ES2542531T3

ES2542531T3 - Procedimiento de preparación de moléculas biológicas conjugadas

Info

Publication number: ES2542531T3
Application number: ES10175143.6T
Authority: ES
Inventors: Antony Robert Godwin; Elisa Pedone; Ji-Won Choi; Stephen James Brocchini
Original assignee: Polytherics Ltd
Current assignee: Abzena UK Ltd
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2004-07-12
Publication date: 2015-08-06
Anticipated expiration: 2024-07-12
Also published as: US20110182855A1; ATE440620T1; JP2007527382A; DK2277550T3; ES2549427T3; EP2253330A3; DK1648518T3; US20140369960A1; EP2277550B1; US8816051B2; EP2133099A3; DK2133099T3; EP1648518B1; WO2005007197A2; US20090298154A1; US20060210526A1; WO2005007197A3; CN101792525B; AU2004257448A1; KR101152500B1

Abstract

Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general:**Fórmula** en la que cada uno de X e X' representa polietilenglicol, y el otro representa un átomo de hidrógeno; cada Q representa independientemente un grupo de unión; W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, o un grupo obtenido por reducción de tal grupo; o, si X' representa polietilenglicol, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano; Z representa una proteína que está unida a A y B por medio de dos grupos tiol que se han obtenido de un puente disulfuro de la proteína; A es una cadena de alquileno o alquenileno C1-5; y B es un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4; que comprenden la reducción de un puente disulfuro en una proteína, y hacer reaccionar el producto resultante en un medio de reacción acuoso bien con (i) un compuesto de la fórmula general**Fórmula** en la que X, X', Q, A, B y L tienen los significados dados anteriormente, W' representa un grupo ceto o aldehído CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, y cada L representa independientemente un grupo saliente; o (ii) un compuesto de la fórmula general**Fórmula** en la que X, X', Q, A, y L tienen los significados dados para la fórmula general II, y m representa un número entero de 1 a 4.

Description

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3,41 (q, 2H), 3,51-3,54 (m, 2H), 3,82 (t, 2H), 8,26 (s,1H), 8,29 (s, 1H), 8,41 (s, 1H),8,44 (s, 1H).

3-(2-hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona

Una solución en agitación de hidrocloruro de p-nitro-3-piperidinopropiofenona (30 g, 0,1 mol) y mercaptoetanol (0,5 g, 0,12 mol) en etanol al 95 % (200 ml) se calentó lentamente hasta homogeneidad. Se añadió piperidina (1,0 mol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h. Después de enfriar, se rotoevaporó la mayor parte del disolvente, se añadió acetato de etilo (200 ml) y se separó el sólido por filtración. La solución de acetato de etilo se sometió a extracción secuencialmente con solución acuosa al 10 % de HCl, solución de NaHCO3 al 5 % y salmuera y luego se secó sobre Na2SO4; luego se evaporó el acetato de etilo, resultando un aceite que cristalizó, obteniéndose 23,2 g del producto deseado que se cristalizó en acetato de etilo-etil éter.

2,2-bis(p-toliltiolmetil)-p-nitroacetofenona: C24H23NO3S2

En un matraz de fondo redondo de 100 ml, de una boca, se añadió hidrocloruro de p-nitropiperidinopropiofenona (10,0 g), 4-metilbencenotiol (8,2 g), formaldehído (solución acuosa al 37 % p/p, 10 ml, exceso), metanol (40 ml) y una barra de agitación magnética. La mezcla heterogénea en agitación se calentó hasta que se formó una solución homogénea amarilla (un par de minutos a 50-60 ºC). Se añadieron luego 5 gotas de piperidina y la solución de reacción se calentó a reflujo. En 15 min la mezcla de reacción se hizo heterogénea debido a la presencia de algún sólido blanco/amarillo y, al cabo de 2 h, este sólido presentaba un color naranja fuerte. Al cabo de este tiempo se paró el reflujo y se dejó que la mezcla de reacción se enfriara durante la noche a temperatura ambiente. Luego se calentó nuevamente a reflujo la mezcla de reacción con más formaldehído (solución acuosa al 37 % p/p, 10 ml, exceso). Después de tener en reflujo durante aproximadamente 30 min, era visible un aceite de color naranja y no se veía sólido alguno. El aceite sedimentó en el fondo del matraz cuando se paró la agitación. Después de otras 7 horas de reflujo, se dejó que la mezcla se enfriara durante la noche, lo que dio por resultado la cristalización del aceite sedimentado. Se aisló el sólido cristalino y se purificó por recristalización en metanol muy caliente habiendo añadido varias gotas de acetona, obteniéndose cristales amarillos (10,0g). RMN1H (D MSO-d6)  2,31 (s,6H), 3,313,33 (m, 4H), 3,97 (quintete, 1H), 7,14 (q, 8H), 7,80 (d, 2H), 8,24 (d,2H).

