ES2405259A1 - Uso del enantiómero (+)-c75 para el tratamiento de la obesidad. - Google Patents

Abstract

Uso del enantiómero (+)-C75 para el tratamiento de la obesidad. Composición farmacéutica de un compuesto de fórmula I y su uso para el tratamiento de la obesidad.

Description

USO DEL ENANTIÓMERO (+)-C75 PARA EL TRATAMIENTO DE LA OBESIDAD

La presente invención se refiere al uso del enantiómero (+)-C75 para el tratamiento de la obesidad como inhibidor del apetito. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo del uso de inhibidores del apetito para el
tratamiento de la obesidad.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La prevalencia de obesidad severa y las enfermedades relacionadas en los países desarrollados y en vías de desarrollo está aumentando a una velocidad alarmante. Por ello, el diseño de fármacos para tratar estas enfermedades es una cuestión de gran prioridad a nivel mundial.

La obesidad es el resultado de un desequilibrio entre el consumo y el gasto de energía. Por este motivo, los fármacos que disminuyan la ingesta de alimentos o aquellos que aumenten el gasto calórico, son buenos candidatos para el tratamiento de esta patología y las enfermedades relacionadas, como la diabetes tipo 2, las enfermedades cardiovasculares, etc (ver (a) Shoelson SE, Herrero L y Naaz A. "Obesity, Inflammation, and Insulin Resistance". Gastroenterology, 2007; 132:2169–2180; (b) San Millán JL, Cortón M, Villuendas G, Sancho J, Peral B, Escobar-Morreale HF. "Association of the polycystic ovary syndrome with genomic variants related to insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, and obesity". J Clin Endocrinol Metab, 2004; 89(6):2640-6).

El (±)-C75 es un compuesto químico que causa una pérdida de peso y gran anorexia en roedores (ver Loftus TM, Jaworsky DE, Frehywot GL, Townsend CA, Ronnett GV, Lane MD, Kuhajda FP. "Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors". Science, 2000; 288:2379-81), sugiriendo que esta molécula pudiera ser un candidato para el tratamiento de la obesidad. Tradicionalmente, el (±)-C75 se ha descrito como un inhibidor de la sintasa de ácidos grasos (FAS), enzima que cataliza la síntesis de novo de ácidos grasos a partir de los sustratos acetil-CoA y malonil-CoA (Kuhajda FP, Pizer ES, Li JN, Mani NS, Frehywot GL, Townsend CA. "Synthesis and antitumor activity of an inhibitor of fatty acid synthase". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97:3450-4). Más recientemente, se ha demostrado que el derivado con coenzima A (CoA) del C75 es un potente inhibidor de la CPT1 (ver Bentebibel A, Sebastian D, Herrero L, Lopez-Viñas E, Serra D, Asins G, et al. "Novel effect of (±)-C75 on carnitine palmitoyltransferase I activity and palmitate oxidation". Biochemistry, 2006; 45:4339-50). A pesar de estos estudios, el mecanismo molecular exacto por el cual el (±)-C75 causa una reducción en el peso y el apetito no ha sido dilucidado.

El sistema nervioso central, y más específicamente, el hipotálamo, juega un papel principal en el control del apetito y en el mantenimiento del balance energético. El hipotálamo es un área específica del cerebro que responde a variaciones en el estado metabólico del organismo, alterando la expresión de neuromoduladores y neurotransmisores que se traduce en modificaciones del apetito y el gasto de energía. Varios estudios sugieren que el malonil-CoA derivado de la glucosa, intermediario de la síntesis de novo de ácidos grasos, actúa como un mensajero molecular del estado energético en el hipotálamo y sus variaciones en las neuronas regulan el apetito (ver Hu Z, Dai Y, Prentki M, Chohnan S, Lane MD. "A role for hypothalamic malonyl-CoA in the control of food intake". The Journal of Biological Chemistry, 2005; 280:39681-3). El malonil-CoA es un inhibidor fisiológico del enzima CPT1, principal regulador de la β-oxidación que cataliza la primera etapa del transporte de ácidos grasos desde el citoplasma a la mitocondria. Los tejidos de mamíferos expresan tres isoformas diferentes de CPT1, la CPT1A, la CPT1B y la CPT1C. La CPT1A y la CPT1C se expresan en el cerebro aunque la segunda está localizada en el retículo endoplasmático de las neuronas y no participa en la oxidación de ácidos grasos. La CPT1A sí se localiza en la mitocondria de las neuronas hipotalámicas y regula los niveles de ácidos grasos de cadena larga unidos a conezima A (LCFA-CoA) en estas células. Evidencias recientes sugieren que son precisamente los niveles de LCFA-CoA en el hipotálamo los que actúan como señal reguladora del apetito y la homeostasis energética (ver Obici S, Feng Z, Morgan K, Stein D, Karkanias G, Rossetti L. "Central administration of oleic acid inhibits glucose production and food intake". Diabetes, 2002; 51:271-5). La administración de (±)-C75 puede modular tanto los niveles de malonil-CoA, inhibiendo la FAS, como los niveles de LCFA-CoA a través de la inhibición indirecta de CPT1, debida a la acumulación de su inhibidor fisiológico, malonil-CoA. Además, recientemente se ha demostrado que (±)C75 se convierte en (±)-C75-CoA in vivo en el hipotálamo donde inhibe la actividad CPT1 y causa una disminución del apetito y el peso, sugiriendo que este enzima es clave en el efecto anoréxico central del (±)-C75 (ver Mera P, Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG, Gurunathan C, Sebastian D, et al. "C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weight". Biochemical Pharmacology, 2009; 77:1084-95).

Por otro lado, el (±)-C75 es un compuesto citotóxico de manera selectiva para algunas células tumorales, debido a su efecto inhibitorio sobre la síntesis de ácidos grasos. Las células cancerosas tienen un fenotipo típico de una actividad FAS muy elevada y la inhibición de la misma las conduce a apoptosis. La identificación de este enzima como una diana de quimioprotección resaltó la importancia del C75 como un buen candidato para el tratamiento de algunos cánceres. De hecho, (±)-C75 tiene una actividad anti-tumoral tanto en líneas celulares tumorales como en modelos animales.

