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WO2006015560A1 - Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen - Google Patents

Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen Download PDF

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WO2006015560A1
WO2006015560A1 PCT/DE2004/001801 DE2004001801W WO2006015560A1 WO 2006015560 A1 WO2006015560 A1 WO 2006015560A1 DE 2004001801 W DE2004001801 W DE 2004001801W WO 2006015560 A1 WO2006015560 A1 WO 2006015560A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
dna
deoxyribonucleic acid
base sequence
sequence
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE2004/001801
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English (en)
French (fr)
Inventor
Burghardt Wittig
Manuel Schmidt
Heribert Bohlen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mologen AG
Original Assignee
Mologen AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mologen AG filed Critical Mologen AG
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Priority to ES05772724.0T priority patent/ES2621123T3/es
Priority to PCT/EP2005/008770 priority patent/WO2006015872A1/en
Priority to EP16205305.2A priority patent/EP3202407A1/de
Priority to DK05772724.0T priority patent/DK1776124T3/en
Priority to US11/573,529 priority patent/US9212366B2/en
Priority to EP05772724.0A priority patent/EP1776124B1/de
Priority to PL05772724T priority patent/PL1776124T3/pl
Publication of WO2006015560A1 publication Critical patent/WO2006015560A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the invention relates to the use of a covalently closed nucleic acid molecule for the production of a medicament which, in combination with chemotherapeutic drugs, serves for the therapeutic treatment of tumor diseases.
  • Tumor diseases are one of the most important causes of death in the industrialized world.
  • Established methods for the treatment of cancers such as surgical removal, radiation and chemotherapy, often lead, at best, to a temporally limited decline in the disease.
  • certain carcinogenic diseases such as non-small cell lung carcinoma, are, for example, not operable, and the life span of the patients is currently about 1 year with or without therapy.
  • the effectiveness of chemotherapy is based primarily on the fact that particularly dieje ⁇ igen cells are sensitive to the attack of drugs that constantly divide and multiply. These are primarily the malignant tumor cells. However, since healthy cells of various organ systems also divide, they are also sensitive to chemotherapy. Some cytostatics are themselves carcinogenic, mutagenic or germ-damaging. For this reason, a short course of treatment with few cycles of chemotherapy would be of great benefit to the patient in order to minimize the side effects for the patient.
  • Chemotherapy usually takes place in several cycles, which are interrupted by 2 to 4 weeks of treatment. During this time the medicaments act and the patient can recover from the side effects.
  • the chemotherapeutic agents destroy the tumor cells by biochemical reactions which initiate cell death.
  • Cells can be destroyed by two types of cell death, apoptosis, programmed cell death, or by necrosis, the provoked cell death.
  • Tumor cells are destroyed by necrosis.
  • the cell nucleus disintegrates and the internal structures of the tumor cell dissolve. This triggers an immune response that causes cells of the immune system to be attracted. They break the necrosis into viable tissue and degrade dead cell proteins.
  • TAA tumor-associated antigens
  • CpG unmethylated cytosine-guanosine
  • NK natural killer
  • dendritic cells Klinman et al., 1996, PNAS USA 93: 2879, Sparwasser et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2045).
  • US Pat. No. 6,653,292 discloses a concept for treating tumor diseases by combination of cytokines, for example GM-CSF, with chemotherapeutic measures as well as with the combination of immunostimulatory CpG-containing oligonucleotides with chemotherapy.
  • cytokines for example GM-CSF
  • chemotherapeutic measures as well as with the combination of immunostimulatory CpG-containing oligonucleotides with chemotherapy.
  • in vivo or in vitro data or clinical results demonstrating the efficacy of the claimed combinations can not be demonstrated.
  • mice shear follicle and for immunosuppression following repeated administration in mice (Heikenwalder et al., 2004, Nat. Med. 10: 187).
  • immunostimulatory nucleic acid sequences are known from EP 1 196 178 B1, which likewise contain CpG motifs, are only a few bases long and do not act via the expression of proteins coded on them. These are dumbbell-shaped, covalently closed deoxyribonucleic acid molecules. They consist of oligonucleotides whose bases can pair with themselves in part and one or two hairpin loops (loop), the 30 bases um ⁇ and contain several CpG motifs (see Fig. 1). The teaching of the use and production of immunostimulatory, CpG-containing ISS is comprehensively explained in EP 1 196 178 B1.
  • the covalently closed deoxyribonucleic acid molecules can advantageously be obtained from open-chain deoxyribonucleic acid molecules which have a self-complementary sequence in part and can form an intermediate-stable hybrid with one another or with a second molecule.
  • the molecule can also be obtained by intramolecular ligation of a molecule which has at least two self-complementary regions which are separated by only one gap in the phosphate backbone. The molecules thus obtained have no free 5 ' or 3 ' ends and are thus not accessible to exonucleases.
  • the immunomodulating oligodeoxyribonucleotide according to EP 1 196 178 B1 preferably comprises a sequence with the base sequence N 1 N 2 CGN 3 N 4 , where N 1 N 2 comprises an element selected from the group consisting of GT, GG, GA, AT or AA, N 3 N 4 is an element selected from the group comprising CT or TT, and C is desoxycytosine, G is deoxyguanosine, A is deoxyadenosine and T is deoxythymidine.
  • the sequence with the base sequence N 1 N 2 CGN 3 N 4 is positioned in the single-stranded region of the oligodeoxyribonucleotide and said deoxyribonucleic acid molecule comprises 40 to 200 nucleotides.
  • the fundamental problem in the recognition of a tumor by the body-own immune system is that tumors unlike most microorganisms do not trigger an inflammatory reaction. As a result, the immune system lacks the signal to start the immune reaction.
  • the tumor cells are not recognized as degenerated cells and can thereby grow unhindered and multiply.
  • tumor antigens Due to the necrotic death of the tumor cells as a result of chemotherapy, cell debris and molecular fragments are released from the cytoplasm. These released structures, which are also referred to as tumor antigens, form important recognition and target structures for the attack of the immune system against the residual tumor or tumor cells scattered in the body. As a result of chemotherapeutic and / or radiotherapeutic measures, some of which have highly toxic cytostatic agents, a large number of antigens are present in the body due to the necrosis of the cells.
  • the endogenous innate immune system however, has no evolutionary specificity for such structures as it is present for microbes or other external pathogens. For this reason, tumor-specific antigenic structures are poorly recognized or not recognized by the innate immune system.
  • the tumor antigens are not effectively controlled by the innate immune system. Since the adaptive immune system is not yet triggered by tumor antigens in the absence of necessary cofactors such as inflammatory signals, specific immune responses to the tumor antigens have not yet been elicited.
  • the invention makes use of the finding that a nonspecific immune response can be converted into an adaptive, specific immune response, even if in a immediate connection, the antigens against which the immune response is intended to be correct.
  • the body's own immune system is faked an infection, which actually did not take place.
  • cells and in particular the thymocytes with helper function and the cytotoxic thymocytes, B lymphocytes and so-called NK (natural killer) cells, macrophages and monocytes, and dendritic cells and their precursors, as well as in their function so far Enlightened cell populations with functions within the immune system are stimulated for proliferation, migration, differentiation or activity and "lured" to the site of infection.
  • NK natural killer cells
  • dendritic cells and their precursors as well as in their function so far Enlightened cell populations with functions within the immune system are stimulated for proliferation, migration, differentiation or activity and "lured" to the site of infection.
  • the various immune cells whether newly formed in the described processes or "attracted” by messenger substances, find none at the site of infection infectious agents.
  • the tumor antigens released by necrosis are present in the body.
  • the immune reaction triggered by the DNA-based immunomodulators resulted in the formation of immune cells as described. These now eat the tumor antigens instead of the non-existing infectious agents and present them as molecular fragments to the adaptive immune system.
  • the adaptive immune system learns about the molecular recognition and target structures of the tumor cells and forms more and more specific immune cells against them. The immune system has thus been enabled to continue training defense and destruction cells against them.
  • the DNA-based immunomodulators lead to the formation of memory antigens, so-called recall antigens.
  • recall antigens By means of special immune cells, the immune system can "remember” these antigens and a cellular immune response is triggered upon renewed contact (see FIG. 7).
  • the invention thus relates to the novel use of DNA-based immune modulators, according to claim 1 and following, for the preparation of a medicament which is used in combination with chemotherapeutic agents in tumor therapy.
  • the DNA-based immunomodulators are dumbbell-shaped, covalently closed deoxyribonucleic acid molecules containing CpG motifs.
  • the immunomodulatory effect of the dumbbell-shaped, covalently closed desyribonucleic acid molecules strongly depends on the loop double-strand combination and the CpG motifs contained.
  • the linearization, the deletion of a hairpin loop, the reduction of the molecule or the removal of CpG motifs from the molecule leads to an altered induction pattern of cytokines.
