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ES2407819T3 - Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer Download PDF

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ES2407819T3
ES2407819T3 ES06818817T ES06818817T ES2407819T3 ES 2407819 T3 ES2407819 T3 ES 2407819T3 ES 06818817 T ES06818817 T ES 06818817T ES 06818817 T ES06818817 T ES 06818817T ES 2407819 T3 ES2407819 T3 ES 2407819T3
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Ugur Sahin
Özlem TÜRECI
Dirk Usener
Stefan Fritz
Christoph Uherek
Gunda Brandenburg
Harald-Gerhard Geppert
Anja Kristina SCHRÖDER
Philippe Thiel
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Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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Abstract

Anticuerpo monoclonal que presenta la capacidad de unirse a la claudina 18A2 (CLD18A2) y que puedeobtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que presenta lasecuencia de aminoácidos SEC ID nº 16 o un ácido nucleico o una célula huésped que expresa dicho péptido,en el que el anticuerpo presenta la capacidad de mediar en la eliminación de células tumorales que expresanCLD18A2 in vivo, siendo inducida dicha eliminación por la unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 expresada pordichas células, y en el que el anticuerpo media en la eliminación de células que expresan CLD18A2 mediante la inducción de lisismediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celulardependiente de anticuerpos (ADCC).

Description

Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer.
Las terapias basadas en anticuerpos para el cáncer presentan el potencial de una mayor especificidad y un perfil de efectos secundarios más bajo que los fármacos convencionales. El motivo es la diferenciación precisa entre células normales y neoplásicas realizada por los anticuerpos y que su modo de acción se basa en mecanismos antitumorales inmunológicos menos tóxicos, tales como la activación del complemento y el reclutamiento de células inmunológicas citotóxicas.
Las dianas para las terapias basadas en anticuerpos deben presentar cualidades particulares, que forman la base para una discriminación correcta entre células normales y neoplásicas. Evidentemente una diana con restricción exclusiva a las células tumorales y totalmente indetectable en los tejidos normales resulta ideal para el desarrollo de terapéuticas de anticuerpos eficientes y seguras. En otro aspecto, un nivel elevado de sobreexpresión puede ser la base para la ventana terapéutica y los bajos efectos secundarios ejemplificados por el receptor de tipo 2 del factor de crecimiento epidérmico (HER-2), que como resultado de la amplificación génica es una buena diana para el anticuerpo trastuzumab (Herceptin).
Otras dianas para anticuerpos que ya han sido aprobados o que se encuentran en desarrollo clínico para la terapia tumoral presentan claras cualidades que no se basan en una sobreexpresión numérica de las moléculas diana sobre las células tumorales. En el caso de los anticuerpos contra el proteoglicano MUC-1, un péptido epítopo repetitivo en el esqueleto de la diana se encuentra infraglucosilado en las células tumorales y, de esta manera, alterado respecto a su contrapartida normal. En el caso de los anticuerpos contra CD20 (rituximab), CD52 (Campath-1H) y CD22 (epratuzumab), las dianas de anticuerpo presentan niveles de expresión comparables sobre las células tumorales y los linfocitos normales. En este caso, la ablación de células normales por el anticuerpo resulta tolerable, ya que las células madre no diana restituye el repertorio de linfocitos normal. Otros ejemplos de diferente accesibilidad de dianas para el anticuerpo son el antígeno carcinoembrionario (CEA) y la carboanhidrasa IX (CA9). Ambos antígenos se expresan sobre epitelios normales de colon y riñón, respectivamente. Sin embargo, los anticuerpos marcados radioactivamente para la obtención de imágenes sí distinguen bien entre tumor y tejido normal, y los anticuerpos citotóxicos resultan bien tolerados. Esto con toda probabilidad se debe a una expresión restringida de CA9 y CEA sobre la cara luminal del tejido epitelial normal, a la que no pueden acceder los anticuerpos IgG. Además, la molécula antigénica de adhesión a células epiteliales (Ep-CAM) pertenece a esta categoría. Debido a que es una molécula de adhesión a células homotípicas para las células epiteliales se localiza en el espacio intercelular. Curiosamente, mientras que los anticuerpos anti-Ep-CAM de alta afinidad son muy tóxicos, los anticuerpos de afinidad intermedia resultan bien tolerados. Esto sugiere accesibilidad de la diana Ep-CAM sobre las células normales, aunque también indica que la cinética de unión de los anticuerpos podría abrir una ventana terapéutica.
Una posibilidad es que otras proteínas específicas de las células epiteliales que participan en la adhesión célula/célula también resulten atractivas para los enfoques basados en anticuerpos, ya que en epitelios bien estructurados podrían resultar escasamente accesibles a los anticuerpos pero pasar a estar expuestos sobre las células tumorales. Por lo tanto, los presentes solicitantes analizaron proteínas que participan en la organización de la estructura del tejido epitelial para su idoneidad como dianas para anticuerpos terapéuticos. Una proteína que atrajo particularmente su atención fue la claudina-18.
Los documentos WO nº 2004/047863 y nº 2005/113587 dan a conocer la identificación de las variantes de procesamiento claudina-18A1 y claudina-18A2 como dianas diagnósticas y terapéuticas del cáncer.
La molécula de la claudina-18 (CLD18) (número de acceso de Genbank: variante de procesamiento 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369 y la variante de procesamiento 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026) es una proteína transmembranal integral con un peso molecular de aproximadamente 27,9/27,72 kD. Las claudinas son proteínas de membrana integrales situadas dentro de las uniones estrechas de epitelios y endotelios. Las uniones estrechas organizan una red de filamentos interconectados de partículas intramembranosas entre células contiguas. En las uniones estrechas, la ocludina y las claudinas son los componentes de proteína transmembranal más importantes. Debido a sus fuertes propiedades de adhesión intercelular, crean una barrera primaria para impedir y controlar el transporte paracelular de solutos y restringir la difusión lateral de los lípidos y proteínas membranales, manteniendo la polaridad celular. Las proteínas formadoras de unión estrecha son participantes cruciales en la organización de la estructura del tejido epitelial. Se planteó que dichas proteínas podrían ser escasamente accesibles a los anticuerpos en epitelios bien estructurados pero pasar a encontrarse expuestas sobre las células tumorales.
La CLD18 es una tetraspanina y presenta, de esta manera, 4 regiones hidrófobas. Los presentes solicitantes obtuvieron resultados que indicaban que CLD18 muestra varias conformaciones diferentes que podrían ser dianas selectivas de los anticuerpos. Una conformación (CLD18-Conformación-1) implica que la totalidad de las cuatro regiones hidrófobas actúa de dominios transmembranales (DT) normales y que se forman dos bucles extracelulares (el bucle1, abrazado por la región hidrófoba 1, y la región hidrófoba 2 y el bucle2, abrazados por las regiones hidrófobas 3 y 4), tal como se describe para la amplia mayoría de miembros de la familia de las claudinas. Una
segunda conformación (CLD18-Conformación-2) implica que, tal como se ha descrito para PMP22, otro miembro de la familia de las tetraspaninas (Taylor et al., J. Neurosc. Res. 62:15-27, 2000), el segundo y tercer dominios hidrofóbicos no cruzan por completo la membrana plasmática de manera que la porción (bucleD3) entre el primer y cuarto dominios transmembranales es extracelular. Una tercera conformación (CLD18-Conformación-3) implica un dominio extracelular de gran tamaño con dos regiones hidrófobas internas abrazadas por la primera y cuarta regiones hidrófobas, que sirven de dominios transmembranales normales. Debido a la presencia del sitio clásico de N-glucosilación en el bucleD3, las variantes topológicas de la claudina-18, CLD18-topología-2 y CLD18-topología-3 alojan un sitio de N-glucosilación extracelular adicional.
Se añade otro nivel de complejidad a la molécula de CLD18 por la presencia de dos variantes de procesamiento diferentes, las cuales han sido descritas en el ratón y el ser humano (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Las variantes de procesamiento CLD18A1 y CLD18A2 difieren en los primeros 21 aminoácidos N-terminales, que comprenden el primer TM y el bucle1, mientras que la secuencia proteica primaria del extremo C-terminal es idéntica.
CLD18A1 se expresa selectivamente sobre los epitelios pulmonar y estomacal normales, mientras que CLD18A2 se expresa únicamente sobre las células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Más importante, CLD18A2 se restringe a células diferenciadas efímeras del epitelio estomacal pero no se encuentra presente en la región de células madre gástricas. Mediante la utilización de RT-PCR sensible, se ha demostrado que ambas variantes no son detectables en absoluto en ningún otro órgano humano normal, pero se expresan robustamente en varios tipos de cáncer, entre ellos los tumores de estómago, esofágico, pancreático y pulmonar, así como en líneas celulares de cáncer humanas. La expresión es más importante en los subtipos de adenocarcinoma de estas indicaciones.
En algunos cánceres el peso molecular de la proteína difiere en el cáncer y el tejido normal contiguo. La proteína de peso molecular más alto observada en el tejido sano puede pasar a presentar el mismo peso molecular observado en el cáncer tras el tratamiento de lisados del tejido con el compuesto desglucosilante PNGasa F. Esto sugiere que CLD18 se encuentra menos N-glucosilado en el cáncer que en su contrapartida de tejido normal. Esta diferencia estructural probablemente da lugar a un epítopo alterado. Un motivo clásico de N-glucosilación se encuentra en la posición aa 116 dentro del dominio bucleD3 de la molécula.
Los términos "CLD18" y "variante de CLD18" según la invención comprenden: (i) variantes de procesamiento de CLD18, (ii) variantes de N-glucosilación de CLD18, (iii) variantes de conformación de CLD18, (iv) variantes de CLD18 libre y homotípica/heterotípicamente asociadas y localizadas en uniones estrechas intercelulares, y (v) variantes relacionadas con células de cáncer CLD18 y con células no de cáncer CLD18.
Las características moleculares y funcionales de CLD18 convierten a esta molécula en una diana muy interesantepara la terapia del cáncer basada en anticuerpos. Éstas en particular son: (i) la ausencia de CLD18 de la amplia mayoría de tejidos normales de toxicidad relevante, (ii) la restricción de la expresión de variante CLD18A2 a una población celular dispensable tal como células gástricas diferenciadas, que pueden ser restituidas por células madre sin diana del estómago, (iii) sugiere a la potencial glucosilación diferencial en células normales y neoplásicas, y (iv) la presencia de diferentes topologías conformacionales. Además, el papel de CLD18 como proteína de unión estrecha podría contribuir además a una buena ventana terapéutica. Debido a que las células tumorales expresan claudinas, aunque con frecuencia no forman uniones estrechas clásicas mediante asociación homotípica y heterotípica de las claudinas tal como se encuentran en el tejido epitelial normal, las células tumorales podrían presentar un pool considerable de claudinas libres que es susceptible a la unión extracelular de anticuerpos y a la inmunoterapia. Posiblemente los epítopos de unión de las claudinas en el epitelio sano se encuentran resguardados dentro de uniones estrechas protegidos del acceso de dichos anticuerpos.
El objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos que resultan útiles para la terapia de enfermedades en la que se expresa CLD18, tal como las enfermedades tumorales. Los anticuerpos indicados en la presente memoria también presentan utilidad en el diagnóstico de dichas enfermedades.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona de manera general anticuerpos que resultan útiles como terapéuticos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades asociadas a células que expresan CLD18, incluyendo enfermedades relacionadas con tumores, tales como el cáncer gástrico, el cáncer esofágico, el cáncer pancreático, el cáncer pulmonar, el cáncer ovárico, el cáncer de colon, el cáncer hepático, el cáncer de cabeza y cuello y el cáncer de la vesícula biliar.
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que presenta la capacidad de unirse a la claudina18A2 (CLD18A2) y que puede obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 16 ó un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicho péptido, en el que el anticuerpo presenta la capacidad de mediar en la eliminación de las células tumorales que expresan CLD18A2 in vivo, siendo inducida dicha eliminación por la unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 expresado por dichas células, y en el que el anticuerpo media en la eliminación de las células que
expresan CLD18A2 mediante la inducción de la lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la lisis mediada por citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC). Preferentemente, el anticuerpo se une a CLD18A1 y a CLD18A2 y más preferentemente se une a CLD18A2 pero no a CLD18A1. Preferentemente, los anticuerpos de la invención se unen a bucle1 de CLD-Conformación-1 y son específicos del mismo.
Las células que expresan CLD18A2 preferentemente son células de cáncer y se seleccionan, en particular, de entre el grupo que consiste de células tumorógenas gástricas, esofágicas, pancreáticas, pulmonares, ováricas, de colon, hepáticas, de cabeza y cuello y de vesícula biliar.
Preferentemente, la lisis mediada por la ADCC de las células tiene lugar en presencia de células efectoras, que en formas de realización particulares se seleccionan de entre el grupo que consiste de monocitos, células mononucleares, células NK y PMN.
El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, humano o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo, y puede seleccionarse de entre el grupo que consiste de anticuerpos IgG1, IgG2, preferentemente IgG2a e IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgD e IgE.
Según todos los aspectos de la invención, CLD18 preferentemente es CLD18 humano, preferentemente CLD18A2 humano, y CLD18A2 preferentemente presenta la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 2 y CLD18A1 preferentemente presenta la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 8.
En las formas de realización preferidas particulares, el anticuerpo de la invención se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes sobre la superficie de las células vivas. En formas de realización preferidas adicionales, el anticuerpo de la invención es específico para las células de cáncer, preferentemente las células de cáncer de estómago.
En determinadas formas de realización de la invención, CLD18A2 se expresa sobre la superficie de las células.
Los anticuerpos de la invención pueden obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con una proteína o péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 2, nº 4, nº 6, nº 16, nº 20, nº 21 a nº 23, nº 28 y nº 31, o un fragmento inmunogénico de la misma, o un ácido nucleico o células huésped que expresa dicha proteína o péptido, o fragmento inmunogénico del mismo. Preferentemente, un anticuerpo de la invención es específico para las proteínas y péptidos anteriormente indicados o fragmentos inmunogénicos de los mismos.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo producido por un clon que presenta el nº de acceso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) o DSM ACC2810 (182-D1106-362), o una forma dimerizada o humanizada de los mismos.
En una forma de realización, el anticuerpo de la invención se acopla a un agente terapéutico, tal como una toxina, un isótopo radioactivo, un fármaco o un agente citotóxico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de la invención. Son hibridomas preferentes aquellos que presentan los nº de acceso DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) o DSM ACC2810 (182-D1106-362).
Los anticuerpos de la invención se denominan en la presente memoria haciendo referencia a la denominación del anticuerpo, por ejemplo 182-D758-035 y/o haciendo referencia al clon producto del anticuerpo, por ejemplo 26D12.
La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y/o un conjugado del mismo con un agente terapéutico, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo, a un conjugado o a una composición farmacéutica de la invención para la utilización en el tratamiento o prevención de cáncer que implica células de cáncer que expresan CLD18A2, en el que dicho anticuerpo, dicho conjugado o dicha composición farmacéutica está destinada a la administración en un sujeto.
Preferentemente, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de la vesícula biliar. CLD18A2 preferentemente se expresa sobre la superficie de dichas células.
Preferentemente, los anticuerpos de la invención presentan la capacidad de discriminar las variantes de CLD18 expresadas por diferentes tipos celulares, incluyendo las células de cáncer y las células no malignas. En una forma de realización particularmente preferente, los anticuerpos del a invención presentan la capacidad de unirse a CLD18A2, mientras que no se unen a CLD18A1, o se unen a CLD18A1 con una especificidad más baja que la especificidad de unión a CLD18A2.
El término "unión" según la invención preferentemente se refiere a una unión específica. La expresión "unión específica" se refiere a que un agente, tal como un anticuerpo, se une de manera más fuerte a una diana, tal como epítopo para el que es específico, que a otra diana. Un agente se une de manera más fuerte a una primear diana que a una segunda diana en el caso de que se une a la primera diana con una constante de disociación (KD) que sea inferior a la constante de disociación para la segunda diana. Preferentemente, la constante de disociación (KD) para la diana a la que se une específicamente el agente es más de 10 veces, preferentemente más de 20 veces, más preferentemente más de 50 veces, todavía más preferentemente más de 100 veces, 200 veces, 500 veces ó
1.000 veces más baja que la constante de disociación (KD) para la diana a la que no se une el agente específicamente.
Los anticuerpos de la invención median en la eliminación de las células que expresan CLD18A2 mediante la unión a CLD18A2 preferentemente expresado sobre la superficie de dichas células. En una forma de realización, los anticuerpos de la invención inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo lisis mediada por CDC de por lo menos aproximadamente 20% a 40%, preferentemente la lisis mediada por CDC de aproximadamente 40% a 50%, y más preferentemente lisis mediada por CDC superior a 50% de células que expresan CLD18A2. Dichos anticuerpos se ejemplifican en la presente memoria con los anticuerpos siguientes: 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-16E12 y ch-175D10. Alternativamente, o además de inducir CDC, los anticuerpos de la invención pueden inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan CLD18A2 en presencia de células efectoras (por ejemplo monocitos, células mononucleares, células NK y PMN). Dichos anticuerpos se ejemplifican en la presente memoria mediante los anticuerpos siguientes: 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 y 125E1. Los anticuerpos de la invención pueden presentar la capacidad de inducir apoptosis de las células que expresan CLD18A2, inducir la adhesión homotípica de células que expresan CLD18A2 y/o inducir fagocitosis de células que expresan CLD18A2 en presencia de macrófagos. Preferentemente, los anticuerpos de la invención inducen lisis mediada por CDC y lisis mediada por ADCC de células que expresan CLD18A2 y más preferentemente inducen lisis mediada por ADCC de células que expresan CLD18A2, mientras que no inducen la lisis mediada por CDC de dichas células. Entre las células diana ejemplares para los anticuerpos de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las células de cáncer que expresan CLD18A2, tales como las células tumorógenas gástricas, pancreáticas, esofágicas y pulmonares. En una forma de realización preferente particular, la eliminación de las células mediada por anticuerpos de la invención es específica de CLD18A2, es decir, los anticuerpos de la invención median en la eliminación de las células, preferentemente la lisis mediada por CDC y/o ADCC de las células, que expresan CLD18A2 pero no media en la eliminación de células que expresan CLD18A1 pero que no expresan CLD18A2. Los anticuerpos indicados anteriormente pueden utilizarse para mediar en la eliminación de las células tumorales en el tratamiento o la prevención del cáncer, tal como el cáncer gástrico, el cáncer esofágico, el cáncer pancreático, el cáncer pulmonar, el cáncer ovárico, el cáncer de colon, el cáncer hepático, el cáncer de cabeza y cuello y el cáncer de vesícula biliar.
Los anticuerpos de la invención pueden categorizarse en clases diferentes según sus propiedades de unión y su capacidad para mediar en la función efectora sobre las células que expresan CLD18. Los anticuerpos de la invención pueden categorizarse según:
•
las propiedades de unión y/o las funciones efectoras mediadas sobre células que expresan CLD18A1 ó CLD18A2 (discriminación entre variantes de procesamiento de CLD18),
•
las propiedades de unión y/o las funciones efectoras mediadas sobre células que expresan variantes de CLD18 glucosiladas o no glucosiladas (discriminación entre variantes de CLD18 con y sin N-glucosilación),
•
las propiedades de unión y/o las funciones efectoras mediadas sobre células de cáncer o tipos celulares normales (discriminación entre variantes de CLD18 expresadas por células tumorales o por células no malignas normales),
•
las propiedades de unión a epítopos CLD18 enmascarados por la formación de uniones estrechas,
•
la capacidad de inducir la formación de agregados de CLD18 sobre las células vivas, y
•
la capacidad de unirse a una variante de CLD18 no humana, particularmente a variantes de CLD18 de ratones, ratas, conejos y primates.
Los anticuerpos de la invención pueden presentar una o más de las propiedades siguientes, en los que se hace referencia a ejemplos específicos de anticuerpos de la invención indicados en la presente memoria (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12 ,ch-166E2, ch-175D10):
5 a) unión a CLD18A2, así como a CLD18A1 (por ejemplo 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 y 41C6),
b) unión a CLD18A2 pero no a CLD18A1 (por ejemplo 26B5, 37G11, 38G5, 42E12 y 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10), 10
c) unión a CLD18 expresado naturalmente por células tumorales pero no a CLD18 expresado naturalmente por células o tejidos no de cáncer, tales como células de estómago y de pulmón (por ejemplo 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10).
15 d) mediación en la eliminación inducida por CDC de las células, que expresan CLD18A2 pero no de células que expresan CLD18A1 (por ejemplo 26D12, 28D10, 37H8 y 39F11, 163E12, ch-125E1, ch-163E12, ch-175D10),
e) mediación en la eliminación inducida por ADCC de células que expresan CLD18 (por ejemplo 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12 y 61C2, ch-163E12, ch-175D10), 20 f) mediación en la eliminación inducida por ADCC pero no en la eliminación mediada por CDC de células que expresan CLD18 (por ejemplo 37G11, 42E12 y 43A11),
g) mediación en la eliminación inducida por ADCC y en la eliminación inducida por CDC de células que 25 expresan CLD18A2 (por ejemplo 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
Tal como se ejemplifica en la presente memoria, los anticuerpos de la invención comprenden además moléculas que:
30 a) se unen a células diferenciadas del estómago normal, pero no a células madre del estómago (por ejemplo 39F11),
b) no se unen a tejido gástrico normal, así como a otros órganos normales, sino exclusivamente a células de cáncer (por ejemplo 26B5), 35 c) se unen a un epítopo que comprende un Asn no glucosilado en la posición 116 de CLD18,
d) se unen a CLD18 humano, así como de ratón, permitiendo llevar a cabo estudios preclínicos de toxicidad en ratones.
40 Los anticuerpos de la invención pueden derivarse de diferentes especies, incluyendo, aunque sin limitación, el ratón, la rata, el conejo, el cobaya y el ser humano. Entre los anticuerpos de la invención también se incluyen moléculas quiméricas en las que una región constante de anticuerpo derivada de una especie, preferentemente el ser humano, se combina con el sitio de unión a antígeno de otra especie. Además, entre los anticuerpos de la invención se
45 incluyen moléculas humanizadas en las que los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo derivado de una especie no humana se combinan con regiones constantes y de marco de origen humano.
Entre los anticuerpos de la invención se incluyen los anticuerpos policlonales y monoclonales y se incluyen IgG2a (por ejemplo IgG2a, K, A), IgG2b (por ejemplo IgG2b, K, A), IgG3 (por ejemplo IgG3, K, A) y anticuerpos IgM. Sin 50 embargo, otros isotipos de anticuerpo también se encuentran comprendidos en la invención, incluyendo anticuerpos IgG1, IgA1, IgA2, IgA secretorio, IgD e IgE. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, incluyendo, por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla o anticuerpos biespecíficos. Además, entre los fragmentos de unión a antígeno se incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión, que comprenden: (i) un polipéptido de dominio de unión (tal como una región
55 variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera) que se fusiona con un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, e (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. Dichas proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se dan a conocer adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y 2003/0133939.
60 Los anticuerpos de la presente invención preferentemente se disocian de CLD18 con una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 1 a 100 nM o menos. Preferentemente, los anticuerpos de la invención no presentan reactividad cruzada con antígenos de superficie celular relacionados y, de esta manera, no inhiben su función.
En las formas de realización preferidas, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por una o más de las propiedades siguientes:
a) especificidad para CLD18, en particular especificidad para CLD18A2,
b) afinidad de unión para CLD18, en particular para CLD18A2, de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente de aproximadamente 5 a 10 nM o menos y, más preferentemente, de aproximadamente 1 a 3 nM o menos,
c) la capacidad de mediar en un nivel elevado de CDC sobre células negativas para CD55/59 o positivas para CD55/59,
d) la capacidad de inhibir el crecimiento de células que expresan CLD18,
e) la capacidad de inducir la apoptosis de células que expresan CLD18,
f) la capacidad de inducir adhesión homotípica de células que expresan CLD18,
g) la capacidad de inducir ADCC de células que expresan CLD18 en presencia de células efectoras,
h) la capacidad de prolongar la supervivencia de un sujeto que presenta célula tumorales que expresan CLD18,
i) la capacidad de reducir el número de células que expresan CLD18,
j) la capacidad de reducir el número de células que expresan niveles bajos de CLD18 y/o
k) la capacidad de agregar CLD18 sobre la superficie de las células vivas.
Los anticuerpos anti-CLD18 de la presente invención pueden derivatizarse, unirse o coexpresarse con otras especificidades de unión. En una forma de realización particular, la invención proporciona una molécula biespecífica
o multiespecífica que comprende por lo menos una primera especificidad de unión para CLD18 (por ejemplo un anticuerpo anti-CLD18 o un mimético del mismo) y una segunda especificidad de unión para una célula efectora, tal como una especificidad de unión para un receptor de Fc (por ejemplo un receptor de Fc-y, tal como Fc-y RI o cualquier otro receptor de Fc) o un receptor de célula T, por ejemplo CD3.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que se unen tanto a CLD18 como a un receptor de Fc o a un receptor de célula T, por ejemplo CD3. Son ejemplos de receptores de Fc, los receptores de IgG, los receptores de Fc-y (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Otros receptores de Fc, tales como los receptores de IgA (por ejemplo FcaRI) también pueden ser dianas. El receptor de Fc preferentemente se localiza sobre la superficie de una célula efectora, por ejemplo un monocito, macrófago o célula mononuclear activada. En una forma de realización preferente, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un receptor de Fc en un sitio que es diferente del sitio de unión de Fc de inmunoglobulina (por ejemplo IgG o IgA) del receptor. Por lo tanto, la unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas no resulta bloqueado por niveles fisiológicos de inmunoglobulinas.
En todavía otro aspecto, los anticuerpos anti-CLD18 de la invención se derivan, unen o coexpresan con otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína (por ejemplo un fragmento Fab'). Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a otra u otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico), una citotoxina, ligando celular o antígeno (por ejemplo para producir un inmunoconjugado, tal como una inmunotoxina). Un anticuerpo de la presente invención puede unirse a otras fracciones terapéuticas, por ejemplo a un isótopo radioactivo, a un fármaco anticáncer de molécula pequeña, o a una citocina o quimoquina recombinante. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención comprende una gran diversidad de conjugados de anticuerpo, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y proteínas de fusión, la totalidad de las cuales se unen a las células que expresan CLD18 y que pueden utilizarse para dirigir otras moléculas a dichas células.
En todavía otro aspecto, la invención proporciona composiciones, por ejemplo composiciones/kits farmacéuticos y diagnósticos, que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable formulado conjuntamente con un anticuerpo o con una combinación de anticuerpos de la invención. En una forma de realización particular, la composición incluye una combinación de anticuerpos que se une a diferentes epítopos o que presenta características funcionales claras, tales como la inducción de CDC y/o ADCC y la inducción de apoptosis. En la presente forma de realización de la invención, los anticuerpos pueden utilizarse en combinación, por ejemplo en forma de una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti-CLD18. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CLD18 que presentan actividades diferentes pero complementarias pueden combinarse en una única terapia para conseguir un efecto terapéutico deseado. En una forma de realización
preferente, la composición incluye un anticuerpo anti-CLD18 que media en la CDC en combinación con otro anticuerpo anti-CLD18 que induce apoptosis. En otra forma de realización, la composición incluye un anticuerpo anti-CLD18 que media en la eliminación altamente efectiva de células diana en presencia de células efectoras, en combinación con otro anticuerpo anti-CLD18 que inhibe el crecimiento de células que expresan CLD18.
