JP6306768B2

JP6306768B2 - 疼痛抑制物質のスクリーニング方法および疼痛の予防または治療用医薬組成物

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Publication number: JP6306768B2
Application number: JP2017068973A
Authority: JP
Inventors: 山下　俊英; 俊英山下; 泰史早野
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: University of Osaka NUC
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2018-04-04
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Description

本発明は、疼痛抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。また、本発明は、疼痛の予防または治療用医薬組成物に関するものである。

疼痛は、その激しい痛みから身体の生理機能と精神状態に著しい影響を及ぼし、患者のＱＯＬ（ＱｕａｌｉｔｙＯｆＬｉｆｅ）を低下させる。慢性疼痛の患者数は全世界で２０００万人を超えると報告されており、疼痛治療薬の市場規模は日米欧で約２兆円と言われている。またがん、脳卒中、糖尿病、エイズといった疼痛発症の原因となり得る疾患の患者数が増加していることから、疼痛治療法の確立は非常に重要な医療課題の一つである。特に、非ステロイド性抗炎症薬や麻薬性鎮痛薬による治療効果が低い神経因性疼痛の治療薬開発に対する医療ニーズは、今後も高まることが予想される。しかしながら、神経障害性疼痛の発症原因は多岐に渡り、その分子作用機序も非常に複雑であることから、いまだに根本的な治療薬が開発されていない（非特許文献１）。神経因性疼痛の発症・維持に関与する分子メカニズムを明らかにすることで、画期的な治療薬の開発に繋げていくことは２１世紀における医療の最大課題の一つである。

脊髄の背側に存在する後角内神経回路の可塑的な変化は神経障害性疼痛の発症原因の一つであると考えられている（非特許文献２）。末梢からの感覚入力は脊髄後角内で増幅、抑制、統合など様々な修飾を受けてから脳へと伝達される。しかし末梢神経が障害されると、異常な軸索側枝形成、シナプス伝達の亢進など、脊髄後角内神経回路網が可塑的に変化して疼痛の発症に繋がってしまうことが過去に報告されている（非特許文献３）。このことから、後角内における神経回路網の可塑性を制御する分子メカニズムを明らかにすることは新たな疼痛治療法の開発に繋がることが期待される。

ネトリン−４（Ｎｅｔｒｉｎ−４）は分泌性タンパク質ネトリンファミリーの一つである。ネトリン−４は細胞外基質ラミニンのβ鎖とよく似た構造を持ち、神経突起形成、細胞移動、細胞生存、血管形成やがん細胞の増殖といった様々な役割があることが知られている（非特許文献４）。しかしながら、ネトリンの成体脊髄での役割については全く研究報告がされておらず、疼痛発症に関与しているかどうかも全く未知である。

Dworkin RH, O'Connor AB, Backonja M, Farrar JT, Finnerup NB, Jensen TS, Kalso EA, Loeser JD, Miaskowski C, Nurmikko TJ, Portenoy RK, Rice AS, Stacey BR, Treede RD, Turk DC, Wallace MS: Pharmacologic management of neuropathic pain: evidence-based recommendations. Pain. 2007 Dec 5;132(3):237-51. Woolf CJ, Salter MW: Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. Science. 2000 Jun 9;288(5472):1765-9. Markman JD, Dworkin RH: Ion channel targets and treatment efficacy in neuropathic pain. Journal of Pain 2006;7(1):S38-S47. Lai Wing Sun K, Correia JP, Kennedy TE: Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 2011 Jun;138(11):2153-69.

本発明は、疼痛の発症に関与する分子を見出し、疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、新規な有効成分を含有する疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］疼痛抑制物質のスクリーニング方法であって、ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体を用いることを特徴とする方法。
［２］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質を選択することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質が、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する物質であることを特徴とする前記［２］に記載の方法。
［４］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質が、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する物質であることを特徴とする前記［２］に記載の方法。
［５］被験物質とネトリン−４および／またはネトリン−４受容体を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のネトリン−４および／またはネトリン−４受容体の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞における発現量と比較し、ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［３］に記載の方法。
［６］被験物質とネトリン−４とネトリン−４受容体を接触させる工程と、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を確認する工程と、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［４］に記載の方法。
［７］ネトリン−４受容体が、Ｕｎｃ５ＢまたはＮｅｏｇｅｎｉｎであることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
［９］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質が、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する核酸である前記［８］に記載の医薬組成物。
［１０］核酸が、配列番号１および２、配列番号３および４、または配列番号５および６の塩基配列をセンス鎖およびアンチセンス鎖として形成されるｓｉＲＮＡである前記［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質が、抗ネトリン−４抗体または抗ネトリン−４受容体抗体である請求項８に記載の医薬組成物。
［１２］ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質の有効量を哺乳動物に投与する工程を包含することを特徴とする疼痛の予防または治療方法。
［１３］疼痛の予防または治療用医薬組成物を製造するための、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質の使用。
［１４］疼痛の予防または治療に使用するための、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質。

本発明のスクリーニング方法によれば、疼痛の予防または治療薬として有用な疼痛抑制物質を取得することができる。また、本発明の医薬組成物は、疼痛の予防または治療に有用である。