  • Oligodesoxyribonukleotide be used, wherein the immunostimulatory Oligodesoxyribonukleotid
  • N 1 N 2 comprises an element selected from the group comprising GT, GG, GA, AT or AA
  • N 3 N 4 comprises an element selected from the group CT or TT
  • C is deoxycytosine
  • G is deoxyguanosine
  • A is deoxyadenosine
  • T is deoxythymidine
  • the sequence with the base sequence N 1 N 2 CGN 3 N 4 is positioned in the single-stranded region of the oligodeoxyribonucleotide and comprises 40 to 200 nucleotides.
  • immunomodulating deoxyribonucleotides described in EP 1 196 178 B1 are preferred. However, it was neither described nor was it to be expected that these immunomodulating deoxyribonucleic acid molecules are suitable for promoting the stimulation of the body's immune system as a preparatory measure in the presence of the diagnosis of a malignant tumor disease with simultaneous use of cytostatics.
  • treatment means the prophylactic and / or therapeutic effect of a drug.
  • Immune stimulation / immunomodulation refers to the therapeutic influence of the immune reaction, ie the preparedness of the organism. The aim of such a therapy is to fight the tumor with the body's own remedies.
  • Chemotherapy is to be understood as meaning the systemic drug therapy of tumor diseases with so-called cytostatic drugs.
  • chemotherapeutic agent pertains to cytostatic agents which are commonly used in adjuvant, palliative and curative tumor therapy. These include, for example, but not exclusively and finally, chemotherapeutic agents
  • topoisomerase inhibitors for example irinotecan, topotecane,
  • alkylating agents for example busulfan and dacarbazine
  • platinum compounds for example cisplatin, carboplatin or oxaliplatin,
  • antracyclines and actinimycins for example mitoxantrone and amsacrine
  • vinca alkaloids such as, for example, vinorelbine
  • taxanes for example paclitaxel and docetaxel
  • cytostatic agents which are not expressly mentioned and which are used in the context of chemotherapy are also included.
  • Prefers are cytostatics or combinations thereof that are administered to a patient in a single cycle only.
  • tumors includes carcinogenic metastatic diseases from the group of cervical carcinomas, breast cancers, colorectal and rectal carcinomas, primary liver cell carcinomas, prostate carcinomas, non-small cell lung carcinoma (NSCLC), pancreatic carcinomas, bladder carcinomas and ovarian cancers, and others said tumor diseases.
  • NSCLC non-small cell lung carcinoma
  • the vaccine resulting from the novel use of the present invention is intended to serve as an injection for patients receiving them into and under the skin and into the musculature.
  • deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following, immediately prior to the start of therapy on the patient with cytostatics thus leads to a high concentration of soluble proliferation-promoting cytokines and co-stimulatory molecules in association with tumor-associated antigens at the application site as a result of the immune reaction taking place (TAA), which leads to activation and proliferation of tumor-specific T cells.
  • TAA immune reaction taking place
  • deoxyribonucleic acid molecules leads to the expression of immune-relevant surface molecules on the tumor cells, including ICAM-1, HLA-DR, CD80 and CD40.
  • the adhesion molecule ICAM-1 causes the activation of effector T helper cells and the HLA-DR was able to show that the expression density of the HLA-DR on the monocytes is a very good surrogate marker for the ability of the monocytes to release proinflammatory cytokines (eg tumor necrosis factor-alpha, IL-1, IL- 6, IL-8).
  • proinflammatory cytokines eg tumor necrosis factor-alpha, IL-1, IL- 6, IL-8.
  • the deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following cause increased proliferation of B lymphocytes, the carriers of the humoral immune response.
  • the B lymphocytes differentiate either into antibody-producing plasma cells or into memory cells which, on renewed contact with the known antigen, directly transfer to antibody production. It has been shown that the deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following lead to an increased secretion of the immunoglobulin IgM, IgA and IgG (see FIG. 4).
  • the antibody isotypes IgGI and IgG2 were also determined to detect a possible Th2 / Th1 shift in the immune response.
  • immunoglobin gamma (IgG) for a given antigen reflects the expression of the entire immune response against this antigen.
  • IgG-1 subtypes are characteristic of a humoral response, accompanied by increased secretion of IL-4 and IL-10 interleukins by activated lymphocytes.
  • An elevated level of subtype IgG 2 is typical of a cellular Th1 response, accompanied by increased secretion of IFN-gamma and IL-12.
  • the deoxyribonucleic acid molecules used according to claims 1 and following have a number of advantages. They do not lead to organ enlargement, which could be shown in the example of the liver, spleen and lymph nodes in mice in comparison (see FIG. 5). Likewise, no occurring anomalies of these organs were found during the treatment period.
  • deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following in the run-up to chemotherapy leads to an upregulation of the expression of surface antigens on tumor cells and thus makes the tumor cells more recognizable to the immune system.
  • NK cells activates receptors for key immune cells, including NK cells, that enhance the immune system's ability to fight tumor cells.
  • NK cells natural killer cells
  • T lymphocytes are important for an effective immune response against tumors.
  • 1a and 1b Schematic representation of covalently closed immunomodulating CpG motifs containing oligodeoxyribonucleotides: dumbbell-shaped structure with in each case three CpG motifs shown as a dark circle in the hairpin structures of the loops; where I means loop and II: stem.
  • Fig. 2 Shows the release of the cytokines interferon-gamma and interleukin-6 after in vitro stimulation of peripheral
  • PBMCs Blood monocytes
  • C linear, thioate-protected CpG oligonucleotides.
  • the negative control is expected to result in no release of interferon-gamma or interleukin-6.
  • Both molecules B and C are able to stimulate the PBMCs to release cytokine.
  • the release of interferon-gamma is even significantly increased by B by 2.5 times compared to C. Also for the cytokine interleukin-6, this tendency of significantly improved release compared to C is visible.
  • Fig. 3 Shows the expression of the immune-relevant
  • the negative control is expected to result in no stimulation of HLA-DR or ICAM-1.
  • the reported values of 9.7% and 209.6 are used as baseline values for mean fluorescence intensity to account for non-stimulated positive cells. Both molecules B and C lead to a stimulation of both surface molecules. Whereby B and C achieve approximately the same results.
  • Fig. 4 Shows the increased antibody production after in vitro stimulation of peripheral blood monocytes (PBMCs) by:
  • the negative control does not stimulate the immunoglobulins IgM 1 IgA, IgGI and IgG2.
  • B and C lead to a marked stimulation of antibody production, whereby the IgA release by B is increased by three times compared to C.
  • the relative titers of the isotypes IgGI and IgG2 can be taken as an indicator of the dominant nature of the resulting immune response.
  • the ratio of IgG2 and IgGI shows that the DNA-based immunomodulators trigger a cytotoxic immune response (Th1) in addition to the humoral immune response.
  • FIG. 5a It was investigated whether the DNA-based immunomodulators and the thioate-protected CpG oligonucleotides have a toxic effect on the living organism. The determination was based on the weight gain of the internal organs liver, spleen and lymph nodes
  • C linear, thioate-protected CpG oligonucleotides.
  • the negative control serves as a basic value again.
  • the DNA-based Immunomodula ⁇ tors, B regardless of the amount administered to no enlargement of the liver.
  • the thioate-protected CpG oligonucleotides lead to a significant increase in liver even at the low level of 60 micrograms.
  • Fig. 5b Here, the influence of B and C on the organ spleen was examined.
  • the negative control serves as a basic value again.
  • the DNA-based immunomodulators, B lead to no enlargement of the spleen regardless of the amount administered.
  • the thioate-protected CpG oligonucleotides lead to a significant spleen enlargement, even at the low level of 60 micrograms, which represents a weight increase of almost five times to A or B.
  • Fig. 5c Here, the influence of B and C on the lymph nodes was examined.
  • C linear, thioate-protected CpG oligonucleotides.
  • the Negativkontrölle serves again as a basic value.
  • the DNA-based immunomodulators, B lead to no enlargement of the lymph nodes, regardless of the amount administered.
  • the thioate-protected CpG oligonucleotides lead to a significant lymph node enlargement, even at the low level of 60 micrograms, which represents a double increase to A or B.
  • Figure 6 Shows another toxicology study on the organism due to the administration of the DNA-based immunomodulators and thioate-protected CpG oligonucleotides. As a parameter, the prolongation of the blood clotting time was investigated. The two images are two different donors. The partial thromboplastin time in seconds is plotted on the ordinate. Was administered: A: negative control, buffer
  • the DNA-based immunomodulators show no prolongation of the blood clotting time in all two experiments.
  • the thioate-protected CpG oligonucleotides lead to a marked prolongation of the blood clotting time in comparison to the negative control and to B.
  • Fig. 7 Shows the recall antigens of four patients after one
  • Stable disease is understood to mean the steady state of the condition.