2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona: C24H23NO7S2

En un matraz de fondo redondo de 250 ml se agitó una suspensión de 2,2-bis(p-toliltiolmetil)-p-nitroacetofenona (2,5 g) y oxona (18,4 g) en metanol:agua 1:1 (100 ml) durante 16 h. Esto dio una suspensión de un sólido blanco a la que se añadió cloroformo (100 ml) y la fase orgánica resultante se aisló usando un embudo separador, dejando una suspensión de un sólido blanco dentro de la fase acuosa. A la fase acuosa se añadió más agua hasta que se formó una solución homogénea, que luego se lavó nuevamente con cloroformo (100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, la combinación se lavó con salmuera (50 ml x 2), se secó con sulfato magnésico y se eliminó el disolvente, obteniéndose un producto sólido en bruto blancuzco después de secar en vacío (2,5 g). El producto se recristalizó en acetona, obteniéndose cristales blancos. RMN1H (CDCl3)  3,43-3,62 (m,4H), 4,44 (quintete, 1H), 7,35 (d,4H), 7,68 (d, 4H), 7,88 (d, 2H), 8,22 (d, 2H). Análisis calculado para C24H23NO7S2 (hallado): C 57,47 (57,27); H 4,62 (4,74); N 2,79 (2,58). MS (FAB) m/z 502 ([M+1]+).

2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona

Un matraz de fondo redondo secado a la llama, purgado con argón y provisto de termómetro y embudo de adición, se cargó con 3-(2-hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona (0,5 g, 2,0 mmol) y tetrahidrofurano anhidro (50,0 ml). Se agitó la solución y se enfrió en baño de hielo seco-acetona, luego se añadió con jeringa TiCl4 (0,23 ml, 2,1 mmol). Se retiró el baño de hielo y se dejó que la solución se calentara a temperatura ambiente, luego se enfrió a -40 ºC y se añadió con jeringa diisopropiletilamina (1,1 ml). Se quitó el baño de enfriamiento y se dejó que la mezcla se calentara a entre -15 ºC y 0 ºC, adquiriendo color rojo. Luego la mezcla de reacción se calentó a 25 ºC en un tiempo de 3-5 min y se añadió una solución de acroleína (0,14 g, 2,1 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 ml), añadiéndolo a gotas en el embudo de adición en un período de 30-40 min. La reacción exotérmica causó que la temperatura de la mezcla de reacción subiera a 30-40 ºC y la solución se agitó 20 min más después de la adición del aldehído antes de añadir acetato de etilo (75 ml). Se usó cromatografía en capa fina para confirmar la desaparición de la 3-(2hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona de partida y la formación de la deseada 2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4penta-dienofenona (Rf -0,38-0,45). Se pudo observar el producto minoritario (isómero E) a Rf más bajo, en el intervalo de 0,29-0,34. La mezcla de reacción en acetato de etilo se sometió a extracción con HCl acuoso al 10 % y salmuera. Se combinaron las capas acuosas y la combinación se sometió a extracción dos veces con acetato de etilo y todas las fracciones de acetato de etilo se lavaron dos veces con HCl acuoso al 10 %, NaHCO3 acuoso al 5 % y salmuera, luego se secaron sobre Na2SO4 sólido. El acetato de etilo se rotoevaporó, obteniéndose la 2-(2hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona en bruto como un aceite que se oxidó inmediatamente como para la síntesis de 2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona, resultando la 2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona como un sólido que se purificó por cromatografía en columna o se recristalizó en acetato de etilo o metanol y luego se unió covalentemente a polietilenglicol terminado en amino como se ha descrito en otro lugar en esta memoria.

