ES2633297T3 - Anticuerpos monoclonales al factor básico de crecimiento de fibroblastos - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une y neutraliza el factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (FGF2), en el que el mAb es quimérico, humanizado o humano y compite por la unión a FGF2 con, y se une al mismo epítopo que, un anticuerpo producido por el hibridoma PTA-8864, y en el que el mAb inhibe el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón.
Description
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alternativamente, el tratamiento (por ejemplo, quimioterapia estándar) incluyendo el mAb anti-FGF2 puede aumentar la tasa de respuesta completa, la tasa de respuesta parcial o la tasa de respuesta objetiva (completa + parcial) de pacientes con estos tumores (por ejemplo, ovario, mama, pulmón, colon y glioblastomas, especialmente en caso de recaída o refractarios) en al menos 30% o 40%, pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o incluso 100% en comparación con el mismo tratamiento (por ejemplo, quimioterapia) pero sin el mAb anti-FGF2.
Típicamente, en un ensayo clínico (por ejemplo, un ensayo de fase II, fase II/III o fase III), los citados incrementos en la supervivencia media libre de progresión y/o la tasa de respuesta de los pacientes tratados con quimioterapia más el mAb anti-FGF2, en comparación con el grupo de control de pacientes que recibieron quimioterapia sola (o más placebo), son estadísticamente significativos, por ejemplo en el nivel de p = 0,05 ó 0,01 o incluso 0,001. Las tasas de respuesta completa y parcial se determinan mediante criterios objetivos comúnmente utilizados en ensayos clínicos para el cáncer, por ejemplo, según se enumeran o aceptan por el Instituto Nacional del Cáncer y/o la Administración de Alimentos y Fármacos.
4. Los mAb de la invención para su uso en otros métodos
Los mAbs anti-FGF2 de la invención también pueden ser para su uso en un método diagnóstico o pronóstico. Los mAbs anti-FGF2 de la invención también encuentran su uso en métodos de laboratorio. Los mAbs pueden usarse para medir el nivel de FGF2 en un tumor o en la circulación de un paciente con un tumor, para determinar si el nivel es medible o incluso elevado, y por lo tanto seguir y guiar el tratamiento del tumor, ya que los tumores asociados con los niveles medibles o elevados de FGF2 serán más susceptibles al tratamiento con el mAb anti-FGF2. Por ejemplo, un tumor asociado con altos niveles de FGF2 sería especialmente susceptible al tratamiento con un mAb anti-FGF2. En realizaciones particulares, los mAb pueden usarse en un ELISA o radioinmunoensayo para medir el nivel de FGF2, por ejemplo, en una muestra de biopsia de tumor o en suero o en sobrenadante de medios de células secretadoras de FGF2 en cultivo celular. El uso de dos mAbs anti-FGF2 que se unen a diferentes epítopos (es decir, que no compiten por la unión) será especialmente útil en el desarrollo de un ELISA "sandwich" sensible para detectar FGF2. Para diversos ensayos, el mAb puede marcarse con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por centrifugación, enzimas o radioisótopos, y puede proporcionarse en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo de FGF2. En otros usos, los mAbs anti-FGF2 se utilizarán para purificar FGF2, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.
Ejemplos
Ejemplo 1: Reactivos y ensayos
Preparación de GST-FGF2, FGF2-Fc y FGF2-Flag. La secuencia de cDNA para FGF2 humano (la forma precursora con 155 aminoácidos, Sommer et al., 1987) fue sintetizada (GenScript, Inc), amplificada por PCR y clonada en un derivado del vector pDisplay (Invitrogen). Estos plásmidos se transformaron en células BL21 (DE3) de E. coli y se indujo la expresión de FGF2 usando IPTG 1 mM. El nivel de expresión de FGF2 se determinó usando un kit de ELISA específico de FGF2 (R & D Systems), y FGF2 se purificó usando perlas de heparina-Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences) como se describe (Wiedlocha et al., Mol. Cell. Biol. 16: 270, 1996). Las proteínas de fusión de FGF2 con glutamina sintetasa (GST-FGF2) respectivamente, péptido Flag (FGF2-Flag) y dominio Fc de IgG1 humano (aminoácidos de 216 a 446, FGF2-Fc), que se usaron en los ensayos de unión FGF2/FGFR así como para la inmunización, se produjeron de manera similar a partir de las construcciones genéticas apropiadas usando técnicas de biología molecular convencionales. Se purificó GST-FGF2 usando una columna anti-GST, se purificó FGF2-Fc usando una columna de proteína A/G y se usó FGF-Flag en sobrenadante de cultivo después de la determinación de la concentración de FGF2-Flag. Además, se adquirieron FGF2 humano purificado (QED Bioscience Inc.) y FGF2 murino (ProSpec-Tany Technogene Ltd.).