ネトリン−４遺伝子欠損ラットを用いて神経障害性疼痛モデルを作製し、機械性刺激に対する痛覚応答を調べた結果を示す図であり、（Ａ）は野生型ネトリン−４遺伝子を持つラットの結果、（Ｂ）はネトリン−４遺伝子欠損ラットの結果、（Ｃ）は両者の結果を比較した図である。ネトリン−４遺伝子欠損ラットを用いて神経障害性疼痛モデルを作製し、熱性刺激に対する痛覚応答を調べた結果を示す図であり、（Ａ）は野生型ネトリン−４遺伝子を持つラットの結果、（Ｂ）はネトリン−４遺伝子欠損ラットの結果、（Ｃ）は両者の結果を比較した図である。ネトリン−４遺伝子欠損ラットを用いて炎症性疼痛モデルを作製し、機械性刺激に対する痛覚応答を調べた結果を示す図であり、（Ａ）は野生型ネトリン−４遺伝子を持つラットの結果、（Ｂ）はネトリン−４遺伝子欠損ラットの結果、（Ｃ）は両者の結果を比較した図である。神経障害性疼痛モデルラットを用いて、ネトリン−４遺伝子の発現抑制による痛覚応答の変化を解析した結果示す図である。炎症性疼痛モデルラットを用いて、ネトリン−４遺伝子の発現抑制による痛覚応答の変化を解析した結果示す図である。ネトリン−４をラットの脊髄髄腔内に投与して痛覚応答の変化を解析した結果を示す図である。各濃度のネトリン−４または熱変性したネトリン−４をラットの脊髄髄腔内に投与したときの投与前後の痛覚応答の変化率を示す図である。ネトリン−４をラットの脊髄髄腔内に投与した後の腰髄組織におけるＩｂａ１、ＧＦＡＰ、ＣＤ３ε、ＣＤ４５Ｒをそれぞれ免疫染色した結果を示す図である。ネトリン−４をラットの脊髄髄腔内に投与した後の腰髄組織におけるｃ−ｆｏｓを免疫染色した結果を示す図である。ネトリン−４の候補受容体分子のｓｉＲＮＡをラットの脊髄髄腔内に投与して、投与前後の痛覚応答の変化を解析した結果を示す図であり、（Ａ）はｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ投与群、（Ｂ）はＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群、（Ｃ）はＵｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群、（Ｄ）はＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群の結果を示す。ネトリン−４の候補受容体分子のｓｉＲＮＡをラットの脊髄髄腔内に投与した２日後に、ネトリン−４を脊髄髄腔内に投与して痛覚応答の変化を解析した結果を示す図であり、（Ａ）はｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ投与群、（Ｂ）はＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群、（Ｃ）はＵｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群、（Ｄ）はＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群の結果を示す。ネトリン−４の候補受容体分子のｓｉＲＮＡをラットの脊髄髄腔内に投与した２日後に、ネトリン−４を脊髄髄腔内に投与し、２４時間後における各群の逃避閾値の低下率を比較した結果を示す図である。神経障害性疼痛モデルラットを用いて、Ｕｎｃ５Ｂ遺伝子の発現抑制による痛覚応答の変化を解析した結果示す図である。ラットの腰髄組織におけるＳＨＰ２およびＮｅｕＮを免疫染色した結果を示す図である。ネトリン−４単独、またはネトリン−４とその阻害剤であるＮＳＣ８７８７７もしくはＰＴＰｉ４との混合物をラットの脊髄髄腔内に投与して痛覚応答の変化を解析した結果を示す図である。ネトリン−４単独、またはネトリン−４とその阻害剤であるＮＳＣ８７８７７もしくはＰＴＰｉ４との混合物をラットの脊髄髄腔内に投与し、２４時間後における各群の逃避閾値の低下率を比較した結果を示す図である。神経障害性疼痛モデルラットを用いて、抗ネトリン−４抗体によるネトリン−４の機能阻害による痛覚応答の変化を解析した結果示す図である。

本発明者らは、ネトリン−４遺伝子欠損ラットを用いて疼痛モデルを作製して疼痛応答について検討したところ、ネトリン−４遺伝子が疼痛発症の原因遺伝子である可能性を見出した。さらに、本発明者らは各種確認実験を行い、ネトリン−４は脊髄内において痛覚応答を増強させる作用を有すること、ネトリン−４の痛覚応答増強シグナルはネトリン−４が受容体に結合することにより下流に伝達されることを明らかにした。

〔スクリーニング方法〕
本発明は疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体を用いるものであればよい。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、ネトリン−４およびネトリン−４受容体のいずれか一方を用いてもよいし、両方を用いてもよい。本発明のスクリーニング方法で用いるネトリン−４およびネトリン−４受容体は、タンパク質でもよく、遺伝子でもよい。また、ネトリン−４およびネトリン−４受容体がタンパク質の場合、全長タンパク質でもよく、機能断片でもよい。

本発明のスクリーニング方法に用いるネトリン−４は、どのような生物由来のネトリン−４でもよく、特に限定されないが、哺乳動物のネトリン−４が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。各種動物のネトリン−４をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。

ネトリン−４受容体は、ネトリン−４と相互作用することにより痛覚応答のシグナルを下流に伝える機能を有する分子であれば特に限定されない。具体的には、例えばＵｎｃ５Ｂ、Ｎｅｏｇｅｎｉｎなどが挙げられる。本発明のスクリーニング方法に用いるネトリン−４受容体は、どのような生物由来のネトリン−４受容体でもよく、特に限定されないが、哺乳動物のネトリン−４受容体が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。各種動物のＵｎｃ５Ｂをコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表２に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。また、各種動物のＮｅｏｇｅｎｉｎをコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表３に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。

被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。ただし、これらに限定されない。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。

本発明のスクリーニング方法により、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質を選択することが好ましい。ネトリン−４の痛覚応答増強シグナルの下流への伝達を抑制すれば、疼痛の発症を抑制することができ、疼痛患者のＱＯＬを向上させることができる。ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質としては、例えば、ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体の発現を阻害する物質、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する物質などが挙げられる。

本発明のスクリーニング方法により、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とネトリン−４および／またはネトリン−４受容体を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のネトリン−４および／またはネトリン−４受容体の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞における発現量と比較し、ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。ネトリン−４および／またはネトリン−４受容体を発現する細胞は、ネトリン−４およびネトリン−４受容体のいずれか一方を発現する細胞でもよく、両方を発現する細胞でもよい。このような細胞は生体内の細胞でもよく、培養細胞でもよい。培養細胞は、初代培養細胞でもよく、細胞株でもよい。初代培養細胞として、例えば、大脳皮質神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられ、細胞株として、例えば、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。これらはいずれも本発明のスクリーニング方法に好適に用いることができる。

被験物質と細胞を接触させる方法は、被験物質と細胞が接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、培養細胞を用いる場合には、培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。例えば、生体において被験物質と細胞とを接触させる場合には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与、標的臓器や標的組織への局所投与などが挙げられる。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。

ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現量の測定は、ネトリン−４またはネトリン−４受容体のタンパク質量を測定してもよく、ネトリン−４またはネトリン−４受容体のｍＲＮＡ量を測定してもよい。タンパク質量を測定する場合は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。

被験物質を接触させない対照群におけるネトリン−４またはネトリン−４受容体のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して、被験物質を接触させた場合にネトリン−４またはネトリン−４受容体のタンパク質量またはｍＲＮＡ量が減少していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がネトリン−４またはネトリン−４受容体のタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して５０％以下に減少させる被験物質が好ましく、２５％以下に減少させる被験物質がより好ましい。

本発明のスクリーニング方法により、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とネトリン−４とネトリン−４受容体を接触させる工程と、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を確認する工程と、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。用いるネトリン−４およびネトリン−４受容体は、天然タンパク質および組み換えタンパク質のいずれでもよい。天然タンパク質を用いる場合、ネトリン−４およびネトリン−４受容体を発現している細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて天然タンパク質を取得することができる。組み換えタンパク質を用いる場合、ネトリン−４発現ベクターまたはネトリン−４受容体発現ベクターが導入された細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法を用いて組み換えタンパク質を取得することができる。組み換えタンパク質は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から得られる遺伝情報（表１〜表３参照）および公知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、製造することができる。

被験物質とネトリン−４とネトリン−４受容体とを接触させる方法は特に限定されない。例えば、ネトリン−４とネトリン−４受容体とを含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。

ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を確認する方法は特に限定されず、ネトリン−４とネトリン−４受容体との結合レベルを確認できる公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法などを好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、ネトリン−４およびネトリン−４受容体のいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、ネトリン−４とネトリン−４受容体の結合レベルを適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。

ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する被験物質を選択する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群におけるネトリン−４とネトリン−４受容体との結合レベルと比較して、被験物質を接触させた場合にネトリン−４とネトリン−４受容体との結合レベルが減弱していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がネトリン−４とネトリン−４受容体との結合レベルを減弱させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の両者の結合レベルと比較して、結合レベルを５０％以下に減弱させる被験物質が好ましく、２５％以下に減弱させる被験物質がより好ましい。

〔疼痛の予防または治療用医薬組成物〕
本発明は、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質を有効成分として含有する疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物の有効成分は、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する物質、および、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する物質のいずれかであることが好ましい。本発明の医薬組成物は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分とすることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。

本発明の医薬組成物の有効成分は、ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害するペプチドまたは抗体であることが好ましい。ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害するペプチドとしては、ネトリン−４と結合可能なペプチド、またはネトリン−４受容体と結合可能なペプチドが挙げられる。ネトリン−４とネトリン−４受容体との相互作用を阻害する抗体としては、ネトリン−４に対する抗体、またはネトリン−４受容体に対する抗体が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。

本発明者らは、ネトリン−４に対する抗体（抗ネトリン−４ポリクローナル抗体）をラットに投与することにより、疼痛が抑制されることを実証している（実施例４参照）。また、当業者は、ネトリン−４受容体に対する抗体がネトリン−４に対する抗体と同様の疼痛抑制作用を奏することを、容易に理解することができる。したがって、ネトリン−４に対する抗体およびネトリン−４受容体に対する抗体は、本発明の医薬組成物の有効成分として有用である。

ペプチドは公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により製造することができる。ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルのいずれであってもよい。また、ペプチドは、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものであってもよい。ペプチドは塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。ペプチドはＤ−アミノ酸を含んでもよく、非天然アミノ酸を含んでもよい。

ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原（ネトリン−４タンパク質もしくはそのフラグメント、またはネトリン−４受容体タンパク質もしくはそのフラグメント）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲ（相補性決定領域：complementarity determining region）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものをいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体などとも称される。ヒト化抗体のＦＲ（フレームワーク領域：framework region）は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＷのアミノ酸配列を置換してもよい。ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列は、公知のデータベース（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ等）から取得することができる。

本発明の医薬組成物の有効成分は、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する核酸であることが好ましい。ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する核酸としては、ネトリン−４遺伝子またはネトリン−４受容体遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。投与対象動物のネトリン−４遺伝子またはネトリン−４受容体遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においてはネトリン−４遺伝子またはネトリン−４受容体遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはネトリン−４遺伝子またはネトリン−４受容体遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＳＨＰ−１遺伝子またはＳＨＰ−２遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により設計することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ネトリン−４遺伝子またはネトリン−４受容体遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。

本発明の医薬組成物の有効成分が、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害する核酸である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（ＧｅｎｅＧｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。

本発明者らは、ラットネトリン−４遺伝子のｓｉＲＮＡをラットに投与することにより、疼痛が抑制されることを実証している（実施例１参照）。また、ネトリン−４受容体であるラットＵｎｃ５Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡまたはラットＮｅｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡをラットに投与することにより、疼痛が抑制されることを実証している（実施例２参照）。したがって、ネトリン−４遺伝子のｓｉＲＮＡ、Ｕｎｃ５Ｂ遺伝子のｓｉＲＮＡおよびＮｅｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡは、本発明の医薬組成物の有効成分として有用である。

