ES2405435B1 - Uso del enantiómero (-)-c75 como antitumoral - Google Patents

Abstract

Uso del enantiómero (?)-C75 como antitumoral.#Composición farmacéutica de un compuesto de fórmula I y su uso como antitumoral.

Description

Uso del enantiómero (–)-c75 como antitumoral.

La presente invención se refiere al uso del enantiómero (–)-C75 como antitumoral. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo del uso de inhibidores antitumorales.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El (±)-C75 puede modular la actividad de los enzimas que participan en el metabolismo lipídico tales como la sintasa de ácidos grasos (FAS), enzima encargado de la síntesis de novo de ácidos grasos (Kuhajda FP, Pizer ES, Li JN, Mani NS, Frehywot GL, Townsend CA. quot;Synthesis and antitumor activity of an inhibitor of fatty acid synthasequot;. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97:3450-4), y la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) (Bentebibel A, Sebastian D, Herrero L, Lopez-Viñas E, Serra D, Asins G, et al. quot;Novel effect of (±)-C75 on carnitine palmitoyltransferase I activity and palmitate oxidationquot;. Biochemistry, 2006; 45:433950), enzima encargado de catalizar la entrada de los ácidos grasos al interior de la mitocondria y principal regulador de la �-oxidación.

Se ha demostrado que, debido a su efecto sobre la actividad FAS, el (±)-C75 es un buen candidato para el tratamiento de algunas clases de cáncer. Aunque los tejidos normales tienen bajos niveles de síntesis de ácidos grasos, algunos tumores y sus lesiones precursoras muestran niveles altos de expresión de FAS y su inhibición conduce a la apoptosis, sugiriendo que este enzima es una buena diana para el desarrollo de drogas anti-tumorales (ver (a) Pizer ES, Chrest FJ, DiGiuseppe JA, Han WF. quot;Pharmacological inhibitors of mammalian fatty acid synthase suppress DNA replication and induce apoptosis in tumor cell linesquot;. Cancer research, 1998; 58:4611-5; (b) Pizer ES, Jackisch C, Wood FD, Pasternack GR, Davidson NE, Kuhajda FP. quot;Inhibition of fatty acid synthesis induces programmed cell death in human breast cancer cellsquot;. Cancer research, 1996; 56:2745-7). De hecho, (±)-C75 tiene actividad anti-cancerígena tanto en líneas celulares como en modelos animales.

El (±)-C75 es un compuesto químico que, además, causa una pérdida de peso y gran anorexia en roedores (ver Loftus TM, Jaworsky DE, Frehywot GL, Townsend CA, Ronnett GV, Lane MD, Kuhajda FP. quot;Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitorsquot;. Science, 2000; 288:2379-81), sugiriendo que esta molécula podría ser útil para el tratamiento de la obesidad. Tradicionalmente, el (±)-C75 se ha descrito como un inhibidor de la FAS, y más recientemente, se ha mostrado que el derivado con coenzima A (CoA) del (±)-C75 es un potente inhibidor de la CPT1. A pesar de estos estudios, el mecanismo molecular exacto por el que el (±)-C75 causa una disminución del apetito y el peso no ha sido dilucidado.

El (±)-C75 es un inhibidor de la FAS in vitro. La inhibición de este enzima en el hipotálamo, parte del sistema nervioso central destinada al control del apetito, podría conducir a un aumento de los niveles de su sustrato malonil-CoA, que como inhibidor fisiológico de CPT1 previene la oxidación de los ácidos grasos sintetizados de novo. Ambos metabolitos, el malonil-CoA y los derivados CoA de los ácidos grasos de cadena larga (LCFA-CoA) se han propuesto como moléculas señal que controlan la ingesta de alimento y el peso corporal ((a) Hu Z, Dai Y, Prentki M, Chohnan S, Lane MD. quot;A role for hypothalamic malonyl-CoA in the control of food intakequot;. The Journal of biological chemistry, 2005; 280:39681-3 y (b) Obici S, Feng Z, Morgan K, Stein D, Karkanias G, Rossetti L. quot;Central administration of oleic acid inhibits glucose production and food intakequot;. Diabetes, 2002; 51:271-5). En un estudio previo nosotros mostramos que el derivado CoA de (±)-C75, (±)-C75-CoA, es un inhibidor muy potente de la actividad enzimática CPT1 y que se forma en el hipotálamo a partir de (±)-C75 y CoA libres, donde inhibe la actividad CPT1, el peso y la ingesta, sugiriendo que la inhibición de este enzima en el hipotálamo es la causa del efecto anorexigénico del compuesto (±)-C75 (Mera P, Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG, Gurunathan C, Sebastian D, et al. quot;C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weightquot;. Biochemical pharmacology, 2009; 77:1084-95).

La reducción del peso y el apetito causada por (±)-C75 es uno de los principales inconvenientes del uso de éste compuesto como fármaco anti-tumoral o quimioprotectivo. De hecho, varios laboratorios están investigando la síntesis de inhibidores de FAS que no causen anorexia y reducción de peso corporal, para el tratamiento del cáncer (McFadden JM, Medghalchi SM, Thupari JN, Pinn ML, Vadlamudi A, Miller KI, et al. quot;Application of a flexible synthesis of (5R)-thiolactomycin to develop new inhibitors of type I fatty acid synthasequot;. Journal of Medicinal Chemistry, 2005; 48:946-61).

Desde que se sintetizó el (±)-C75 en 1997, se ha venido utilizando en todos los estudios publicados la mezcla racémica (Kuhajda FP, Pizer ES, Li JN, Mani NS, Frehywot GL, Townsend CA. quot;Synthesis and antitumor activity of an inhibitor of fatty acid synthasequot;. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97:3450-4), a pesar de que es conocido que la estereoquímica de un compuesto puede determinar su actividad biológica.

El aislamiento separado de ambos enantiómeros (+)-C75 y (–)-C75 se ha descrito recientemente (Chakrabarty, K. et al. Lett. Org. Chem. 2010, 7, 245-248) mediante resolución cinética.

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Así pues, sería deseable disponer de un método de síntesis enantioselectivo del enantiómero (–)-C75.

Y, por otro lado, sería deseable disponer de un compuesto selectivo para el tratamiento del cáncer, particularmente del cáncer de ovario, mama y próstata. 5

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una síntesis enantioselectiva del enantiómero (–)-C75.

10 Asimismo, la presente invención describe el efecto selectivo frente a células cancerígenas de ovario, mama y próstata del enantiómero (–)-C75.

Así pues, un aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I:

15 Fórmula I

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I o de una composición 20 farmacéutica tal y como se han definido anteriormente, para la preparación de un medicamento.

En otra realización, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

25 En otra realización, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de ovario, próstata, mama, tiroides, colorrectal, vejiga, lengua, esófago, hepático, pancreático o estomacal.