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La secuencia de reacciones anterior se realizó con muchos aldehídos, entre los que están incluidos acetaldehído, metacroleína, etacroleína, butiraldehído, crotonaldehído, 2,4-pentadienilo, sorbaldehído, tolualdehído, cinamaldehído, metilcinamaldehído, clorocinamaldehído, 5-fenil-2,4-pentadienal y 7-fenil-2,4,6-heptatrienal. Esta secuencia de reacciones se realizó con muchos cetoderivatizados, incluidos 3-(p-toliltiometil)-m-nitroacetofenona, 3(2-hidroxi-etiltio)-m-nitropropriofenona, 3-(etiltiometil)-m-nitropropiofenona, 3-(dimetilamino-etltio)-mnitropropiofenona, 3-(2-hidroxietiltio)-3-fenilpropriofenona, 3(2-hidroxi-etiltiol)-5-fenil-4(E)-pentenofenona, 3(etiltiometil-o-nitropropiofenona, 3(etiltio)-propiofenona, 3(2-hidroxietilsulfonil)propiofenona, 2-(3-(2-hidroxietiltio)-1propenil)-m-2(E)-4-pentadienofenona. Esta secuencia de reacciones se realizó también con cetoderivatizados alifáticos, incluidos 4-(etiltio)-2-butanona, 4-(p-toliltio)-2-butanona, 4-(4-nitrofeniltio)-2-butanona, 4-(2-hidroxietiltio)-2butanona y metil-3-(2-hidroxietiltio)-propanoato. Los productos finales de las reacciones antes mencionadas para estos precursores se pueden unir covalentemente a polietilenglicol como se ha descrito en otro lugar en esta memoria.

Hidrocloruro de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]-p-aminoacetofenona C24H26ClNO5S2

Se cargó un matraz de fondo redondo de 100 ml con 2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona (2 g), etanol (25 ml), ácido clorhídrico (al 37 % en peso en agua, 8 ml) y una barra de agitación magnética. A la mezcla heterogénea resultante se añadió luego cloruro de estaño(II) dihidratado y la mezcla se calentó a 45 ºC en baño de aceite durante 2h. A la solución homogénea amarilla que se formó se añadió luego agua hasta que se observó que podía haber precipitación si se añadía más agua. Se dejó enfriar la solución homogénea a temperatura ambiente, resultando un compuesto amarillo que precipitó/ cristalizó, que se aisló por filtración en vacío. El producto aislado se mezcló luego con una mezcla caliente de acetona y metanol (aprox. 90:10 v/v). Se aisló por filtración en vacío un sólido insoluble y se secó a peso constante en horno de vacío (1,4g). RMN1H (D MSO-d6)  2,50 (s, 6H), 3,57-3,73 (solapamiento m’s, 5H), 6,27 (s, 2H), 6,39 (d, 2H), 6,96 (d, 2H), 7,47 (d, 4H), 7,55 (d,4H).

Acoplamiento de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metal]-p-aminoacetofenona a -metoxi--aminopolietilenglicol

Un matraz de fondo redondo de 100 ml, de una boca, equipado con un embudo de adición y un conducto para nitrógeno se cargó con trifosgeno (23 mg), hidrocloruro de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]-p-aminoacetofenona (125 mg), tolueno anhidro (2,5 ml) y una barra de agitación magnética bajo atmósfera de nitrógeno. El embudo de adición se cargó separadamente con trietilamina anhidra (68 l) y tolueno anhidro (2,5 ml). Se puso un baño de acetona/hielo seco bajo el matraz de fondo redondo y se dejó que se enfriara el contenido. Luego se añadió a gotas la solución de trietilamina a la solución de trifosgeno agitando durante 5-10 min. Se dejó que el matraz y el baño de hielo seco se calentaran a temperatura ambiente, lo que tardó varias horas en hacerlo y, una vez que estaba a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se dejó en reposo durante aproximadamente 2 h bajo atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción a temperatura ambiente se añadió luego a gotas una solución de O-(2-aminoetil)-O’metilpolietilenglicol 2.000 (490 mg) y trietilamia anhidra (68 l) en tolueno anhidro. La mezcla resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche (aprox. 20 h en total). Luego se abrió la mezcla de reacción a la atmósfera y se filtró por gravedad a través de una jeringa desechable de 5 ml con un trozo de lana de algodón no absorbente para que actuara de filtro. El eluyente homogéneo se pasó a un embudo separador de 100 ml y luego se lavó dos veces con agua desionizada (30 ml y luego 10 ml). Se combinaron las fases acuosas y luego la combinación se lavó con dietiléter (aprox. 25ml). La fase acuosa se liofilizó, obteniéndose un producto sólido blancuzco (160mg). Se encontró producto también en las fases de dietiléter y tolueno. RMN1H (CDCl3)  2,5 (s), 3,39 (s), 3,41-3,53 (solapamiento m’s), 3,53-3,76 (m), 3,82 (t), 4,17 (quintete), 7,35-7,39 (m, 1,39), 7,46 (d), 7,68 (d).

