuye la inhibición mediada 20 por la mielina del crecimiento y la germinación de la neurita, particularmente del crecimiento axonal, y atenúa el colapso del cono de crecimiento mediado por la mielina.
[0073] En algún caso, el anticuerpo anti-receptor Nogo-1 o el fragmento de unión al antígeno del mismo es murino. En algún caso, el receptor Nogo-1 es de rata. En otro caso, el receptor Nogo-1 es humano. En algún caso el 25 anticuerpo anti-receptor Nogo-1 o el fragmento de unión al antígeno del mismo es recombinante, modificado, humanizado y/o quimérico.
[0074] En algún caso, el anticuerpo se elige de entre el grupo que consiste en: 7E11 monoclonal (Nº de acceso de la ATCC® PTA-4587); 1H2 monoclonal (Nº de acceso de la ATCC® PTA-4584); 2F7 monoclonal (Nº de 30 acceso de la ATCC® PTA-4585); 3G5 monoclonal (Nº de acceso de la ATCC® PTA-4586); y 5B10 monoclonal (Nº de acceso de la ATCC® PTA-4588). En algún caso, el anticuerpo es el anticuerpo policlonal 46.
[0075] Algunos ejemplos de fragmentos de unión al antígeno son Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fd, dAb y fragmentos que contienen fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única 35 (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir al polipéptido una unión específica al antígeno (por ejemplo,
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expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vol. 3. (1987)). Cuando un marcador del sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará
5 (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).
[0159] La célula hospedadora puede ser transfectada conjuntamente con dos vectores de expresión de la divulgación, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de una cadena pesada, y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores 10 seleccionables idénticos que permitan una expresión igualitaria de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifique para ambos polipéptidos de las cadenas pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera se coloca ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 77: 2197 (1980)). Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN
15 genómico.
[0160] Una vez que una molécula de anticuerpo de la divulgación ha sido expresada recombinantemente, puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la materia para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante una cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad,
20 particularmente mediante la afinidad por el antígeno específico de la Proteína A, y una cromatografía en columna de exclusión por tamaños), una centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica habitual para la purificación de proteínas. Alternativamente, un método preferido para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la divulgación se divulga en el documento US 2002 0123057 A1.
25 [0161] En un caso, una molécula de unión o una molécula de unión al antígeno para su uso en los métodos de la divulgación comprende una región constante sintética en la que uno o más dominios han sido parcial o totalmente delecionados ("anticuerpos de dominios delecionados"). En ciertos casos, los anticuerpos modificados compatibles comprenderán constructos con los dominios delecionados o variantes en las que se ha eliminado la totalidad del dominio CH2 (constructos ΔCH2). Para otros casos puede sustituirse un péptido de conexión corto por
30 el dominio delecionado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento a la región variable. Los expertos en la materia apreciarán que dichos constructos son particularmente preferidos debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 sobre la tasa catabólica del anticuerpo.
[0162] En ciertos casos, los anticuerpos modificados para su uso en los métodos divulgados en el presente
35 documento son minicuerpos. Los minicuerpos pueden ser elaborados mediante el uso de los métodos descritos en la materia (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.837.821 o el documento WO 94/09817A1).
[0163] En otro caso, los anticuerpos modificados para su uso en los métodos divulgados en el presente documento son anticuerpos con el dominio CH2 delecionado que son conocidos en la materia. Los constructos y el
40 dominio delecionado pueden derivarse mediante el uso de un vector (por ejemplo, de Biogen IDEC Incorporated) que codifica para el dominio constante de una IgG1 humana (véase, por ejemplo, el documento WO 02/060955A2 y el documento WO 02/096948A2). Este vector ejemplar fue diseñado para delecionar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de la IgG1 con el dominio delecionado.
45 [0164] En un caso, un anticuerpo antagonista del NgR1 o un fragmento del mismo para su uso en los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento comprende una cadena pesada de una inmunoglobulina que tiene una deleción o una sustitución de unos pocos o incluso de un único aminoácido, siempre que permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en las áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión del Fc y aumentar así la
50 localización del tumor. De forma análoga, puede ser deseable simplemente delecionar aquella parte de uno o más dominios de la región constante que controla la función efectora (por ejemplo, la unión al complemento) que se va a modular. Dichas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar unas características seleccionadas del anticuerpo (semivida sérica) conservando otras funciones deseables asociadas con el dominio intacto de la actual región constante. Además, como se ha indicado anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos
55 divulgados pueden ser sintéticas a través de la mutación o la sustitución de uno o más aminoácidos que mejora el perfil del constructo resultante. A este respecto, puede ser posible desestabilizar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, la unión al Fc) conservando sustancialmente la configuración y el perfil inmunógeno del anticuerpo modificado. Otras características más comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como la función efectora, o proporcionar más
60 unión a citotoxinas o a carbohidratos. En dichos casos puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas
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Tabla 1. Secuencias de los polipéptidos del receptor Nogo-1 humano y de rata
ID. SEC. Nº: 6 (1 -344 humanos)
ID. SEC. Nº: 7 (1 -310 humanos)
ID. SEC. Nº: 8 (1 -344 de rata)
ID. SEC. Nº: 9 (1 -310 de rata)
ID. SEC. Nº: 58 (1 -310 humanos con sustituciones de ala en las posiciones de los aminoácidos 266 y 309)
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que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, excepto por hasta tres sustituciones de aminoácidos individuales, en el que dicha secuencia de aminoácidos de referencia es los aminoácidos 309 hasta 344 del ID. SEC. Nº: 49.
5 [0180] En un caso, la divulgación proporciona un fragmento aislado de un polipéptido de 60 residuos o menos, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, excepto por hasta tres sustituciones de aminoácidos individuales, en el que dicha secuencia de aminoácidos de referencia es los aminoácidos 309 hasta 335 del ID. SEC. Nº: 49.
10 [0181] En una forma de realización, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia excepto porque al menos un residuo de cisteína de dicha secuencia de aminoácidos de referencia se ha sustituido por un aminoácido diferente, en el que dicha secuencia de aminoácidos de referencia se elige de entre el grupo que consiste en: (i) los aminoácidos a hasta 445 del ID. SEC. Nº: 49, (ii) los aminoácidos 27 hasta b del ID. SEC. Nº: 49 y (iii) los
15 aminoácidos a hasta b del ID. SEC. Nº: 49, en los que a es cualquier número entero desde 25 hasta 35 y b es cualquier número entero desde 300 hasta 450; y (b) un polipéptido heterólogo; que dicho polipéptido inhibe la inhibición mediada por el receptor nogo del crecimiento de la neurita.
[0182] Algunos ejemplos de sustituciones de aminoácidos para los fragmentos de polipéptido de acuerdo con
20 esta forma de realización incluyen sustituciones de residuos individuales de cisteína en los polipéptidos de la invención por aminoácidos diferentes. Cualquier aminoácido diferente puede ser sustituido por una cisteína en los polipéptidos de la invención. El aminoácido diferente que se use dependerá de diversos criterios, por ejemplo, el efecto de la sustitución sobre la conformación del fragmento de polipéptido, la carga del fragmento de polipéptido o la hidrofobicidad del fragmento de polipéptido. Las sustituciones de aminoácidos para los aminoácidos de los
25 polipéptidos de la invención y las secuencias de aminoácidos de referencia pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), con cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), con cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), con cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina,
30 isoleucina) y con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los aminoácidos típicos para la sustitución por cisteínas en el aminoácido de referencia incluyen alanina, serina, treonina, en particular, alanina. La realización de dichas sustituciones a través de la modificación que un polinucleótido que codifica para el fragmento de polipéptido están en la pericia rutinaria del experto habitual en la materia.
35 [0183] En otro caso, la presente divulgación proporciona un polipéptido aislado de la divulgación en el que al menos un residuo de cisteína está sustituido por un aminoácido diferente. Los residuos de cisteína que pueden ser sustituidos en el NgR1 humano incluyen la C27, la C31, la C33, la C43, la C80, la C140, la C264, la C266, la C287, la C309, la C335, la C336, la C419, la C429, la C455 y la C473. Los residuos de cisteína que pueden ser sustituidos
40 en el NgR1 de rata incluyen la C27, la C31, la C33, la C80, la C140, la C264, la C266, la C287, la C309, la C335, la C336, la C419, la C429, la C455 y la C473. Los residuos de cisteína que pueden ser sustituidos en el NgR1 de ratón incluyen la C27, la C31, la C33, la C43, la C80, la C140, la C264, la C266, la C287, la C309, la C335, la C336, la C419, la C429, la C455 y la C473.
45 [0184] La presente divulgación también proporciona un fragmento aislado de un polipéptido de 40 residuos o menos, en el que el fragmento de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a los aminoácidos 309 hasta 344 del ID. SEC. Nº: 49, excepto porque: la C309 está sustituida, la C335 está sustituida, la C336 está sustituida, las C309 y C335 están sustituidas, las C309 y C336 están sustituidas, las C335 y C336 están sustituidas,
o las C309, C335, y C336 están sustituidas.
50 [0185] Los residuos de cisteína de los polipéptidos de la invención pueden ser sustituidos por cualquier aminoácido heterólogo. En ciertas formas de realización, la cisteína es sustituida por un aminoácido pequeño sin carga que al menos es probable que altere la conformación tridimensional del polipéptido, por ejemplo, alanina, serina, treonina, preferiblemente alanina.
55 [0186] El polipéptido soluble del receptor Nogo-1 de la invención es un componente de una proteína de fusión que adicionalmente comprende un polipéptido heterólogo. En algunas formas de realización, el polipéptido heterólogo es un dominio constante de una inmunoglobulina. En algunas formas de realización, el dominio constante de la inmunoglobulina es un dominio constante de una cadena pesada. En algunas formas de realización, el
60 polipéptido heterólogo es un fragmento Fc. En algunas formas de realización el Fc está unido al extremo C-terminal
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[0198] El polipéptido NgR2 de ratón se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 61. ` [0199] El NgR2 de ratón completo (ID. SEC. Nº: 61):
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[0200]
ElNgR3 polipéptido humano se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 62.
[0201]
El NgR3 humano completo (ID. SEC. Nº: 62):
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[0202] El polipéptido NgR3 de ratón se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 63. 15 [0203] El NgR3 de ratón completo (ID. SEC. Nº: 63):
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laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En un caso, el aminoácido añadido es triptófano. En un caso adicional, la arginina en la posición 269 del ID. SEC. Nº: 49 está sustituida por triptófano.