Desde que se sintetizó el (±)-C75 en 1997, se ha venido utilizando en todos los estudios publicados la mezcla racémica (Kuhajda FP, Pizer ES, Li JN, Mani NS, Frehywot GL, Townsend CA. "Synthesis and antitumor activity of an inhibitor of fatty acid synthase". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97:3450-4), a pesar de que es conocido que la estereoquímica de un compuesto puede determinar su actividad biológica.

El aislamiento de ambos enantiómeros (+)-C75 y (–)-C75 se ha descrito recientemente (Chakrabarty, K. et al. Lett. Org. Chem. 2010, 7, 245-248) mediante resolución cinética.

Así pues, sería deseable disponer de un método de síntesis enantioselectivo del enantiómero (+)-C75.

Y, por otro lado, sería deseable disponer de un compuesto capaz de inhibir el apetito de forma selectiva.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una síntesis enantioselectiva del enantiómero (+)-C75.

Asimismo, la presente invención describe el efecto selectivo en el apetito y el peso de un animal del enantiómero (+)-C75.

Así pues, un aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se han definido anteriormente, para la preparación de un medicamento.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se han definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad, la diabetes tipo II, las enfermedades cardiovasculares, la hipertensión, la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, la artritis, el asma, el ovario poliquístico o el cáncer, y preferiblemente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I tal y como se han definido anteriormente, para la fabricación de un alimento o complemento, dietético o funcional, y preferiblemente para la fabricación de un alimento o complemento donde dicho compuesto es un aditivo dietético.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un alimento o complemento alimenticio que comprende un compuesto de fórmula I, preferiblemente la presente invención se refiere a un alimento o complemento alimenticio que comprende un compuesto de fórmula I donde dicho alimento o complemento es dietético o funcional.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de preparación de un compuesto de fórmula I como se ha definido anteriormente, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula II con metoximagnesio carbonato de metilo (MMC), formol y N-metilanilina:

Algunos compuestos de la presente invención podrían contener uno o más protones ácidos y por tanto podrían formar también sales con bases. Ejemplos de dichas sales incluyen: sales con cationes inorgánicos como

10 sodio, potasio, calcio, magnesio, litio, aluminio, zinc, etc.; y sales formadas con aminas farmacéuticamente aceptables como amoníaco, alquilaminas, hidroxialquilaminas, lisina, arginina, N-metilglucamina, procaína y similares.

No hay limitación en el tipo de sal que se puede utilizar, con la condición de

15 que cuando se usen con fines terapéuticos sean farmacéuticamente aceptables. Se entiende por sales farmacéuticamente aceptables aquellas sales que, a criterio médico, son adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos u otros mamíferos sin provocar una toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica o similar. Las sales

20 farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por cualquier experto en la materia.

Las sales de un compuesto de fórmula I pueden obtenerse durante el aislamiento final y purificación de los compuestos de la invención o bien 25 pueden prepararse por tratamiento de un compuesto de fórmula I con una cantidad suficiente de la base deseada para dar la sal de una forma convencional. Las sales de los compuestos de fórmula I se pueden

transformar a su vez en otras sales de compuestos de fórmula I por intercambio de iones mediante una resina de intercambio iónico.

Los compuestos de fórmula I y sus sales pueden diferir en ciertas propiedades físicas, pero son equivalentes a efectos de la invención. Todas las sales de los compuestos de fórmula I quedan incluidas dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de la presente invención pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o desde los que se hacen precipitar o cristalizar. Estos complejos se conocen como solvatos. Tal como se utiliza aquí, el término solvato se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (un compuesto de fórmula I o una sal del mismo) y un disolvente. Ejemplos de disolventes incluyen los disolventes farmacéuticamente aceptables como agua, etanol y similares. Un complejo con agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los compuestos de la invención (o sus sales), incluyendo hidratos, quedan incluidos dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de fórmula I pueden existir en diferentes formas físicas, es decir en forma amorfa y formas cristalinas. Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden tener la capacidad de cristalizar de más de una forma, una característica que se conoce como polimorfismo. Los polimorfos se pueden diferenciar por varias propiedades físicas bien conocidas por los entendidos en la materia como por ejemplo sus difractogramas de rayos X, puntos de fusión o solubilidad. Todas las formas físicas de los compuestos de fórmula I, incluyendo todas sus formas polimórficas (“polimorfos”), quedan incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y de no ser perjudiciales para quién tome dicha composición. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del principio activo y de su vía de administración. En principio se puede utilizar cualquier vía de administración, por ejemplo oral, parenteral, nasal, ocular, rectal, y tópica.

Las composiciones sólidas para la administración oral incluyen comprimidos, granulados y cápsulas. En cualquier caso el método de fabricación está basado en una mezcla simple, granulación seca o granulación húmeda del principio activo con excipientes. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes tales como lactosa, celulosa microcristalina, manitol o hidrogenofosfato cálcico; agentes aglutinantes como por ejemplo almidón, gelatina o polivinilpirrolidona; disgregantes como carboximetilalmidón sódico

o croscarmelosa sódica; y agentes lubricantes como por ejemplo estearato magnésico, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden ser además recubiertos con excipientes adecuados y mediante técnicas conocidas con el objeto de retrasar su disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y así conseguir una acción sostenida durante un mayor período de tiempo, o simplemente para mejorar sus propiedades organolépticas o su estabilidad. El principio activo puede también ser incorporado por recubrimiento sobre pellets inertes mediante el uso de polímeros filmógenos naturales o sintéticos. También es posible la realización de cápsulas de gelatina blanda, en las que el principio activo se mezcla con agua o con medio oleoso, por ejemplo aceite de coco, parafina líquida o aceite de oliva.

Se pueden obtener polvos y granulados para la preparación de suspensiones orales mediante la adición de agua, mezclando el principio activo con agentes dispersantes o humectantes; suspensantes y conservantes. También pueden añadirse otros excipientes, por ejemplo edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Como formas líquidas para la administración oral se pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados, tales como agua destilada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles (macrogoles) y propilénglicol. Dichas composiciones pueden también contener coadyuvantes como agentes humectantes, suspensantes, edulcorantes, aromatizantes, conservantes y reguladores de pH.