Ejemplo 2

Síntesis de reactivo de conjugación de polímero

Hidrocloruro de p-carboxi-3-piperidinopropriofenona

Un matraz de fondo redondo de 250 ml, de una boca, se cargó con ácido p-acetilbenzoico (10 g) e hidrocloruro de piperidina (7,4 g), 100 ml de etanol absoluto y una barra de agitación magnética. A la mezcla heterogénea en agitación se añadió ácido clorhídrico concentrado (1 ml) y la solución se calentó luego a reflujo bajo nitrógeno. Al matraz se añadió paraformaldehído (3,7 g) y se continuó el reflujo durante aproximadamente 1,5 horas. Se formó una solución homogénea a la que se añadió más paraformaldehído (3,7 g). Se continuó calentando durante aproximadamente 6 horas, tiempo durante el cual se añadió más formaldehído (3,7 g). Se dejó enfriar a temperatura ambiente la solución de reacción y se dejó durante una semana. Se aisló por filtración de la mezcla de reacción enfriada un sólido blanco. Después de disolverlo en metanol muy caliente se intentó cristalizar el sólido. Se aisló por filtración un producto insoluble (1,96 g) y del filtrado cristalizó un segundo producto (0,88 g). Ambos producto aparecían como idénticos por análisis de espectroscopia de infrarrojos y cromatografía de capa después de secar en vacío, por lo que se combinaron para usarlos en posteriores reacciones. ATR-FT-IR 1704, 1691, 1235, 760.

Ácido 4-[2,2-bis[(p-toliltio)metil]acetil]benzoico: C25H24O3S2

A un matraz de fondo redondo de 50 ml, de una boca, se añadió hidrocloruro de p-carboxi-3-piperidinopropriofenona (2,5 g), 4-metilbencenotiol (2,1 g), formaldehído (al 37 % p/p, solución acuosa, 2,5 ml), etanol (10 ml), una barra de

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agitación magnética y piperidina (aprox. 10 gotas). Luego se acopló al matraz un condensador y la solución de reacción se calentó a reflujo. Luego se añadió metanol (5 ml). Después de aproximadamente 2 horas, se añadió más formaldehído (2,5 ml) y se calentó durante otras 2 horas. Luego se dejó enfriar el matraz a temperatura ambiente y después se diluyó la solución de reacción con dietíl éter (aprox. 150 ml). La fase orgánica resultante se lavó luego con agua (acidificada con ácido clorhídrico 1 N a pH 2-3, 50 ml x 2), agua (50 ml) y salmuera (75 ml) y seguidamente se secó sobre sulfato magnésico. La filtración seguida de la eliminación de volátiles en un evaporador rotatorio dio un residuo sólido. El sólido se disolvió en un volumen mínimo de una mezcla predominantemente de metanol y acetona calentando. La solución homogénea se puso luego en un congelador durante la noche, obteniéndose cristales blancuzcos que se aislaron por filtración en vacío, se lavaron con acetona fresca y luego se secaron a peso constante en horno de vacío (2,5 g). RMN1H (CDCl3)  2,38 (s, 6H), 3,16-3,31 (m, 4H), 3,85 (quintete, 1H), 7,15 (d, 4H), 7,18 (d, 4H), 7,64 (d, 2H), 8,07 (d, 2H). Análisis calculado para C25H24O3S2 (hallado): C 68,78 (68,84), H 5,54 (5,77).

Ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico: C25H24O7S2

Un matraz de fondo redondo de 250 ml se cargó con una suspensión de ácido 4-[2,2-bis[(ptoliltio)metil]acetil]benzoico (2 g) y oxona (16,9 g) y se agitó en metanol:agua 1:1 v/v (100 ml) durante 16 h. Resultó una suspensión de un sólido blanco a la que se añadió cloroformo (100 ml) y la fase orgánica resultante se aisló usando un embudo separador, quedando una suspensión de un sólido blanco con la fase acuosa. A la fase acuosa heterogénea se añadió más agua hasta homogeneidad (aprox. 170 ml) y luego la fase acuosa se lavó con cloroformo (75 ml). Se combinaron las fases orgánicas, la combinación se lavó con agua (50 ml x 2, acidificada con unas pocas gotas de ácido clorhídrico 1N) y salmuera (50 ml). La fase orgánica se secó con sulfato magnésico, se filtró y se eliminó el disolvente usando un evaporador rotatorio, obteniéndose un producto sólido blancuzco en bruto (2,2 g). La purificación (de un 1 g de producto) se realizó por recristalización en acetato de etilo muy caliente, acetona y hexano, obteniéndose 0,6 g de producto. RMN1H (CDCl3)  2,51 (s, 6H), 3,49-3,72 (m, 4H), 4,44 (quintete, 1H), 7,40 (d, 4H), 7,37-7,78 (m, 6H), 8,13 (d, 2H). Análisis calculado para C25H24O7S2 (hallado): C 59,98 (59,88), H 4,38 (4,76).

Acoplamiento de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico a -metoxi--amino PEG (2000 g/mol)

Un matraz con llave de 50 ml, de una boca, se cargó con ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico (100 mg) y una barra de agitación magnética. El matraz se selló y se aplicó un vacío fuerte durante aproximadamente 15 min. Se introdujo en el matraz atmósfera de argón y se añadió con jeringa cloruro de tionilo (1 ml) mientras que se agitaba. La mezcla resultante se calentó a 50 ºC durante 2 h. Se eliminaron en vacío los líquidos volátiles, obteniéndose una espuma amarilla. Se introdujo nuevamente atmósfera de argón en el matraz y se añadió con jeringa diclorometano anhidro (5 ml), obteniéndose una solución homogénea. Nuevamente se eliminaron en vacío los líquidos volátiles. Se repitió el proceso de adición/eliminación de disolvente hasta que quedó un residuo blanco. Al matraz con llave se añadió nuevamente diclorometano anhidro (5 ml) para formar una solución homogénea. Separadamente, en un matraz de fondo redondo de 25 ml, provisto de diafragma y con barra de agitación magnética se disolvieron O-(2-aminoetil)-O’-metilpoli(etilenglicol) (2.000 g/mol) (0,2 g) y trietilamina anhidra (30 l) en diclorometano anhidro (5 ml) bajo atmósfera de argón. La solución de reacción con ácido bis[(ptolilsulfonil)metil]acetil]benzoico fue inyectada en el matraz que contenía la solución de polietilenglicol gota a gota, produciéndose inmediatamente el desprendimiento de un gas blanco. La solución resultante se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente y luego se añadió más trietilamina (28 l). Al cabo de 1 hora .la solución de reacción se añadió a gotas mediante una pipeta de vidrio a dietíl éter sometido a una rápida agitación. Para conseguir la precipitación fue necesario añadir hexano a la solución de dietíl éter y poner el matraz en baño de hielo. El precipitado obtenido se aisló por centrifugación y se secó en horno de vacío a peso constante, obteniéndose un producto sólido blancuzco (230 mg). Se logró una pureza mayor por precipitación disolviendo primeramente el producto en diclorometano y añadiendo la solución a una solución enfriada de dietíl éter. RMN1H (CDCl3)  2,51 (s), 3,40 (s), 3,60-3,75 (m), 3,84 (t), 4,36 (quintuplete), 7,39 (d), 7,68 (d), 7,71 (d), 7,85 (d).

