ES2402191T3 - Procedimiento para producir L- arginina utilizando una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que presenta una expresión atenuada de un gen codificante de un transportador de la L- arginina - Google Patents
Procedimiento para producir L- arginina utilizando una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que presenta una expresión atenuada de un gen codificante de un transportador de la L- arginina Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para producir L-arginina, que compreProcedimiento para producir L-arginina, que comprende: - cultivar una bacteria productora de L-arginnde: - cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas en un ina de la familia de las enterobacteriáceas en un medio, y - recoger la L-arginina del medio, en el medio, y - recoger la L-arginina del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuarque dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del genartI mediante la inactivación la expresión del genartI mediante la inactivación del gen artI. del gen artI.
Description
Procedimiento para producir L-arginina utilizando una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que presenta una expresión atenuada de un gen codificante de un transportador de la L-arginina.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a la industria microbiológica, y específicamente a un procedimiento para producir L-arginina. El procedimiento utiliza una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que ha sido modificado para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina.
Convencionalmente, los L-aminoácidos se han producido industrialmente mediante procedimientos de fermentación utilizando cepas de microorganismos de fuentes naturales, o mutantes de los mismos. Típicamente, los microorganismos se modifican para incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos diana.
Se han publicado muchas técnicas para incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos, incluyendo la transformación de microorganismos con ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765). Entre otras técnicas para incrementar los rendimientos de producción se incluyen incrementar las actividades de enzimas que participan en la biosíntesis de los aminoácidos y/o desensibilizar los enzimas diana respecto a la inhibición por retroalimentación por el L-aminoácido producido (ver, por ejemplo, el documento WO 95/16042 o las patentes US nº 4.346.170, nº 5.661.012 y nº 6.040.160).
Otras maneras de incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos son atenuar la expresión de uno o varios genes que participan en la degradación del L-aminoácido, genes que desvían los precursores del L-aminoácido diana de la ruta biosintética de L-aminoácidos, genes implicados en la redistribución de los flujos de carbono, nitrógeno y fosfato, y genes codificantes de toxinas, etc.
Un sistema de transporte dependiente de una proteína de unión en Escherichia coli específica para la L-arginina se caracterizó por medios genéticos y bioquímicos. El sistema está formado de cinco genes contiguos, artPIQMJ ("art" se refiere al transporte de arginina), que se organizan en dos unidades transcripcionales (artPIQM y artJ). Los productos de los genes artI y artJ, ArtI y ArtJ, son proteínas de unión periplasmáticas con similitud de secuencia con proteínas de unión para aminoácidos polares o básicos. Los productos de artQ, artM y artP son similares a las proteínas transmembranales conocidas y la ATPasa de los portadores dependientes de proteína de unión. Las proteínas ArtI y ArtJ maduras se localizan en el periplasma y no presentan un péptido de señal de 19 residuos aminoácidos. ArtI y ArtJ se aíslan de cepas sobreproductoras. ArtJ se une específicamente a L-arginina con elevada afinidad y la sobreproducción de ArtJ estimula la incorporación de L-arginina por parte de las bacterias. No se conoce cuál es el sustrato para ArtI y la proteína ArtI aislada no se une a los aminoácidos comunes, a diversos aminoácidos no comunes básicos ni a aminas. Se ha concluido que los genes artPIQM artJ codifican un tercer sistema de incorporación de la arginina, además del sistema conocido argT hisJQMP de Salmonella typhimurium y
E. coli y el portador arginina (-ornitina) (aps) de E. coli (Wissenbach U. et al., Mol. Microbiol. 17(4):675-86, (1995).
Sin embargo, actualmente no existen publicaciones de atenuación de la expresión de un gen codificante de un transportador de la L-arginina para la producción de L-arginina.
El documento EP 1 829 965 A1 da a conocer una lista de genes, entre ellos el gen artI, que pueden delecionarse en mutantes de E. coli para producir sustancias útiles, entre ellas la L-arginina.
El documento WO 2007/013639 A1 da a conocer un procedimiento para producir L-arginina utilizando Escherichia coli en el que se ha atenuado el gen cpxR.
La presente invención incluye incrementar la productividad de las cepas productoras de L-arginina y proporcionar un procedimiento para producir ácido L-arginina utilizando dichas cepas.