Preparaciones inyectables, de acuerdo con la presente invención, para la administración parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles, en un solvente acuoso o no acuoso como propilénglicol, polietilénglicol o aceites vegetales. Estas composiciones pueden también contener coadyuvantes, como humectantes, emulsionantes, dispersantes y conservantes. Podrían ser esterilizadas por cualquiera de los métodos conocidos o preparadas como composiciones sólidas estériles que serán disueltas en agua o cualquier otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de uso. También es posible partir de materias primas estériles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricación.

Para la administración rectal, el principio activo puede ser formulado preferentemente como supositorio en una base oleosa, como por ejemplo aceites vegetales o glicéridos semisintéticos sólidos, o en una base hidrófila como polietilénglicoles (macrogol).

Los compuestos de la invención pueden también ser formulados para su aplicación tópica para el tratamiento de patologías en zonas o órganos accesibles por esta vía, como ojos, piel y tracto intestinal. Formulaciones incluyen cremas, lociones, geles, polvos, soluciones y parches en las que el compuesto se encuentra dispersado o disuelto en excipientes adecuados. Para la administración nasal o por inhalación, el compuesto puede presentarse formulado en forma de aerosol de dónde es convenientemente liberado con el empleo de propelentes adecuados.

La dosificación y la frecuencia de las dosis variarán en función de la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar, la edad, la condición general y el peso del paciente, así como también del compuesto particular administrado y la vía de administración, entre otros factores. A título de ejemplo, un rango adecuado de dosificación oscila entre alrededor de 0,01 mg/Kg y alrededor de 100 mg/Kg por día, que pueden administrarse como dosis única o en varias tomas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención describe el efecto de la estereoquímica del C75 en su actividad farmacológica.

En la presente invención se ha demostrado que el aducto (±)-C75-CoA (Figura 1), es un inhibidor muy potente de CPT1, mientras que el compuesto en su forma libre no tiene ningún efecto sobre esta actividad enzimática (Figura 2A). Para la realización de estos experimentos se utilizaron extractos mitocondriales de levaduras que sobre-expresan el enzima CPT1A de rata, obtenidos tal y como se decribe en Materiales y Métodos. A continuación se estudió el efecto in vitro de (±)-C75-CoA y (±)-C75 sobre la actividad del enzima FAS, presente en extractos de hígado de rata. Los resultados obtenidos mostraron que el (±)-C75 es un inhibidor de FAS mientras que el (±)-C75-CoA no tiene actividad inhibitoria sobre el mismo (Figura 2B).

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención describe la síntesis del enantiómero (+)-C75 del C75 separadamente utilizando una oxazolidinona derivada de la D-fenilalanina como auxiliar quiral (Esquema 1), para estudiar las posibles diferencias en sus propiedades biológicas respecto a la mezcla racémica.

Una vez comprobado que las formas activas de (±)-C75 sobre la CPT1 son sus aductos de CoA, mientras que las formas inhibitorias activas sobre la FAS son las formas libres, se sintetizaron los aductos (+)-C75-CoA y (±)-C75-CoA, siguiendo el protocolo descrito en Materiales y Métodos. Posteriormente, estos compuestos se incubaron con extractos mitocondriales de levaduras que sobre-expresan CPT1A y a continuación se analizó la actividad enzimática. Los resultados mostraron que (+)-C75-CoA inhibe la actividad enzimática CPT1, con una IC50 similar a la observada para la mezcla racémica (Tabla 1). Por otro lado, extractos de hígado de rata que contienen el enzima FAS fueron incubados con (±)-C75 y (+)-C75 y a continuación se analizó la actividad del enzima. Los resultados demostraron que, a diferencia de la mezcla racémica, el enantiómero (+)-C75 inhibe poco a la FAS con un IC50 mayor que 5000 µM (Tabla 1). Estos resultados mostraron la estereo-especificidad de (+)-C75 lo que permite disponer de un compuesto altamente selectivo frente a sus dianas terapéuticas.

La presente invención demuestra que el (+)-C75 y (±)-C75 producen una reducción del apetito y el peso (Figura 4A y 4B). Sorprendentemente, en las mismas condiciones no se produce inhibición en la actividad FAS hipotalámica (Figura 4D). Tradicionalmente, el efecto central del (±)-C75 se ha atribuido a la inhibición de este enzima, pero en las condiciones experimentales llevadas a cabo en la presente invención, a pesar de que se observa una reducción del apetito, no se ha observado ninguna inhibición de la actividad enzimática FAS en el hipotálamo tras la inyección de la mezcla racémica y del enantiómero (+)-C75. La falta de la actividad inhibitoria de (±)C75 se podría explicar por las concentraciones del compuestos utilizadas in vivo si se comparan con los niveles del experimento in vitro. Por otro lado, el enantiómero (+)-C75 y la mezcla (±)-C75 sí produjeron una inhibición en la actividad de CPT1 en el hipotálamo (Figura 4C). Además, previamente se demostró que el (±)-C75-CoA se forma en el hipotálamo a partir de (±)-C75; de esta manera la inhibición de CPT1 observada tras una inyección central de (±)-C75 es debida al compuesto formado (±)-C75-CoA (Mera P,

5 Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG, Gurunathan C, Sebastian D, et al. "C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weight". Biochemical Pharmacology, 2009; 77:1084-95). .

10 El enantiómero (+)-C75 tiene propiedades anorécticas y, a diferencia de la mezcla racémica, no inhibe la actividad FAS ni in vitro ni in vivo. Por otro lado, su aducto con CoA es un potente inhibidor de la actividad CPT1, tanto in vitro como in vivo. Todos los datos, en su conjunto, aportan nuevas evidencias de que con la síntesis separada del enantiómero (+)-C75 es

15 posible separar los efectos farmacológicos del (±)-C75.

La síntesis del enantiómero (+)-C75 comprende las etapas descritas en el esquema 1:

Esquema 1

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, 25 componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,

ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra la estructura molecular de (±)-C75, (±)-C75-CoA y (+)-C75.