  • a mixed response is a mixed reaction, eg the
  • a complete response indicates the complete decline of the tumor centers.
  • Patients with cervical carcinoma, breast cancer, colorectal and rectal carcinoma, primary hepatocellular carcinoma, prostate carcinoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC), pancreatic carcinoma, bladder cancer and ovarian carcinoma between the ages of 18 and 70, and a Karnofsky index of 70 -100 were eligible.
  • Exclusion criteria were: previous cytokine treatment or chemotherapy less than 28 days, creatinine levels above 265 ⁇ mol / L, bilirubin levels above 51 ⁇ mol / L, non-compensated heart failure, ventricular rhythm disorders, severe psychiatric illnesses, active hepatitis A, B or C, HIV infection.
  • Treatment In addition to the history, the following parameters were determined prior to treatment: physical examination, hematology (hemoglobin, hematocrit, leucocytes and platelet counts), blood chemistry and urinalysis. It was taken for the immune status determination blood. DHT (Delayed type hypersensitivity) skin tests were performed with the Multitest Merieux test (Leimen, Germany). X-rays of the upper body and computed tomography of the upper body and abdomen were created. Extensive immunological examinations, haematological examinations and rough clinical examinations (physical examination, ultrasound examination and abdominal examination, if required) were performed repeatedly. A complete clinical and immunological examination, comparable to the initial screening, took place at the end of a treatment cycle.
  • patients receive injections of 500 micrograms of the deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following into and under the skin and into the musculature.
  • the patients receive in the period around the respective chemotherapy cycle at fixed intervals, ranging from 2 to 8 days, five times in each case two injections a 500 micrograms with Des oxyribonukleinklakülen according to claim 1 and following.
  • the total amount of deoxyribonucleic acid molecules administered in accordance with claim 1 and following, dissolved in PBS buffer is thus 1000 per injection day
  • the total amount of deoxyribonucleic acid molecules varies and is between 1 and 10 milligrams.
  • the two injections are made on the first day of injection to the typical injection sites intradermally on the left and right upper arm, on the second day intradermally on the front of the left and right thigh, on the third day of injection subcutaneously about 30 millimeters left and right of the navel, on the fourth Injetations ⁇ day subcutaneously in the described areas of the upper arms and on the fifth day intra ⁇ muscular in the front of the left and right thigh.
  • the injection time is given in relation to the start of chemotherapy (day zero) with gemcitabine.
  • Patients with metastatic primary liver carcinoma and prostate carcinoma are treated palliatively with the combination of deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following and taxotere or deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following, and mitoxanthrone.
  • Patients suffering from metastatic rectal or colorectal carcinoma are treated by adjuvant or palliative therapy after injection of deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following with the cytostatic combination leucovorin and 5-fluorouracil (5-FU).
  • the combination with FOLFOX 4 (oxaliplatin, folinic acid and 5-fluorouracil) and FOLFIRI (iridotecan, folinic acid and 5-fluorouracil) is provided after the injection of deoxyribonucleic acid molecules according to claim 1 and following. All treatments take place after given cycles. It is intended to perform only one cycle of the combination consisting of the treatment with deoxyribonucleic acid molecules and subsequent chemotherapy.
  • Example 1 Synthesis of covalently closed immunomodulating oligodeoxyribonucleotides according to claim 1 and following
  • the ligation product was subjected to subsequent anion exchange chromatography (carrier: LiChrospher DMAE, Merck Darmstadt, 0-1 M NaCl in 50 mM NaPhosphate) and concentrated by isopropanol precipitation.
  • anion exchange chromatography carrier: LiChrospher DMAE, Merck Darmstadt, 0-1 M NaCl in 50 mM NaPhosphate
  • isopropanol precipitation for in vivo experiments, the procedure is performed under sterile conditions and the final product taken up in sterile PBS.
  • Example 2 Increased Cytokine Release by DNA-based Immunomodato ⁇ ren.
  • PBMCs Peripheral blood monocytes
  • A negative control
  • B DNA-based immunomodulators
  • C linear, thioat-protected CpG oligonucleotides
  • the incubation of the PBMCs was carried out with equimolar amounts of the substances used (1 micromol / liter). Thereafter, the supernatant of the batches was removed and an ELISA for the cytokines interferon-gamma and interleukin-6 was performed.
  • Delta Ct is plotted. Delta Ct is the difference of Ct values (of reference gene minus cytokine). The results are shown in FIG.
  • RPMI-8226 cells cell line of the B lymphocytes
  • A negative control, buffer
  • B DNA-based immunomodulators C: linear, thioat-protected CpG oligonucleotides
  • the cells were harvested and stained with fluorescently labeled antibodies against the surface molecules HLA-DR and ICAM-1 and measured in FACS. Plotted on the ordinate is the fluorescence intensity, on the abscissa the cell size.
  • Fig. A shows the results of buffer-stimulated B lymphocytes. According to this, 9.7% of the living cells are positive for the surface molecule HLA-DR, for ICAM-1 209.6%. These values are considered basic values. The results are shown in FIG.
  • PBMCs Peripheral blood monocytes
  • RPMI 1640 medium Peripheral blood monocytes
  • the PBMCs were stimulated by adding the following substances: A: negative control, buffer, B: DNA-based immunomodulators C: linear, thioat-protected CpG oligonucleotides and then incubated for 48 h.
  • the antibody titers IgM, IgA and IgG were determined by ELISA.
  • the antibody isotypes Ig1 and Ig2 were determined to give a measure of the cellular and humoral immune response. The titres that occur can be taken as an indicator of the dominant type of immune response that has developed. The results are shown in FIG. Example 5: Toxicity comparisons based on organ enlargements.
  • mice Female mice (C57BL / 6) were grouped into three groups of 10 animals each. The animals were 100 microliters daily for one week
  • the concentration of the injected substances was 2.5 micrograms / microliter and 60 micrograms / microliter. After one week, the animals were stunned and killed. Spleen, liver, inguinal and mesenteric lymph nodes were removed and weighed. Static analysis was performed by ANOVA test. The results are shown in Fig. 5 a, b, c.
  • Example 6 Examination of the influence on the blood clotting time.
  • PBMCs Peripheral blood monocytes
  • A negative control
  • B DNA-based immunomodulators
  • C linear, thioat-protected CpG oligonucleotides
  • the values of the diagrams are from different donors.
  • the aPPT was determined according to the clinical standard using the BBL Fibro System Fibrometer (Becton Dickinson). The results are shown in FIG.
  • Example 7 Determination of recall antigens after a chemotherapy cycle
  • PBMCs obtained after the first cycle of chemotherapy were tested for the presence of recall antigen specific cytotoxic T lymphocytes.
  • the determination of the recall antigens took place before and after the therapy.
  • the recall antigens used were cytomegalovirus and Epstein-Barr virus (CMV, EBV). The values were determined by flow cytometric analysis (see FIG. 7). Thereafter, Pat12 (patient 12) shows an increase in CD8 positive cells by 723% after the first cycle.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren in Form von kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäuremolekülen, enthaltend immunstimulatorische Sequenzmotive zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen in Kombination mit chemotherapeutischen Substanzen.

Description

IMMUNMODULIERENDES MITTEL IN VERBINDUNG MIT CHEMOTHERAPEUTISCHEN MASSNAHMEN
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines kovalent geschlossenen Nukleinsäure- moleküls zur Herstellung eines Arzneimittels, welches in Kombination mit Che¬ motherapeutika zur therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen dient.
Tumorerkrankungen sind eine der wesentlichsten Todesursachen in der industriali- 5 sierten Welt. Etablierte Methoden der Therapie von Krebserkrankungen wie chirur¬ gische Entfernung, Bestrahlung und Chemotherapie führen häufig bestenfalls zu einem zeitlich begrenzten Rückgang der Erkrankung. Bestimmte karzinogene Er¬ krankungen, wie das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom, sind jedoch beispielswei¬ se nicht operabel und die Lebensdauer der Patienten beträgt derzeit mit oder ohne 10 Therapie ungefähr 1 Jahr.
Die Wirksamkeit der Chemotherapie beruht vor allem darauf, dass besonders dieje¬ nigen Zellen empfindlich auf den Angriff von Medikamenten reagieren, die sich ständig teilen und vermehren. Dies sind in erster Linie die malignen Tumorzellen. Da sich aber auch gesunde Zellen verschiedener Organsysteme teilen, reagieren 15 auch diese empfindlich auf die Chemotherapie. Einige Zytostatika sind dabei selbst krebserregend, mutagen oder keimbahnschädigend. Aus diesem Grund wäre eine kurze Behandlungsdauer mit wenigen Chemotherapie-Zyklen von großem Vorteil für die Patienten, um die Nebenwirkungen für den Patienten gering zu halten.