30 En otra realización, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de ovario.

35 En otra realización, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata.

En otra realización, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica que 40 comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de preparación de un compuesto de fórmula I como se ha definido anteriormente, que comprende: 45 (a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula II con metoximagnesio carbonato de metilo (MMC), formol y Nmetilanilina:

Fórmula II

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Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos de la presente invención son útiles para el tratamiento de enfermedades que cursen con un aumento de la expresión del enzima FAS. Por ello, estos compuestos podrían ser útiles para el tratamiento de aquellas enfermedades en las que el aumento en la síntesis de ácidos grasos es importante en mamíferos, incluyendo seres humanos. Tales enfermedades incluyen, sin limitación:

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cáncer, preferiblemente cualquier cáncer de los descritos en Flavin R, Peluso S, Nguyen PL, Loda M. quot;Fatty acid synthase as a potential therapeutic target in cancerquot;. Future Oncol, 2010; 6(4):551-62 (cuyo contenido queda incorporado aquí por referencia), más preferiblemente cáncer de ovario, cáncer de mama y cáncer de próstata;

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diabetes y esteatosis hepática (véase por ejemplo, (Wu M, Singh SB, Wang J, Chung CC, Salituro G, Karanam BV, Lee SH, Powles M, Ellsworth KP, Lassman ME, Miller C, Myers RW, Tota MR, Zhang BB, Li C. quot;Antidiabetic and antisteatotic effects of the selective fatty acid synthase (FAS) inhibitor platensimycin in mouse models of diabetesquot;. PNAS, 2011; 108(13): 5378-5383).

Algunos compuestos de la presente invención podrían contener uno o más protones ácidos y por tanto podrían formar también sales con bases. Ejemplos de dichas sales incluyen: sales con cationes inorgánicos como sodio, potasio, calcio, magnesio, litio, aluminio, zinc, etc.; y sales formadas con aminas farmacéuticamente aceptables como amoníaco, alquilaminas, hidroxialquilaminas, lisina, arginina, N-metilglucamina, procaína y similares.

No hay limitación en el tipo de sal que se puede utilizar, con la condición de que cuando se usen con fines terapéuticos sean farmacéuticamente aceptables. Se entiende por sales farmacéuticamente aceptables aquellas sales que, a criterio médico, son adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos u otros mamíferos sin provocar una toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica o similar. Las sales farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por cualquier experto en la materia.

Las sales de un compuesto de fórmula I pueden obtenerse durante el aislamiento final y purificación de los compuestos de la invención o bien pueden prepararse por tratamiento de un compuesto de fórmula I con una cantidad suficiente de la base deseada para dar la sal de una forma convencional. Las sales de los compuestos de fórmula I se pueden transformar a su vez en otras sales de compuestos de fórmula I por intercambio de iones mediante una resina de intercambio iónico.

Los compuestos de fórmula I y sus sales pueden diferir en ciertas propiedades físicas, pero son equivalentes a efectos de la invención. Todas las sales de los compuestos de fórmula I quedan incluidas dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de la presente invención pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar

o desde los que se hacen precipitar o cristalizar. Estos complejos se conocen como solvatos. Tal como se utiliza aquí, el término solvato se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (un compuesto de fórmula I o una sal del mismo) y un disolvente. Ejemplos de disolventes incluyen los disolventes farmacéuticamente aceptables como agua, etanol y similares. Un complejo con agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los compuestos de la invención (o sus sales), incluyendo hidratos, quedan incluidos dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de fórmula I pueden existir en diferentes formas físicas, es decir en forma amorfa y formas cristalinas. Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden tener la capacidad de cristalizar de más de una forma, una característica que se conoce como polimorfismo. Los polimorfos se pueden diferenciar por varias propiedades físicas bien conocidas por los entendidos en la materia como por ejemplo sus difractogramas de rayos X, puntos de fusión o solubilidad. Todas las formas físicas de los compuestos de fórmula I, incluyendo todas sus formas polimórficas (“polimorfos”), quedan incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y de no ser perjudiciales para quién tome dicha composición. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del principio activo y de su vía de administración. En principio se puede utilizar cualquier vía de administración, por ejemplo oral, parenteral, nasal, ocular, rectal, y tópica.

Las composiciones sólidas para la administración oral incluyen comprimidos, granulados y cápsulas. En cualquier caso el método de fabricación está basado en una mezcla simple, granulación seca o granulación húmeda del principio activo con excipientes. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes tales como lactosa, celulosa microcristalina, manitol o hidrogenofosfato cálcico; agentes aglutinantes como por ejemplo almidón, gelatina o polivinilpirrolidona; disgregantes como carboximetilalmidón sódico o croscarmelosa sódica; y agentes lubricantes como por ejemplo estearato magnésico, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden ser además recubiertos con excipientes adecuados y mediante técnicas conocidas con el objeto de retrasar su disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y así conseguir una acción sostenida durante un mayor período de tiempo, o simplemente para mejorar sus propiedades organolépticas o su estabilidad. El principio activo puede también ser incorporado por

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recubrimiento sobre pellets inertes mediante el uso de polímeros filmógenos naturales o sintéticos. También es posible la realización de cápsulas de gelatina blanda, en las que el principio activo se mezcla con agua o con medio oleoso, por ejemplo aceite de coco, parafina líquida o aceite de oliva.

Se pueden obtener polvos y granulados para la preparación de suspensiones orales mediante la adición de agua, mezclando el principio activo con agentes dispersantes o humectantes; suspensantes y conservantes. También pueden añadirse otros excipientes, por ejemplo edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Como formas líquidas para la administración oral se pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados, tales como agua destilada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles (macrogoles) y propilénglicol. Dichas composiciones pueden también contener coadyuvantes como agentes humectantes, suspensantes, edulcorantes, aromatizantes, conservantes y reguladores de pH.

Preparaciones inyectables, de acuerdo con la presente invención, para la administración parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles, en un solvente acuoso o no acuoso como propilénglicol, polietilénglicol o aceites vegetales. Estas composiciones pueden también contener coadyuvantes, como humectantes, emulsionantes, dispersantes y conservantes. Podrían ser esterilizadas por cualquiera de los métodos conocidos o preparadas como composiciones sólidas estériles que serán disueltas en agua o cualquier otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de uso. También es posible partir de materias primas estériles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricación.

Para la administración rectal, el principio activo puede ser formulado preferentemente como supositorio en una base oleosa, como por ejemplo aceites vegetales o glicéridos semi-sintéticos sólidos, o en una base hidrófila como polietilénglicoles (macrogol).

Los compuestos de la invención pueden también ser formulados para su aplicación tópica para el tratamiento de patologías en zonas u órganos accesibles por esta vía, como ojos, piel y tracto intestinal. Formulaciones incluyen cremas, lociones, geles, polvos, soluciones y parches en las que el compuesto se encuentra dispersado o disuelto en excipientes adecuados. Para la administración nasal o por inhalación, el compuesto puede presentarse formulado en forma de aerosol de dónde es convenientemente liberado con el empleo de propelentes adecuados.