FIG. 2A. Representa el efecto in vitro de (±)-C75 y (±)-C75-CoA sobre la

actividad CPT1A. Extractos mitocondriales de levadura (12 µg) que sobre-expresan CPT1A fueron pre-incubados durante 5 minutos con concentraciones crecientes de (±)-C75 (○)y(±)-C75-CoA (•) tras lo que se

determinó la actividad CPT1. Los datos se expresan como % de actividad remanente respecto al control (100%) como la media±SEM de, al menos,

dos experimentos independientes.

FIG. 2B. Representa el efecto in vitro de (±)-C75 y (±)-C75-CoA sobre la

actividad FAS. Extractos citosólicos de hígado de rata (130 µg) fueron preincubados durante 30 minutos como en la Fig. 2A. A continuación se analizó la actividad FAS. Los datos se expresan como % de actividad remanente

respecto al control (100%) como la media±SEM de, al menos, dos

experimentos independientes.

FIG. 3A. Representa el efecto in vitro de (±)-C75-CoA y (+)-C75-CoA sobre

la actividad CPT1A. Extractos mitocondriales de levaduras que sobre-expresan CPT1A (12 µg) se pre-incubaron con concentraciones crecientes de (±)-C75-CoA (▲) y (+)-C75-CoA (○). A continuación se analizó la actividad

CPT1. Los resultados se expresan como % de actividad remanente respecto al control, en ausencia de los compuestos (100% de actividad).

FIG. 3B. Representa el efecto in vitro de (±)-C75 y (+)-C75 sobre la actividad

FAS. Extractos citosólicos de hígado de rata (130 µg) fueron pre-incubados con los compuestos en su forma libre, (±)-C75 (▲), (+)-C75 (○), y la actividad

FAS fue analizada. Los resultados se expresan como % de actividad remanente respecto al control, en ausencia de los compuestos (100% de actividad).

FIG. 4. Representa el efecto de (±)-C75 y (+)-C75 sobre el peso, la ingesta y

las actividades FAS y CPT1 en el hipotálamo. (A) la ingesta y (B) el cambio en el peso corporal fueron analizados en las ratas 22 horas después de la inyección central (i.c.v.) de (±)-C75 (n = 7; barra gris) y (+)-C75 (n = 8, barra

negra). Los resultados se expresan como el % de cambio respecto al control (100%). Determinación de la actividad (C) CPT1 y (D) FAS tras la inyección

i.c.v. de los compuestos. Control (n = 13, barra blanca), (±)-C75 (n = 19;

barra gris) y (+)-C75 (n = 7; barra negra). * P < 0.05

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se han utilizado en los ejemplos:

�: incremento BSA: albúmina sérica bovina cDNA: DNA complementario CoA-SH: coenzima A CPT1: carnitina palmitoiltrasnferas 1 (CPT1A: isoforma hepática del enzima) DMSO: dimetilsulfóxido DTT: ditiotreitol EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético FAS: sintasa de ácidos grasos HAM's F12: medio de cultivo celular IC50: concentración máxima a la que se produce el 50% de inhibición de un enzima i.c.v.: intracerebroventricular MTT: 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro

n: número de animales en un grupo experimental NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NMR: Resonancia magnética nuclear RPMI 1640: medio de cultivo celular Roswell Park Memorial Institute SEM: error estándar de la media

Materiales L-(metil-3H) carnitina hidrocloruro se obtuvo de Amersham Biosciences (GE Healthcare Europe, Barcelona, España). (Malonil-2-14C)-Malonil-Coenzima A es un producto de PerkinElmer Health Sciences (Boston, USA). Los productos de medios de cultivo para levadura eran de DifcoTM Laboratories (Detroit, USA). La solución Bradford para ensayos de proteína fue de Bio-Rad Laboratories (Barcelona, España). RPMI 1640 fue de Gibco-Invitrogen Corporation (Barcelona, España). Albúmina de suero bovino desengrasada (BSA), palmitoil-CoA, malonil-CoA y otros reactivos fueron de Sigma-Aldrich (Madrid, España).

Métodos

Síntesis de (+)-C75

(+)-C75 se preparó a partir de n-nonanal vía una reacción aldólica asimétrica de una oxazolidinona de Evans derivada de la L-fenilalanina.

Síntesis de (±) C75-CoA y (+)-C75-CoA

La sal sódica de CoA hidratada (8,6 mg) y Na3PO4:12H2O (7,6 mg) se añadieron a una solución de (±)-C75 (2,5 mg) en D2O (0,8 mL) en un tubo de NMR. La estructura del aducto C75-CoA se determinó inequívocamente por experimentos de NMR de protón 1H y de 13C, gCOSY y gHSQC. De un modo semejante, el (+)-C75-CoA se preparó a partir de (+)-C75 y de CoA-SH.

Animales

Las ratas macho de la cepa Sprague Dawley (260-290 g) fueron subministradas por la empresa Harlan. Los animales se mantuvieron en un ciclo de 12 h oscuridad/luz con acceso libre a la comida (Ref: 2014, Harlan) y al agua. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Ético Animal de la Universidad de Barcelona de acuerdo con la legislación vigente.

Cirugía de Canulación

Las cánulas i.c.v. fueron implantadas estereotáxicamente en el ventrículo lateral del cerebro. Los animales se anestesiaron con una mezcla de ketamina (Imalgene, 90 mg/kg) y xilazina (Rompun, 11 mg/kg). Las coordenadas fueron: 1,0 mm posterior al bregma, 1,4 mm lateral al seno sagital y 4 mm ventral a la dura madre (Paxinos G y Watson C. "The rat brain in stereotaxic coordenates". 4th edition, London, Academic Press). Durante la semana posterior a la operación se añadieron analgésicos (buprenorfina 0,3 mg/400 mL) y antibióticos (enrofluoxacina, 10%) al agua de bebida.

