ES2541051T3

ES2541051T3 - Estructuras cristalinas de fragmentos de neuropilina y complejos neuropilina-anticuerpo

Info

Publication number: ES2541051T3
Application number: ES07762242.1T
Authority: ES
Inventors: Brent A. Appleton; Christian Wiesmann; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2007-05-17
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2027-05-17
Also published as: US20120322989A1; US8318163B2; JP2010530359A; MX2009012282A; KR101523788B1; CN101743253A; CA2687556A1; US8466264B2; CN101743253B; US20100150919A1; AU2007353779B2; HK1144580A1; AU2007353779A1; KR20100020967A; BRPI0721707A2; RU2012109383A; EP2158215A2; IL201983A0; WO2008143666A3; IL201983A

Abstract

Un cristal de un complejo formado entre un fragmento Nrp2a1a2b1b2 y un fragmento Fab de anticuerpo anti-panNrpA que inhibe la unión de semaforina a Nrp2, en donde dicho cristal difracta radiación de rayos X para producir un patrón de difracción que representa la estructura tridimensional de dicho complejo, que tiene aproximadamente las siguientes constantes de celda: a>=148 Å, b>=106 Å, c>=92,4 Å, y un grupo espacial de C2; o a>=121 Å, b>=121 Å, c>=203 Å, y un grupo espacial de P3221.

Description

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constantes de celda a=213 Å, b=213 Å, c=45,3 Å, y un grupo espacial de H3, para diseñar una molécula de unión a un sitio que comprende al menos parte del epítopo unido por dicho anticuerpo en Nrp1B, sintetizar el compuesto, y confirmar que el compuesto inhibe la unión de VEGF a Nrp1.

En una realización, el antagonista no interfiere con la unión de semaforina a Nrp1, y el método puede incluir adicionalmente una etapa que confirma esto.

En otra realización, el antagonista inhibe la actividad biológica de VEGF.

En otra realización más, el método comprende adicionalmente la etapa de confirmar que el antagonista inhibe una actividad biológica de VEGF.

En una realización adicional, el antagonista inhibe el remodelado vascular.

En una realización adicional más, el antagonista se selecciona entre el grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, polipéptidos de unión, péptidos, y moléculas pequeñas no peptídicas, y preferiblemente es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, donde el fragmento de anticuerpo puede, por ejemplo, ser un Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, anticuerpo lineal, molécula de anticuerpo de cadena sencilla, minicuerpo, diacuerpo, o anticuerpo multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticuerpo.

También se describe un método para el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto mamífero que lo necesite una cantidad eficaz de un antagonista de VEGF preparado por el método anterior de la presente invención. El cáncer puede, por ejemplo, seleccionarse entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar no microcítico, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, y mieloma múltiple.

En otra realización, el tratamiento comprende adicionalmente un segundo agente terapéutico, donde el segundo agente terapéutico puede ser, sin limitación, un agente seleccionado entre el grupo que consiste en un agente antiangiogénico, una composición antineoplásica, un agente quimioterapéutico y un agente citotóxico, tal como un antagonista adicional de VEGF.

En una realización adicional, el antagonista adicional de VEGF es un anticuerpo anti-hVEGF o un fragmento del mismo.

El anticuerpo anti-hVEGF puede ser capaz, por ejemplo, de unirse al mismo epítopo de VEGF que el anticuerpo A4.6.1, y específicamente bevacizumab o ranibizumab.

En otras realizaciones, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de receptor tirosina quinasa seleccionado entre el grupo que consiste en vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN518, CEP-701, PKC-412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880, y CHIR

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Breve descripción de los dibujos

