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ES2435531T3 - Modulación de la capacidad de respuesta a los esteroides - Google Patents

Modulación de la capacidad de respuesta a los esteroides Download PDF

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ES2435531T3
ES2435531T3 ES09167538T ES09167538T ES2435531T3 ES 2435531 T3 ES2435531 T3 ES 2435531T3 ES 09167538 T ES09167538 T ES 09167538T ES 09167538 T ES09167538 T ES 09167538T ES 2435531 T3 ES2435531 T3 ES 2435531T3
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ES
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ES09167538T
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English (en)
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Ann-Kristin Spiik
Robert LÖFBERG
Lisa Charlotta Bandholtz
Oliver Von Stein
Arezou Zargari
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Index Pharmaceuticals AB
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Abstract

Uso de un oligonucleótido que tiene la secuencia 5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 17) para la fabricación de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides, afectado por una condición inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada a un tratamiento anti-inflamatorio, en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m>=0-6, n>=0-6 y en donde al menos un dinucleótido CG no es metilado y dicho oligonucleótido tiene de 8 a 100 ácidos nucleicos de longitud.

Description

Modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de oligonucleotidos para la fabricacion de un medicamento que puede ser utilizado en un metodo para la modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides en un paciente. En particular, la invencion se refiere al uso de tales oligonucleotidos para revertir la resistencia a esteroides o mejorar la capacidad de respuesta a los esteroides en un paciente permitiendo asi, que el sujeto sea tratado con esteroides tales que los esteroides alcancen el efecto anti-inflamatorio deseado.
Antecedentes
La inflamacion es una enfermedad compleja que involucra muchos factores y tipos de celulas. Desde una perspectiva de la enfermedad, muchos aros de investigacion nos han enserado que un trastorno inflamatorio tal como asma, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, y enfermedad de Crohn y otros, tienen un perfil de citoquinas inflamatorias definido. Estos perfiles son el resultado de la naturaleza de los linfocitos de respuesta. En otras palabras, la inflamacion no se puede considerar simplemente como "inflamacion" sino mas bien como diferentes enfermedades inflamatorias asociadas con diferentes citoquinas secretadas que potencian la proliferacion y la diferenciacion de ciertas sub-poblaciones de celulas T auxiliares.
La naturaleza y la magnitud de una respuesta inmunitaria estan dictadas en gran medida por el perfil del antigeno foraneo al cual se ha expuesto el sistema inmunologico. Este evento pone en marcha una serie de eventos que finalmente conducen a la generacion de inmunidad humoral y mediada por las celulas. Estas dos diferentes funciones efectoras se ocasionan por la presencia de dos subpoblaciones de celulas T auxiliares. Como tambien se indica, diferentes enfermedades inflamatorias se pueden separar ya sea como Th1 o Th2, dependiendo del perfil de citoquinas observado.
En condiciones de salud "normales" existe un delicado equilibrio entre las citoquinas pro-inflamatorias tipicas de Th1 y las citoquinas anti-inflamatorias tipicas de Th2. Si este equilibrio se pierde, habra una polarizacion dando como resultado la inflamacion de tipo Th1 o Th2 predominantemente y se producira la manifestacion clinica de la enfermedad.
Algunas formas mas recientes de agentes terapeuticos ahora intentan restaurar el "equilibrio" por ejemplo, en enfermedades del tipo Th1 reduciendo el perfil de citoquinas de Th1 y permitiendo asi que se produzca un perfil mas de Th2 (Neurath et al, 1995; Mannon et al, 2004). En los ultimos 5 aros mas o menos, muchos investigadores han demostrado tanto in vitro como in vivo la validez del uso de oligonucleotidos como agentes inmunoestimuladores en aplicaciones de inmunoterapia. La observacion de que los oligonucleotidos modificados con fosfodiester e incluso con fosforotioato pueden inducir la inmunoestimulacion ha creado un interes creciente en el desarrollo de este efecto como una herramienta terapeutica.
El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimuladores que pueden activar las celulas B y los linfocitos citoliticos naturales, pero el ADN de vertebrados no (revisado en Krieg, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein and A. M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448). Ahora se entiende que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son un resultado de la presencia de dinucleotidos CpG no metilados, en particular contextos de bases (motivos CpG), que son comunes en el ADN bacteriano, pero metilados e insuficientemente representados en ADN de vertebrados (Krieg et al, 1995). Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden ser imitados con oligodesoxinucleotidos (ODN) sinteticos que contienen estos motivos CpG. Tales ODN con CpG tienen efectos altamente estimuladores en leucocitos humanos y murinos, que inducen la proliferacion de las celulas B; la secrecion de citoquinas y de inmunoglobulinas; la actividad litica de los linfocitos citoliticos naturales (NK) y la secrecion del IFN-gamma; y la activacion de las celulas dendriticas (DCs) y otras celulas que presentan antigenos para expresar moleculas coestimualdoras y secretar las citoquinas, especialmente las citoquinas de tipo Th1 que son importantes en la promocion del desarrollo de respuestas de celula T de tipo Th1. Estos efectos inmunoestimuladores del ODN con CpG con esqueleto fosfodiester nativo son altamente especificos para CpG porque se reducen drasticamente los efectos si el motivo CpG se metila, se cambia por un GpC, o de otra manera se elimina o se altera (Krieg et al, 1995 and Hartmann et al, 1999).
En los estudios primarios, se penso que el motivo CpG inmunoestimulador cumple con la formula purina-purinaCpG-pirimidina- pirimidina (Krieg et al, 1995; Pisetsky, 1996 and Hacker et al., 1998).
Actualmente existe una cantidad significativa de los datos publicados que indican que los oligonucleotidos que contienen motivos CpG inducen ciertas citoquinas, por ejemplo, las celulas de raton y humanas responden a los oligonucleotidos con motivo CpG por un aumento de la secrecion del interferon-gamma (IFN-gamma) (Iho et al.,
1999: Cowdery et al., 1996) IL-1, IL-6, TNF-alfa e IL-12 (Stacey et al., 1996; Jakob et al., 1998 and Sparwasser et al., 1998).
Debido a la naturaleza de las citoquinas inducidas, se considera ampliamente que los oligonucleotidos que contienen CpG inducen un perfil de Th1 tanto in vitro como in vivo (Zimmermann et al., 1998; Kline, 2000).
Ademas de la presencia de los motivos CpG, los investigadores tambien han observado que sintetizando los oligonucleotidos con un esqueleto de fosforotioato (PS) resistente a la nucleasa completo, pueden potenciar los efectos estimuladores de los oligonucleotidos, porque estos oligonucleotidos fueron mucho mas potentes en las celulas B estimulantes, mientras que la misma secuencia con esqueleto fosfodiester nativo no tuvo ningun efecto (Zhao et al., 1996). Mientras que la presencia de un motivo CpG dentro de la secuencia de un oligonucleotido puede inducir una fuerte respuesta de la citoquina Th1, esta respuesta debe ser considerada en el contexto general de los compuestos del estado de modificacion quimica asi como la estructura de la secuencia general.
Como ya se indico en la introduccion de los antecedentes a la inflamacion, existe un perfil de citoquinas especifico que se hace prominente en varios tipos de enfermedades inflamatorias. Por ejemplo en pacientes asmaticos existen altos niveles de IL-4 y bajos niveles de IFN-gamma. Esta descripcion de citoquinas indicara que el asma es un tipo Th2 de enfermedad. La artritis reumatoide por el contrario se asocia mejor con un tipo Th1 de la inflamacion caracterizado�oorueese observan niveles altos de IFN-gamma y niveles bajos de IL-4.
El fenomeno de resistencia a los corticosteroides se ha estudiado mas extensamente en pacientes asmaticos y en menor grado en colitis ulcerosa donde la evidencia se ha acumulado a lo largo de los aros, lo que apunta a un numero de anormalidades de la citoquinas. Ambas enfermedades se clasifican como de tipo Th2 y se han implicado los interferones asi como IL-10 como factores importantes en la patogenesis de la resistencia a los corticosteroides.
Puede ser posible que los oligonucleotidos inmunoestimuladores que son capaces de inducir la produccion endogena de tales citoquinas, tales como interferones e IL-10, sean capaces de influenciar el estado inflamatorio de pacientes con resistencia a esteroides o dependientes de los esteroides de manera beneficiosa.
La evidencia de que ciertas citoquinas pueden influenciar la capacidad de respuesta a los esteroides se deduce de los estudios clinicos realizados en asmaticos resistentes a los corticosteroides y pacientes con colitis ulcerosa que tambien estaban todos en terapias con corticosteroides. De hecho, este tipo de caracteristica del subgrupo de pacientes fue el unico denominador comun entre los estudios clinicos descritos a continuacion.
Los interferones (IFNs) juegan papeles cruciales en la regulacion de una amplia variedad de respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los interferones de tipo I (IFN-alfa/beta) son fundamentales para la defensa del huesped contra patogenos tales como virus, mientras que el interferon de tipo II (IFN-gamma) principalmente contribuye con la regulacion mediada por la celula T de las respuestas inmunes (Taniguchi and Takaoka, 2001). Los interferones tambien han encontrado su lugar en el tratamiento exitoso de diferentes enfermedades humanas tales como neoplasia benigna (Gill et al, 1995) y enfermedades virales (Niederau et al, 1996; Zeuzem et al, 2000).
En un estudio (Simon et al, 2003), 10 pacientes con asma resistente a los corticosteroides donde se les administro IFN-alfa (3x106 IU/dia) (Roferon A® Roche) ademas de la dosis de la prednisona que todos estaban recibiendo. El ensayo demostro alta eficacia en estos pacientes y signos clinicos de mejoria que se producian 1-2 semanas despues de la terapia con citoquinas, lo que permite que la dosis de corticosteroides sea reducida. Los autores ademas observaron que el tratamiento con IFN-alfa incremento la capacidad de las celulas T de sangre periferica para producir el IFN-gamma, sugiriendo que habia habido un cambio de una respuesta de tipo Th2 (tipica del asma y enfermedades alergicas) a una respuesta Th1.
Por otra parte, los autores mostraron que tambien hubo un aumento en celulas T en sangre que secretan IL-10, en los pacientes que han recibido terapia con citoquinas. Ya que los corticosteroides median sus efectos antiinflamatorios, en parte, por medio del incremento de los niveles de IL-10, los autores concluyen que la administracion de IFN-alfa exogeno rompio la resistencia a los corticosteroides en estos pacientes.