Tratamientos

La inyección i.c.v. (10 µL, de una solución 33 mM) de (±)-C75, (+)-C75 o el vehículo en el que se disolvieron los compuestos (DMSO:RMPI, 1:3) se llevó a cabo con una jeringa Hamilton, después de 1 semana de recuperación post-quirúrgica. En los experimentos de análisis de la ingesta, las ratas recibieron inyecciones únicas de los compuestos o el vehículo (animales control) 30 minutos antes del inicio de la fase oscura. Se midió el consumo de comida y el peso corporal 22 horas después de la inyección. Para las determinaciones de actividad CPT1, las ratas se sacrificaron 1 h después de la inyección. A continuación se diseccionó el hipotálamo y se procesó para la obtención de extractos mitocondriales que fueron utilizados inmediatamente para el análisis de la actividad enzimática. Para las determinaciones de actividad FAS las ratas se sacrificaron 1 h después de la inyección y los hipotálamos se diseccionaron y se almacenaron a -80 ºC para estudios posteriores.

Expresión de CPT1 en Sacchromyces cerevisiae

El cDNA de la CPT1A de rata se expresó en células de levadura, y a continuación se obtuvieron los extractos mitocondriales libres de células. siguiendo el protocolo descrito previamente (ver Mera P, Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG, Gurunathan C, Sebastian D, et al. "C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weight". Biochemical Pharmacology, 2009; 77:1084-95).

Determinación de la actividad Carnitina acil transferasa

Las fracciones enriquecidas en mitocondrias se obtuvieron por centrifugación diferencial de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente (ver Rickwood D G, JM. "Subcellular fractionation: a practical approach", 1997). Todas las concentraciones proteicas se determinaron usando el método de Bradford utilizando el reactivo comercial de la empresa BioRad (Ref. 5000006) utilizando la albúmina bovina sérica (BSA) como estándar.

Para medir la actividad CPT1 se utilizó un método radiométrico descrito con anterioridad (ver Morillas M, Gomez-Puertas P, Roca R, Serra D, Asins G, Valencia A, et al. "Structural model of the catalytic core of carnitine palmitoyltransferase I and carnitine octanoyltransferase (COT): mutation of CPT I histidine 473 and alanine 381 and COT alanine 238 impairs the catalytic activity". The Journal of Biological Chemistry, 2001; 276:45001-8). Se utilizaron aproximadamente 12 µg de proteína mitocondrial de levadura y 100 µg de proteína de hipotálamo de rata, según los casos. La actividad enzimática se ensayó a lo largo de 5 minutos a 30 ºC en un volumen final de 200 µL. Los sustratos fueron 400 µM de L-carnitina y 50 µM de palmitoil-CoA. En los ensayos in vitro el enzima se pre-incubó con concentraciones crecientes de los compuestos (0,1-100 µM) durante 1 minuto. El valor IC50 corresponde a la concentración de inhibidor que inhibe el 50% de la actividad enzimática. En todos los casos, la relación molar de acil-CoA y albúmina se mantuvo en 5:1 para evitar la presencia de aciles-CoA libres y prevenir los efectos detergentes y evitar la formación de micelas.

Determinación de la actividad acido graso sintasa

Para la realización de los experimentos in vitro, la FAS se purificó a partir de hígado de rata siguiendo el protocolo descrito por Linn (Linn TC. "Purification and crystllization of rat liver fatty acid synthase". Archives of biochemistry and biophysics, 1981; 209:613-9). Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales no se añadió el ditiotreitol. Se utilizó un ensayo espectrofotométrico para la determinación de la actividad FAS in vitro (ver Lelliott CJ, Lopez M, Curtis RK, Parker N, Laudes M, Yeo G, et al. "Transcript and metabolite analysis of the effects of tamoxifen in rat liver reveals inhibition of fatty acid synthesis in the presence of hepatic steatosis". Faseb J, 2005; 19:1108-19). Las concentraciones de compuestos que se utilizaron oscilaban entre 100 y 5000 µM, y sirvieron para determinar la concentración IC50.

Para los experimentos in vivo se utilizó la fracción hipotalámica conteniendo el enzima FAS. Los hipotálamos congelados se homogenizaron con 400 µL de solución tampón (0,25 sacarosa, 1mM EDTA, 1 mM DTT, e inhibidores de proteasas). Después se centrifugó a 14.000 xg a 2 ºC durante 30 minutos. El sobrenadante se ensayó para medir la actividad FAS, utilizando un método radiométrico (ver Arslanian MJ, Wakil SJ. "Fatty acid synthase from chicken liver". Methods in Enzymology, 1975; 35:59-65).

Método espectrofotométrico Los extractos citosólicos de hígado de rata (315 µg) se pre-incubaron a 30 ºC durante 30 minutos con concentraciones crecientes de los compuestos (±)-C75 y (+)-C75 disueltos en DMSO (de media 100-5000 µM), usando DMSO como blanco, y (±)-C75-CoA y (+)-C75-CoA disueltos en agua destilada. NADPH (121 µM) y acetil-CoA 61 µM se añadieron al enzima pre incubado y equilibrado a 37 ºC durante 3 minutos. La reacción se inició poniendo malonil-CoA 55 µM. El volumen final de la reacción fue de 0,33 mL. La oxidación de NADPH se observó a 340 nm durante 10 min.

Método radiométrico Los extractos citosólicos de hipotálamo, conteniendo el enzima FAS, (100 µL) se pre-incubaron a 37 ºC durante 10 minutos añadiéndose a continuación una solución tampón (K2HPO4 0,1 M, pH=7,2, EDTA 0,2 mM pH=8, DTT 4 mM y BSA 0,2 %) que contenía NADPH (225 µM), acetil-CoA (24 µm), malonil-CoA (640 µM) y 14C [malonil-CoA] (0,05 µCi). El volumen final de la reacción fue 500 µL. Después de 20 min a 37 ºC, la reacción se detuvo con la adición de 100 µL de NaOH 0,5 M. Después, se añadieron 200 µL de alcohol (66%) y la mezcla se calentó a 100 ºC durante 15 min para saponificar los lípidos. Entonces, la solución se acidificó con 100 µL de HCl 1 M y los ácidos grasos se extrajeron con 3 lavados de 2 mL de pentano. Las fracciones orgánicas se combinaron (5 mL) y se lavaron nuevamente con 2 mL de ácido acético 0,1%. Se evaporaron 4 mL del extracto de pentano y finalmente el residuo se redisolvió en 0,5 mL de pentano y se llevó al contador de centelleo.