La presente invención incluye además la administración simultánea o secuencia de dos o más anticuerpos anti-CLD18 de la invención, en la que por lo menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo anti-CLD18 quimérico y por lo menos un anticuerpo adicional es un anticuerpo anti-CLD18 humano, uniéndose los anticuerpos a los mismos epítopos o a epítopos diferentes de CLD18. Preferentemente, en primer lugar se administra un anticuerpo de CLD18 quimérico de la invención, seguido de la administración de un anticuerpo anti-CLD18 humano de la invención, en el que el anticuerpo anti-CLD18 humano preferentemente se administra durante un periodo de tiempo prolongado, es decir, en forma de terapia de mantenimiento.
Los anticuerpos, inmunoconjugados, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y composiciones de la presente invención pueden utilizarse en una diversidad de métodos para inhibir el crecimiento de células que expresan CLD18A2 y/o que eliminan selectivamente células que expresan CLD18A2 mediante la puesta en contacto de las células con una cantidad efectiva del anticuerpo, inmunoconjugado, molécula biespecífica/multiespecífica o composición, de manera que se inhibe el crecimiento de la célula y/o se elimina la célula. Entre las células que expresan CLD18A2 que pueden inhibirse o eliminarse utilizando los anticuerpos de la invención se incluyen células de cáncer tales como las células tumorógenas de estómago, pancreáticas, esofágicas, pulmonares, ováricas, de colon, hepáticas, de cabeza y cuello y de vesícula biliar.
En una forma de realización particular de la invención, el sujeto en el que se administra el anticuerpo se trata adicionalmente con un agente quimioterapéutico, radiación o agente que modula, por ejemplo que intensifica o que inhibe, la expresión o actividad de un receptor de Fc, por ejemplo de un receptor de Fc-y, tal como una citocina. Entre las citocinas típicas para la administración durante el tratamiento se incluyen el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el interferón-y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral (TNF). Entre los agentes terapéuticos típicos se incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como la doxorrubicina, el cisplatino, el Taxotere, el 5-fluorouracilo, el metotrexato, la gemcitabina y la ciclofosfamida.
Pueden inmunizarse animales no humanos, tales como ratones, con CLD18A2 humano o con un fragmento peptídico del mismo, con el fin de obtener anticuerpos. Los péptidos peferidos para la inmunización son aquellos seleccionados de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 2, nº 4, nº 6, nº 16, nº 20 a nº 23, nº 28 y nº 31. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en formas de realización preferidas, los anticuerpos de la invención son aquellos obtenidos mediante inmunización con péptidos seleccionados de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 2, nº 4, nº 6, nº 16, nº 20 a nº 23, nº 28 y nº 31. Análogamente, los anticuerpos de CLD18A2 pueden generarse en un animal no humano transgénico, tal como un ratón transgénico. El animal no humano transgénico puede ser un ratón transgénico que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera codificante de la totalidad o una parte de un anticuerpo.
Pueden inmunizarse animales no humanos de tipo salvaje, así como transgénicos, con una preparación purificada o enriquecida de antígeno y/o ácidos nucleicos de CLD18A2 y/o células que expresan CLD18A2 o un fragmento peptídico del mismo. Preferentemente, el animal no humano es capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos de CLD18A2 (por ejemplo IgG, IgA y/o IgM) experimentando recombinación V-D-J e intercambio de isotipos. El intercambio de isotipos puede producirse mediante, por ejemplo intercambio de isotipos clásico o no clásico.
Las células B aisladas que se han obtenido a partir de un animal no humano tal como se ha indicado anteriormente seguidamente pueden inmortalizarse mediante fusión con una célula inmortalizada, proporcionando una fuente (por ejemplo un hibridoma) de anticuerpos de la invención. Este tipo de hibridomas (es decir, que producen anticuerpos de la invención) también se encuentran incluidos dentro del alcance de la invención.
Tal como se ejemplifica en la presente memoria, los anticuerpos de la invención pueden obtenerse directamente a partir de hibridomas que expresan el anticuerpo, o pueden clonarse y expresarse recombinantemente en una célula huésped (por ejemplo una célula CHO o una célula linfocítica). Son ejemplos adicionales de células huésped algunos microorganismos tales como E. coli y hongos, tales como levaduras. Alternativamente, pueden producirse recombinantemente en un animal o planta no humano transgénico.
Son células de hibridoma preferentes para producir anticuerpos de la invención aquéllas secuencias o depositadas en DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Alemania; nueva dirección: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Alemania), que presentan los nombres y números de acceso siguientes:
a.
182-D1106-055, nº de acceso DSM ACC2737, depositado el 19 de octubre de 2005.
b.
182-D1106-056, nº de acceso DSM ACC2738, depositado el 19 de octubre de 2005.
c.
182-D1106-057, nº de acceso DSM ACC2739, depositado el 19 de octubre de 2005.
d.
182-D1106-058, nº de acceso DSM ACC2740, depositado el 19 de octubre de 2005.
e.
182-D1106-059, nº de acceso DSM ACC2741, depositado el 19 de octubre de 2005.
f.
182-D1106-062, nº de acceso DSM ACC2742, depositado el 19 de octubre de 2005.
g.
182-D1106-067, nº de acceso DSM ACC2743, depositado el 19 de octubre de 2005.
h.
182-D758-035, nº de acceso DSM ACC2745, depositado el 17 de noviembre de 2005.
i.
182-D758-036, nº de acceso DSM ACC2746, depositado el 17 de noviembre de 2005.
j.
182-D758-040, nº de acceso DSM ACC2747, depositado el 17 de noviembre de 2005.
k.
182-D1106-061, nº de acceso DSM ACC2748, depositado el 17 de noviembre de 2005.
l.
182-D1106-279, nº de acceso DSM ACC2808, depositado el 26 de octubre de 2006.
m.
182-D1106-294, nº de acceso DSM ACC2809, depositado el 26 de octubre de 2006.
n.
182-D1106-362, nº de acceso DSM ACC2810, depositado el 26 de octubre de 2006.
Los anticuerpos preferentes de la invención son aquellos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas anteriormente indicados, es decir, 37G11 en el caso de 182-D1106-055, 37H8 en el caso de 182-D1106-056, 38G5 en el caso de 182-D1106-057, 38H3 en el caso de 182-D1106-058, 39F11 en el caso de 182-D1106-059, 43A11 en el caso de 182-D1106-062, 61C2 en el caso de 182-D1106-067, 26B5 en el caso de 182-D758-035, 26D12 en el caso de 182-D758-036, 28D10 en el caso de 182-D758-040, 42E12 en el caso de 182-D1106-061, 125E1 en el caso de 182-D1106-279, 163E12 en el caso de 182-D1106-294 y 175D10 en el caso de 182-D1106-362, y las formas quimerizadas y humanizadas de los mismos.
En formas de realización preferidas, entre los anticuerpos, en particular formas quimerizadas de anticuerpos según la invención, se incluyen los anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena pesada humana tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 46 o nº 150 o un fragmento de la misma. En formas de realización preferidas adicionales, entre los anticuerpos, en particular las formas quimerizadas de anticuerpos según la invención, se incluyen anticuerpos que comprenden una región constante de cadena ligera (CL) que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una región constante de cadena ligera humana, tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 41 o nº 148 o un fragmento de la misma. En una forma de realización preferente particular, entre las formas quimerizadas particulares de anticuerpos según la invención se incluyen los anticuerpos que comprenden una CH que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CH humana, tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 46 o nº 150 o un fragmento de la misma y que comprende una CL que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una CL humana, tal como la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 41 o nº 148 o un fragmento de la misma.
Una CH que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 46 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 45. Una CH que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 150 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 149. Una CL que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 41 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 40. Una CL que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 148 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 147.
En determinadas formas de realización las formas quimerizadas de los anticuerpos comprenden los anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 115, 116, 117, 118, 119, 120 y un fragmento de la misma y/o que comprenden una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por SEC ID nº: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 y un fragmento de la misma.
En determinadas formas de realización preferidas, entre las formas quimerizadas de anticuerpos se incluyen anticuerpos que comprenden una combinación de cadenas pesadas y cadenas ligeras seleccionadas de entre las posibilidades (i) a (ix) siguientes:
(i)
la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 115 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 122 o un fragmento de la misma,
(ii)
la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 116 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 121 o un fragmento de la misma,
(iii) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 117 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 123 o un fragmento de la misma,
(iv)
la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 119 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 126 o un fragmento de la misma,
(v)
la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 118 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 125 o un fragmento de la misma,
(vi)
la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 120 o un fragmento de la misma y al cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 124 o un fragmento de la misma,
(vii) la cadena pesada comprende una secuenciad de aminoácidos representada por SEC ID nº 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 127 o un fragmento de la misma,
(viii) la cadena pesada comprende una secuenciad de aminoácidos representada por SEC ID nº 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 128 o un fragmento de la misma, y
(ix) la cadena pesada comprende una secuenciad de aminoácidos representada por SEC ID nº 120 o un fragmento de la misma y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 129 o un fragmento de la misma.
El término "fragmento" o "fragmento de una secuencia de aminoácidos" tal como se ha utilizado anteriormente se refiere a una parte de una secuencia de anticuerpo, es decir, una secuencia que representa la secuencia de anticuerpo acortada en el extremo N-terminal y/o C-terminal, que, al sustituir dicha secuencia de anticuerpo en un anticuerpo conserva la capacidad de unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 y preferentemente las funciones de dicho anticuerpo descritas en la presente memoria, por ejemplo la lisis mediada por CDC o la lisis mediada por ADCC. Preferentemente, un fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de los residuos aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 115, nº 116, nº 117, nº 118, nº 119, nº 120, nº 121, nº 122, nº 123, nº 124, nº 125, nº 126, nº 127, nº 128 y nº 129 preferentemente se refiere a dicha secuencia, en la que 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó 23 aminoácidos en el extremo N-terminal han sido eliminados. Los fragmentos de las secuencias de aminoácidos indicadas en la presente memoria pueden encontrarse codificadas por fragmentos respectivos de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de dichas secuencias de aminoácidos.
Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 115 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 100. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 116 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 101. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 117 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 102. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 119 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 104. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 118 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 103. Una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 120 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 105.
Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 122 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por
SEC ID nº 107. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 121 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 106. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 123 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos 5 representada por SEC ID nº 108. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 126 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 111. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 125 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC IDS nº 110. Una cadena ligera que comprende una secuencia de 10 aminoácidos representada por SEC ID nº 124 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 109. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 127 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 112. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 128 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico
15 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 113. Una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 129 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 114.
En una forma de realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena
20 pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 132, nº 133, nº 134, nº 135, nº 136, nº 137 y un fragmento de los mismos.
En una forma de realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº
25 138, nº 139, nº 140, nº 141, nº 142, nº 143, nº 144, nº 145, nº 146 y un fragmento de los mismos.
En determinadas formas de realización preferidas, un anticuerpo de la invención comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) seleccionados de entre las posibilidades (i) a (ix) siguientes:
(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 132 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 139 o un fragmento de la misma,
35 (ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 133 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 138 o un fragmento de la misma,
(iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 134 o un fragmento de la
40 misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 140 o un fragmento de la misma,
(iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 136 o un fragmento de la
misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 143 o un fragmento de 45 la misma,
(v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 135 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 142 o un fragmento de la misma,
(vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 141 o un fragmento de la misma,
55 (vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 137 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 144 o un fragmento de la misma,
(viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 137 o un fragmento de la
60 misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 145 o un fragmento de la misma,
(ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 137 o un fragmento de la
misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 146 o un fragmento 65 de la misma.
Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 132 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 55. Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 133 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 56. Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 134 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 57. Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 136 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 59. Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 135 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 58. Una VH que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 137 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 60.
Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 139 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 62. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 138 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 61. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 140 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 63. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 143 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 66. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 142 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 65. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 141 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 64. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 144 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 67. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 145 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 68. Una VL que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SC ID nº 146 puede encontrarse codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 69.
En una forma de realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una VH que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionado de entre las formas de realización (i) a (vi) siguientes:
(i)
CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 115; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 115; CDR3: posiciones 116 a 125 de SEC ID nº 115,
(ii)
CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 116; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 116; CDR3: posiciones 116 a 126 de SEC ID nº 116,
(iii) CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 117; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 117; CDR3: posiciones 116 a 124 de SEC ID nº 117,
(iv)
CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 118; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 118; CDR3: posiciones 116 a 126 de SEC ID nº 118,
(v)
CDR1: posiciones 44 a 51 de SEC ID nº 119; CDR2: posiciones 69 a 76 de SEC ID nº 119; CDR3: posiciones 115 a 125 de SEC IDnº 119,y
(vi)
CDR1: posiciones 45 a 53 de SEC ID nº 120; CDR2: posiciones 71 a 78 de SEC ID nº 120; CDR3: posiciones 117 a 128 de SEC ID nº 120.
En una forma de realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de entre las realizaciones (i) a (ix) siguientes:
(i)
CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 121; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 121; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 121,
(ii)
CDR1: posiciones 49 a 53 de SEC ID nº 122; CDR2: posiciones 71 a 73 de SEC ID nº 122; CDR3: posiciones 110 a 118 de SEC ID nº 122,
(iii) CDR1: posiciones 47 a 52 de SEC ID nº 123; CDR2: posiciones 70 a 72 de SEC ID nº 123; CDR3: posiciones 109 a 117 de SEC ID nº 123,
(iv)
CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 124; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 124; CDR3: posiciones 115 a 113 de SEC ID nº 124,
(v)
CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 125; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 125; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 125,
(vi)
CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 126; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 126; CDR3: posiciones 115 a 122 de SEC ID nº 126,
(vii) CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 127; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 127; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 127,
(viii) CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 128; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 128; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 128,
(ix) CDR1: posiciones 47 a 52 de SEC ID nº 129; CDR2: posiciones 70 a 72 de SEC ID nº 129; CDR3: posiciones 109 a 117 de SEC ID nº 129.
En una forma de realización preferente, un anticuerpo de la invención comprende una combinación de VH y VL, comprendiendo cada uno un conjunto de regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas de entre las formas de realización (i) a (ix) siguientes:
(i)
VH: CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 115; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 115; CDR3: posiciones 116 a 125 de SEC ID nº 115; VL: CDR1: posiciones 49 a 53 de SEC ID nº 122; CDR2: posiciones 71 a 73 de SEC ID nº 122; CDR3: posiciones 110 a 118 de SEC ID nº 122,
(ii)
VH: CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 116; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 116; CDR3: posiciones 116 a 126 de SEC ID nº 116; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 121; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 121; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 121,
(iii) VH: CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 117; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 117; CDR3: posiciones 116 a 124 de SEC ID nº 117; VL: CDR1: posiciones 47 a 52 de SEC ID nº 123; CDR2: posiciones 70 a 72 de SEC ID nº 123; CDR3: posiciones 109 a 117 de SEC ID nº 123,
(iv)
VH: CDR1: posiciones 44 a 51 de SEC ID nº 119; CDR2: posiciones 69 a 76 de SEC ID nº 119; CDR3: posiciones 115 a 125 de SEC ID nº 119; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 126; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 126; CDR3: posiciones 115 a 122 de SEC ID nº 126,
(v)
VH: CDR1: posiciones 45 a 52 de SEC ID nº 118; CDR2: posiciones 70 a 77 de SEC ID nº 118; CDR3: posiciones 116 a 126 de SEC ID nº 118; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 125; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 125; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 125,
(vi)
VH: CDR1: posiciones 45 a 53 de SEC ID nº 120; CDR2: posiciones 71 a 78 de SEC ID nº 120; CDR3: posiciones 117 a 128 de SEC ID nº 120; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 124; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 124; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 124,
(vii) VH: CDR1: posiciones 45 a 53 de SEC ID nº 120; CDR2: posiciones 71 a 78 de SEC ID nº 120; CDR3: posiciones 117 a 128 de SEC ID nº 120; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 127; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 127; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 127,
(viii) VH: CDR1: posiciones 45 a 53 de SEC ID nº 120; CDR2: posiciones 71 a 78 de SEC ID nº 120; CDR3: posiciones 117 a 128 de SEC ID nº 120; VL: CDR1: posiciones 47 a 58 de SEC ID nº 128; CDR2: posiciones 76 a 78 de SEC ID nº 128; CDR3: posiciones 115 a 123 de SEC ID nº 128, y
(ix) VH: CDR1: posiciones 45 a 53 de SEC ID nº 120; CDR2: posiciones 71 a 78 de SEC ID nº 120; CDR3: posiciones 117 a 128 de SEC ID nº 120; VL: CDR1: posiciones 47 a 52 de SEC ID nº 129; CDR2: posiciones 70 a 72 de SEC ID nº 129; CDR3: posiciones 109 a 117 de SEC ID nº 129.
En formas de realización preferidas adicionales, un anticuerpo de la invención preferentemente comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferentemente por lo menos la región variable de CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLD18A2, preferentemente de un anticuerpo monoclonal contra CLD18A2 descrito en la presente memoria, y preferentemente comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), preferentemente por lo menos la región variable de CDR3, de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o de las regiones variables de cadena ligera (VL) indicadas en la presente memoria. En una forma de realización, dicha
región o regiones determinantes de complementariedad (CDR) se seleccionan de entre un conjunto de regiones determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3 indicadas en la presente memoria. En una forma de realización particularmente preferente, un anticuerpo de la invención preferentemente comprende las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal contra CLD18A2, preferentemente de un anticuerpo monoclonal contra CLD18A2 indicado en la presente memoria, y preferentemente comprende las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada (VH) y/o de las regiones variables de cadena ligera (VL) indicadas en la presente memoria.
En una forma de realización, un anticuerpo de la invención que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de conjuntos de CDR tal como se indica en la presente memoria, comprende dichas CDR conjuntamente con sus regiones de marco intermedias. Preferentemente, la parte también incluye por lo menos aproximadamente 50% de la primera o cuarta región de marco o de ambas, siendo el 50%, el 50% C-terminal de la primera región de marco y el 50% N-terminal de la cuarta región de marco. La construcción de anticuerpos de la presente invención preparados mediante técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos en el lado N-terminal o C-terminal de las regiones variables codificadas por conectores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, incluyendo la introducción de conectores para unir regiones variables de la invención a secuencias proteicas adicionales, incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcajes de proteína.
En una forma de realización, un anticuerpo de la invención que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de conjuntos de CDR tal como se indica en la presente memoria, comprende dichas CDR en una región de marco de anticuerpo humano.
La referencia en la presente memoria a un anticuerpo que comprende con respecto a la cadena pesada del mismo una cadena particular, o una región o secuencia particular, preferentemente se refiere a una situación en la que todas las cadenas pesadas de dicho anticuerpo comprenden dicha cadena, región o secuencia particular. Esto resulta aplicable, análogamente, a la cadena ligera de un anticuerpo.
Los ácidos nucleicos que comprenden genes o secuencias de ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos o partes de los mismos, por ejemplo una cadena de anticuerpo, tal como se indica en la presente memoria, pueden encontrarse comprendidos en un vector, por ejemplo un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector utilizado, por ejemplo, convencionalmente en ingeniería genética. El vector puede comprender genes adicionales, tales como genes marcadores que permiten la selección del vector en una célula huésped adecuado y bajo condiciones adecuadas. Además, el vector puede comprender elementos de control de la expresión que permiten la expresión correcta de las regiones codificantes en huéspedes adecuados. Dichos elementos de control son conocidos por el experto en la materia y entre ellos pueden incluirse un promotor, un casete de corte y empalme y un codón de inicio de la traducción.
Preferentemente, el ácido nucleico se une operablemente a las secuencias de control de la expresión anteriormente indicadas, permitiendo la expresión en células eucarióticas o procarióticas. Los elementos de control que garantizan la expresión en las células eucarióticas o procarióticas son bien conocidos por el experto en la materia.
Los métodos de construcción de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente indicadas para la construcción de vectores que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente indicadas, para la introducción de los vectores en células huésped apropiadamente seleccionados, o para provocar o conseguir la expresión, son bien conocidos de la técnica.
Un ácido nucleico o vector tal como se da a conocer en la presente memoria puede encontrarse comprendido en una célula huésped.
Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y reivindicaciones siguientes.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 muestra un análisis de inmunofluorescencia de células HEK293 transfectadas con CLD18A2 acoplado a un fluorocromo verde y que se ha hecho reaccionar con suero de ratón tras la inmunización con ADN de SEC ID nº 15 fusionado con un epítopo ayudante.
La fig. 2 muestra un análisis de transferencia western de células HEK293 transfectadas con CLD18A2-myc (SEC ID nº 3) y células HEK293 no transfectadas con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-c-myc 9E11 (Serotec, CRL MCA2200).
La fig. 3 muestra un análisis de inmunofluorescencia con células CHO transfectadas con CLD18A2 y un anticuerpo policlonal de conejo anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
Las figs. 4A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 24H5 y 85A3 a células HEK293 transfectadas transitoriamente con CLD18A2 humano y un marcador fluorescente según se determina mediante citometría de flujo. La figura 4C muestra la unión de los sobrenadantes de hibridoma 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 a células
5 HEK293 transfectadas establemente con CLD18A2 humano y contrateñidas con yoduro de propidio.
La fig. 5 muestra la unión de los sobrenadantes de hibridoma 24H5 (A), 9E8 (B), 26B5 (C) y 19B9 (D) a células HEK293 transfectadas transitoriamente con un marcador fluorescente y con CLD18A2 ó CLD18A2-Myc o CLD18A2-HA analizados mediante citometría de flujo.
10 Las figs. 6A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 37H8, 43A11, 45C1 y 163E12 a células HEK293 transfectadas establemente con CLD18A2 ó CLD18A1 humano según se determina mediante citometría de flujo.
15 La fig. 7 muestra un análisis de inmunofluorescencia del anticuerpo monoclonal 37G1 específico de la isoforma CLD18A2 mediante tinción de células HEK293 transfectadas con CLD18A2 (A, C) y CLD18A1 (B, D), respectivamente, bajo condiciones nativas (A, B) y de fijación con paraformaldehído (C, D).
La fig. 8 muestra un análisis de inmunofluorescencia del anticuerpo monoclonal de CLD18 26B5 mediante tinción de 20 células HEK293 transfectadas con CLD18A2 (A, C) y CLD18A1 (B, D), respectivamente, bajo condiciones nativas (A, B) y de fijación con paraformaldehído (C, D).
Fig. 9. RT-PCR de líneas celulares. El análisis de RT-PCR con cebadores específicos para CLD18A2 mostró una clara expresión en 4/5 de las líneas 25 celulares sometidas a ensayo.
La fig. 10 muestra un análisis de inmunofluorescencia de células DAN-G (subclón F2) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
30 La fig. 11 muestra un análisis de inmunofluorescencia de células KATO-III (subclón 3B9 4D5) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000).
La fig. 12A muestra un análisis de inmunofluorescencia de células SNU-16 (subclón G5) con un anticuerpo policlonal de conejo anti-CLD18 (Zymed, CRL 38-8000). La fig. 12B muestra un análisis de inmunofluorescencia de células 35 KATO-III con anticuerpos monoclonales de la invención.
La fig. 13 muestra la expresión en superficie de CLD18 sobre células KATO-III y NUGC-4 analizada mediante tinción de las células con los anticuerpos monoclonales 61C2 y 163E12, seguido del análisis de citometría de flujo.
40 Fig. 14. Alineación de proteínas de CLD18A1 humano (NP_057453), CLD18A2 humano (NP_001002026), CLD18A1 de ratón (NP_062789) y CLD18A2 de ratón (AAL15636).
Las figs. 15A y B muestran la unión de los sobrenadantes de hibridoma 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 y 163E12, respectivamente, a células HEK293 transfectadas transitoriamente con un marcador fluorescente y CLD18A1 ó 45 CLD18A2 murino según análisis de citometría de flujo.
Fig. 16. Análisis inmunohistoquímicos con anticuerpo policlonal p105.
Las tinciones inmunohistoquímicas de un subconjunto de tejidos normales (estómago, pulmón, médula ósea y
50 próstata) confirman la especificidad para el tejido gástrico (A). La expresión también se detectó en carcinomas de estómago (fila superior) y en carcinomas pulmonares (B). Sólo las células diferenciadas pero no las células madre expresan CLD18A2 (C).
Fig. 17. Análisis inmunohistoquímicos con anticuerpo monoclonal 39F11D7. 55
(A)
La expresión específica de proteínas se detectó en mucosa de estómago normal, mientras que todos los tejidas tejidos normales sometidos a ensayo fueron negativos.
(B)
Se observó una fuerte expresión de CLD18A2 en los carcinomas de estómago y de pulmón.
60 Fig. 18. Análisis inmunohistoquímicos con los anticuerpos monoclonales 26B5 (A), 175D10 (B), 43A11 (C), 163E12
(D) y 45C1 (E). Todos los anticuerpos mostraron una fuerte tinción de los tumores xenoinjertados HEK293-CLD18A2 y de los especímenes de cáncer gástrico, pero no de los tumores transfectados de células HEK293 de control simuladamente transfectadas.
La fig. 19 es un gráfico que compara el porcentaje de células muertas tras la inducción de CDC por los anticuerpos 85A3, 28D10, 24H5 ó 26D12 contra células HEK293 establemente transfectadas con CLD18A2 humano según citometría de flujo.
La fig. 20 es un gráfico que compara el porcentaje de lisis celular específica tras la inducción de CDC por los anticuerpos 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 ó 61C2 contra células CHO adherentes establemente transfectadas con CLD18A2 ó CLD18A1 humano según se determinó mediante medición fluorescente.
La fig. 21 muestra la inducción dependiente de la concentración de CDC contra las células CHO establemente transfectadas con CLD18A2 humano por los anticuerpos 75B8 (A), 28D10 (B) ó 37H8 (C) según se determinó mediante medición fluorescente.
La fig. 22 muestra la lisis de las células HEK293-CLD18A2 por los anticuerpos 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2, respectivamente, en presencia de células MNC.
La fig. 23 muestra la lisis de las células HEK293-CLD18A1 por los anticuerpos 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2, respectivamente, en presencia de células MNC.
La fig. 24 muestra la inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos del a invención en un modelo de xenoinjerto de tratamiento precoz con células HEK293-CLD18A2.
Las figs. 25A y B muestran la supervivencia prolongada mediante el tratamiento con anticuerpos de la invención en dos modelos de xenoinjerto de tratamiento precoz con células HEK293-CLD18A2.
La fig. 26 muestra la prolongación de la supervivencia por anticuerpos de la invención en un modelo de xenoinjerto de tratamiento avanzado con células HEK293-CLD18A2.
La fig. 27A muestra la inhibición del crecimiento tumoral con anticuerpos de la invención en un modelo de xenoinjerto de tratamiento precoz. La fig. 27B muestra la prolongación de la supervivencia por anticuerpos de la invención en un modelo de xenoinjerto de tratamiento precoz. Se utilizaron células DAN-G de expresión endógena de CLD18A2.