Tabla 1-Recogida de datos y estadística de refinamiento

Figura 1-VEGF no bloquea el colapso del cono de crecimiento inducido por Sema3A de de neuronas DRG. A) Imágenes de conos de crecimiento de axones. Los DRG no tratados tienen grandes conos de crecimiento ricos en actina (punta de flecha) que se reducen significativamente tras la adición de Sema3A. Se añadieron anticuerpos anti-Nrp a 50 µg/ml. B) Cuantificación de colapso inducido por Sema3A del cono de crecimiento. El porcentaje de conos de crecimiento colapsados se calculó contando los conos de crecimiento colapsados y no colapsados (N=4 explantes por condición). Las barras de error representan el error típico de la media. Figura 2-Sumario de las estructuras cristalinas de neuropilina. A) El ectodominio de Nrp está compuesto por CUB en tándem (a1a2), factor V/VIII de coagulación en tándem (b1b2) y un dominio MAM (c1). Representación en dibujos de las siete estructuras cristalinas presentadas en este informe con los límites de resolución enumerados a continuación. Las esferas naranjas indican un ión de calcio unido en el dominio a2. B) Alineación de secuencia de los dominios a1a2b1b2 de Nrp1 y Nrp2 humana. Los elementos de estructura secundaria se refieren a la estructura Nrp2 a1a2b1b2 (azul, a1; verde, a2; amarillo, b1; rojo, b2) y se nombran de acuerdo con las convenciones adoptadas para el dominio CUB de espermadesina (Romero, A. et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)) y el dominio C2 del factor V de coagulación (Macedo-Ribeiro, S. et al., Nature 402, 434-9 (1999)). Los restos recuadrados en azul y amarillo delinean los epítopos de anticuerpo para anti-panNrpA y anti-Nrp1B, respectivamente. Los aminoácidos resaltados en naranja indican el sitio de unión de Ca2+ en a2, mientras que los restos en rojo representan un sitio de unión a Ca2+ putativo en el dominio a1. Los restos sombreados en verde destacan las posiciones de sustituciones de aminoácido que alteran interacciones entre Sema3A y Nrp1

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(Gu, C. et al., J Biol Chem 277, 18069-76 (2002)). Esta alineación se produjo con EsPript (Gouet, P. et al., Nuclei Acids Res 31, 3320-3 (2003)). Figura 3-Arquitectura global de dominios de neuropilinas. A) Organización de dominios de Nrp2 (azul, a1; verde, a2; amarillo, b1: rojo, b2) en complejo con el fragmento Fab de anti-panNrpA (naranja claro, cadena pesada; gris, cadena ligera). Los restos N-glucosilados se indican en magenta. B) Representación en cintas de las estructuras a2b1b2 de Nrp1 y Nrp2; las esferas naranjas destacan un ión de calcio unido. C) Superposición del complejo Nrp2/Fab de dos formas cristalinas diferentes basadas en los dominios a2b1b2. Obsérvese la mala superposición de los dominios a1 en comparación con la región a2b1b2. Todas las figuras de estructura se produjeron con PyMol (http://www.pymol.org). Figura 4-Detalles moleculares de los dominios CUB de neuropilina. A) En las estructuras a2b1b2, el dominio a2 incluye un ión de calcio unido (naranja). Los dominios a1 (véase panel C) y a2 de Nrp carecen de la hebra b1 encontrada en espermadesina (Romero et al, supra). B) El ión de calcio del dominio a2 de Nrp1 está coordinado por tres aminoácidos cargados negativamente, dos oxígenos de carbonilo de cadena principal, y una molécula de agua. Estas interacciones están altamente conservadas entre las Nrp (véase la Fig. S2-S3). C) (panel de la izquierda) Los aminoácidos están coloreados de acuerdo con el porcentaje de superficie accesible a disolvente que está enterrado en la interfaz Nrp2/Fab (rojo, 75-100 %; naranja, 50-74 %; amarillo, 25-49 %). AntipanNrpA tiene reactividad cruzada para Nrp1 y Nrp2, y once de los catorce restos en el epítopo estructural son idénticos (texto en negro, idéntico; texto en blanco, no conservado; los asteriscos indican restos en los que la cadena lateral apunta hacia el núcleo proteico a1). Los restos perfilados en verde representan las posiciones de sustitución de aminoácido que son necesarias para interacciones entre Nrp1 y Sema3A23. (panel de la derecha) Los átomos Cα de estas sustituciones de aminoácidos se indican como esferas verdes. Los átomos Cα sombreados en morado representan un sitio de unión a calcio putativo. D) La interfaz anti-panNrpA/Nrp2. Nrp2 se muestra como una superficie molecular de acuerdo con el potencial electrostático (rojo, ácido; azul, básico). Los restos de contacto del anticuerpo están dominados por restos aromáticos de las CDR H2, H3, y L3. Figura 5-Características de los dominios de unión a VEGF y heparina de Nrp. A) Superposición de las estructuras cristalinas de Nrp b1b2 (Nrp1, amarillo (b) y rojo (b2); Nrp2, gris). Los restos azules (Nrp1) y verdes (Nrp2) destacan diferencias conformacionales en las "puntas" de b2, pero no de b1. B) La superficie molecular de las estructuras cristalinas de b1b2 de rata (nº de acceso PDB 2ORZ) (Vancer Kooi, C.W., et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. (2007)) y humano están coloreadas por potencial electrostático. Las flechas amarillas indican un surco ácido que está formado por las "puntas" del dominio b1 y que representa el sitio de unión a Tuftsina en la estructura de rata (Vander Kooi et al., supra). Las flechas verdes indican la localización aproximada del parche de unión a heparina. C) La conservación relativa de secuencia (verde, 100 %; amarillo, ≥75 %) de los dominios b1b2 entre doce Nrp (Fig. S3) se mapeó sobre la superficie de la estructura b1b2 de Nrp1 humana. Dos parches altamente conservados están delineados en naranja. Los restos perfilados en cian indican aquellos restos que contactan con el Fab en el complejo anti-Nrp1B-Fab/b1. El dominio a2 (trigo) se muestra usando una superposición de las estructuras b1b2b y a2b1b2 de Nrp1. D) Representación en cintas del complejo anti-Nrp1BFab/b1 (amarillo, b1; naranja, cadena pesada; gris, cadena ligera). E) La interfaz anti-Nrp1B/b1. El dominio b1 se representó en dibujo como una superficie molecular de acuerdo con el potencial electrostático; la flecha amarilla indica el surco de unión a la cola de VEGF. Solamente las CDR H3 y L1 contactan con b1. Figura 6-Un dímero cristalográfico de Nrp2 sugiere modelos para la unión de VEGF y semaforina. A) Nrp2 forma un dímero con forma de silla de montar en ambas formas cristalinas del complejo Nrp2/Fab. Esta figura destaca los dominios a1a2b1b2 de Nrp2 de la forma monoclínica del complejo Fab. Los sitios putativos de unión a cola de VEGF, heparina, y semaforina están indicados. B) Modelos potenciales de complejos VEGF/Nrp y semaforina/Nrp basados en el dímero mediado por a1 de Nrp en las estructuras cristalinas.