Eine der großen Herausforderungen bei der Anwendung der Chemotherapie ist aber 20 nicht nur die Reduzierung der Nebenwirkungen. Es zeigt sich auch, dass gewisse Krebsarten eine Resistenz gegen Medikamente der Chemotherapie entwickeln. Trotz aller teilweise schweren Nebenwirkungen bleibt die Chemotherapie dennoch eine unverzichtbare Säule der Krebsbehandlung. Stand der Technik
Chemotherapien erfolgen üblicherweise in mehreren Zyklen, die von 2- bis 4- wöchigen Behandlungspausen unterbrochen sind. In dieser Zeit wirken die Medika¬ mente und der Patient kann sich von den Nebenwirkungen erholen.
Die Chemotherapeutika vernichten die Tumorzellen durch biochemische Reaktio¬ nen, die den Zelltod einleiten.
Zellen können durch zwei Arten des Zelltodes untergehen, durch Apoptose, den programmierten Zelltod, oder durch Nekrose, den provozierten Zelltod. Tumorzellen gehen durch Nekrose zu Grunde. Der Zellkern zerfällt und die inneren Strukturen der Tumorzelle lösen sich auf. Dadurch wird eine Immunantwort ausgelöst, in deren Folge Zellen des Immunsystems angelockt werden. Sie grenzen die Nekrose zu lebensfähigem Gewebe ab und zersetzen die Proteine der abgestorbenen Zellen.
Im Gegensatz zu Pathogenen, die in den Körper eindringen, induzieren die beim Zerfall freigesetzten tumor-assoziierten Antigene (TAA) meistens nur eine schwache Immunantwort. Um gegen solche Antigene eine suffiziente Immunantwort zu indu¬ zieren, muß die vorhandene immunologische Toleranzschwelle durchbrochen wer¬ den. Aus diesem Grund besteht ein Therapieansatz darin, die Wirkung der Chemo¬ therapie durch Kombination mit anderen Therapien, u.a. durch zusätzliche Verabrei¬ chung von Interferonen oder Zytokinen, zu verbessern und so das körpereigene Immunsystem zu unterstützen (McDermott et al., 2004, Expert Opin Biol Ther. 4: 455-68).
Bei Versuchen zur Stimulation von Immunantworten ist beobachtet worden, daß gewisse Nukleinsäuresequenzen, die CpG-Motive (CpG = unmethyliertes Cytosin- Guanosin) aufweisen, eine enorme immunstimulatorische Wirkung haben können. Solche nicht methylierten CpG-Motive kommen in bakterieller DNA vor und stellen für das Immunsystem ein „danger signal" dar (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835).
In Mausexperimenten zeigte sich, daß die Verabreichung von CpG-reichen DNA- Sequenzen zu einer starken Aktivierung der B-Lymphozyten führt und die Expression bestimmter Zytokine, beispielsweise von IL-6 und GM-CSF, anregt. Zusätzlich induzieren sie über die Zytokine lnterleukin-12, Interferon-gamma und Tumomekrosefaktor-alpha eine zytotoxische, also TH1 -betonte, Immunantwort. Die zytotoxischen T-Lymphozyten des TH1 -Armes sind in der Lage, Tumorzellen anzugreifen und zu zerstören. Daneben führen CpG-Motive zur Aktivierung von NK- (natural killer) und dendritischen Zellen (Klinman et al., 1996, PNAS USA 93: 2879, Sparwasser et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2045).
Klinische Versuche der Phase l/ll zur Verwendung von CpG-haltigen Oligonukleotiden zur Unterstützung der Therapie von metastasiertem Brustkrebs mit Herceptin (HER) wurden durchgeführt. Die Therapie führte in einem signifikanten Anteil an Patienten zu einer Tumorregression (Baselga et al., 1996, J. Clin. Oncol. 14: 737-744). Im Gegensatz zu den Chemotherapeutika ist das Wirkungsprinzip von Herceptin ein völlig anderes. Bei etwa 20 Prozent aller Brustkrebspatientinnen wird das HER-2 Rezeptorprotein auf den Krebszellen überexprimiert. Herceptin, ein monoklonaler Antikörper, bindet gezielt an Teile des HER-2 Rezeptors und blockiert ihn, so daß keine Wachstumssignale mehr ausgesandt werden. Bei HER-2- negativen Tumoren finden sich auf den Krebszellen dagegen keine oder zu wenige Andockstellen für den Antikörper. Das Wachstum dieser Zellen wird von ihm so we¬ nig beeinflusst, dass eine Blockade des Rezeptors keinen Effekt hat; diese Patien¬ tinnen haben keinen Nutzen von einer Therapie.
Das US-Patent 6,653,292 zeigt ein Konzept auf, Tumor-Erkrankungen per Kombina¬ tion von Zytokinen, bspw. GM-CSF, mit chemotherapeutischen Maßnahmen als auch mit der Kombination von immunstimulatorischen CpG-enthaltenen Oligonukle¬ otiden mit Chemotherapie zu behandeln. In-vivo bzw. in-vitro Daten oder klinische Ergebnisse, die die Wirksamkeit der beanspruchten Kombinationen belegen, kön¬ nen allerdings nicht gezeigt nicht gezeigt werden.
Die in beiden Fällen eingesetzten linearen CpG-Oligonukleotide sind zum Schutz vor deren Abbau durch zelluläre Enzyme an ihren Enden mit Phosphorthioaten ge¬ schützt. In klinischen Studien zeigte sich allerdings, dass diese Thioat- Verbindungen erhebliche nachteilige Nebenwirkungen, vor allem auf das Blutgerin¬ nungssystem und das Komplementsystem, haben (Sheehan et al., 1998, Blood 92: 1617-1625). So wurde in Rhesus Affen eine starke Toxizität der thioat-geschützten CpG-Oligonukleotide infolge der Aktivierung des Komplementssystems nachgewie¬ sen (Henry et al., 2002, Int. Immunopharmacol 2: 1657). Zudem führen die Thioat- Modifikationen zu einer signifikanten Milzvergrößerung, zur Zerstörung lymphati- - A -
scher Follikel und zur Immunsuppression nach wiederholter Anwendung in Mäusen (Heikenwalder et al., 2004, Nat. Med. 10: 187).
Diese gravierenden Nebenwirkungen, lassen eine Anwendung thioat-geschützter CpG-Oligonukleotide in der Tumortherapie nur unter großem Vorbehalt zu.
Aus der EP 1 196 178 B1 sind weiterhin immunstimulatorische Nukleinsäurese- quenzen (ISS) bekannt, die ebenfalls CpG-Motive enthalten, nur einige Basen lang sind und nicht über die Expression von auf ihnen kodierten Proteinen wirken. Es handelt sich dabei um hanteiförmige, kovalent geschlossene Desoxyribonukleinsäu¬ remoleküle. Sie bestehen aus Oligonukleotiden, deren Basen partiell mit sich selbst paaren können und einer oder zwei Haarnadelschleifen (Loop), die 30 Basen um¬ fassen und mehrere CpG -Motive enthalten (siehe Fig. 1 ). Die Lehre vom Gebrauch und Herstellung immunstimulatorischer, CpG-enthaltender ISS ist in der EP 1 196 178 B1 umfassend erläutert. Die kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäure¬ moleküle können mit Vorteil aus offenkettigen Desoxyribonukleinsäuremolekülen, welche eine in Teilen selbstkomplementäre Sequenz aufweisen und miteinander oder einem zweiten Molekül ein intermediär stabiles Hybrid bilden können, gewon¬ nen werden. Vorteilhafterweise kann das Molekül auch durch intramolekulare Ligati- on eines Moleküls, welches mindestens zwei selbstkomplementäre Bereiche auf¬ weist, welche durch nur eine Lücke im Phosphatrückgrat getrennt sind, gewonnen werden. Die so gewonnenen Moleküle weisen keine freien 5'- oder 3'- Enden auf und sind somit nicht für Exonukleasen zugänglich.
Vorzugsweise umfaßt das immunmodulierende Oligodesoxyribonukleotid nach der EP 1 196 178 B1 eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxyzyto- sin, G Desoxyguanosin, A Desoxyadenosin und T Desoxythymidin ist. Vorzugswei¬ se ist die Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert und besagtes Desoxyribonukleinsäuremole¬ kül umfasst 40 bis 200 Nukleotide.
Trotz langjährigen Forschungen und erfolgversprechenden Ansätzen, ist es bisher nicht gelungen, eine wirksame Therapie gegen Tumorerkrankungen zu entwickeln. Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Arz¬ neimittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen zur Verfügung zu stellen, wel¬ ches zu einer effektiven gegen die Tumor-Antigene gerichteten humoralen und zel¬ lulären Immunantwort führt.