La fig. 28 muestra la expresión de ARNm de CLD18A2 en tejidos de ratón. Los análisis de RT-PCR con cebadores específicos de CLD18A2 no mostraron expresión significativa en ninguno de los tejidos normales sometidos a ensayo excepto en el estómago. Se analizaron los tejidos normales siguientes: 1: intestino delgado; 2: bazo; 3: piel;
4: estómago; 5: pulmón; 6: páncreas; 7: nódulo linfático; 8: timo; 9: control negativo.
La fig. 29 muestra la expresión de CLD18 en estómago normal. El análisis inmunohistoquímico con anticuerpo específico de CLD18 de estómago de ratón revela un patrón de expresión conservado. Aunque los epitelios superficiales y las criptas más profundas expresaban CLD18 en la superficie celular, la región central del cuello era negativa para CLD18.
La fig. 30 muestra la tinción de hematoxilina-eosina de tejidos de estómago de ratón. Se muestra una vista general
(A) y de detalle (B) del estómago de un ratón tratado con 37G11 en comparación con un ratón de control (C y D), que fue tratado con únicamente PBS.
Las figs. 31A y B muestra la tinción de citometría de flujo de células HEK293 establemente transfectadas con CLD18A1 y A2 humano, respectivamente, así como de células KATO-III de expresión endógena con anticuerpos de la invención (43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10).
La fig. 32 muestra la CDC de células que expresan CLD18A2 mediada por anticuerpos quiméricos de la invención.
La fig. 33 muestra la ADCC de células KATO-III mediada por anticuerpos quiméricos de la invención.
Descripción detallada de la invención
Los anticuerpos indicados en la presente memoria pueden ser anticuerpos monoclonales aislados que se unen específicamente a un epítopo presente sobre CLD18A2. Entre los anticuerpos monoclonales aislados comprendidos dentro de la presente invención se incluyen los anticuerpos IgA, IgG1-4, IgE, IgM e IgD. En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un IgG1, kappa o IgG1, isotipo lambda. En otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG3, más particularmente un isotipo kappa de IgG3 ó IgG3, isotipo lambda. En todavía otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4, más particularmente un isotipo kappa de IgG4 ó IgG4, isotipo lambda. En todavía otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgA1 ó IgA2. En todavía otra forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgM.
En una forma de realización, la invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a células que expresan CLD18A2, y que preferentemente: (i) se unen a células que expresan CLD18A2, e (ii) no se unen a células que no expresan CLD18A2 pero que expresan CLD18A1. Los anticuerpos de la invención preferentemente: (i) median en la eliminación de las células que expresan CLD18A2, e (ii) no median en la eliminación de las células que no expresan CLD18A2 pero que expresan CLD18A1.
En otra forma de realización, la invención se refiere a anticuerpos que: (i) se unen a células tumorales que expresan CLD18, (ii) no se unen a células que expresan CLD18 de mucosa de estómago normal, y/o (iii) no se unen a células que expresan CLD18 de tejido pulmonar no canceroso.
La invención incluye además anticuerpos que: (i) median en la eliminación de células tumorales que expresan CLD18, (ii) no median en la eliminación de células que expresan CLD18 de mucosa de estómago normal, y/o (iii) no median en la eliminación de células que expresan CLD18 de tejido pulmonar no canceroso.
En formas de realización particulares, los anticuerpos de la invención (i) se unen a un epítopo sobre CLD18A2 que no se encuentra presente sobre CLD18A1, preferentemente SEC ID nº 21, nº 22 y nº 23, (ii) se unen a un epítopo localizado sobre CLD18A2-bucle1, preferentemente SEC ID nº 28, (iii) se unen a un epítopo, que comprende CLD18A2-bucle1 y CLD18A2-bucleD3, o (iv) se unen a un epítopo presente en CLD18 humano y de ratón (SEC ID nº 2, SEC ID nº 8 y SEC ID n 35, SEC ID nº 37, respectivamente).
En formas de realización particularmente preferentes, los anticuerpos de la invención se unen a un epítopo de CLD18A2 que no se encuentra presente sobre CLD18A1.
Entre los anticuerpos de la invención se incluyen algunos anticuerpos totalmente humanos. Dichos anticuerpos pueden ser producidos en un animal transgénico no humano, por ejemplo en un ratón transgénico, capaz e producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos de CLD18 mediante recombinación V-D-J e intercambio de isotipos. Dicho animal transgénico también puede ser un conejo transgénico para la producción de anticuerpos policlonales, tal como se da a conocer en la patente US nº 2003/0017534.
Con el fin de que la presente invención se entiende con mayor facilidad, en primer lugar se definen determinados términos. Se proporcionan definiciones adicionales durante toda la descripción detallada.
Definición de términos
El término "CLD18" se refiere a la claudina-18 e incluye cualesquiera variantes, incluyendo CLD18A1 y CLD18A2, conformaciones, isoformas y homólogos específicos de CLD18 que se expresan naturalmente en las células o que se expresan en células transfectadas con el gen CLD18. Preferentemente, "CLD18" se refiere a CLD18 humano, en particular CLD18A2 (SEC ID nº 1, nº 2) y/o CLD18A1 (SEC ID nº 7, nº 8), más preferentemente CLD18A2.
El término "CLD18A1" incluye las variantes modificadas post-traduccionalmente, isoformas y homólogos específicos de CLD18A1 humano naturalmente expresados por las células o que se expresan sobre células transfectadas con el gen CLD18A1.
El término "CLD18A2" incluye variantes modificadas post-traduccionalmente, isoformas y homólogos específicos de CLD18A2 humano naturalmente expresados por las células o que se expresan sobre células transfectadas con el gen CLD18A2.
La expresión "variante de CLD18" debe comprender: (i) las variantes de procesamiento de CLD18, (ii) las variantes de CLD18 modificadas post-traduccionalmente, particularmente incluyendo variantes con diferentes estados de Nglucosilación, (iii) variantes de conformación de CLD18, particularmente incluyendo CLD18-Conformación-1, CLD18Conformación-2 y CLD18-Conformación-3, (iv) variantes de CLD18 libre y homotípica/heterotípicamente asociadas y localizadas en uniones estrechas intercelulares, y (v) variantes relacionadas con células de cáncer CLD18 y con células no de cáncer CLD18.
El término "balsa" se refiere a microdominios membranales ricos en esfingolípidos y en colesterol situados en el área de la cara externa de la membrana plasmática de una célula. La capacidad de determinadas proteínas de asociarse dentro de dichos dominios y su capacidad de formar "agregados" o "agregados focales" puede realizar la función de la proteína. Por ejemplo, la traslocación de moléculas de CLD18 al interior de dichas estructuras, tras unirse a los anticuerpos de la presente invención, crean una densidad elevada de complejos de antígeno CLD18-anticuerpo en las membranas plasmáticas. Dicha densidad elevada de complejos de antígeno CLD18-anticuerpo permite la activación eficiente del sistema del complemento durante la CDC.
Los términos "conformación" y "topología" se refieren a cómo una molécula integral de membrana se sitúa en la membrana de superficie celular y, en particular, cuáles de sus regiones son extracelulares y, de esta manera, elegibles para los anticuerpos. Por ejemplo, CLD18 puede existir en tres conformaciones diferentes, que con toda probabilidad dependen de si predomina como homómero o heterómero y de si se encuentra integrado en estructuras
supramoleculares de unión estrecha o se encuentra "libre". Estos diferentes estados resultan en diferentes epítopos elegibles para los anticuerpos.
Según la invención, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, incluyendo el cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en la presente memoria.
El término "tumor" se refiere a un grupo anormal de células o tejido que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y que continúa creciendo tras cesar los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y habitualmente forman una masa diferenciada de tejido, que puede ser benigna o maligna.
El término "metástasis" se refiere a la diseminación de las células de cáncer desde su sitio originario a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas a partir del tumor primario, de la invasión de la matriz extracelular, de la penetración de las membranas basales endoteliales y la entrada en la cavidad corporal y los vasos y, tras el transporte por la sangre, de la infiltración de los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. Con frecuencia la metástasis tumoral se produce incluso tras la extirpación del tumor primario, debido a que pueden subsistir células o componentes tumorales y desarrollar potencial metastásico. En una forma de realización, el término "metástasis" según la invención se refiere a "metástasis distante", que se refiere a una metástasis alejada del tumor primario y del sistema regional de nódulos linfáticos.
La expresión "tratamiento de una enfermedad" incluye la curación, el acortamiento de la duración, la mejora, la prevención, el enlentecimiento o la inhibición de la progresión o del empeoramiento, o la prevención o retraso de la aparición de una enfermedad o de los síntomas de la misma.
Según la invención, una muestra puede ser cualquier muestra útil según la presente invención, en particular una muestra biológica tal como una muestra de tejido, incluyendo líquidos corporales y/o una muestra celular, y puede obtenerse de manera convencional, tal como mediante biopsia de tejido, incluyendo la biopsia por punción, y la extracción de sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros líquidos corporales. Según la invención, la expresión "muestra biológica" también incluye fracciones de muestras biológicas.
El término "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, o una parte de unión a antígeno de las mismas. El término "anticuerpo" también incluye todas las formas recombinantes de los anticuerpos, en particular de los anticuerpos indicados en la presente memoria, por ejemplo anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glucosilados y cualesquiera fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno y derivados tal como se indica posteriormente. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo aminoterminal a extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunológico (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema clásico del complemento.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que presenta un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina procedente de una especie no humana, en la que la estructura restante de inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o en la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o únicamente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en las regiones de marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno puede ser de tipo salvaje o modificados con una o más sustituciones de aminoácido, por ejemplo modificados para ser más similares a inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan la totalidad de las secuencias de CDR (por ejemplo un anticuerpo de ratón humanizado que contiene la totalidad de las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas presentan una o más CDR que se encuentran alteradas respecto al anticuerpo original.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en los que una parte de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga respecto a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento restante de las cadenas es homólogo respecto a las secuencias correspondientes de otra especie. Típicamente, la región variable de tanto las cadenas ligeras como las pesadas imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las partes constantes son homólogas respecto a las secuencias de anticuerpos derivadas de otra especie. Una clara ventaja de dichas formas quiméricas es que la
región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas utilizando células B o hibridomas fácilmente disponibles de organismos huésped no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Aunque la región variable presenta la ventaja de su fácil preparación y de que la especificidad no resulta afectada por el origen, siendo humana la región constante, es menos probable que induzca una respuesta inmunológica de un sujeto humano al inyectar los anticuerpos que con la región constante de origen no humano. Sin embargo, la definición no se encuentra limitada al presente ejemplo particular.
La expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de unión"), tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo con fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Entre los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro de la expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen: (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten de los dominios VL, VH, CL y CH, (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten de los dominios VH y CH, (iv) fragmentos Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consisten de un dominio VH, (vi) regiones determinantes de complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que opcionalmente pueden unirse mediante un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se encuentran codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite prepararlos en forma de una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan formando moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv), ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que se encuentren comprendidos dentro de la expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de dominio de unión-inmunoglobulina, las cuales comprenden: (i) un polipéptido dominio de unión que se encuentra fusionado con un polipéptido región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, e (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. El polipéptido dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de dominio de unióninmunoglobulina se dan a conocer en mayor detalle en las patentes US nº 2003/0118592 y nº 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por el experto en la materia, y los fragmentos se criban para su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
El término "epítopo" se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a un anticuerpo, en el que la expresión "de unión" en la presente memoria preferentemente se refiere a una unión específica. Los epítopos habitualmente consisten de agrupamientos superficiales de moléculas químicamente activos, tales como aminoácidos o cadenas laterales sacáridas y habitualmente presentan características específicas de estructura tridimensional, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.
La expresión "epítopo discontinuo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un epítopo conformacional sobre un antígeno proteico que está formado de por lo menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.
La expresión "molécula biespecífica" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido o complejo de proteínas o péptidos, que presenta dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con: (a) un antígeno de superficie celular, y (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora. La expresión "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" pretende incluir cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido o complejo de proteínas o péptidos, que presenta más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con: (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora, y (c) por lo menos otro componente. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención incluye, aunque sin limitación, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras moléculas multiespecíficas dirigidas contra CLD18 y contra otras dianas, tales como receptores de Fc sobre las células efectoras. La expresión "anticuerpos biespecíficos" también incluye los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, aunque utilizando un conector que es excesivamente corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando de esta manera que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak R.J. et al., Structure 2:11211123, 1994).
La invención incluye además derivados de los anticuerpos indicados en la presente memoria. La expresión "derivados de anticuerpo" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo "se deriva de" una secuencia de línea germinal particular en el caso de que el anticuerpo se obtenga de un sistema mediante
inmunización de un animal o mediante cribado de una biblioteca de genes de inmunoglobulina, y en el que el anticuerpo seleccionado presenta una identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, todavía más preferentemente de por lo menos 96%, 97%, 98% ó 99% respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por le gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo derivado de una secuencia de línea germinal particular no mostrará más de 10 diferencias de aminoácido, más preferentemente, no más de 5, o todavía más preferentemente, no más de 4, 3, 2 ó 1 diferencia de aminoácido respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de los mismos, o regiones de unión a antígeno unidas entre sí, por los menos dos de las cuales presentan diferente especificidad. Entre estas diferentes especificidades se incluyen una especificidad de unión para un receptor de Fc sobre una célula efectora y una especificidad de unión para un antígeno o epítopo sobre una célula diana, por ejemplo una célula tumoral.
Los anticuerpos indicados en la presente memoria pueden ser anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo mutaciones introducidas mediante mutagénesis in vitro aleatoria o específica de sitio o mediante mutación somática in vivo).
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Un anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular. En una forma de realización, los anticuerpos monoclonales son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo un ratón, fusionado con una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo recombinante", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como: (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina
o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca combinatorial recombinante de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualesquiera otros medios que implican el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.
El término "transfectoma", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye células huésped eucarióticas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales, u hongos, incluyendo células de levadura.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación a un organismo transgénico que produce este tipo de anticuerpo. Esta expresión se refiere a un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos codificante que corresponde a la presente en un organismo que no consiste del organismo transgénico, y que se deriva generalmente de una especie que no es la del organismo transgénico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que presenta cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes de organismo. Por ejemplo, un anticuerpo que presenta una cadena pesada humana asociada a una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.
Los anticuerpos indicados en la presente memoria preferentemente han sido aislados. Un "anticuerpo aislado" tal como se utiliza en la presente memoria pretende referirse a un anticuerpo que se encuentra sustancialmente libre de otros anticuerpos que presentan diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo un anticuerpo aislado que se une específicamente a CLD18 se encuentra sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes de CLD18). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CLD18 humano puede, sin embargo, presentar reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otra especie (por ejemplo homólogos específicos de CLD18). Además, un anticuerpo aislado puede encontrarse sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o compuestos químicos. En una forma de realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que presentan diferentes especificidades y que se combinan en una composición bien definida.
Según la invención, la expresión "de unión" preferentemente se refiere a "de unión específica". Tal como se utiliza en la presente memoria, "de unión específica" se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad correspondiente a una KD de aproximadamente 1x10-7 M o inferior, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una KD que es por lo menos dos
órdenes de magnitud inferior a su afinidad para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo BSA, caseína) diferente del antígeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado.
El término "KD" (M), tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo IgM o IgG1) que se encuentra codificada por genes de región constante de cadena pesada.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "intercambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el que la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
La expresión "de origen natural" tal como se utiliza en la presente memoria aplicada a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia polinucleótido que se encuentra presente en un organismo (incluyendo virus), que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada deliberadamente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.
El término "reorganizado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una configuración de un locus de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en el que un segmento V se sitúa inmediatamente contiguo a un segmento D-J ó J en una conformación codificante esencialmente de un dominio VH o VL completo, respectivamente. Puede identificarse un locus génico de inmunoglobulina (anticuerpo) reorganizado mediante comparación con el ADN de línea germinal; un locus reorganizado presentará por lo menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.
La expresión "no reorganizado" o "configuración de línea germinal" tal como se utiliza en la presente memoria en referencia un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no se ha recombinado de manera que sea inmediatamente contiguo a un segmento D o J.
La expresión "molécula de ácidos nucleicos", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácidos nucleicos puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, aunque preferentemente es ADN de doble cadena.
Los ácidos nucleicos indicados según la invención preferentemente han sido aislados. La expresión "ácido nucleico aislado" se refiere según la invención a que el ácido nucleico: (i) ha sido amplificado in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) es producido recombinantemente mediante clonación, (iii) ha sido purificado, por ejemplo mediante corte y fraccionamiento mediante electroforesis en gel, o (iv) ha sido sintetizado, por ejemplo mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que se encuentra disponible para la manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.
Los ácidos nucleicos pueden, según la invención, encontrarse presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En formas de realización preferidas, un ácido nucleico se encuentra funcionalmente relacionado con secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" se refiere a que un ácido nucleico también se encuentra funcionalmente relacionado con la secuencia de control de la expresión de manera natural y el término "heterólogo" se refiere a que el ácido nucleico no se encuentra funcionalmente relacionado con la secuencia de control de la expresión de manera natural.
Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia de control de la expresión se encuentran "funcionalmente" relacionados entre sí en el caso de que se encuentren unidos covalentemente entre sí de manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico se encuentre bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. En el caso de que el ácido nucleico deba traducirse en una proteína funcional, con una secuencia de control de la expresión funcionalmente relacionada con una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin provocar un desplazamiento de marco en la secuencia codificante o sin que dicha secuencia codificante sea incapaz de ser traducida en la proteína o péptido deseado.
La expresión "secuencia de control de la expresión" comprende según la invención promotores, sitios de unión ribosómica, intensificadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En formas de realización particulares de la invención, las secuencias de control de la expresión pueden encontrarse reguladas. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar como función de la especie o tipo celular, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, las cuales participan en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, secuencia de adición de caperuza y la secuencia CAAT. Más concretamente, las secuencias de control de la expresión 5' no transcritas comprenden una región promotora que incluye una secuencia de promotor para el control transcripcional del ácido nucleico funcionalmente asociado. Las secuencias de control de la expresión pueden comprender además secuencias intensificadoras o secuencias activadoras cadena arriba.
Según la invención, el término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se sitúa cadena arriba (5') respecto a la secuencia de ácidos nucleicos que se expresa y que controla la expresión de la secuencia al proporcionar un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa. La "región promotora" puede incluir sitios adicionales de reconocimiento y unión para factores adicionales que participan en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" en el caso de que la transcripción no se encuentre controlada por un agente inductor. Un gen que se encuentra bajo el control de un promotor inducible no se expresa, o sólo se expresa en un grado reducido, si el agente inductor se encuentra ausente. En presencia del agente inductor, el gen se activa o se incrementa el nivel de transcripción. Lo anterior se encuentra mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.
Entre los promotores que son preferentes según la invención se incluyen los promotores de la polimerasa de SP6, T3 y T7, el promotor del ARN U6 humano, el promotor del CMV y los promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo del CMV), en los que se ha fusionado una o más partes con una o más partes de promotores de genes de otras proteínas celulares, tales como, por ejemplo, la GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) humana, e incluyendo o no uno o más intrones adicionales.
Según la invención, el término "expresión" se utiliza en su sentido más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo transitoriamente o establemente.
En una forma de realización preferente, una molécula de ácidos nucleicos se encuentra, según la invención, presente en un vector, según resulte apropiado con un promotor, el cual controla la expresión del ácido nucleico. El término "vector" se utiliza en la presente memoria en su sentido más general y comprende cualquier vehículo intermediario para el ácido nucleico que permita que dicho ácido nucleico se introduzca, por ejemplo, en células procarióticas y/o eucarióticas y, según resulte apropiado, que se integre en un genoma. Los vectores de este tipo preferentemente se replican y/o expresan en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas víricos. El término "plásmido" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere de manera general a un constructo de material genético extracromosómico, habitualmente un dúplex de ADN circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosómico.
Como vector para la expresión de un anticuerpo, puede utilizarse un vector en el que se encuentre la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo en diferentes vectores, o un tipo de vector en el que la cadena pesada y la cadena ligera se encuentren presentes en el mismo vector.
Las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria con respecto a secuencias específicas de ácidos nucleicos y de aminoácidos, por ejemplo las mostradas en el listado de secuencias, deben interpretarse como también referidas a las modificaciones de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas y secuencias de ácidos nucleicos codificantes de secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias específicas de ácidos nucleicos. Una importante propiedad es conservar la unión de un anticuerpo a su diana o mantener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferentemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, cuando sustituye la secuencia específica en un anticuerpo, conserva la unión de dicho anticuerpo a CLD18 y preferentemente las funciones de dicho anticuerpo tal como se indica en la presente memoria, por ejemplo lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC.
El experto en la materia apreciará que, en particular, las secuencias de la CDR, regiones hipervariables y variables, pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a CLD18. Por ejemplo, las regiones de la CDR son idénticas o altamente homólogas respecto a las regiones especificadas en la presente memoria. Se contempla que "altamente homólogo" se refiera a 1 a 5, preferentemente 1 a 4, tal como 1 a 3 ó 1 ó 2 sustituciones realizadas en las CDR. Además, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse de manera que muestren homología sustancial con las regiones específicamente dadas a conocer en la presente memoria.
Debe apreciarse que los ácidos nucleicos específicos indicados en la presente memoria también incluyen los ácidos nucleicos modificados con el fin de optimizar el uso de los codones en una célula u organismo huésped particular. Las diferencias en el uso de los codones entre organismos pueden conducir a una diversidad de problemas referentes a la expresión heteróloga de genes. La optimización de los codones mediante el cambio de uno o más nucleótidos de la secuencia original puede resultar en una optimización de la expresión de un ácido nucleico, en particular en la optimización de la eficacia de la traducción, en un huésped homólogo o heterólogo en el que deba expresarse dicho ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de que deban utilizarse ácidos nucleicos derivados del ser humano y codificantes de regiones constantes y/o regiones de marco de anticuerpos según la presente invención, por ejemplo para preparar anticuerpos quiméricos o humanizados, puede resultar preferente modificar dichos ácidos
nucleicos con el fin de optimizar el uso de los codones, en particular en el caso de que dichos ácidos nucleicos, opcionalmente fusionados con ácidos nucleicos heterólogos, tales como ácidos nucleicos derivados de otros organismos tal como se indica en la presente memoria, deban expresarse en células de un organismo diferente del ser humano, tal como el ratón o el hámster. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de 5 regiones constantes de cadena ligera y pesada humana, tales como aquéllas según SEC ID nº 40 y nº 45, respectivamente, pueden modificarse para que incluyan una o más, preferentemente por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 y preferentemente hasta 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ó 100 sustituciones de nucleótidos, resultando en un uso optimizado del os codones, pero no resultando en un cambio de la secuencia de aminoácidos. Dichas sustituciones de nucleótidos preferentemente se refieren a sustituciones de nucleótidos en SEC ID nº 40 y nº 45, respectivamente, 10 seleccionadas de entre las sustituciones mostradas en la alineación siguiente de SEC ID nº 40 y nº 45, respectivamente, con sus contrapartidas modificadas y no resultando en un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada o referida a sustituciones correspondientes en posiciones correspondientes en otras secuencias de ácidos nucleicos codificantes de regiones constantes de cadena ligera y pesada humana, respectivamente. Preferentemente, todas las sustituciones mostradas en las alineaciones siguientes de SEC ID nº 40 y nº 45,
15 respectivamente, con sus contrapartidas modificadas, que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada, se llevan a cabo en secuencias de ácidos nucleicos codificantes de regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, respectivamente.
Además, puede desearse según la presente invención modificar las secuencias de aminoácidos indicadas en la presente memoria, en particular las de regiones constantes de cadena pesada humana para adaptar la secuencia a un alotipo deseado, por ejemplo un alotipo observado en la población caucásica. Dichas modificaciones se seleccionan preferentemente de entre el grupo que consiste de las sustituciones de aminoácidos siguientes en SEC ID nº 46 o en posiciones correspondientes dentro de otras regiones constantes de cadena pesada humana: K93R, D235E y L237M. Preferentemente, la totalidad de dichas modificaciones se encuentra incluida en las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de cadena pesada humana.
Según la invención, la expresión "posiciones correspondientes" se refiere a nucleótidos o residuos aminoácidos que, en una alineación de secuencias de dos ácidos nucleicos o secuencias de proteína, se alinean uno con otro.
Preferentemente, el grado de identidad entre una secuencia específica de ácidos nucleicos indicada en la presente memoria y una secuencia de ácidos nucleicos modificada con respecto a dicha secuencia específica de ácidos nucleicos es de por lo menos 70%, preferentemente de por lo menos 75%, más preferentemente de por lo menos 80%, todavía más preferentemente de por lo menos 90% o todavía más preferentemente de por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%. Preferentemente, las dos secuencias son capaces de hibridarse y formar un dúplex estable una con la otra, llevando a cabo la hibridación preferentemente bajo condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones restrictivas). Las condiciones restrictivas se describen en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., editores, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, o en Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, Inc., New York, y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5xSSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albúmina de suero bovino al 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro sódico 0,15 M/citrato sódico 0,15 M, pH 7. Tras la hibridación, la membrana a la que se ha transferido el ADN se lava en, por ejemplo, 2xSSC a temperatura ambiente y después en 0,1-0,5xSSC/0,1xSDS a temperaturas de hasta 68ºC.
Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente de identidad entre una secuencia específica de aminoácidos indicada en la presente memoria y una secuencia de aminoácidos modificada con respecto a dicha secuencia específica de aminoácidos, tal como entre secuencias de aminoácidos que muestran homología sustancial, es de por lo menos 70%, preferentemente de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90% o todavía más preferentemente de por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%.
La totalidad de las secuencias modificadas anteriormente indicadas se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
La expresión "similitud de secuencias" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. La expresión "identidad de secuencias" entre dos secuencias polipeptídicas o de ácidos nucleicos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.
El "porcentaje de identidad" se obtiene tras una alineación óptica, siendo este porcentaje puramente estadístico, y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente y a lo largo de su longitud completa. Las comparaciones entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos convencionalmente se llevan a cabo mediante la comparación de estas secuencias tras alinearlas óptimamente, llevando a cabo dicha comparación segmento por segmento o en una "ventana de comparación", con el fin de identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede alcanzarse, aparte de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Ads App. Math. 2:482, 1981, por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, o por medio de programas informáticos que utilizan dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones que se comparan y multiplicando el resultado obtenido por 100, de manera que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Pueden llevarse a cabo "sustituciones conservadoras", por ejemplo basándose en las similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o en la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, (b) entre los aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina, (c) entre los aminoácidos con carga positiva (básicos) se incluyen arginina, lisina e histidina, y (d) entre los aminoácidos con carga negativa (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden llevarse a cabo dentro de los grupos (a) a (d). Además, la glicina y la prolina pueden sustituirse una por otra basándose en su capacidad de interrumpir las hélices a. Pueden llevarse a cabo algunas sustituciones preferentes entre los grupos siguientes: (i) S y T, (ii) P y G, e (iii) A, V, L e I. Dado el código genético conocido y las técnicas de ADN recombinante y sintético, el científico experto en la materia podrá construir fácilmente los ADN codificantes de variantes conservadoras de aminoácidos.