Análisis estadístico:

Los datos se expresan como medias ± SEM. La significación de las diferencias se calcula usando el test de t de Student no pareado.

Resultados

Ejemplo 1 Síntesis estereoselectiva de (+)-C75

(S)-4-(4-bencil-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-il)-4-oxobutanoato de metilo

Sobre una solución de (S)-4-bencil-1,3-oxazolidin-2-ona (6,00 g, 33,90 mmol) en THF anh. (250 mL) se adicionó gota a gota (durante 15 min) BuLi en hexano (16,3 mL, 40,7 mmol) a –78 ºC en atmósfera de N2. La disolución resultante se dejó agitando en estas condiciones durante 35 min. A continuación se añadió 4-cloro-4-oxobutanoato de metilo (4,68 mL, 37,29 mmol) y se dejó agitando durante 30 min a -70 ºC y 30 min a t.a. Entonces la reacción se paró adicionando una solución saturada de NH4Cl (30 mL). Los disolventes orgánicos se evaporaron y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se lavó con NaOH 1N (20 mL), disolución saturada de NaCl, se secó (MgSO4) y el disolvente evaporó. El crudo resultante se recristalizó (AcOEt: hexano) obteniéndose el producto deseado (7,18 g, 24.67 mmol, 73%).

Sólido blanco; Pf: 81-82 ºC. Rf (hexano/AcOEt 7:3) = 0,33. [α]D = + 55,3 (c = 1,0, CHCl3). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): δ 2,69-2,75 (2 H, m, CH2-CO-N), 2,77 (1 H, dd, J=13,4, 9,5 Hz, CHPh), 3,24-3,31 (3 H, m, CHPh y CH2-COO), 3,72 (3 H, s, OCH3); 4,21 (2 H, m, CH2-O); 4,68 (1 H, m, CH-N); 7,20-7,36 (5 H, m, Ar). 13C RMN (CDCl3, 101 MHz): δ 28.0; 30,8; 37,7; 51,9; 55,1; 66,3; 127,3; 128,9; 129,4; 135,1; 153,4; 171,9; 172,8. IR (film): 2953, 2928, 1780, 1737, 1697, 1390, 1213, 993, 761. HRMS (ESI+) calcd para C15H17NO5Na [M+Na]+ = 314,0999, encontrado: 314,0992.

(S)-4-Bencil-3-((2R,3S)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carbonil)-1,3oxazolidin-2-ona

Se adicionó gota a gota una disolución de Bu2BOTf 1 M en CH2Cl2 (0,57 mL, 0,57 mmol) sobre una solución de (S)-4-(4-bencil-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-il)4-oxobutanoato de metilo (150 mg, 0,515 mmol) y tamiz molecular de 4 Ǻ (~0,8 g) en CH2Cl2 anh. bajo atmósfera de N2 a –20 ºC. Tras 30 min de agitación se adicionó lentamente DIPEA (0,11 mL, 0,625 mmol). Al cabo de 45 min a –20 ºC, se añadió n-nonanal (0,13 mL, 0,76 mmol) previamente destilado. La solución resultante se dejó agitando a –20 ºC durante 3 h y se añadió una solución saturada de NH4Cl (1,5 mL). La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 × 5 mL) y el conjunto de las fases orgánicas se secó (MgSO4) y se evaporó el disolvente. Sobre el crudo obtenido (278 mg) se añadió MeOH (5 mL) y una cantidad catalitica de ácido p-toluenosulfónico. La disolución resultante se calentó a reflujo durante 1h. A continuación el disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en CH2Cl2 (10 mL). La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de NaHCO3 (5 mL), H2O (5 mL), se secó (MgSO4) y el disolvente se evaporó. El crudo resultante se purificó por columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt 6:4) obteniéndose el producto deseado (0,130 g, 0,33 mmol, 65 %).

1,0, CHCl3); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): δ 0.88 (3 H, t, J = 6,9 Hz, CH3); 1,26-1,55 (12 H, m, CH2); 1,71 (2 H, m, OCHCH2); 2,71 (1 H, dd, J = 6,8; 17,6 Hz, CHH-CO); 2,83 (1 H, dd, J = 9,2; 13,2 Hz, CHH-Ph); 3,00 (1 H, dd, J = 9,6; 17,6 Hz, CHH-CO); 3,26 (1 H, dd, J = 3,2; 13,2 Hz, CHH-Ph); 4,16 (1 H, m, CHR-CO); 4,28 (2 H, m, CH2-OCO); 4,71 (1 H, m, CHR-N); 4,80 (1 H, m, CHR-O-CO); 7,17-7,37 (5 H, m, Ar). 13C RMN (CDCl3, 101 MHz): δ 14.0; 22,6; 25,3; 29,1; 29,2; 29,3; 31,7; 32,4; 35,1; 37,7; 45,0; 55,2; 66,7; 81,5; 127,6; 129,0; 129,3; 134,6; 153,0; 171,0; 174,3. IR (film): 2926, 2855, 1782, 1698, 1559, 1456, 1389, 1210, 1113, 1076, 1054, 762, 703; HRMS (ESI+) calcd para C23H32NO5 [M+H]+ = 402,2275, encontrado: 402,2284.

Ácido (2R,3S)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carboxílico

Sobre una disolución de (S)-4-bencil-3-((2R,3S)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran3-carbonil)oxazolidin-2-ona (50 mg, 0,125 mmol) en THF/H2O 1:1 (5 mL) a 0 ºC se adicionó H2O2 (100 µL, 0,98 mmol) y LiOH·H2O (6 mg, 0,25 mmol) y se dejo agitando durante 30 min a t.a. A continuación se añadió Na2SO3 1,5 M (0,4 mL) y 1N NaOH hasta pH básico. La fase acuosa se lavó con CH2Cl2 (5 × 10 mL) y acidificó hasta pH=1–2 con HCl conc. La fase acuosa se extrajo posteriormente con CH2Cl2 (5 × 10 mL). El conjunto de de fases orgánicas se lavó con una solución acuosa saturada de NaCl, se secó (MgSO4) y después de filtrar se evaporó el disolvente al vacío obteniéndose el producto deseado (0,022 g, 0,091 mmol, 73 %).