Lösung der Aufgabe und Vorteile der Erfindung
Das grundsätzliche Problem in der Erkennung eines Tumors durch das körpereige¬ ne Immunsystem besteht darin, dass Tumore im Gegensatz zu den meisten Mikro¬ organismen keine Entzündungsreaktion auslösen. Dadurch fehlt dem Immunsystem das Signal zum Start der Immunreaktion. Die Tumorzellen werden nicht als entarte- te Zellen erkannt und können dadurch ungehindert wachsen und sich vermehren.
Durch das nekrotische Absterben der Tumorzellen infolge der Chemotherapie wer¬ den Zelltrümmer und molekulare Bruchstücke aus dem Zytoplasma freigesetzt. Die¬ se freigesetzten Strukturen, die auch als Tumor-Antigene bezeichnet werden, bilden wichtige Erkennungs- und Zielstrukturen für den Angriff des Immunsystems gegen den Rest-Tumor oder im Körper verstreute Tumorzellen. Als Folge chemotherapeu¬ tischer und/oder strahlentherapeutischer Maßnahmen mit teilweise hoch-toxischen Zytostatika, befinden sich aufgrund der eintretenden Nekrose der Zellen eine Viel¬ zahl von Antigenen im Körper. Das körpereigene, angeborene (innate) Immunsys¬ tem hat jedoch keine evolutiv ausgebildete Spezifität für solche Strukturen wie es für Mikroben oder andere externe Krankheitserreger vorhanden ist. Tumor-spezifische antigene Strukturen werden aus diesem Grund nur schlecht oder nicht erkannt vom innaten Immunsystem. Das hat zur Folge, dass die Tumor-Antigene durch das inna¬ te Immunsystem nicht effektiv bekämpft werden. Da das adaptive Immunsystem noch nicht durch Tumor-Antigene in Abwesenheit von notwendigen Kofaktoren wie Entzündungssignalen ausgelöst ist, ist eine spezifische Immunantworten gegen die Tumor-Antigene noch nicht hervorgerufen.
Dieses Problem wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren und die erfindungsgemäße Kombinationsvakzine gelöst.
Die Erfindung macht sich die Erkenntnis zunutze, dass eine unspezifische Immun- antwort in eine adaptive, spezifische Immunantwort überführbar ist, sofern auch in unmittelbarem Zusammenhang die Antigene, gegen die sich die Immunantwort rich¬ ten soll, vorhanden sind.
Durch die Verabreichung von DNA-basierten Immunmodulatoren wird dem körper¬ eigenen Immunsystem eine Infektion vorgetäuscht, die tatsächlich nicht stattgefun- den hat. Infolgedessen werden Zellen, also vor allem die Thymozyten mit Helfer¬ funktion und die zytotoxischen Thymozyten, B-Lymphozyten und sog. NK (natural killer)-Zellen, Makrophagen und Monozyten sowie dendritische Zellen und ihre Vor¬ läufer, sowie bisher in ihrer Funktion nicht aufgeklärte Zellpopulationen mit Funktio¬ nen innerhalb des Immunsystems zur Proliferation, Migration, Differenzierung oder Aktivität angeregt und zum Infektionsort „gelockt". Die verschiedenen Immunzellen, ob in den beschriebenen Prozessen neu gebildet oder durch Botenstoffe „ange¬ lockt", finden allerdings am Infektionsort keine Infektionserreger. Infolge der Chemo¬ therapie befinden sich jedoch die durch Nekrose freigesetzten Tumor-Antigene im Körper. Die durch die DNA-basierten Immunmodulatoren ausgelöste Immunreaktion führte wie beschrieben zur Bildung von Immunzellen. Diese fressen nun die Tumor- Antigene anstelle der nicht vorhandenen Infektionserreger und präsentieren sie als molekulare Bruchstücke dem adaptiven Immunsystem. Dadurch lernt das adaptive Immunsystem die molekularen Erkennungs- und Zielstrukturen der Tumorzellen kennen und bildet immer mehr spezifische Immunzellen gegen diese aus. Das Im- munsystem ist dadurch in die Lage versetzt worden, auch zukünftig Abwehr- und Zerstörungszellen gegen diese auszubilden.
Die DNA-basierten Immunmodulatoren führen zur Bildung von Gedächtnisantige¬ nen, sog. Recall-Antigenen. Durch spezielle Abwehrzellen kann sich das Immunsys¬ tem an diese Antigene "erinnern" und es kommt zur Auslösung einer zellulären Im- munantwort bei erneutem Kontakt (siehe Fig. 7).
Die Erfindung betrifft somit die neuartige Verwendung von DNA-basierten Immun¬ modulatoren, entsprechend Anspruch 1 und folgende, zur Herstellung eines Arz¬ neimittels, welches in Kombination mit Chemotherapeutika in der Tumortherapie eingesetzt wird.
Bei den DNA-basierten Immunmodulatoren handelt es sich um hanteiförmige, kova- lent geschlossene, CpG-Motive enthaltende Desoxyribonukleinsäuremoleküle. Die immunmodulierende Wirkung der hanteiförmigen, kovalent geschlossenen Des¬ oxyribonukleinsäuremoleküle hängt stark von der Loop-Doppelstrang-Kombination sowie den enthaltenen CpG Motiven ab. Die Linearisierung, die Deletion einer Haarnadelschleife, die Verkleinerung des Moleküls oder die Entfernung von CpG Motiven aus dem Molekül führt zu einem veränderten Induktionsmuster von Zytoki¬ nen.
Erfindungsgemäß werden daher Oligodesoxyribonukleotide eingesetzt, wobei das immunstimulierende Oligodesoxyribonukleotid
a) eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfasst, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,
b) und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teil- weise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.
Die Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 ist dabei im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert und umfasst 40 bis 200 Nukleotide.
Die in der EP 1 196 178 B1 beschriebenen immunmodulierenden Desoxyribo- nukleotide sind bevorteilt. Es war aber weder beschrieben noch war es zu erwarten, dass diese immunmodulierenden Desoxyribonukleinsäuremoleküle dazu geeignet sind, der Anregung des körpereigenen Immunsystems als vorbereitende Maßnahme bei Vorliegen der Diagnose einer malignen Tumorerkrankung bei gleichzeitig indi¬ ziertem Einsatz von Zytostatika zu dienen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend eine Reihe allgemeiner Begriffe wie folgt verstanden:
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Behand¬ lung" die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung eines Arzneistoffes. Immunstimulation/ Immunmodulation bezeichnet die therapeutische Beeinflussung der Immunreaktion, also der Abwehrbereitschaft des Organismus. Das Ziel einer solchen Therapie ist es, den Tumor mit körpereigenen Mitteln zu bekämpfen.
Unter Chemotherapie soll die systemische medikamentöse Therapie von Tumorer- krankungen mit sog. Zytostatika verstanden werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff Chemothera¬ peutika Zytostatika, die in der adjuvanten, palliativen und kurativen Tumortherapie üblicherweise eingesetzt werden. Dazu gehören beispielsweise, aber nicht aus¬ schließlich und abschließend, Chemotherapeutika
• aus der Gruppe der Topoisomerase-Inhibitoren, bspw. Irinotecan, Topote- can,
• aus der Gruppe der Alkylantien, bspw. Busulfan und Dacarbazin,
• aus der Gruppe der Platinverbindungen, bspw. Cisplatin, Carboplatin oder Oxaliplatin,
• aus der Gruppe der Antimetaboliten, bspw. Methotrexat, 5- Fluoruracil, Mer- captopurin oder Cytarabin,
• aus der Gruppe der Antracycline und Actinimycine, bspw. Mitoxantron und Amsacrin,
• aus der Gruppe der Vinca-Alkaloide, wie bspw. Vinorelbin,
• aus der Gruppe der Taxane, bspw. Paclitaxel und Docetaxel,
• sowie Zytostatika aus der Gruppe der AntiÖstrogene, bspw. Tamoxifen.
Im Sinne der Erfindung sind auch weitere nicht ausdrücklich genannte Zytostatika umfasst, die im Rahmen einer Chemotherapie zum Einsatz kommen. Bevorzugt sind Zytostatika oder Kombinationen davon, die nur in einem einzigen Zyklus einem Patienten verabreicht werden.
Der Begriff Tumorerkrankungen umfaßt karzinogene metastasierende Erkrankungen aus der Gruppe der Cervixkarzinome, der Mammakarzinome, der kolorektalen und rektalen Karzinome, der primären Leberzellkarzinome, der Prostatakarzinome, des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomes (NSCLC), der Pankreaskarzinome, der Harnblasenkarzinome und der Ovarialkarzinome, sowie weitere nicht genannte Tu¬ morerkrankungen.
Die aufgrund der neuen erfindungsgemäßen Verwendung resultierende Vakzine ist dazu vorgesehen, als Injektion für Patienten zu dienen, die diese in und unter die Haut und in die Muskulatur erhalten.