[0209] En un caso, la divulgación proporciona un polipéptido aislado que comprende un primer fragmento de
5 polipéptido y un segundo fragmento de polipéptido, en el que dicho primer fragmento de polipéptido consiste en los aminoácidos 1 -310 del ID. SEC. Nº: 49, excepto por hasta una, dos, tres, cuatro, diez o veinte sustituciones de aminoácidos individuales; y en el que dicho segundo fragmento de polipéptido consiste en los aminoácidos 311 -318 del ID. SEC. Nº: 60 excepto por hasta una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos individuales; y en el que dicho polipéptido inhibe la inhibición del crecimiento de la neurita mediada por el receptor nogo.
10 [0210] Los polipéptidos de la invención comprenden adicionalmente un polipéptido heterólogo. En algunas formas de realización, el polipéptido heterólogo es un dominio constante de una inmunoglobulina. En algunas formas de realización, el dominio constante de la inmunoglobulina es un dominio constante de una cadena pesada. En algunas formas de realización, el polipéptido heterólogo es un fragmento Fc. En algunas formas de realización el Fc
15 está unido al extremo C-terminal de los polipéptidos de la invención. En algunas formas de realización la fusión es un dímero. La divulgación engloba adicionalmente variantes, análogos o derivados de los fragmentos de polipéptidos como se ha descrito anteriormente.
[0211] Como una alternativa a la expresión de una proteína de fusión, puede preformarse una fracción
20 heteróloga elegida y conjugarse químicamente con la fracción del polipéptido NgR de la invención. En la mayoría de los casos, una fracción heteróloga elegida funcionará de una forma similar, tanto si está fusionada como conjugada con la fracción del polipéptido NgR. Por lo tanto, en el siguiente análisis de las secuencias heterólogas de aminoácidos, salvo que se indique de otro modo, debe entenderse que la secuencia heteróloga puede estar unida a la fracción del polipéptido NgR en forma de una proteína de fusión o en forma de un conjugado químico.
25 [0212] Los aptámeros del NgR1 y los anticuerpos y los fragmentos de los mismos para su uso en los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento también pueden condensarse recombinantemente con un polipéptido heterólogo en el N o C-terminal o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos o con otras composiciones. Por ejemplo, los aptámeros antagonistas NgR1 y los
30 anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden condensarse recombinantemente o conjugarse con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección, y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Patente de EE.UU. Nº 5.314.995; y el documento EP 396.387.
35 [0213] Los polipéptidos antagonistas del NgR1, los aptámeros y los anticuerpos y los fragmentos de los mismos para su uso en los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento incluyen derivados que están modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula, de forma que la unión covalente no impida que el polipéptido antagonista del NgR1, el aptámero o el anticuerpo inhiba la función biológica del NgR1. Por ejemplo, pero no como limitación, los polipéptidos antagonistas del NgR1, los aptámeros y los
40 anticuerpos y los fragmentos de los mismos de la presente divulgación pueden ser modificados por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, PEGilación, fosfilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores / bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Puede realizarse cualquiera de las numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, una escisión química específica, una acetilación, una formilación, una síntesis metabólica de
45 tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
[0214] Los polipéptidos antagonistas del NgR1, los aptámeros y los anticuerpos y los fragmentos de los mismos para su uso en los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento pueden estar formados por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres 50 peptídicos, y puede contener aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos codificados genéticamente. Los polipéptidos antagonistas del NgR1, los aptámeros y los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden ser modificados mediante procesos naturales, tales como un procesado post-traduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Las 55 modificaciones pueden producirse en cualquier parte del polipéptido antagonista del NgR1, del aptámero o del anticuerpo o de fragmentos de los mismos, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en fracciones tales como carbohidratos. Se apreciará que puede haber presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en grados variables en diversos sitios de un polipéptido antagonista del NgR1, un aptámero o un anticuerpo o fragmentos de los mismos dados. También, un polipéptido 60 antagonista del NgR1, un aptámero un anticuerpo o fragmentos de los mismos dados puede contener muchos tipos
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formas de realización de la invención emplean una proteína de fusión tal como las descritas en Capon y col., Patentes de EE.UU. Nº 5.428.130 y 5.565.335.
[0224] La secuencia de señalización es un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos
5 que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico. Las secuencias de señalización útiles para la construcción de una inmunofusina incluyen las secuencias de señalización de la cadena ligera de un anticuerpo, por ejemplo, del anticuerpo 14.18 (Gillies y col., J. Immunol. Meth., 125: 191 -202 (1989)), las secuencias de señalización de la cadena pesada de un anticuerpo, por ejemplo, la secuencia de señalización de la cadena pesada del anticuerpo MOPC141 (Sakano y col., Nature 286: 5774 (1980)). Alternativamente, pueden
10 usarse otras secuencias de señalización. Véase, por ejemplo, Watson, Nucl. Acids Res. 12: 5145 (1984). El péptido de señalización habitualmente es escindido en la luz del retículo endoplásmico por peptidasas de señalización. Esto da como resultado la secreción de una proteína inmunofusina que contiene la región Fc y la fracción del polipéptido NgR.
15 [0225] En algunas formas de realización, la secuencia de ADN puede codificar para un sitio de escisión proteolítica entre el casete de secreción y la fracción del polipéptido NgR. Dicho sitio de escisión puede proporcionar, por ejemplo, el sitio de escisión proteolítica de la proteína de fusión codificada, separando así el dominio Fc de la proteína objetivo. Algunos sitios de escisión proteolítica útiles incluyen las secuencias de aminoácidos reconocidas por enzimas proteolíticas tales como tripsina, plasmina, trombina, factor Xa o enterocinasa
20 K.
[0226] El casete de secreción puede ser incorporado en un vector de expresión replicable. Algunos vectores útiles incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos y similares. Un ejemplo de vector de expresión es pdC, en el que la transcripción del ADN de la inmunofusina se pone bajo el control de un potenciador y 25 de un promotor del citomegalovirus humano. Véase, por ejemplo, Lo y col., Biochim. Biophys. Acta 1088: 712 (1991); y Lo y col., Protein Engineering 11: 495 -500 (1998). Puede ser transformada o transfectada una célula hospedadora apropiada con un ADN que codifica para un polipéptido NgR1 o un fragmento de polipéptido de la divulgación, y usada para la expresión y la secreción del polipéptido. Las células hospedadoras que se usan normalmente incluyen células inmortales de hibridoma, células de mieloma, células 293, células de ovario de
30 hámster chino (CHO), células Hela y células COS.
[0227] Las regiones naturales totalmente intactas de tipo Fc muestran funciones efectoras que normalmente son innecesarias e indeseadas en una proteína de fusión Fc usada en los métodos de la presente divulgación. Por lo tanto, normalmente se delecionan ciertos sitios de unión de la región Fc durante la construcción del casete de
35 secreción. Por ejemplo, dado que es innecesaria la expresión conjunta con la cadena ligera, el sitio de unión para la proteína de unión de la cadena pesada, el Bip (Hendershot y col., Immunol. Today 8: 111 -14 (1987)), es delecionado del dominio CH2 de la región Fc de la IgE, de forma que este sitio no interfiere con la secreción eficiente de la inmunofusina. Generalmente también se delecionan las secuencias del dominio transmembranal, tales como las presentes en la IgM.
40 [0228] La región Fc de la IgG1 es la que se usa más a menudo. Alternativamente, puede usarse la región Fc de las otras subclases de inmunoglobulina gamma (gamma-2, gamma-3 y gamma-4) en el casete de secreción. Generalmente ser usa la región Fc de la IgG1 de la inmunoglobulina gamma-1 en el casete de secreción e incluye al menos parte de la región de bisagra, la región CH2 y la región CH3. En algunas formas de realización, la región Fc
45 de la inmunoglobulina gamma-1 es una Fc con la CH2 delecionada, que incluye parte de la región de bisagra y la región CH3, pero no la región CH2. Una Fc con la CH2 delecionada ha sido descrita por Gillies y col., Hum. Antibod. Hybridomas 1: 47 (1990). En algunas formas de realización, se usa la región Fc de una de la IgA, de la IgD, de la IgE o de la IgM.
50 [0229] Las proteínas de fusión de la fracción Fc del polipéptido NgR pueden construirse con numerosas configuraciones diferentes. En una configuración, el C-terminal de la fracción del polipéptido NgR se condensa directamente con el N-terminal de la fracción de bisagra de la Fc. En una configuración ligeramente diferente se incorpora un polipéptido corto, de, por ejemplo, 2 -10 aminoácidos, en la fusión entre el N-terminal de la fracción del polipéptido NgR y el C-terminal de la fracción Fc. En la configuración alternativa, el polipéptido corto se incorpora en
55 la fusión entre el C-terminal de de la fracción del polipéptido NgR y el N-terminal de la fracción Fc. Un caso ejemplar de esta configuración es el NgR1(310)-2XG4S-Fc, que es los aminoácidos 26 -310 del ID. SEC. Nº: 49 unido a (GlyGly-Gly-Gly-Ser)2 (ID. SEC. Nº: 66) que está unido a la Fc. Dicho conector proporciona una flexibilidad conformaciónal que puede mejorar la actividad biológica en algunas circunstancias. Si se conserva una porción suficiente de la región de bisagra en la fracción Fc, la fusión polipéptido NgR-fracción Fc dimerizará, formando así
60 una molécula divalente. Una población homogénea de fusiones Fo monoméricas producirá dímeros
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NgR para mejorar la producción de una fracción del polipéptido NgR en bacterias. En dichos constructos se emplea una proteína bacteriana expresada y/o secretada normalmente a un elevado nivel como el compañero de fusión Nterminal de un polipéptido NgR1 de la invención. Véase, por ejemplo, Smith y col., Gene 67: 31 (1988); Hopp y col., Biotechnology 6: 1204 (1988); La Vallie y col., Biotechnology 11: 187 (1993).
5 [0236] Mediante la fusión de una fracción del polipéptido NgR en los extremos amino y carboxi de un compañero de fusión adecuado, pueden obtenerse formas bivalentes o tetravalentes de un polipéptido NgR1 de la invención. Por ejemplo, puede fusionarse una fracción del polipéptido NgR con los extremos amino y carboxi de una fracción de una Ig para producir un polipéptido monomérico bivalente que contiene las fracciones del polipéptido
10 NgR. Después de la dimerización de estos dos monómeros, en virtud de la fracción de Ig se obtiene una forma tetravalente de un polipéptido NgR. Dichas formas multivalentes pueden usarse para conseguir un aumento en la afinidad de unión con el objetivo. Las formas multivalentes de un polipéptido NgR1 de la invención también pueden obtenerse colocando fracciones del polipéptido NgR en tándem para formar concatámeros, que pueden emplearse solos o condensados con un compañero de fusión tal como Ig o HSA.