Acoplamiento de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico a -metoxi--amino PEG (20.000 g/mol)

Un matraz con llave de 50 ml, de una boca, se cargó con ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico (100 mg) y una barra de agitación magnética. El matraz se selló y se aplicó vacío fuerte durante aproximadamente 15 min. Se introdujo en el matraz atmósfera de argón y se añadió con jeringa cloruro de tionilo (1 ml) mientras que se agitaba. La mezcla resultante se calentó a 50 ºC durante 2 h. Se eliminaron en vacío los líquidos volátiles, obteniéndose una espuma amarilla. Se introdujo nuevamente atmósfera de argón en el matraz y se añadió con jeringa diclorometano anhidro (5 ml), obteniéndose una solución homogénea. Nuevamente se eliminaron en vacío los líquidos volátiles. Se repitió el proceso de adición/eliminación de disolvente hasta que quedó un residuo blanco. Finalmente, al matraz se añadió diclorometano anhidro (5 ml) bajo argón para formar una solución homogénea.

En un matraz con llave de 50 ml distinto se disolvió O-(2-aminoetil)-O’-metilpoli(etilenglicol) (20.000 g/mol) (0,5 g) en 4 ml de tolueno anhidro en atmósfera de argón y luego la solución se evaporó a sequedad en vacío. El residuo blanco obtenido se mantuvo en vacío durante 3 h y luego se disolvió en diclorometano anhidro (5 ml) en atmósfera de argón.

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La solución de reacción de ácido bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico se añadió lentamente a gotas a la solución de polietilenglicol, que estaba en agitación y enfriada en baño de hielo. Finalizada la adición completa, se añadieron a gotas a la solución resultante 40 l de trietilamina seca. Cuando se había añadido la trietilamina, se dejó la solución resultante en agitación durante la noche y que se calentara a la temperatura ambiente.

La solución de reacción se filtró luego a través de un filtro de 0,45 m y se eliminaron los líquidos volátiles del eluyente, obteniéndose un residuo ligeramente amarillo/naranja que se redisolvió en acetona caliente (10 ml). El matraz que contenía la solución homogénea resultante se puso en un baño de hielo-agua y se agitó hasta que se produjo precipitación. El precipitado blanco se aisló en un embudo de vidrio sinterizado nº. 3 y se lavó con acetona fresca enfriada (aprox. 30 ml). El sólido aislado se dejó secar en vacío, obteniéndose 0,4 g de sólido blanco. RMN1H (CDCl3)  2,42 (s), 3,31 (s), 3,40-3,75 (m), 4,27 (m), 7,30 (d), 7,59 (d), 7,63 (d), 7,75 (d).

El reactivo de conjugación -metoxi--4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol (20.00 g/mol) (0,4 g) se disolvió en 10 ml de una mezcla de acetonitrilo-agua (24:1, v/v, 2 mg de hidroquinona) purgada con argón y la solución se filtró a través de un filtro PP de 0,45 m. El eluyente se puso bajo argón en un matraz de fondo redondo y se añadió trietilamina (50 l) mientras que se agitaba. El matraz se puso luego en un baño de aceite a 30 ºC durante 20 h mientras que se agitaba y al cabo de este tiempo el matraz se enfrió a temperatura ambiente y los líquidos volátiles se eliminaron en vacío. El residuo obtenido se disolvió en acetona caliente (10 ml) y, una vez que la solución se hizo homogénea, se puso en baño de hielo-agua, después de lo cual se produjo precipitación mientras que se agitaba la solución. El precipitado blanco se aisló en un embudo de vidrio sinterizado nº. 3 y se lavó con acetona fresca enfriada (aprox. 30 ml). Se dejó secar en vacío el sólido aislado, obteniéndose 0,3 g de un sólido blanco. RMN 1H (CDCl3)  2,35 (s), 3,31(s), 3,39-3,78 (m), 4.28 (s), 5,84 (s), 6,22 (s), 7,26 (d), 7,65 (d), 7,72 (d), 7,81 (d).

Ejemplo 3

Reacción de 4-metilbencenotiol y -metoxi--4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol

El reactivo que conjuga al polímero, -metoxi--4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol

(2.000 g/mol) (30 mg, 12,1 mol, 1 equiv), y 4-metilbencenotiol (3 mg, 24,2 mmol, 2 equiv) se disolvieron en cloroformo deuteriado (aprox. 0,75 ml). A la solución homogénea se añadió luego trietilamina (1,7 l, 12,1 mol, 1 equiv). Se agitó la mezcla de reacción y se obtuvo un espectro de RMNH. El espectro obtenido confirmó que se había efectuado la adición de 4-metilbencenotiol al reactivo de conjugación al polímero. Se realizó una reacción similar con propanotriol.