Musch et al (2002) demostraron una alta tasa de respuesta en pacientes con colitis ulcerosa refractarios a los corticosteroides cuando se les suministra INF-beta i.v. El estudio piloto registro 25 pacientes gravemente enfermos con colitis ulcerosa que se demostraron refractarios a la medicacion basica. Todos los pacientes recibian corticosteroides en el momento del tratamiento con citoquinas. Despues del tratamiento, 22 de los 25 (88%) entraron en remision en 3 semanas con una fuerte disminucion en el indice de actividad clinica (CAI) detectado 1 semana despues de iniciar el tratamiento. La duracion media de respuesta fue de 13 meses.
En otro estudio, Sumer et al, (1995), reportaron una tasa de mejora del 82% al tratamiento con citoquinas IFN-alfa
s.c. en pacientes con colitis ulcerosa resistentes a los corticosteroides. Ademas observaron que los 23 pacientes respondieron a la terapia con citoquinas con una rapida mejoria (en un plazo de 15 dias) y se encontraron en remision clinica y endoscopica completa despues de 6 meses de terapia. Tres pacientes entraron en remision despues de una terapia mas larga; sin embargo, los 26 pacientes se observaron durante mas de 2 aros sin recibir terapia adicional y permanecieron en remision endoscopica y clinica completa durante este periodo.
Otra citoquina que ha recibido interes en la patogenesis de la resistencia a los corticosteroides es la IL-10. Se cree que esta citoquina tiene potentes efectos anti-inflamatorios porque puede suprimir la produccion de citoquinas proinflamatorias. Tambien tiene amplias implicaciones en el desarrollo de ciertas enfermedades inflamatorias, mas notablemente alergia y asma (Hawrylowicz et al, 2005), asi como que juega un papel fundamental en la regulacion de respuestas inmunitarias. Se cree que los corticosteroides ejercen sus efectos anti-inflamatorios, en parte, mediante la mejora de la produccion de IL-10 (Richards et al, 2005).
Numerosos estudios clinicos han indicado que existe una falta general de niveles suficientes de IL-10 en asmaticos que potencialmente pueden contribuir a una inflamacion mas intensa. En un estudio clinico doble ciego aleatorio realizado en niros con asma atopica moderada, Stelmach et al (2002) demostraron que el tratamiento con Triamcinolona, un corticosteroide, y montelukast, un anti-leucotrieno, incrementaba significantemente los niveles de IL-10 en suero sanguineo y ademas mejoraba significantemente los sintomas clinicos.
En otro estudio clinico, se demostro que los niveles de celulas que producen IL-10 e IL-10 se reducen significantemente en pacientes con asma persistente aguda en comparacion con el asma suave (Tomitai et al, 2002). Estas observaciones estuvieron de acuerdo con hallazgos previos de que existe un defecto en la produccion de celulas que son capaces de producir IL-10 en sujetos asmaticos (Tormey et al, 1998).
Tambien se demostro que este defecto existe en pacientes asmaticos resistentes a los corticosteroides. En condiciones normales, los corticosteroides provocaran un incremento en la produccion de IL-10 en pacientes sensibles a los corticosteroides. Sin embargo, Hawrylowicz et al (2002) pudieron confirmar que en pacientes asmaticos resistentes a los corticosteroides, los corticosteroides no logran inducir la sintesis de IL-10. Estas observaciones sugieren un fuerte enlace entre la induccion de sintesis de IL-10 y la eficacia de los corticosteroides.
En un estudio publicado recientemente (Xystrakis et al, 2006), los autores aislaron PBMC de pacientes asmaticos resistentes a los corticosteroides y pudieron demostrar que la adicion de vitamina D3 con dexametasona a estos cultivos mejoraron la sintesis de IL-10 hasta niveles observados en celulas de pacientes sensibles a los corticosteroides cultivadas con dexametasona sola. Adicionalmente, y quizas mas significantemente, el pretratamiento con IL-10 restauro completamente la sintesis de IL-10 en estas celulas en respuesta a la dexametasona.
El uso de la flora bacteriana humana para tratar trastornos gastrointestinales (GI) no es un concepto novedoso, que se practicado periodicamente durante mas de 40 aros (Eiseman et al, 1958). Se han observado mejorias clinicas significantes en numerosos trastornos GI incluyendo enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) (Bennet and Brinkman 1989). Borody et al, reportaron en 2003 que la bacterioterapia humana se podria utilizar para tratar la colitis ulcerosa (UC) resistente a los corticosteroides grave.
En un pequero estudio, a 6 pacientes con UC cronica que han fracasado previamente a terapias estandar con corticosteroides toleradas maximas, se les proporciona un unico enema fecal concomitante a las terapias con corticosteroides que recibian actualmente. Se logro una remision completa de UC en los 6 pacientes despues de la infusion rectal. Los autores tambien seralan que todos los pacientes dejaron la terapia anti-inflamatoria en el plazo de 6 semanas y permanecieron en remision en un caso por hasta 13 aros. El exito aparente de la bacterioterapia en pacientes con colitis ulcerosa resistente, se puede deber a la repoblacion del colon con una flora bacteriana "sana", pero igualmente como los autores sugieren, tambien puede deberse a la instilacion de una gran cantidad de ADN bacteriano, que contiene abundantes motivos CpG, los que inducen un efecto inmunomodulador beneficioso dando como resultado la remision completa de la enfermedad.
Un estudio en asmaticos comparo la respuesta a un esteroide (prednisona) en pacientes tanto resistentes a los esteroides como sensibles a los esteroides. Los pacientes en primer lugar recibieron un periodo de "lavado" de una semana antes de la administracion del esteroide. Los perfiles de citoquinas antes de la administracion y 1 semana despues indicaron que los pacientes que responden al esteroide pasaron un tipo Th2 a un estado mas similar a Th1. Por el contrario, los pacientes que no lograron responder al esteroide administrado permanecieron en el tipo Th2 (Naseer et al., 1997).
Si bien la razon de resistencia a esteroides en pacientes asmaticos no esta totalmente clara, numerosos estudios en humanos han indicado que aquellos pacientes que son resistentes a los esteroides tienen altos niveles persistentes de IL-2/4 que no son suprimidos por la accion de los esteroides. Adicionalmente, estudios in vitro indican que cuando IL-2/4 se coloca en el medio de cultivo, las celulas se vuelven resistentes a la accion de los esteroides (Sousa AR et al., 2000; Hamid QA et al., 1999).
En la artritis reumatoide, se ha sugerido un escenario similar en cuanto a que los pacientes resistentes a los esteroides demuestran niveles altos de IL-4, que no pueden ser reducidos cuando se exponen a esteroides (Chikanza et al., 2004). De interes son los hallazgos de que INF-gamma es capaz de inhibir la expresion de las respuestas de IL-4 (Eui-Young et al., 2000; Smeltz et al., 2002) al nivel de la transcripcion.
El uso de oligonucleotidos inmunomoduladores para tratar enfermedades inflamatorias previamente se ha discutido en US 2003/0087848 y en US 2003/0050268. US 2003/0087848 se refiere al uso de oligonucleotidos inmunomoduladores para la prevencion o tratamiento de asma y alergia. En particular, el documento revela una terapia de combinacion mediante la cual un medicamento para el asma/alergia se administra junto con unos acidos nucleicos inmunomoduladores para reducir sinergisticamente la respuesta inflamatoria o inmunologica cuando se encuentra un mediador de asma o alergia. La refractariedad del esteroide no se discute en US 2003/0087848.
US 2003/0050268 revela el uso de acidos nucleicos inmunoestimuladores para el tratamiento de enfermedades inflamatorias no- alergicas. Los acidos nucleicos inmunoestimuladores comprenden motivos ricos en T, CpG y/o poliG. Los nucleotidos que comprenden tales motivos no son para mostrar propiedades especificas. El documento revela mas de miles de secuencias pero no comprende los ejemplos de trabajo que ejercen el efecto asumido o la orientacion de como se pueden identificar los oligonucleotidos efectivos.
La dependencia o resistencia a esteroides sigue siendo un problema clinico importante para un gran numero de pacientes afectados por enfermedades inflamatorias puesto que las terapias actuales se basan en el uso de potentes inmunomoduladores que pueden inducir graves efectos secundarios. Un metodo directo y sencillo para potenciar la eficacia de esteroides en un individuo que no responde a los esteroides con poco riesgo de efectos secundarios no deseados mejoraria esencialmente el tratamiento anti-inflamatorio, mejorando asi la enfermedad en cuestion, y aumentando la calidad y la duracion de la vida para un gran numero de pacientes.
Resumen de la invencion
La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que los oligonucleotidos se pueden utilizar para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides o dependiente de esteroides, afectado por una condicion inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada a un tratamiento anti-inflamatorio o existe una incapacidad para independizar el nivel bajo de dosificacion del tratamiento antiinflamatorio.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere al uso de un oligonucleotido para la fabricacion de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides afectado por una condicion inflamatoria, que no responde o responde poco o de manera inadecuada al tratamiento anti-inflamatorio. Dicho oligonucleotido que tiene la secuencia 5'-Xm- GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 17), en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m=0-6, n=0-6 y en donde al menos un dinucleotido CG no esta metilado y en donde dicho oligonucleotido tiene de 8 a 100 nucleotidos de longitud.
Descripcion de las figuras
Figura 1 es un grafico que muestra el numero de celulas que producen IL-10 en respuesta a 48 hrs de estimulacion con DIMS0150 en PBMC de cinco (n=5) donantes sanos diferentes analizados mediante ELISpot. Se incubaron PBMC en medio (basal) o con concentraciones crecientes (0.1, 1, 5, 10, 25, 100, 150 o 200 !M) del DIMS0150 que contiene CpG o, o su control con GpC IDX0526, o los ODNs con CpG, IDX0910 (0.1 o 10 !M) e IDX0900 (3 !M) durante 48 horas antes de la deteccion de manchas positivas de IL-10. Cada barra del histograma representa los resultados promedio de cinco donantes de sangre diferentes. Las muestras se realizaron y se analizaron por triplicado para cada experimento/donante de sangre. Tener en cuenta que IDX0900 fue probado en tres individuos (n=3).
Figura 2 es un grafico que muestra el numero de celulas que producen IFN-gamma en respuesta a 72 hrs de estimulacion con DIMS0150 de PBMC de cinco (n=5) diferentes donantes, segun se analiza por medio de ELISpot. Se incubaron PBMC en medio (basal) o con concentraciones crecientes (0.1, 1, 5, 10, 25, 50 100, 150 o 200 !M) del DIMS0150 que contiene CpG, o su control GpC IDX0526, o los ODNs con CpG IDX0910 (a 0. 1 !M) y IDX0900 (a 3 !M), durante 72 horas antes de la deteccion de manchas positivas de IFN-gamma. Cada barra del histograma representa los resultados promedio de cinco diferentes donantes de sangre. Las muestras se realizaron y se analizaron por triplicado para cada experimento/donante de sangre. Tener en cuenta que IDX0900 fue probado en tres individuos (n=3).