Figura 7-Alineación de secuencia de dominio variable de cadena ligera de los clones Anti-panNrpA YW68.11 e YW68.11.26. Figura 8-Alineación de secuencia de dominio variable de cadena pesada de los clones Anti-panNrpA YW68.11 e YW68.11.26. Figura 9A-Secuencia completa del anticuerpo IgG1 humano Anti-panNrpA YW68.11. Figure 9B-Secuencia completa del anticuerpo IgG1 humano Anti-panNrpA YW68.11.26.

Tabla S1 -Condiciones usadas para la cristalización y crioprotección.

Figura S1 -Análisis de cinética de unión a anticuerpo anti-Nrp. Análisis cinético BIAcore de anticuerpo antipanNrpA. Los sensogramas para la inyección de 500 nM de cada proteína NRP humana a 25 ºC sobre IgG inmovilizada en chip sensor BIAcore demuestran la especificidad de unión. Anti-panNrpA se une a a1a2b1b2 de Nrp1 y de Nrp2, pero no a los dominios b1b2 de Nrp2.

Figura S2 -Los dominios CUB de Nrp incluyen un sitio de unión a calcio conservado. A) Densidad electrónica alrededor del ión de calcio en la estructura a2b1b2 de Nrp1 (mapa final 2Fo-Fc contorneado a 1,5σ. B) El ión de calcio del dominio a2 de Nrp2 C) Tres aminoácidos cargados negativamente (sombreados en naranja), que delinean el sitio de unión a calcio, están conservados en los dominios CUB de Nrp1 y Nrp2.