La dosificación y la frecuencia de las dosis variarán en función de la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar, la edad, la condición general y el peso del paciente, así como también del compuesto particular administrado y la vía de administración, entre otros factores. A título de ejemplo, un rango adecuado de dosificación oscila entre alrededor de 0,01 mg/Kg y alrededor de 100 mg/Kg por día, que pueden administrarse como dosis única o en varias tomas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención demuestra que el (–)-C75 es un inhibidor de FAS in vitro con una IC50 de 460 ± 44 μM. Debido al efecto del (–)-C75 sobre la actividad FAS, in vitro, se han llevado a cabo estudio de citotoxicidad con líneas celulares tumorales de mama, ovario y próstata, tales como MCF-7, SKBr3, OVCAR-3 y HCT116, respectivamente. Los resultados obtenidos han mostrado diferentes efectos en la viabilidad celular tras el tratamiento con (–)-C75 y (±)-C75. El enantiómero (–)-C75, que ha demostrado tener una actividad inhibitoria hacia FAS muy marcada, presenta actividad citotóxica en todas las líneas celulares tumorales mencionadas anteriormente, con valores de IC50 de 11,87, 9,80, 4,61 y 19,76 μg/mL para cada una de ellas respectivamente.

La administración central del (–)-C75, a diferencia de (±)-C75, no afecta al peso o a la ingesta de alimento por lo que es un buen compuesto para el tratamiento de algunos tipos de cáncer.

Así pues, se ha demostrado en la presente invención que el enantiómero (–)-C75 actúa como inhibidor de FAS y agente anti-tumoral in vitro pero no muestra efecto anorexigénico cuando se administra a los animales.

La síntesis del enantiómero (–)-C75 comprende las etapas descritas en el esquema 1:

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Esquema 1

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra la estructura molecular de (s)-C75, (s)-C75-CoA y (–)-C75.

FIG. 2A. Representa el efecto de (s)-C75 y (s)-C75-CoA sobre la actividad CPT1A y FAS. Extractos mitocondriales de levadura (3-4 μg) expresando CPT1A fueron pre-incubados durante 5 minutos con concentraciones crecientes de (s)-C75 (0) y (s)-C75-CoA (e) tras lo que se determinó la actividad CPT1.

FIG. 2B. Representa el efecto de (s)-C75 y (s)-C75-CoA sobre la actividad CPT1A y FAS. Extractos citosólicos de hígado de rata (130 μg) fueron pre-incubados durante 30 minutos como en (A). A continuación se analizó la actividad FAS. Los datos se expresan como % de actividad remanente respecto al control (100%) como la media s SEM de, al menos, dos experimentos independientes.

FIG. 3A. Representa el efecto de (s)-C75-CoA y (–)-C75-CoA sobre la actividad CPT1 y de (s)-C75 y (–)-C75 sobre la actividad FAS. Extractos mitocondriales de levaduras que sobre-expresan CPT1A se pre-incubaron con concentraciones crecientes de (s)-C75-CoA (Ⴃ) y (–)-C75-CoA (-). A continuación se analizó la actividad CPT1.

FIG. 3B. Representa el efecto de (s)-C75-CoA y (–)-C75-CoA sobre la actividad CPT1 y de (s)-C75 y (–)-C75 sobre la actividad FAS. Extractos citosólicos de hígado de rata fueron pre-incubados con los mismos compuestos en su forma libre, (s)-C75 (Ⴃ),(–)-C75 (-), y la actividad FAS fue analizada. Los resultados se expresan como % de actividad remanente respecto al control, en ausencia de los compuestos (100% de actividad).

FIG. 4A. Representa el efecto de (+)-C75 y (–)-C75 sobre la viabilidad celular de la líneas tumorales MCF-7. Las células MCF-7 fueron incubadas con concentraciones crecientes de los compuestos durante 3 días.

FIG. 4B. Representa el efecto de (+)-C75 y (–)-C75 sobre la viabilidad celular de la líneas tumorales SKBr3. Las células SKBr3 fueron incubadas con concentraciones crecientes de los compuestos durante 3 días.

FIG. 4C. Representa el efecto de (+)-C75 y (–)-C75 sobre la viabilidad celular de la líneas tumorales Ovcar-3. Las células Ovcar-3 fueron incubadas con concentraciones crecientes de los compuestos durante 3 días.

FIG. 4D. Representa el efecto de (+)-C75 y (–)-C75 sobre la viabilidad celular de la líneas tumorales HCT116. Las células HCT116 fueron incubadas con concentraciones crecientes de los compuestos durante 3 días.

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FIG. 4E. Representa el efecto de (+)-C75 y (–)-C75 sobre la viabilidad celular de la líneas tumorales MCF-7, SKBr3, Ovcar-3 y HCT116. La citotoxicidad de las mismos fue determinada utilizando un ensayo colorimétrico estándar, y las constantes de inhibición (IC50) fueron calculadas. Los resultados se expresan como la media s SEM.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se han utilizado en los ejemplos:

L: incremento BSA: albúmina sérica bovina cDNA: DNA complementario CoA-SH: coenzima A CPT1: carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1A: isoforma hepática del enzima) DMEM 41965: medio de cultivo celular Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: dimetilsulfóxido DTT: ditiotreitol EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético FAS: sintasa de ácidos grasos HAM's F12: medio de cultivo celular IC50: concentración máxima a la que se produce el 50% de inhibición de un enzima. En los experimentos de citotoxicidad corresponde a la concentración máxima a la que la viabilidad del cultivo celular es del 50% i.c.v.: intracerebroventricular MTT: 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NMR: Resonancia magnética nuclear RPMI 1640: medio de cultivo celular Roswell Park Memorial Institute SEM: error estándar de la media

Materiales L-(metil-3H) carnitina hidrocloruro se obtuvo de Amersham Biosciences (GE Healthcare Europe, Barcelona, España). (Malonil-2-14C)-Malonil-Coenzima A es un producto de PerkinElmer Health Sciences (Boston, USA). Los productos de medios de cultivo para levadura eran de DifcoTM Laboratories (Detroit, USA). La solución Bradford para ensayos de proteína fue de Bio-Rad Laboratories (Barcelona, España). RPMI 1640 fue de Gibco-Invitrogen Corporation (Barcelona, España). Albúmina de suero bovino desengrasada (BSA), palmitoil-CoA, malonil-CoA, MTT y otros reactivos fueron de Sigma-Aldrich (Madrid, España).

Métodos Síntesis de (–)-C75 (–)-C75 se preparó a partir de n-nonanal vía una reacción aldólica asimétrica de una oxazolidinona de Evans derivada de la D-fenilalanina.