Ejemplo 4

Conjugación de polímero a ribonucleasa A

Se añadieron a un tubo de centrifugadora de 15 ml que contenía ribonucleasa A (30 mg) 3 ml de una solución acuosa 8 M de urea y seguidamente 60 l de 2-mercaptoetanol. Se ajustó a 8 el pH de la solución resultante usando solución acuosa de metilamina al 10 %. Luego se burbujeó nitrógeno a través de la solución durante aproximadamente 30 min. Mientras que se continuaba burbujeando nitrógeno, se calentó el tubo a 37 ºC durante 5 h. La mezcla de reacción se enfrió luego en baño de hielo-agua salada y a la solución de reacción se añadieron 10 ml de una solución enfriada, purgada con argón, de HCl 1N:etanol absoluto (1:39 v/v). Se produjo precipitación y el precipitado se aisló por centrifugación y luego se lavó tres veces con más porciones de 10 ml de la mezcla de HCl:etanol absoluto y dos veces con dietíl éter enfriado, purgado con nitrógeno (2 x 10 ml). Después de cada lavado, el precipitado se aisló por centrifugación. El precipitado lavado se disolvió luego en agua desionizada purgada con nitrógeno y se liofilizó, obteniéndose un sólido seco. Se confirmó la reducción parcial de ribonucleasa A y se cuantificó usando el Ensayo de Ellman, que dio 5,9 tioles libres por molécula de proteína.

En un eppendorf, la ribonucleasa A parcialmente reducida (10,9 mg) se disolvió en solución de amoniaco pH 8 (500 l) purgada con argón. En un eppendorf separado se disolvió también en solución de amoniaco (250 l) el reactivo de conjugación a polímero, -metoxi--4-[2,2-bis [(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida derivada de polietilenglicol (2000 g/mol) (5 mg) y la solución resultante se añadió a la solución de ribonucleasa A. El eppendorf con PEG se lavó con 250 l de solución recientemente preparada de amoniaco y ésta se añadió también al eppendorf de reacción principal. Luego se cerró bajo argón el eppendorf de reacción principal y se calentó a 37 ºC durante aproximadamente 24 h, luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego se analizó la solución de reacción enfriada por dodecilsulfato sódico-electroforesis de gel de poliacrilamida-(SDS-PAGE). El experimento de SDS-PAGE era consistente con la reacción de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico pegilado.

Ejemplo 5

Conjugación de polímero a fragmento Fab de anticuerpo IgG de ratón

A 240 l de una solución de 0,4 mg/ ml de fragmentos Fab de anticuerpo IgG de ratón (catálogo de Abcam nº. AB6668) en tampón de fosfato sódico 0,02 M, pH 6, purgada con argón, que contenía cloruro sódico 0,15 M y EDTA

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14-07-2015

Silver Staining; Colloidal Blue Staining y ácido perclórico 0,1 M/5 % de BaCl2 y tinción con I2 0,1 M). No se observó conjugación cuando una solución de 40 l de interferón (1 mg/ ml) en 60 l de fosfato sódico 0,02 M, NaCl 0,15 M, EDTA 0,005 M, pH 6,0, en agua purgada con argón, se mezcló con el reactivo de conjugación -metoxi--4-[2,2bis[(p-tolilsulfonil)metil-acetil]-benzamida derivada de polietilenglicol (20.000 g/mol), se disolvió en la solución tampón (50 mg/ ml) se enfrió a 4 ºC y se añadieron 16 l a la solución de proteína. La mezcla de reacción se agitó en un Vórtex y se incubó a 4 ºC durante 2 h.