La presente invención proporciona lo siguiente:
[1] un procedimiento para producir L-arginina, que comprende:
- -
- cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de la enterobacteriáceas en un medio, y
- -
- recoger L-arginina a partir del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen artI mediante inactivación del gen artI.
[2] El procedimiento según [1], en el que dicho gen artI codifica una proteína que presenta una homología no inferior a 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos completa SEC ID nº 4.
[3] El procedimiento según [1], en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del complejo artPIQM-artJ.
[4] El procedimiento según [3], en el que se ha atenuado la expresión del complejo artPIQM-artJ mediante inactivación del complejo artPIQM-artJ.
[5] El procedimiento según cualquiera de [1] a [4], en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
[6] El procedimiento según cualquiera de [1] a [4], en el que dicha bacteria pertenece al género Pantoea.
[7] El procedimiento según [5], en el que dicha bacteria es Escherichia coli. A continuación se describe en detalle la presente invención.
La figura 1 muestra las posiciones relativas de las parejas de cebadores P1 y P2, y P5 y P6 en el plásmido pMW118-attL-Cm-attR.
La figura 2 muestra la construcción del fragmento de ADN cromosómico que comprende el gen artI inactivado o el complejo artPIQM-artJ.
1. Bacteria utilizada en la presente invención
La bacteria es una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina.
La expresión "bacteria productora de L-arginina" se refiere a una bacteria que es capaz de producir y secretar L-arginina al medio, durante el cultivo de la bacteria en el medio.
La expresión "bacteria productora de L-arginina" también puede referirse a una bacteria que es capaz de producir y provocar la acumulación de la L-arginina en un medio de cultivo en una cantidad superior a la de una cepa de tipo salvaje o parental de una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, por ejemplo E. coli, tal como E. coli K12, y preferentemente se refiere a que la bacteria es capaz de provocar la acumulación en el medio de una cantidad no inferior a 0,5 g/l, más preferentemente no inferior a 1,0 g/l, de L-arginina.
La familia de las enterobacteriáceas incluye bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia, etc. Específicamente, pueden utilizarse aquéllas clasificadas como enterobacteriáceas según la taxonomía utilizada en la
- base
- de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
- (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?
- id=91347). Resulta preferida una bacteria que
- pertenezca al género Escherichia o Pantoea.
La expresión "una bacteria perteneciente al género Escherichia" se refiere a que la bacteria se clasifica en el género Escherichia según la clasificación conocida por el experto en el campo de la microbiología. Un ejemplo de una bacteria perteneciente al género Escherichia es, aunque sin limitarse a ella, Escherichia coli (E. coli).
La bacteria perteneciente al género Escherichia no se encuentra particularmente limitada; sin embargo, se encuentran comprendidas, por ejemplo, las bacterias indicadas por Neidhardt F.C. et al. (Escherichia coli y Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabla 1).
La expresión "una bacteria perteneciente al género Pantoea" se refiere a que la bacteria se clasifica como del género Pantoea según la clasificación conocida por el experto en el campo de la microbiología. Algunas especies de Enterobacter agglomerans se han reclasificado recientemente como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Panttoea stewartii o similar basándose en el análisis de la secuencia de nucleótidos del ARNr 16S, etc.
La expresión "bacteria que ha sido modificada para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina" puede referirse a que la bacteria ha sido modificada de manera que la bacteria modificada contenga una cantidad reducida de transportador de la L-arginina o cualquier subunidad del mismo en comparación con una bacteria no modificada, o también puede referirse a que la bacteria es incapaz de sintetizar el transportador de la L-arginina o cualquier subunidad del mismo.
El sistema transportador de la L-arginina está formado de los productos de cinco genes contiguos, artPIQMJ, que se organizan en dos subunidades transcripcionales, artPIQM y artJ. Los productos de los genes artI y artJ, ArtI y ArtJ, son proteínas de unión periplasmáticas con secuencias similares a las proteínas de unión a aminoácidos polares o básicos. Los productos de artQ, artM y artP son similares a las proteínas transmembranales y a la ATPasa de los portadores dependientes de proteína de unión.