Figura 3 es un grafico que muestra el numero de celulas que producen IFN-alfa en respuesta a DIMS0150 en 48 hrs en PBMC de diez (n=10) donantes sanos diferentes como se evalua por ELISpot. Se incubaron PBMC en medio (basal) o con concentraciones crecientes (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150 o 200 !M) del DIMS0150 que contiene CpG,
o su control con GpC IDX0526 (n=9) o el ODN con CpG IDX0910 (0. 1 !M o 10 !M) durante 48 horas antes de la deteccion de manchas positivas de IFN-alfa. Cada barra del histograma representa los resultados promedio de diez diferentes donantes de sangre. Las muestras se realizaron y se analizaron por triplicado para cada experimento/donante de sangre. Tener en cuenta que IDX0910 a 0,1 !M fue probado en ocho donantes y 10 !M fueron probados en cuatro individuos.
Figura 4A es un grafico que muestra la produccion de IL-10 en respuesta a 48 hrs de estimulacion con DIMS0150 como se cuantifica por ELISA. Se incubaron PBMC con concentraciones crecientes (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150 o 200 !M) de DIMS0160 o su control GpC IDX0526. Como controles, las celulas se dejaron en medio (basal) o se trataron con ODNs con CpG IDX0910 (0.1!M) y IDX0900 (3!M). Este grafico representa los resultados de un experimento en PBMC de uno de dos donantes realizados y analizados por duplicado.
Figura 4B es un grafico que muestra la produccion de IFN-gamma en respuesta a 48 hrs de estimulacion con DIMS0150 como se cuantifica por ELISA. Se incubaron PBMC con concentraciones crecientes (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 o 300 !M) de DIMS0150 o su control con GpC IDX0526. Como controles, las celulas se dejaron en medio (basal) o se trataron con ODNs con CpG, IDX0910 (0.1 !M y1 !M) o IDX0900 (3 !M). Este experimento se realizo en celulas de un donante de sangre y cada muestra se realizo y se analizo por duplicado.
Figura 4C es un grafico que muestra la produccion de IFN-alfa en respuesta a 48 hrs de estimulacion con DIMS0150 como se cuantifica por ELISA. Se incubaron PBMC con diferentes concentraciones (0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 o 300 !M) de DIMS0150 o su control con GpC IDX0526. Como controles, las celulas se dejaron en medio (basal) o se trataron con ODNs con CpG, IDX0910 (0.1 !M y1 !M) y IDX0900 (3 !M). Este grafico representa los resultados de un experimento realizado y analizado por duplicado, en PBMC de uno de dos donantes.
Figura 5 es un grafico que muestra la comparacion de la produccion de IL-10 en PBMC humanas con estimulacion con una variedad de ODNs con CpG y sus controles invertidos como se cuantifica por ELISA. Se trataron las PBMC con concentraciones crecientes (de izquierda a derecha, como se indica por el triangulo: 0.1, 1,10 o 100 !M) de los ODNs de DIMS0150, IDX0250, IDX0920 y IDX 0910 y su respectivo control negativo ODNs con GpC junto con el ODN que no contiene CpG IDX0304, durante 48 horas antes de la recoleccion de los sobrenadantes y su posterior analisis. Las celulas que se dejaron sin tratar en medio mostraron el nivel basal de IL-10 en PBMC. Se recolectaron los sobrenadantes despues de 48 horas seguidos por su posterior analisis. Este experimento se llevo a cabo en las celulas de un donante de sangre y todas las muestras se realizaron y se analizaron por duplicado.
Figura 6 es un grafico que muestra la comparacion de la produccion de IFN-gamma en PBMC humanas con estimulacion con una variedad de ODNs con CpG como se cuantifica por ELISA. Se trataron las PBMC con concentraciones crecientes (de izquierda a derecha, como se indica por el triangulo: 0.1, 1, 10 o 100 !M) de los ODNs de DIMS0150, IDX0250, IDX0920 y IDX 0910 y sus respectivos controles negativos de ODNs con GpC junto con el ODN que no contiene CpG IDX0304, durante 48 horas antes de la recoleccion de sobrenadantes y su posterior analisis. Las celulas se que se dejaron sin tratar en medio mostraron el nivel basal de IFN-gamma en PBMC. Se recolectaron los sobrenadantes despues de 48 horas seguidas por su posterior analisis. Este experimento se llevo a cabo en celulas de un donante de sangre y todas las muestras se realizaron y se analizaron por duplicado.
Figura 7 es un grafico que muestra la produccion de IFN-gamma a partir de esplenocitos de raton en respuesta a 48 hs de estimulacion con CpG como se cuantifica por ELISA. Los esplenocitos de raton se trataron con concentraciones crecientes (de izquierda a derecha, como se indica por los triangulos: 0.1, 1, 10 o 100 !M) de ODNs de DIMS0150, IDX0250, IDX0920, IDX0910 y sus respectivos controles negativos ODNs con GpC en comparacion con el control de ODN que no contiene CpG IDX0304, durante 48 horas antes de la recoleccion de sobrenadantes y su posterior analisis. Las celulas que se dejaron sin tratar en medio mostraron el nivel basal de IFN-gamma en los esplenocitos. Se recolectaron los sobrenadantes despues de 48 horas de estimulacion, seguidas por el analisis posterior. Tener en cuenta que este experimento se realizo en celulas del bazo de raton y todas las muestras se realizaron y se analizaron por duplicado.
Figura 8 es un grafico que muestra la produccion de IL-10 a partir de esplenocitos de raton en respuesta a 48 hs de estimulacion con CpG como se cuantifica por ELISA. Los esplenocitos de raton se trataron con concentraciones crecientes (de izquierda a derecha, como se indica por el triangulo: 0.1, 1, 10 o 100 !M) de los ODNs de DIMS0150, IDX0250, IDX0920 y IDX 0910 y sus respectivos controles negativos ODNs con GpC junto con el ODN que no contiene CpG IDX0304 durante 48 horas antes de la recoleccion de sobrenadantes y su posterior analisis. Las celulas que se dejaron sin tratar en medio mostraron el nivel basal de IL-10 en los esplenocitos. Se recolectaron los sobrenadantes despues de 48 horas seguidas por su posterior analisis. Este experimento se llevo a cabo en celulas del bazo de raton y todas las muestras se realizaron y se analizaron por duplicado.
Figura 9A y B muestra la IL-10 liberada de PBMC humanas en respuesta a DIMS0150 y versiones truncadas de SEQ.ID.NO.1 como se describe en la tabla 1.
Figura 10A y B muestra la IL-10 y IL-6 liberada de PBMC humanas pre-incubadas con diferentes concentraciones de cloroquina en respuesta a la estimulacion con los compuestos de CpG y los controles, respectivamente.
Descripcion detallada
Como se utiliza en este documento, los terminos "resistente a esteroides" y "refractario a esteroides" se refiere a pacientes que tienen enfermedades inflamatorias en los que la administracion de un tratamiento con esteroides, por lo general efectivo en pacientes que tienen dichas enfermedades, no es efectivo. En este contexto los pacientes "resistentes a los esteroides" y "refractarios a esteroides" incluyen, pero no se limitan a, pacientes que no responden
o responden poco o de manera inadecuada segun se evalua por parametros fisiologicos apropiados comunes a esteroides administrados por via topica o sistemica. Se han descrito dos tipos de pacientes resistentes a los esteroides i.e. resistencia adquirida a los esteroides (Tipo I) y resistencia primaria a los esteroides (Tipo II), ambos de los cuales estan comprendidos en la presente invencion.
Como se utiliza en este documento, el termino "dependencia a esteroides", se refiere a pacientes con la incapacidad de dejar de depender del tratamiento de esteroides administrados por via topica o sistemica.
Las referencias que describen la actividad inmunoestimuladora de los polinucleotidos incluyen, pero no se limitan a, Krug et al. (2001); Bauer et al. (2001); Klinman et al. (1999); Jahn-Sohmld et al. (1999) y Tighe et al. (2000).
Las referencias adicionales que describen secuencias inmunoestimuladoras incluyen: Tokunaga et al. (1992); Yamamoto et al. (1992) y EP 468,520; WO 96/02555; WO 97/28259; WO 98/16247; US Pat. Nos. 6,339,068, 6,406,705, 6,426,334 y 6,426,336.
Para los propositos de la invencion, el termino "oligonucleotido" se refiere a un polinucleosido formado de una pluralidad de unidades de nucleosidos individuales enlazadas. Tales oligonucleotidos se pueden obtener de fuentes de acidos nucleicos existentes, incluyendo genomicos o ADNc, pero preferiblemente se producen por metodos sinteticos. Los residuos de nucleosidos se pueden acoplar entre si por medio de cualquiera de los numerosos enlaces internucleosidos conocidos. Tales enlaces internucleosidos incluyen, sin limitacion, el enlace fosfodiester internucleosidico natural o internucleosidos modificados de hecho tales como, pero no limitado a, enlaces internucleosidos con fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioeter, fosforamidato en puente, fosfonato de metileno en puente, fosforotioato en puente, y sulfona. El termino "oligonucleotido" tambien abarca los polinucleosidos que tienen uno o mas enlaces internucleosidos esteroespecificos (por ejemplo, enlaces (Rp)-o (Sp)fosforotioato, alquilfosfonato, o fosfotriester). Como se utiliza en este documento, los terminos "oligonucleotido" y "dinucleotido" expresamente tienen la intencion de incluir los polinucleosidos y los dinucleosidos que tienen cualquier enlace internucleosido, tanto si el enlace comprende un grupo fosfato como si no. En ciertas modalidades preferidas, estos enlaces internucleosidos pueden ser enlaces fosfodiester, fosforotioato, o fosforoditioato, o combinaciones de estos.
El termino "oligonucleotido" tambien abarca los polinucleosidos que tienen sustituyentes adicionales incluyendo, sin limitacion, grupos de proteina, grupos lipofilicos, agentes intercalantes, diaminas, acido folico, colesterol y adamantano. El termino "oligonucleotido" tambien abarca cualquier otra polimero que contiene una nucleobase, incluyendo, sin limitacion, acidos nucleicos peptidicos (PNA), acidos nucleicos peptidicos con grupos fosfato (PHONA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), oligonucleotidos con esqueleto morfolino, y oligonucleotidos que tienen secciones de esqueleto con ligadores alquilo o ligadores amino.