本発明者らが実施例において実際に使用したラットを対象とするｓｉＲＮＡの標的配列に相当するヒト遺伝子の塩基配列は、ヒトを対象とするｓｉＲＮＡの標的配列になり得る。したがって、ヒトネトリン−４遺伝子の塩基配列（配列番号２３）の第１９５１位〜第１９７５位の塩基配列および第２０７１位〜第２０９５位の塩基配列は、ヒトネトリン−４遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡの標的配列として好ましく用いることができる。また、ヒトＮｅｏｇｅｎｉｎ遺伝子の塩基配列（配列番号２４）の第３３１６位〜第３３４０位の塩基配列は、ヒトＮｅｏｇｅｎｉｎ遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡの標的配列として好ましく用いることができる。これらの塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡの塩基配列を表４に示す。具体的には、配列番号１および２の塩基配列をセンス鎖およびアンチセンス鎖として形成されるヒトネトリン−４遺伝子のｓｉＲＮＡ、配列番号３および４の塩基配列をセンス鎖およびアンチセンス鎖として形成されるヒトネトリン−４遺伝子のｓｉＲＮＡ、配列番号５および６の塩基配列をセンス鎖およびアンチセンス鎖として形成されるヒトＮｅｏｇｅｎｉｎ遺伝子のｓｉＲＮＡが挙げられる。なお、ネトリン−４またはネトリン−４受容体の発現を阻害するｓｉＲＮＡはこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の有効成分として好適なｓｉＲＮＡは、各標的遺伝子の塩基配列（ヒトＵｎｃ５Ｂ遺伝子の塩基配列（配列番号２５）を含む）に基づいて、公知の方法で設計することができる。

ｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖が同一の塩基長であっても異なっていてもよく、その全長は３０塩基以下であり、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２３塩基以下、さらに好ましくは２１塩基である。センス鎖およびアンチセンス鎖の両端は、平滑末端でもよいし、それぞれの鎖の３’側がオーバーハング（突出末端）であってもよい。突出末端部分の塩基数は１〜１０塩基であり、好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１〜２塩基である。なお、突出末端の長さは二つの鎖の間で無関係であり、互いに異なる長さであってもよい。突出末端部分のヌクレオチドはＲＮＡでも、ＤＮＡでもよく、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基が好ましいが、ＲＮＡ干渉能を保持する限り相補的でない塩基であってもよい。

ｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡである他、１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡであってもよい。すなわち、ｓｉＲＮＡには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡ、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。さらには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。

ｓｉＲＮＡと標的配列は同一であることが望ましいが、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、完全に同一な配列でなくてもよい。具体的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、１〜数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、ｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１〜数個の塩基が置換、付加もしくは欠失したものであってＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。また、ｓｉＲＮＡには、標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつＲＮＡ干渉を誘導できるものが含まれる。

ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか一方のヌクレオチドを全てＤＮＡに変換したもの（ハイブリッド型）や、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したもの（キメラ型）であってもよい。ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが好ましい。キメラ型としては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の３’末端側およびアンチセンス鎖の５’末端側のヌクレオチドを共にＤＮＡに変換したもの、センス鎖の３’末端側またはアンチセンス鎖の５’末端側の何れかのヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチドまでの任意長とするのが好ましく、例えば末端から１〜１３ヌクレオチド、好ましくは１〜１０ヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安定性、安全性等の点から、好適なキメラ型ｓｉＲＮＡとしては、例えばヌクレオチド長がそれぞれ１９〜２１であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の５’末端側から１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが挙げられる。また、この場合、センス鎖（オーバーハングヌクレオチドを除く）とアンチセンス鎖のＤＮＡ変換数は同一であることがより好ましい。

ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基および／またはリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であってもよい。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジンまたはシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシンまたはグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

本発明の医薬組成物には、有効成分を０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、目的、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ〜４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。

本発明には、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする疼痛の予防または治療方法が含まれる。また、本発明には、疼痛の予防または治療用医薬組成物を製造するための、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質の使用が含まれる。また、本発明には、疼痛の予防または治療に使用するための、ネトリン−４の下流へのシグナル伝達を抑制する物質が含まれる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１：痛覚応答に対するネトリン−４の関与〕
１−１実験方法
（１）ネトリン−４トランスジェニック動物の作製および繁殖
ネトリン−４が神経障害性疼痛の発症にどのように関与しているのか明らかにするために、ネトリン−４遺伝子がノックアウトされたトランスジェニックラットの痛み関連行動を観察した。ネトリン−４トランスジェニックラットは北海道大学大学院理学研究院の北田一博博士が作製し、２００７年に発表したものであり（Kitada K, Ishishita S, Tosaka K, Takahashi R, Ueda M, Keng VW, Horie K, Takeda J: Transposon-tagged mutagenesis in the rat. Nat Methods. 2007 Feb;4(2):131-3.）、北田博士より分与を受けて使用した。このトランスジェニックラットはネトリン−４遺伝子配列がｐｏｌｙＡを含んだ配列に置換された遺伝子座を持っており、正常なネトリン−４遺伝子が発現されなくなる。
ネトリン−４トランスジェニックラットのヘテロ動物の雌雄を交配させて、野生型動物とホモノックアウト動物の同腹子を産ませ、８週齢になるまで飼育した。遺伝子型は動物の尻尾からゲノムＤＮＡを回収し、野生型アレルおよび遺伝子欠損アレルそれぞれを検出する２種類のジェノタイピングＰＣＲの結果によって判定した。雌は性周期によって痛み応答が変化することが知られているので、痛み関連行動実験には雄のみを使用した。動物に耳タグを付けることで、動物の遺伝子型（野生型動物、ヘテロ動物、ホモノックアウト動物）を管理した。

（２）神経障害性疼痛モデルの作製
神経障害性疼痛モデルは坐骨神経部分絞扼モデル（Seltzer Z, Dubner R, Shir Y: A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain, 1990 Nov;43(2):205-18.）を用いた。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、８週齢ラットの左後肢大腿部とその付け根付近を剃毛し、アルコールで消毒した。大腿骨と腰骨の関節部分の皮膚と筋肉を切開し、大腿骨に沿って走る坐骨神経を露出させた。４−０号ナイロン縫合糸で坐骨神経の１／２〜１／３を結紮し、筋肉および皮膚を縫合した。対側である右後肢の坐骨神経は皮膚と筋肉の切開だけ行って、偽手術側とした。

（３）炎症性疼痛モデルの作製
炎症性疼痛モデルには完全フロインドアジュバントモデルを用いた（B.B. Newbould: Chemotherapy of arthritis induced in rats by mycobacterial adjuvant. British Journal of Pharmacology Chemotherapy, 1963; 21, pp. 127-136.）。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、８週齢ラットの左後肢の足裏に完全フロインドアジュバント（Complete Freund’s Adjuvant、CFA）液を４０μＬ注入した。対側である右後肢の足裏には等量の生理食塩水を注入して、偽手術側とした。