La expresión "inactivación de un gen" se refiere a que el gen modificado codifica una proteína completamente no funcional. También resulta posible que la región de ADN modificado sea incapaz de expresar naturalmente el gen debido a la deleción de una parte del gen o del gen completo, a un desplazamiento del marco de lectura del gen, a la introducción de unas o más mutaciones de falta de sentido/sin sentido, o a la modificación de una región contigua del gen, incluyendo las secuencias que controlan la expresión génica tales como promotores, intensificadores, atenuadores, sitios de unión ribosómica, etc.
La presencia o ausencia de un gen en el cromosoma de una bacteria puede detectarse mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo la PCR, la transferencia southern y similares. Además, el nivel de expresión génica puede estimarse mediante la medición de la cantidad de ARNm transcrita, a partir del gen utilizando diversos procedimientos bien conocidos, entre ellos la transferencia northern, la RT-PCR cuantitativa y similares. La cantidad de proteína codificada por el gen puede medirse mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo la SDS-PAGE seguido de un ensayo de inmunotransferencia (análisis de transferencia western) y similares.
El gen artP (sinónimos: ECK0855, b0864) codifica la subunidad de la proteína ArtP del transportador ABC de la arginina (sinónimo B0864) situado en el citoplasma. El gen artP (nucleótidos complementarios a los nucleótidos
902.229 a 902.957 en el GenBank número de acceso NC_000913.2; gi:49175990, SEC ID nº 1) se encuentra situado entre los genes ybjP y artI en el cromosoma de la cepa E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen artP y la secuencia de aminoácidos de la proteína ArtP codificada por el gen artP, se muestran en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2, respectivamente.
El gen artI (sinónimos: ECK0854, b0863) codifica la subunidad de la proteína ArtI del transportador ABC de la arginina (sinónimo: B0863) situado en el espacio periplasmático. El gen artI (nucleótidos complementarios a los nucleótidos 901.480 a 902.211 en GenBank número de acceso NC_000913.2; gi:49175990, SEC ID nº 3) se encuentra situado entre los genes artQ y artP en el cromosoma de la cepa E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen artI y la secuencia de aminoácidos de la proteína ArtI codificada por el gen artI, se muestra en SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4, respectivamente.
El gen artQ (sinónimos: ECK0853, b0862) codifica la subunidad de la proteína ArtQ del transportador ABC de la arginina (sinónimo: B0862) situado en la membrana interna. El gen artQ (nucleótidos complementarios a los nucleótidos 900.757 a 901.473 en GenBank número de acceso NC_000913.2; gi:49175990, SEC ID nº 5) se encuentra situado entre los genes artI y artM en el cromosoma de la cepa E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen artQ, y la secuencia de aminoácidos de la proteína ArtQ codificada por el gen artI, se muestran en SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, respectivamente.
El gen artM (sinónimos: ECK0852, b0861) codifica la subunidad de la proteína ArtM del transportador ABC de la arginina (sinónimo: B0861) situado en la membrana interna. El gen artI (nucleótidos complementarios a los nucleotidos 900.089 a 900.757 en GenBank número de acceso NC_000913.2, gi:49175990, SEC ID nº 7) se encuentra situado entre los genes artQ y artJ en el cromosoma de la cepa E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen artM y la secuencia de aminoácidos de la proteína ArtM codificada por el gen artM se muestra en SEC ID nº 7 y en SEC ID nº 8, respectivamente.
El gen artJ (sinónimos: ECK0851, b0860) codifica la subunidad de la proteína ArtJ del transportador ABC de la arginina (sinónimo: B0860) situado en el espacio periplasmático. El gen artJ (nucleótidos complementarios a los nucleótidos 899.067 a 899.798 en GenBank número de acceso NC_000913.2; gi:49175990, SEC ID nº 9) se encuentra situado entre los genes artM y rlmC en el cromosoma de la cepa E. coli K-12. La secuencia de nucleótidos del gen artJ y la secuencia de aminoácidos de la proteína ArtJ codificada por el gen artJ, se muestran en SEC ID nº 9 y en SEC ID nº 10, respectivamente.