Preparación de proteínas FGFR-Fc. El dominio extracelular (ECD) de FGFR1 alfa humano (IIIc) (designado como FGFR1c) y FGFR2c alfa humano (IIIc) (designado como FGFR2c) se expresaron como moléculas de inmunoadhesina. Fragmentos de ADN que codifican el ECD entero de FGFR1c y FGFR2c se fusionaron a Fc humano a través de un enlazador polipéptido. Estas moléculas de FGFR-Fc se expresaron transfectando células 293F humanas y seleccionando transfectantes 293 estables en presencia de G418 (1 mg/ml) en medio de expresión 293 (Invitrogen). El FGFR-Fc secretado a partir de células transfectadas con 293F se purificó usando una columna de proteína A/G. Además, FGFR3c-Fc humano y la fusión de FGFR4-Fc humano se obtuvieron de R & D Systems.
Síntesis de fragmentos de FGF2. Los péptidos que consisten en los residuos de aminoácidos 29-44 (péptido nº 1), 101-118 (péptido nº 3) y 137-155 (péptido nº 4) de FGF2 fueron sintetizados por SynBioSci. Se añadieron residuos de cisteína adicionales al extremo C del péptido nº1 y nº3 y al extremo N del péptido nº4. Estos fragmentos de péptido se conjugaron a continuación con hemocianina de lapa (KLH).
ELISA de unión a FGF2. Los pocillos del ELISA se revistieron con 50 μg/ml de heparina (Sigma) durante la noche a 4ºC y luego se incubaron con 0,3-1 μg/ml de FGF2 humano o de ratón durante 1 h a temperatura ambiente (RT) para que la heparina pudiera capturar el FGF2. Después de bloquear con BSA al 2% durante 1 hora a TA, se añadieron sobrenadantes de cultivo de hibridoma o mAbs purificados durante 1 hora a TA. Los anticuerpos anti-FGF2 unidos se detectaron mediante la adición de IgG Fc HRP-de cabra anti-ratón durante 1 h a RT, seguido de
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lavado, adición de sustrato TMB (Sigma) y lectura a 450 nm.
ELISA de unión de FGFR-Fc/FGF2-Flag. La actividad de bloqueo de los mAbs anti-FGF2 se determinó en el ELISA de unión a FGFR-Fc/FGF2-Flag. Los pocillos de ELISA se revistieron con 2 μg/ml de anticuerpo de cabra específico para IgG-Fc humano durante la noche a 4ºC. Después de bloquear con BSA al 2% durante 1 h a RT, los pocillos se incubaron con 0,5 μg/ml de FGFR1c-Fc, FGFR2c -Fc, FGFR3c-Fc o FGFR4-Fc durante 1 h. Después del lavado, los pocillos se incubaron con FGF2-Flag (0,2 μg/ml) en presencia de diversas concentraciones de mAbs durante 1 h. El FGF2-Flag unido se detectó mediante la adición del anticuerpo HRP-anti-Flag M2 (Sigma).