O

COH

C8H17

Sólido blanco. Pf: 98-100 ºC. Rf (hexano/EtAcO/AcOH 8:2:0,1) = 0,24; [α]D=

+ 34,0 (c = 1,0, MeOH). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): δ 0,88 (3 H, t, J = 6,4 Hz, CH3); 1,28-1,56 (12 H, m, CH2); 1,70-1,86 (2 H, m, CH2); 2,82 (1 H, dd,

5 J= 9,6, 17,6 Hz, CHH-CO); 2,95 (1 H, dd, J= 8,4, 17,9 Hz, CHH-CO); 3,10 (1 H, m, CH-COOH); 4,62 (1 H, m, CHR-O). 13C RMN (CDCl3,101MHz): δ 15,1; 23,6; 26,2; 30,1; 30,2; 30,3; 32,8; 32,9; 36,3; 46,4; 83,0; 175,7; 177,1. IR (film): 3000-3300, 2926, 2853, 1749, 1718, 1393, 1243, 1215, 1195, 759,

669. HRMS (ESI+) calcd para C13H22NaO4 [M+Na]+ = 265,1410; encontrado: 10 265,1410.

Ácido (2R,3S)-4-metilen-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carboxílico (+)C75]

15 Sobre una muestra de ácido (2R,3S)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3carboxílico (85 mg, 0,35 mmol) se adicionó una solución 2M de MMC (metilcarbonato de magnesio) en DMF (6 mL) y la mezcla se calentó a 130135 ºC bajo atmósfera de N2 durante 45 h. A continuación se añadió lentamente 6N HCl (10 mL) y CH2Cl2 (15 mL). La fase acuosa se extrajo con

20 CH2Cl2 (2 × 10 mL). El conjunto de fases orgánicas se secó (MgSO4) y después de filtrar, se eliminó el disolvente al vacío obteniéndose 100 mg de aceite marrón. Sobre el crudo se adicionó 1,2 mL de una solución recién preparada que contenía 1 mL AcOH, 0,75 mL formol, 30 mg AcONa y 0,26 mL N-metilanilina. La mezcla se dejó agitando durante 1,45 h a t.a. Sobre

25 suspensión resultante se añadieron 5 mL de una solución 10:1 de NaCl (ac.) y HCl conc. y 12 mL de CH2Cl2. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (5 × 10 mL). Las fases orgánicas se lavaron sucesivamente con una solución acuosa de LiCl (5%, 2 × 4 mL), HCl 0,02 N (2 × 4 mL) y H2O (3 × 5 mL). La fase orgánica se dejo agitando durante 5 min con 5 mL de NaHCO3 sat. A continuación la fase acuosa se acidificó hasta pH 1-2 con HCl conc. y extrajo con CH2Cl2 (4 × 10 mL). El conjunto de fases orgánicas se lavó con NaCl sat., se secó (MgSO4) y se evaporo el disolvente, obteniéndose el (+)-C75 (54 mg, 0,21 mmol, 60%).

Sólido blanco. Pf: 88-89 ºC. Rf = 0,27. [α]D = + 11,4

10 (c=1.0, CHCl3). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): δ 0,88 (3 H, t, J = 6,9 Hz, CH3); 1,20-1,53 (12 H, m, CH2); 1,67-1,79 (2H, m, CH2); 3,63 (1 H, dt, J=5,6, 2,8 Hz, CH-COOH); 4,81 (1 H, td, J=7,2, 5,6 Hz, CHR-O); 6,02 (1 H, d, J= 2,7 Hz, =CHH); 6,46 (1 H, d, J=3,0 Hz=CHH). 13C RMN (CDCl3, 101 MHz): δ 14,0; 22,6; 24,7; 29,1; 29,3; 31,7; 35,7; 49,4; 78,8; 125,9; 132,4; 168,2;

15 174,5. IR (film): 3000-3400, 2924, 2852, 1743, 1717, 1660, 1621, 1460.

Ejemplo 2 Síntesis y caracterización de (+)-C75 y su aducto con CoA

Se confirmó que la configuración absoluta de (+)-C75 era el ácido (2R,3S)

20 4-metilen-2-octil-5-oxotetrahidrofurano-3-carboxílico (Ejemplo 1), en base a los ámplios precedentes de la literatura científica en el uso de los auxiliares de Evans. Se determinó la estructura y estereoquímica del (+)-C75-CoA por espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Los datos indicaron una estereoquímica trans, trans del aducto (Figura 1).

Ejemplo 3 Efecto in vitro de (±)-C75 y su aducto con CoA sobre las actividades enzimáticas FAS y CPT1

A causa de que la forma activa del C75 sobre la CPT1 es la forma del aducto del CoA (ver Bentebibel A, Sebastian D, Herrero L, Lopez-Viñas E, Serra D, Asins G, et al. "Novel effect of C75 on carnitine palmitoyltransferase I activity and palmitate oxidation". Biochemistry, 2006), se sintetizó el derivado (±)-C75-CoA tal y como se describe en Materiales y Métodos. A continuación se analizó el efecto de este compuesto, y su forma libre, sobre la actividad CPT1 del enzima sobre-expresado en levaduras. Los resultados mostraron que este compuesto se comporta tal y como se había observado anteriormente e inhibe la actividad enzimática. Asimismo, se observó que la forma libre de (±)-C75 no tiene efecto sobre la actividad este enzima (Figura 2A). También analizamos el efecto de estos dos compuestos sobre extractos citosólicos hepáticos conteniendo el enzima FAS. Los resultados obtenidos,

consistentes

con estudios previos, demostraron que el (±)-C75 es un

inhibidor de FAS mientras que el aducto (±)-C75-CoA

no tiene a ctivi dad

inhibitoria sobre esta actividad enzimática (Figura 2B).