Debido a que existen algunas diferencias en las secuencias de ADN de diferentes géneros o cepas de la familia de las enterobacteriáceas, el gen que debe inactivarse en el cromosoma no se encuentra limitado a los genes mostrados en SEC ID nº 1, nº 3, nº 5, nº 7 o nº 9, sino que puede incluir genes homólogos a SEC ID nº 1, nº 3, nº 5, nº 7 y nº 9, que codifican una proteína variante de la proteína correspondiente. La expresión "proteína variante" se refiere a una proteína que presenta cambios en la secuencia, sean deleciones, inserciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, pero que sigue manteniendo la actividad del producto como proteína.
El número de cambios en la proteína variante depende de la posición en la estructura tridimensional de la proteína o del tipo de residuos aminoácidos. Puede ser de 1 a 30, preferentemente de 1 a 15, y más preferentemente de 1 a 5. Estos cambios en las variantes son mutaciones conservadoras, que conservan la función de la proteína. En otras palabras, estos cambios en las variantes pueden producirse en regiones de la proteína que no resultan críticas para la función de la proteína. Esto se debe a que algunos aminoácidos presentan una elevada homología unos respecto a otros, de manera que la estructura tridimensional o la actividad no resulta afectada por dicho cambio. Una mutación conservadora es una mutación en la que la sustitución tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp y Tyr, en el caso de que el sitio de sustitución sea un aminoácido aromático; entre Leu, Ile y Val en el caso de que el sitio de sustitución sea un aminoácido hidrofóbico; entre Gln y Asn en el caso de que sea un aminoácido polar; entre Lys, Arg y His en el caso de que sea un aminoácido básico; entre Asp y Glu en el caso de que sea un aminoácido ácido, y entre Ser y Thr en el caso de que sea un aminoácido que presente un grupo hidroxilo. Las mutaciones conservadoras típicas son sustituciones conservadoras. Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr, y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val. Las sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones y similares de los aminoácidos indicados anteriormente incluyen las mutaciones naturales (mutantes o variantes), dependiendo de diferencias en las especies, o de diferencias individuales entre los microorganismos que conservan el gen artI. Dicho gen puede obtenerse mediante modificación de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 1, utilizando, por ejemplo, la mutagénesis sitio-dirigida de manera que el residuo aminoácido específico de sitio en la proteína codificada incluya sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones. La proteína variante codificada por el gen puede presentar una homología no inferior a 80%, preferentemente no inferior a 90%, y más preferentemente no inferior a 95%, con respecto a la secuencia de aminoácidos completa mostrada en SEC ID nº 2, nº 4, nº 6, nº 8 o nº 10, con la condición de que la proteína previamente a la inactivación sea capaz de funcionar como transportador ABC de la arginina al acomplejarse con el resto de las 4 subunidades de las 5 proteínas de tipo salvaje que componen el transportador de la L-arginina.
La homología entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando procedimientos bien conocidos, por ejemplo el programa informático BLAST 2.0, que calcula tres parámetros: puntuación, identidad y similitud.
Además, cualquiera de los genes artP, artI, artQ, artM o artJ puede ser una variante que se hibride con la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia mostrada en SEC ID nº 1, nº 3, nº 5, nº 7 o nº 9, respectivamente, o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos, bajo condiciones restrictivas, con la condición de que codifique una proteína funcional previamente a la inactivación. La expresión "condiciones restrictivas" incluye aquéllas bajo las que se forma un híbrido específico, por ejemplo un híbrido que presente una homología no inferior a 60%, preferentemente no inferior a 70%, más preferentemente no inferior a 80%, todavía más preferentemente no inferior a 90%, y todavía más preferentemente no inferior a 95%, y bajo las que un híbrido no específico, por ejemplo un híbrido que presenta una homología inferior a la anteriormente indicada, no se forma. Por ejemplo, las condiciones restrictivas se ejemplifican mediante el lavado una vez, preferentemente dos o tres veces a una concentración salina correspondiente a 1x SSC, SDS al 0,1%, preferentemente 0,1x SSC, SDS al 0,1%, a 60ºC. La duración del lavado depende del tipo de membrana utilizado para la transferencia y, a modo de regla general, puede ser la recomendada por el fabricante. Por ejemplo, la duración recomendada del lavado para la membrana de nilón HybondTM N+ (Amersham) bajo condiciones restrictivas es de 15 minutos. Preferentemente el lavado puede llevarse a cabo 2 a 3 veces. La longitud de la sonda puede seleccionarse convenientemente dependiendo de las condiciones de hibridación y habitualmente es de entre 100 pb y 1 kpb.