15 Polímeros conjugados (distintos a polipéptidos)
[0237] Algunas formas de realización de la invención implican un polipéptido NgR1 de la invención en el que uno o más polímeros están conjugados (unidos covalentemente) con el polipéptido NgR. Algunos ejemplos de
20 polímeros adecuados para dicha conjugación incluyen polipéptidos (analizados anteriormente), polímeros de azúcar y cadenas de polialquilenglicol. Normalmente, pero no necesariamente, un polímero se conjuga con el polipéptido NgR1 de la invención con el fin de mejorar una o más de las siguientes: solubilidad, estabilidad o biodisponibilidad.
[0238] La clase de polímero usada generalmente para la conjugación con un polipéptido NgR1 de la invención
25 es un polialquilenglicol. El polietilenglicol (PEG) es el más frecuentemente usado. Las fracciones de PEG, por ejemplo, polímeros de 1, 2, 3, 4 o 5 PEG, pueden ser conjugadas con cada polipéptido NgR para aumentar la semivida sérica con respecto al polipéptido NgR solo. Las fracciones de PEG no son antigénicas y son esencialmente biológicamente inertes. Las fracciones de PEG usadas en la práctica de la invención pueden estar ramificadas o no ramificadas.
30 [0239] El número de fracciones de PEG unidas al polipéptido NgR y el peso molecular de las cadenas individuales de PEG puede variar. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menos cadenas de polímero se unirán al polipéptido. Habitualmente, la masa total del polímero unido al polipéptido NgR o a un fragmento del polipéptido, es desde 20 kDa hasta 40 kDa. Por lo tanto, si hay unida una cadena de polímero, el peso
35 molecular de la cadena es generalmente de 20 -40 kDa. Si hay dos cadenas unidas, el peso molecular de cada cadena es generalmente de 10 -20 kDa. Si hay tres cadenas unidas, el peso molecular es generalmente de 7 -14 kDa.
[0240] El polímero, por ejemplo, PEG, puede unirse al polipéptido NgR a través de cualquier grupo reactivo
40 adecuado expuesto del polipéptido. El (los) grupo(s) reactivo(s) expuesto(s) puede(n) ser, por ejemplo, un grupo amino N-terminal o el grupo amino épsilon de un residuo de lisina interno, o ambos. Un polímero activado puede reaccionar con, y unirse covalentemente a, cualquier grupo amino libre del polipéptido NgR. También pueden usarse los grupos carboxílicos libres, los grupos adecuadamente activados carbonilo, hidroxilo, guanidilo, imidazol, las fracciones de carbohidrato oxidadas y los grupos mercapto del polipéptido NgR (si estuviera disponible) como
45 grupos reactivos para la unión del polímero.
[0241] En una reacción de conjugación se emplean normalmente desde aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 10 moles de polímero activado por mol de polipéptido, dependiendo de la concentración del polipéptido. Habitualmente, la proporción elegida representa un equilibrio entre maximizar la reacción y minimizar las
50 reacciones secundarias (a menudo no específicas) que pueden deteriorar la actividad farmacológica deseada de la fracción del polipéptido NgR. Preferiblemente, se conserva al menos el 50 % de la actividad biológica (según se muestra, por ejemplo, en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento o conocidos en la materia) del polipéptido NgR, y lo más preferiblemente se conserva aproximadamente el 100 %.
55 [0242] El polímero puede ser conjugado con el polipéptido NgR mediante el uso de una química convencional. Por ejemplo, puede acoplarse una fracción de polialquilenglicol al grupo amino épsilon de una lisina del polipéptido NgR. La unión con la cadena lateral de lisina puede llevarse a cabo con un éster de N-hidroxilsuccinimida (NHS) activo tal como succinato de succinimidilo PEG (SS-PEG) y propionato de succinimidilo (SPA-PEG). Algunas fracciones de polialquilenglicol adecuadas incluyen, por ejemplo, carboximetil-NHS y norleucina-NHS, SC. Estos
60 reactivos están disponibles en el mercado. Algunos conectores adicionales de amina-PEG reactivo pueden ser
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En algunos casos, el ácido nucleico comprende adicionalmente un promotor de la transcripción y opcionalmente una secuencia de señalización, cada uno de los cuales está unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos de la divulgación.
5 [0259] En algunos casos, la divulgación proporciona un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión del receptor Nogo-1 de la divulgación, incluyendo una proteína de fusión que comprende un polipéptido elegido de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 26 -344 del receptor Nogo-1 según se muestra en los ID. SEC. Nº: 6 y 8, o los residuos de aminoácidos 27 -344 del ID. SEC. Nº: 8 y los residuos de aminoácidos 26 -310 del receptor Nogo-1 según se muestra en los ID. SEC. Nº: 7 y 9, o los residuos de
10 aminoácidos 27 -310 del ID. SEC. Nº: 9. En algunos casos, el ácido nucleico codifica para una proteína de fusión del receptor Nogo-1 que comprende un polipéptido elegido de entre el grupo que consiste en los ID. SEC. Nº: 26 27, 29 -37 y 41 -45. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión del receptor Nogo-1 comprende adicionalmente un promotor de la transcripción y opcionalmente una secuencia de señalización. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente para una región constante de una
15 inmunoglobulina. En algunos casos, la región constante de una inmunoglobulina es una región constante de la cadena pesada. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos adicionalmente codifica para una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina unida a región de bisagra. En algunos casos el ácido nucleico codifica adicionalmente para Fc. En algunos casos las proteínas de fusión del receptor Nogo-1 comprenden un fragmento Fc.
20 [0260] Los ácidos nucleicos codificantes de la presente divulgación pueden ser modificados adicionalmente de forma que contengan un marcador detectable con fines diagnósticos y de sonda. En la materia se conoce una variedad de dichos marcadores y pueden ser fácilmente empleados con las moléculas codificantes descritas en el presente documento. Algunos marcadores incluyen, pero no se limitan a, biotina, nucleótidos radiomarcados y
25 similares. Un artesano experto puede emplear cualquiera de los marcadores conocidos en la técnica para obtener una molécula de ácido nucleico codificante marcada.
[0261] La presente divulgación también incluye polinucleótidos que hibridan en unas condiciones moderadamente rigurosas o muy rigurosas con una hebra no codificante, o complemento, de un polinucleótido que
30 codifica para uno cualquiera de los polipéptidos de la invención. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la materia y pueden encontrarse en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6.
[0262] El polinucleótido del receptor Nogo-1 humano se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 81.
35 [0263] El receptor Nogo-1 completo humano está codificado por el nucleótido 166 hasta el nucleótido 1587 del ID. SEC. Nº: 81:
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[0265] El polinucleótido del receptor Nogo-1 de ratón se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 83 y es el número de registro NM_022982 en el Genbank.
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[0268] El polinucleótido del receptor Nogo-3 humano se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 86 y es el número de registro BK001305 en el Genbank.
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5 [0269] El polinucleótido del receptor Nogo-3 de ratón se muestra a continuación como el ID. SEC. Nº: 87 y es número de registro BK001304 en el Genbank.
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[0278] En las que N, X e Y son nucleótidos; el hidrógeno X se une a Y; ": " significa un puente de hidrógeno entre dos bases; x es un número entero natural que tiene un valor de entre 1 y aproximadamente 100; y m y n son 5 números enteros completos que tienen, independientemente, unos valores de entre 0 y aproximadamente 100. En algunos casos, N, X e Y son independientemente A, G, C y T o U. Puede haber presentes bases y nucleótidos no naturales, particularmente en el caso de un ARNip sintético (es decir, el producto del apareamiento de dos oligonucleótidos). La sección central bicatenaria se denomina “núcleo” y tiene pares de bases (pb) como unidades de medida; las porciones monocatenarias son salientes que tienen nucleótidos (nt) como unidades de medida. Los
10 salientes mostrados son salientes en 3’, pero las moléculas con salientes en 5’ también están en el ámbito de la divulgación. También están en el ámbito de la divulgación las moléculas de ARNip que no tienen ningún saliente (es decir, m = 0 y n = 0) y aquellas que tienen un saliente en un lado del núcleo pero ninguno en el otro (por ejemplo, m = 0 y n > 1, o viceversa).
15 [0279] Inicialmente, la tecnología del ARNi no parecía ser fácilmente aplicable a sistemas de mamíferos. Esto es debido, en los mamíferos, a que el ARNbc activa la cinasa de proteínas activada por el ARNbc (PKR) que da como resultado una cascada apoptótica y la muerte celular (Der y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 3279 3283, 1997). Además, durante mucho tiempo se ha sabido que el ARNbc activa la cascada del interferón en las células de mamífero, que también puede dar lugar a una fisiología celular alterada (Colby y col., Annu. Rev.
20 Microbiol. 25: 333, 1971; Kleinschmidt y col., Annu. Rev. Biochem. 41: 517, 1972; Lampson y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 58: L782, 1967; Lomniczi y col., J. Gen. Virol. 8: 55, 1970; e Younger y col., J. Bacteriol. 92: 862, 1966). Sin embargo, la activación mediada por el ARNbc de las cascadas de la PKR y del interferón requiere un ARNbc mayor de aproximadamente 30 pares de bases. Por el contrario, se ha demostrado que un ARNbc menor de 30 pares de bases de longitud causa el ARNi en células de mamífero (Caplen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98:
25 9742 -9747, 2001). Por lo tanto, se espera que puedan evitarse los efectos no específicos indeseables asociados con las moléculas más grandes de ARNbc mediante la preparación de un ARN pequeño que esté sustancialmente exento de ARNbc más grandes.
[0280] Referencias relativas al ARNip: Bernstein y col., Nature 409: 363 -366, 2001; Boutla y col., Curr Biol
30 11: 1776 -1780, 2001; Cullen, Nat Immunol. 3: 597 -599, 2002; Caplen y col., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 98: 9742 9747, 2001; Hamilton y col., Science 286: 950 -952, 1999; Nagase y col., ADN Res. 6: 63 -70, 1999; Napoli y col., Plant Cell 2: 279 -289, 1990; Nicholson y col., Mamm. Genome 13: 67 -73, 2002; Parrish y col., Mol Cell 6: 1077 1087, 2000; Romano y col., Mol Microbiol 6: 3343 -3353, 1992; Tabara y col., Cell 99: 123 -132, 1999; y Tuschl, Chembiochem. 2: 239 -245,2001.
35 [0281] Paddison y col. (Genes & Dev. 16: 948 -958, 2002) han usado moléculas de ARN pequeño plegadas en horquilla como un medio para efectuar el ARNi. Consecuentemente, dicho ARN pequeño en horquilla (las moléculas de ARNph también se usan ventajosamente en los métodos de la divulgación. La longitud del tallo y del bucle del ARNph funcional varía; los tallos pueden tener una longitud cualquiera desde aproximadamente 25 hasta
40 aproximadamente 30 nt, y el tamaño del bucle puede variar desde 4 hasta aproximadamente 25 nt sin que afecte a la actividad silenciadora. Sin desear ceñirnos a ninguna teoría en particular, se cree que estos ARNph se asemejan a los productos de ARNbc de la RNasa DICER y en cualquier caso, tienen la misma capacidad para inhibir la expresión de un gen específico.