Ejemplo 4 Efecto in vitro de (±)-C75-CoA y (+)-C75-CoA sobre CPT1 y de (±)-C75 y (+)-C75 sobre FAS

Analizamos el efecto in vitro de (±)-C75, (+)-C75 y de sus derivados CoA sobre las actividades enzimáticas FAS y CPT1 respectivamente. Para llevar a cabo estos estudios, sintetizamos primero (±)-C75-CoA y (+)-C75-CoA siendo caracterizados seguidamente como se describió en Materiales y Métodos. Se estudió a continuación el efecto de estos aductos de CoA sobre la actividad enzimática CPT1 del enzima sobre-expresado en levadura. Los resultados mostraron que el (+)-C75-CoA inhibe la actividad CPT1, con una IC50 similar a la de la mezcla racémica (Tabla 1 y Figura 3A).

Tabla 1: Valores de la constante de inhibición IC50 para (±)-C75-CoA y (+)-C75-CoA sobre la actividad CPT1 y para (±)-C75 y (+)-C75 sobre la actividad FAS. La actividad CPT1 se analizó en extractos mitocondriales de levaduras que sobre-expresan el enzima CPT1A de rata. La actividad FAS se analizó en extractos citosólicos de hígado de rata. Los resultados se expresan como la media ± SEM de, al menos, dos experimentos independientes.

Los ensayos de actividad equivalentes se llevaron a cabo con las formas libres (±)-C75 y (+)-C75 y extractos citosólicos de hígado de rata, que contenían el enzima FAS. Los resultados mostraron que, tal y como se describe en estudios anteriores, el (±)-C75 inhibe la actividad FAS con una IC50 de 498 ± 46 µM (Tabla 1 y Figura 3B). Sin embargo, el enantiómero (+)C75, que tiene efecto inhibidor sobre la actividad CPT1, no mostró una gran actividad inhibitoria sobe el enzima FAS con una IC50 > 5000 µM (Tabla 1 y Figura 3B).

Ejemplo 5 Efecto de la administración central del enantiómero (+)-C75 y la mezcla racémica (±)-C75 sobre el peso y la ingesta

Para analizar el efecto de (±)-C75 y (+)-C75 sobre el apetito y el peso corporal realizamos inyecciones i.c.v. de 10 µL (a una concentración de 33 mM) de ambos compuestos, 30 minutos antes del inicio de la fase oscura (ver Materiales y Métodos). Los animales control recibieron inyecciones del vehículo en el que disolvieron los compuestos (DMSO:RPMI, 1:3). Los resultados obtenidos mostraron una disminución en el peso y la ingesta de los animales tratados con el compuesto racémico (±)-C75, tal y como se describe en estudios publicados anteriormente (Aja S, Bi S, Knipp SB, McFadden JM, Ronnett GV, Kuhajda FP, Moran TH. "Intracerebroventricular C75 decreases meal frequency and reduces AgRP gene expression in rats". Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006; 291(1):R148-54). De igual manera, el enantiómero (+)-C75 causó un reducción en el peso corporal y el consumo de alimentos muy similar a la causada por la mezcla racémica (Tabla 2 y Figura 4A y 4B).

Tabla 2: Efecto de (±)-C75 y (+)-C75 sobre la ingesta, el peso y las actividades FAS y CPT1 en el hipotálamo. 30 minutos antes del inicio de la fase oscura, las ratas recibieron una inyección i.c.v. de 10 µL de (±)-C75 o 15 (+)-C75 (33 mM). Los animals control fueron inyectados con el vehículo en el que se disolvieron los compuestos (DMSO:RPMI, 1:3). La ingesta de alimento y el peso corporal se midieron 22 horas después de la inyección. Para los ensayos de actividad de FAS y CPT1 los animales recibieron inyecciones i.c.v. de la misma manera que para los experimentos de ingesta,

20 sin embargo 1 hora después de la inyección fueron sacrificados y el hipotálamo fue diseccionado y utilizado para los análisis de actividad enzimática. * P < 0.05.

Ejemplo 6 25 Efecto de la administración central del enatiómero (+)-C75 y de (±)-C75 en las actividades de FAS y CPT1 en el hipotálamo

Se analizó el efecto que el enantiómero (+)-C75 y la mezcla racémica, (±)C75 tienen sobre la actividad de los enzima FAS y CPT1 en el hipotálamo. Para ello se realizaron inyecciones de los compuestos tal y como se describe en el ejemplo 5 y Materiales y Métodos. Una hora después se 5 diseccionó el hipotálamo y se procesó, en unos casos para analizar la actividad CPT1 y en otros para analizar la actividad FAS. Sorprendentemente, los resultados obtenidos mostraron que ninguno de loa dos compuestos inhiben la actividad FAS en el hipotálamo (Tabla 2 y Figura 4D), a pesar de que en las mismas condiciones si se produce una supresión 10 de la ingesta y una disminución del peso. Por otro lado, la administración de (+)-C75 y (±)-C75 sí causó una inhibición de la actividad CPT1 en el hipotálamo (Tabla 2 y Figura 4C). En el caso de la mezcla racémica este efecto inhibitorio sobre la CPT1 hipotalámica se había reportado con anterioridad (Mera P, Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG,

15 Gurunathan C, Sebastian D, et al. "C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weight". Biochemical Pharmacology, 2009; 77:1084-95).

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula 1:

   o

   Fórmula I 5 O una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
2. 2.-Uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica de la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento.

   10 3.-Uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica de la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad, la diabetes tipo 11, las enfermedades cardiovasculares, la hipertensión, la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, la artritis, el asma,

   15 el ovario poliquístico o el cáncer.
3. 4.-Uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica según la reivindicación 3, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad.

   20 5.-Uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación de un alimento o complemento, dietético o funcional.
4. 6.-Uso según la reivindicación 5, donde dicho compuesto es un aditivo 25 dietético.
5. 7.-Alimento o complemento alimenticio que comprende un compuesto de fórmula I.
6. 8.-Alimento o complemento según la reivindicación anterior, donde dicho alimento o complemento es dietético o funcional.

   FIG.1

   FIG.2A

   FIG.2B

   FIG.3A

   FIG.3B

   FIG.4