La expresión de un gen puede atenuarse mediante la introducción de una mutación en el gen en el cromosoma de manera que la actividad intracelular de la proteína codificada por el gen se reduzca en comparación con una cepa no modificada. Entre las mutaciones que resultan en la atenuación de la expresión del gen se incluyen la sustitución de una base o más para provocar una sustitución de un aminoácido en la proteína codificada por el gen (mutación de sentido incorrecto), la introducción de un codón de parada (mutación sin sentido), la deleción o la inserción de una o dos bases para provocar un desplazamiento de marco, la inserción de un gen de resistencia a fármaco o la deleción de una parte del gen o el gen entero (Qiu Z. y Goodman M.F., J. Biol. Chem. 272:8611-8617, (1997); Kwon D.H. et al., J. Antimicrob. Chemother. 46:793-796, (2000)). La expresión del gen artI también puede atenuarse mediante la modificación de una secuencia reguladora de la expresión, tal como el promotor, la secuencia de Shine-Dalgarno (SD), etc. (documento WO 95/34672; Carrier T.A. y Keasling J.D., Biotechnol. Prog. 15:58-64, (1999)).
Por ejemplo, pueden utilizarse los procedimientos siguientes para introducir una mutación mediante recombinación génica. Se prepara un gen mutante codificante de una proteína mutante con actividad reducida, y la bacteria que debe modificarse se transforma con un fragmento de ADN que contiene el gen mutante. A continuación, el gen nativo presente en el cromosoma se sustituye por el gen mutante mediante recombinación homóloga, y la cepa resultante se selecciona. La sustitución génica utilizando la recombinación homóloga puede llevarse a cabo mediante la utilización de un ADN lineal, lo que se conoce como "integración controlada por Red" (Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):6640-6645, 2000) o mediante la utilización de un plásmido que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura (patente US nº 6.303.383 o documento JP nº 05007491A). Además, también puede incorporarse una mutación específica de sitio mediante sustitución génica utilizando la recombinación homóloga, tal como se ha indicado anteriormente, utilizando un plásmido que se incapaz de replicarse en el huésped.
La expresión del gen también puede atenuarse mediante inserción de un trasposón o un factor IS en la región codificante del gen (patente US nº 5.175.107) o mediante procedimientos convencionales, tales como la mutagénesis por irradiación con luz UV o con nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).
El gen también puede inactivarse mediante procedimientos convencionales, tales como la mutagénesis utilizando la irradiación con luz UV o la nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), la mutagénesis sitio-dirigida, la interrupción génica mediante recombinación homóloga y/o la mutagénesis por inserción-deleción (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):5978-83, 2000, y Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):664045, 2000), también denominada "integración conducida por Red".
Los procedimientos para la preparación del ADN plasmídico, la digestión y la ligación del ADN, la transformación, la selección de oligonucleótidos como cebadores, y similares, pueden ser procedimientos ordinarios bien conocidos por el experto en la materia. Estos procedimientos se describen en, por ejemplo, Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Bacterias productoras de L-arginina
Pueden utilizarse bacterias que se modifican para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina y que son capaces de producir L-arginina.
La bacteria puede obtenerse mediante inactivación de uno o varios genes codificantes de un transportador de L-arginina en una bacteria que presenta una capacidad nativa o inherente de producir L-arginina. Alternativamente, la bacteria puede obtenerse proporcionando la capacidad de producir L-arginina a una bacteria que ya presenta uno
o varios genes inactivados codificantes de un transportador de L-arginina.
Entre los ejemplos de cepas parentales que pueden utilizarse para derivar bacterias productoras de L-arginina se incluyen, aunque sin limitación, cepas pertenecientes al género Escherichia, tales como la cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (solicitud de patente US nº 2002/058315 A1) y sus cepas derivadas que portan N-acetilglutamato sintasa mutante (solicitud de patente rusa nº 2001/112869), la cepa E. coli 383 (VKPM B-7926) (documento EP 1 170 358 A1), una cepa productora de arginina en la que se ha introducido el gen argA codificante de la N-acetilglutamato sintetasa (documento EP 1 170 361 A1) y similares.