Figura S3 – Alineación de secuencia de las neuropilinas. Alineación de secuencia de longitud completa de los dominios a1a2b1b2 de Nrp1 y Nrp2 humana, de ratón, de rata, de pez cebra (BRARE), rana (XENLA), y pollo. Esta figura está coloreada usando el mismo esquema que la Fig. 2B y se produjo con EsPript (Gouet P. et al., supra).

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(2006)). Aunque los estudios de estructura-función delinean las necesidades globales de dominios para la función neuropilina, los detalles moleculares de estos complejos receptor/ligando siguen estando mal comprendidos. Hasta la fecha, la información estructural de las Nrp se limita al dominio b1b2 de Nrp1 (Vander Kooi et al., supra; Lee, C. et al., J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)). La estructura cristalina de Nrp1 b1b2 en complejo con tuftsina, un tetrapéptido homólogo al extremo C-terminal de VEGF165, proporcionó la primera información estructural sobre la interacción de Nrp con su compañero de unión VEGF (Vander Kooi, et al., supra; von Wronski, M.A., et al., J. Biol Chem 281, 570210 (2006)).

La presente descripción proporciona la estructura cristalina de Nrp2 a1a2b1b2 en complejo con un fragmento Fab de un anticuerpo que puede bloquear la unión de Sema3 tanto a Nrp1 como a Nrp2 in vitro. Las estructuras de los fragmentos a2b1b2 y b1b2 de ambas isoformas de Nrp también están comparadas y contrastadas. Además, la estructura del dominio b1 de Nrp1 combinado con el fragmento Fab de un anticuerpo derivado de fago recientemente descrito que inhibe específicamente la unión de VEGF165 a Nrp1 in vivo (Liang, W.C., et al., J Mol Biol 366, 815-29 (2007); Pan, Q et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007) también está proporcionada y evaluada. En conjunto, estas estructuras presentan una imagen detallada de una gran parte del dominio extracelular de Nrp y sugiere modelos para la unión de VEGF y semaforina. Basándose en el dímero de Nrp2 presente en dos diferentes formas cristalinas, se propone un nuevo mecanismo para la dimerización de Nrp y unión del ligando.

Se proporcionan detalles de los estudios cristalográficos en los siguientes Ejemplos. Se describen métodos generales para la producción de anticuerpos anti-NRP en este documento y en el Ejemplo 1.

Producción de anticuerpos anti-NRP

La invención en este documento incluye la producción y uso de anticuerpos anti-NRP. Se describen en más detalle métodos ejemplares para generar anticuerpos en las siguientes secciones.

Los anticuerpos anti-NRP se seleccionan usando un antígeno de NRP (por ejemplo, NRP1 y/o NRP2) derivado de una especie de mamífero. Preferiblemente el antígeno es NRP humana (hNRP). Sin embargo, también pueden usarse las NRP de otras especies tales como NRP murina (mNRP) como el antígeno diana. Los antígenos de NRP de diversas especies de mamífero pueden aislarse de fuentes naturales. En otras realizaciones, el antígeno se produce de forma recombinante o se prepara usando otros métodos sintéticos conocidos en la técnica.

El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión suficientemente fuerte para el antígeno de NRP. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a hNRP con un valor de Kd de no más de aproximadamente 5 nM, preferiblemente no más de aproximadamente 2 nM, y más preferiblemente no más de aproximadamente 500 pM. Las afinidades del anticuerpo pueden determinarse mediante un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (tal como el ensayo BIAcore como se describe en los Ejemplos); ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competición (por ejemplo, RIA), por ejemplo.

Además, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y uso pretendido del anticuerpo. Ejemplos incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC (como se describe en los siguientes Ejemplos); ensayos de inhibición de crecimiento de células tumorales (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (patente de Estados Unidos 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (véase el documento WO 95/27062).

Para seleccionar anticuerpos que se unan a un epítopo particular en el antígeno de interés, puede realizarse un ensayo rutinario de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, puede realizarse mapeado de epítopos, por ejemplo como se describe en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

Generación de anticuerpos anti-NRP a partir de bibliotecas de anticuerpos sintéticos en fagos

En una realización preferida, los anticuerpos anti-NRP se seleccionan usando un enfoque de presentación en fagos único. El enfoque implica la generación de bibliotecas de anticuerpos sintéticos en fagos basadas en un único molde flanqueante, el diseño de suficientes diversidades dentro de los dominios variables, la presentación de polipéptidos que tienen los dominios variables diversificados, la selección de anticuerpos candidato con alta afinidad por el antígeno de NRP diana, y el aislamiento de los anticuerpos seleccionados.