（４）痛み関連行動の計測
機械性刺激に対する応答を計測するために、ｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行った。金網の上にプラスチックケースを置き、疼痛モデルラットをケースに入れて落ち着くまで５〜１０分間慣らした。フィラメント（Semmes-Weinstein Von Frey Anesthesiometer、室町機械）を後肢足裏中央に３〜５秒間押し当てて逃避反応を起こす閾値（ｇ）を測定した。両足の逃避閾値の測定が終了後、動物の耳タグを確認してから飼育ケージに戻した。
熱性刺激に対する応答を計測するために、Ｐｌａｎｔｅｒテストを行った。ＵＧＯＢＡＳＩＬＥ社製熱刺激鎮痛効果測定装置３７３７０型を用いた。付属のガラス板の上に置いたプラスチックケースの中に疼痛モデルラットを入れ、落ち着くまで５〜１０分慣らした。付属の赤外線光源装置をガラス板の下に置き、後肢足裏中央に下から赤外線を照射した。赤外線照射開始から逃避反応を起こすまでの潜時を計測した。両足の計測が終了後、動物の耳タグを確認してから飼育ケージに戻した。

（５）ｓｉＲＮＡによるネトリン−４遺伝子の発現抑制
ネトリン−４遺伝子の発現を抑制するために、ネトリン−４ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡを脊髄髄腔内に遺伝子導入試薬と共に投与した。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの背中を剃毛し、アルコールで消毒した。第５腰椎骨と第６腰椎骨の間に１９Ｇ注射針（テルモ）を挿入し、針の中に生理食塩水を満たしたポリエチレンチューブ（BECKTON DICKINSON Intramedic Polyethylene Tubing, PE-10）を通して脊髄髄腔内に挿管した。ポリエチレンチューブの先端が脊髄腰膨大部に位置しているかどうか確認するために、局所麻酔剤の２％キシロカイン注射液（アストラゼネカ）２０μＬをチューブ後端から投与し、後肢に麻痺が起こること確認してから動物をケージに戻した。チューブ挿管から１週間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌｅｍｅｎｔテストを行って、チューブの挿管による運動障害や疼痛が起こっていないことを確認した。遺伝子導入試薬ＨＶＪ−Ｅ（GenomeONE-Neo、石原産業）と２種類のネトリン−４ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA、invitrogen、表５参照）各１μｇを混合した液を、挿管したチューブの後端から１０μＬ注入して、脊髄髄腔内に投与した。対照群の動物にはｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA Negative Control、invitrogen）とＨＶＪ−Ｅの混合液を同じ量だけ投与した。

（６）脊髄髄腔内に投与するタンパク質または阻害剤の調製
ネトリン−４精製タンパク質（R&D）を生理食塩水に溶解し、４０ｎｇ／μＬのネトリン−４溶液を調製した。ＳＨＰｓの阻害剤であるＮＳＣ８７８７７（Calbiochem）は、５０ｍＭの濃度になるように滅菌水に溶解して冷蔵保存しておき、用時に生理食塩水で５０倍に希釈して使用した。ＳＨＰ２の阻害剤であるＰＴＰｉ４（bis(4-Trifluoromethylsulfonamidophenyl)-1,4-diisopropylbenzene, Protein Tyrosine Phosphatase Inhibitor IV、Calbiochem）は、１６．４ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide、Sigma-Aldrich）に溶解して冷蔵保存しておき、用時に最終濃度が１ｍＭになるように生理食塩水で希釈して使用した。

（７）免疫組織染色
ペントバルビタール液の腹腔内投与により、ラットを深く麻酔した後還流固定した。まず０．１Ｍリン酸緩衝液で潅流した後、４％ＰＦＡ液（パラホルムアルデヒド（ナカライテスク）を４％の濃度になるように０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したもの）を還流して固定した。還流固定後、脊髄腰膨大部を剖出して４％ＰＦＡ液に漬けてさらに６時間固定し、４％ＰＦＡ液をスクロース（ナカライテスク）を３０％の濃度になるように０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したものに置換して、二晩４℃で振盪した。腰髄組織をＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン）に包埋して凍結させた後、凍結薄切片作製装置で２０μｍの厚さの薄切片を作製してスライドガラス（松浪ガラス）に貼りつけた。５％ＢＳＡ液（５％の濃度になるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Sigma-Aldrich）を０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解したもの）に漬けて２時間室温に置いた後、一次抗体を加えた５％ＢＳＡ液に置換して４℃で二晩反応させた。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄してから二次抗体を加えた５％ＢＳＡ液に置換して４℃で一晩反応させた。二次抗体反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液で３回洗浄してから封入し、蛍光顕微鏡で観察した。

免疫染色には以下の抗体を使用した。抗Ｉｂａ１抗体（1:1000、Wako）、抗ＧＦＡＰ抗体（1:1000、Sigma-Aldrich）、抗ＣＤ３ε抗体(1:200、eBioscience) 、抗ＣＤ４５Ｒ抗体(1:200、BD)、抗c−ｆｏｓ抗体（1:10000、Calbiochem）、抗ＮｅｕＮ抗体（1:1000、Millipore）、抗ＳＨＰ２抗体（1:1000、Santa Cruz）、蛍光標識抗ラビットＩｇＧ抗体（1:500、Molecular Probes）、蛍光標識抗マウスＩｇＧ抗体（1:500、Molecular Probes）