Los oligonucleotidos de la invencion pueden incluir nucleosidos de origen natural, nucleosidos modificados, o mezclas de estos. Como se utiliza en este documento, el termino "nucleosido modificado" es un nucleosido que incluye una base heterociclica modificada, una fraccion de azucar modificada, o una combinacion de estos. En algunas modalidades, el nucleosido modificado es un nucleosido de purina o pirimidina no-natural, como se describe en este documento. En algunas modalidades, el nucleosido modificado es un ribonucleosido 2'-sustituido, un arabinonucleosido o un 2'- desoxi-2'-sustituido-arabinosido.
El termino "oligonucleotido" incluye oligonucleotidos hibridos o quimericos. Un "oligonucleotido quimerico" es un oligonucleotido que tiene mas de un tipo de enlace internucleosido dentro de su estructura de secuencia. Un ejemplo preferido de dicho oligonucleotido quimerico es un oligonucleotido quimerico que comprende una region fosforotioato, fosfodiester o fosforoditioato y enlaces no-ionicos tales como enlaces alquilfosfonato o alquilfosfonotioato (Pederson et al. U. S. Patent Nos. 5,635, 377 and 5,366, 878).
Un "oligonucleotido hibrido" es un oligonucleotido que tiene mas de un tipo de nucleosido. Un ejemplo preferido de dicho oligonucleotido hibrido comprende una region ribonucleotido o 2'-sustituido-ribonucleotido, y una region desoxiribonucleotido (Metelev and Agrawal, U. S. Patent No. 5,652, 355,6, 346,614 and 6,143,881).
Para los propositos de la invencion, el termino "oligonucleotido inmunomodulador" se refiere a un oligonucleotido como se describe anteriormente que induce una respuesta inmunitaria ya sea estimulando el sistema inmunologico o bien reprimiendo el sistema inmunologico o ambos en un organismo cuando se administra a un vertebrado, tal como un mamifero. Como se utiliza en este documento, el termino "mamifero" incluye, sin limitacion las ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado bovino, vacas, cerdos, conejos, primates no-humanos, y seres humanos.
Preferiblemente, el oligonucleotido inmunomodulador comprende al menos un fosfodiester de origen natural, o un enlace internucleosido fosforotioato, o fosforoditioato modificado, sin embargo los enlaces preferidos o de hecho modificaciones del esqueleto incluyendo, sin limitacion, metilfosfonatos, metilfosfonotioatos, fosfotriesteres, fosfotiotriesteres, fosforotioatos, fosforoditioatos, profarmacos con triester, sulfonas, sulfonamidas, sulfamatos, formacetal, N-metilhidroxilamina, carbonato, carbamato, morfolino, boranofosfonato, fosforamidatos, especialmente amino-fosforamidatos primarios, fosforamidatos-N3 y fosforamidatos-N5, y enlaces estereospecificos (por ejemplo, enlaces (Rp)-o (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonato, o fosfotriester).
El termino "respuesta inmunomoduladora" describe el cambio de una respuesta inmunitaria cuando se expone a un oligonucleotido inmunomodulador. Este cambio por lo general se mide a traves de la liberacion de ciertas citoquinas tales como interferones asi como otros parametros fisiologicos tales como proliferacion. La respuesta igualmente puede ser una que sirve para estimular el sistema inmunologico asi como para reprimir el sistema inmunologico dependiendo de las citoquinas inducidas por el oligonucleotido inmunomodulador en cuestion.
En algunas modalidades, el oligonucleotido inmunomodulador comprende un dinucleotido inmunoestimulador de formula 5'-Pyr-Pur-3', en donde Pyr es un nucleosido pirimidina natural o sintetico y Pur es un nucleosido purina natural o sintetico. En algunas modalidades preferidas, el oligonucleotido inmunomodulador comprende un dinucleotido inmunoestimulador de formula 5'-Pur*-Pur-3', en donde Pur* es un nucleosido purina sintetico y Pur es un nucleosido purina natural o sintetico. En diferentes lugares el dinucleotido se expresa como RpG, C*pG o YZ, en cuyo caso respectivamente, R, C*, o Y representan una purina sintetica. Una purina sintetica particularmente preferida es 2-oxo-7- deaza-8-metilpurina. Cuando esta purina sintetica esta en la posicion Pur* del dinucleotido, se supera la especificidad de la especie (dependencia de secuencia) del efecto inmunoestimulador y se mejora el perfil de citoquina. Como se utiliza en este documento, el termino "nucleosido de pirimidina" se refiere a un nucleosido en donde el componente base del nucleosido es una nucleobase monociclica. Del mismo modo, el termino "nucleosido de purina" se refiere a un nucleosido en donde el componente base del nucleosido es una nucleobase biciclica. Para los propositos de la invencion, un nucleosido de pirimidina o purina "sintetico" incluye una base de purina o pirimidina de origen no-natural, una fraccion de azucar de origen no-natural, o una combinacion de estos.
En algunas modalidades, la fraccion de azucar del nucleosido puede ser una fraccion de azucar de origen nonatural. Para los propositos de la presente invencion, una "fraccion de azucar de origen natural" es una fraccion de azucar que ocurre naturalmente como parte de un acido nucleico, por ejemplo, ribosa y 2'- desoxiribosa, y una "fraccion de azucar de origen no-natural" es cualquier azucar que no ocurre naturalmente como parte de un acido nucleico, pero que puede ser utilizada en el esqueleto por un oligonucleotido, por ejemplo pero no limitado a hexosa. La arabinosa y los derivados de arabinosa son ejemplos de fracciones de azucar preferidos.
Las fracciones inmunoestimualdoras preferidas de acuerdo con la invencion ademas incluyen nucleosidos que tienen modificaciones de azucar, incluyendo, sin limitacion, azucares de pentosa 2'-sustituida incluyendo, sin limitacion, 2'-O-metilribosa, 2'-O-metoxietil-ribosa, 2'-O-propargilribosa, y 2'-desoxi-2'-fluororibosa; azucares de pentosa 3'-sustituida, incluyendo, sin limitacion, 3'-O-metilribosa ; 1', 2'-didesoxiribosa; arabinosa; azucares de arabinosa sustituida, incluyendo, sin limitacion,1'-metilarabinosa, 3'-hidroximetilarabinosa, 4'-hidroximetilarabinosa, 3'-hidroxiarabinosa y azucares de arabinosa 2'-sustituida; azucares de hexosa, incluyendo, sin limitacion, 1,5anhidrohexitol; y alfa-anomeros.
En otra modalidad, las fracciones inmunoestimuladoras preferidas de acuerdo con la invencion ademas incluyen oligonucleotidos que tienen otras modificaciones y sustituciones del esqueleto de carbohidrato, incluyendo acidos nucleicos peptidicos (PNA), acidos nucleicos peptidicos con grupos fosfato (PHONA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), oligonucleotidos con esqueleto de morfolino, y oligonucleotidos que tienen secciones del ligador del esqueleto que tiene una longitud de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms, incluyendo sin limitacion, ligadores alquilo o ligadores amino. El ligador alquilo puede ser ramificado o sin ramificar, sustituido o no sustituido, y quiralmente puro o una mezcla racemica. Mas preferiblemente, tales ligadores alquilo tienen aproximadamente 2 a aproximadamente 18 atomos de carbono. En algunas modalidades preferidas tales ligadores alquilo tienen aproximadamente 3 a aproximadamente 9 atomos de carbono. Algunos ligadores alquilo incluyen uno
o mas grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, amino, tiol, tioeter, eter, amida, tioamida, ester, urea, y tioeter. Algunos ligadores alquilo funcionalizados son ligadores poli (etilenglicol) de formula-0- (CH2CH2-O-), (n =1-9). Algunos otros ligadores alquilo funcionalizados son peptidos o aminoacidos.
En modalidad preferida adicional, las fracciones inmunoestimuladoras de acuerdo con la invencion ademas incluyen isoformas de ADN, incluyendo, sin limitacion, -L-desoxiribonucleosidos y a-desoxiribonucleosidos. Las fracciones inmunoestimualdoras preferidas de acuerdo con la invencion incorporan modificaciones en 3', y ademas incluyen nucleosidos que tienen posiciones de enlace de internucleosido no-natural, incluyendo, sin limitacion, enlaces 2'-5', 2'-2', 3'-3'y 5'- 5'.
El oligonucleotido inmunomodulador de acuerdo con la invencion comprende al menos cinco nucleosidos unidos a traves de un enlace internucleosido o un azucar o nucleobase funcionalizada a traves de un ligador no-nucleotidico. Para los propositos de la invencion, un "ligador no-nucleotidico" es cualquier fraccion que puede estar unida a los oligonucleotidos por medio de enlaces covalentes o no-covalentes.
Los enlaces no-covalentes incluyen, pero no se limitan a, interaccion electrostatica, interaccion hidrofoba, interaccion de apilamiento, y enlace de hidrogeno. El termino "ligador no-nucleotidico" no tiene la intension de hacer referencia a un enlace internucleosido, como se describe anteriormente, por ejemplo un grupo funcional fosfodiester, fosforotioato, o fosforoditioato, que directamente conecta los grupos 3'-hidroxilo de dos nucleosidos. Para los propositos de esta invencion, un enlace 3'-3' directo (sin involucrar un ligador) se considera que es un "enlace nucleotidico".
En algunas modalidades, el ligador no-nucleotidico es un metal, incluyendo, sin limitacion, particulas de oro. En algunas otras modalidades, el ligador no-nucleotidico es una perla de polimero biodegradable soluble o insoluble.
En incluso otras modalidades, el ligador no-nucleotidico es una fraccion organica que tiene grupos funcionales que permiten la union con el oligonucleotido. Tal union preferiblemente es mediante cualquier enlace covalente estable.
En algunas modalidades, el ligador no-nucleotidico es una biomolecula, incluyendo, sin limitacion, polipeptidos, anticuerpos, lipidos, antigenos, alergenos, y oligoscaridos. En algunas otras modalidades, el ligador no-nucleotidico es una molecula pequera. Para los propositos de la invencion, una molecula pequera es una fraccion organica que tiene un peso molecular de menos de 1,000 Da.