La presente invención comprende anticuerpos en los que se han realizado alteraciones en la región Fc para modificar las propiedades funcionales o farmacocinéticas de los anticuerpos. Estas alteraciones pueden resultar en una reducción o incremento de la unión de C1q y de la CDC o de la unión de FcyR y de la ADCC. Pueden realizarse sustituciones, por ejemplo, en uno o más residuos aminoácidos de la región constante de cadena pesada, provocando de esta manera una alteración en una función efectora, manteniendo simultáneamente la capacidad de unión al antígeno respecto a la del anticuerpo modificado; ver las patentes US nº 5.624.821 y nº 5.648.260.
La vida media in vivo de los anticuerpos puede mejorarse mediante la modificación del epítopo del receptor de reciclaje del dominio constante de Ig o de un dominio constante similar a Ig, de manera que la molécula no comprenda un dominio CH2 intacto o una región Fc de Ig intacta; ver las patentes US nº 6.121.022 y nº 6.194.551. La vida media in vivo puede incrementarse además realizando mutaciones en la región Fc, por ejemplo mediante la sustitución de la treonina por leucina en la posición 252, mediante la sustitución de la treonina por serina en la posición 254 ó mediante la sustitución de la treonina por fenilalanina en la posición 256; ver la patente US nº
6.277.375.
Además, el patrón de glucosilación de los anticuerpos puede modificarse con el fin de modificar la función efectora de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en un transfectoma que no añada la unidad de fucosa normalmente unida a Asn en la posición 297 de la región Fc con el fin de incrementar la afinidad de la región Fc para los receptores de Fc que, a su vez, resultarán en una ADCC incrementada de los anticuerpos en presencia de células NK; ver Shield et al., JBC 277:26733, 2002. Además, puede realizarse una modificación de la galactosilación para modificar la CDC.
Alternativamente, en otra forma de realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-CDL18, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los anticuerpos anti-CDL18 modificados resultantes pueden cribarse para la actividad de unión.
La expresión "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichas expresiones pretenden referirse no sólo a la célula sujeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o a influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental aunque todavía se encuentra comprendida dentro del alcance de la expresión "célula huésped" tal como se utiliza en
la presente memoria. Entre las células huésped recombinantes se incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como células CHO, células NS/0 y células linfocíticas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" incluye cualquier ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, ovejas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
La expresión "animal transgénico" se refiere a un animal que presenta un genoma que comprende uno o más transgenes, preferentemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que preferentemente es capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede presentar un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos anti-CDL18 humanos al inmunizarse con antígeno CLD18 y/o células que expresan CLD18. El transgén de cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, tal como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo ratones HuMAb, tales como ratones HCo7 ó HCol2, o el transgén de cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, tal como es el caso para los ratones transcromosómicos (por ejemplo KM) descritos en el documento WO 02/43478. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de produce múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos de CLD18 (por ejemplo IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación V-D-J e intercambio de isotipos.
Mecanismo de acción de mAb
Aunque lo siguiente proporciona consideraciones sobre el mecanismo subyacente a la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención, no debe considerarse limitativo de la invención en modo alguno.
Los anticuerpos indicados en la presente memoria preferentemente interactúan con componentes del sistema inmunológico, preferentemente mediante ADCC o CDC. Los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse para dirigirse a cargas diana (por ejemplo isótopos radioactivos, fármacos o toxinas) para eliminar directamente células tumorales, o pueden utilizarse sinérgicamente con agentes quimioterapéuticos tradicionales, atacando tumores mediante mecanismos de acción complementarios que pueden incluir respuestas inmunológicas antitumorales que podrían encontrarse comprometidas debido a los efectos secundarios citotóxicos de la quimioterapia sobre los linfocitos T.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. La ADCC describe la capacidad de eliminación celular de las células efectoras tal como se indica en la presente memoria, en particular linfocitos, que preferentemente requieren que la célula diana sea marcada por un anticuerpo.
La ADCC preferentemente se produce cuando los anticuerpos se unen a antígenos sobre las células tumorales y los dominios Fc de anticuerpo se acoplan a receptores de Fc (FcR) sobre la superficie de las células efectoras inmunológicas. Se han identificado varias familias de receptores de Fc y poblaciones celulares específicas expresan característicamente receptores de Fc definidos. La ADCC puede considerarse un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce a la presentación de antígeno y a la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente, la inducción in vivo de la ADCC conduce a respuestas de células T dirigidas a tumor y respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.
Citotoxicidad dependiente del complemento. La CDC es otro método de eliminación celular que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más efectivo para la activación del complemento. IgG1 e IgG3 también resultan muy efectivos en el direccionamiento de la CDC mediante la ruta clásica de activación del complemento. Preferentemente, en esta cascada, la formación de complejos de antígeno-anticuerpo resulta en el destapado de múltiples sitios de unión de C1q en estrecha proximidad en los dominios CH2 de las moléculas de anticuerpo participantes, tales como moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferentemente, dichos sitios de unión de C1q destapados convierten la interacción C1q-IgG previamente de baja afinidad en una de alta avidez, lo que induce una cascada de sucesos que implica una serie de otras proteínas del complemento y conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de células efectoras C3a y C5a. Preferentemente, la cascada del complemento finaliza en la formación de un complejo de ataque membranal, lo que crea poros en la membrana celular, facilitando el paso libre de agua y solutos hacia el interior y el exterior de la célula.
Producción de anticuerpos
Los anticuerpos de la invención pueden producirse mediante una diversidad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. Aunque resultan preferentes los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio pueden utilizarse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo la transformación vírica u oncogénica de linfocitos B o técnicas de expresión fágica utilizando bibliotecas de genes de anticuerpo.
El sistema animal preferente para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos de la técnica. Las parejas de fusión (por ejemplo las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión también son conocidos.
Otros sistemas animales preferentes para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de la rata y el sistema del conejo (por ejemplo descritos en Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348, 1995; ver también Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124:295, 2005).
En todavía otra forma de realización preferente, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CLD18 pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunológico humano y no del sistema del ratón. Entre estos ratones transgénicos y transcromosómicos se incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y colectivamente se denominan en la presente memoria "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en dichos ratones transgénicos puede llevarse a cabo tal como se describe en detalle para CD20 en el documento WO 2004/035607.
Todavía otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes codificantes de anticuerpos a partir de linfocitos productores de anticuerpos de estrategia definida, por ejemplo ver Babcock et al., A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy, 1996. Para más información sobre la ingeniería de anticuerpos recombinantes, ver también Welschof y Kraus, Recombinant antibodies for cancer therapy, ISBN-0-89603-918-8, y Benny K.C. Lo, Antibody Engineering, ISBN 1-58829-092-1.
Inmunizaciones
Para generar anticuerpos contra CLD18, pueden inmunizarse ratones con péptidos conjugados con portadores derivados de la secuencia de CDL18, una preparación enriquecida de antígeno CLD18 expresado recombinantemente o fragmentos del mismo y/o células que expresan CLD18, tal como se describe. Alternativamente, pueden inmunizarse ratones con ADN codificante de CLD18 humano de longitud completa (por ejemplo SEC ID nº 1) o fragmentos del mismo, en particular aquellos de SEC ID nº 15, nº 17 y nº 19. En el caso de que las inmunizaciones con una preparación purificada o enriquecida del antígeno CLD18 no resulten en anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan CLD18, por ejemplo una línea celular, para inducir respuestas inmunológicas.
Puede realizarse un seguimiento de la respuesta inmunológica durante el curso del protocolo de inmunización, extrayendo muestras de plasma y suero de la vena de la cola o mediante sangrados retroorbitales. Para las fusiones pueden utilizarse ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-CLD18. Los ratones pueden recibir un refuerzo intraperitoneal o intravenoso con células que expresan CLD18 3 días antes del sacrificio y extirpación del bazo para incrementar la tasa de hibridomas secretores de anticuerpos específicos.
Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales
Para generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales contra CLD18, pueden aislarse esplenocitos y células de nódulo linfático a partir de ratones inmunizados y fusionarse con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. A continuación, los hibridomas resultantes pueden cribarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Seguidamente pueden cribarse pocillos individuales mediante ELISA para hibridomas secretores de anticuerpos. Mediante inmunofluorescencia y análisis de FACS con células expresantes, pueden identificarse anticuerpos con especificidad para CLD18. Los hibridomas secretores de anticuerpos pueden sembrarse en placa nuevamente, cribarse nuevamente y, en caso de que todavía sean positivos para los anticuerpos monoclonales anti-CLD18, pueden subclonarse mediante dilución limitante. A continuación, los subclones estables pueden cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo de tejidos para la caracterización.
Generación de transfectomas productores de anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos de la invención también pueden producirse en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica, tales como los que son bien conocidos de la técnica (Morrison S., Science 229:1202, 1985).
Por ejemplo, en una forma de realización, el gen o genes de interés, por ejemplo genes de anticuerpo, pueden ligarse en un vector de expresión, tal como un plásmido de expresión eucariótico, tal como se utiliza mediante el sistema de expresión del gen GS dado a conocer en los documentos WO 87/04462 y 89/01036 y patente EP nº 338 841, u otros sistemas de expresión bien conocidos de la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpo clonados puede introducirse en células huésped eucarióticas, tales como células CHO, células NS/0, células
HEK293T o células HEK293, o alternativamente otras células eucarióticas, tales como células derivadas de plantas, células fúngicas o de levadura. El método utilizado para introducir estos genes puede ser un método descrito en la técnica, tal como la electroporación, la lipofectina, la lipofectamina u otros. Tras la introducción de estos genes de anticuerpo en las células huésped, pueden identificarse y seleccionarse las células que expresan el anticuerpo. Estas células representan los transfectomas que seguidamente pueden amplificarse para su nivel de expresión y escalarse para producir anticuerpos. Pueden aislarse y purificarse anticuerpos recombinantes a partir de dichos sobrenadantes y/o células de cultivo.
Alternativamente, los genes de anticuerpo clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, incluyendo células procarióticas, tales como microorganismos, por ejemplo E. coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales no humanos transgénicos, tal como en leche de ovejas y conejos o en huevos de gallina, o en plantas transgénicas; ver, por ejemplo, Verma R. et al., J. Immunol. Meth. 216:165-181, 1998; Pollock et al., J. Immunol. Meth. 231:147-157, 1999; y Fischer R. et al., Biol. Chem. 380:825-839, 1999.
Utilización de secuencias parciales de anticuerpo para expresar anticuerpos intactos (es decir, humanización y quimerización)
a) Quimerización
Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales murinos como anticuerpos terapéuticos en seres humanos al marcarlos con toxinas o isótopos radioactivos. Los anticuerpos murinos no marcados son altamente inmunogénicos en el ser humano en el caso de que se apliquen repetidamente, conduciendo a la reducción del efecto terapéutico. La inmunogenicidad principal se encuentra mediada por las regiones constantes de cadena pesada. La inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en el ser humano puede reducirse o evitarse por completo en el caso de que los anticuerpos respectivos se quimericen o humanicen. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos las diferentes partes de los cuales se derivan de diferentes especies animales, tales como los que presentan una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se consigue uniendo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo murino con la región constante de las cadenas pesadas y ligeras humanas (por ejemplo tal como describen Kraus et al., en la serie de Methods in Molecular Biology, Recombinant antibodies for cancer therapy, ISBN 0-89603-918-8). En una forma de realización preferente, se generan anticuerpos quiméricos mediante la unión de una región constante de cadena ligera kappa humana a una región variable de cadena ligera murina. En una forma de realización también preferente, pueden generarse anticuerpos quiméricos mediante la unión de una región constante de cadena ligera lambda humana a una región variable de cadena ligera murina. Las regiones constantes de cadena pesada preferentes para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de cadena pesada preferentes para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.
b) Humanización
Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente mediante residuos aminoácidos que se encuentran situados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas pesadas y ligeras. Por ello, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de las CDR son responsables de la mayor parte de las interacciones anticuerpo-antígeno, resulta posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos naturales específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR procedentes de los anticuerpos naturales específicos injertados en secuencias de marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1998; Jones P. et al., Nature 321:522-525, 1986, y Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033, 1989). Dichas secuencias de marco pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpo de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal serán diferentes de las secuencias génicas del anticuerpo maduro porque no incluyen los genes variables completamente ensamblados, los cuales se forman mediante unión V(D)J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de línea germinal también difieren de las secuencias de un anticuerpo de un repertorio secundario de alta afinidad en posiciones individuales uniformemente a lo largo de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la parte aminoterminal de la región marco 1 y en la parte carboxiterminal de la región marco 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por ello, no resulta necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que presente propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (ver el documento WO 99/45962). Las secuencias parciales de cadenas pesadas y ligeras que comprenden las regiones de CDR típicamente resultan suficientes para este fin. La secuencia parcial se utiliza para determinar qué segmentos génicos variables y de unión de la línea germinal contribuyen a los genes variables del anticuerpo recombinado. A continuación, la secuencia de línea germinal se utiliza para rellenar las partes faltantes de las regiones variables. Las secuencias líder de cadenas pesadas y ligeras se cortan durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir las secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación por PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse en forma de un conjunto de oligonucleótidos solapantes cortos y combinarse
mediante amplificación de PCR para crear un clon completamente sintético de la región variable. Este procedimiento presenta determinadas ventajas, tales como la eliminación o la inclusión de sitios de restricción particulares, o la optimización de codones particulares.
Las secuencias de nucleótidos de transcritos de cadenas pesadas y ligeras procedentes de hibridomas se utilizan para diseñar un conjunto solapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades codificantes de aminoácidos idénticas a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: las cadenas de bases nucleotídicas repetidas se encuentran interrumpidas para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; se han incorporado sitios de inicio de traducción óptima según las reglas de Kozak (Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870, 1991) y se han insertado sitios HindIII cadena arriba de los sitios de inicio de traducción.
Para las regiones variables tanto de cadenas pesadas como ligeras, las secuencias optimizadas codificantes y no codificantes correspondientes se descomponen en 30 a 50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. De esta manera, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en juegos de fragmentos de doble cadena solapantes que abarcan segmentos de 150 a 400 nucleótidos. A continuación, los grupos se utilizan como moldes para producir productos de amplificación por PCR de 150 a 400 nucleótidos. Típicamente se descompone un solo nucleótido de región variable en dos grupos que se amplifican separadamente para generar dos productos de PCR solapantes. Estos productos solapantes seguidamente se combinan mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede resultar deseable incluir un fragmento solapante de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que puedan clonarse fácilmente en los constructos de vector de expresión.
Las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras quimerizadas o humanizadas reconstruidas se combinan seguidamente con secuencias clonadas de promotor, líder, inicio de traducción, región constante, 3' no traducida, de poliadenilación y de terminación de transcripción para formar constructos de vector de expresión. Los constructos de expresión de cadenas pesadas y ligeras pueden combinarse en un único vector, cotransfectados, transfectados en serie o separadamente transfectados en células huésped que seguidamente se fusionan para formar una célula huésped que exprese ambas cadenas. Los plásmidos para la utilización en la construcción de vectores de expresión para la IgGK humana se describen posteriormente. Los plásmidos se construyeron de manera que la PCR amplificase secuencias de ADNc de cadena V pesada y V ligera kappa para reconstruir minigenes completos de cadena pesada y ligera. Estos plásmidos pueden utilizarse para expresar anticuerpos IgG1 kappa o IgG4 kappa completamente humanos o quiméricos. Pueden construirse plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de cadena pesada o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.
De esta manera, en otro aspecto de la invención, se utilizan características estructurales de los anticuerpos anti-CDL18 de la invención para crear anticuerpos anti-CLD18 humanizados y estructuralmente relacionados que conserven por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como la unión a CLD18. Más concretamente, pueden combinarse una o más regiones CDR de anticuerpos monoclonales de ratón recombinantemente con regiones de marco humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-CLD18 humanizados construidos recombinantemente adicionales de la invención.
Unión a células expresantes de antígenos
La capacidad del anticuerpo de unirse a CLD18 puede determinarse utilizando ensayos de unión estándares, tales como los indicados en los ejemplos (por ejemplo ELISA, transferencia western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).
Caracterización de la unión de anticuerpos
Para purificar anticuerpos anti-CLD18, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces de centrifugación de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos anti-CLD18 en biorreactores basados en diálisis. Pueden filtrarse sobrenadantes y, en caso necesario, concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína G-sefarosa o proteína A-sefarosa. La IgG eluida puede comprobarse mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución de tampón puede intercambiarse con PBS, y la concentración puede determinarse a partir de la DO280 utilizando un coeficiente de extinción 1,43. Los anticuerpos monoclonales pueden dividirse en alícuotas y almacenarse a -80ºC.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 seleccionados se unen a epítopos únicos, puede utilizarse la mutagénesis dirigida a un sitio o dirigida a múltiple sitios.
Determinación de isotipo
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, pueden llevarse a cabo los ELISA de isotipo con diversos kits comerciales (por ejemplo Zymed, Roche Diagnostics). Los pocillos de placas de microtitulación pueden recubrirse con Ig antirratón. Tras el bloqueo, las placas se hacen reaccionar con anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los pocillos pueden hacerse reaccionar con IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón, IgA o sondas conjugadas con peroxidasa específicas de IgM de ratón. Tras el lavado, las placas pueden revelarse con sustrato ABTS (1 mg/ml) y analizarse a una DO de 405-650. Alternativamente, puede utilizarse el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, nº de cat. 1493027) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis de citometría de flujo
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos anti-CDL18 en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLD18, puede utilizarse la citometría de flujo. Las líneas celulares que expresan CLD18 naturalmente o después de la transfección y los controles negativos que no presentan expresión de CDL18 (cultivadas bajo condiciones de crecimiento estándares) pueden mezclarse con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS que contiene FBS al 1%, y pueden incubarse a 4ºC durante 30 minutos. Tras el lavado, el anticuerpo anti-IgG marcado con APC o con Alexa647 puede unirse a anticuerpo monoclonal con CLD18 unido bajo las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse mediante citometría de flujo con un instrumento FACS utilizando propiedades de dispersión lumínica y lateral para dejar pasar células vivas individuales. Con el fin de distinguir los anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 de los ligantes no específicos en una sola medición, puede utilizarse el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos codificantes de CLD18 y un marcador fluorescente pueden teñirse tal como se ha indicado anteriormente. Las células transfectadas pueden detectarse en un canal de fluorescencia diferente que las células teñidas con anticuerpo. Debido a que la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 se unen preferentemente a células que expresan marcadores de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transfectadas. Puede utilizarse un ensayo alternativo que utiliza microscopía de fluorescencia adicionalmente o alternativamente al ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente tal como se ha indicado anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia.
Las proteínas de unión estrecha tienden a ser internalizadas en el caso de que el contacto célula-célula con células vecinas de células particularmente adherentes se pierda, por ejemplo por desprendimiento de las células. La expresión en superficie celular de CLD18 puede optimizarse mediante: a) el ajuste de las condiciones de cultivo, por ejemplo con el cultivo a una densidad más alta de una manera estandarizada, utilizando un desprendimiento suave (por ejemplo EDTA/PBS 2 mM o acutasa), el procesamiento a temperatura ambiente y la adición de inhibidores de endocitosis (por ejemplo azida sódica) o activadores de la transcripción o traducción de CLD18, y mediante b) la selección y clonación de células que mantienen CLD18 a niveles elevados en la superficie celular, por ejemplo mediante selección con antibióticos en términos de células transfectadas, mediante inmunomagnetismo o separación celular por FACS y por clonación mediante dilución limitante.
Microscopía de inmunofluorescencia
Con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos anti-CLD18 en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLD18 puede utilizarse el análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, se cultivan líneas celulares que expresan espontáneamente o tras la transfección, CLD18 y controles negativos que no presentan expresión de CLD18, en portaobjetos con cámara bajo condiciones de crecimiento estándares en medio DMEM/F12, suplementado con suero de feto bovino al 10% (FCS), L-glutamina 2 mM, 100 IU/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. A continuación, las células pueden fijarse con metanol o paraformaldehído o dejarse sin tratar. Las células seguidamente pueden hacerse reaccionar con anticuerpos monoclonales contra CLD18 durante 30 minutos a 25 ºC. Tras el lavado, las células pueden hacerse reaccionar con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) bajo las mismas condiciones. A continuación, las células pueden examinarse mediante microscopía de fluorescencia.
Los niveles totales de CLD18 en las células pueden observarse tras fijar las células con metanol o paraformaldehído y permeabilizarlas con Triton X-100. En células vivas y no permeabilizadas, puede examinarse la localización en superficie de CLD18 en células fijadas con paraformaldehído. Además, puede analizarse el direccionamiento de CLD18 a uniones estrechas mediante la cotinción con marcadores de unión estrecha tales como ZO-1. Además, pueden examinarse los efectos de la unión de anticuerpos y la localización de CLD18 dentro de la membrana celular.
Transferencia western
La IgG anti-CLD18 puede someterse a ensayo adicionalmente para reactividad con el antígeno CLD18 mediante transferencia western. Brevemente, pueden prepararse extractos celulares procedentes de células que expresan CLD18 y controles negativos apropiados y someterse a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)poliacrilamida. Tras la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean y se sondean con los anticuerpos monoclonales que deben someterse a ensayo. La unión de IgG puede detectarse utilizando anticuerpo anti-IgG de ratón-peroxidasa y revelarse con sustrato ECL.
Inmunohistoquímica
Pueden someterse a ensayo adicionalmente las IgG anti-CLD18 de ratón para reactividad con el antígeno CLD18 mediante inmunohistoquímica de una manera bien conocida por el experto en la materia, por ejemplo utilizando criosecciones fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con paraformaldehído procedentes de muestras de tejido no canceroso o canceroso obtenidas de pacientes durante procedimientos quirúrgicos rutinarios o de ratones portadores de tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan espontáneamente (por ejemplo DAN-G, SNU-16 ó KATO-III) o tras la transfección (por ejemplo HEK293) CLD18. Para la inmunotinción, pueden incubarse anticuerpos reactivos con CLD18, seguido de anticuerpos de cabra antirratón y de cabra anticonejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (DAKO) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Actividades fagocítica y de eliminación celular de los anticuerpos in vitro
Además de la unión específica a CLD18, pueden someterse a ensayo anticuerpos anti-CLD18 para su capacidad de mediar en la fagocitosis y eliminación de células que expresan CLD18. Para el ensayo de la actividad in vitro de anticuerpos monoclonales, los presentes inventores proporcionan un cribado inicial previamente al ensayo de modelos in vivo.
Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC):
Brevemente, pueden purificarse células polimorfonucleares (PMN), células NK, monocitos, células mononucleares u otras células efectoras, procedentes de donantes sanos, mediante centrifugación de densidad en Ficoll-Hypaque, seguido de la lisis de los eritrocitos contaminantes. Las células efectoras lavadas pueden suspenderse en RPMI suplementado con suero de feto bovino al 10% inactivado por calor o, alternativamente, con suero humano al 5% inactivado por calor y mezclado con células diana marcadas con 51Cr que expresan CLD18, a diversas proporciones de células efectoras a células diana. Alternativamente, las células diana pueden marcarse con un ligando intensificador de la fluorescencia (BATDA). Puede medirse con un fluorímetro un quelato altamente fluorescente del europio con el ligando intensificador, el cual resulta liberado de las células muertas. Otra técnica alternativa puede utilizar la transfección de las células diana con luciferasa. A continuación, el amarillo lucifer añadido puede ser oxidado por las células viables únicamente. Seguidamente las IgG anti-CLD18 purificadas pueden añadirse a diversas concentraciones. Puede utilizarse IgG humano irrelevante a modo de control negativo. Pueden llevarse a cabo ensayos durante 4 a 20 horas a 37ºC dependiendo del tipo de célula efectora utilizado. Pueden someterse a ensayo muestras para citólisis mediante la medición de la liberación del 51Cr o la presencia del quelato EuTDA en el sobrenadante de cultivo. Alternativamente, la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer puede ser una medida del número de células viables. Los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 también pueden someterse a ensayo en diversas combinaciones para determinar si la citólisis resulta incrementada con múltiples anticuerpos monoclonales.
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC):
Los anticuerpos monoclonales anti-CLD18 pueden someterse a ensayo para su capacidad de mediar en la CDC utilizando una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, puede obtenerse suero para el complemento de sangre de una manera conocida por el experto en la materia. Para determinar la actividad de CDC de los mAb, pueden utilizarse diferentes métodos. Por ejemplo puede medirse la liberación de 51Cr o puede evaluarse una permeabilidad membranal elevada utilizando un ensayo de exclusión de yoduro de propidio (YP). Brevemente, las células diana pueden lavarse y pueden incubarse 5x105 células/ml con diversas concentraciones de mAb durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente o a 37ºC. A continuación, puede añadirse suero o plasma a una concentración final de 20% (v/v) y las células incubarse a 37ºC durante 20 a 30 minutos. Todas las células de cada muestra pueden añadirse a la solución de YP en un tubo para FACS. La mezcla seguidamente puede analizarse inmediatamente mediante análisis de citometría de flujo utilizando FACSArray.
En un ensayo alternativo, puede determinarse la inducción de la CDC sobre las células adherentes. En una forma de realización de este ensayo, se siembran las células 24 horas antes del ensayo con una densidad de 3x104 células/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano para cultivo de tejidos. Al día siguiente, se extrae el medio y las células se incuban por triplicado con anticuerpos. Las células de control se incuban con medio de crecimiento o con medio de crecimiento que contiene saponina al 0,2% para la determinación de la lisis de fondo y la lisis máxima, respectivamente. Tras la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, se extrajo el sobrenadante y se añadió plasma humano al 20% (v/v) o suero en DMEM (precalentado a 37ºC) a las células y se incubaron durante 20
minutos más a 37ºC. Todas las células de cada muestra se añadieron a solución de yoduro de propidio (10 µg/ml). A continuación, se sustituyeron los sobrenadantes por PBS que contenía 2,5 µg/ml de bromuro de etidio y se midió a 600 nm la emisión de fluorescencia tras la excitación a 520 nm, utilizando un aparato Tecan Safire. Se calculó el porcentaje de lisis específica de la manera siguiente: % de lisis específica = (fluorescencia de la muestra fluorescencia de fondo) / (fluorescencia de la lisis máxima - fluorescencia de fondo) x 100.
Inhibición de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales:
Para someter a ensayo la capacidad de iniciar la apoptosis, pueden incubarse anticuerpos monoclonales anti-CLD18, por ejemplo con células tumorales positivas para CLD18, por ejemplo SNU-16, DAN-G, KATO-IIII o células tumorales transfectadas con CLD18, a 37ºC durante aproximadamente 20 horas. Las células pueden recolectarse, lavarse en tampón de unión de anexina-V (BD Biosciences), e incubarse con anexina-V conjugada con FITC o APC (BD Biosciences) durante 15 minutos en la oscuridad. Todas las células de cada muestra pueden añadirse a solución de YP (10 µg/ml en PBS) en un tubo de FACS y evaluarse inmediatamente mediante citometría de flujo (tal como anteriormente). Alternativamente, puede detectarse una inhibición general de la proliferación celular por anticuerpos monoclonales utilizando kits disponibles comercialmente. El kit de proliferación celular DELFIA (Perkin-Elmer, nº de cat. AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo2'-desoxiuridina (BrdU) durante la síntesis del ADN de las células proliferantes en microplacas. El BrdU incorporado se detecta utilizando anticuerpo monoclonal marcado con europio. Para permitir la detección de los anticuerpos, se fijan las células y el ADN se desnaturaliza utilizando solución de fijación. Los anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavado y se añade inductor DELFIA para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado hacia la solución, en donde forman quelatos altamente fluorescentes con componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia medida (utilizando fluorimetría resuelta temporalmente en la detección) es proporcional a la síntesis de ADN en las células de cada pocillo.