１−２実験結果
（１）ネトリン−４遺伝子欠損ラットの痛み関連行動の解析
（１−１）神経障害性疼痛モデルの機械性刺激に対する痛覚応答
ネトリン−４ヘテロ動物の雌雄を交配させて、野生型とホモノックアウトラットを含む同腹子の雄だけを８週齢まで飼育した。吸気麻酔下で左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。
機械性刺激に対する痛覚応答を調べるために、損傷２日、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行った。結果を図１（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示した。野生型遺伝子を持つラットはこれまでの報告通り、徐々に損傷側の逃避閾値が減少していることからアロディニア（痛覚過敏）を発症していることが分かった（図１（Ａ））。しかしながら、ネトリン−４ノックアウトラットは野生型で見られたような逃避閾値の低下は見られなかった（図１（Ｂ））。損傷前後の逃避閾値を比較した結果、野生型では損傷後２週間で逃避閾値が６０％低下していたが、ノックアウトラットは＋１０％であり痛覚過敏は引き起こされていないことが分かった（図１（Ｃ））。この逃避閾値の低下について、野生型とホモノックアウトラットを比較すると損傷後２日、４日、７日、１４日、２１日、３５日後において有意な差が見られることが定量解析の結果から明らかになった（図１（Ｃ））（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。

（１−２）神経障害性疼痛モデルの熱性刺激に対する痛覚応答
次に、ネトリン−４ノックアウトラットの神経障害性モデルにおける熱性刺激に対する応答を解析した。
ネトリン−４ヘテロ動物の雌雄を交配させて、野生型とホモノックアウトラットを含む同腹子の雄だけを８週齢まで飼育した。吸気麻酔下で左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。損傷７日、１４日、２１日、２８日後にＰｌａｎｔｅｒテストを行って、逃避行動を起こすまでの潜時を調べた。結果を図２（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示した。野生型ラットでは損傷１週間後から損傷側の逃避潜時が対側の逃避潜時よりも有意に低下していた（図２（Ａ））。ネトリン−４ノックアウトラットでは野生型のような有意な低下は観察されなかった（図２（Ｂ））。損傷前を基準とした逃避潜時の低下率を比較したところ、損傷７日目と２１日目において、野生型との有意な差があることが分かった（図２（Ｃ））（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。

（１−３）炎症性疼痛モデルの機械性刺激に対する痛覚応答
炎症性物質完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を足裏に投与して炎症性疼痛モデルを作製した。ＣＦＡ投与１日、２日、４日、７日後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行った。結果を図３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示した。野生型ラットではＣＦＡ投与後１日目以降から徐々に逃避閾値の低下が観察された（図３（Ａ））。一方、ネトリン−４ノックアウトラットは野生型で見られたような逃避閾値の低下は見られなかった（図３（Ｂ））。損傷前を基準とした逃避閾値の低下率を比較したところ、ＣＦＡ投与１日、２日、４日、７日後において、神経障害性疼痛モデルの場合と同様に有意な差があることが分かった（図３（Ｃ））（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。

以上の結果から、神経障害性疼痛モデルおよび炎症性疼痛モデルのどちらの場合でもネトリン−４ノックアウトラットは機械性痛覚過敏（＝アロディニア）を示さないことが分かった。特に神経障害性モデルでは熱性痛覚過敏もネトリン−４ノックアウトラットでは起こらないことが明らかになった。この実験結果から、ネトリン−４遺伝子が疼痛発症の原因遺伝子である可能性が示唆された。

（２）ネトリン−４遺伝子の発現抑制による痛覚応答の抑制
疼痛発症後にネトリン−４遺伝子の発現を抑制した時の鎮痛効果を明らかにするために、ネトリン−４のｓｉＲＮＡを脊髄髄腔内に投与して機械性刺激に対する応答を調べた。

（２−１）神経障害性疼痛モデルラット
８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後に左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。さらに損傷を与えてから１週間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて痛覚過敏が起こっていることを確認した（０日目）。ネトリン−４ｓｉＲＮＡと遺伝子導入試薬ＨＶＪ−Ｅを混合した液を調製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から投与した。対照群の動物にはｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡとＨＶＪ−Ｅを混合した液を投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。ｓｉＲＮＡを投与して１日、２日、３日、４日後に、それぞれｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化を調べた。
結果を図４に示した。ｓｉＲＮＡ投与前（０日目）は神経障害性疼痛の発症によって低下していた逃避閾値は、投与後２日目から３日目にかけて有意に上昇していることが分かった（Tukey-Kramer検定、*Ｐ<0.05）。

（２−２）炎症性疼痛モデルラット
８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を足裏に投与して炎症性疼痛モデルを作製した。ＣＦＡ投与７日後、ｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて投与側後肢に痛覚過敏が起こっていることを確認した（０日目）。ネトリン−４ｓｉＲＮＡと遺伝子導入試薬ＨＶＪ−Ｅを混合した液を調製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から投与した。対照群の動物にはｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡとＨＶＪ−Ｅを混合した液を投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。ｓｉＲＮＡを投与して１日、２日、３日、４日後に、それぞれｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化を調べた。
結果を図５に示した。ｓｉＲＮＡ投与前（０日目）は神経障害性疼痛の発症によって低下していた逃避閾値は、投与後２日目以後、有意に上昇していることが分かった（Tukey-Kramer検定、*Ｐ<0.05）。

以上のように、神経障害性疼痛もしくは炎症性疼痛の発症後に観察されるアロディニアがネトリン−４ｓｉＲＮＡの脊髄髄腔内投与によって阻害できたことから、ネトリン−４ｓｉＲＮＡに鎮痛効果があることが明らかになった。特に、神経障害性疼痛が発症した後でもネトリン−４の遺伝子発現を阻害すれば痛みを抑制できること明らかになったことから、ネトリン−４は疼痛治療の標的分子であると考えられた。

（３）ネトリン−４の脊髄内投与による痛覚応答の増強
（３−１）実験１
ネトリン−４の脊髄における機能をｉｎｖｉｖｏで明らかにするために、ネトリン−４を脊髄髄腔内に投与して痛覚応答の変化について調べた。まず、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って、挿管による運動障害が無いことを確かめた。ネトリン−４溶液（40ng/μL）１０μＬを挿管したチューブの後端から投与した。対照群の動物には生理食塩水を等量投与した。投与後１２、２４、４８時間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化について調べた。
結果を図６に示した。ネトリン−４を投与した動物は投与後徐々に逃避閾値が低下し始めた。逃避閾値の低下率を対照群と比較したところ、投与１２、２４、４８時間後において有意に逃避閾値が低下していることが分かった（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。