Síntesis de (±) C75-CoA y (–)-C75-CoA La sal sódica de CoA hidratada (8,6 mg) y Na3PO4:12H2O (7,6 mg) se añadieron a una solución de (±)-C75 (2,5 mg) en D2O (0,8 mL) en un tubo de NMR. La estructura del aducto C75-CoA se determinó inequívocamente por experimentos de NMR de protón 1H y de 13C, gCOSY y gHSQC. De un modo semejante, el (–)-C75-CoA se preparó a partir de (–)-C75 y de CoA-SH.

Animales y tratamientos

Las ratas macho Sprague-Dawley (260–290 g) se adquirieron de Harlan. Los animales se mantuvieron en un ciclo 12 h oscuridad/luz con acceso libre a la comida (Ref. 2014, Harlan) y al agua. Todos los protocolos experimentalesfueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Barcelona de acuerdo con la legislación vigente. Después de una semana de aclimatación, se les implantaron a las ratas cánulas intracerebroventriculares (i.c.v.) en el ventrículo lateral, utilizando cirugía estereotáxica. Los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (Imalgene, 90 mg/Kg) y xilazina (Rompun, 11 mg/Kg). Las coordenadas para la colocación de las cánulas fueron: 1,0 mm posterior al punto bregma, 1,4 mm lateral al seno sagital y 4 mm ventral a la dura madre (Paxinos G y Watson C. quot;The rat brain in stereotaxic coordenatesquot;. 4th edition, London, Academic Press). Se añadieron analgésicos (buprenorfina, 0,3 mg/400 mL) y antibióticos (enrofluoxacina, 10%) al agua de bebida durante los 7 días posteriores a la operación. Una semana después de la operación se realizaron inyecciones i.c.v. a las ratas de (±)-C75, (-)-C75 (10 iL, 33 mM concentración final en medio RPMI 1640) o vehículo (RMPI 1640) utilizando una jeringa de 50 iL (marca Hamilton). En los experimentos de análisis de la ingesta, las ratas recibían inyecciones únicas del vehículo o los compuestos, disueltos en vehículo, 30 minutos antes del inicio de la fase oscura. Se midió el consumo de alimentos y el peso

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corporal 22 horas después de la administración.. En los experimentos de determinación de actividad CPT1, las ratas fueron sacrificadas 1 hora después de la inyección de los compuestos, y el hipotálamo fue diseccionado y procesado para la obtención de extractos enriquecidos en mitocondrias, que se utilizaron para determinar la actividad enzimática. Para la determinación de la actividad FAS, las ratas se sacrificaron 1 hora después de la inyección de los compuestos y el hipotálamo fue diseccionado y congelado a -80 ºC, para posteriores análisis.

Expresión de CPT1 en Sacchromyces cerevisiae

El cDNA de la CPT1A de rata se expresó en levadura, y a continuación se obtuvieron los extractos mitocondriales. siguiendo el protocolo descrito previamente (ver Mera P, Bentebibel A, Lopez-Viñas E, Cordente AG, Gurunathan C, Sebastian D, et al. quot;C75 is converted to C75-CoA in the hypothalamus, where it inhibits carnitine palmitoyltransferase 1 and decreases food intake and body weightquot;. Biochemical pharmacology, 2009; 77:1084-95).

Determinación de la actividad carnitina aciltransferasa 1

Las fracciones enriquecidas en mitocondrias se obtuvieron por centrifugación diferencial de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente (ver Rickwood D G, JM. quot;Subcellular fractionation: a practical approachquot;, 1997). Todas las concentraciones proteicas se determinaron usando el método de Bradford utilizando el reactivo comercial de la empresa BioRad (Ref. 500-0006) utilizando la albúmina bovina sérica (BSA) como estándar.

Para medir la actividad CPT1 se utilizó un método radiométrico descrito con anterioridad (ver Morillas M, Gomez-Puertas P, Roca R, Serra D, Asins G, Valencia A, et al. quot;Structural model of the catalytic core of carnitine palmitoyltransferase I and carnitine octanoyltransferase (COT): mutation of CPT I histidine 473 and alanine 381 and COT alanine 238 impairs the catalytic activityquot;. The Journal of biological chemistry, 2001; 276:45001-8). Se utilizaron aproximadamente 12 ig de proteína mitocondrial de levadura y 100 ig de proteína de hipotálamo de rata, según los casos. La actividad enzimática se ensayó a lo largo de 5 minutos a 30 ºC en un volumen final de 200 iL. Los sustratos fueron 400 iM de L-carnitina y 50 iM de palmitoil-CoA. En los ensayos in vitro el enzima se pre-incubó con concentraciones crecientes de los compuestos (0,1-100 iM) durante 1 minuto. El valor IC50 corresponde a la concentración de inhibidor que inhibe el 50% de la actividad enzimática. En todos los casos, la relación molar de acil-CoA y albúmina se mantuvo en 5:1 para evitar la presencia de aciles-CoA libres y prevenir los efectos detergentes y evitar la formación de micelas.

Determinación de la actividad ácido graso sintasa

Para la realización de los experimentos in vitro, la FAS se purificó a partir de hígado de rata siguiendo el protocolo descrito por Linn (Linn TC. quot;Purification and crystllization of rat liver fatty acid synthasequot;. Archives of biochemistry and biophysics, 1981; 209:613-9). Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales no se añadió el ditiotreitol. Se utilizó un ensayo espectrofotométrico para la determinación de la actividad FAS in vitro (ver Lelliott CJ, Lopez M, Curtis RK, Parker N, Laudes M, Yeo G, et al. quot;Transcript and metabolite analysis of the effects of tamoxifen in rat liver reveals inhibition of fatty acid synthesis in the presence of hepatic steatosisquot;. Faseb J, 2005; 19:1108-19). Las concentraciones de compuestos que se utilizaron oscilaban entre 100 y 5000 μM, y sirvieron para determinar la concentración IC50.

Para los experimentos in vivo se utilizó la fracción hipotalámica conteniendo el enzima FAS. Los hipotálamos congelados se homogenizaron con 400 iL de solución tampón (0,25 sacarosa, 1mM EDTA, 1 mM DTT, e inhibidores de proteasas). Después se centrifugó a 14.000 xg a 2 ºC durante 30 minutos. El sobrenadante se ensayó para medir la actividad FAS, utilizando un método radiométrico (ver Arslanian MJ, Wakil SJ. quot;Fatty acid synthase from chicken liverquot;. Methods in enzymology, 1975; 35:59-65).

Método espectrofotométrico Los extractos citosólicos de hígado de rata (315 ig) se pre-incubaron a 30 ºC durante 30 minutos con concentraciones crecientes de los compuestos (±)-C75 y (–)-C75 disueltos en DMSO (de media 100-5000 iM), usando DMSO como blanco, y (±)-C75-CoA y (–)-C75-CoA disueltos en agua destilada. NADPH (121 iM) y acetil-CoA 61 iM se añadieron al enzima pre-incubado y equilibrado a 37 ºC durante 3 minutos. La reacción se inició poniendo malonil-CoA 55 iM. El volumen final de la reacción fue de 0,33 mL. La oxidación de NADPH se observó a 340 nm durante 10 min.