Estudios preclínicos
Los anticuerpos monoclonales que se unen a CLD18 también pueden someterse a ensayo en un modelo in vivo (por ejemplo en ratones inmunológicamente deficientes portadores de tumores xenoinjertados, en los que se han inoculado líneas celulares que expresan CLD18, por ejemplo DAN-G, SNU-16 ó KATO-III, o después de la transfección, por ejemplo HEK293) para determinar su eficacia en el control del crecimiento de las células tumorales que expresan CLD18.
Pueden llevarse a cabo estudios in vivo tras xenoinjertar células tumorales que expresan CLD18 en ratones inmunocomprometidos u otros animales utilizando anticuerpos de la invención. Pueden administrarse anticuerpos en ratones sin tumor seguido de la inyección de células tumorales para medir los efectos de los anticuerpos en la prevención de la formación de tumores o de síntomas relacionados con tumores. Los anticuerpos pueden administrarse en ratones portadores tumorales con el fin de determinar la eficacia terapéutica de los anticuerpos respectivos en la reducción del crecimiento tumoral, la metástasis o síntomas relacionados con tumores. La aplicación de anticuerpos puede combinarse con la aplicación de otras sustancias, tales como fármacos citostásticos, inhibidores de factor de crecimiento, bloqueantes del ciclo celular, inhibidores de la angiogénesis u otros anticuerpos para determinar la eficacia sinérgica y la potencial toxicidad de las combinaciones. Con el fin de analizar los efectos secundarios tóxicos mediados por anticuerpos de la invención, los animales pueden inocularse con anticuerpos o reactivos de control e investigarse a fondo para síntomas posiblemente relacionados con la terapia de anticuerpos de CLD18. Entre los posibles efectos secundarios de la aplicación in vivo de anticuerpos de CLD18 se incluyen en particular la toxicidad en los tejidos que expresan CLD18, incluyendo el estómago y el pulmón. Los anticuerpos que reconocen CLD18 en el ser humano y en otras especies, por ejemplo el ratón, resultan particularmente útiles para predecir los potenciales efectos secundarios mediados por la aplicación de los anticuerpos monoclonales de CLD18 en el ser humano.
Mapeado de epítopos
El mapeado de epítopos reconocidos por los anticuerpos de la invención puede llevarse a cabo tal como se describe en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)" de Glenn E. Morris, ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach", Practical Approach Series, 248, de Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay.
I. Moléculas biespecíficas/multiespecíficas que se unen a CLD18
En todavía otra forma de realización de la invención, los anticuerpos de CLD18 pueden derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína (por ejemplo un fragmento Fab') con el fin de generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se une a múltiples sitios de unión o epítopos diana. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro modo) a otra u otras moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, péptido o mimético de unión.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de unión para CLD18 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una forma de realización particular de la invención, el segundo epítopo diana es un receptor de Fc, por ejemplo Fc-yRI humano (CD64) o un receptor de Fc-a (CD89) o un receptor de célula T, por ejemplo CD3. Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas capaces de unirse a células efectoras expresantes de Fc-yR, Fc-aR o Fc-£R (por ejemplo monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)) y a células diana que expresan CLD18. Estas moléculas biespecíficas o multiespecíficas pueden dirigir las células expresantes de CLD18 a células efectoras y pueden inducir actividades de célula efectora mediadas por receptores de Fc, tales como la fagocitosis de las células expresantes de CLD18, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la liberación de citocinas o la generación de anión superóxido.
Entre las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención pueden incluirse además una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de anti-unión de Fc y una especificidad anti-unión de CLD18. En una forma de realización, la tercera especificidad de unión es una porción anti-factor de intensificación (FI), por ejemplo una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en la actividad citotóxica y que de esta manera incrementa la respuesta inmunológica contra la célula diana. La "porción anti-factor de intensificación" puede ser un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo un antígeno o un receptor, y que de esta manera resulta en una intensificación del efecto de los determinantes de unión para el receptor de Fc o el antígeno de la célula diana. La "porción anti-factor de intensificación" puede unirse a un receptor de Fc o a un antígeno de la célula diana. Alternativamente, la porción anti-factor de intensificación puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen la primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, una porción anti-factor de intensificación puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo mediante CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmunológica que resulte en una respuesta inmunológica incrementada contra la célula diana).
En una forma de realización, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2 o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadenas ligeras o de cadenas pesadas, o cualquier fragmento mínimo del mismo, tal como un Fc o un constructo de cadena sencilla, tal como se describe en Ladner et al., patente US nº 4.946.778. El anticuerpo también puede ser una proteína de fusión de dominio de unióninmunoglobulina, tal como se da a conocer en los documentos US 2003/0118592 y 2003/0133939.
En una forma de realización, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden una especificidad de unión para un Fc-yR o un Fc-aR presente sobre la superficie de una célula efectora, y una segunda especificidad de unión para un antígeno de la célula diana, por ejemplo CLD18.
En una forma de realización, un anticuerpo monoclonal proporciona la especificidad de unión para un receptor de Fc, la unión del cual no resulta bloqueada por la inmunoglobulina G (IgG) humana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ochos genes de cadena y situados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembranal o soluble, los cuales se agrupan en tres clases de receptor de Fcy: Fc-yRI (CD64), Fc-yRII (CD32) y Fc-yRIII (CD16). En una forma de realización preferente, el receptor de Fcy es un Fc-yRI de alta afinidad humano.
La producción y caracterización de estos anticuerpos monoclonales preferentes se describen en Fanger et al., en el documento WO 88/00052 y en la patente US nº 4.954.617. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fc-yRI, FcyRII o Fc-yRIII en un sitio que es diferente del sitio de unión de Fcy del receptor y, de esta manera, su unión no resulta bloqueada sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Son anticuerpos anti-FcyRI específicos que resultan útiles en la presente invención, mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. En otras formas de realización, el anticuerpo anti-receptor de Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano R.F. et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002, 1995 y en el documento WO nº 94/10332. La línea celular productora de anticuerpo H22 se ha depositó en la American Type Culture Collection el 4 de noviembre de 1992 bajo la designación HA022CL1 y presenta el nº de acceso CRL 11177.
En todavía otras formas de realización preferidas, la especificidad de unión para un receptor de Fc la proporciona un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, por ejemplo un receptor de Fc-a (Fc-aRI (CD89)), la unión del cual preferentemente no resulta bloqueada por la inmunoglobulina A (IgA) humana. La expresión "receptor de IgA" pretende incluir el producto génico de un gen a (Fc-aRI) situado en el cromosoma 19. Este gen es codificado que codifica varias isoformas transmembranales alternativamente procesadas de 55 a 110 kDa. Fc-aRI (CD89) se expresa constitutivamente sobre monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no sobre poblaciones celulares no efectoras. Fc-aRI presenta una afinidad intermedia tanto para IgA1 como para IgA2, que se incrementa con la exposición a citocinas, tales como G-CSF o GM-CSF (Morton H.C. et al., Critical Reviews in Immunology 16:423-440, 1996). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos para Fc-aRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a Fc-aRI fuera del dominio de unión de ligando de IgA (Monteiro R.C. et al., J. Immunol. 148:1764, 1992).
Fc-aRI y Fc-yRI son receptores de inducción preferentes para la utilización en la invención debido a que: (1) se expresan principalmente sobre las células efectoras inmunológicas, por ejemplo monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas, (2) se expresan a niveles elevados (por ejemplo 5.000 a 100.000 en cada célula), (3) son mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo la ADCC y la fagocitosis), (4) median en la presentación incrementada de antígenos, incluyendo autoantígenos, dirigidos a ellos.
En otra forma de realización, la molécula biespecífica comprende dos anticuerpos monoclonales según la invención que presentan actividades funcionales complementarias, de manera que un anticuerpo funciona predominantemente induciendo CDC y el otro anticuerpo funciona predominantemente induciendo apoptosis.
La expresión "anticuerpo específico de célula efectora" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional de anticuerpo que se une al receptor de Fc de células efectoras. Los anticuerpos preferentes para la utilización en la presente invención se unen a receptores de Fc de las células efectoras en un sitio al que no se unen las inmunoglobulinas endógenas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula efectora" se refiere a una célula inmunológica que participa en la etapa efectora de una respuesta inmunológica, y no en las etapas cognitiva y de activación de una respuesta inmunológica. Entre las células inmunológicas ejemplares se incluyen las células de origen mieloide o linfoide, por ejemplo linfocitos (por ejemplo células B y células T, incluyendo células T citotóxicas (CTL), células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basófilos). Algunas células efectoras expresan receptores de Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunológicas específicas. En formas de realización preferidas, una célula efectora es capaz de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, los macrófagos, los cuales expresan FcR, participan en la eliminación específica de las células diana y presentan antígenos a otros componentes del sistema inmunológico, o la unión a células que presentan antígenos. En otras formas de realización, una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana, una célula diana o un microorganismo. La expresión de un FcR particular sobre una célula efectora puede encontrarse regulada por factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, la expresión de Fc-yRI se ha encontrado que resulta regulada positivamente por el interferón-y (IFN-y). Esta expresión intensificada incrementa la actividad citotóxica de las células portadoras de Fc-yRI contra las dianas. Una célula efectora puede fagocitar o lisar un antígeno diana o una célula diana.
La expresión "célula diana" se refiere a cualquier célula no deseable en un sujeto (por ejemplo un ser humano o animal) que puede ser la diana de un anticuerpo de la invención. En formas de realización preferidas, la célula diana es una célula que expresa o sobreexpresa CLD18. Entre las células que expresan CLD18 típicamente se incluyen las células tumorales.
Pueden prepararse moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención utilizando técnicas químicas (ver, por ejemplo, D.M. Kranz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807, 1981), técnicas de "polidoma" (ver la patente US nº 4.474.893, de Reading) o técnicas de ADN recombinante.
En particular, pueden prepararse moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención mediante la conjugación de especificidades de unión constituyentes, por ejemplo las especificidades de unión anti-FcR y anti-CLD18 utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas puede generarse por separado y después conjugarse con otras. En el caso de que las especificidades de unión sean proteínas o péptidos, puede utilizarse una diversidad de agentes de acoplamiento
o de entrecruzamiento para la conjugación covalente. Entre los ejemplos de agentes de entrecruzamiento se incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil-4-(Nmaleimidometil)ciclohexán-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160:1686, 1984; Liu M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648, 1985). Entre otros métodos se incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. 78:118-132, 1985), Brennan et al. (Science 229:81-83, 1985) y Glennie et al. (J. Immunol. 139:2367-2375, 1987). Son agentes de conjugación preferentes, SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
En el caso de que las especificidades de unión sean anticuerpos, pueden conjugarse mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra C-terminales de las dos cadenas pesadas. En una forma de realización particularmente preferente, la región bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno, previamente a la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden encontrarse codificadas en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método resulta particularmente útil en el caso de que la molécula biespecífica y multiespecífica sea una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica y multiespecífica de la invención, por ejemplo una molécula biespecífica, puede ser una molécula de cadena sencilla, tal como un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula
biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas de cadena sencilla o pueden comprender por lo menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas y multiespecíficas se describen en, por ejemplo, las patentes US nº 5.260.203, nº 5.455.030, nº 4.881.175, nº 5.132.405, nº 5.091.513, nº 5.476.786, nº 5.013.653, nº 5.258.498 y nº 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse mediante ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), análisis de FACS, un bioensayo (por ejemplo de inhibición del crecimiento) o un ensayo de transferencia western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular mediante la utilización de un reactivo marcado (por ejemplo un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, pueden detectarse complejos FcR-anticuerpo utilizando, por ejemplo, un anticuerpo unido a enzima o un fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse utilizando cualquiera de entre una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radioactivamente y utilizarse en un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isótopo radioactivo puede detectarse mediante medios tales como la utilización de un contador y o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.
II. Inmunoconjugados
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CLD18 conjugado con una fracción o agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo un inmunosupresor) o un isótopo radioactivo. Dichos conjugados se denominan en la presente memoria "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que resulte perjudicial para las células y, en particular, que las mate. Entre los ejemplos se incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Entre los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la invención se incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5fluorouracil-decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina). En una forma de realización preferente, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra forma de realización, el agente terapéutico es un inmunosupresor. En todavía otra forma de realización, el agente terapéutico es GM-CSF. En una forma de realización preferente, el agente terapéutico es doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida o ricina-A.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse con un isótopo radioactivo, por ejemplo yodo131, itrio-90 ó indio-111, para generar radiofarmacéuticos citotóxicos para el tratamiento de un trastorno relacionado con CLD18, tal como un cáncer. Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y la fracción fármaco no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción fármaco puede ser una proteína o polipéptido que presente una actividad biológica deseada. Entre dichas proteínas pueden incluirse, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica; una proteína, tal como el factor de necrosis tumoral o el interferón-y o modificadores de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar dicha fracción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas; ver, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243 a 256 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en: Controlled Drug Delivery (2a edición), Robinson et al. (editores), páginas 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (editores), páginas 475 a 506, 1985; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), páginas 303 a 316 (Academic Press, 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58, 1982.
En una forma de realización adicional, los anticuerpos según la invención se unen a un conector-quelante, por ejemplo tiuxetano, que permite que el anticuerpo se conjugue con un isótopo radioactivo.
III. Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo o una combinación de anticuerpos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, así como con otros adyuvantes y excipientes conocidos según técnicas convencionales, tales como las dadas a conocer en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, Gennaro, editor, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. En una forma de realización, entre las composiciones se incluyen una combinación de múltiples (por ejemplo dos o más) anticuerpos aislados de la invención que actúan mediante mecanismos diferentes, por ejemplo un anticuerpo que actúa predominantemente mediante la inducción de CDC en combinación con otro anticuerpo que actúa predominantemente mediante la inducción de apoptosis.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, en combinación con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención con por lo menos un agente antiinflamatorio o por lo menos un agente inmunosupresor. En una forma de realización, entre dichos agentes terapéuticos se incluyen uno o más agentes antiinflamatorios, tales como un fármaco esteroideo o un NSAID (fármaco antiinflamatorio no esteroideo). Entre los agentes preferentes se incluyen, por ejemplo, aspirina y otros salicilatos, inhibidores de Cox-2, tales como rofecoxib (Vioxx) y celecoxib (Celebrex), NSAID tales como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
En otra forma de realización, entre dichos agentes terapéuticos se incluyen agentes que conducen al agotamiento o inactivación funcional de las células T reguladoras, tales como dosis bajas de ciclofosfamida, anticuerpos anti-CTLA4, o anticuerpos anti-IL2 o anti-receptor de IL-2.
En todavía otra forma de realización, entre dichos agentes terapéuticos se incluyen uno o más quimioterapéuticos, tales como derivados de taxol, taxotere, gemcitabina, 5-fluorouracilo, doxorrubicina (adriamicina), cisplatino (platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar). En otra forma de realización, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse en combinación con agentes quimioterapéuticos, que preferentemente muestran eficacia terapéutica en pacientes que sufren de cáncer de estómago, esofágico, pancreático y pulmonar.
En todavía otra forma de realización, los anticuerpos de la invención pueden administrarse conjuntamente con radioterapia y/o células madre periféricas autólogas o trasplante de médula ósea.
En todavía otra forma de realización, los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con uno
o más anticuerpos seleccionados de entre anticuerpos anti-CD25, anti-EPCAM, anti-EGFR, anti-Her2/neu y anti-CD40.
En todavía una forma de realización adicional, los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con un anticuerpo anti-C3b(i) con el fin de incrementar la activación del complemento.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto frente a la acción de ácidos y otras condiciones naturales que podrían inactivar el compuesto.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no produce ningún efecto toxicológico no deseado (ver, por ejemplo, Berge S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19, 1977).
Entre los ejemplos de dichas sales se incluyen las sales de adición de ácido y las sales de adición de base. Entre las sales de adición de ácido se incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como los ácidos hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrómico, hidroyódico y fosforoso, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos con sustitución del fenol, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos y ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos. Entre las sales de adición de ácidos se incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio y calcio, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina y procaína.
Una composición de la presente invención pueden administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán el compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones son generalmente conocidos por el experto en la materia. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, editor, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Con el fin de administrar un compuesto de la invención mediante determinadas vías de administración puede resultar necesario recubrir el compuesto un material que impida su inactivación, o coadministrar el compuesto con dicho material. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse en un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas, o un diluyente. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables se incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Entre los liposomas se incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7:27, 1984).
Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional resulte incompatible con el compuesto activo, se encuentra contemplada la utilización del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada que resulte adecuada para una concentración elevada de fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse mediante, por ejemplo, la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante la utilización de surfactantes. En muchos casos, resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede generarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo sales monoestearato y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes indicado anteriormente, según resulte necesario, seguido de la esterilización mediante microfiltración.
Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de entre los indicados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío y el secado mediante congelación (liofilización), los cuales rinden unos polvos del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución del mismo previamente esterilizada mediante filtración.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionan la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente según dicten las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de las dosis. La forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas que resultan adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que deben tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención está dictada y es directamente dependiente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que debe conseguirse, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de preparación de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Entre los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables se incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico y sulfito sódico, (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo y a-tocoferol, y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico y ácido fosfórico.
Para las composiciones terapéuticas, entre las formulaciones de la presente invención se incluyen las adecuadas para la administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualesquiera métodos conocidos de la técnica farmacéutica. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto bajo tratamiento y el modo particular de administración. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual generalmente será la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico.
Generalmente, en porcentaje, dicha cantidad se encuentra comprendida entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente noventa y nueve por ciento del principio activo, preferentemente entre aproximadamente 0,1 por ciento y aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente entre aproximadamente 1 por ciento y aproximadamente 30 por ciento.
Las formulaciones de la presente invención que resultan adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en spray que contienen dichos portadores, tal como es conocido de la técnica que resulta apropiado. Entre las formas de dosificación para la administración tópica
o transdérmica de composiciones de la presente invención se incluyen polvos, sprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualesquiera conservantes, tampones o propelentes que resulten necesarios.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a modos de administración diferentes de las administraciones entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, aunque sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Entre los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas de la invención se incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilización de materiales de recubrimiento, tales como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante la utilización de surfactantes.
Dichas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabén, clorobutanol y ácido fenolsórbico. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares y cloruro sódico en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En una forma de realización, los anticuerpos monoclonales de la invención se administran en forma cristalina mediante inyección subcutánea; ver Yang et al., PNAS 100(12):6934-6939, 2003. En el caso de que los compuestos de la presente invención se administren como farmacéuticos, en seres humanos y en animales, pueden proporcionarse solos o en forma de una composición farmacéutica que contenga, por ejemplo, 0,01% a 99,5% (más preferentemente 0,1% a 90%) de principio activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
Con independencia de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, los cuales pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.
Los niveles de dosis reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del principio activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que resulte tóxica para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, entre ellos la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, de la vía de administración, del tiempo de administración, de la tasa de excreción del compuesto particular utilizado, de la duración del tratamiento, de otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares usadas, de la edad, sexo, peso, estado general de salud e historia médica previa del paciente bajo tratamiento y de factores similares bien conocidos de la medicina.
Un médico o veterinario experto en la materia podrá determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar el tratamiento con dosis de
los compuestos de la invención utilizadas en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosis hasta alcanzar el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis efectiva mínima necesaria para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva generalmente dependerá de los factores indicados anteriormente. Resulta preferente que la administración sea por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferentemente administrada en un sitio próximo al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas separadamente a intervalos apropiados durante el día, opcionalmente en formas de dosificación unitaria. Aunque resulta posible la administración de un compuesto de la presente invención por sí solo, resulta preferible administrar el compuesto en forma de una formulación (composición) farmacéutica.
En una forma de realización, los anticuerpos de la invención pueden administrarse mediante infusión, preferentemente mediante infusión continua lenta durante un periodo prolongado, tal como más de 24 horas, con el fin de reducir los efectos secundarios tóxicos. La administración también puede llevarse a cabo mediante infusión continua durante un periodo de entre 2 y 24 horas, tal como entre 2 y 12 horas. Dicho régimen puede repetirse una o más veces según resulte necesario, por ejemplo tras 6 ó 12 meses. La dosis puede determinarse o ajustarse mediante la medición de la cantidad de anticuerpos monoclonales anti-CDL18 circulantes tras la administración en una muestra biológica mediante la utilización de anticuerpos antiidiotípicos con diana en los anticuerpos anti-CLD18.
En todavía otra forma de realización, los anticuerpos se administran mediante terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un periodo de 6 ó más meses.
En todavía otra forma de realización, los anticuerpos según la invención pueden administrarse mediante un régimen que incluye una infusión de un anticuerpo contra CLD18 seguido de una infusión de un anticuerpo contra CLD18 conjugado con un isótopo radioactivo. El régimen puede repetirse, por ejemplo, 7 a 9 días después.
Pueden administrarse composiciones terapéuticas con dispositivos médicos conocidos de la técnica. Por ejemplo, en una forma de realización preferente, puede administrarse una composición terapéutica de la invención con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos dados a conocer en las patentes US n 5.399.163, nº 5.383.851, nº 5.312.335, nº 5.064.413, nº 4.941.880, nº 4.790.824 ó nº 4.596.556. Entre los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos que resultan útiles en la presente invención se incluyen los descritos en la patente US nº 4.487.603, que da a conocer una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una tasa controlada; la patente US nº 4.486.194, que da a conocer un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente US nº 4.447.233, que da a conocer una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una tasa de infusión exacta; la patente US nº 4.447.224 que da a conocer un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la patente US nº 4.439.196, que da a conocer un sistema osmótico de administración de fármacos que presenta compartimientos multicámara, y la patente US nº 4.475.196, que da a conocer un sistema osmótico de administración de fármaco.
Muchos otros de entre dichos implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por el experto en la materia. En determinadas formas de realización, los anticuerpos de la invención pueden formularse para garantizar la distribución correcta in vivo. Por ejemplo, la barrera hematocefálica (BHC) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la BHC (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de preparación de liposomas ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.522.811, nº 5.374.548 y nº 5.399.33. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que son transportadas selectivamente al interior de células u órganos específicos y de esta manera incrementar la administración dirigida de fármacos (ver, por ejemplo, V.V. Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29:685, 1989). Entre las fracciones diana ejemplares se incluyen el folato o la biotina (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.416.016, de Low et al.), los manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038, 1988), los anticuerpos (P.G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357:140, 1995; M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39:180, 1995) y el receptor de proteína A surfactante (Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233:134, 1995).
En una forma de realización de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención se formulan en liposomas. En una forma de realización más preferente, los liposomas incluyen una fracción diana. En una forma de realización más preferente, los compuestos terapéuticos en los liposomas se administran mediante inyección de bolo en un sitio próximo al área deseada, por ejemplo el sitio de un tumor. La composición debe ser líquida en el grado de que haya una fácil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
En una forma de realización adicional, los anticuerpos de la invención pueden formularse para prevenir o reducir su transporte a través de la placenta. Esto puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica, pro ejemplo mediante PEGilación de los anticuerpos o mediante la utilización de fragmentos F(ab')2.
Pueden obtenerse referencias adicionales en "Cunningham-Rundles C., Zhuo Z., Griffith B., Keenan J., Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation", J. Immunol.
Methods 152:177-190, 1992, y en Landor M., Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74:279-283, 1995.
Puede medirse una "dosis terapéuticamente efectiva" para la terapia tumoral a partir de respuestas tumorales objetivas que pueden ser completas o parciales. Una respuesta completa (RC) se define como ninguna evidencia de enfermedad, clínica, radiológica o de otro tipo. Una respuesta parcial (RP) resulta de una reducción en el tamaño tumoral agregado superior al 50%. La mediana del tiempo hasta la progresión es una medida que caracteriza la durabilidad de la respuesta tumoral objetiva.
Una "dosis terapéuticamente efectiva" para la terapia tumoral también puede medirse a partir de su capacidad de estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto de inhibir el cáncer puede evaluarse en un sistema modelo animal predictivo de la eficacia para los tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse mediante el examen de la capacidad del compuesto de inhibir el crecimiento o apoptosis celular mediante ensayos in vitro conocidos por el experto en la materia. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede reducir el tamaño tumoral, o de otro modo mejorar los síntomas en un sujeto. El experto ordinario en la materia podrá determinar dichas cantidades basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.
La composición debe ser estéril y líquida en la medida en que la composición puede administrarse con una jeringa. Además de agua, el portador puede ser una solución salina tamponada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez correcta mediante, por ejemplo, la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante la utilización de surfactantes. En muchos casos resulta preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro sódico en la composición. Puede conseguirse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina.
En el caso de que el compuesto activo se encuentre convenientemente protegido, tal como se ha indicado anteriormente, el compuesto puede administrarse oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable.
IV. Usos y métodos que incluyen anticuerpos de la invención
Los anticuerpos (incluyendo inmunoconjugados, biespecíficos/multiespecíficos, composiciones y otros derivados indicados en la presente memoria) de la presente invención presentan numerosas utilidades terapéuticas que implican el tratamiento de trastornos en los que participan célula que expresan CLD18A2. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse en células en cultivo, pro ejemplo in vitro o ex vivo, o en sujetos humanos, por ejemplo in vivo, con el fin de tratar o prevenir una diversidad de trastornos, tales como los indicados en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos que responden a los anticuerpos contra CLD18A2. Entre los sujetos preferentes se incluyen pacientes humanos que presentan trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la eliminación de células enfermas, en particular células caracterizadas por un patrón de expresión alterado de CLD18A2 en comparación con las células normales.
Un efecto terapéutico en los tratamientos expuestos en la presente memoria preferentemente se consigue a partir de las propiedades funcionales de los anticuerpos de la invención para mediar en la eliminación de las células.
Por ejemplo, en una forma de realización, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan CLD18A2, incluyendo, por ejemplo, el cáncer gástrico. Entre los ejemplos de enfermedades tumorógenas que pueden tratarse y/o prevenirse se incluyen todos los cánceres y entidades tumorales que expresan CLD18A2, incluyendo el cáncer de estómago, el cáncer esofágico, el cáncer pancreático, el cáncer pulmonar, el cáncer ovárico, el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer hepático, el cáncer de la vesícula biliar y cáncer de cabeza y cuello. Estos cánceres pueden encontrarse en estadios tempranos, intermedios o avanzados, por ejemplo en metástasis.
Las composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento descritos según la invención también pueden utilizarse para la inmunización o vacunación con el fin de prevenir una enfermedad indicada en la presente memoria.