En algunas modalidades, la molecula pequera es un hidrocarburo alifatico o aromatico, cualquiera de los cuales opcionalmente pueden incluir, ya sea en la cadena lineal que conecta los oligonucleotidos o unidos a este, uno o mas grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, amino, tiol, tioeter, eter, amida, tioamida, ester, urea, y tiourea. La molecula pequera puede ser ciclico o aciclico. Ejemplos de ligadores de molecula pequera incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos, carbohidratos, ciclodextrinas, adamantano, colesterol, haptenos y antibioticos. Sin embargo, para propositos de la descripcion del ligador no-nucleotidico, el termino "molecula pequera" no tiene la intension de incluir un nucleosido.
En algunas modalidades, el ligador de molecula pequera es glicerol o un homologo del glicerol de la formula HO(CH2) o- CH (OH)- (CH2) p-OH, en donde o y p independientemente son numeros enteros de 1 a aproximadamente 6, de 1 a aproximadamente 4, o de 1 a aproximadamente 3. En algunas otras modalidades, el ligador de molecula pequera es un derivado de 1, 3-diamino-2-hidroxipropano. Algunos de tales derivados tienen la formula HO-(CH2) m-C (O) NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-m-OH, en donde m es un numero entero de 0 a aproximadamente 10, de 0 a aproximadamente 6, de 2 a aproximadamente 6, o de 2 a aproximadamente 4.
A menudo, se prefieren los oligonucleotidos modificados o sustituidos con respecto a las formas nativas debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorcion celular mejorada, afinidad mejorada para la diana del acido nucleico y aumento de la estabilidad en la presencia de nucleasas. Un oligonucleotido habitualmente esta compuesto de mas de dos (2), y por lo general mas de diez (10) y hasta cien (100) o mas desoxiribonucleotidos o ribonucleotidos, aunque preferiblemente entre aproximadamente ocho (8) y aproximadamente cuarenta (40), mas preferiblemente entre aproximadamente ocho (8) y aproximadamente veinte (20). El tamaro exacto dependera de muchos factores, que a su vez dependen del uso o la funcion final del oligonucleotido. El oligonucleotido se puede generar de cualquier manera, incluyendo sintesis quimica, replicacion de ADN, transcripcion inversa, o una combinacion de estos.
Los oligonucleotidos se pueden administrar mediante cualquier ruta de administracion apropiada, tal como, pero no limitado a, administracion por inhalacion, oftalmica, intranasal, parenteral, oral, intradermica y rectal. Si el paciente tambien esta en tratamiento con esteroides u otros tratamientos anti-inflamatorios, tal como el uso de inmunomoduladores, los esteroides e inmunomoduladores se pueden administrar junto con los oligonucleotidos o por separado. La ruta de administracion de los oligonucleotidos es independiente de la ruta de administracion de esteroides.
La frase "cantidad efectiva terapeuticamente" como se utiliza en este documento se refiere a una cantidad suficiente para potenciar la eficacia de los esteroides hasta cierto grado beneficioso, preferiblemente para potenciarla en al menos aproximadamente el 30 por ciento, mas preferiblemente en al menos el 50 por ciento, e incluso mas preferible en al menos el 90 por ciento. Mas preferiblemente se trata la resistencia a esteroides.
El termino "esteroide" se utiliza para abarcar ambos corticosteroides y glucocorticosteroides. El termino "oligonucleotido que contiene CG" se utiliza para abarcar un oligonucleotido que tiene al menos un dinucleotido CG no metilado dentro de su longitud de secuencia completa y que preferiblemente tiene una longitud de 8 a 100 bases de acido nucleico.
La expresion "potenciar la eficacia de los esteroides" se utiliza en el documento para abarcar un efecto ahorrador de esteroides, evidente como una situacion clinica en la que se demuestra que un tratamiento simultaneo o secuencial con un oligonucleotido que contiene CG, preferiblemente un tratamiento previo, reduce la dosis necesaria de esteroides para tratar la inflamacion. La expresion "potenciar la eficacia de los esteroides" tambien tiene la intension de abarcar un uso sinergico de un oligonucleotido que contiene CG y un esteroide, o bien simultaneamente o de manera sustancial simultanea, o secuencialmente o de manera sustancial simultaneamente, mostrando que reduce la dosis necesaria de esteroides para tratar la inflamacion. Las expresiones "resistencia a esteroides" o "refractario a esteroides" se utilizan para abarcar un paciente que no logra responder adecuadamente a un regimen terapeutico actual que se considera que es normalmente efectivo y suficiente para tratar la enfermedad en cuestion. La expresion "dependiente de esteroides" se utiliza para abarcar un paciente con una incapacidad observada de dejar de depender de la terapia actual sin comprometer el estado del paciente o aumentar la severidad de los sintomas de la enfermedad en cuestion.
En un aspecto, la invencion provee las formulaciones farmaceuticas que comprenden un oligonucleotido inmunomodulador, de acuerdo con la invencion y un portador fisiologicamente aceptable. Como se utiliza en este documento, el termino "fisiologicamente aceptable" se refiere a un material que no interfiere con la eficacia del oligonucleotido inmunomodulador y es compatible con un sistema biologico tal como una celula, un cultivo celular, un tejido, un organismo. Preferiblemente, el sistema biologico es un organismo vivo, tal como un vertebrado.
Como se utiliza en este documento, el termino "portador" abarca cualquier excipiente, diluente, carga, sal, solucion reguladora, estabilizante, solubilizante, lipido, u otro material bien conocido en la tecnica para su uso en formulaciones farmaceuticas. Se entendera que las caracteristicas del portador, el excipiente, o el diluente dependeran de la ruta de administracion para una aplicacion particular. La preparacion de formulaciones farmaceuticamente aceptables que contienen estos materiales se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.
La concentracion de un oligonucleotido de inmunomodulacion en una mezcla farmaceuticamente aceptable variara dependiendo de varios factores, incluyendo la dosificacion del compuesto que sera administrado, las caracteristicas farmacocineticas del o los compuestos empleados, la edad, sexo y condicion del paciente, asi como la ruta de administracion. Cantidades efectivas de oligonucleotidos de inmunomodulacion para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente resistente a esteroides o dependiente de esteroides oscilaran ampliamente entre aproximadamente 0.01 !g a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal, preferiblemente aproximadamente
0.1 !g a aproximadamente 10 mg, y mas preferiblemente aproximadamente 1 !g a aproximadamente 5 mg por kg de peso corporal de un mamifero receptor.
Para los propositos de este aspecto de la invencion, el termino "en combinacion con" significa en el transcurso del tratamiento de la misma enfermedad en el mismo paciente, e incluye administrar el oligonucleotido inmunomodulador en cualquier orden, incluyendo la administracion simultanea, asi como orden espaciada temporalmente de hasta varios meses aparte. Tal tratamiento de combinacion tambien puede incluir mas de una unica administracion del oligonucleotido inmunomodulador. Mas preferible, el oligonucleotido inmunomodulador de la invencion se administra a un paciente resistente a esteroides o dependiente de esteroides despues de que ese paciente haya iniciado una terapia con esteroides, y este en un regimen de dosificacion estable.
En una modalidad, la presente invencion se refiere al uso de un oligonucleotido para la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides, afectado por una condicion inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada al tratamiento anti-inflamatorio. Un oligonucleotido que tiene la formula de secuencia:
5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. NO. 17) se administra en una cantidad efectiva al paciente, en donde X es A, T, C
o G, Y es A, T, C o G, m=0-6, n=0-6 y en donde al menos un dinucleotido CG no es metilado y dicho oligonucleotido tiene de 8-100 acidos nucleicos de longitud. El oligonucleotido tambien puede tener las siguientes formulas:
5'-Xm-AGTTCGTCC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 16), en donde m=0-5 y n=0-5;
5'-Xm-CAGTTCGTCCA-Yn-3' (SEQ. ID. No. 15), en donde m=0-4 y n=0-4;
5'-Xm-ACAGTTCGTCCAT-Yn-3' (SEQ. ID. No. 14), en donde m=0-3 y n=0-3;
5'-Xm-AACAGTTCGTCCATG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 13), en donde m=0-2 y n=0-2; o 5'-Xm-GAACAGTTCGTCCATGG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 12), en donde m=0-1 y n=0-1;
En una modalidad el oligonucleotido tiene la formula:
5'-GGAACAGTTCGTCCATGGC-3' (SEQ. ID. No. 1)
Los oligonucleotidos que van a utilizarse de acuerdo con la presente invencion tambien se muestran a modo de ejemplo en la Tabla 1.
En un metodo la administracion de los oligonucleotidos utilizados de acuerdo con la presente invencion, el paciente esta actualmente en tratamiento con corticosteroides o el paciente esta actualmente con tratamiento antiinflamatorio.
El metodo es para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente afectado por una condicion inflamatoria. La condicion inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), artritis reumatoide, psoriasis, enfisema, asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC). En una modalidad la condicion inflamatoria es colitis ulcerosa y en otra modalidad la condicion inflamatoria es la enfermedad de Crohn.
El oligonucleotido utilizado en la presente invencion se puede modificar de acuerdo con los metodos conocidos por el experto y como se define anteriormente. Por ejemplo, al menos un nucleotido del oligonucleotido tiene una modificacion del esqueleto de fosfato, en donde la modificacion del esqueleto de fosfato es una modificacion fosforotioato o fosforoditioato. La modificacion puede producirse en uno o mas nucleotidos en cualquier posicion a lo largo de la longitud total del oligonucleotido. En una modalidad el esqueleto del acido nucleico incluye la modificacion del esqueleto de fosfato en los enlaces inter-nucleotidos en 5'. Como alternativa, el esqueleto del acido nucleico incluye la modificacion del esqueleto de fosfato en los enlaces inter-nucleotido en 3'.
Ademas del ADN, el oligonucleotido puede estar compuesto de un analogo o copia de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, los siguientes: metilfosfonato, N3'->P5'-fosforamidato, morfolino, acido nucleico peptidico (PNA), acido nucleico bloqueado (LNA), acido nucleico con arabinosilo (ANA), acido nucleico con fluoro-arabinosilo (FANA) acido nucleico con metoxi-etilo (MOE).
Ademas, el oligonucleotido utilizado en la presente invencion puede comprender al menos una nucleobase con fraccion de azucar modificada como se define anteriormente. La fraccion de azucar modificada es, por ejemplo, una fraccion de azucar 2'-O-metoxietilo.
En una modalidad de la presente invencion el oligonucleotido se administra en combinacion con corticosteroides.
La presente invencion se refiere al uso de un oligonucleotido que tiene la secuencia:
5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 17)
para la fabricacion de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides, afectado por una condicion inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada al tratamiento anti-inflamatorio, en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m=0-6, n=0-6 y en donde al menos un dinucleotido CG no es metilado y dicho oligonucleotido tiene de 8 a 100 acidos nucleicos de longitud.