45 [0282] En algunos casos, la divulgación proporciona que ese ARNip o ARNph inhibe la expresión del NgR1. En algunos casos, la divulgación también proporciona que ese ARNip o ARNph es idéntico en al menos el 80 %, el 90 % o el 95 % a la secuencia de nucleótidos que comprende: CUACUUCUCCCGCAGGCG (ID. SEC. Nº: 52) o CCCGGACCGACGUCUUCAA (ID. SEC. Nº: 54) o CUGACCACUGAGUCUUCCG (ID. SEC. Nº: 56). En otros casos, la secuencia de nucleótidos del ARNip o del ARNph es CUACUUCUCCCGCAGGCG (ID. SEC. Nº: 52) o
50 CCCGGACCGACGUCUUCAA (ID. SEC. Nº: 54) o CUGACCACUGAGUCUUCCG (ID. SEC. Nº: 56).
[0283] En algunos casos, la divulgación también proporciona que la secuencia de nucleótidos del ARNip o del ARNph es complementaria del ARNm producido por la secuencia del polinucleótido GATGAAGAGGGCGTCC GCT (ID. SEC. Nº: 53) o GGGCCTGGCTGCAGAAGTT (ID. SEC. Nº: 55) o GACTGGTGACTCAGAG AAGGC (ID. SEC.
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(Wincott y col., Nucleic Acids Res. 23: 2677 (1995); Caruthers y col., Methods en Enzymology 211: 3 -19 (1992)) han expandido la capacidad de modificar moléculas de ácidos nucleicos mediante la introducción de modificaciones de nucleótidos que mejoran su estabilidad frente a la nucleasa, como se ha descrito anteriormente.
5 [0290] Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden incluir uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) nucleótidos de pinza de G. Un nucleótido de pinza de G es un análogo de citosina modificada, en el que las modificaciones confieren la capacidad de crear puentes de hidrógeno tanto en la cara de Watson-Crick como de Hoogsteen de una guanina complementaria de un dúplex, véase, por ejemplo, Lin y Matteucci, J. Am. Chem. Soc. 120: 8531 -8532 (1998). Una única sustitución de un análogo de pinza
10 de G en un oligonucleótido puede dar como resultado una estabilidad térmica de la hélice sustancialmente mejorada y la discriminación del desapareamiento cuando se hibrida con oligonucleótidos complementarios. La inclusión de dichos nucleótidos en los polinucleótidos de la divulgación da como resultado una mejora tanto en la afinidad como en la especificidad hacia los ácidos nucleicos objetivo, las hebras complementarias o las hebras de molde. Los polinucleótidos de la presente divulgación también pueden incluir uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3,
15 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) nucleótidos LNA de "ácido nucleico bloqueado", tal como un 2’, 4’-C mitilen biciclo nucleótido (véase, por ejemplo, Wengel y col., Publicación Internacional PCT Nº WO 00/66604 y WO 99/14226).
[0291] La presente divulgación también presenta conjugados y/o complejos de las moléculas del ARNip de la divulgación. Dichos conjugados y/o complejos pueden usarse para facilitar la administración de las moléculas del 20 ARNip a un sistema biológico, tal como una célula. Los conjugados y los complejos proporcionados por la actual divulgación pueden impartir una actividad terapéutica mediante la transferencia de compuestos terapéuticos a través de las membranas celulares, alterando la farmacocinética y/o modulando la localización de las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación. La presente divulgación engloba el diseño y la síntesis de nuevos conjugados y complejos para la administración de moléculas, que incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, lípidos, 25 fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente y otros polímeros, por ejemplo, proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles o poliaminas, a través de las membranas celulares. En general, los transportadores descritos están diseñados para ser usados bien individualmente o bien como parte de un sistema multicomponente, con o sin conectores degradables. Se espera que estos compuestos mejoren la administración y/o la localización de las moléculas de ácidos nucleicos de la
30 divulgación en diversos tipos celulares procedentes de diferentes tejidos, en presencia o en ausencia de suero (véase Sullenger y Cech, Patente de EE.UU. Nº 5.854.038). Los conjugados de las moléculas descritas en el presente documento pueden ser unidos a moléculas biológicamente activas a través de conectores que son biodegradables, tales como moléculas conectadas de ácidos nucleicos biodegradables.
35 [0292] Los polinucleótidos terapéuticos (por ejemplo, las moléculas de ARNip) administrados de forma exógena son óptimamente estables en las células hasta que se ha modulado la transcripción inversa del ARN lo suficiente como para reducir los niveles del transcrito del ARN. Las moléculas de ácidos nucleicos son resistentes a las nucleasas con objeto de funcionar como unos agentes terapéuticos intracelulares eficaces. Las mejoras en la síntesis química de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la actual divulgación y en la materia han
40 expandido la capacidad de modificar las moléculas de ácidos nucleicos mediante la introducción de modificaciones en los nucleótidos para mejorar su estabilidad frente a la nucleasa como se ha descrito anteriormente.
[0293] La presente divulgación también proporciona moléculas de ARNip que tienen modificaciones químicas que mantienen o mejoran la actividad enzimática de las proteínas implicadas en el ARNi. Dichos ácidos nucleicos
45 también son generalmente más resistentes a las nucleasas que los ácidos nucleicos no modificados. Por lo tanto, la actividad in vitro y/o in vivo no debería reducirse significativamente.
[0294] El uso de las moléculas basadas en polinucleótidos de la divulgación emitirá un mejor tratamiento de la progresión de la enfermedad proporcionando la posibilidad de terapias de combinación (por ejemplo, múltiples
50 moléculas de ARNip dirigidas a diferentes genes; moléculas de ácidos nucleicos acopladas con pequeñas moléculas moduladoras conocidas; o el tratamiento intermitente con combinaciones de moléculas, incluyendo diferentes motivos y/u otras moléculas químicas o biológicas). El tratamiento de sujetos con las moléculas de ARNip también puede incluir combinaciones de diferentes tipos de moléculas de ácidos nucleicos, tales como moléculas de ácidos nucleicos enzimáticas (ribozimas), alozimas, antisentido, 2,5-A oligoadenilato, señuelos, aptámeros etc.
55 [0295] En otro aspecto, una molécula de ARNip de la divulgación puede comprender una o más estructuras protegidas en 5’ y/o en 3’, por ejemplo, únicamente en la hebra del ARNip sentido, en la hebra del ARNip antisentido
o en ambas hebras del ARNip.
60 Por “estructura protegida” se entienden modificaciones químicas que han sido incorporadas en cualquier extremo del
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controlado (Sarin y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 85: 7448 -7451(1988)), etc.
[0309] Las composiciones de polinucleótidos para su uso en los métodos terapéuticos divulgados en el presente documento incluyen adicionalmente ARN catalítico o una ribozima (Véase, por ejemplo, la Publicación 5 Internacional PCT WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver y col., Science 247: 1222 -1225 (1990). Se prefiere el uso de ribozimas cabeza de martillo. Las ribozimas cabeza de martillo escinden los ARNm en unas ubicaciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman los pares de bases complementarios del ARNm objetivo. El único requisito es que el ARNm objetivo tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5’-UG-3’. La construcción y la producción de ribozimas cabeza de martillo es bien conocida en la materia y se describe más
10 completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585 -591 (1988). Preferiblemente, la ribozima se diseña de tal forma que el sitio de reconocimiento de la escisión esté ubicado cerca del extremo 5’ del ARNm objetivo; es decir, para aumentar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de transcritos no funcionales del ARNm.
[0310] Como en la metodología antisentido, las ribozimas para su uso en los métodos diagnósticos y
15 terapéuticos divulgados en el presente documento pueden estar formadas por oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, el direccionamiento, etc.) y pueden ser administradas a células que expresan el NgR1 in vivo. Los constructos de ADN que codifican para la ribozima pueden ser introducidos en la célula de la misma forma a la descrita anteriormente para la introducción del ADN codificante antisentido. Un método de administración preferido implica el uso de un constructo de ADN "que codifica para" la ribozima bajo el control de un
20 fuerte promotor constitutivo, tal como, por ejemplo, el promotor pol III o pol II, de forma que las células transfectadas producirán unas cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajes endógenos de NgR1 e inhibir la traducción. Dado que las ribozimas, al contrario que las moléculas antisentido, son catalíticas, se necesita una menor concentración intracelular para su eficacia.
25 Aptámeros
[0311] En otro caso, el antagonista NgR1 para su uso en los métodos de la presente divulgación es un aptámero. Un aptámero puede ser un nucleótido o un polipéptido que tiene una secuencia única, tiene la propiedad de unirse específicamente a un objetivo deseado (por ejemplo, un polipéptido) y es un ligando específico de un
30 objetivo dado. Los aptámeros de los nucleótidos de la divulgación incluyen moléculas de ADN bicatenario y de ARN monocatenario que se unen al NgR1.
[0312] Los aptámeros de ácidos nucleicos se seleccionan mediante el uso de métodos conocidos en la materia, por ejemplo, a través del proceso de evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento 35 exponencial (SELEX). El SELEX es un método para la evolución in vitro de moléculas de ácidos nucleicos con una elevada especificidad de unión con las moléculas objetivo según se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 5.475.096, 5.580.737, 5.567.588, 5.707.796, 5.763.177, 6.011.577 y 6.699.843. Otro método de cribado para la identificación de aptámeros se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.270.163. El proceso de SELEX se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de formar diversas estructuras bi y tridimensionales, así como la
40 versatilidad química disponible en los monómeros de nucleótidos para que actúen como ligandos (formen pares de unión específicos) con prácticamente cualquier compuesto químico, tanto monomérico como polimérico, incluyendo otras moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos. Pueden servir como objetivo moléculas de cualquier tamaño o composición.
45 [0313] El método SELEX implica la selección a partir de una mezcla de oligonucleótidos candidatos y repeticiones por etapas de unión, partición y amplificación, mediante el uso del mismo esquema general de selección, para conseguir la afinidad y la selectividad de unión deseadas. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que preferiblemente comprende un segmento de una secuencia aleatorizada, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con el objetivo en unas condiciones favorables para la unión; particionar
50 los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas objetivo; disociar los complejos de ácido nucleico-objetivo; amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando. Las etapas de unión, partición, disociación y amplificación se repiten durante muchos ciclos según se desee para producir ligandos de ácidos nucleicos con una alta especificidad y una alta afinidad por la molécula objetivo.