Pueden encontrarse detalles de los métodos de presentación en fagos, por ejemplo, en el documento WO03/102157 publicado el 11 de diciembre de 2003.

En un aspecto, las bibliotecas de anticuerpos pueden generarse mutando las posiciones accesibles a disolvente y/o altamente diversas en al menos una CDR de un dominio variable de anticuerpo. Algunas o todas las CDR pueden

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(4): básicos: his, lys, arg;

(5): restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

En otra realización, los sitios seleccionados para modificación son se maduran en afinidad usando presentación en fagos (véase anteriormente).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de secuencia de aminoácidos se preparan por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por casete de un mutante preparado previamente o una versión no mutante del anticuerpo precursor. El método preferido para preparar mutantes es mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488).

En ciertas realizaciones, el mutante de anticuerpo solamente tendrá un único resto de la región hipervariable sustituido. En otras realizaciones, se habrán sustituido dos o más de los restos de la región hipervariable del anticuerpo precursor, por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente diez sustituciones en la región hipervariable.

Normalmente, el mutante de anticuerpo con propiedades biológicas mejoradas tendrá una secuencia de aminoácidos que tendrá al menos un 75 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo precursor, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, y mucho más preferiblemente al menos un 95 %. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en este documento como el porcentaje de restos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo resto) o similares (es decir, un resto de aminoácido del mismo grupo basado en propiedades comunes de la cadena lateral, véase anteriormente) a los restos del anticuerpo precursor, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones, o inserciones N-terminales, C-terminales, o internas en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se entenderá que afecta a la identidad o similitud de secuencia.

Después de la producción del mutante de anticuerpo, se determina la actividad biológica de esa molécula respecto al anticuerpo precursor. Como se ha indicado anteriormente, esto puede implicar la determinación de la afinidad de unión y/u otras actividades biológicas del anticuerpo. En una realización preferida de la invención, se prepara un panel de mutantes de anticuerpo y se selecciona para la afinidad de unión por el antígeno tal como NRP1 o un fragmento de la misma. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados de esta criba inicial se someten opcionalmente a uno o más ensayos adicionales de actividad biológica para confirmar que el mutante o mutantes de anticuerpo con afinidad de unión potenciada son de hecho útiles, por ejemplo para estudios preclínicos.

El mutante o mutantes de anticuerpo así seleccionados pueden someterse a modificaciones adicionales, muchas veces dependiendo del uso pretendido del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden implicar alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión a uno o más polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes tales como las detalladas a continuación. Con respecto a alteraciones de la secuencia de aminoácidos, se han detallado anteriormente modificaciones ejemplares. Por ejemplo, también puede sustituirse cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del mutante de anticuerpo, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden añadirse uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv). Otro tipo de mutante de aminoácidos tiene un patrón alterado de glucosilación. Esto puede conseguirse delecionando uno o más restos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos es normalmente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-Xserina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiamino ácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5hidroxilisina. La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación N-ligada). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación Oligada).

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Vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes

Los anticuerpos anti-Nrp de la invención pueden producirse de forma recombinante, usando técnicas y materiales fácilmente obtenibles.

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-NRP, se aísla el ácido nucleico que lo codifica y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente o sintetiza usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a ADN que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de secuencia señal

El anticuerpo de esta invención puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo nativo, la secuencia señal está sustituida con una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, el líder de factor α (incluyendo líderes del factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En expresión en células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como líderes virales de secreción, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex.

El ADN para dicha región precursora se liga en fase de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Componente de origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que posibilita que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una que posibilita que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede usarse normalmente sólo porque contiene el promotor temprano).

(iii) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas,

o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y por tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otros ejemplo de marcadores adecuados de selección para células de mamífero son aquellos que posibilitan la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR.

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