Die Verabreichung von Desoxyribonukleinsäuremolekülen, entsprechend Anspruch 1 und folgende, im unmittelbaren Vorfeld des Beginns einer Therapie am Patienten mit Zytostatika führt somit am Applikationsort infolge der stattfindenden Immunreak- tion zu einer hohen Konzentration an löslichen proliferationsfördemden Zytokinen und kostimulatorischen Molekülen im Verbund mit tumor-assoziierten Antigenen (TAA), die zu Aktivierung und Proliferation von tumor-spezifischen T-Zellen führt.
Ebenso werden in Folge der Injektionen mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende antigenpräsentierende Zellen (APC) und den- dritische Zellen (DC) an den Applikationsort dirigiert. Das Vorhandensein dieser beiden Zelltypen wirkt synergistisch auf die Präsentation von TAA und die verstärkte Präsentation der TAA wirkt seinerseits auf die aktivierten zytotoxischen T- Lymphozyten, die jetzt verstärkt gebildet werden.
Weiterhin führt die Injektion von Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende zur Expression immunrelevanter Oberflächenmoleküle auf den Tumorzellen, eingeschlossen ICAM-1 , HLA-DR, CD80 und CD40. Das Adhäsi¬ onsmolekül ICAM-1 bewirkt die Aktivierung von Effektor-T-Helferzellen und über das HLA-DR konnte gezeigt werden, dass die Expressionsdichte des HLA-DR auf den Monozyten ein sehr guter Surrogatmarker für die Fähigkeit der Monozyten mit der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (z.B. Tumomekrosefaktor-alpha, IL-1 , IL- 6, IL-8) zu reagieren, ist. In-vitro konnte gezeigt werden, das Desoxyribonukleinsäu¬ remoleküle entsprechend Anspruch 1 und folgende zur Bildung von Interferon- gamma und lnterleukin-6, ein weiterer Stimulator der Immunantwort und der Häma- topoese führt (siehe Fig. 2). Die verstärkte Expression der Oberflächenmoleküle ICAM-1 und HLA-DR auf B-Lymphozyten ist in Fig. 3 gezeigt.
Weiterhin verursachen die Desoxyribonukleinsäuremoleküle entsprechend An¬ spruch 1 und folgende eine verstärkte Proliferation von B-Lymphozyten, den Trä¬ gern der humoralen Immunantwort. Die B-Lymphozyten differenzieren sich entwe¬ der zu antikörperproduzierenden Plasmazellen oder zu Gedächtniszellen, die bei erneutem Kontakt mit dem bekannten Antigen direkt zur Antikörperproduktion über¬ gehen. Es konnte gezeigt werden, das die Desoxyribonukleinsäuremoleküle ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende zu einer verstärkten Sekretion der Immunglo¬ buline IgM, IgA und IgG führen (siehe Fig. 4). Die Antikörperisotypen IgGI und lgG2 wurden ebenfalls bestimmt, um einen möglichen Th2/Th1 shift in der Immunantwort nachzuweisen. Die Isotopenverteilung von Immunglobin gamma (IgG) für ein be¬ stimmtes Antigen spiegelt die Ausprägung der gesamten Immunantwort gegen die¬ ses Antigen wider. Dabei sind IgG -1 Subtypen charakteristisch für eine humorale Antwort, begleitet von einer verstärkten Ausschüttung von Interleukinen IL-4 und IL- 10 durch aktivierte Lymphozyten. Ein erhöhter Spiegel von Subtyp IgG 2 ist typisch für eine zelluläre Th1 -Antwort, begleitet von erhöhter Ausschüttung von IFN-gamma und lL-12.
Im Unterschied zu den im Stand der Technik bekannten linearen, thioat-geschützten CpG-Motive enthaltenden Oligonukleotiden, weisen die verwendeten Desoxyribo¬ nukleinsäuremoleküle, entsprechend Anspruch 1 und folgende, eine Reihe von Vor- teilen auf. Sie führen nicht zu einer Organvergrößerung, was am Beispiel der Orga¬ ne Leber, Milz und Lymphknoten in Mäusen im Vergleich gezeigt werden konnte (siehe Fig. 5). Ebenso konnten keine auftretenden Anomalien dieser Organe im Be¬ handlungszeitraum festgestellt werden.
Desweiteren führen sie nicht zu der beschriebenen Verlängerung der Blutgerin- nungszeit als Folge der Behandlung (siehe Fig. 6). Eine Erhöhung der Blutgerin¬ nungszeit würde zu einer verlängerten Blutungsdauer bei äußeren Wunden, Nasen¬ bluten, Zahnfleischbluten oder winzigen Verletzungen durch die Aufnahme von Nah- rung auf der Magen-Darmschleimhaut und bei Operationen führen. Weiterhin be¬ stünde die Gefahr innerer Blutungen, die evtl. zu spät erkannt werden.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, das die Gabe von Desoxyribonuklein¬ säuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende im Vorfeld einer Chemothe- rapie zu einer Hochregulation der Expression von Oberflächenantigenen an Tumor¬ zellen führt und damit die Tumorzellen für das Immunsystem besser erkennbar macht. Ebenso kommt es zur Aktivierung von Rezeptoren für wichtige Immunzellen, unter anderem NK-Zellen, die die Fähigkeit des Immunsystems zur Bekämpfung der Tumorzellen steigern. Desweiteren ist die verstärkte Bildung von Antikörpern, die ebenfalls die Tumorzellen zerstören können, zu beobachten. Lokale Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und Effektorzellen wie natürlichen Killerzel¬ len (NK-Zellen) und T-Lymphozyten sind wichtig für eine effektive Immunreaktion gegen Tumore.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Un- teransprüchen und der Beschreibung. Die überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels zur Tumortherapie, sowie das erfindungsmäße Verfahren wird anhand der Tabellen und den Ausführungsbeispielen deutlich; es zeigt:
Fig. 1a und 1b: Schematische Darstellung kovalent geschlossener immunmo- dulierender CpG-Motive enthaltende Oligodesoxyribonukleoti- de: hanteiförmige Struktur mit jeweils drei, als dunkler Kreis dargestellten CpG-Motiven in den Haarnadelstrukturen der Loops; darin bedeuten I: Loop und II: Stamm.
Fig. 2: Zeigt die Ausschüttung der Zytokine Interferon-gamma und lnterleukin-6 nach der in-vitro Stimulation von periphären
Blutmonozyten (PBMCs) mit:
A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Ausschüttung von Interferon- gamma oder lnterleukin-6. Beide Moleküle B und C sind in der Lage, die PBMCs zur Zytokinausschüttung anzuregen. Die Ausschüttung von Interferon-gamma wird durch B sogar signifikant um das 2,5 fache im Vergleich zu C gesteigert. Auch für das Zytokin lnterleukin-6 ist diese Tendenz der signifikant verbesserten Ausschüttung im Vergleich zu C sichtbar.
Fig. 3: Zeigt die Expression der immunrelevanten
Oberflächenmoleküle HLA-DR und ICAM-1 nach in-vitro Stimulation von B-Lymphozyten durch: A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.
Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Stimulation von HLA-DR oder ICAM-1. Die angegebenen Werte von 9,7% und 209.6 werden als Grundwerte für die mittlere Fluoreszenzintensität zur Berücksichtigung von nicht-stimulierten positiven Zellen benutzt. Beide Moleküle B und C führen zu einer Stimulation beider Oberflächenmoleküle. Wobei durch B und C annähernd gleiche Ergebnisse erreicht werden.
Fig. 4: Zeigt die erhöhte Antikörperproduktion nach in-vitro Stimulation von periphären Blutmonozyten (PBMCs) durch:
A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.
Die Negativkontrolle führt erwartungsgemäß zu keiner Stimulation der Immunglobuline IgM1 IgA, IgGI und lgG2. B und C führen zu einer deutlichen Stimulation der Antikörperproduktion, wobei die IgA Ausschüttung durch B um das Dreifache im Vergleich zu C gesteigert wird. Die relativen Titer der Isotypen IgGI und lgG2 können als Indikator für die dominante Art der entstandenen Immunant¬ wort gewertet werden. Das Verhältnis von lgG2 und IgGI zeigt, das die DNA- basierten Immunodulatoren neben der humoralen Immunantwort auch eine zytotoxi¬ sche Immunantwort (Th1 ) auslösen. Fig. 5a: Es wurde untersucht, ob die DNA-basierten Immunmodulato¬ ren und die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide auf den lebenden Organismus eine toxische Wirkung haben. Die Bestimmung erfolgte anhand der Gewichtszunahme der inneren Organe Leber, Milz und Lymphknoten Es wurden in
Mausexperimenten verabreicht:
A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrolle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula¬ toren, B, führen unabhängig von der verabreichten Menge zu keiner Vergrößerung der Leber. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Lebervergrößerung.
Fig. 5b: Hier wurde der Einfluß von B und C auf das Organ Milz untersucht. Verabreicht wurde:
A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.