55 [0314] Los aptámeros de nucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como herramientas diagnósticas o como inhibidores específicos para interrumpir la señalización intracelular y las rutas de transporte (James (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1: 540 -546). La elevada afinidad y especificidad de los aptámeros de nucleótidos los hace buenos candidatos para el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, se han aislado los antagonistas aptámeros de
60 la toxina ricina y tienen unos valores de la CI50 en el intervalo nanomolar (Hesselberth JR y col. (2000) J Biol Chem
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en formas solubles en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos en forma de las apropiadas suspensiones oleosas para inyección. Algunos disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También pueden usarse liposomas para encapsular las moléculas de esta invención para su administración en la célula. Algunos ejemplos de "portadores farmacéuticamente aceptables" son cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunos casos, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. En algunos casos, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida de almacenamiento o la eficacia de los anticuerpos, de los fragmentos de unión al antígeno, de los receptores Nogo solubles o de las proteínas de fusión de la divulgación.
[0325] Las composiciones de la divulgación pueden estar en una diversidad de formas, que incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica previstos. En un caso, las composiciones están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos.
[0326] La composición puede ser formulada en forma de una solución, una microemulsión, una dispersión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de un anticuerpo anti-receptor Nogo-1 en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de los mismos. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
[0327] En algunos casos, el compuesto activo puede ser preparado con un portador que protegerá al compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se han patentado muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones, o son conocidos generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery System, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978).
[0328] También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones. En algunos casos, un anticuerpo del receptor Nogo-1 o fragmentos de unión al antígeno del mismo, o los polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 o las proteínas de fusión de la invención, son formulados conjuntamente y/o administrados conjuntamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales que incluyen, por ejemplo, un agente antiinflamatorio. En un caso, el agente antiinflamatorio es un agente antiinflamatorio no esteroideo. En otro caso, el agente antiinflamatorio es un agente antiinflamatorio esteroideo. En un caso particular, el agente antiinflamatorio es metilprednisolona.
[0329] En un caso, la presente divulgación se refiere al uso de un antagonista del receptor Nogo junto con un agente antiinflamatorio no esteroideo (AINE), ésteres de profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Algunos ejemplos de AINEs que son bien conocidos en la materia incluyen derivados del ácido propiónico (por ejemplo, ahninoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, ketoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno,
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disponibles y pueden ser aplicadas para la administración de un antagonista del NgR de acuerdo con la divulgación. Por ejemplo, la colocación estereotáctica de un catéter o de un implante puede realizarse mediante el uso de la unidad de Riechert-Mundinger y la unidad de localización multipropósito ZD (Zamorano-Dujovny). Un escáner de tomografía computerizada mejorada por contraste (CT), mediante la inyección de 120 ml de omnipaque, 350 mg de yodo/ml, con 2 mm de espesor de corte, puede permitir la planificación de un tratamiento tridimensional multiplanar (STP, Fischer, Friburgo, Alemania). Este equipo permite la planificación sobre la base de los estudios por imagen de resonancia magnética, combinando la información del objetivo de la CT y de la MRI para una confirmación clara del objetivo.
[0340] El sistema estereotáctico Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para su uso con un escáner GE CT (General Electric Company, Milwaukee, WI) así como el sistema estereotáctico de Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) puede usarse para este fin. Por lo tanto, la mañana del implante, puede fijarse el anillo de base anular del marco estereotáctico BRW al cráneo del paciente. Pueden obtenerse secciones sucesivas de CT a unos intervalos de 3 mm a través de la región (tejido objetivo) con un marco localizador de barra de grafito fijado en la placa de base. Puede ejecutarse un programa de planificación de tratamiento computerizado con un ordenador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) mediante el uso de las coordenadas de CT de las imágenes de la barra de grafito para el cartografiado entre el espacio de la CT y el espacio del BRW.
Usos de los anticuerpos, los fragmentos de unión al antígeno, los receptores solubles, las proteínas de fusión, los polinucleótidos y las composiciones
[0341] En algunos casos, la divulgación proporciona métodos para la inhibición de la actividad del receptor Nogo-1 mediante la administración de anticuerpos anti-receptor Nogo-1, de fragmentos de unión al antígeno de dichos anticuerpos, de polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 o de proteínas de fusión que comprenden dichos polipéptidos, a un mamífero en necesidad de los mismos.
[0342] En algunos casos, la divulgación proporciona un método para la inhibición de la unión del receptor Nogo-1 a un ligando, que comprende la etapa de poner en contacto el receptor Nogo-1 con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de esta divulgación. En algunos casos, el ligando se elige de entre el grupo que consiste en NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp.
[0343] En algunos casos, la divulgación proporciona un método para la inhibición del colapso del cono de crecimiento en una neurona, que comprende la etapa de poner en contacto la neurona con el anticuerpo o con el fragmento de unión al antígeno del mismo de esta invención divulgación. En algunos casos, la divulgación proporciona un método para la disminución de la inhibición del crecimiento de la neurita o de la germinación en una neurona, que comprende la etapa de poner en contacto la neurona con el anticuerpo o con el fragmento de unión al antígeno de esta divulgación. En algunos casos, la neurona es una neurona del CNS. En algunos de estos casos, el crecimiento o la germinación de la neurita es un crecimiento axonal.
[0344] En algunos casos, la divulgación proporciona un método para promover la supervivencia de una neurona en un mamífero, una que está en riesgo de morir, que comprende (a) proporcionar una célula hospedadora cultivada que expresa (i) un anticuerpo anti-receptor Nogo-1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo; o (ii) un polipéptido soluble del receptor Nogo-1; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en el sitio de la neurona o cerca. Almudena Ramón-Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F Santos-Benito y Jesús Ávila (2000) Functional recovery of paralegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells. Neuron 25, 425 -435.
[0345] En algunos casos, la divulgación proporciona un método de terapia génica para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir, neurona que está en un mamífero, que comprende la administración en el sitio de la neurona o cerca, de un vector vírico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para (a) un anticuerpo anti-receptor Nogo-1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo; o (b) un polipéptido soluble del receptor Nogo-1, en el que el anticuerpo anti-receptor Nogo-1, el fragmento de unión al antígeno o el polipéptido soluble del receptor Nogo-1 es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos en el mamífero en una cantidad suficiente para promover la supervivencia de la neurona. Algunas vectores víricos y los métodos útiles para estas formas de realización se describen, por ejemplo, en Noel y col., Human Gene Therapy, 13: 1493 -93 (2002).
[0346] En algunos casos, la divulgación proporciona un método para la inhibición de la unión del receptor Nogo-1 a un ligando, que comprende la etapa de poner en contacto el ligando con el polipéptido soluble del receptor Nogo-1 o la proteína de fusión del receptor Nogo-1 de esta invención.
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de tratamiento concomitante, si lo hubiera, de la frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado.
[0356] Los compuestos de esta divulgación pueden ser utilizados in vivo, habitualmente en mamíferos, tales como seres humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro.
Vectores de la divulgación
[0357] En algunos casos, la divulgación proporciona moléculas de ADN recombinante (ADNr) que contienen una secuencia codificante. Según se usa en el presente documento, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que ha sido sometida a una manipulación molecular. Los métodos para la generación de moléculas de ADNr son bien conocidos en la materia, por ejemplo, véase Sambrook y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). En algunas moléculas de ADNr, una secuencia codificante de ADN está unida operativamente a secuencias de control de la expresión y a secuencias del vector.
[0358] En algunos casos, la divulgación proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de la invención. La elección del vector y de las secuencias de control de la expresión a las que los ácidos nucleicos de esta divulgación están unidas operativamente depende directamente, como es bien conocido en la materia, de las propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, de la expresión de la proteína y de la célula hospedadora que se va a transformar). Un vector de la presente divulgación pueden ser al menos capaz de dirigir la replicación o la inserción en el cromosoma del hospedador, y preferiblemente también la expresión, del gen estructural incluido en la molécula de ADNr.
[0359] Los elementos de control de la expresión que se usan para la regulación de la expresión de una secuencia codificante de una proteína unida operativamente son conocidos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción y otros elementos reguladores. Preferiblemente, el promotor inducible se controla fácilmente, tal como siendo sensible a un nutriente del medio de la célula hospedadora.
[0360] En un caso, el vector que contiene una molécula de ácido nucleico codificante incluirá un replicón procariota, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedadora procariota, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada con el mismo. Dichos replicones son bien conocidos en la materia. Además, los vectores que incluyen un replicón procariota también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable tal como la resistencia a un fármaco. Los genes bacterianos típicos de resistencia a fármacos son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina.
[0361] Los vectores que incluyen un replicón procariota pueden incluir adicionalmente un promotor procariota
o de bacteriófago capaz de dirigir la expresión (la transcripción y la traducción) de las secuencias codificantes del gen en una célula hospedadora bacteriana, tal como en E. coli. Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que se produzca la unión de la polimerasa de ARN y la transcripción. Las secuencias promotoras compatibles con hospedadores bacterianos normalmente se proporcionan en vectores de plásmidos que contienen los sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente divulgación. Algunos ejemplos de dichos plásmidos vectores son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (Bio-Rad® Laboratories), pPL y pKK223 (Pharmacia). Puede usarse cualquier hospedador procariota adecuado para la expresión de una molécula de ADN recombinante que codifica para una proteína de la invención.
[0362] También pueden usarse vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferiblemente aquellos compatibles con células de vertebrados, para formar moléculas de ADNr que contienen una secuencia codificante. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la materia y están disponibles en numerosas fuentes comerciales. Normalmente, dichos vectores se proporcionan conteniendo los sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Algunos ejemplos de dichos vectores son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC® 31255) y otros vectores de expresión eucariotas.
[0363] Los vectores de expresión de células eucariotas usados para la construcción de las moléculas de ADNr de la presente divulgación pueden incluir adicionalmente un marcador seleccionable que sea eficaz en una célula eucariota, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármacos. Un marcador de resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión da como resultado una resistencia a la neomicina, es decir, el gen de la fosfotransferasa de neomicina (neo) (Southern y col., J. Mol. Anal. Genet. 1: 327 -341 (1982)). Alternativamente, el marcador seleccionable puede estar presente en un plásmido individual, introducirse los dos vectores mediante una
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emplearse una electroporación y métodos de tratamiento salino (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Cohen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69: 2110 -2114 (1972)). Con respecto a la transformación en células de vertebrados con vectores que contienen el ADNr, puede emplearse una electroporación, lípidos catiónicos o métodos de tratamiento salino (véase, por ejemplo, Graham y col., Virology 52: 456 -467 (1973); Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76: 1373 1376 (1979)).