Los oligonucleotidos como se define, anteriormente, se pueden utilizar para la fabricacion del medicamento.
En el uso de acuerdo con la presente invencion, el paciente esta actualmente en tratamiento con corticosteroides o el paciente esta actualmente en tratamiento anti-inflamatorio. En una modalidad el oligonucleotido se administra en combinacion con corticosteroides.
La condicion inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), artritis reumatoide, psoriasis, enfisema, asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC). En una modalidad la condicion inflamatoria es la colitis ulcerosa y en otra modalidad la condicion inflamatoria es la enfermedad de Crohn.
El oligonucleotido inmunomodulador de la invencion se ilustra por SEQ.ID.No 1 (DIMS0150) y sirve como ejemplo de oligonucleotidos inmunomoduladores a base de ADN, que contienen un motivo CpG. La invencion revelo el hallazgo sorprendente de que cuando se administra tal oligonucleotido inmunomodulador, segun se indica por SEQ.ID.N0.1 a un paciente que padece de una condicion inflamatoria del intestino (i.e colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), y que igualmente no estaba respondiendo a terapias con esteroides y estaba en terapia concomitante con esteroides, hubo una rapida y pronunciada mejora de tales pacientes y podia reducirse la dosis de los esteroides administrados. Por el contrario, cuando se administro dicho oligonucleotido inmunomodulador a pacientes que padecian colitis ulcerosa en los que se excluyeron los esteroides y los pacientes eran sensibles a los esteroides, no se observo ninguna mejoria en su enfermedad. Esta sorprendente observacion indico claramente que mediante mecanismos
5 todavia no conocidos, los efectos inmunomoduladores de un oligonucleotido que contiene CpG en el contexto de resistencia a esteroides, indujeron una mejoria de la enfermedad que no fue aparente en los pacientes que no eran resistentes a esteroides.
Los siguientes ejemplos no limitantes en primer lugar confirman que SEQ.ID.NO.1 funciona como un oligonucleotido inmunomodulador y que diversas longitudes de SEQ.ID.NO.1 conservan su actividad. Los ultimos ejemplos son 10 resumenes de datos clinicos en pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn que recibieron una unica administracion rectal de SEQ.ID.NO.1.
EJEMPLOS
Materiales y Metodos
O/igodesoxinuc/e6tidos (ODN).
15 En la invencion se utilizaron numerosos ODNs para los experimentos de estimulacion utilizando monocitos de sangre periferica humana (PBMC) o esplenocitos de raton. Los ODNs utilizados se enumeran en la Tabla 1. En algunos de los oligonucleotidos el motivo de dinucleotido se "invirtio", y como tal funcionan como controles
Tabla 1. Oligodesoxinucleotidos inmunomoduladores Compuesto ID Secuencia ID Oligo secuencia (5'-3') DIMS0150 SEQ.ID.NO.1 G*G*A*ACAGTTCGTCCAT*G*G*C IDX0526 SEQ.ID.NO.2 G*G*A*ACAGTTGCTCCAT*G*G*C IDX0304 SEQ.ID.NO.3 A*G*C*TGAGTAGCCTATA*G*A*C IDX0900 SEQ.ID.NO.4 G*G*TGCATCGATGCAG*G*G*G*G*G IDX0910 SEQ.ID.NO.5 T*C*GT*C*G*T*C*T*TG'T*C*G*T*T*T'T*G*T*C*G*T*T IDX0915 SEQ.ID.NO.6 T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T IDX0250 SEQ.ID.NO.7 G*A*A*ACAGATCGTCCAT*G*G*T IDX0254 SEQ.ID.NO.8 G*A*A*ACAGATGCTCCAT*G*G*T IDX0920 SEQ.ID.NO.9 T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*C*G*T*T IDX0925 SEQ.ID.NO.10 T*C*C*A*T*G*A*G*C*T*T*C*C*T*G*A*G*C*T*T IDX-0912b1 SEQ.ID.NO.11 T*C*G*TCGTTTTGTCGTTTTGTC*G*T*T IDX-0024b1 SEQ.ID.NO.12 G*A*A*CAGTTCGTCCA*T*G*G IDX-0025b1 SEQ.ID.NO.12 G*A*ACAGTTCGTCCAT*G*G IDX-0026b1 SEQ.ID.NO.13 A*A*C*AGTTCGTCC*A*T*G IDX-0027b1 SEQ.ID.NO.13 A*ACAGTTCGTCCAT*G IDX-0028b1 SEQ.ID.NO.14 A*C*A*GTTCGTC*C*A*T
IDX-0029b1 SEQ.ID.NO.14 ACAGTTCGTCCAT IDX-0030b1 SEQ.ID.NO.15 C*A*G*TTCGT*C*C*A IDX-0031b1 SEQ.ID.NO.15 CAGTTCGTCCA IDX-0032b1 SEQ.ID.NO.16 A*G*T*TCG*T*C*C IDX-0033b1 SEQ.ID.NO.16 AGTTCGTCC IDX-0034b1 SEQ.ID.NO.17 G*T*T*C*G*T*C IDX-0035b1 SEQ.ID.NO.17 GTTCGTC
Clave
* indica enlace fosforotioato mientras que otros tienen enlace fosfodiester.
Formulacion
Todos los ODNs, excepto para DIMS0150 e IDX0250 sintetizados por Avecia, se sintetizaron y suministraron por Biomers.net, Germany.
Los ODNs liofilizados utilizados (vease Tabla 1) -todos excepto DIMS0150 humano -en primer lugar se diluyeron en un volumen pequero de agua destilada. Despues de mezclar completamente, cada ODN se diluyo adicionalmente con agua en una serie de diferentes diluciones. Se determino la densidad optica (OD) A260/A280 en al menos cinco o mas muestras de cada dilucion utilizando un espectrofotometro (SmartSpec 3000, BioRad). Se calculo, la concentracion media de todas las lecturas, para todas las diluciones con el fin de determinar la concentracion de la solucion stock. Se almacenaron todas estas soluciones stock a -200 C. Para todos los ODNs, se diluyo adicionalmente una porcion de la solucion stock concentrada, con el fin de obtener una solucion stock de alta concentracion y una de baja concentracion (1 !g/ml y 20 !g/ml respectivamente). Se determino la concentracion de la misma manera, midiendo la OD, utilizando un espectrofotometro como se menciono anteriormente.
Se prepararon las diferentes soluciones de trabajo utilizadas en los experimentos; 0,1 !M, 1 !M, 3 !M, 5 !M, 10 !M, 25 !M, 50 !M, 100 !M, 150 !M, 200 !M y 300 !M, diluyendo los ODNs adicionalmente en PBS utilizando la solucion stock de alta concentracion (20 !g/ml) y la solucion stock de baja concentracion (1 !g/ml).
Se diluyo DIMS0150 en agua destilada y la concentracion se determino de una manera similar tal como se menciono para los ODNs liofilizados.
Sistemas biologicos
Preparacion de celulas:
Se obtuvieron muestras de sangre de voluntarios sanos. Se aislaron las PBMC mediante centrifugacion de gradiente de densidad utilizando Ficoll-Paque Plus (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), se lavaron tres veces en solucion salina regulada (PBS), y se volvieron a suspender en RPMI 1640 (Sigma) que contiene suero fetal bovino (FCS) inactivado con calor al 10% (Life Technologies), penicilina 100U/ml, estreptomicina 100 !g/ml (Life Technologies), Lglutamina 2mM (Sigma), gentamicina (Sigma) y Hepes 5 mM (Gibco, Life Technologies). Las celulas se contaron utilizando solucion de azul de Tripano al 0, 4% (Sigma Aldrich)
Preparacion de esplenocitos de raton:
Para cada experimento se extrajo el bazo de un raton C57 BL/6 (los ratones se pidieron de unidad de animales MTC, Karolinska Institutet) y se preparo una unica suspension de celulas en condiciones esteriles, utilizando un filtro de celula de nailon (Filtro de celulas de 100 !M, BD Falcon). A continuacion se lavaron las celulas una vez en RPMI 1640 completo (RPMI 1640 que contiene FCS inactivado con calor al 5%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 !g/ml) a 1200 rpm durante 7-10 minutos. Se decanto el sobrenadante y las celulas se volvieron a suspender en 1 ml de solucion reguladora de lisis de globulos rojos (Sigma) y se incubo durante un maximo de dos minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron otros 5 ml de medio completo antes de llevar a cabo la centrifugacion como se describe previamente. Despues de decantar el sobrenadante, se volvio a suspender el pellet celular en medio completo y se determinaron los numeros de celulas en solucion de azul de Triptano al 0, 4% .
Tecnicas
ELISpot
Se sembraron las PBMC, como se describe previamente, en una placa de membrana basada en PVDF para ELISpot, pre-recubierta, (MABTech AB, Sweden). Antes de la adicion de las celulas, se recubrio la placa de PDVF durante la noche a +40C con un anticuerpo de recubrimiento especifico para IFN-alfa, IFN-gamma o IL-10 (incluidos en los kits de ELISpot; IFN-alfa, IFN-gamma e IL-10 de MABTech AB, Suecia) respectivamente. A continuacion, se sembraron las PBMC a 500 000 celulas/pozo en RPMIc completo. Directamente despues de la siembra, las celulas se trataron con los oligonucleotidos (ODN) respectivos. Se adicionaron cada uno de los ODN a los pozos especificos dando unas concentraciones finales de ODN de 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150 y 200 !M en un volumen total de 100 !l/pozo. Las muestras se prepararon por triplicado. Despues del tratamiento, se incubaron las celulas en un incubador humidificado con un 5% de dioxido de carbono a 370C. Se analizo el IFN-alfa para 2, 10 y 3 donantes a 24, 48 y 72 hrs, respectivamente. Se analizo el IFN-gamma para 2, 7 y 5 donantes a 24, 48 y 72 hrs, respectivamente. Se analizo la IL-10 para 5 y 4 donantes a 48 y 72 hrs, respectivamente. Se realizo la deteccion y el recuento de celulas que producen la citoquina, siguiendo el manual del fabricante. El software lector de ELISpot fue AID 2.3.3 ubicado en el Center for Molecular Medicine, CMM, Karolinska Hospital, Solna, Suecia.