Método radiométrico Los extractos citosólicos de hipotálamo, conteniendo el enzima FAS, (100 iL) se pre-incubaron a 37 ºC durante 10 minutos añadiéndose a continuación una solución tampón (K2HPO4 0,1 M, pH=7,2, EDTA 0,2 mM pH=8, DTT 4 mM y BSA 0,2 %) que contenía NADPH (225 iM), acetil-CoA (24 im), malonil-CoA (640 iM) y 14C [malonil-CoA] (0,05 iCi). El volúmen final de la reacción fue 500 iL. Después de 20 min a 37 ºC, la reacción se detuvo con la adición de 100 iL de NaOH 0,5 M. Después, se añadieron 200 iL de alcohol (66%) y la mezcla se calentó a 100 ºC durante 15 min para saponificar los lípidos. Entonces, la solución se acidificó con 100 iL de HCl 1 M y los ácidos grasos se extrajeron con 3 lavados de 2 mL de pentano. Las fracciones organicas se combinaron (5 mL) y se lavaron nuevamente con 2 mL de ácido acetico 0,1%. Se evaporaron 4 mL del extracto de pentano y finalmente el residuo se redisolvió en 0,5 mL de pentano y se llevó al contador de centelleo.

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Cultivos celulares:

Las líneas celulares de cáncer MCF-7 y SKBr3 fueron gentilmente cedidas por el Dr. Carlos Ciudad, de la Universidad de Barcelona. Las células Ovcar-3 y HCT116 fueron cedidas por Leitat Technological centre. Todas las líneas se cultivaron a 37 ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 en un medio completo compuesto por HAM'S F12 o DMEM 41965 suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado al calor, 100 unidades/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina. Los cultivos se trataron una o dos veces por semana con tripsinización suave y las células se crecieron hasta su confluencia en placas de cultivo de 10 cm.

Para evaluar el efecto citotóxico de los compuestos, se llevó a cabo el ensayo de citotoxicidad-MTT. Se sembraron 4-8 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos con 100 iL de medio de cultivo en cada uno. Una vez que las células se fijaron a la placa, se eliminó el medio y las células se incubaron durante 72 horas en medio fresco con diferentes concentraciones (2,5, 5, 10, 15, 20 y 30 μg/mL) de (±)-C75 y (–)-C75. Se utilizó como blanco DMSO a una concentración final de 0,2%. A continuación, las células se incubaron durante 3 horas con medio fresco (100 iL) y 20 iL de MTT (5 mg/mL). Tras este tratamiento los sobrenadantes se eliminaron cuidadosamente y los cristales de MTT-formazán, formados por las células metabólicamente viables, se solubilizaron añadiendo 100 iL/pocillo de DMSO, midiéndose a continuación la absorbancia a 570 nm.

Análisis estadístico:

Los datos se expresan como la media ± SEM. La significación de las diferencias se calcula usando el test t de Student no pareado.

Resultados

Ejemplo 1

Síntesis estereoselectiva de (–)-C75 (R)-4-(4-bencil-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-il)-4-oxobutanoato de metilo Sobre una solución de (R)-4-benzil-1,3-oxazolidin-2-ona (0,50 g, 2,82 mmol) en THF anh. (25 mL) se adicionó gota a gota (durante 15 minutos) BuLi en hexano (2,2 mL, 3,52 mmol) a –78 ºC en atmósfera de N2. La disolución resultante se dejó agitando en estas condiciones durante 35 min. A continuación se añadió 4-cloro-4-oxobutanoato de metilo (0,36 mL, 2,84 mmol) y se dejó agitando durante 30 min a –70 ºC y 30 min a t.a. Entonces la reacción se paró adicionando una solución saturada de NH4Cl (3,8 mL). Los disolventes orgánicos se evaporaron y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 x 10 mL). El conjunto de las fases orgánicas se lavó con NaOH 1N (10 mL), disolución saturada de NaCl, se secó (MgSO4) y el disolvente evaporó. El crudo resultante se recristalizó (AcOEt: hexano) obteniéndose el producto deseado (0,58 g, 1,99 mmol, 70%).

OO

MeO Bn NO

O

Sólido blanco; Pf: 81-82 ºC; Rf (hexano/AcOEt 7:3) = 0,33; [a]D = – 55,3 (c = 1.0, CHCl3); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 2,69-2,75 (2 H, m, CH2-CO-N); 2,77 (1 H, dd, J=13,4, 9,5 Hz, CHPh); 3,24-3,31 (3 H, m, CHPh and CH2-COO); 3,72 (3 H, s, OCH3), 4,21 (2 H, m, CH2-O); 4,68 (1 H, m, CH-N); 7,20-7,36 (5 H, m, Ar); 13C RMN (CDCl3, 101 MHz): 8 28,0; 30,8; 37,7; 51,9; 55,1; 66,3; 127,3; 128,9; 129,4; 135,1; 153,4; 171,9; 172,8; IR (film): 2953, 2928, 1780, 1737, 1697, 1390, 1213, 993, 761; HRMS (ESI+) calcd para C15H17NO5Na [M+Na]+ = 314,0999; encontrado: 314,0989.

(R)-4-Benzil-3-((2S,3R)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carbonil)-1,3-oxazolidin-2-ona Se adicionó gota a gota una disolución de Bu2BOTf 1 M en CH2Cl2 (1,3 mL, 1,3 mmol) sobre una solución de (R)-4(4-bencil-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-il)-4-oxobutanoato de metilo (340 mg, 1,17 mmol) y tamiz molecular de 4 A (~0.8 g) en CH2Cl2 anh. bajo atmósfera de N2 a –20 ºC. Tras 30 min de agitación se adicionó lentamente DIPEA (0,25 mL, 1,42 mmol). Al cabo de 45 min a –20 ºC, se añadió n-nonanal (0,3 mL, 1,74 mmol) previamente destilado. La solución resultante se dejó agitando a –20 ºC durante 3 h y se añadió una solución saturada de NH4Cl (1,5 mL). La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 × 5 mL) y el conjunto de las fases orgánicas se secó (MgSO4) y se evaporó el disolvente. Sobre el crudo obtenido (1,07 g) se añadió MeOH (5 mL) y una cantidad catalítica de ácido ptoluenosulfónico. La disolución resultante se calentó a reflujo durante 1h. A continuación el disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en CH2Cl2 (10 mL). La fase orgánica se lavó con una disolución saturada de NaHCO3 (5 mL), H2O (5 mL), se secó (MgSO4) y el disolvente se evaporó. El crudo resultante se purificó por columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt 6:4) obteniéndose el producto deseado (0,28 g, 0,69 mmol, 59 %).