[0373] Las células transformadas con éxito, es decir, las células que contienen una molécula de ADNr de la presente divulgación, pueden ser identificadas mediante técnicas bien conocidas que incluyen la selección para un marcador seleccionable. Por ejemplo, pueden clonarse las células resultantes de la introducción de un ADNr de la presente divulgación para producir colonias individuales. Las células de esas colonias pueden ser recogidas, lisadas, y examinarse su contenido en ADN para comprobar la presencia del ADNr mediante el uso de un método tal como el descrito por Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 -517 (1975), o pueden ensayarse las proteínas producidas en la célula mediante un método inmunológico.
[0374] Las células hospedadoras para la expresión de un polipéptido o de un anticuerpo de la divulgación para su uso en un método de la divulgación pueden ser procariotas o eucariotas. Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores de expresión son bien conocidas en la materia e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC®). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549 y muchas otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen unos niveles de expresión elevados. Otras células hospedadoras eucariotas útiles incluyen células vegetales. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como las células Sf9. Algunos ejemplos de células hospedadoras procariotas son E. coli y Streptomyces.
[0375] Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican para los polipéptidos inmunógenos, los anticuerpos del receptor Nogo-1 o los fragmentos de unión al antígeno, los polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 y las proteínas de fusión solubles del receptor Nogo-1 de la divulgación, son introducidos en células hospedadoras de mamífero, son producidos mediante el cultivo de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo, del polipéptido y del polipéptido de fusión en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción de los polipéptidos inmunógenos, de los anticuerpos del receptor Nogo-1 o de los fragmentos de unión al antígeno, de los polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 y de las proteínas de fusión solubles del receptor Nogo-1 de la divulgación en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras. Los polipéptidos inmunógenos, los anticuerpos del receptor Nogo-1 o los fragmentos de unión al antígeno, los polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 y las proteínas de fusión solubles del receptor Nogo-1 de la divulgación, pueden ser recuperados a partir del medio de cultivo mediante el uso de los métodos de purificación de proteínas habituales.
[0376] Además, la expresión de los polipéptidos inmunógenos, de los anticuerpos del receptor Nogo-1 o de los fragmentos de unión al antígeno, de los polipéptidos solubles del receptor Nogo-1 y de las proteínas de fusión solubles del receptor Nogo-1 de la divulgación (o de otras fracciones de los mismos) a partir de las líneas celulares de producción puede mejorarse mediante el uso de numerosas técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la sintetasa de glutamina (el sistema GS) es una metodología habitual para mejorar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se analiza total o parcialmente en relación con las Patentes Europeas Nº 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea Nº 89303964.4.
Células hospedadoras
[0377] La presente divulgación también proporciona células hospedadoras transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo del receptor Nogo-1, un fragmento de unión al antígeno, un polipéptido soluble del receptor Nogo-1 y/o una proteína de fusión soluble del receptor Nogo-1 de la divulgación. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células eucariotas útiles para la expresión de una proteína de la invención no están limitadas siempre que la línea celular sea compatible con los métodos de cultivo celular y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión de producto del gen. Las células hospedadoras eucariotas preferidas incluyen, pero no se limitan a, células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado tales como aquellas de una línea celular de ratón, de rata, de mono o humana. Algunos ejemplos de células hospedadoras eucariotas útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles en la ATCC® como CCL61, células embrionarias de ratón suizo NIH NIH-3T3 disponibles en la ATCC como
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verificó la expresión en superficie de la proteína del receptor Nogo-1 mediante FACS. Se prepararon membranas de COS-7 a partir de estas células de acuerdo con los procedimientos descritos [Wang y col., J. Neurochem. 75: 1155 1161 (2000)] con dos lavados y se almacenaron a 1 mg/ml [concentración de proteína] en glicerol al 10 % a -70 ºC.
[0387] Se inmunizaron intraperitonealmente ratones RBF hembras de ocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) bien con una emulsión que contiene 50 µg del receptor Nogo-1 de rata – membranas de COS-7 o bien con células COS-7 completas que expresan el receptor Nogo-1 en la superficie y 50 µl de coadyuvante RIBI MPL + TDM + CWS (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) una vez cada dos semanas (Lipman y col., 1992). Los sueros de los ratones inmunizados se recogieron antes de la primera inmunización, 7 días después de la segunda y de la tercera inmunización y 38 días después de la tercera inmunización, y se midieron los títulos del anticuerpo antireceptor Nogo-1 mediante un ELISA como se describe a continuación.
2. Péptidos específicos del receptor Nogo-1 como inmunógeno
[0388] La secuencia génica del receptor Nogo-1 de rata se sometió a análisis de antigenicidad mediante el uso del programa informático Vector NTi™ (Fig. 2). Los péptidos antigénicos que fueron identificados en los análisis se conjugaron con hemocianina de lapa californiana (KLH) mediante el uso de los procedimientos habituales con glutaraldehído.
[0389] Se inmunizaron intraperitonealmente ratones RBF hembras de ocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) con una emulsión que contiene 50 µg de los péptidos conjugados con KLH y 50 µl de coadyuvante completo de Freund (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) una vez cada dos semanas. El suero de los ratones inmunizados se recogió antes de la primera inmunización y 1 semana después de la segunda y de la tercera inmunización, y se midieron los títulos del anticuerpo anti-receptor Nogo-1. Se administró una dosis de refuerzo después de la tercera inmunización. Tres días después de esta dosis de refuerzo, se iniciaron los experimentos de fusión.
Producción de hibridomas y cribado
[0390] Los sueros de los ratones inmunizados con los péptidos antigénicos del receptor Nogo-1 fueron cribados mediante un ELISA, mientras que los sueros de los ratones inmunizados con las células COS-7 que expresan el receptor Nogo-1 fueron cribados mediante una citometría de flujo. Los ratones que eran positivos para los anticuerpos que se unían específicamente a las células COS-7 con el receptor Nogo-1 fueron identificados mediante una citometría de flujo y fueron sacrificados. Se aislaron los esplenocitos de los ratones y se condensaron con el mieloma FL653 (un derivado de APRT de un mieloma Ig-/ HG-PRT-de ratón Balb/c, mantenido en DMEM que contiene un 10 % de FBS, 4.500 mg/l glucosa, L-glutamina 4 mM y 20 mg/ml de 8-azaguanina) según se describe (Kennett y col., Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Nueva York (1993)). Las células fusionadas se colocaron en placas de 24 o de 48 pocillos (Corning Glass Works, Coming, NY) y se alimentaron con un medio de cultivo que contiene adenina, aminopterina y timidina. Los cultivos resistentes a AAT fueron cribados mediante un ELISA o mediante una citometría de flujo para comprobar la unión a las células COS-7 con el receptor Nogo-1 o al péptido antigénico del receptor Nogo-1 según se describe a continuación. Las células de los pocillos positivos se subclonaron adicionalmente mediante una dilución limitante.
[0391] Para cribar la unión del anticuerpo al péptido antigénico del receptor Nogo-1, los péptidos que se usaron como inmunógenos se conjugaron con BSA. Se añadieron 0,5 µg del péptido conjugado a 50 µl de tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M, a pH 9,0 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos MaxiSorp™ (Nunc™). La placa se incubó después a 37 ºC durante 1 hora o a 4 ºC durante 16 horas, y los sitios de unión no específica se bloquearon mediante el uso de HEPES 25 mM, a pH 7,4 que contiene un 0,1 % de BSA, un 0,1 % de ovoalbúmina, un 0,1 % de blotto y un 0,001 % de azida. Se añadió el sobrenadante del hibridoma y se incubó a 25 ºC durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS, se añadieron en cada pocillo 50 µl de una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Inc.) y se incubaron adicionalmente durante 1 hora. Después de tres lavados se desarrolló un color mediante TMB (Pierce) y se detuvo con ácido sulfúrico 2 M. La intensidad del color se monitorizó con un espectrofotómetro a 450 nm.
[0392] Se cribaron los anticuerpos para comprobar la unión al receptor Nogo-1 completo como sigue. Las células COS-7 se marcaron con CellTracker™ Green CMFDA 0,1 µM (Molecular Probes, Eugene, OR) según describe el vendedor. Se mezclaron volúmenes iguales de células de control marcadas con CellTracker™ con células COS-7 con el receptor Nogo-1 lavadas antes de la incubación con los sueros de ensayo anti-receptor Nogo-1. Se dispensaron cincuenta microlitros de la mezcla celular en cada pocillo de placas de poliestireno de fondo en V de 96 pocillos (Costar® 3877, Coming, NY) y se añadieron 100 µl del sobrenadante del hibridoma o un anticuerpo de
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Cartografiado de los epítopos del anticuerpo monoclonal 7E11
[0395] El mAb 7E11 se une tanto al NgR1 de rata como al humano. Para determinar el epítopo responsable 5 de la unión del 7E11, generamos fragmentos y péptidos sintéticos del NgR1 de rata y los ensayamos para comprobar la unión del 7E11.
[0396] Se trató un fragmento recombinante del NgR1 de rata que contiene la totalidad de los 8 dominios LRR con protecciones N y C terminales (sNgR310) con ácido o con bromuro de cianógeno (CNBr) y los fragmentos se 10 separaron mediante una electroforesis en gel. El sNgR310 no tratado migra con un peso molecular aparente de 42 kDa. El tratamiento ácido del sNgR310 produjo dos productos de escisión principales de 15 kDa (aa 27 -aa 122) y de 30 kDa (aa 123 -aa 310). El tratamiento con CNBr generó tres fragmentos, un doblete de 33 / 35 kDa (aa 27 -aa 229), que puede representar los fragmentos con una glucosilación heterogénea, un producto de 10 kDa (aa 241 -aa 310) y un fragmento de 11 aminoácidos (aa 230 -aa 240) que no es retenido en el gel. Una inmunotransferencia
15 western del gel se sondeó con 7E11 y se demostró que se unía al NgR1 de rata intacto (aa 27 -aa 310), al fragmento de ácido de 15 kDa (aa 27 -aa 122) y al fragmento de CNBr de 35 kDa (aa 27 -aa 229). El 7E11 no se une al fragmento ácido de 30 kDa (aa 123 -aa 310) ni al fragmento de CNBr de 10 kDa (aa 241 -aa 310). Tanto el fragmento ácido de 15 kDa como el fragmento de CNBr de 35 kDa contenían la secuencia LDLSADNQLRVVDPTT (ID. SEC. Nº: 1), coherente con la unión del 7E11 a un único epítopo del NgR1.