En otra forma de realización, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar niveles de CLD18 ó formas particulares de CLD18, o los niveles de las células que contienen CLD18 sobre su superficie membranal, los cuales pueden relacionarse con determinadas enfermedades o síntomas de enfermedad, tal como se ha indicado anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse para reducir el número o interactuar con la función de las células expresantes de CLD18, convirtiendo de esta manera a estas células en importantes
mediadores de la enfermedad. Lo anterior puede conseguirse poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-CLD18 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y CLD18. Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y CLD18 se detectan y se comparan en la muestra y una muestra de control, es decir, una muestra de referencia.
Los anticuerpos de la invención pueden someterse a ensayo inicialmente para su actividad de unión asociada a usos terapéuticos o diagnósticos in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos pueden someterse a ensayo utilizando ensayos de citometría de flujo tal como se indica en la presente memoria.
Además, puede someterse a ensayo la actividad de los anticuerpos en la inducción de por lo menos una actividad de célula efectora mediada por un efector, incluyendo la inhibición del crecimiento y/o la eliminación de células que expresan CLD18. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la capacidad de los anticuerpos de inducir CDC y/o apoptosis. En la presente memoria se describen protocolos de ensayo para la CC, la adhesión homotípica, el agrupamiento molecular o la apoptosis.
Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para inducir in vivo o in vitro una o más de las actividades biológicas siguientes: inhibición del crecimiento y/o diferenciación de una célula que expresa CLD18; eliminación de una célula que expresa CLD18; mediación en la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa CLD18 en presencia de células efectoras; mediación de la CDC de una célula que expresan CLD18 en presencia de complemento; mediación en la apoptosis de una célula que expresa CLD18; inducción de adhesión homotípica, y/o inducción de la traslocación a balsas de lípidos tras la unión a CLD18.
En una forma de realización particular, los anticuerpos pueden utilizarse in vivo o in vitro para tratar, prevenir o diagnosticar una diversidad de enfermedades relacionadas con CLD18. Entre los ejemplos de enfermedades relacionadas con CLD18 se incluyen, entre otras, cánceres tales como el cáncer gástrico, el cáncer pancreático, el cáncer esofágico, el cáncer pulmonar y cánceres tales como los presentados anteriormente.
CLD18A2 también se expresan en células de estómago normales diferenciadas. Los posibles efectos secundarios clínicos inducidos por anticuerpos derivados de la eliminación de dichas células pueden reducirse o evitarse mediante la administración en paralelo de fármacos protectores de estómago, tales como antácidos o inhibidores de la bomba gástrica de protones, tales como omeprazol o fármacos relacionados.
Las vías adecuadas de administración de las composiciones de anticuerpo de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas de la técnica y pueden ser seleccionadas por el experto ordinario en la materia.
Tal como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos anti-CLD18 de la invención pueden coadministrarse con uno
o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo un agente citotóxico, un agente radiotóxico, un agente antiangiogénico y/o un agente inmunosupresor para reducir la inducción de respuestas inmunológicas contra los anticuerpos de la invención. El anticuerpo puede unirse al agente (en forma de complejo inmunológico) o puede administrarse separadamente del agente. En este último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o concurrentemente con el agente o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo una terapia anticáncer, por ejemplo la radiación. Entre dichos agentes terapéuticos se incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tal como se ha indicado anteriormente. La coadministración de los anticuerpos anti-CLD18 de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticáncer que funcionan mediante mecanismos diferentes, rindiendo un agente citotóxico para las células tumorales. Dicha coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio de antigenicidad de las células tumorales que las convertiría en no reactivas con el anticuerpo.
En otra forma de realización particular de la invención, el sujeto en el que se administra el anticuerpo se trata adicionalmente con un agente antiangiogénico, incluyendo anticuerpos con diana en VEGF o VEGFR y uno o más compuestos químicos inhibidores de la angiogénesis. El pretratamiento o la aplicación en paralelo de estos fármacos puede mejorar la penetración de los anticuerpos en tumores sólidos.
En otra forma de realización particular de la invención, el sujeto en el que se administra el anticuerpo se trata adicionalmente con un compuesto que inhibe la señalización de receptores de factor de crecimiento, incluyendo anticuerpos monoclonales que se unen al receptor EGFR, así como compuestos químicos que inhiben la señalización iniciada por el receptor EGFR, Her1 ó Her2/neu.
Las células efectoras específicas de diana, por ejemplo células efectoras unidas a composiciones (por ejemplo anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Las células efectoras para el direccionamiento pueden ser leucocitos humanos, tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Entre otras células se incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras de receptor de IgG o IgA. Si se desea, pueden obtenerse células efectoras del sujeto que debe tratarse. Las células efectoras específicas de diana pueden administrarse en forma de suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administrado puede ser del orden de 108 a 109, aunque variará dependiendo del objetivo terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para conseguir la localización
en la célula diana, por ejemplo una célula tumoral que expresa CLD18, y para llevar a cabo la eliminación celular mediante, por ejemplo, fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar.
La terapia con células efectoras específicas de diana puede llevarse a cabo conjuntamente con otras técnica para la eliminación de células diana. Por ejemplo, la terapia antitumoral utilizando las composiciones de la invención y/o células efectoras armadas con dichas composiciones puede utilizarse conjuntamente con quimioterapia. Además, puede utilizarse la inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas diferentes al rechazo de las células tumorales. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos anti-CLD18 unidas a anti-Fc-RI o a anti-CD3 conjuntamente con agentes de unión específicos de receptor de IgG o de IgA.
También pueden utilizarse moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención para modular los niveles de FcyR o Fc-aR sobre las células efectoras, tal como mediante adición de caperuza y eliminación de receptores sobre la superficie celular. También pueden utilizarse mezclas de receptores anti-Fc con este objetivo.
Las composiciones (por ejemplo anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que presentan sitios de unión al complemento, tales como partes de IgG1, IgG2 ó IgG3 ó IgM que se unen al complemento, también pueden utilizarse en presencia del complemento. En una forma de realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células diana con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas puede suplementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células diana recubiertas con un agente de unión de la invención puede mejorarse mediante la unión de proteínas del complemento. En otra forma de realización, también pueden ser lisadas por el complemento células diana recubiertas con las composiciones de la invención. En todavía otra forma de realización, las composiciones de la invención no activan el complemento.
Las composiciones de la invención también pueden administrarse conjuntamente con el complemento. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se encuentran comprendidas dentro del alcance de la invención composiciones que comprenden anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones resultan ventajosas en el aspecto de que el complemento se encuentra situado en estrecha proximidad a los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas.
Alternativamente, los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la invención, y el complemento o suero pueden administrarse separadamente. La unión de las composiciones de la presente invención a las células diana provoca la traslocación del complejo de antígeno CLD18-anticuerpo a balsas de lípidos de la membrana celular. Dicha traslocación crea una densidad elevada de complejos de antígeno-anticuerpo que pueden activar eficientemente y/o intensificar la CDC.
Las composiciones de anticuerpos de la invención (por ejemplo anticuerpos e inmunoconjugados) e instrucciones para la utilización pueden encontrarse comprendidas en un kit. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo un anticuerpo que presenta una actividad complementaria).
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la invención pueden administrarse además (antes, simultáneamente o después de la administración de un anticuerpo del a invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que intensifica o potencia el efecto terapéutico de los anticuerpos de la invención.
En otras formas de realización, el sujeto puede tratarse además con un agente que modula, por ejemplo incrementa
o inhibe, la expresión o actividad de los receptores de Fc-y o Fc-a mediante, por ejemplo, el tratamiento de un sujeto con una citocina. Entre las citocinas preferentes se incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el interferón-y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral (TNF). Otros genes importantes para incrementar la eficacia terapéutica de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas indicadas en la presente memoria son los �-glucanos, que son homopolisacáridos de residuos de glucosa ramificados y son producidos por una diversidad de plantas y microorganismos, por ejemplo bacterias, algas, hongos, levaduras y cereales. También pueden utilizarse fragmentos de �-glucanos producidos por organismos. Preferentemente, el �-glucano es un polímero de �(1,3)-glucosa, en el que por lo menos algunas de las unidades esqueléticas de glucosa, por ejemplo 3% a 6% de las unidades esqueléticas de glucosa, presentan ramificaciones tales como ramas �(1,6).
Los métodos para detectar la presencia de antígeno CLD18 en una muestra, o para medir la cantidad de antígeno CLD18 pueden comprender poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo que se une específicamente a CLD18, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o una parte del mismo y CLD18. La formación de un complejo seguidamente se detecta, en el que una diferencia en la formación de complejo entre la muestra y la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno CLD18 en la muestra.
Un método para detectar la presencia o para cuantificar la cantidad de células expresantes de CLD18 in vivo o in vitro puede comprender: (i) administrar en un sujeto una composición de la invención conjugada con un marcador detectable, (ii) exponer el sujeto a un medio para detectar dicho marcador detectable para identificar áreas que contienen células expresantes de CLD18.
Los métodos indicados anteriormente resultan útiles, en particular, para diagnosticar enfermedades relacionadas con CLD18 y/o para la localización de enfermedades relacionadas con CLD18 tales como enfermedades de cáncer. Preferentemente, una cantidad de CLD18, preferentemente CLD18-A2 en una muestra, que es superior a la cantidad de CLD18, preferentemente de CLD18-A2, en una muestra de control es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con CLD18 en un sujeto, en particular un ser humano, a partir del cual se deriva la muestra.
En todavía otra forma de realización, pueden utilizarse inmunoconjugados de la invención para dirigir compuestos (por ejemplo agentes terapéuticos, marcajes, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que presentan CLD18 expresado sobre su superficie, mediante la unión de dichos compuestos al anticuerpo.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.
Ejemplos
1. Generación de anticuerpos murinos contra CLD18
a. Inmunizaciones:
Se inmunizaron ratones Balb/c o C57/BL6 con vectores de expresión eucarióticos, codificantes de fragmentos de CLD18 humano (SEC ID nº 15, nº 16, nº 17 y nº 18). Se inyectaron 50 µg ó 25 µg de ADN plasmídico en el cuadríceps (intramuscular, i.m.) los días 1 y 10, para la generación de anticuerpos monoclonales de Juego1 o, alternativamente, los días 1 y 9, 1 y 11, ó 1, 16 y 36, para la generación de anticuerpos monoclonales de Juego2, en presencia de adyuvantes, por ejemplo CpG (para más detalles ver Tab. 1b). Se inyectó intramuscularmente CpG, así como células transfectadas con CLD18A2 (SEC ID nº 1) solas o cotransfectadas adicionalmente con ARN murino soluble codificante de CD40L; PEI-Man se inyectó intramuscular o intraperitonealmente. Se realizó un seguimiento de la presencia de anticuerpos dirigidos contra CLD18 humano en sueros de ratones mediante microscopia de inmunofluorescencia entre los días 16 y 43, dependiendo del protocolo específico de inmunización utilizado. Se determinó la inmunofluorescencia utilizando células HEK293 transfectadas transitoriamente con un ácido nucleico codificante de un constructo de fusión que comprende CLD18A2 humano (SEC ID nº 1 y nº 2) y una proteína informadora fluorescente. Los ratones con respuestas inmunológicas detectables (fig. 1) recibieron un refuerzo tres días antes de la esplenectomía para la generación de los anticuerpos monoclonales del Juego1, o los ratones recibieron un refuerzo tres días antes, tres y dos días antes, o recibieron un refuerzo cuatro, tres y dos días antes de la esplenectomía, para la generación de anticuerpos monoclonales del Juego2 mediante inyección intraperitoneal de 5x107 ó alternativamente 1x108 células HEK293 transfectadas transitoriamente con un ácido nucleico codificante de CLD18A2 humano (SEC ID nº 1, nº 2) (para más datos ver Tab. 1b). En la tabla 1a, los protocolos de inmunización utilizados se relacionan con los anticuerpos monoclonales respectivos.
Tab. 1a: protocolos de inmunización utilizados para la generación de anticuerpos monoclonales
mAb
Protocolo de inmunización* mAb Protocolo de inmunización
Juego1
24H5
40 42E12 45
26B5
40 43A11 45
26D12
40 44E10 45
28D10
40 47D12 45
37G11
45 61C2 45
37H8
45 75B8 6
38G5
45 85A3 6
38H3
45 9E8 40
39F11
45 19B9 40
41C6
45
Juego2
45C1
53 166E2 51
125E1
45 175D10 51
163E12
51
* Para protocolos de inmunización específicos ver la Tab. 1b.
Tab. 1b: protocolos de inmunización detallados
Protocolo de inmunización
Inmunización (sensibilización y refuerzos con ADN) Suero seguimiento Refuerzos con células transfectadas
Con vectores de ADN codificantes de fragmentos de CLD18
Con adyuvante El día El día Células transfectadas con CLD18A2 (SEC ID nº 1) solas Células cotransfectadas con CLD18A2 (SEC ID nº 1) y con ARN murino codificante de CD40L soluble Días antes de la esplenectomía
6
SEC ID nº 15: 50 µg 50 µg de CpG 1 y 10 18 5x107 células MC3T3 transfectadas Ninguna 3
40
SEC ID nº 17: 50 µg 50 µg de CpG 1 y 10 18 5x10 7 células HEK293; 100 µg de CPG a modo de adyuvante 3
45
SEC ID nº 15: 50 µg 50 µg de CpG 1 y 9 16 1x108 células HEK293 3
51
SEC ID nº 15: 25 µg 2,5 µl de PEI-Man* (150 mM) en H2O con glucosa al 5% 1, 16 y 36 22, 30 y 43 5x107 células HEK293 transfectadas Ninguna 3 y 2
53
Sensibilización: SEC ID nº 15: 25 µg, y SEC ID nº 17: 25 µg; Refuerzo: SEC ID nº 17: 50 µg 50 µg de CpG en H2O con glucosa al 5% 1 y 11 20 5x107 células HEK293 transfectadas Ninguna 4, 3 y 2
*jetPEITM-Man in vivo de PolyPlus Transfection
b. Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos de CLD18:
5 se aislaron esplenocitos de ratón y se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón utilizando protocolos estándares. A continuación, los hibridomas resultantes se cribaron para la producción de inmunoglobulinas con especificidad para CLD18 utilizando células HEK293 transfectadas con un ácido nucleico codificante de CLD18 humano mediante análisis FACS.
10 Se fusionaron suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicas procedentes de ratones inmunizados con células de mieloma de ratón no secretoras P3X63Ag8U.1 (ATCC nº CRL 1597) en una proporción 2:1 utilizando PEG al 50% (Roche Diagnostics, nº CRL 738641). Se sembraron las células en placas a razón de aproximadamente 3x104/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de la incubación durante aproximadamente dos
15 semanas en medio selectivo que contenía suero de feto bovino al 10%, fusión de hibridoma al 2% y suplemento de clonación (HFCS, Roche Diagnostics, nº CRL 1 363 735) más HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 µg/ml de gentamicina y 1xHAT (Sigma, nº CRL H0262). Tras 10 a 14 días, los pocillos individuales se cribaron mediante citometría de flujo para anticuerpos monoclonales anti-CLD18. Los hibridomas secretores de anticuerpos se sembraron en placa nuevamente, se cribaron nuevamente y, en el caso de que todavía fuesen positivos para
20 anticuerpos monoclonales anti-CLD18, se subclonaron mediante dilución limitante. A continuación, los subclones se cultivaron in vitro para generar cantidades reducidas de anticuerpo en medio de cultivo de tejidos para la caracterización. Se seleccionó por lo menos un clon de cada hibridoma, que conservó la reactividad de las células parentales (según FACS). Se generaron 9 bancos de células viables para cada clon y se almacenaron en nitrógeno líquido.
c. Selección de anticuerpos monoclonales de unión a CLD18:
para determinar el isotipo de los anticuerpos, se llevó a cabo un ELISA de los isotipos. Se utilizó el kit monoAB ID de ratón (Zymed, nº CRL 90-6550) o alternativamente el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón
30 IsoStrip (Roche, nº de cat. 1493027) para determinar las subclases de Ig de los anticuerpos monoclonales identificados como reactivos con CLD18. Definido como Juego1, se generaron diecinueve líneas celulares de
hibridoma, seis de una fusión de células procedente de un ratón C57/BL6 inmunizado con CLD18A2-BucleD3 (SEC ID nº 17, nº 18), trece de una fusión de células de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-Bucle1 (SEC ID nº 15, nº 16), que expresaban los anticuerpos siguientes:
24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2,
75B8, 85A3, 9E8, 19B9
24H5: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2b, K, 182-D758-034
26B5: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D758-035, DSM ACC2745
26D12: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D758-036, DSM ACC2746
28D10: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D758-040, DSM ACC2747
37G11: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D1106-055, DSM ACC2737
37H8: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-056, DSM ACC2738
38G5: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-057, DSM ACC2739
38H3: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-058, DSM ACC2740
39F11: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-059, DSM ACC2741
41C6: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D1106-060
42E12: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D1106-061, DSM ACC2748
43A11: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D1106-062, DSM ACC2742
44E10: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-063
47D12:anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-064
61C2: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2b, K, 182-D1106-067, DSM ACC2743
75B8: anticuerpo monoclonal de ratón IgM, K, 182-D756-001
85A3: anticuerpo monoclonal de ratón IgM, K, 182-D756-002
9E8: anticuerpo monoclonal de ratón IgM, K, 182-D758-011
19B9: anticuerpo monoclonal de ratón IgM, K, 182-D758-024 Definido como Juego2, se generaron cinco líneas celulares de hibridoma, una de una fusión de células procedentes de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-BucleD3 (SEC ID nº 17, nº 18) y CLD18A2-BucleD1 (SEC ID nº 15, nº 16), cuatro de una fusión de células procedentes de un ratón Balb/c inmunizado con CLD18A2-BucleD1 (SEC ID nº 15, nº 16), que expresaban los anticuerpos siguientes:
45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10
45C1: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D758-187
125E1: anticuerpo monoclonal de ratón IgG2a, K, 182-D1106-279, DSM ACC2808
163E12: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-294, DSM ACC2809
166E2: anticuerpo monoclonal de ratón IgG3, K, 182-D1106-308
175D10: anticuerpo monoclonal de ratón IgG1, K, 182-D1106-362, DSM ACC2810
2. Producción de anticuerpos monoclonales
Producción y purificación de anticuerpos monoclonales reactivos con CLD18:
con el fin de producir cantidades mg de anticuerpo para la caracterización funcional, se sembraron células de hibridoma en biorreactores basados en diálisis (CELLine CL1000, Integra, Chur, CH) a razón de 2x106 células/ml. El sobrenadante que contenía anticuerpos se recolectó una vez a la semana. Se purificó el anticuerpo monoclonal de ratón utilizando Melon Gel (Pierce, Rockford, USA) y se concentró mediante precipitación con
sulfato amónico o alternativamente se purificó con proteína A utilizando FPLC. Se determinaron la concentración y la pureza de los anticuerpos mediante ensayo BCA y se comprobó la pureza mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico y tinción de Coomassie.
3. Características de unión de los anticuerpos monoclonales
a. Control de calidad de los transfectantes en WB, IF:
con el fin de generar células expresantes de CLD18A2, se transfectaron células HEK293 ó CHO con ácidos nucleicos codificantes de CLD18A2 (SEC ID nº 1, nº 2) o de CLD18A2-myc (SEC ID nº 3, nº 4).
Se transfectaron células HEK293 con CLDN18A2-myc (SEC ID nº 3, nº 4) o se dejaron sin transfectar. Veinticuatro horas después de la transfección se recolectaron las células, se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico. Se realizaron las transferencias del gel y se tiñeron con un anticuerpo anti-myc de ratón. Tras la incubación con un anticuerpo antirratón marcado con peroxidasa, se reveló la transferencia con reactivo ECL y se visualizó utilizando un generador de imágenes LAS-3000 (Fuji). Sólo en las células transfectadas, pero no en el control negativo, se observó una banda con el peso molecular esperado para CLD18-myc (fig. 2).
Se transfectaron células CHO con CLD18A2 (SEC ID nº 1, nº 2) y se cultivaron en portaobjetos con cámara durante 24 horas. Las células se fijaron con metanol y se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo contra CLD18 a razón de 1 µg/ml durante 60 minutos a 25ºC. Tras el lavado, las células se tiñeron con una IgG de cabra anticonejo marcada con Alexa488 (Molecular Probes) y se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. La fig. 3 muestra las células CHO transfectadas, que expresan CLD18 sobre la membrana celular, así como las células no transfectadas. Estas células expresantes de CLD18 heterólogamente se utilizaron para los ensayos siguientes con el fin de someter a ensayo la especificidad de la unión de los anticuerpos.
b. Selección de anticuerpos monoclonales de unión a CLD18/Cribados primarios mediante citometría de flujo:
se cotransfectaron células HEK293 con vectores de expresión codificantes de CLD18A2 humano (SEC ID nº 1, nº 2) y una proteína informadora fluorescente 40 horas antes del ensayo, o alternativamente se utilizaron células HEK293 que expresaban establemente CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) y se contratiñeron con yoduro de propidio (YP). Tras el desprendimiento celular con EDTA/PBS 2 mM, las células se lavaron con medio de crecimiento completo y se sembraron a razón de aproximadamente 1 a 5x105 células/pocillo en placas de microtitulación de fondo en U. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con sobrenadante de hibridoma, seguido de dos etapas de lavado con FBS al 1% inactivado por calor/PBS y finalmente incubación con anticuerpo secundario específico de IgG antiratón conjugado con APC o Alexa647. Tras dos etapas de lavado, las células cotransfectadas se fijaron con CellFIX (BD Biosciences). Se evaluó la unión mediante citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. Se muestra la expresión de marcadores de fluorescencia en el eje horizontal frente a la unión de anticuerpo en el eje vertical. Se detectó que todos los anticuerpos de ratón 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 se unían específicamente a la superficie de células expresantes de marcador de fluorescencia (fig. 4, células en Q2), tal como se ejemplificada para sobrenadantes de hibridoma que contienen los anticuerpos monoclonales 24H5 (fig. 4A, células en Q2), 85A3 (fig. 4B), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 y 45C1 (fig. 4C, células en Q1).
c. Comparación entre la unión de anticuerpos a CLD18A2 etiquetado con Myc o con HA:
se especificaron adicionalmente las características de unión de los anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 identificados. Por lo tanto, se analizó la unión de anticuerpos monoclonales a mutantes de CLD18A2, creados mediante inserción de etiquetas epítopo. CLD18A2-H1 (SEC ID nº 6) contiene una etiqueta epítopo-HA en CLD18A2-bucle1, mientras que CLD18A2-Myc (SEC ID nº 4) contiene una etiqueta epítopo Myc insertada en CLD18A2-bucle2. Debido a que la inserción de estas etiquetas provoca la destrucción de los epítopos, los anticuerpos monoclonales identificados pueden agruparse según la pérdida de unión a cualquiera de los mutantes. Se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales específicos de CLD18, células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con un marcador de fluorescencia y CLD18A2 humano o con un marcador de fluorescencia y CLD18A2-HA, o con un marcador de fluorescencia y CLD18A2-Myc, seguido de la incubación con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Alexa647. Antes del análisis en un BD FACSArray, las células se fijaron utilizando CellFIX. Tal como se ejemplificada para 24H5, 9E8, 26B5 y 19B9 en la fig. 5, pudieron separarse los anticuerpos monoclonales basándose en sus características de unión en cuatro grupos diferentes: (i) anticuerpos que se unen a CLD18A2 no modificado, así como a CLD18A2-HA y CLD18A2-Myc, por ejemplo 24H5 (fig. 5A), o (ii) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-HA, por ejemplo 9E8 (fig. 5B), o (iii) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-Myc, por ejemplo 26B5 (fig. 5C), o (iv) anticuerpos que no se unen a CLD18A2-HA ni a CLD18A2-Myc, por ejemplo 19B9 (fig. 5D).
d. Comparación mediante citometría de flujo de la unión de anticuerpos a transfectantes humanos de CLD18A1 y de CDL18A2:
se analizó mediante citometría de flujo la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales identificados a isoformas de CLD18A2. Se incubaron durante 30 minutos a 4 con sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales, células HEK293 que expresaban establemente CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) y células HEK293 que expresaban establemente CLD18A1 humano (SEC ID nº 7, nº 8) (HEK293-CLD18A1), seguido de la incubación con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Alexa647 y la fijación de células, o alternativamente sin fijación pero con contratinción de YP. Se evaluó la unión mediante citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La fig. 6 muestra ejemplos de dos grupos de anticuerpos monoclonales que se identificaron en el panel que comprende 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10: (i) los anticuerpos monoclonales 43A11, 45C1 y 163E12 se unen específicamente a CLD18A2 humano pero no a CLD18A1 humano (fig. 6A,B) e (ii) el anticuerpo monoclonal 37H8 se une a ambas isoformas humanas (fig. 6A).
e. Comparación entre la unión de anticuerpos a los transfectantes humanos CLD18A1 y CLD18A2 mediante microscopía de inmunofluorescencia:
se transfectaron transitoriamente células HEK293 con un vector de expresión codificante de una proteína de fusión de CLD18A1 (SEC ID nº 8) o de CLD18A2 (SEC ID nº 2) con un informador fluorescente y se cultivaron en portaobjetos con cámara. Las células se tiñeron sin fijar o tras la fijación con paraformaldehído con sobrenadante de cultivo de tejidos que contenía anticuerpo monoclonal durante 30 minutos a 37ºC. Tras el lavado, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-Ig de ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes). Se evaluó la unión de los anticuerpos mediante microscopía de fluorescencia. Tal como se muestra en la fig. 7, el anticuerpo 37G11 reaccionó específicamente con CLD18A2 (fig. 7A) pero no con CLD18A1 (fig. 7B). En contraste, el anticuerpo 26B5 era reactivo con ambos, CLD18A2 y CLD18A1 (fig. 8).