La concentración de cada fracción purificada del conjugado de polietilenglicol-interferón se determinó mediante inmunoensayo de enzimas. Se utilizó el mismo ensayo para determinar la concentración del interferón nativo que se conjugó y una muestra de interferón patrón internacional NIBSC (RU). En la Figura 1 se muestra la curva patrón reproducible y precisa obtenida para todas las formas del interferón antes mencionado. Se cultivaron células A549 (fibroblasto de pulmón humano) a 15.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos. A las células por triplicado se añadieron separadamente interferón de NIBSC (RU), el interferón nativo que se conjugó y el conjugado de polietilenglicol interferón y la placa se incubó a 37 ºC (5 % de CO2) durante 24 h. Al día siguiente se preparó una solución de trabajo de E MCV (virus de encefalomiocarditis) en D ME M/2 % de FCS de virus de acopio almacenado a menos 80 ºC. Se eliminó el medio que contenía el interferón o el conjugado de polietilenglicol interferón y se reemplazó con medio que contenía EMCV. La placa de cultivo de tejidos se incubó luego durante 1 h a 37 ºC y después se eliminó el virus. Se añadieron 100 microlitros del medio D ME M/10 % de FCS y la placa se incubó a 27 ºC durante 16-24 horas. Después de 16 horas, se empezó a leer la placa con regularidad para ver cuándo empezaba la muerte de células. Luego se aspiró el medio y las células se lavaron con 100 l de solución de tampón de fosfato. A esto siguió la adición de 50 l de solución de violeta de metilo [esto es, violeta de metilo (4 % de formaldehído, 0,05 % de violeta de metilo 2B (Sigma-Aldrich)] durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa con 100 l de agua y se secó al aire. Se determinó la absorbancia espectrofotométrica a 570 nm usando un lector de placas. La Figura 2 confirma que el interferón usado para la conjugación tenía una actividad equivalente a la del interferón patrón internacional NIBSC (RU). La Figura 3 confirma que el interferón nativo usado para la conjugación mantenía una actividad biológica equivalente después de ser sometido a todos los procesos químicos y de purificación excepto la exposición con el reactivo de conjugación de polietilenglicol. La Figura 4 confirma que el interferón nativo usado para la conjugación y el conjugado de polietilenglicol interferón purificado mantenían una actividad biológica equivalente.

Se determinó la inducción de la 2’5’-sintetasa oligoadenilada (2’5’-OAS) y ARNm de proteínaquinasa R(PRKR) por interferón  2b Se evaluaron el conjugado polietilenglicol-interferón purificado y una muestra del interferón  2b. Se incubaron 2 millones de células MOLT 4/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos con 5000 pg de cada muestra de interferón midiendo según un inmunoensayo de 24 h a 37 ºC. Se extrajo el ARN total (kit de aislamiento de ARN II, Macheray-Nagel) y se sometieron 200 ng a transcripción inversa en un volumen final de 20 l (Sigma, kit de transcripción inversa A MV). Se diluyeron las muestras 1 a 4 en agua y se amplificaron 2 l de cada muestra en una mezcla de cuantificación de 20 l RCP en tiempo real (Sigma SybGreen Ready Mix). Los cebadores usados fueron: 2’5’-OAS directo GGC TAT AAA CCT AAC CCC CAA ATC 2’5’-OAS inverso AGC TTC CCA AGC TTC TTC TTA CAA

PKR directo ACT CTT TAG TGA CCA GCA CAC TCG PRKR inverso TTT AAA ATC CAT GCC AAA CCT CTT

Para una amplificación de 2’,5’-OAS, a la activación de la enzima a 94 ºC durante 5 min siguieron 48 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 5 s, condensación a 60 ºC durante 2 s y extensión a 72 ºC durante 8 s. Para la amplificación de PRKR, las muestras se activaron a 94 ºC durante 5 min y se sometieron a 48 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 5 s, condensación a 59 ºC durante 2 s y extensión a 72 ºC durante 8 s. Al final de las amplificaciones se hizo un análisis de la curva de fusión de los productos. La cuantificación de los niveles inducidos de ARNm se hizo en relación a las células de control no tratadas usando la fórmula siguiente:

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en la que Ct es el valor umbral de entrecruzamiento.

La Figura 5, en la que la Figura 5(a) muestra el análisis cuantitativo en tiempo real por TR-RCP (dos etapas) de genes de 2’5’-sintetasa oligoadenilada (2’5’-OAS) inducible por interferón, y la Figura 5(b) muestra el análisis cuantitativo en tiempo real por TR-RCP (dos etapas) del gen de proteína quinasa R (PRKR) inducible por interferón. Los resultados confirman que el conjugado polietilenglicol-interferón-2b estimulaba la síntesis de 2’5’-sintetasa oligoadenilada (2’5’-OAS) y ARNm de proteínaquinasa (PRKR) a niveles que eran similares a los del interferón-2b nativo no pegilado.

Claims

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