20 [0397] El sitio de unión del 7E11 se analizó adicionalmente mediante el ensayo de los digeridos peptídicos trípticos del sNgR310. Los análisis mediante HPLC mostraron numerosos fragmentos, indicando que había numerosos residuos de lisina y de arginina sensibles a la tripsina en la secuencia del NgR1. El 7E11 se unió únicamente a un único digerido peptídico tríptico, proporcionando pruebas adicionales de que el 7E11 se une a un
25 único epítopo del NgR1. La subsiguiente espectroscopía de masas (MS) y análisis de la secuencia identificaron el péptido unido como AAAFTGLTLLEQLDLSADNQLR (ID. SEC. Nº: 26).
[0398] El péptido LDLSADNQLRVVDPTT (ID. SEC. Nº: 1) se sometió a un análisis de cartografiado adicional. El péptido se digirió con tripsina, lo que produjo dos fragmentos principales, LDLSADNQLR (ID. SEC. Nº: 27) y 30 VVDPTT (ID. SEC. Nº: 28) y se ensayó la capacidad del 7E11 para unirse a ellos. El análisis mediante EM reveló que el anticuerpo se unía al péptido LDLSD-NAQLR (ID. SEC. Nº: 27) y por lo tanto este péptido contiene el epítopo de unión para el 7E11. En esta fracción peptídica, un análisis detallado mediante EM identificó numerosos péptidos desordenados que también se unían al 7E11, incluyendo péptidos con una desaminación en la Asn115 y en la Gln117, una adición de Alanina en 112 o en 113, o una adición de Serina en 114 (Tabla 3). Estos datos indican que
35 numerosos residuos de aminoácidos ubicados en este fragmento peptídico pueden no ser críticos para la unión del 7E11.
TABLA 3. PÉPTIDOS MUTANTES UNIDOS POR EL 7E11.
Péptidos unidos
Secuencia de aminoácidos
Fragmento natural desaminado
LDLSADNQLR (ID. SEC. Nº: 27) LDLSDDAELR (ID. SEC. Nº: 29)
Fragmento desordenado #1 desaminado
LDLASADNQLR (ID. SEC. Nº: 30) LDLASDDAELR (ID. SEC. Nº: 31)
Fragmento desordenado #2 desaminado
LDALSADNQLR (ID. SEC. Nº: 32) LDALSDDAELR (ID. SEC. Nº: 33)
Fragmento desordenado #3 desaminado
LDLSSADNQLR (ID. SEC. Nº: 34) LDLSSDEAELR (ID. SEC. Nº: 35)
[0399] El péptido LDLSADNQLRVVDPTT (ID. SEC. Nº: 1) también se digirió con la endoproteasa Asp-N y se ensayó la unión del 7E11. La endoproteasa Asp-N escindió el péptido en 3 fragmentos peptídicos, L, DLS y ADNQLPVVDPTT (ID. SEC. Nº: 36). De estos productos, el 7E11 se unió al péptido ADNQLRWDPTT (ID. SEC. Nº: 36). Tomados conjuntamente, los datos de escisión de la tripsina y de la Asp-N localizan adicionalmente el epítopo
45 de unión del 7E11 en la secuencia compartida por ambos, el ADNQLR (ID. SEC. Nº: 37).
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[0400] Se analizaron las secuencias de aminoácidos del NgR1, del NgR2 y del NgR3 de varias especies para predecir residuos críticos en el epítopo de unión del 7E11 basándose en la observación de que el 7E11 se une al NgR1 de rata y humano pero no al NgR1 de ratón, al NgR2 humano ni al NgR3 de ratón. La alineación de la secuencia reveló que los aminoácidos 110 -125 del NgR1 de rata y la correspondiente secuencia del NgR1 humano
5 son idénticos, y que la secuencia del NgR1 de ratón difieren únicamente en un aminoácido en la posición 119 (Arg119 en el NgR1 de rata y humano e His119 en el NgR1 de ratón; Tabla 4).
TABLA 4. ALINEACIÓN DE LA SECUENCIA DE LOS NGR DE DIFERENTES ESPECIES.
Proteína(s)
Secuencia desde el aa 110 hasta el aa 119 ID. SEC. Nº:
NgR1 de rata y humana
LDLSADNQLR 27
NgR1 de ratón
LDLSADNQLH 38
NgR2 de rata y humana
LDLGDNRHLR 39
NgR3 de rata, humana y de ratón
LDLGDNRQLR 40
10 [0401] La Arg119 del NgR1 contribuye a la unión del 7E11 porque se une bien al NgR1 de rata y humano pero mal al NgR1 de ratón. De forma análoga, debido a que el 7E11 no se une bien al NgR3, la Ala116 está implicada en el epítopo porque dentro de la secuencia ADNQLR (ID. SEC. Nº: 37), el NgR3 sólo difiere del NgR1 en una Arginina en la secuencia correspondiente. En la secuencia ADNQLR (ID. SEC. Nº: 37), 4 de los 6 residuos del NgR2 son
15 idénticos a los del NgR1 de rata. La Ala116 y la Gln117 están sustituidas por Arginina e Histidina, respectivamente. Esto confirma que la Ala116 es un residuo de aminoácido importante que contribuye a la unión del 7E11, pero que no descarta necesariamente la implicación de la Gln 117.
[0402] Para verificar estos puntos de contacto se generaron numerosos péptidos que contienen mutaciones
20 puntuales en la secuencia LDLSADNQLR (ID. SEC. Nº: 27) y se ensayaron para comprobar la unión del 7E11. Los péptidos se inmovilizaron en una placa MaxiSorp™ (Nunc™) y se aplicaron diluciones sucesivas del 7E11. Los valores resultantes de la CE50 se muestran en la Tabla 5. El 7E11 se une a los mutantes de Leu110Ala y de Asp111Ala con unos valores de la CE50 similares a los del péptido original. Cuando se ensayó con Gln117Ala, la CE50 aumentó 30 veces, y cuando se ensayó con Arg119His la CE50 aumentó 25 veces. El cambio más significativo
25 en la CE50 se observó cuando la Arg119 se mutó por Alanina.
TABLA 5. EL 7E11 SE UNE A LOS PÉPTIDOS MUTANTES CON DIFERENTES CE50
Cambio en el péptido
Secuencia CE50 ID. SEC. Nº:
Nº de cambios
LDLSADNQLRVVDPTT 0,55 1
L110A
ADLSADNQLRVVDPTT 0,62 41
D111A
LALSADNQLRVVDPTT 0,31 42
Q117A
LDLSADNALRVVDPTT 16 43
R119H
LDLSADNQLHVVDPTT 12 44
R119A
LDLSADNQLAVVDPTT 88 45
30 [0403] También se determinó la posición del epítopo de unión del 7E11 en la recientemente resuelta estructura cristalina del sNgR310. Como se esperaba, la estructura demostró que el epítopo del 7E11 está expuesto en la superficie de la molécula. Los residuos Arg119, Gln117, Ala116 y Asp114 sobresalen hacia fuera de la estructura, mientras que la Leu118 y la Asn115 están localizadas hacia dentro. El epítopo está en la parte superior de un parche ácido de una superficie cóncava de la estructura y una superficie básica orientada hacia uno de los
35 lados.
Inhibición de la unión del ligando al receptor soluble Nogo-1 por el anticuerpo monoclonal anti-receptor Nogo-1
[0404] Los anticuerpos monoclonales anti-receptor Nogo-1 producidos como se ha descrito anteriormente se 40 ensayaron para determinar si inhibían la unión del ligando al receptor Nogo-1.
[0405] Se inmovilizaron 0,5 µg de una proteína de fusión de un receptor soluble Nogo-1 que comprende los residuos de aminoácidos 26 -344 del receptor Nogo-1 de rata y la región bisagra y Fc de la molécula de IgG1 de
75
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VH2 y la cadena ligera deriva del gen VKI. Las secuencias de aminoácidos de las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de uno de estos Fab-fagos, el 14D5, se muestran en la Tabla 7.
TABLA 7. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE LAS CDR DE 14D5
Secuencia de aminoácidos
ID. SEC. Nº:
Cadena pesada de la CDR1
GFSLSTSGGSVG 19
Cadena pesada de la CDR2
LIYSNDTKYYSTSLKT 20
Cadena pesada de la CDR3
SRFWTGEYDV 21
Cadena ligera de la CDR1
RASQNIAITLN 22
Cadena ligera de la CDR2
LASSLQS 23
Cadena ligera de la CDR3
QQYDNYPL 24
[0410] El 14D5 se une al receptor Nogo-1 de rata en ambas formas monovalente y bivalente. Además, el 14D5 se une al receptor Nogo-1 humano y de ratón y al receptor Nogo-2 humano, pero no al receptor Nogo-3 de ratón.
10
EJEMPLO 3
INMUNOPRECIPITACIÓN DEL RECEPTOR NOGO-1 MEDIANTE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-RECEPTOR NOGO-1
15 [0411] Para llevar a cabo la inmunoprecipitación, se mezclaron 100 µl de células lisadas o 50 µl de células PiPLC tratadas con 400 o con 450 µl de tampón de extracción [Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, 0,5 % de Tween-20™, PMSF 0,2 mM] o de tampón RIPA, respectivamente, en presencia de 30 µl de Proteína A o G y 1 -2 µg de anticuerpo. La mezcla se incubó en un agitador a 4 ºC durante 16 horas.
20 [0412] Las muestras se agitaron suavemente para sedimentar las microesferas acopladas a la proteína A o G. Las microesferas se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, 0,1 % de Tween20™). El lavado final se realizó mediante el uso de un 10 % del tampón de lavado original.
25 [0413] Las microesferas se resuspendieron en 100 µl de 2X SDS con un 10 % de beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a la temperatura ambiente antes de ser analizadas en un 4 -20 % de gel de Tris-Glicina para una SDS-PAGE. Según se determinó mediante el análisis en gel de SDS-PAGE, los anticuerpos monoclonales, 3G5 y 2F7, inmunoprecipitan el receptor Nogo-1.
30 EJEMPLO 4
DETERMINACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO MEDIANTE ELISA
[0414] Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales y Fab-fago producidos en los
35 Ejemplos 1 y 2, llevamos a cabo un ELISA mediante el uso de un conjunto de polipéptidos del receptor Nogo-1. El conjunto consistía en la sNogoR310-Fc (una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 26 -310 del receptor Nogo-1 de rata y un fragmento Fc de rata), la sNogoR344-Fc (véase supra), el polipéptido p-617 (ID. SEC. Nº: 1), el polipéptido p-618 (un polipéptido de 19 aminoácidos de la región LRR7 del receptor Nogo-1 de rata; Fig. 2; ID. SEC. Nº: 11) y los polipéptidos p-4 y p-5 (polipéptidos de las regiones LRR5 y LRRCT del receptor Nogo-1,
40 respectivamente). Se usaron ovoalbúmina y BSA como controles. Según se muestra en la Fig. 4, los mAb 1H2, 3G5 y 2F7 se unían todos específicamente al sNogoR344-Fc. En experimentos similares, esos anticuerpos también se unían específicamente a un polipéptido que consiste en los aminoácidos 310 -344 del receptor Nogo-1 de rata (ID. SEC. Nº: 3) y los mAb 7E11 y 5B10 se unen específicamente al polipéptido p-617 (ID. SEC. Nº: 1).