ES 2 405 435 Al

Sólido blanco; Pf: 55-57 ºC; Rf (hexano/AcOEt 6:4) = 0,61; [a]D = – 85,3 (c = 1.0, CHCl3); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 0,88 (3 H, t, J = 6,9 Hz, CH3); 1,26-1,55 (12 H, m, CH2); 1,71 (2 H, m, OCHCH2); 2,71 (1 H, dd, J = 6,8, 17,6 Hz, CHH-CO); 2,83 (1 H, dd, J = 9,2, 13,2 Hz, CHH-Ph); 3,00 (1 H, dd, J = 9,6, 17,6 Hz, CHH-CO); 3,26 (1 H, dd, J = 3,2,

5 13,2 Hz, CHH-Ph); 4,16 (1 H, m, CHR-CO); 4,28 (2 H, m, CH2-OCO); 4,71 (1 H, m, CHR-N); 4,80 (1 H, m, CHR-O-CO); 7,17-7,37 (5 H, m, Ar); 13C RMN (CDCl3, 101 MHz): 8 14,0; 22,6; 25,3; 29,1; 29,2; 29,3; 31,7; 32,4; 35,1; 37,7; 45,0; 55,2; 66,7; 81,5; 127,6; 129,0; 129,3; 134,6; 153,0; 171,0; 174,3; IR (film): 2926, 2855, 1782, 1698, 1559, 1456, 1389, 1210, 1113, 1076, 1054, 762, 703; HRMS (ESI+) calcd para C23H32NO5 [M+H]+ = 402,2275, encontrado: 402,2280.

10 Ácido (2S,3R)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carboxílico Sobre una disolución de (R)-4-bencil-3-((2S,3R)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carbonil)oxazolidin-2-ona (130 mg, 0,324 mmol) en THF/H2O 1:1 (5 mL) a 0 ºC se adicionó H2O2 (265 μL, 2,59 mmol) y LiOH·H2O (11 mg, 0,46 mmol) y se dejó agitando durante 30 min a t.a. A continuación se añadió Na2SO3 1,5 M (1,2 mL) y 1N NaOH hasta pH básico.

15 La fase acuosa se lavó con CH2Cl2 (5 × 10 mL) y acidificó hasta pH=1–2 con HCl conc. La fase acuosa se extrajo posteriormente con CH2Cl2 (5 × 10 mL). El conjunto de fases orgánicas se lavó con una solución acuosa saturada de NaCl, se secó (MgSO4) y después de filtrar se evaporó el disolvente al vacío obteniéndose el producto deseado (0,060 g 0,248 mmol, 77 %). O

20 Sólido blanco; Pf: 98-100 ºC; Rf (hexano/EtAcO/AcOH 8:2:0.1) = 0,24; [a]D = – 39,6 (c = 1,0, MeOH); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 0,88 (3 H, t, J = 6,4 Hz, CH3); 1,28-1,56 (12 H, m, CH2); 1,70-1,86 (2 H, m, CH2); 2,82 (1 H, dd, J= 9,6, 17,6 Hz, CHH-CO); 2,95 (1 H, dd, J= 8.4, 17.9 Hz, CHH-CO); 3,10 (1 H, m, CH-COOH); 4,62 (1 H, m, CHR-O); 13C RMN (CDCl3,101MHz): 8 15,1; 23,6; 26,2; 30,1; 30,2; 30,3; 32,8; 32,9; 36,3; 46,4; 83,0; 175,7; 177,1; IR (film): 3000-3300, 2926, 2853, 1749, 1718, 1393, 1243, 1215, 1195, 759, 669; HRMS (ESI+) calcd para C13H22NaO4

25 [M+Na]+ = 265,1410, encontrado: 265,1414.

Ácido (2S,3R)-4-metilen-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carboxílico Sobre una muestra de ácido (2S,3R)-2-octil-5-oxotetrahidrofuran-3-carboxílico (91 mg, 0,376 mmol) se adicionó una solución 2M de MMC (metilcarbonato de magnesio) en DMF (7,4 mL) y la mezcla se calentó a 130-135 ºC bajo

30 atmósfera de N2 durante 45 h. A continuación se añadió lentamente 6N HCl (10 mL) y CH2Cl2 (15 mL). La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 × 10 mL). El conjunto de fases orgánicas se secó (MgSO4) y después de filtrar, se eliminó el disolvente al vacío obteniéndose 121 mg de aceite marrón. Sobre el crudo se adicionó 1,2 mL de una solución recién preparada que contenía 1 mL AcOH, 0,75 mL formol, 30 mg AcONa y 0,26 mL N-metilanilina. La mezcla se dejó agitando durante 1,45 h a temperatura ambiente. Sobre suspensión resultante se añadieron 5 mL de

35 una solución 10:1 de NaCl (ac.) y HCl conc. y 12 mL de CH2Cl2. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (5 × 10 mL). Las fases orgánicas se lavaron sucesivamente con una solución acuosa de LiCl (5%, 2 × 4 mL), HCl 0,02 N (2 × 4 mL) y H2O (3 × 5 mL). La fase orgánica se dejo agitando durante 5 min con 5 mL de NaHCO3 sat. A continuación la fase acuosa se acidificó hasta pH 1-2 con HCl conc. y extrajo con CH2Cl2 (4 × 10 mL). El conjunto de fases orgánicas se lavó con NaCl sat., se secó (MgSO4) y se evaporo el disolvente, obteniéndose el (–)-C75 (53 mg, 0,208

40 mmol, 55 %).

ES 2 405 435 Al

Sólido blanco; Pf: 88-89 ºC; Rf (CH2Cl2/MeOH 9:1) = 0.27; [a]D = – 11,4 (c=1,0, CHCl3); 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 8 0,88 (3 H, J = 6,9 Hz, CH3); 1,20-1,53 (12 H, m, CH2), 1,67-1,79 (2H, m, CH2); 3,63 (1 H, dt, J=5,6, 2,8 Hz, CH-COOH); 4,81 (1 H, dt, J=7,2, 5,6 Hz, CHR-O); 6,02 (1 H, d, J= 2,7 Hz, =CHH); 6,46 (1 H, d, J=3.0 Hz, =CHH); 13C

5 RMN (CDCl3, 101 MHz): 8 14,0; 22,6; 24,7; 29,1; 29,3; 31,7; 35,7; 49,4; 78,8; 125,9; 132,4; 168,2; 174,5; IR (film): 3000-3400, 2924, 2852, 1743, 1717, 1660, 1621, 1460.

Ejemplo 2 Síntesis y caracterización de (–)-C75 y su aducto con CoA

10 De acuerdo con nuestra estrategia sintética, la configuración absoluta de (–)-C75 se confirmó ser el ácido (2S,3R)-4metilen-2-octil-5-oxotetrahidrofurano-3-carboxílico (Ejemplo 1). Se determinó la estructura y estereoquímica del aducto de (–)-C75-CoA por espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Los datos indicaron una estereoquímica trans, trans del aducto (Figura 1).