Ensayo de Inmunoabsorcion de Enzima Ligada -ELISA
Se sembraron las PBMC preparadas como se describe previamente, en una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pozos a 500.000 celulas/pozo en RPMIc. Directamente despues de la siembra, las celulas se trataron con el ODN respectivo. Se adicionaron cada uno de los ODNs a los pozos especificos dando las concentraciones finales de ODN entre 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 y 300 !M en un volumen total de 100 !l/pozo. Se prepararon las muestras por duplicado. Despues del tratamiento, las celulas se incubaron en un incubador humidificado con un 5% de dioxido de carbono y a 370C durante 48 hrs. Se guardaron los sobrenadantes y se almacenaron a -200C previo a la determinacion del nivel de citoquinas utilizando Quantikine ELISA especifico, siguiendo el protocolo del fabricante (Para los experimentos en PBMCs humanas se utilizaron los siguientes kits de ELISA: IL-10 humana y IFN-alfa humano. Para los experimentos en esplenocitos de raton; IL-10 de murino; IFN-alfa de murino, R&D Systems, Abingdon, UK).
Ejemolo�1. Evaluacion de produccion de citoquinas de PBMC tras la estimulacion con DIMS0150
Se evaluo la actividad de inmunoestimuladores del ODN que contiene CpG, DIMS0150, en PBMC humanas. La hipotesis fue que PBMC incubadas con diferentes concentraciones de DIMS0150, durante diferentes periodos de tiempo estimularian la produccion de citoquinas de una manera dependiente de CpG. Por esta razon, se eligieron tres citoquinas que son bien conocidas por ser producidas por PBMC en respuesta a ADN con CpG, particularmente IFN-alfa, IL-10 e IFN-gamma. De hecho, las PBMC de diferentes donantes sanos mostraron una produccion de citoquinas dependiente del tiempo (los datos no se muestran) y de la dosis, segun se analiza mediante ELISpot en respuesta a DIMS0150. Entre las tres citoquinas evaluadas, IL-10 fue la citoquina de mayor respuesta despues de 48 hrs de estimulacion con DIMS0150 (Figura 1.). A diferencia de IL-10, DIMS0150 que fue menos potente en la induccion de IFN-alfa e IFN-gamma en PBMC en todas las concentraciones y los momentos probados, representados por 72 hrs para IFN-gamma (ver figura 2) y 48 hrs para IFN-alfa (ver figura 3). Tambien se incluyo, una forma revertida de CpG de DIMS0150, IDX0526, en todos los experimentos con el fin de evaluar la dependencia de CpG de la posible produccion de citoquinas. Las PBMC tratadas con el IDX0526 no mostraron o redujeron la produccion de las tres citoquinas estudiadas en comparacion con la estimulacion con DIMS0150 (veanse las figuras 1, 2 y 3).
Ejemolo�2. Cuantificacion de la produccion de citoquinas de PBMC en respuesta a DIMS0150
Con el fin de cuantificar la cantidad de citoquina producida de las celulas positivas observadas por ELISpot, se realizaron los analisis de ELISA. Se incubaron las PBMC con concentraciones crecientes de DIMS0150 y los sobrenadantes se analizaron para los niveles de IL-10, IFN-alfa e IFN-gamma. De acuerdo con los resultados obtenidos por los datos de ELISpot, utilizando concentraciones entre 0.1 y 200 !M (o 300 !M para IFN-alfa e IFNgamma) dieron como resultado la respuesta dependiente de la dosis de CpG de todas las citoquinas despues de 48 hrs de incubacion (vease las figuras 4A, B y C). Dado que ELISpot y ELISA miden diferentes parametros (i.e. numero de celulas que secretan una citoquina particular contra la cantidad de citoquina secretada) las mediciones de ELISA deben ser consideradas como la informacion complementaria con respecto a la cantidad real que se produce a una concentracion particular, independientemente del numero de celulas que secretan la citoquina de interes. Por lo tanto, el patron de respuesta de dosis puede parecer diferente cuando se comparan los resultados de estas tecnicas diferentes. Se ha investigado mas extensamente la variacion individual en respuesta a DIMS0150 segun se analiza por medio de ELISA cuantitativa (1-3 donantes), en comparacion con ELISpot.
Ejemolo 3. Comparacion de DIMS0150 con diferentes ODN con CpGs en PBMC
Se comparo una respuesta a la dosis de estimulacion con DIMS0150 con los ODNs con CpG humanos y murinos conocidos, IDX0910 e IDX0920, respectivamente. Ademas, tambien se incluyo IDX0250 en esta configuracion experimental, dado esto la secuencia de ODN tambien contiene un dinucleotido de CpG y pueden actuar como ADN con CpG. Las bases flanqueadoras de CpG en IDX0250 difieren ligeramente de DIMS0150 y esto puede influenciar el nivel de respuesta de las citoquinas en PBMC con estimulacion. En esta investigacion, se trataron las PBMC por 48 horas con los ODNs de CpG y sus respectivos controles de CpG invertidos antes de que se analizaron los sobrenadantes por duplicado utilizando ensayos de ELISA cuantitativos para IL-10 e IFN-gamma de DIMS0150 y el IDX0250 dieron lugar a una respuesta de IL-10 similar a 100 !M (Figura 5.) pero a las concentraciones mas bajas
(0.1 !M a1 !M), ninguno de estos ODNs estimulo la produccion de IL-10 de PBMC. En comparacion, la incubacion de PBMC con IDX0910 o IDX0920 alcanzo la mas alta produccion de IL-10 a las concentraciones mas bajas utilizadas. El analisis de IFN-gamma de los sobrenadantes resulto en una secrecion inferior de esta citoquina en comparacion con IL-10 (Figura 6). Ninguno de los controles de GpC invertidos o IDX0304 indujo IFN-gamma pero se observaron algunos niveles de secrecion de IL-10 en PBMC con los dos ODNs de GpC control, IDX0915 e IDX0925. Esto se puede deber a la presencia de un esqueleto completamente de fosforotioato en estos ODNs.
Ejemolo 4. Comparacion de DIMS0150 con diferentes ODNs de CpG en esplenocitos de raton
Los humanos y ratones responden a diferentes ODNs de CpG. Se comparo el efecto inmunoestimulador de DIMS0150 con el mismo conjunto de ODNs de CpG realizado en PBMC (vease figura 6) en un sistema de esplenocito de raton. Los esplenocitos se trataron con ODNs de CpG y su respectivo control negativo GpC invertido por 48 horas antes de que se analizaran los sobrenadantes para IFN-gamma e IL-10 por duplicado utilizando ensayos de ELISA cuantitativos. El tratamiento de esplenocitos con DIMS0150 dio como resultado una fuerte respuesta de IFN-gamma a la concentracion mas alta utilizada. Sin embargo, en este ensayo IDX0250 fue mas potente que DIMS0150, lo que indica que las secuencias que rodean al CpG tambien tienen impacto en el nivel de respuesta (Figura 7). Los niveles de IFN-gamma mas pronunciados se encontraron en sobrenadantes de celulas estimuladas con el ODN con CpG, IDX0920 a las concentraciones mas bajas utilizadas. Finalmente, el analisis de los sobrenadantes para niveles de IL-10 (Figura 8.) mostro un patron similar al que se observo cuando se midio IFNgamma. Ninguno de los controles de ODN invertido GpC indujo IFN-gamma, pero IDX0925 indujo cierto nivel de IL10 tambien en el sistema murino.
Ejemolo 5. Inhibicion de TLR9
Se prepararon PBMC de voluntarios sanos, utilizando un procedimiento estandar. Las celulas se sembraron en placas de cultivo de 96-pozos con densidad de 5x106 celulas por pozo en RPMIc que contiene FCS al 5 % (Gibco). Se prepararon y almacenaron la cloroquina (CQ) un conocido inhibidor de TLR9 y Concavalina A (Con A) adquiridos de Sigma, como soluciones stock (5 mg/ml). Los oligonucleotidos inmunomoduladores de SEQ.ID.NO.11 (IDX0912b), SEQ.ID.NO.9 (IDX-0920) y SEQ.ID.NO 1 (DIMS0150) se adicionaron al medio de cultivo a las concentraciones optimas de trabajo que se determinaron previamente: 1 uM, 10uM y 100uM, respectivamente. Las celulas fueron incubadas previamente en el incubador de celulas (37 DC, 5% de CO2) 40 min con 0; 1; 10 o 50 ug/ml CQ. Luego se adicionaron IS ODNs al medio de cultivo.
Se adiciono Con A al grupo control positivo de celulas a una concentracion final de 20 ug/ml.
Tres grupos de celula control se incubaron con medio solo o medio que contiene IS ODNs o CQ. Se recolectaron 100ul de sobrenadante despues de 24 horas de cultivo y se utilizaron para medir el nivel de IL-6 y IL-10 utilizando el kit II CBA Th1/Th2 (BD). De la figura 9A y la 9B se puede observar que existe una reduccion dependiente de la dosis en los niveles de IL-10 y IL-6 respectivamente, cuando se estimulo con oligonucleotidos inmunomoduladores, despues de la pre-incubacion de concentraciones crecientes de Cloroquina. Estos resultados indican una dependencia de TLR9 para los efectos inmunomoduladores de los oligonucleotidos como se determina a traves de la liberacion de la citoquina.
Ejemolo 6. Estudio de truncamiento
Se obtuvieron los concentrados de celulas de sangre periferica (capas leucocitarias) de donantes sanos de sangre del Karolinska University Hospital Blood Bank. Se separaron las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) en Ficoll-Paque (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) mediante centrifugacion de gradiente. Despues de lavar 3 veces en solucion salina regulada con fosfato (PBS, pH 7.4. Libre de Ca2+ y Mg2+), se determinaron el numero y la viabilidad de las celulas por exclusion de azul Tripano. Las celulas se diluyeron a 10 x 106 celulas/mL en medio cultivo completo, RPMIc [medio 1640 RPMI suplementado con 25 mg/mL de gentamicina,
L-glutamina 2 mM, 100 IU/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina (Gibco BRL, Life Technologies Ltd), Hepes 5mM, y suero fetal bovino inactivado con calor al 10% (v/v) (FCS, Hyclone, Logan, UT, USA)]. Las PBMCs aisladas se cultivaron en placas de cultivo de 48-pozos (2x 106 celulas en 400 !l de medio/pozo) en la presencia de diferentes oligo dinucleotidos (ODNs) (Tabla I) en la concentracion final de 10 o 100 !M. RPMIc solo sirvio como 5 control negativo. Las celulas se incubaron durante 48 hrs, a 370C en una condicion humeda con 6% de CO2 en aire. Se recolectaron y analizaron los sobrenadantes celulares para la presencia de citoquina utilizando el matriz de perlas citometricas (CBA) (Becton Dickinson) de acuerdo con el protocolo del fabricante en un citometro de flujo FACSCalibur seguido por el analisis, utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson). El limite de deteccion inferior fue 20 pg/ml para cada citoquina. Las figuras 10A y 10B, indican que disminuyendo la longitud de
10 SEQ.ID.NO.1 por el truncamiento de la secuencia a traves de la eliminacion de nucleotidos de cada extremo del oligonucleotido, la actividad sigue siendo retenida con respecto a la estimulacion de IL-10. Por ejemplo, IDX-0031b1, un 13 mer truncado de la SEQ.ID.N0.1 original, es aun capaz de inducir IL-10 a una concentracion de 100uM. A una concentracion menor de 10uM, se observa hasta version 15 mer truncado (IDX-0027b1) de la SEQ.ID.NO.1 original.