（３−２）実験２
実験１と同様の方法で、ネトリン−４溶液（40ng/μL）、１０％ネトリン−４溶液（4ng/μL）、１％ネトリン−４溶液（0.4ng/μL）または熱変性ネトリン−４溶液（ネトリン−４溶液（40ng/μL）を１００℃、１０分間熱処理したもの）をそれぞれ１０μＬ投与し、投与前の逃避閾値と投与後２４時間目の逃避閾値の変化率を算出した。
結果を図７に示した。逃避閾値の低下はネトリン−４濃度を１０％（4ng/μL）に薄めた場合でも観察されたが、１％（0.4ng/μL）に薄めると有意な低下はみられなかった。また、熱変性させたネトリン−４を投与しても、逃避閾値の低下は見られなかった（Dunnett検定、**Ｐ<0.01）。

以上の結果から、ネトリン−４を脊髄髄腔内に投与すると、逃避閾値が減少して痛覚過敏が引き起こされることが明らかになった。このことから、ネトリン−４は脊髄内において動物の痛覚応答を増強させる働きがあることが分かった。またこの痛覚応答の増強はネトリン−４の濃度依存的に引き起こされることも明らかになった。

（３−３）免疫組織染色１
ネトリン−４の投与が脊髄内のグリア応答や免疫応答を活性化している可能性を検証するために、ネトリン−４または生理食塩水の脊髄髄腔内投与後４８時間目に４％ＰＦＡ液で腰髄組織を固定し、２０μｍの凍結薄切片を作製して、各種マーカーで免疫染色を行った。
結果を図８に示した。ミクログリアマーカーのＩｂａ１、アストロサイトマーカーのＧＦＡＰ、Ｔ細胞マーカーのＣＤ３ε、Ｂ細胞マーカーのＣＤ４５Ｒに関しては、各細胞形態とその脊髄内分布に大きな差は見られなかった。この結果から、ネトリン−４投与によって脊髄内のグリア細胞や免疫細胞が活性化して痛覚過敏を引き起こしているわけではないことが示唆された。

（３−４）免疫組織染色２
ネトリン−４投与によって脊髄内神経細胞の興奮性が変化しているかどうかを調べた。ネトリン−４または生理食塩水の脊髄髄腔内投与後４８時間目に４％ＰＦＡ液で腰髄組織を固定し、２０μｍの凍結薄切片を作製して、神経興奮マーカーであるｃ−ｆｏｓで免疫染色を行った。
結果を図９に示した。図９から明らかなように、ネトリン−４を投与したラットの脊髄後角におけるｃ−ｆｏｓ陽性細胞数が、対照群と比較して増加していた。この結果からネトリン−４投与によって脊髄後角内の神経興奮が引き起こされていることが分かった。

以上の結果から、ネトリン−４は脊髄後角内の神経興奮を上昇させ、痛覚応答が増強する働きがあることが示唆された。

〔実施例２：ネトリン−４の痛覚応答を増強するシグナルを伝達する受容体の同定〕
脊髄内のネトリン−４が司る痛覚応答の増強シグナルがどのような受容体を介して下流に伝わっていくのかを明らかにするために、ネトリン−４の候補受容体の遺伝子発現を抑制してネトリン−４脊髄内投与の効果が打ち消されるかどうかを調べた。

２−１実験１
これまでの知見からネトリン−４に結合することが知られている候補受容体分子であるＤＣＣ、Ｕｎｃ５Ｂ、ＮｅｏｇｅｎｉｎそれぞれのｓｉＲＮＡを作製した。各受容体のｓｉＲＮＡと遺伝子導入試薬ＨＶＪ−Ｅを混合した液を調製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から投与した。対照群の動物にはｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA Negative Control、invitrogen）とＨＶＪ−Ｅを混合した液を投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。ｓｉＲＮＡ投与２日後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って、ｓｉＲＮＡ投与前日と逃避閾値を比較した。Ｕｎｃ５ＢｓｉＲＮＡとして、表５に記載の２種類のｓｉＲＮＡを用いた。ＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡとして表５に記載の２種類のｓｉＲＮＡを用いた。ＤＣＣｓｉＲＮＡとして表５に記載の２種類のｓｉＲＮＡを用いた。

結果を図１０（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）はｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ投与群（対照群）、（Ｂ）はＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群、（Ｃ）はＵｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群、（Ｄ）はＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群である。ＤＣＣ、Ｕｎｃ５Ｂ、Ｎｅｏｇｅｎｉｎの各ｓｉＲＮＡを投与した群には、対照群と比較して逃避閾値の有意な変化は見られなかった（Tukey-Kramer検定）。

２−２実験２
さらに、ｓｉＲＮＡ投与２日後にネトリン−４精製タンパク質（R&D）の生理食塩水溶液（40ng/μL）１０μＬを挿管したチューブの後端から投与した。対照群の動物には生理食塩水を等量投与した。投与後１２、２４、４８時間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化について調べた。
結果を図１１（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）はｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ投与群（対照群）、（Ｂ）はＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群、（Ｃ）はＵｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群、（Ｄ）はＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群である。対照群はネトリン−４投与後、徐々に逃避閾値が低下した。ＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群も対照群と同様の変化を示した。一方、Ｕｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群およびＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群は、ネトリン−４投与による逃避閾値の低下が抑制された。

ネトリン−４投与２４時間後における各群の逃避閾値の低下率を比較した結果を図１２に示した。ＤＣＣｓｉＲＮＡ投与群は対照群と比較して有意差が認められなかった。一方、Ｕｎｃ５ＢｓｉＲＮＡ投与群およびＮｅｏｇｅｎｉｎｓｉＲＮＡ投与群は、対照群と比較して有意に逃避閾値の低下率が抑制されていることが分かった（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。
以上の結果から、ネトリン−４の痛覚応答増強シグナルはネトリン−４がＵｎｃ５ＢまたはＮｅｏｇｅｎｉｎに結合することで下流に伝達される可能性が示唆された。