Para los anticuerpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8 y 19B9 se observó una clara diferencia entre la tinción de células vivas y células fijadas con paraformaldehído. Los anticuerpos formaron una tinción uniforme de las membranas al fijar las células (fig. 7C, 8C, 8D). En contraste, la incubación de células vivas con estos anticuerpos condujo a la generación de agrupamientos de proteínas, visibles en forma de patrón de tinción de tipo moteado (fig. 7A, 8A, 8B). Lo anterior demuestra que todos los anticuerpos se unen a los epítopos nativos en la forma en que se encuentran sobre la superficie de las células vivas.
f. Determinación de las líneas celulares de expresión endógena:
Se utilizó una pareja de cebadores específica para el gen CLD18A2 (SEC ID nº 11, nº 12) en análisis de RT-PCR para cribar las líneas celulares para la expresión de CLD18A2. Se encontró que las líneas celulares de carcinoma gástrico humano NCI-SNU-16 (ATCC nº CRL-5974) NUGC-4 (JCRB0834) y KATO-III (ATCC nº HTB-103) y la línea celular de adenocarcinoma pancreático humano DAN-G (DSMZ ACC249) mostraban una expresión endógena robusta de CLD18 (fig. 9). SE confirmó la expresión a nivel de las proteínas mediante tinción con un suero policlonal de conejo contra CLD18.
g. Tinción de líneas celulares de expresión endógena con anticuerpos específicos de CLD18 y análisis de inmunofluorescencia:
Se cultivaron células DAN-G, SNU-16, NUGC-4 y KATO-III en portaobjetos con cámara bajo condiciones estándares. Las células se encontraban no fijadas o alternativamente fijadas con metanol y teñidas con los anticuerpos respectivos. Para los anticuerpos 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, se observó tinción de la superficie celular, tal como se ejemplifica en las figs. 10, 11 y 12A. Para los anticuerpos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, se sometió a ensayo el reconocimiento de epítopos nativos y se observó tinción de la superficie celular sobre células no fijadas, tal como se muestra en la fig. 12B. Algunos subgrupos de anticuerpos mostraron tinción homogénea de la membrana celular, principalmente en las interfaces célula-célula o en partes libres de la membrana no contiguas a otras células. Otros anticuerpos tiñeron focos discretos y agregados sobre la membrana celular, demostrando que los anticuerpos respectivos se unen a diferentes epítopos, incluyendo epítopos que se encuentran enmascarados mediante asociación homotípica o heterotípica de CLD18, así como epítopos CLD18 accesibles en uniones estrechas preformadas.
h. Tinción de líneas celulares de expresión endógena mediante citometría de flujo:
se analizó mediante citometría de flujo la expresión de CLD18A2 expresado constitutivamente sobre células KATO-III y NUGC-4 vivas. Lo anterior queda ejemplificado por células KATO-III y NUGC-4 teñidas con el anticuerpo 61C2 ó 163E12, seguido de la incubación con anticuerpo segundario anti-IgG de ratón conjugado con Alexa647 y la fijación de células o alternativamente sin fijación. Se evaluó la unión mediante citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La fig. 13 muestra una unión fuerte de 61C2 a por lo menos 70,3% de las células KATO-III y de 163E12 a CLD18A2 sobre células KATO-III y NUGC-4.
i. Alineación de secuencias de CLD18A1 y CLD18A2 de ratón y humanas
CLD18A2 humano (NP_001002026) y CLD18A1 humano (NP_057453) en una comparación entre secuencias 5 difieren en el extremo N-terminal y las variantes de CLD18 de ratón (NP_062789 y AAL15636) demuestran elevada homología y sitios de variación de secuencia entre las moléculas (ver la fig. 14).
j. Reactividad de anticuerpos con CLD18A1 murino y CLD18A2 murino analizada mediante citometría de flujo:
10 la unión de los anticuerpos monoclonales identificados contra CLD18A2 y CLD18A1 murinos se analizó mediante citometría de flujo. Las células HEK293 cotransfectadas transitoriamente con un marcador de fluorescencia y CLD18A2 murino (SEC ID nº 33, nº 35) o con un marcador de fluorescencia y CLD18A1 murino (SEC ID nº 36, nº 37) se incubaron con sobrenadantes de hibridoma que contenían los anticuerpos monoclonales específicos de CLD18 humano 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 y 163E12, respectivamente, durante 30 minutos a 4ºC, seguido de la
15 incubación con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con Alexa647 y la fijación de las células. Se evaluó la unión mediante citometría de flujo utilizando un BD FACSArray. La fig. 15 muestra tres perfiles de unión diferentes: 38G5 y 45C1 no se unen a ninguna de las isoformas de CLD18 murino; 37G11 y 163E12 se unen a CLD18A2 murino pero no a CLD18A1 murino, y 38H3 se une a CLD18A1 y CLD18A2 murinos. Estos anticuerpos son herramientas valiosas para determinar una toxicidad potencial de los anticuerpos monoclonales de CLD18 en
20 estudios preclínicos.
En conjunto estos datos demuestran que los anticuerpos monoclonales de la invención 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 generados contra CLD18 representan una diversidad de características de unión
25 con diferentes epítopos y topologías de CLD18 humano.
Puede utilizarse una combinación de diferentes propiedades descritas en los Ejemplos 3b, c, d, e, g, h y j para clasificar los anticuerpos monoclonales en dichas clases diferentes.
30 4. Inmunohistoquímica (IHC)
Se utilizó un anticuerpo específico de epítopo CLD18A2 generado mediante inmunización con el péptido de SEC ID nº 21, para la caracterización inmunohistoquímica de la expresión de CLD18A2. Se utilizaron secciones de tejido incluidas en parafina derivadas de un panel completo de tejidos normales y tumorales, para análisis de expresión y
35 localización de proteínas. No se detectó expresión significativa en ningún otro tejido de órgano normal excepto del estómago (ver la Tab. 2, fig. 16A). En contraste, se verificó la expresión de CLD18A2 mediante inmunohistoquímica en diferentes cánceres, incluyendo el cáncer de estómago y el cáncer de pulmón (fig. 16B).
Resulta interesante que la expresión de proteína CLD18A2 en la mucosa gástrica se encontraba restringida a
40 células diferenciadas terminalmente del epitelio gástrico en las regiones de base y de fosa. En contraste, las células en la región del cuello de la mucosa gástrica, en particular las células madre gástricas en la parte del istmo, que reabastecen la mucosa entera, no expresan CLD18A2 (fig. 16C).
Tab. 2: expresión de CLD18A2 en tejidos normales y tumorales según el análisis IHC
Tipo de tejido Resultado
Adrenal -Vejiga -Células sanguíneas -Médula ósea -Mama -Colon -Endotelio -Esófago -Conducto de Falopio -Corazón -Riñón (glomérulo, túbulo) -Hígado -Pulmón -Nódulo linfático -Ovario -Páncreas -Paratiroides -Pituitaria -Placenta -Próstata -
Piel -Bazo -Estómago + Músculo estriado -Testículo -Timo -Tiroides -Uréter -Útero (cérvix, endometrio) -
Se utilizó el anticuerpo monoclonal 39F11 para estudios inmunohistoquímicos específicos de CLD18A2. Tal como se muestra en la fig. 17A, no era detectable reactividad significativa en todos los tejidos normales sometidos a ensayo excepto el estómago (fig. 17A), mientras que los carcinomas de estómago y los carcinomas pulmonares siguieron siendo fuertemente positivos (fig. 17B).
Otro grupo de anticuerpos de la invención mostraba un patrón de tinción de cáncer específico con la unión a cáncer de estómago pero sin reactividad con el tejido de estómago normal. Se muestra dicho patrón de tinción en la fig. 18A con el anticuerpo monoclonal 26B5.
Se utilizó la inmunohistoquímica para el análisis de especificidad de 175D10 (fig. 18B), 43A11 (fig. 18C), 163E12 (fig. 18D) y 45C1 (fig. 18E) de secciones derivadas de líneas celulares tumorales HEK293: se xenoinjertaron líneas celulares tumorales HEK293 que expresaban establemente CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) o CLD18A1 (HEK293-CLD18A1) o transfectadas con un plásmido de control de la expresión que contenía únicamente el gen de resistencia a antibióticos para la selección (HEK293-simulado), en ratones para formar tumores sólidos. No era detectable expresión en los tumores xenoinjertados de HEK293 transfectados simuladamente. En contraste, se observó una tinción membranal fuerte y homogénea en los tumores xenoinjertados HEK293-CLD18A2 y en especímenes de carcinoma de estómago.
5. Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
a. CDC de anticuerpos monoclonales de Juego1 medida mediante citometría de flujo:
Se preparó plasma para la lisis del complemento mediante extracción de sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer S-Monovette-EDTA (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania), que seguidamente se centrifugaron a 600g durante 20 minutos. Se recolectó el plasma y se almacenaron a -20ºC.
En un primer conjunto de experimentos, se analizaron sobrenadantes de hibridoma para su capacidad de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células HEK293 que expresasen establemente CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2). Las células se incubaron con sobrenadantes de hibridoma que contenían los anticuerpos monoclonales 85A3, 28D10, 24H5 ó 26D12, respectivamente, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación (5 minuto a 450g), se separó el sobrenadante y se añadió plasma humano al 20% en DMEM (precalentado a 37ºC) al as células y se incubó durante 20 minutos adicionales a 37ºC. A continuación, se determinó la lisis celular en FACS mediante la utilización del método de tinción con yoduro de propidio (YP). Se añadió YP hasta una concentración final de 2,5 µg/ml. Para la citometría de flujo, se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Se recogieron por lo menos 10.000 sucesos para el análisis, excluyendo los residuos celulares mediante ajuste del umbral de dispersión frontal-lateral (FCS). El porcentaje de células lisadas (células YP-positivas) se muestra en la figura 19. Los anticuerpos monoclonales 85A3, 28D10 y 26D12 indujeron lisis de 33,5%, 38,2% y 39,2%, respectivamente, de las células HEK293-CLD18A2, mientras que la CDC mediada por 24H5 fue de sólo 19,3%.
b. CDC de anticuerpos monoclonales del Juego1:
En un segundo conjunto de experimentos, se analizó la especificidad de los anticuerpos monoclonales en la inducción de CDC sobre células expresantes de CLD18A2. Por lo tanto, se sometió a ensayo un conjunto de anticuerpos de unión específicamente a CLD18A2 humano o que también se unían a CLD18A1 humano, para comprobar la inducción de CDC contra las células CHO establemente transfectadas con CLD18A2 humano (CHO-CLD18A2) o CLD18A2 humano (CHO-CLD18A1). Se sembraron células CHO-CLD18A2 y CHO-CLD18A1 24 horas antes del ensayo con una densidad de 3x104 células/pocillo en placas de microtitulación para cultivo de tejidos de fondo plano. Al día siguiente, se eliminó el medio de crecimiento y las células se incubaron por triplicado con sobrenadantes de hibridoma ajustados a una concentración de 10 µg/ml que contenían los anticuerpos monoclonales 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 y 61C2, respectivamente. Se incubaron células de control con medio de crecimiento o medio de crecimiento que contenía saponina al 0,2% para determinar el nivel de lisis de fondo y máximo, respectivamente. Tras incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y se añadió plasma humano al 20% en DMEM (precalentado a 37ºC) a las células y se incubó durante 20 minutos adicionales a 37ºC. A continuación, se sustituyeron los sobrenadantes por PBS que contenía 2,5 µg/ml de bromuro de etidio y se midió la emisión de
fluorescencia tras la excitación a 520 nm utilizando un sistema Tecan Safire. Se calculó el porcentaje de lisis específica de la manera siguiente: % de lisis específica = (fluorescencia de la muestra - fluorescencia de fondo) / (fluorescencia lisis máxima - fluorescencia de fondo) x 100. La fig. 20 muestra que los anticuerpos monoclonales 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 y 39F11 median en una CDC baja; el anticuerpo monoclonal 38G5 media en un nivel intermedio de CDC; los anticuerpos monoclonales 41C6 y 61C2 median en un nivel bajo de CDC y los anticuerpos monoclonales 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 y 47D12 median en una CDC nula contra las células CHO-CLD18A2. En contraste, ninguno de los anticuerpos fue capaz de inducir CDC contra las células CHO-CLDA1, aunque 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 y 61C2 también se unían a CLD18A1 según se determinó mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia.
c. Titulación de anticuerpos monoclonales y CDC utilizando anticuerpos monoclonales del Juego1:
con el fin de medir la capacidad de los anticuerpos anti-CLD18 de inducir CDC a bajas concentraciones, se llevó a cabo un experimento en el que se titularon tres anticuerpos diferentes. SE incubaron células CHO-CLD18A2 en placas de microtitulación con un intervalo de concentraciones de 75B8 (100, 30, 10, 3 y 1 µg/ml), 37H8 (10, 3,3 y 1 µg/ml) y 28D10 (10, 1 y 0,1 µg/ml), respectivamente, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se añadió plasma humano al 20% en DMEM (precalentado a 37ºC) a las células y se incubaron durante 20 minutos adicionales a 37ºC. Antes del análisis utilizando un Tecan Safire, los sobrenadantes se sustituyeron por PBS que contenía 2,5 µg/ml de bromuro de etidio. Las figuras 21A-C muestran el porcentaje de lisis específica como función de la concentración de anticuerpo. El anticuerpo monoclonal 75B8 induce la lisis de 31,0% de las células CHO-CLD18A2 a una concentración de 10 µg/ml y cae a 6,2% a 1 µg/ml (fig. 21A), mientras que los anticuerpos monoclonales 28D10 y 37H8 todavía inducen 39% y 26,5% de lisis específica a 1 µg/ml (fig. 21B, C), respectivamente.
d. CDC de anticuerpos monoclonales del Juego2 medida mediante citometría de flujo:
se preparó suero para la lisis mediada por el complemento mediante la extracción de sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer Serum-Monovette (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania) que seguidamente se centrifugaron a 600g durante 20 minutos. Se recolectó el suero y se almacenó a -20ºC. El suero de control se inactivó por calor a 56ºC durante 30 minutos antes del almacenamiento.
Se analizaron los sobrenadantes de hibridoma para su capacidad de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células KATO-III que expresan endógenamente CLD18A2 humano. Se incubaron células con sobrenadantes de hibridoma crudo o purificado que contenían los anticuerpos monoclonales 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, respectivamente, durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió suero humano al 20% en RPMI a las células y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 37ºC. A continuación, se determinó la lisis celular mediante FACS utilizando el método de tinción con yoduro de propidio (YP). Se añadió YP hasta una concentración final de 2,5 µg/ml. Para la citometría de flujo, se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Se recogieron por lo menos 10.000 sucesos para el análisis, excluyendo los residuos celulares mediante ajuste del umbral de dispersión frontal-lateral (FSC/SSC). Se calculó la lisis específica mediante la fórmula siguiente: lisis específica = (% de células YP-positivas - % de células YP-positivas en la muestra con suero inactivado por calor). Se observó lisis robusta mediada por CDC, en particular con 163E12.
6. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
Se analizaron sobrenadantes de hibridoma para su capacidad de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra células HEK293 que expresaban establemente CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) o CLD18A1 humano (HEK293-CLD18A1).
a.
Enriquecimiento en células mononucleares de sangre periférica humanas: se diluyó sangre humana procedente de donantes sanos dos veces en tampón fosfato (PBS) y se dispusieron en capas sobre Ficoll (medio de separación de linfocitos 1.077 g/ml, PAA Laboratories, nº de cat. J15-004). Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (MNC) de la interfase, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de feto bovino al 10% inactivado por calor, L-glutamina 2 mM.
b.
Experimento de ADCC: se marcaron células diana con un ligando intensificador de fluorescencia (BADTA, kit de ensayo de citotoxicidad de Perkin-Elmer DELFIA EuTDA reactivos de citotoxicidad, nº de cat. AD0116) durante 30 minutos. Tras el lavado extensivo en RPMI-10 suplementado con probenecid 10 mM (Sigma, nº de cat. P8761), HEPES 10-20 mM y suero de feto bovino al 10% inactivado por calor, las células se ajustaron a 1x105 células/ml. Las células diana marcadas, células efectoras (MNC) y sobrenadantes que contenían anticuerpos monoclonales ajustados a una concentración de 10 µg/ml se añadieron a placas de microtitulación de fondo redondo. Para las células efectoras aisladas, se utilizó una proporción de células efectoras a células diana (E:D) de 100:1 (datos no mostrados para 50:1 y 25:1). Tras la incubación (2 horas, 37ºC), se detuvieron los ensayos mediante centrifugación y se midió la liberación de ligando de fluorescencia de muestras por duplicado, como pulsos de europio, en un fluorímetro con resolución temporal. Se calculó el porcentaje de citotoxicidad celular utilizando la fórmula siguiente: % de lisis específica ) (pulsos de liberación experimental -pulsos de liberación espontánea) / (pulsos de liberación
máxima - pulsos de liberación espontánea) x 100, determinando la liberación máxima de ligando de fluorescencia mediante la adición de Triton X-100 (concentración final de 0,25%) a las células diana, y midiendo la liberación espontánea en ausencia de anticuerpos y células efectoras. La figura 22 muestra que los anticuerpos monoclonales 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 y 61C2 median en la ADCC contra las células HEK293-CLD18A2. En contraste, estos anticuerpos no indujeron citotoxicidad significativa o un nivel bajo de citotoxicidad sobre las dianas CLD18A1, demostrando una ADCC específica para CLD18A2 (figura 23).
7. Inhibición de la proliferación
Se analizaron anticuerpos monoclonales murinos purificados para su capacidad de inhibir el crecimiento celular de células KATO-III que expresaban endógenamente CLD18A2 humano.
Se cultivaron 1x104 células diana que expresaban endógenamente CLD18A2 (KATO-III) en presencia de aproximadamente 10 µg de anticuerpos monoclonales.
El kit de proliferación celular DELFIA (Perkin-Elmer, nº de cat. AD0200) es un inmunoensayo no isotópico basado en la medición de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante la síntesis de ADN de las células proliferantes en microplacas. La BrdU incorporada se detecta utilizando anticuerpo monoclonal marcado con europio. Para permitir la detección de anticuerpos, las células se fijan y el ADN se desnaturaliza utilizando solución de fijación. El anticuerpo no unido se elimina mediante lavado y el inductor DELFIA se añade para disociar los iones de europio del anticuerpo marcado hacia la solución, en donde forman quelatos altamente fluorescentes con componentes del inductor DELFIA. La fluorescencia medida (mediante fluorimetría con resolución temporal en la detección) es proporcional a la síntesis de ADN en la célula de cada pocillo.
Se observó una fuerte inhibición de la proliferación con los anticuerpos 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 y 166E2, respectivamente. Se observó una inhibición moderada de la proliferación con los anticuerpos murinos 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 y 38H3, respectivamente.
8. Rendimiento en modelos terapéuticos de xenoinjerto de ratón
Se estudió el potencial terapéutico de los anticuerpos monoclonales identificados de unión específica a CLD18A2 en modelos de xenoinjerto terapéuticos.
a. Tratamiento precoz de tumores de alta expresión de CLD18A2 en ratones
Se inocularon 1x107 células HEK293 que expresaban establemente niveles elevados de CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) por vía subcutánea en ratones SCID. Los niveles de expresión de CLD18A2 humano en células HEK293-CLD18A2 eran comparables, con niveles de expresión en cánceres gástricos primarios de pacientes. Cada grupo de tratamiento experimental comprendía 10 ratones (número de ratones en cada grupo, n=10). La terapia de los ratones se inició 3 días después de la inoculación de tumor. Se inyectaron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificados que representaban los anticuerpos monoclonales 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3 ó 61C2, una vez a la semana durante 4 semanas por vía intravenosa. Alternativamente, se administraron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificados que contenían los anticuerpos monoclonales murinos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ó 175D10 dos veces a la semana durante 6 semanas alternando las inyecciones intravenosa e intraperitoneal. Se realizó un seguimiento del crecimiento tumoral de los ratones tratados dos veces a la semana (volumen tumoral = longitud x anchura x anchura dividida por 2, en mm3). Los ratones fueron sacrificados en el caso de que el tumor alcanzase un volumen de 500 mm3 o en caso de morbilidad severa. La fig. 24 ejemplifica una inhibición robusta del crecimiento de las células tumorales HEK293-CLD18A2 por los anticuerpos de la invención. Las figs. 25A y 25B muestran la prolongación de la supervivencia mediante tratamiento con anticuerpos de la invención en un modelo de xenoinjerto de tratamiento precoz utilizando células HEK293-CLD18A2.
b. Tratamiento de inicio tardío de tumores avanzados de alta expresión de CLD18A2 en ratones
Se diseñó el mismo modelo de xenoinjerto tumoral basándose en células HEK293-CLD18A2 en forma de un protocolo de inicio tardío de la terapia, en contraste con el tratamiento precoz descrito anteriormente. El día 27 después de la inoculación de las células tumorales, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de ensayo, comprendiendo cada grupo 5-6 ratones e iniciando la terapia con 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificados que contenían los anticuerpos monoclonales murinos 43A11, 163E12 y 175D10, respectivamente. Se administraron anticuerpos dos veces a la semana durante 6 semanas, alternando las inyecciones intravenosa e intraperitoneal. Además, en este modelo se demostró que los anticuerpos de la invención inhibían el crecimiento tumoral. Para varios anticuerpos lo anterior resultó en la prolongación de la supervivencia (fig. 26).
c. Tratamiento precoz de tumores que expresan niveles bajos de CLD18A2
Se inocularon en ratones SCID por vía subcutánea 2x105 células de la línea celular tumoral DAN-G, una línea celular de adenocarcinoma pancreático humano infiltrante que expresa constitutivamente proteína CLD18A2 a nivel bajo.
Se inició el tratamiento de los ratones (10 en cada grupo) 3 días después de la injertación de los tumores: se administraron 200 µg de sobrenadantes de hibridoma purificados que contenían los anticuerpos monoclonales murinos 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 ó 175D10 dos veces a la semana durante 6 semanas, alternando las inyecciones intravenosa e intraperitoneal. Debido al rápido y agresivo crecimiento tumoral de la línea celular tumoral DAN-G pancreático, los ratones desarrollaron caquexia tumoral y murieron en unos pocos días. Sin embargo, en consecuencia, la ventana para medir los efectos terapéuticos era estrecha, también se observó en este modelo inhibición del crecimiento tumoral y supervivencia prolongada mediada por los anticuerpos de la invención (figs. 27A y 27B).
d. Los anticuerpos de la invención no inducen efectos secundarios en ratones
Se utilizó una pareja de cebadores específica para CLD18A2 murino (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC) en análisis de RT-PCR en la amplificación de ADNc derivado de un panel completo de tejidos de ratón normales (ver la fig. 28).
La expresión de CLD18A2 murino no era detectable en ninguno de los tejidos normales sometidos a ensayo, excepto en los de estómago (ver la fig. 28). Además, un anticuerpo específico para CLD18A2, el cual reacciona cruzadamente con CLD18A2 humano y de ratón, se utilizó para el análisis inmunohistoquímico de la expresión de CLD18A2 en un panel de gran tamaño de tejidos normales de ratón (ver la Tab. 3). Excepto para el tejido gástrico normal, todos los tejidos normales sometidos a ensayo no mostraron expresión de CLD18A2. Al igual que se había observado para CLD18A2 humano, los presentes inventores también observaron para la contrapartida de ratón que, aunque las células epiteliales superficiales y las células de cripta más profundas expresaban CLD18A2 en la superficie celular, la región central de cuello era negativa para CLD18A2 (ver la fig. 29 A-C). En resumen, la distribución en los tejidos de CLD18A2 aparentemente era idéntica en el ser humano y en el ratón.
Tab. 3: expresión de CLD18 en tejidos normales murinos analizados mediante inmunohistoquímica
tejido Expresión de CLD18 Cerebelo -Cerebro -Colon -Esófago -Corazón -Riñón -Hígado -Pulmón -Nódulo linfático -Ovario -Páncreas -Músculo esquelético -Bazo -Estómago + Timo -Vejiga -
Se investigaron adicionalmente los efectos secundarios mediados por los anticuerpos 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10 en ratones. Todos dichos anticuerpos habían demostrado previamente en análisis FACS la reacción con CLD18A2 murino, así como con la proteína humana.
Tampoco se observó ningún efecto secundario visible en los ratones durante y después del tratamiento con dichos anticuerpos, ni se observaron correlatos histomorfológicos de toxicidad en la mucosa gástrica de los ratones tratados con anticuerpos en comparación con los ratones no tratados (tratados con PBS) (ver la figura 30).
9. Quimerización de anticuerpos
a. Generación de anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón/humanos
Se preparó ARN total y seguidamente ADNc de cadena sencilla a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) y de tejido de bazo humano mediante métodos estándares conocidos por ele experto en la materia, por ejemplo mediante la utilización del kit RNeasy Midi (Qiagen) y la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen).
La región constante de la cadena ligera kappa humana se amplificó a partir de ADNc de PBMC mediante PCR. El oligómero de sentido (SEC ID nº 38) añadió un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' de la región constante y modificó la secuencia de ácidos nucleicos original 5'-CGAACT-3' codificante para los primeros dos aminoácidos
(Arg-Thr) de la región constante en 5'-CGTACG-3', generando un sitio de restricción BsiWI sin modificar la secuencia de aminoácidos. El oligómero antisentido (SEC ID nº 39) incluía un codón de parada y añadió un sitio de restricción NotI en el extremo 3' de la región constante amplificada. El producto de PCR, así como un vector de expresión estándar (por ejemplo pcDNA3.1(+), Invitrogen) se incubaron secuencialmente con los enzimas de restricción BamHI y NotI. El vector se trató adicionalmente con fosfatasa alcalina intestinal bovina para evitar la recirculación. La región constante finalmente se ligó en el vector, de manera que cualquier fusión futura de una región variable enfrente de la región constante ahora resulta posible mediante un sitio de restricción HindIII (5'-AAGCTT-3') procedente del sitio de clonación múltiple del vector residual y mediante el sitio de restricción BsiWI (5-CGTACG-3') generado con el producto de PCR. La secuencia de la región constante de cadena ligera kappa humana insertada en el vector se presenta como SEC ID nº 40, la secuencia de aminoácidos de la región constante kappa humana se presenta como SEC ID nº 41.
La región constante de la cadena pesada y-1 humana se amplificó a partir de ADNc de bazo mediante PCR. Se introdujo el oligómero de sentido 5'-fosforilado (SEC ID nº 42) en el sitio de restricción ApaI natural, situado 11 nucleótidos cadena abajo del inicio de la región constante, y se añadió un sitio de restricción HindIII en el extremo 5' de la parte amplificada de la región constante. El oligómero antisentido 5'-fosforilado (SEC ID nº 43) incluía un codón de parada y añadió un sitio de restricción NotI en el extremo 3' de la región constante amplificada de esta manera. El producto de PCR generado de esta manera presentaba extremos romos y se encontraba 5'-fosforilado. La región constante y amplificada se verificó que era de la subclase IgG1 mediante PCR con un oligómero antisentido discriminante (SEC ID nº 44) y mediante secuenciación. Un vector de expresión estándar (por ejemplo pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen) con una resistencia de antibiótico diferente (por ejemplo a higromicina) que la del vector utilizado para la expresión de la cadena ligera (por ejemplo a neomicina) se incubó con el enzima de restricción PmeI para eliminar por completo el sitio de clonación múltiple, dejando extremos romos. El vector se trató adicionalmente con fosfatasa alcalina intestinal bovina para evitar la recirculación. La región constante finalmente se ligó en el vector, de manera que cualquier fusión futura de una región variable enfrente de la región constante ahora resultase posible mediante el sitio de restricción HindIII (5'-AAGCTT-3') y mediante el sitio de restricción ApaI (5'-GGGCCC-3'), ambos generados con el producto de PCR. La orientación correcta de la región constante en el vector, es decir, adecuada para el promotor anterior del vector, se verificó mediante secuenciación. Debido a la posición del sitio de restricción ApaI, cualquier amplificación de una región variable con dicho fin debe incluir los primeros 11 nucleótidos de la secuencia de la región constante y-1 humana además de la secuencia del sitio ApaI. La secuencia de la región constante de cadena pesada y-1 humana amplificada de esta manera que se ha insertado en el vector se presenta como SEC ID nº 45, la secuencia de aminoácidos de la región constante y-1 humana expresada de esta manera se presenta como SEC ID nº 46.