45 [0415] Diez de los anticuerpos (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1 y 2G7.1) de la inmunización sNogoR310-Fc se desplazaron entre sí por la unión, indicando que reconocen epítopos similares o solapantes del sNogoR310-Fc. Los otros tres anticuerpos de la inmunización sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1 y 1H4.1) reconocen epítopos diferentes localizados en los residuos de 26 -310.
50 [0416] También llevamos a cabo ensayos de unión mediante ELISA mediante el uso del Fab-fago 14D5.
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punteó por separado mielina del CNS sola o mezclada con el sNogoR310, la proteína de fusión sNogoR310-Fc, el mAb 5B10 o PBS de control en forma de gotas de 3 µl. Se añadieron microesferas fluorescentes (Polysciences) a la mielina / PBS para facilitar la posterior identificación de las gotas (Grand-pre y col., Nature 403: 439 -444 (2000)). Después los portaobjetos Lab-Tek® se aclararon y se cubrieron con 10 µg/ml de laminina (Gibco™).
[0433] Se disociaron los ganglios de las raíces dorsales (DRG) de crías de ratas Sprague Dawley P3-4 con 1 mg/ml de colagenasa de tipo 1 (Worthington), se trituraron con pipetas Pasteur pulidas al fuego, y se colocaron previamente en las placas para enriquecer en células neuronales y finalmente se colocaron en placas a 23.000 células/pocillo en los portaobjetos de cultivo Lab-Tek® prerrecubiertos. El medio de cultivo era F12 que contiene un 5 % de suero equino de donante inactivado por calor, un 5 % de suero bovino fetal inactivado por calor y 50 ng/ml de mNGF, y se incubaron a 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 6 horas.
[0434] Los portaobjetos se fijaron durante 20 minutos con un 4 % de paraformaldehído que contiene un 20 % de sacarosa y se tiñeron para el marcador neuronal anti-tubulina beta-III (Covance TUJ1) diluido a 1:500. Como anticuerpo secundario se diluyó a 1:300 anti-ratón Alexa Fluor® 594 (Molecular Probes) y los portaobjetos se cubrieron con Gel/Mount™ (Biomeda™). Se adquirieron imágenes digitales a 5x con el programa informático OpenLab™ y se analizaron mediante el uso del programa informático MetaMorph® para la cuantificación del crecimiento de la neurita.
[0435] El sNogoR310, el sNogoR310-Fc y el mAb 5B10 protegieron, todos, a las neuronas de los DRG de la inhibición del crecimiento de la neurita mediada por la mielina (Figs. 9 -11). El sNogoR310 se usó en un ensayo similar mediante el uso de neuronas de pollo, y se averiguó que era protector.
[0436] También ensayamos el efecto neuroprotector de los receptores solubles Nogo mediante la realización de experimentos con células cultivadas en presencia y en ausencia de laminina. El crecimiento de las células neuronales en medio sin laminina es bajo y sirve como modelo de condiciones de estrés neuronal.
[0437] Se diseccionaron los DRG de crías de rata de 6 -7 días post-natales (P6-7), se disociaron en células individuales y se colocaron en placas de 96 pocillos cubiertas previamente con poli-D-lisina como se ha descrito anteriormente. En algunos pocillos se añadieron 2 µg/ml de laminina durante 2 -3 horas y se aclararon antes de poner las células en las placas. Después de 18 -20 h de incubación, las placas se fijaron con un 4 % de paraformaldehído, se tiñeron con un anticuerpo anti-tubulina beta-III de conejo diluido a 1:500 (Covance®) y anti-HuC/D diluido a 1:100 (Molecular Probes) y se añadieron los anticuerpos secundarios fluorescentes (Molecular Probes) a una dilución de 1:200. Se usó el ArrayScan® II (Cellomics®) para capturar imágenes digitales a 5x y para cuantificar el crecimiento de la neurita como el crecimiento promedio de la neurita/neurona por pocillo, mediante el uso de la aplicación de crecimiento de Neuritas. Se analizaron nueve imágenes a 5x de 3 pocillos / condición.
[0438] En algunos experimentos se usó un subclon de células PCl2 (Neuroscreen™) (Cellomics®). Las células Neuroscreen™ se diferenciaron previamente durante 7 días con 200 ng/ml de NGF, se desprendieron y se volvieron a colocar en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-D-lisina. En algunos pocillos se añadieron 5 µg/ml de laminina durante 2 -3 horas y se aclararon antes de poner las células en las placas. Después de 2 días de incubación, las placas se fijaron con un 4 % de paraformaldehído, de tiñeron con un anticuerpo anti-tubulina beta-III de conejo diluido a 1:500 (Covance®) y con Hoechst (tinción nuclear). Se usó el ArrayScan® II para cuantificar el crecimiento de la neurita como en las células de los DRG.
[0439] Se añadieron el sNogoR344-Fc o la IgG de rata en solución a las neuronas de los DRG P6-7 y a células diferenciadas Neuroscreen™ en el momento de colocarlas en las placas.
[0440] El efecto neuroprotector del sNogoR344-Fc se observó a 1 µM y a 10 µM cuando se cultivaron las neuronas de los DRG P6 en ausencia de laminina. La cuantificación del crecimiento de la neurita mostró un aumento dependiente de la dosis con la adición del sNogoR344-Fc. La adición de sNogoR344-Fc a las mismas concentraciones a las neuronas de los DRG que crecían en un sustrato de laminina no produjo ningún efecto inusual, lo que indica que el sNogoR344-Fc sólo es activo en las células estresadas. También se observó el efecto neuroprotector del sNogoR344-Fc a las mismas concentraciones en ausencia de laminina con las células Neuroscreen™.
EJEMPLO 11
PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN FC-SNOGOR-1
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imagen65
de las huellas se registraron los patrones de pisada de las extremidades posteriores de la rata con tinta durante una locomoción continua a lo largo de una pista de 90 cm y se calcularon la longitud de la zancada en cada lado y el ancho de la zancada (Metz y col., Brain Res. 883: 165 -177 (2000)). Todos estos ensayos de comportamiento fueron realizados por al menos dos individuos. A lo largo de la cirugía, los ensayos de comportamiento y de los análisis histológicos, los investigadores desconocían la identidad del compuesto de la minibomba.
[0448] El sNogoR310-Fc promovió la recuperación funcional (Fig. 12).
EJEMPLO 13
ENSAYO DE CONTUSIÓN DE LA MÉDULA ESPINAL DE RATA
[0449] Se ensaya el efecto de los polipéptidos y de las proteínas de fusión solubles del receptor Nogo-1 en neuronas in vivo en un ensayo de contusión de la médula espinal de rata.
[0450] Se tratan profilácticamente ratas Long Evans hembras encapuchadas (de 170 -190 g) con agentes analgésicos y antibióticos. Diez minutos antes de la cirugía los animales se tranquilizan con 2,5 mg/kg de midazolam
i.p. y se anestesian con un 2 -3 % de isoflurano en O2. Después las ratas se rasuran, se limpian con alcohol y betadine y se aplica lubricante ocular en los ojos. Después se realiza a una incisión hacia abajo a lo largo de la línea media y se exponen las vértebras T7 hasta T12.
[0451] Se realiza una laminectomía dorsal en T9 1/2 y en T10 para exponer la médula. La rata se monta en el Impactor. En primer lugar se fijan los segmentos T7 y T8, y después los segmentos T11 y T12 se unen a la fijación caudal. Se pone un material blando bajo el pecho de la rata. La varilla del Impactor se pone en posición cero y la presilla de tierra eléctrica se une al borde de la herida. Entonces se eleva la varilla del Impactor hasta 25,0 mm y se ajusta apropiadamente en una posición directamente por encima de la médula espinal expuesta. Después se libera la varilla del Impactor para que golpee la médula expuesta e inmediatamente se sube la varilla del Impactor.
[0452] Después se desmonta la rata y se pone Gelespuma® en la herida. Se sutura el músculo que rodea la herida y la incisión se grapa quirúrgicamente. Los animales se colocan en una incubadora hasta que se recuperan de la anestesia. A las ratas se les administran antibióticos, analgésicos y solución salina según sea necesario. Las vejigas se exprimen cada mañana y tarde a continuación hasta que se recupera la función.
[0453] La proteína de fusión soluble del receptor Nogo-1 (por ejemplo, sNogoR310-Fc) se administra intratecalmente según se describe en el modelo anterior de sección transversal de médula espinal de rata. La puntuación de BBB se realiza un día después de la cirugía, después cada semana a continuación hasta entre 4 y 6 semanas.
EJEMPLO 14
EXPRESIÓN DEL SNOGOR310 EN RATONES TRANSGÉNICOS
[0454] Produjimos ratones transgénicos que expresan la proteína soluble del receptor Nogo-1 para ensayar su efecto cuando es expresada in vivo.
[0455] Clonamos el ADNc del sNogoR310 de ratón (correspondiente a los aminoácidos 1 -310 del receptor Nogo-1) en el sitio NotI del vector C-3123. En este vector, la expresión del sNogoR310 está bajo el control de los elementos reguladores del gen de la proteína ácida fibrilar glial (gfap), que permiten un alto nivel de expresión con una secreción mejorada a partir de astrocitos reactivos en el sitio de la lesión. Digerimos el vector resultante secuencialmente con AatII y SfiI y aislamos el constructo gfap: :sNogoR310 en un fragmento de 3,4 kb. Microinyectamos este fragmento en embriones para generar ratones transgénicos. Verificamos mediante una PCR que el transgen se había integrado, e identificamos cinco líneas fundadoras. Cruzamos machos heterocigóticos de las dos líneas fundadoras con los mayores niveles de expresión, con ratones hembra C57BL/6J. Confirmamos que las células positivas para GFAP expresan y secretan el sNogoR310 en ratones transgénicos heterocigóticos mediante un análisis por inmunotransferencia Western mediante el uso de un anticuerpo creado contra el receptor Nogo-1.
[0456] Homogenizamos la corteza y la médula espinal en solución salina tamponada con Tris complementada con inhibidores de la proteasa (Roche) y centrifugamos el homogeneizado a 40.000 rpm durante 20 min a 4 ºC. Tratamos el sobrenadante con un 4 % de paraformaldehído durante 20 min para mejorar la especificidad del
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