Die Negativkontrolle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula- toren, B, führen auch hier unabhängig von der verabreichten Menge zu keiner Ver¬ größerung der Milz. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Milzvergrößerung, die eine Gewichtszunahme um fast das Fünfache zu A oder B darstellt.
Fig. 5c: Hier wurde der Einfluß von B und C auf die Lymphknoten untersucht. Verabreicht wurde:
A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide. Die Negativkontrölle dient wieder als Grundwert. Die DNA-basierten Immunmodula¬ toren, B, führen auch hier wieder unabhängig von der verabreichten Menge zu kei¬ ner Vergrößerung der Lymphknoten. Die thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide hingegen, führen schon bei der geringen Menge von 60 Mikrogramm zu einer signifikanten Lymphknotenvergrößerung, die eine Zunahme um das Doppelte zu A oder B darstellt.
Fig. 6: Zeigt eine weitere Untersuchung zur toxischen Wirkung auf den Organismus infolge der Verabreichung der DNA-basierten Immunmodulatoren und thioat-geschützten CpG- Oligonukleotide. Als Parameter wurde hier die Verlängerung der Blutgerinnungszeit untersucht. Bei den zwei Abbildungen handelt es sich um zwei verschiedene Spender. Die partielle Thromboplastinzeit in Sekunden ist auf der Ordinate aufgetragen. Verabreicht wurde: A: Negativkontrolle, Puffer
B: DNA-basierte Immunmodulatoren
C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide.
Die DNA-basierten Immunmodulatoren zeigen in allen beiden Versuchen im Gegensatz zur Negativkontrolle zu keiner Verlängerung der Blutgerinnungszeit. Hingegen führen die thioat-geschützten CpG-Oligonukleotide im Vergleich zur Negativkontrolle und zu B zu einer deutlichen Verlängerung der Blutgerinnungszeit.
Fig. 7: Zeigt die Recall-Antigene von vier Patienten nach einem
Chemotherapie-Zyklus.
Alle Patienten befanden sich zu Beginn der Behandlung in einer fortgeschrittenen Phase der Erkrankung. Zur Beurteilung des klinischen Erfolges sollen folgende
Formulierungen entsprechend World Health Organization (1979) gelten: als eine partial Response (PR) wird der Rückgang der erfaßbaren Tumorherde um mehr als
50% in den letzten vier Wochen sowie die Unterdrückung neuer Tumorherde bezeichnet. Unter stable disease (SD) ist das Gleichbleiben des Zustandes zu verstehen. Eine mixed Response (MR) ist eine gemischte Reaktion, bspw. das
Fortschreiten der Metastasierung und ein Rückgang der Metastasen an einem anderen Ort. Eine complete Response (CR) bezeichnet den vollständigen Rückgang der Tumorherde.
Auswahl der Patienten: Patienten mit Cervixkarzinom, Mammakarzinom, kolorekta¬ lem und rektalem Karzinom, primärem Leberzellkarzinom, Prostatakarzinom, nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC), Pankreaskarzinom, Harnblasenkar¬ zinom und Ovarialkarzinom im Alter zwischen 18 und 70 Jahren, und einem Karnofsky-Index von 70-100 waren aufnahmeberechtigt. Ausschlusskriterien waren: eine vorhergegangene Zytokinbehandlung oder Chemotherapie, die weniger als 28 Tage zurücklag, Kreatinwerte über 265μmol/l, Bilirubinwerte über 51 μmol/l, nichtkompensierte Herzinsuffizienz, ventrikuläre Rhytmusstörungen, schwere psychiatrische Krankheiten, aktive Hepatitis A, B oder C, HIV Infektion.
Behandlung: Neben der Anamnese wurden die folgenden Parameter vor Begin der Behandlung bestimmt: physische Untersuchung, Hämatologie (Hämoglobin, Hematocrit, Leukozyten und Plättchenzahl), chemische Blutwerte and Urinanalyse. Es wurde für die Immunstatusbestimmung Blut genommen. DHT (Delayed type hypersensitivity) Hauttests wurden mit dem Multitest Merieux Test (Leimen, Germany) durchgeführt. Röntgenaufnahmen des Oberkörpers sowie Computertomographien des Oberkörpers und Abdomens wurden erstellt. Umfassende immunologische Untersuchungen, hämatologische Untersuchungen und grobe klinische Untersuchungen (physische Untersuchung, Ultraschall Untersuchung und Untersuchung des Unterleibes, bei Bedarf) wurden wiederholt durchgeführt. Eine komplette klinische und immunologische Untersuchung, vergleichbar mit der eingangs durchgeführten Auswahluntersuchung, fand am Ende eines Behandlungs-Zyklus statt.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass Patienten Injektionen von 500 Mikrogramm der Desoxyribonukleinsäuremoleküle entsprechend Anspruch 1 und folgende in und unter die Haut und in die Muskulatur erhalten. Dabei erhalten die Patienten im Zeit¬ raum um den jeweiligen Chemotherapie- Zyklus in festgelegten Abständen, die von 2 bis 8 Tagen reichen, fünfmal jeweils zwei Injektionen a 500 Mikrogramm mit Des- oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende. Die Ge¬ samtmenge an verabreichten Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend An¬ spruch 1 und folgende, in PBS-Puffer gelöst, beträgt somit pro Injektionstag 1000 Mikrogramm der Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende. Die Gesamtmenge an Desoxyribonukleinsäuremolekülen variiert und liegt zwischen 1 und 10 Miligramm.
Die zwei Injektionen erfolgen am ersten Injektionstag an die typischen Impfstellen intradermal seitlich am linken und rechten Oberarm, am zweiten Tag intradermal auf der Vorderseite des linken und rechten Oberschenkels, am dritten Injektionstag subkutan ca. 30 Millimeter links und rechts des Bauchnabels, am vierten Injektions¬ tag subkutan in die beschriebenen Stellen der Oberarme und am fünften Tag intra¬ muskulär in die Vorderseite des linken und rechten Oberschenkels.
Injektionsschema für die Behandlung von metastasiertem Mammakarzinom:
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Der Injektionszeitpunkt ist in Relation zum Beginn der Chemotherapie (Tag Null) mit Gemcitabin angegeben.
Für die begleitende Diagnostik werden den Patienten vor Beginn der Behandlung und vor den jeweiligen Injektionen bis zu 50 Milliliter Blut entnommen.
Patienten mit metastasiertem Cervixkarzinom werden nach der Injektion von Des¬ oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende durch Be¬ strahlung behandelt.
Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom werden nach der Injektion von Des¬ oxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende mit dem ge- bräuchlichen Chemotherapeutikum Gemcitabin oder mit Xeloda behandelt. Ebenso ist der Einsatz von Anthracyklinen (Epirubicin, Doxorubicin, Mitoxanthrane) in Kom¬ bination mit der Behandlung mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 vorgesehen.
Patienten mit metastasiertem primären Leberkarzinom und Prostatakarzinom wer- den palliativ mit der Kombination an Desoxyribonukleinsäuremolekülen, entspre¬ chend Anspruch 1 und folgende, und Taxotere oder Desoxyribonukleinsäuremolekü¬ len, entsprechend Anspruch 1 und folgende, und Mitoxanthron behandelt.
Patienten, die an metastasiertem rektalen oder colorektalen Karzinom leiden, wer¬ den durch eine adjuvante oder palliative Therapie nach Injektion von Desoxyribo- nukleinsäuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende mit der Zytostatika- kombination Leucovorin und 5-Fluorouracil (5-FU) behandelt. Ebenso ist die Kombi¬ nation mit FOLFOX 4 (Oxaliplatin, Folinsäure und 5-Fluorouracil) und FOLFIRI (Iri- notecan, Folinsäure und 5-Fluorouracil) nach der Injektion von Desoxyribonuklein¬ säuremolekülen entsprechend Anspruch 1 und folgende vorgesehen. AIIe Behandlungen finden nach vorgegebenen Zyklen statt. Dabei ist vorgesehen, nur einen Zyklus der Kombination bestehend aus der Behandlung mit Desoxyribo¬ nukleinsäuremolekülen und nachfolgender Chemotherapie durchzuführen. Sollte nach Beendigung des Chemotherapie-Zyklus eine weitere Behandlung notwendig sein, wird diese mit weiteren Injektionen mit Desoxyribonukleinsäuremolekülen ent¬ sprechend Anspruch 1 und folgende fortgesetzt. Ebenso kann die Behandlung durch immunotherapeutische Ansätze fortgeführt werden. Eine sofort anschließende Fortführung der Chemotherapie erscheint aus medizinischer Sicht nicht sinnvoll, wird aber nicht ausgeschlossen. Es erscheint durchaus möglich und ggf. auch ange- raten nach 6 Monaten die Behandlung fortzuführen, was im Sinne der Erfindung als weitere Verabreichung der erfindungsgemäßen Vakzine verstanden wird.