15 Ejemplo 3 Efecto in vitro de (±)-C75, (–)-C75 y sus aductos con CoA sobre las actividades enzimáticas FAS y CPT1 A causa de que la forma activa del (±)-C75 sobre la CPT1 es la forma del aducto con CoA (ver Bentebibel A, Sebastian D, Herrero L, Lopez-Viñas E, Serra D, Asins G, et al. quot;Novel effect of C75 on carnitine palmitoyltransferase I activity and palmitate oxidationquot;. Biochemistry, 2006), se sintetizó el derivado (±)-C75-CoA tal y como se describe

20 en Materiales y Métodos. A continuación se analizó el efecto de este compuesto, y su forma libre, sobre la actividad CPT1 del enzima sobre-expresado en levaduras. Los resultados mostraron que este compuesto se comporta tal y como se había observado anteriormente e inhibe la actividad enzimática. Asimismo, se observó que la forma libre, (±)-C75, no tiene efecto sobre la actividad este enzima (figura 2A y 2B). También analizamos la acción de estos dos compuestos sobre extractos citosólicos hepáticos conteniendo el enzima FAS. Los resultados obtenidos,

25 consistentes con estudios previos, demostraron que el (±)-C75 es un inhibidor de FAS mientras que el aducto (±)-C75-CoA no tiene actividad inhibitoria sobre esta actividad enzimática.

Ejemplo 4 Efecto in vitro de (±)-C75-CoA y (–)-C75-CoA sobre CPT1 y de (±)-C75 y (–)-C75 sobre FAS

30 Analizamos el efecto in vitro de (±)-C75, (–)-C75 y de sus derivados CoA sobre las actividades enzimáticas FAS y CPT1 respectivamente. Para llevar a cabo estos estudios, sintetizamos primero (±)-C75-CoA y (–)-C75-CoA siendo caracterizados seguidamente como se describió en Materiales y Métodos. Se estudió a continuación el efecto de estos aductos de CoA sobre la actividad enzimática CPT1 del enzima sobre-expresado en levadura. Los resultados mostraron que, a diferencia de la mezcla racémica, el (–)-C75-CoA no afecta la actividad CPT1 (Tabla 1 y Figura 3A

35 y 3B).

Tabla 1: Valores de la constante de inhibición IC50 para (±)-C75-CoA y (–)-C75-CoA sobre la actividad CPT1 y para (±)-C75 y (–)-C75 sobre la actividad FAS. La actividad CPT1 se analizó en extractos mitocondriales de levaduras

40 que sobre–expresan el enzima CPT1A de rata. La actividad FAS se analizó en extractos citosólicos de hígado de rata. Los resultados se expresan como la media ± SEM de, al menos, dos experimentos independientes.

Los ensayos de actividad equivalentes se llevaron a cabo con las formas libres, (±)-C75 y (–)-C75, y extractos citosólicos de hígado de rata, que contenían el enzima FAS. Los resultados mostraron que, tal y como se describe

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en estudios anteriores, el (±)-C75 inhibe la actividad FAS con una IC50 de 498 ± 46 μM (Tabla 1 y Figura 3A y 3B). El enantiómero (–)-C75, que no tiene efecto sobre la actividad CPT1, sí mostró una gran actividad inhibitoria sobe el enzima FAS con una IC50 de 460 ± 44, semejante a la mezcla racémica (Tabla 1 y Figura 3A y 3B).

5 Ejemplo 5

Efecto citotóxico de (±)-C75 y (–)-C75 sobe líneas celulares tumorales Tras el análisis de la acción in vitro de la mezcla racémica (±)-C75 y (–)-C75 sobre la actividad FAS, analizamos el efecto de estos compuestos sobre la viabilidad de diferentes líneas celulares tumorales. Ya se había reportado que la inhibición de FAS en las células cancerosas disminuye su viabilidad y que tiene un efecto citotóxico. Para estudiar

10 la acción anti-cancerígena de (–)-C75, llevamos a cabo un ensayo de citotoxicidad-MTT con diferentes células cancerosas. Los resultados mostraron que el (–)-C75, enantiómero con propiedades inhibitorias sobre el enzima FAS tiene un efecto citotóxico en las células MCF-7, SKBr3, Ovcar y HCT116 con una IC50 de 11,87, 9,80, 4,61 y 19,76 ig/mL respectivamente (Figura 4A, 4B, 4C, 4D, 4E).

15 Ejemplo 6 Efecto de la administración central de (±)-C75 y (–)-C75 sobre el peso, la ingesta y la actividad hipotalámica FAS y CPT1 Para analizar el efecto de (±)-C75 y (–)-C75 sobre el apetito y el peso corporal realizamos inyecciones i.c.v. de 10 iL (a una concentración de 33 mM) de ambos compuestos, 30 minutos antes del inicio de la fase oscura (ver

20 Materiales y Métodos). Los animales control recibieron inyecciones del vehículo en el que disolvieron los compuestos (DMSO:RPMI, 1:3). Los resultados obtenidos mostraron una disminución en el peso y la ingesta de los animales tratados con el compuesto racémico (±)-C75, tal y como se describe en estudios publicados anteriormente (Aja S, Bi S, Knipp SB, McFadden JM, Ronnett GV, Kuhajda FP, Moran TH. quot;Intracerebroventricular C75 decreases meal frequency and reduces AgRP gene expression in ratsquot;. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006;

25 291(1):R148-54). Sin embargo, el enantiómero (–)-C75 no causó ningún efecto sobre el peso corporal o el apetito de los animales tratados. Las actividades CPT1 y FAS en el hipotálamo fueron analizadas tras la administración de (±)-C75 y (–)-C75. Los resultados obtenidos mostraron que el compuesto (–)-C75 no afecta ni la actividad CPT1 ni la actividad FAS hipotalámicas, mientras que (±)-C75 no produjo inhibición del enzima FAS pero sí de CPT1 (ver Tabla 2). Sorprendentemente, los compuestos (±)-C75 y (–)-C75 sí causan una inhibición de FAS in vitro, sugiriendo que

30 las diferencias observadas en ambos modelos podría deberse a la dosis utilizada para los experimentos in vivo. Sin embargo, cabe resaltar que a la misma dosis los animales inyectados con (±)-C75 i.c.v. sí experimentaron una disminución del peso y el apetito, sugiriendo que este efecto podría deberse a su acción inhibitoria sobre la CPT1 hipotalámica.