２−３実験３
さらにＵｎｃ５Ｂ受容体の遺伝子発現抑制により、神経障害性疼痛が抑制されるかどうか明らかにするために、疼痛を発症したモデルラットに上記のＵｎｃ５ＢｓｉＲＮＡを投与して痛み関連行動を調べた。まず、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後に雄ラットの左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。さらに損傷を与えてから１週間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて痛覚過敏が起こっていることを確認した。Ｕｎｃ５ＢｓｉＲＮＡと遺伝子導入試薬ＨＶＪ−Ｅを混合した液を調製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から投与した。対照群の動物にはｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi siRNA Negative Control、invitrogen）とＨＶＪ−Ｅを混合した液を投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。ｓｉＲＮＡを投与して１日、２日、３日、４日後のそれぞれでｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化について調べた。

結果を図１３に示した。ｓｉＲＮＡ投与前（０日目）は神経障害性疼痛発症によって低下していた逃避閾値は投与後１日目以後、有意に上昇していることが分かった（Tukey-Kramer検定、*Ｐ<0.05）。この結果から、ネトリン−４と同様に、Ｕｎｃ５Ｂの遺伝子発現抑制に神経障害性疼痛に対する鎮痛効果があることが明らかになった。

〔実施例３：ネトリン−４の細胞内下流シグナルの同定〕
３−１実験１
ネトリン−４がＵｎｃ５ＢまたはＮｅｏｇｅｎｉｎを介してどのような細胞内シグナルを活性化させて痛覚応答の増強を引き起こしているのか明らかにするために、ネトリン−４の下流分子のチロシン脱リン酸化酵素であるＳＨＰ２（Src-homology 2-containing protein tyrosine phosphatase）に着目した。そこで、まずＳＨＰ２が脊髄内でどのように発現しているのかについて解析した。ラット腰髄組織を４％ＰＦＡで固定し、厚さ２０μｍの凍結薄切片を作製してＳＨＰ２と神経細胞マーカーであるＮｅｕＮとの二重免疫染色を行った。
結果を図１４に示した。図１４において脊髄後角においてＳＨＰ２とＮｅｕＮが共局在している細胞の存在が認められた。この結果から、ＳＨＰ２は脊髄後角の神経細胞に発現していることが分かった。

３−２実験２
ネトリン−４の痛覚応答を増強させる働きにＳＨＰ２の活性化が必要であるかどうか明らかにするために、ＳＨＰｓ阻害剤であるＮＳＣ８７８７７またはＳＨＰ２阻害剤であるＰＴＰｉ４（bis(4-Trifluoromethylsulfonamidophenyl)-1,4-diisopropylbenzene, Protein Tyrosine Phosphatase Inhibitor IV）を脊髄髄腔内に投与してネトリン−４脊髄内投与の効果が打ち消されるかどうかを調べた。ＮＳＣ８７８７７（最終濃度1mM）またはＰＴＰｉ４（最終濃度1mM）をネトリン−４（最終濃度40ng/μL)と混合した液１０μＬを脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から投与した。投与後１２、２４、４８時間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って逃避閾値の変化について調べた。
結果を図１５に示した。ネトリン−４の単独投与群では逃避閾値の低下が観察されたが、ＮＳＣ８７８７７またはＰＴＰｉ４を混合して投与した群では逃避閾値の低下が観察されなかった。

投与２４時間後における各群の逃避閾値の低下率を比較した結果を図１６に示した。ＮＳＣ８７８７７またはＰＴＰｉ４を混合して投与した群では、ネトリン−４の単独投与群と比較して有意に逃避閾値の低下率が抑制されていることが分かった（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。
以上の結果から、ネトリン−４は脊髄後角神経細胞に発現するＳＨＰ２の活性化を介して痛覚応答を増強していることが示唆された。

〔実施例４：抗ネトリン−４抗体による痛覚応答の抑制〕
抗ネトリン−４抗体によるネトリン−４の機能阻害によって神経障害性疼痛における鎮痛効果が得られるかどうか明らかにするために、疼痛を発症したモデルラットに抗ネトリン−４抗体（R&D社、AF1132）を投与して痛み関連行動を調べた。まず、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後に雄ラットの左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。さらに損傷を与えてから１週間後にｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて痛覚過敏が起こっていることを確認した。抗ネトリン−４抗体を生理食塩水で溶解した液（1μg/μL）を作製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から30μL投与した。対照群の動物にはラットコントロールＩｇＧ液（1μg/μL）を等量だけ投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。抗体液を投与して１日、２日、３日、４日後のそれぞれでｖｏｎＦｒｅｙｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って損傷側後肢の逃避閾値の変化について調べた。

結果を図１７に示した。抗ネトリン−４抗体液投与前（投与後０日目）は神経障害性疼痛発症によって低下していた逃避閾値は投与後１日目から４日目において有意に上昇していることが分かった（Tukey-Kramer検定、**Ｐ<0.01、*Ｐ<0.05）。この結果から、ｓｉＲＮＡ投与実験と同様に、抗ネトリン−４抗体によるネトリン−４の機能阻害に神経障害性疼痛に対する鎮痛効果があることが明らかになった。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims

ネトリン−４、Ｕｎｃ５ＢもしくはＮｅｏｇｅｎｉｎの発現を阻害する核酸、または、ネトリン−４、Ｕｎｃ５ＢもしくはＮｅｏｇｅｎｉｎに対する抗体を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
前記核酸が、配列番号１および２、配列番号３および４、または配列番号５および６の塩基配列をセンス鎖およびアンチセンス鎖として形成されるｓｉＲＮＡである請求項１に記載の医薬組成物。
疼痛の予防または治療用医薬組成物を製造するための、ネトリン−４、Ｕｎｃ５ＢもしくはＮｅｏｇｅｎｉｎの発現を阻害する核酸、または、ネトリン−４、Ｕｎｃ５ＢもしくはＮｅｏｇｅｎｉｎに対する抗体の使用。