Beispiel 1 : Synthese kovalent geschlossener immunmodulierender Oligodesoxy- ribonukleotide entsprechend Anspruch 1 und folgende
Die Synthese kovalent geschlossener immunmodulierender Oligodesoxyribonukleo- tide wurde entsprechend der EP 1 196 178 B1 durchgeführt.
Zur Reinigung von Endotoxinen wurde das Ligationsprodukt einer anschließenden Anionenaustauschchromatographie (Trägermaterial: LiChrospher DMAE, Merck Darmstadt; 0-1 M NaCI in 50 mM NaPhosphat) unterworfen und durch Isopropa- nolpräzipitation konzentriert. Für in-vivo-Versuche wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt und das Endprodukt in sterilem PBS aufgenommen.
Beispiel 2: Erhöhte Zytokinausschüttung durch DNA-basierte Immunmodulato¬ ren.
Periphere Blutmonozyten (PBMCs) in RPMI 1640 - Medium wurden in 96-Loch- Platten ausgesät. Die PBMCs wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 48h inkubiert. Die Inkubation der PBMCs erfolgte mit äquimolaren Mengen der eingesetzten Substanzen (1 Mikromol/Liter). Danach wurde der Überstand der Ansätze abgenommen und ein ELISA für die Zytokine Interferon-gamma und lnterleukin-6 durchgeführt. Auf der Ordinate ist Delta Ct aufgetragen. Delta Ct ist die Differenz der Ct-Werte (von Referenzgen minus Zytokin). Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 3: Stimulation von immunologisch relevanten Oberflächenmolekülen auf B-Lymphozyten durch DNA-basierte Immunmodulatoren.
Die Inkubation von RPMI-8226 Zellen (Zelllinie der B-Lymphozyten) erfolgte über 48h mit äquimolaren Mengen (I Mikromol/Liter) der eingesetzten Substanzen (A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide). Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen die Oberflächenmoleküle HLA-DR und ICAM-1 angefärbt und im FACS gemessen. Aufgetragen auf der Ordinate ist die Fluoreszenzintensität, auf der Abszisse die Zellgröße. In Abb. A sind die Ergebnisse der mit Puffer stimulierten B-Lymphozyten aufgetragen. Danach sind 9,7% der lebenden Zellen positiv für das Oberflächenmolekül HLA-DR, für ICAM-1 209,6%. Diese Werte werden als Grundwerte angesehen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
Beispiel 4: Erhöhte Antikörperproduktion durch DNA-basierte Immunmodulato¬ ren.
Periphere Blutmonozyten (PBMCs) in RPMI 1640 - Medium wurden in 96-Loch- Platten ausgesät. Die PBMCs wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 48h inkubiert. Die Antikörpertiter IgM, IgA und IgG wurden mittels ELISA bestimmt. Die Antikörperisotypen Ig1 und Ig2 wurden bestimmt, um ein Maß für die zelluläre und humorale Immunantwort zu erhalten. Die auftretenden Titer können als Indikator für die dominante Art der entstandenen Immunantwort gewertet werden. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Beispiel 5: Toxizitätsvergleiche anhand von Organvergrößerungen.
Weiblichen Mäuse (C57BL/6) wurden zu drei Gruppen, je 10 Tiere zusammengefaßt. Den Tieren wurde über eine Woche täglich 100 Mikroliter der
Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat-geschützte CpG-Oligonukleotide intraperitoneal injiziert. Die
Konzentration der injizierten Substanzen betrug dabei 2,5 Mikrogramm/Mikroliter und 60 Mikrogramm/Mikroliter. Nach einer Woche wurden die Tiere betäubt und getötet. Milz, Leber, die inguinalen und mesenterialen Lymphknoten wurden entfernt und gewogen. Die statische Anlalyse wurde mittels ANOVA Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 a, b, c dargestellt.
Beispiel 6: Untersuchung des Einflusses auf die Blutgerinnungszeit.
Periphere Blutmonozyten (PBMCs) wurden durch Zugabe folgender Substanzen: A: Negativkontrolle, Puffer, B: DNA-basierte Immunmodulatoren C: lineare, thioat- geschützte CpG-Oligonukleotide stimuliert und danach für 3 min inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde die Blutgerinnungszeit anhand der partiellen Thromboplastinzeit (aPPT) in Sekunden bestimmt und ist auf der Ordinate aufgetragen. Die Werte der Diagramme stammen von unterschiedlichen Spendern. Die Bestimmung der aPPT erfolgte nach dem klinischen Standard mittels des BBL Fibro System Fibrometer (Becton Dickinson). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Beispiel 7: Bestimmung der Recall-Antigene nach einem Chemotherapy-Zyklus
Nach dem ersten Chemotherapy-Zyklus erhaltene PBMCs wurden auf das Vorhandensein Recall-Antigen spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten untersucht. Die Bestimmung der Recall-Antigene erfolgte vor und nach der Therapie. Als Recall-Antigene wurden Zytomegalie- und Epstein-Barr Virus (CMV, EBV) verwendet. Die Werte wurden mittels durchflußzytometrischer Analyse bestimmt (siehe Fig. 7). Danach zeigt sich bei Pat12 (Patient 12) eine Steigerung der CD8 positiven Zellen um 723% nach dem ersten Zyklus.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von DNA-basierten Immunmodulatoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort gegen Tumor- Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeutische Maß- nahmen freigesetzt werden, wobei die DNA-basierten Immunmodulatoren in
Form von hanteiförmigen, kovalent geschlossenen Desoxyribonukleinsäu¬ remolekülen vorliegen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei es sich bei den DNA-basierten Im¬ munmodulatoren um CpG-Motive enthaltende immunstimulatorische Nuk- leinsäuresequenzen handelt.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das immunstimulierende Oligodesoxy- ribonukleotid
a. eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfasst, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend
CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,
b. und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teil¬ weise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.
4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Sequenz mit der Basenfol¬ ge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und wobei besagtes Desoxyribonukleinsäuremolekül 40 bis 200 Nukleotide umfasst.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die immunmstimulierenden Oligodesoxyribonukleotide in eine applika¬ tionsfähige pharmazeutische Zusammensetzung überführt werden.
6. Arzneimittel zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort gegen Tumor- Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeutische Ma߬ nahmen freigesetzt werden, insbesondere eine Vakzine, entsprechend ei¬ nem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5.
7. Kombinationsvakzine zur Erzeugung einer spezifischen Immunantwort ge¬ gen Tumor-Antigene, die durch chemotherapeutische oder strahlentherapeu¬ tische Maßnahmen freigesetzt werden, bestehend aus zumindest zwei wirk¬ samen Komponenten, nämlich einem DNA-basierten Immunmodulator und einem Zytostatikum.
8. Kombinationsvakzine nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem DNA- basierten Immunmodulator um CpG-Motive enthaltende immunstimulatori- sche Nukleinsäuresequenzen handelt.
9. Kombinationsvakzine nach Anspruch 8, wobei das immunstimulierende ON- godesoxyribonukleotid
a. eine Sequenz mit der Basenfolge N1N2CGN3N4 umfasst, wobei N1N2 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend GT, GG, GA, AT oder AA, N3N4 ein Element ausgewählt aus der Gruppe umfassend CT oder TT, sowie C Desoxycytosin, G Desoxyguanosin, A Desoxy- adenosin und T Desoxythymidin ist,
b. und einen zirkulären Strang Desoxyribonukleinsäure mit einer teil¬ weise zueinander komplementären, antiparallelen Basensequenz umfasst und hanteiförmig ausgebildet ist.
10. Kombinationsvakzine nach Anspruch 9, wobei die Sequenz mit der Basen¬ folge N1N2CGN3N4 im einsträngigen Bereich des Oligodesoxyribonukleotids positioniert ist und wobei besagtes Desoxyribonukleinsäuremolekül 40 bis
200 Nukleotide umfasst.
11. Kombinationsvakzine nach Anspruch 7, wobei das Zytostatikum ausgewählt ist aus einer oder mehreren der Gruppe der Topoisomerase-Inhibitoren, aus der Gruppe der Alkylantien, aus der Gruppe der Platinverbindungen, aus der Gruppe der Antimetaboliten, aus der Gruppe der Antracycline und Actinimy- cine, aus der Gruppe der Vinca-Alkaloide, aus der Gruppe der Taxane, aus der Gruppe der Antiöströgene, sowie Kombinationen und Modifikationen da- von.
12. Kombinationsvakzine nach Anspruch 11 , wobei mehrere Zytostatika unter¬ schiedlicher Gruppen Bestandteil der Vakzine sind.
13. DNA-basierter Immunmodulator als Teil einer Kombinationsvakzine nach Anspruch 7 bis 12.
14. Zytostatikum als Teil einer Kombinationsvakzine nach Anspruch 7 bis 12.
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