Entre los ejemplos de cepas parentales que pueden utilizarse para derivar bacterias productoras de L-arginina también se incluyen cepas en las que se ha incrementado la expresión de uno o más genes codificantes de enzimas biosintéticos de la L-arginina. Entre los ejemplos de dichos genes se incluyen los genes codificantes de la N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), de la ornitina acetiltransferasa (argJ), de la N-acetilglutamato quinasa (argB), de la acetilornitina transaminasa (argD), de la ornitina carbamoil transferasa (argF), de la ácido argininosuccínico sintetasa (argG), de la ácido argininosuccínico liasa (argH) y de la carbamoilfosfato sintetasa (carAB). Las abreviaturas entre paréntesis después de los nombres de los enzimas representan los nombres de los genes.
2. Procedimiento de la presente invención
El procedimiento de la presente invención incluye producir L-arginina mediante el cultivo de la bacteria descrita en la presente memoria en un medio de cultivo para producir y secretar L-arginina al medio, y recoger la L-arginina del medio.
El cultivo, la recolección y la purificación de la L-arginina a partir del medio y similares pueden llevarse a cabo mediante procedimientos de fermentación convencionales, en los que se produce un aminoácido utilizando una bacteria.
El medio utilizado para el cultivo puede ser un medio sintético o natural, con la condición de que el medio incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y minerales y, en caso necesario, cantidades apropiadas de nutrientes que la bacteria requiere para el crecimiento. La fuente de carbono puede incluir diversos carbohidratos, tales como la glucosa y la sacarosa, y diversos ácidos orgánicos. Dependiendo del modo de asimilación del microorganismo seleccionado, puede utilizarse alcohol, incluyendo etanol y glicerol. A modo de fuente de nitrógeno, pueden utilizarse diversas sales amónicas tales como amonio y sulfato amónico, otros compuestos del nitrógeno tales como las aminas, una fuente natural de nitrógeno tal como peptona, hidrolizado de soja y microorganismos fermentadores digeridos. A modo de minerales puede utilizarse monofosfato potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro de calcio y similares. A modo de vitaminas puede utilizarse tiamina, extracto de levadura y similares.
El cultivo preferentemente se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, tales como un cultivo bajo agitación, y un cultivo bajo agitación con aireación, a una temperatura de entre 20ºC y 40ºC, preferentemente entre 30ºC y 38ºC. El pH del cultivo habitualmente es de entre 5 y 9, preferentemente de entre 6,5 y 7,2. El pH del cultivo puede ajustarse con amonio, carbonato de calcio, diversos ácidos, diversas bases y tampones. Habitualmente un cultivo de 1 a 5 días conduce a la acumulación de L-arginina en el medio líquido.
Tras el cultivo, pueden retirarse los sólidos, tales como las células, del medio líquido mediante centrifugación o filtración a través de membrana, y después puede recogerse la L-arginina y purificarse mediante procedimientos de intercambio iónico, concentración y/o cristalización.
La presente invención se explicará con mayor detalle a continuación, haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1. Construcción de una cepa con un gen artI inactivado
1. Deleción del gen artI
El gen artI en una cepa bacteriana puede delecionarse mediante el procedimiento desarrollado inicialmente por Datsenko K.A. y Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):6640-6645, 2000) denominado "integración conducida por Red". Según este procedimiento, se construyeron los cebadores de PCR P1 (SEC ID nº 11) y P2 (SEC ID nº 12), los cuales son homólogos tanto de la región contigua al gen artI como del gen que proporciona resistencia a antibiótico en el plásmido molde. Se utilizó el plásmido pMW118-attL-Cm-attR (documento WO 05/010175) como molde en la reacción de PCR. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial del ADN durante 5 minutos a 95ºC, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, apareamiento a 54ºC durante 30 segundos, alargamiento a 72ºC durante 40 segundos y el alargamiento final durante 5 minutos a +72ºC.