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales
Se inmunizaron ratones Balb/c (hembras de 5 a 6 semanas de edad) por inyección en sus patas traseras 14 veces a intervalos de una semana con péptidos sintéticos FGF2 conjugados con GST-FGF2, FGF2-Fc y/o KLH, resuspendidos en MPL/TDM (Sigma -Aldrich), como se describe en la tabla siguiente. Tres días después de la inyección final, las células linfoides poplíteas se fusionaron con células de mieloma de ratón P3/X63-Ag8U1 usando métodos de fusión estándar con polietilenglicol al 35% como se describe (Chuntharapai et al., Methods Enzymol
288: 15, 1997). Diez días después de la fusión, los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se seleccionaron para determinar su capacidad para unirse a FGF2 usando el ELISA de unión a FGF2 descrito anteriormente. Se seleccionaron los mAbs seleccionados para detectar sus actividades de bloqueo en el ELISA de unión a FGFR1Fc/FGF-Flag. Los hibridomas seleccionados se clonaron a continuación dos veces utilizando la técnica de dilución limitativa como se describe (Harlow et al., 1988).
Tabla: Protocolo de inmunización
- Inyección No.
- Antígenos (en MPL/TDM) por almohadilla plantar
- 1
- GST-FGF2 10 μg
- 2
- GST-FGF2 5 μg
- 3
- GST-FGF2 2,5 μg
- 4-7
- GST-FGF2 5 μg
- 8-9
- GST-FGF2 10 μg
- 10
- GST-FGF2 (5 μg) + FGF2-Fc (5 μg)
- 11
- FGF2-Fc (2 μg) + Péptido Nº 1 y Nº 3 (2 μg)
- 12
- FGF2-Fc (2 μg) + Péptido Nº 1, Nº 3 y Nº 4 (3 μg)
- 14
- FGF2-Fc 2 μg
La FIG. 1 muestra que el mAb GAL-F2 generado de esta manera se une tanto al FGF2 humano como al FGF2 de ratón, aproximadamente igual de bien, mientras que un mAb IgG de ratón de control negativo no se une al FGF2. La FIG. 2 muestra que GAL-F2 pero no el mAb de control 5G8 es capaz de inhibir la unión de FGF2 humano a cada uno de los cuatro receptores FGFR1-4 de FGF. En otro experimento utilizando el ELISA de unión a FGFR-Fc/FGF2-Flag, GAL-F2 (a una concentración de 10 μg/ml) inhibió completamente la unión de FGF2 a cada uno de los cuatro FGFRs-FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4-es decir, redujo la señal al nivel de fondo dentro del error experimental, mientras que los mAbs anti-FGF2 bFM-1 y 3H3 redujeron la unión sustancialmente pero no completamente.
Ejemplo 3: Epítopo de GAL-F2
Se compraron varios mAbs anti-FGF2 comercialmente disponibles que se han descrito como que tienen ciertas actividades neutralizantes-3H3 (Calbiochem), mAb bFM-1 (Millipore) y mAb FB-8 (Abcam). Se realizó un ELISA de unión competitiva para determinar si GAL-F2 tiene el mismo epítopo que cualquiera de estos mAbs. Las placas de ELISA se recubrieron con 50 μl/pocillo de heparina (50 μg/ml) durante la noche, se decantaron e incubaron con 50 μl/pocillo de FGF2 durante 1 hora. Después de bloquear con BSA al 2%, los pocillos se incubaron con 0,5 μg/ml de mAb GAL-F2 biotinilado en presencia de varias concentraciones de cada mAb anti-FGF2 a ensayar. El nivel de la unión de GAL-F2 biotinilada al FGF2 en cada pocillo se detectó mediante la adición de HRP-estreptavidina seguido de sustrato de TMB. La FIG. 3 muestra que ninguno de los mAbs 3H3, bFM-1 y FB-8 ni un mAb de ratón de control negativo (mIgG) compitió por la unión a FGF2 con GAL-F2, mientras que, por supuesto, GAL F2 compitió con sí mismo. Por lo tanto, ningún mAb anti – FGF2 anterior probado tiene el epítopo igual o que se superpone en FGF2 como GAL – F2.
Ejemplo 4: Inhibición de la proliferación inducida por FGF2 por GAL-F2
10
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-
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