Tab. 4: líneas celulares de hibridoma de ratón utilizadas para la clonación de anticuerpos
clon
mAb Isotipo Región variable Pareja de Anticuerpo
oligómeros en la
quimerizado
PCR
Cadena
43A11 182-D1106-062 IgG2a SEC ID nº 55, 132 SEC ID nº 70, 71 SEC ID nº 100, 115
pesada
163E12
182-D1106-294 IgG3 SEC ID nº 56, 133 SEC ID nº 72, 73 SEC ID nº 101, 116
125E1
182-D1106-279 IgG2a SEC ID nº 57, 134 SEC ID nº 74, 75 SEC ID nº 102, 117
166E2
182-D1106-308 IgG3 SEC ID nº 59, 136 SEC ID nº 78, 79 SEC ID nº 104, 119
175D10
182-D1106-362 IgG1 SEC ID nº 58, 135 SEC ID nº 76, 77 SEC ID nº 103, 118
45C1
182-D758-187 IgG2a SEC ID nº 60, 137 SEC ID nº 80, 81 SEC ID nº 105, 120
Cadena
43A11 182-D1106-062 IgK SEC ID nº 62, 139 SEC ID nº 84, 85 SEC ID nº 107, 122
ligera
163E12
182-D1106-294 IgK SEC ID nº 61, 139 SEC ID nº 82, 83 SEC ID nº 106, 121
125E1
182-D1106-279 IgK SEC ID nº 63, 140 SEC ID nº 86, 87 SEC ID nº 108, 123
166E2
182-D1106-308 IgK SEC ID nº 66, 143 SEC ID nº 92, 93 SEC ID nº 111, 126
175D10
182-D1106-362 IgK SEC ID nº 65, 142 SEC ID nº 90, 91 SEC ID nº 110, 125
45C1
182-D758-187 IgK SEC ID nº 64, 141 SEC ID nº 88, 89 SEC ID nº 109, 124
45C1
182-D758-187 IgK SEC ID nº 67, 144 SEC ID nº 94, 95 SEC ID nº 112, 127
45C1
182-D758-187 IgK SEC ID nº 68, 145 SEC ID nº 96, 97 SEC ID nº 113, 128
45C1
182-D758-187 IgK SEC ID nº 69, 145 SEC ID nº 98, 99 SEC ID nº 114, 129
En correspondencia con sus contrapartidas murinas, los anticuerpos monoclonales murinos se denominaron añadiendo un prefijo "ch", por ejemplo ch-43A11, ch-163E12, ch-125E1, ch-166E2, ch-175D10 y ch-45C1.
La amplificación de las regiones variables murinas de cadenas ligeras y pesadas se llevó a cabo según el método de PCR "step out" descrito en Matz et al. (Nucleic Acids Research 27(6), 1999). Para ello, se preparó ARN total a partir de líneas celulares de hibridoma monoclonal (ver la Tab. 4) mediante métodos estándares conocidos por el experto en la materia, por ejemplo utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). Se preparó ADNc de cadena sencilla según el método de "intercambio de molde" también descrito en Matz et al. (Nucleic Acids Research 27(6):1558, 1999). Además de un oligómero (dT)30 (SEC ID nº 47), incluía un oligómero híbrido de ADN/ARN (SEC ID nº 48) utilizado a
modo de adaptador 5' para el intercambio de molde durante la polimerización de la cadena de ADNc. En este oligómero adaptador, los últimos tres nucleótidos eran ribonucleótidos y no desoxirribonucleótidos. La PCR "stepout" siguiente utilizada como oligómero antisentido presentaba como diana la región constante de la cadena kappa de ratón o la región constante de las subclases 1, 2a ó 3 de las cadenas y (SEC ID nº 49 a nº 52, respectivamente). La subclase IgG del anticuerpo monoclonal murino producido por las líneas celulares de hibridoma se analizó inmunológicamente utilizando IsoStrip (ver el Ejemplo 1) y de acuerdo con ella se seleccionó el oligómero antisentido apropiado (ver la Tab. 4). Una primera mezcla sirvió como oligómero de sentido en la PCR "step-out", que comprendía los dos oligómeros presentados en SEC ID nº 53 y nº 54. Algunas líneas celulares de hibridoma expresaban más de una cadena pesada o ligera (además de las cadenas expresadas por la línea celular de mieloma utilizada para la generación de hibridomas). La Tabla 4 resume los SEC ID nº de las regiones variables clonadas y secuencias de las cadenas de anticuerpos murinos (SEC ID nº 55 a nº 69 y SEC ID nº 132 a nº 146) y de las cadenas de anticuerpo quimérico de longitud completa clonadas y secuenciadas (SEC ID nº 100 a nº 129).
Las regiones variables murinas identificadas seguidamente se amplificaron mediante PCR omitiendo la UTR 5' y la región 3' constante de ratón, añadiendo sitios de restricción a los extremos, lo que permitió la subclonación en los vectores de expresión preparados que portaban las regiones constantes humanas. Además, los oligómeros de sentido proporcionaron una secuencia Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC-3' ó 5'-AGCCACC-3') y los oligómeros antisentido para las regiones variables de cadena pesada incluían los primeros 11 nucleótidos de la región constante y-1 humana además del sitio de restricción ApaI (ver la Tab. 4, SEC ID nº 70 a nº 99). Las regiones variables de cadena ligera kappa se clonaron utilizando los sitios de restricción HindIII y BsiWI, las regiones variables de cadena pesada y requerían los enzimas de restricción HindIII y ApaI. La región variable de cadena pesada y del anticuerpo monoclonal 45C1 contenía un sitio de restricción HindIII interno (en la presente memoria se utilizó por el contrario el enzima BsaI compatible (ver SEC ID nº 80)). SEC ID nº 100 a nº 114 mostraban las secuencias de ácidos nucleicos de los anticuerpos quimerizados resultantes (ver la Tab. 4). SEC ID nº 115 a nº 129 muestran las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos quimerizados expresados de acuerdo con lo anterior (ver la Tab. 4).
b. Generación y producción de anticuerpos quiméricos contra CLD18
Se generaron líneas celulares de mamífero productoras de anticuerpos quiméricos con especificidad para CLD18. Las líneas celulares se derivaron de células HEK293T (ATCC nº CRL-11268). Un día antes de la transfección, se sembraron 2,5x107 células en una placa de cultivo de tejidos de 14,5 cm y se cultivaron en 20 ml de medio completo,
o alternativamente se sembraron 1x107 células en una palca de cultivo de tejidos de 10 cm y se cultivaron en 10 ml de medio completo, o alternativamente se sembraron 0,6x106 células en un pocillo de una placa para tejidos de 12 pocillos y se cultivaron en 2-3 ml de medio completo (medio completo: medio DMEM:F12 suplementado con FBS al 10% con antibióticos). La densidad celular recomendada en el momento de la transfección debía alcanzar el 90% de confluencia. Inmediatamente antes de la transfección se sustituyó el medio por medio fresco. Se transfectaron células HEK293T con reactivos de transfección, por ejemplo lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668-019), o alternativamente polietilenimina (Sigma-Aldrich, 408727). A título de ejemplo para la transfección de células HEK293t, se utilizó una cantidad total de ADN de 110 µg o se utilizaron 296 µg para una placa para tejidos de 14,5 cm, y la proporción de agente de transfección a ADN fue de 1:2,5 y 1:12 para lipofectamina 2000 y PEI, respectivamente. Veinticuatro horas después de la sustitución del medio de transfección por un medio de GMP adecuado, por ejemplo X-Vivo 15 (Cambrex) o un medio químico definido como Pro293a (Cambrex) sin suero. Las células HEK293T transfectadas productoras de anticuerpos monoclonales quiméricos contra CLD18 se cultivaron durante 96 horas adicionales. Se recolectaron los sobrenadantes crudos, se esterilizaron mediante filtración y se purificaron mediante proteína A-sefarosa. Se determinó la concentración de anticuerpos mediante ensayo de BCA y se comprobó la pureza mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico y tinción de Coomassie.
c.
Características de unión de los anticuerpos monoclonales quiméricos
La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales quiméricos clonados y generados contra CLD18A2 se analizó mediante citometría de flujo tal como se indica en el Ejemplo 3. Se incubaron durante 30 minutos a 4ºC células HEK293 vivas establemente expresantes de CLD18A2 humano (HEK293-CLD18A2) y células HEK293 establemente expresantes de CLD18A1 humano (SEC ID nº 7, nº 8) (HEK293-CLD18A1), con sobrenadantes de cultivo purificado de células HEK293T que contenían anticuerpos monoclonales quiméricos, seguido de la incubación con anticuerpo secundario fragmento F(ab')2 de cabra conjugado con APC anti-Fcy de IgG humano y se contratiñó con YP. Se evaluó la unión mediante citometría de flujo utilizando un BD FACSArray.
De manera similar, se analizaron mediante citometría de flujo líneas celulares tumorales humanas expresantes endógenamente de CLD18A2, pro ejemplo células KATO-III y NUGC-4.
Las figs. 31A y B muestran análisis de citometría de flujo de los anticuerpos quiméricos ch-43A11, ch-125E1, ch163E12, ch-166E2 y ch-175D10. Todos ellos muestran reconocimiento de epítopos nativos y muestran una unión específica y fuerte a células que expresan CLD18A2 pero no a células que expresan CLD18A1.
d. Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Se preparó suero para la lisis mediada por el complemento, mediante extracción de sangre de voluntarios sanos en tubos vacutainer Serum-Monovette (Sarstedt, Nürmbrecht, Alemania), que seguidamente se centrifugaron a 600g durante 20 minutos. Se recolectó suero y se almacenó a -20ºC. Se inactivó por calor suero de control a 56ºC durante 30 minutos antes de almacenarlo.
Se analizaron anticuerpos quiméricos de la presente invención purificados mediante proteína A-sefarosa, para su capacidad de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células KATO-III expresantes endógenamente de CLD18A2, así como células CHO-CLD18A2 establemente transfectadas. Las células se incubaron con los anticuerpos monoclonales ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10, respectivamente, a una concentración final de 2,5 µg/ml a 35 µg/ml durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió suero humano al 20% en RPMI a las células y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 37ºC. A continuación, se discriminaron las células vivas y las células muertas mediante tinción con YP a una concentración final de 2,5 µg/ml y se determinó mediante citometría de flujo el porcentaje de lisis celular mediada por anticuerpos. Para el análisis de citometría de flujo, se utilizó un citómetro de flujo BD FACSArray (BD Biosciences, Mountain View, CA). Se recolectaron por lo menos
10.000 sucesos para el análisis, excluyendo los residuos celulares mediante ajuste del umbral de dispersión frontallateral (FSC/SSC). Se calculó la lisis específica mediante la fórmula siguiente: lisis específica = (% de células YPpositivas en la muestra - % de células YP-positivas en la muestra con suero inactivado por calor). Se demostró la lisis específica mediada por CDC con varios anticuerpos. La totalidad de los tres anticuerpos medió en una CDC robusta en células CHO-CLD18A2 (figura 32). En las células KATO-III, los anticuerpos ch-163E12 y ch-175D10 eran inductores de una CDC robusta.
e. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)
Se analizaron anticuerpos quiméricos purificados mediante FPLC de la invención para su capacidad de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra células KATO-III expresantes endógenamente de CLD18A2 humano.
Se diluyó sangre humana de donantes sanos dos veces en tampón fosfato (PBS) y se depositaron capas de células sanguíneas sobre Ficoll (1.077 g/ml, Pharmacia). Tras la centrifugación, se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la interfase, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo X-Vivo-15 suplementado con suero humano al 5% inactivado por calor.
Quince horas antes del ensayo, se transfectaron células KATO-III con luciferasa y se sembraron 5x104 células/pocillo en una microplaca blanca.
Para el ensayo, se añadieron células efectoras (PBMC, preparadas tal como se ha indicado anteriormente) a una proporción de células efectoras a células diana (E:D) de 20:1 y anticuerpos quiméricos purificados mediante FPLC, y se incubaron durante 2-3 horas a 37ºC, con 5% de CO2. La concentración final del anticuerpo en el pocillo era de 50 µg/ml. Tras 2-3 horas de preincubación, se añadió amarillo lucifer (BD Biosciences, San Jose, USA) a una concentración de 1 mg/ml. Se midió continuamente la luminiscencia resultante de la oxidación del amarillo lucifer por la luciferasa de las células viables, durante un máximo de 6 horas utilizando un lector de microplacas (Infinite200, Tecan, Suiza). Se calculó el porcentaje de citotoxicidad celular utilizando la fórmula siguiente: % de lisis específica = 100-((pulsos de luminiscencia de la muestra - pulsos de luminiscencia espontánea) / (pulsos de luminiscencia máxima - pulsos de luminiscencia máxima) x 100), determinando la luminiscencia espontánea mediante la adición de Triton X-100 (concentración final de 0,2%) y se midió la señal máxima en ausencia de anticuerpos.
Utilizando dicho ensayo se demostró que los anticuerpos monoclonales ch-163E12 y ch-175D10 mediaron en una fuerte ADCC sobre las células KATO-III (fig. 33).
f. Inhibición de la proliferación
Se analizaron anticuerpos quiméricos purificados mediante FPLC de la invención para su capacidad de inhibir el crecimiento celular de células KATO-III expresantes endógenamente de CLD18A2 humano.
Se cultivaron células diana (KATO-III) en presencia de los anticuerpos quiméricos respectivos (ver inhibición de la proliferación con anticuerpos murinos, Ejemplo 7). Se demostró que los anticuerpos quiméricos purificados mediante FLPC ch-163E12 y ch-166E2 inhibieron la proliferación celular.
10. Selección de anticuerpos como candidatos a desarrollo clínico
Los compuestos candidatos a desarrollo clínico ideales cubren un amplio abanico de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas (ver también la sección IV - Usos y métodos de la invención). Según la invención, se proporcionan anticuerpos con diana en CLD18-A2. Se demuestra que los anticuerpos proporcionados según la invención ofrecen un amplio espectro de propiedades referentes a la especificidad, capacidad de inducir CDC y ADCC e inhibición de la proliferación de células que expresan CLD18, en particular células tumorales. Además, se ha demostrado que la quimerización de los anticuerpos puede conducir a la adquisición de funciones efectoras dependientes de Fc adicionales no presentes en la molécula murina parental. Por ejemplo, se muestra en la presente memoria que el anticuerpo 175D10 con IgG1 murina no induce citotoxicidad dependiente del complemento (ver el Ejemplo 5), mientras que ch-175D10 con IgG1 humana induce lisis específica de las células tumorales expresantes constitutivamente de CLD18 (ver las Tab. 5 y 6).
5 Los anticuerpos proporcionados según la presente invención pueden clasificarse en diferentes clases según sus propiedades de unión y su capacidad de mediar en funciones efectoras sobre células que expresan CLD18. De entre los anticuerpos proporcionados según la presente invención pueden seleccionarse candidatos a desarrollo clínico basándose en sus características funcionales. Se proporciona una vista general de las propiedades para anticuerpos
10 murinos y quiméricos seleccionados de la invención en las Tab. 5 y 6, respectivamente.
Los candidatos a desarrollo clínico de la invención pueden presentar una o más de las propiedades siguientes:
a) unión a CLD18A2 humano pero no a CLD18A1 humano (por ejemplo 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 15 175D10, y ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10). Para ejemplos ver las figuras 6A y 6B.
b) Unión a CLD18A2 de ratón pero no a CLD18A1 de ratón (por ejemplo 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Para ejemplos ver las figuras 15A y 15B. 20
c) Unión a CLD18 expresado naturalmente por células tumorales (por ejemplo 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, y ch-45C1, ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 y ch-175D10). Para ejemplos ver la figura 13.
25 d) Unión a CLD18 en zonas de contacto intercelular (por ejemplo 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Para ejemplos ver las figuras 12A y 12B.
e) Mediación en la eliminación inducida por CDC de células que expresan CLD18 (por ejemplo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10, y ch-163E12 y ch-175D10). Para ejemplos ver la figura 32. 30 f) Mediación en la eliminación inducida por ADCC de células que expresan CLD18 (por ejemplo ch-163E12 y ch-175D10). Para ejemplos ver la figura 33.
g) Inhibición de la proliferación de células que expresan CLD18 (por ejemplo 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 y 35 175D10, y ch-163E12 y ch-166E2).
h) Inhibición del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto con células que expresan CLD18 (por ejemplo 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Para ejemplos ver la figura 24.
40 i) Prolongación de la supervivencia en modelos de xenoinjerto con células que expresan CLD18 (por ejemplo 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 y 175D10). Para ejemplos ver la figura 25B.
Vista general ejemplificativa de propiedades para la selección de candidatos a desarrollo clínico
45 Tabla 5: anticuerpos murinos
Anticuerp o
Unión de CLD18A 2 humano pero no CLD18A 1 Unión de CLD18A 2 de ratón pero no CLD18A 1 Unión de CLD18 sobre células tumorales naturalment e expresante s Unión a CLD18 en zonas de contact o Mediación de CDC sobre células expresante s de CLD18 Inhibición de la proliferació n de células expresante s de CLD18 Inhibición del crecimient o tumoral en xenoinjerto s expresante s de CLD18 Prolongació n de la supervivenci a en xenoinjertos expresantes de CLD18
45C1
+ - + + (+) + (+) (+)
125E1
+ + + + (+) + + +
163E12
+ + + + + + + +
175D10
+ + + + (+) (+) + +
leyenda: + rendimiento excelente, (+) rendimiento en diferentes diseños
Tabla 6: anticuerpos quiméricos
Anticuerpo
Unión de CLD18A2 humano pero no a CLD18A1 Unión de CLD18 sobre células tumorales naturalmente expresantes Mediación de CDC sobre células expresantes de CLD18 Mediación de ADCC sobre células expresantes de CLD18 Inhibición de la proliferación de células expresantes de CLD18
ch-45C1
+ + n.d. n.d. n.d.
ch-125E1
+ + n.d. n.d. n.d.
ch-163E12
+ + + + +
ch-175D10
+ + + + n.d.
leyenda: + rendimiento excelente, (+) rendimiento en diferentes diseños, n.d. no realizado 5
Listado de secuencias
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG 10 <120> Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer
<130> 342-31PCT
<150> EP 05 025 657.7 15 <151> 2005-11-24
<160> 150
<170> PatentIn versión 3.3 20
<210> 1
<211> 786
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 1
30 <210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
35 <400> 2 5 <210> 3
<211> 816
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 3
<210> 4
<211> 271
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 813
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 270
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 786
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<210> 8
<211> 261
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 8
5
<210> 9 <211> 795 <212> ADN <213> Mus musculus
10
<400> 9
64
<210> 10
<211> 795
<212> ADN
<213> Mus musculus
15
<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
20
<400> 11 tggctctgtg tcgacactgt g 21
<210> 12
<211> 21 <212> ADN <213> Artificial
5
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
10 15
<400> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c<210> 11 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 15
<211> 390
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16 10 <211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 411
<212> ADN 20 <213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 531
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<400> 19
<210> 20
<211> 176
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 22
25 <210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
30 <400> 23 <210> 27
5
<210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 24
10 15
<210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
20
<210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 26
<211> 13
<212> PRT 30 <213> Homo sapiens
35 <210> 28
<211> 55
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 29
<211> 24 45 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 31
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 31
<210>
32 20 <211> 3359
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 32
<211> 849
<212> ADN
<213> Mus musculus
<210> 35
<211> 264
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35
<210> 36
<211> 2786
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 36
<210> 37
<211> 264
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 41
<210>
46 35 <211> 326
10
<210> 34
<211> 3350
<212> ADN
<213> Mus musculus
15
<400> 34
5
<210> 38 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
10
<400> 38 gagaggatcc cgtacggtgg ctgcaccatc tgtccttcatc 40
15
<210> 39 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial
20
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 39
gagagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagctc
37
5
<210> 40 <211> 324 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
30
<210> 42 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial
35
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 42 gagaaagctt tccaccaagg gcccatcggt cttc 34
<210> 43
<211> 36 <212> ADN <213> Artificial
5
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
10 15
<400> 43 gagagcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag <210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido 36
20
<400> 44 taccagttga acttgacctc a 21
25
<210> 45 <211> 981 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
30
<400> 45
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 40 <223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 46
<210> 47 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<220> <221> misc_feature <222> 31 .. 32 <223> n es a, c, g o t
<400> 47 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn
32
<210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 48 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg
30
<210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 49 ctgctactg gatggtggga agatgg
26
<210> 50 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag
25
<210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg
25
<210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
5 10
<400> 52 agccagggac caagggatag acagatg <210> 53 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido 27
15
<400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
20
<210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
25
<400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc 22
30
<210> 55 <211> 351 <212> ADN <213> Artificial
35
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR <400> 55
<210> 56 40 <211> 354
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 45 <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<210> 57
<211> 348
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 57
<210> 58
<211> 354
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<210> 59
<211> 354 25 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR 30
<400> 59
<210> 60 35 <211> 339
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 40 <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 60
5 <210> 61
<211> 339
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<210> 62
<211> 318
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 62
<210> 63
<211> 339
<212> ADN 30 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<210> 64
<211> 339 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR 10
<400> 64
<210> 65 15 <211> 339
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 65
25
<210> 66
<211> 336
<212> ADN
<213> Artificial
30
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 66
<210> 67
<211> 339 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR 10
<400> 67
<210> 68 15 <211> 339
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
25 <210> 69
<211> 321
<212> ADN
<213> Artificial
30 <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR
<400> 69
<210> 70 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt ctc
43
<210> 71 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc
43
<210> 72 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc
47
<210> 73 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc
44
<210> 74 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc
46
<210> 75 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc
44
<210> 76 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 76 gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc
46
<210> 77 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg
43
<210> 78 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc
47
<210> 79 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc
44
<210> 80 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c
51
<210> 81 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc
44
<210> 82 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctc
43
<210> 83 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cagc
34
<210> 84 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 84 gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc
46
<210> 85 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc
30
<210> 86 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 86 gagaaagctt gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg
44
<210> 87 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc
33
<210> 88 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 88 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg
46
<210> 89 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc
30
<210> 90 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 90 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg
46
<210> 91 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc
30
<210> 92 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg
49
<210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc
30
<210> 94 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg
46
<210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc
30
<210> 96 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg
46
<210> 97 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag
33
<210> 98 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c
41
5
<210> 99 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
10
<400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30
15
<210> 100 <211> 1401 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal
<210> 102
<211> 1398 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal 15
<400> 102 <210> 103
<211> 1404 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 103 <210> 104
<211> 1401 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 104 <210> 105
<211> 1410 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 105 <210> 106
<211> 723 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 106 <210> 107
<211> 708 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 107
<210> 108 15 <211> 705
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 108 <210> 109
<211> 723 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 109
<210> 110 15 <211> 723
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
20 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 110
<210> 111
<211> 720 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 111
<210> 112 15 <211> 723
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
20 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 112
<210> 113
<211> 723 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 113
15 <210> 114
<211> 705
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 114
<210> 115
<211> 466 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 115
<210> 116
<211> 467 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 116
<210> 117
<211> 465 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 117
<210> 118
<211> 467 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 118
<211> 466
<212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
10 <400> 119
<210> 120
<211> 469 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 120
<210> 121
<211> 240 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 121 <210> 122
<211> 235 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico 10
<400> 122
<210> 123 5 <211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 123
<210> 124 5 <211> 240
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 124
<210> 125 5 <211> 240
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 125
<210> 126 5 <211> 239
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 126
<210> 127 5 <211> 240
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 127
<210> 128 5 <211> 240
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 128
<210> 129 5 <211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: anticuerpo monoclonal quimérico
<400> 129
5
<210> 130 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 130 ccaagggcta tggcgttc
18
15
<210> 131 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial
20
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
5 10
<400> 131 ccgaaggtgt acctggtc <210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR 18
<400> 132
<210> 133
<211> 118
<212> PRT 20 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR <210> 134
<211> 116 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR 10
<400> 134
15 <211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
20 <223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 135
<210> 136
<211> 118 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR 10
<400> 136
15 <210> 137
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 137
<210> 138
<211> 113 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR 15
<400> 138
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 139
<210> 140
<211> 107 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR 20
<400> 140
<210>
141 25 <211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 141
<210>
142 10 <211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 15 <223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<210> 143
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 143
<210> 144
<211> 113
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
20 <400> 144 <210> 145
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
<400> 145
<210> 146
<211> 107
<212> PRT 15 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: traducción de producto de PCR
20 <400> 146
<210> 147
<211> 324
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: ácido nucleico con codones optimizados
<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: ácido nucleico con codones optimizados
<210> 149
<211> 981
<212> ADN 25 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: ácido nucleico con codones optimizados
30 <400> 149
<210> 150 5 <211> 326
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Descripción de secuencia artificial: ácido nucleico con codones optimizados
<400> 150

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo monoclonal que presenta la capacidad de unirse a la claudina 18A2 (CLD18A2) y que puede obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 16 o un ácido nucleico o una célula huésped que expresa dicho péptido,
    en el que el anticuerpo presenta la capacidad de mediar en la eliminación de células tumorales que expresan CLD18A2 in vivo, siendo inducida dicha eliminación por la unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 expresada por dichas células, y
    en el que el anticuerpo media en la eliminación de células que expresan CLD18A2 mediante la inducción de lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
  2. 2.
    Anticuerpo según la reivindicación 1, que se une a CLD18A1 y a CLD18A2.
  3. 3.
    Anticuerpo según la reivindicación 1, que se une a CLD18A2 pero no a CDL18A1.
  4. 4.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células que expresan CLD18A2 son células cancerosas.
  5. 5.
    Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que las células cancerosas se seleccionan de entre el grupo que consiste de células de cáncer gástrico, esofágico, pancreático y pulmonar tumorígenas.
  6. 6.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha lisis mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras seleccionadas de entre el grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN.
  7. 7.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo.
  8. 8.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo IgG1, IgG2, preferentemente IgG2a e IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE.
  9. 9.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que CLD18A2 presenta la secuencia de aminoácidos según la SEC ID nº 2.
  10. 10.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que CLD18A1 presenta la secuencia de aminoácidos según la SEC ID nº 8.
  11. 11.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes sobre la superficie de células vivas.
  12. 12.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es específico para las células cancerosas, preferentemente las células de cáncer de estómago.
  13. 13.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha CLD18A2 se expresa sobre la superficie de dichas células.
  14. 14.
    Anticuerpo producido por un clon depositado bajo los números de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, o DSM ACC2810.
  15. 15.
    Anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo según la reivindicación 14.
  16. 16.
    Hibridoma que puede producir el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
  17. 17.
    Hibridoma depositado bajo los números de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ó DSM ACC2810.
  18. 18.
    Conjugado que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 acoplado a un agente terapéutico.
  19. 19.
    Conjugado según la reivindicación 18, en el que el agente terapéutico es una toxina, un isótopo radioactivo, un fármaco o un agente citotóxico.
  20. 20.
    Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y/o conjugado según la reivindicación 18 o 19, y portador farmacéuticamente aceptable.
    5 21. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, conjugado según la reivindicación 18 o 19, o composición farmacéutica según la reivindicación 20, para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer que implica células cancerosas que expresan CLD18A2, en las que dicho anticuerpo, dicho conjugado o dicha composición farmacéutica debe administrarse en un sujeto.
    10 22. Anticuerpo, conjugado o composición farmacéutica según la reivindicación 21, en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de la vesícula biliar.
  21. 23. Anticuerpo, conjugado o composición farmacéutica según la reivindicación 21 o 22, en el que dicha CLD18A2 se 15 expresa sobre la superficie de dichas células.
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