Ejemolo 7. Prueba Piloto en Humanos del estudio conceptual
15 La prueba Piloto de estudio conceptual se describe en su totalidad en el Anexo I.
Objetivos del estudio
Objetivo primario: Evaluar los temas de seguridad con respecto al uso del oligonucleotido basado en ADN representado como SEQ.ID.No 1 en pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
Objetivos secundarios: Explorar la eficacia clinica como se determina mediante las tasas de remision/mejoras 20 endoscopicas y clinica, mejora histologica y cambios en parametros de laboratorio clinico.
El estudio se controlo con placebo; de dosis unica, doble ciego y se consideraron pacientes que no eran sensibles a corticosteroides o dependientes a corticosteroides que estaban en terapias con esteroides concomitantes.
Los niveles de dosis utilizados fueron 3 mg y 30mg proporcionados como una administracion rectal unica.
Respuesta clinica en la semana 1
25 i) SEQ.ID.NO.1 5/7 pacientes que responden al tratamiento (71 %)
ii) Placebo 1/4 pacientes que responden al tratamiento (25%)
En general, este estudio piloto indico buena eficacia en ambos grupos de dosis despues de una administracion rectal unica. Tal vez mas sorprendente fue la rapidez de respuesta en cuanto que todos los pacientes que respondieron al tratamiento lo hicieron en el plazo de una semana de recibir el farmaco de estudio. Fue de interes el hallazgo de que
30 dos de los 7 pacientes que recibieron la SEQ.ID.NO.1 estan aun en la actualidad en remision y libres de esteroides. Por otra parte, no se registraron eventos adversos graves.
Ejemolo 8. Estudio clinico de fase II
Objetivos del estudio
Objetivo primario: Evaluar la capacidad de cada uno de los cuatro niveles de dosis (0.3 mg, 3mg, 30mg y 100 mg) de
35 oligonucleotido SEQ.ID.NO.1 como una terapia anti-inflamatoria para inducir la remision clinica en pacientes con colitis ulcerosa (UC) de leve a moderadamente activa, en comparacion con el placebo.
Objetivos secundarios: Evaluar la tolerancia de dosis rectales unicas del oligonucleotido de SEQ.ID.NO.1 y evaluar ademas la eficacia y seguridad del oligonucleotido de SEQ.ID.NO.1 en cuatro niveles de dosis y evaluar la farmacocinetica del oligonucleotido de SEQ.ID.NO.1, despues de la administracion rectal, en comparacion con el
40 placebo.
Conclusiones del estudio
Respuesta clinica en la Semana 1, poblacion de Seguridad/ITT
Respuesta clinica
0.3 mg (N=31) 3 mg (N=29) 30 mg (N=30) 100 mg (N=29) Placebo (N=29)
Si, n (%)
8 (25.8) 6 (20.7) 7 (23.3) 5 (17.2) 11 (37.9)
No, n (%)
23 (74.2) 23 (79.3) 23 (76.7) 24 (82.8) 18 (62.1)
De la tabla, la tasa de respuesta para los que recibieron el farmaco activo fue 22% (26/119), el placebo fue 38% (11/29). Este estudio no se pudo confirmar que una dosis unica del oligonucleotido de SEQ.ID.NO.1 en una dosis de 0,3 a 100 mg en un numero limitado de pacientes, pueda inducir remisiones clinicas, endoscopicas o histopatologicas o respuestas durante un periodo de 12 semanas, sin embargo, este estudio demostro un buen perfil de seguridad del farmaco.
En comparacion las tasas de respuesta clinica en la semana 1
Estudio Piloto
Fase II
Activo
71 % 22 %
Placebo
25 % 38 %
Es aparente que los pacientes del estudio piloto tuvieron una tasa de respuesta mucho mejor que la observada en la fase II. Tambien es claro que mientras que a los pacientes del estudio piloto se les permitio esteroides como medicamentos concomitantes y eran resistentes a o dependientes de corticosteroides, este fue un criterio de exclusion en la fase II. No se permitieron esteroides durante la duracion del estudio de fase II y los pacientes no eran resistentes ni dependientes de las terapias con esteroides.
Los resultados divergentes entre el estudio piloto y el estudio de fase II mas grande insinuarian que los pacientes que son resistentes a o dependientes de corticosteroides y estan en terapia con corticosteroides concomitante responden mas favorablemente a una dosis rectal unica de SEQ.ID.No 1 que los pacientes que no lo son. La razon de esta sorprendente diferencia en el resultado clinico no es clara. Sin embargo, la accion inmunomoduladora de oligonucleotidos que contienen CpG podria inducir cambios beneficiosos en el sistema inmunologico del paciente de tal manera que los pacientes resistentes a esteroides o dependientes de esteroides serian capaces de responder a esteroides de nuevo. En otras palabras, los oligonucleotidos de inmunomodulacion pueden inducir una resensibilizacion de los pacientes a los efectos anti-inflamatorios de esteroides.
Los ejemplos proporcionados confirman que los oligonucleotidos inmunomoduladores que contienen un dinucleotido de CpG dentro de sus secuencias tales como ejemplo SEQ.ID.NO.1 son capaces de inducir ciertas citoquinas para las que existe evidencia de su papel en la modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides, tal como se menciona en la tecnica anterior. A la vista de esto, los oligonucleotidos inmunomoduladores que inducen la produccion de interferones e IL-10, por ejemplo, pueden ser beneficiosos.
LISTA DE SECUENCIAS
�110> Index Pharmaceuticals AB
�120> Metodo para la modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides
�130> 58507
�160> 18
�170> PatentIn version 3.3
�210> 1
�211> 19
�212> ADN
�213> Artificial
�223> Oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(19)
�400> 1 ggaacagttc gtccatggc
�210> 2
�211> 19
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(19)
�400> 2 ggaacagttg ctccatggc
�210> 3
�211> 19
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(19)
�400> 3 agctgagtag cctatagac
�210> 4
�211> 20
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(20)
�400> 4 ggtgcatcga tgcagggggg
�210> 5
�211> 24
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(24)
�400> 5 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
�210> 6
�211> 24
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(24)
�400> 6 tgctgctttt gtgcttttgt gctt
�210> 7
�211> 19
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(19)
�400> 7 gaaacagatc gtccatggt
�210> 8
�211> 19
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(19)
�400> 8 gaaacagatg ctccatggt
�210> 9
�211> 20
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(20)
�400> 9 tccatgacgt tcctgacgtt
�210> 10
�211> 20
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(20)
�400> 10 tccatgagct tcctgagctt
�210> 11
�211> 24
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido
�221> misc�feature
�222> (1)..(24)
�400> 11 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
�210> 12
�211> 17
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(17)
�400> 12 gaacagttcg tccatgg
�210> 13
�211> 15
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(15)
�400> 13 aacagttcgt ccatg
�210> 14
�211> 13
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(13)
�400> 14 acagttcgtc cat
�210> 15
�211> 11
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(11)
�400> 15 cagttcgtcc a 11
�210> 16
�211> 9
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(9)
�400> 16 agttcgtcc 9
�210> 17
�211> 7
�212> ADN
�213> Artificial
�223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(7)
�400> 17 gttcgtc 7
�210> 18
�211> 5
�212> ADN
�213> Artificial �223> oligonucleotido �221> misc�feature
�222> (1)..(5)
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30.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso de un oligonucleotido que tiene la secuencia
    5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 17) para la fabricacion de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a
    esteroides, afectado por una condicion inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada a un tratamiento anti-inflamatorio, en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m=0-6, n=0-6 y en donde al menos un dinucleotido CG no es metilado y dicho oligonucleotido tiene de 8 a 100 acidos nucleicos de longitud.
  2. 2.
    Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el oligonucleotido tiene entre 8 y 40 acidos nucleicos de longitud.
  3. 3.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-Xm-AGTTCGTCC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 16)
    y en donde m=0-5 y n=0-5.
  4. 4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-Xm-CAGTTCGTCCA-Yn-3' (SEQ. ID. No. 15)
    y en donde m=0-4 y n=0-4.
  5. 5.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-Xm-ACAGTTCGTCCAT-Yn-3' (SEQ. ID. No. 14) y en donde m=0-3 y n=0=3.
  6. 6.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-Xm-AACAGTTCGTCCATG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 13) y en donde m=0-2 y n=0-2.
  7. 7.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-Xm-GAACAGTTCGTCCATGG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 12) y en donde m=0-1 y n=0-1.
  8. 8.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia
    5'-GGAACAGTTCGTCCATGGC-3' (SEQ. ID. No.1)
  9. 9.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho paciente esta actualmente en un tratamiento con esteroides.
  10. 10.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho paciente esta actualmente en un tratamiento anti-inflamatorio.
  11. 11.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la condicion inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), artritis reumatoide, psoriasis, enfisema, asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC).
  12. 12.
    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho oligonucleotido comprende al menos un nucleotido que tiene una modificacion del esqueleto y dicha modificacion ocurre en uno o mas nucleotidos en cualquier posicion a lo largo de la longitud total de dicho oligonucleotido.
  13. 13. Uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la modificacion es una modificacion del esqueleto de fosfato 5 seleccionado del grupo que consiste de una modificacion fosforotioato y una fosforoditioato.
  14. 14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho oligonucleotido tiene de un oligonucleotido compuesto de ADN o un analogo o imitador de ADN seleccionado de metilfosfonato, N3'->P5'fosforamidato, morfolino, acido nucleico peptidico (PNA), acido nucleico bloqueado (LNA), acido nucleico con arabinosilo (ANA), acido nucleico con fluoro-arabinosilo (FANA), acido nucleico con metoxi-etilo (MOE).
    10 15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el oligonucleotido va a ser administrado en combinacion con los esteroides.
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