Tabla 2. Efecto de (±)-C75 y (–)-C75 sobre la ingesta, el peso y las actividades FAS y CPT1 en el hipotálamo. 30 minutos entes del inicio de la fase oscura, las ratas recibieron una inyección i.c.v. de 10 μL de (±)-C75 o (–)-C75 (33 mM). Los animales control fueron inyectados con el vehículo en el que se disolvieron los compuestos (DMSO:RPMI, 1:3). La ingesta de alimento y el peso corporal se midieron 22 horas después de la inyección. Para los ensayos de

40 actividad de FAS y CPT1 los animales recibieron inyecciones i.c.v. de la misma manera que para los experimentos de ingesta, sin embargo 1 hora después de la inyección fueron sacrificados y el hipotálamo fue diseccionado y utilizado para los análisis de actividad enzimática. * P lt; 0.05.

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES
2. 1.- Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I:

   5 Fórmula I

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
3. 2.- Uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica de la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento.

   10 3.- Uso de un compuesto de fórmula I o de la composición farmacéutica de la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
4. 4.- El uso de acuerdo con la reivindicación 3, para el tratamiento del cáncer de ovario. 15 5.- El uso de acuerdo con la reivindicación 3, para el tratamiento del cáncer de próstata.
5. 6.- El uso de acuerdo con la reivindicación 3, para el tratamiento del cáncer de mama.

   FIG.1

   FIG. 2ª

   FIG. 2B

   FIG. 3A

   FIG. 3B

   FIG. 4A

   FIG. 4B

   FIG. 4C

   FIG. 4D

   FIG. 4E

   OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

   N.º solicitud: 201131910

   ESPAÑA

   Fecha de presentación de la solicitud: 25.11.2011

   Fecha de prioridad:

   INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

   51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

   DOCUMENTOS RELEVANTES

   Categoría

   56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

   A

   FLAVIN, R. et al. “Fatty acid synthase as a potential therapeutic target in cancer”. Future Oncology, Abril 2010, Volumen 6, Número 4, páginas 551-562. Ver página 555, resumen; página 553, párrafos 3-4. 1-6

   A

   KUHAJDA, F.P. et al. “Synthesis and antitumor activity of an inhibitor of fatty acid synthase”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Marzo 2000, Volumen 97, Número 7, páginas 3450-3454. Ver página 3450, resumen. 1-6

   A

   BENTEBIBEL, A. et al. “Novel Effect of C75 on Carnitine Palmitoyltransferase I Activity and Palmitate Oxidation”. Biochemistry, 2006, Volumen 45, Número 14, páginas 4339-4350. [Disponible en línea el 14.03.2006]. Ver página 4340, resumen. 1-6

   A

   CHAKRABARTY, K. et al. “The First Kinetic Enzymatic Resolution of Methyl Ester of C75”. Letters in Organic Chemistry, 2010, Volumen 7, páginas 245-248. Ver página 245, resumen; página 246, esquema 2. 1-6

   Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

   El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

   Fecha de realización del informe 30.04.2012

   Examinador G. Esteban García Página 1/4

   INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

   Nº de solicitud: 201131910

   CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD C07D307/68 (2006.01)

   A61K31/365 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

   C07D, A61K, A61P

   Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES,EPODOC,WPI,REGISTRY,CAPLUS,MEDLINE,BIOSIS,XPESP,NPL,EMBASE,CHEMSPIDER,PUBMED

   Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

   OPINIÓN ESCRITA

   Nº de solicitud: 201131910

   Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 04.05.2012

   Declaración

   Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO

   Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

   Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO

   Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

   Base de la Opinión.-

   La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

   Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

   OPINIÓN ESCRITA

   Nº de solicitud: 201131910

   1. Documentos considerados.-

   A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

   Documento

   Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

   D01

   FLAVIN, R. et al. Future Oncology, Abril 2010, Vol. 6, Nº 4, pp. 551-562 00/04/2010

   D02

   KUHAJDA, F.P. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Marzo 2000, Vol. 97, Nº 7, pp. 3450-3454 00/03/2000

   D03

   BENTEBIBEL, A. et al. Biochemistry, 2006, Vol. 45, Nº 14, pp. 4339-4350 14/03/2006

   D04

   CHAKRABARTY, K. et al. Letters in Organic Chemistry, 2010, Vol. 7, pp. 245-248 00/00/2010

6. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

   El objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I, que es el enantiómero (-)-C75, y el uso del compuesto de fórmula I o de la composición que lo comprende para la preparación de un medicamento, en concreto, para el tratamiento del cáncer.

   El documento D01 divulga el compuesto racémico C75 y su capacidad para inducir apoptosis en algunas líneas celulares tumorales debido a que funciona como inhibidor de la enzima ácido graso sintetasa (FASN). Sin embargo esta molécula presenta algunas limitaciones farmacológicas, además de provocar pérdida de peso como efecto secundario, por lo que su desarrollo como medicamento se ve dificultado (página 555, resumen; página 553, párrafos 3-4).

   El documento D02 divulga la actividad antitumoral del compuesto C75, que aparece concomitante con la inhibición de la síntesis de ácidos grasos en tejidos tumorales, incluyendo e hígados normales, debido a que este compuesto inhibe la enzima ácido graso sintasa (FAS), que aparece sobreexpresada en muchos tipos de cáncer humanos, incluyendo los carcinomas de próstata, mama y ovario (ver página 3450, resumen).

   El documento D03 divulga el efecto de compuesto racémico C75 sobre la actividad de carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que causa la consecuente inhibición de la oxidación de ácidos grasos, debido a su transformación en el derivado C75-CoA (ver página 4340, resumen).

   Los documentos citados divulgan la actividad antitumoral del compuesto racémico C75, que aparece asociada a pérdida de peso, provocada por su actividad inhibidora de síntesis de ácidos grados, y que constituye un efecto secundario que impide su utilización para el tratamiento del cáncer.

   El objeto de la invención es el uso del enantiómero (-)-C75 para el tratamiento del cáncer. A pesar de que dicho enantiómero se halla explícitamente divulgado en el estado de la técnica (ver documento D04), no se ha encontrado en el estado de la técnica divulgación de una composición farmacéutica que lo comprenda ni de su uso para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Se considera que la ausencia del efecto secundario mencionado en el enantiómero (-)-C75 constituye un efecto sorprendente que confiere al uso del mismo actividad inventiva respecto al compuesto racémico, sobre todo teniendo en cuenta que el compuesto cuenta con más de un centro quiral.

   Por tanto, los documentos citados muestran sólo el estado de la técnica del campo al que pertenece la invención. Ninguno de ellos, tomado solo o en combinación con los otros contiene divulgación ni sugerencia alguna que pudiera dirigir al experto en la materia hacia la invención recogida en la solicitud, que es la composición farmacéutica que comprende el enantiómero (-)-C75 y su uso para la preparación de un medicamento.

   En consecuencia, se considera que el objeto de las reivindicaciones 1-6 reúne los requisitos de novedad y actividad inventiva recogidos en los Artículos 6.1 y 8.1 de la Ley de Patentes.

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