El producto de PCR de 1,7 kb (figura 1) se purificó a partir de un gel de agarosa y se utilizó para la electroporación de la cepa E. coli MG1655 (ATCC nº 700926), que contiene el plásmido pKD46. El plásmido pKD46 (Datsenko K.A. y Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(12):6640-45, 2000) contiene un origen de replicación sensible a la temperatura e incluye un fragmento de ADN de 2.154 nucleótidos del fago
g (posiciones de nucleótidos 31.088 a 33.241, GenBank nº de acceso J02459), así como los genes del sistema de recombinación homóloga Red de
g (genes V, f y exo), los cuales se encuentran bajo el control del promotor ParaB inducible con arabinosa. El plásmido pKD46 resulta necesario para la integración del producto de PCR en el cromosoma de la cepa MG1655. La cepa MG1655 puede obtenerse de la American Type Culture Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, U.S.A.).
Se prepararon células electrocompetentes del modo siguiente: se cultivaron durante la noche a 30ºC en medio LB que contenía ampicilina (100 mg/l) células de E. coli MG1655/pKD46 y el cultivo se diluyó 100 veces con 5 ml de medio SOB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) que contenía ampicilina y L-arabinosa (1 mM). Las células se cultivaron bajo aireación a 30ºC hasta una DO600 de "0,6 y despues se convirtieron en electrocompetentes mediante la concentración 100 veces y el lavado tres veces con H2O desionizada helada. La electroporación se llevó a cabo utilizando 70 μl de células y "100 ng del producto de PCR. Tras la electroporacion las celulas se incubaron con 1 ml de medio SOC (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a 37ºC durante 2,5 horas y después se sembraron en placas sobre L-agar que contenía cloranfenicol (30 μg/ml) y se cultivaron a 37ºC para seleccionar los recombinante CmR. A continuación, para eliminar el plásmido pKD46, se llevaron a cabo dos pases sobre L-agar con Cm a 42ºC y las colonias se sometieron a ensayo para la sensibilidad a la ampicilina.
2. Verificación de la deleción del gen artI mediante PCR
Los mutantes en los que se había delecionado el gen artI y que se marcaron con el gen de resistencia Cm se verificaron mediante PCR utilizando los cebadores específicos de locus P3 (SEC ID nº 13) y P4 (SEC ID nº 14). Con este fin, una colonia recién aislada se suspendió en 20 μl de agua y después se utilizó 1 μl de suspensión para la PCR. El perfil de temperatura fue el siguiente: desnaturalización inicial del ADN durante 5 minutos a 95ºC, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, apareamiento a 55ºC durante 30 segundos y alargamiento a 72ºC durante 1 minuto, y alargamiento final durante 5 minutos a 72ºC. El producto de PCR obtenido en la reacción de PCR utilizando las células de la cepa artI+ parental MG1655 como molde presentaba una longitud de 803 pb. El producto de PCR obtenido en la reacción de PCR utilizando las células de la cepa mutante MG1655 LartI::cat como molde presentaba una longitud de 1.453 nucleótidos (figura 2). La cepa mutante se denominó MG1655Larti.
Ejemplo 2: construcción de una cepa con un complejo artPIQM-artJ inactivado
1. Deleción del complejo artPIQM-artJ
5 Se delecionó el complejo artPIQM-artJ en una cepa bacteriana mediante integración conducida por Red. Siguiendo este procedimiento, se construyeron los cebadores de PCR P5 (SEC ID nº 15) y P6 (SEC ID nº 16), los cuales son homólogos a tanto la región contigua al complejo artPIQM-artJ como al gen que proporciona resistencia a antibiótico en el plásmido molde. Se utilizó el plásmido pMW118-attL-Cm-attR (documento WO 05/010175) como el molde en la reacción de PCR. Las condiciones para la PCR fueron las indicadas anteriormente.
10 Se purificó el producto de PCR de 1,7 kb (figura 1) a partir de un gel de agarosa y se utilizó para la electroporación de la cepa E. coli MG1655 (ATCC nº 700926), que contiene el plásmido pKD46.
Se prepararon células electrocompetentes tal como se ha descrito anteriormente. La electroporación se llevó a cabo
15 utilizando 70 μl de células y " 100 ng del producto de PCR. Despues de la electroporacion las celulas se incubaron con 1 ml de medio SOC a 37ºC durante 2,5 horas y seguidamente se sembraron en placas sobre L-agar que contenía cloranfenicol (30 μg/ml) y se cultivaron a 37ºC para seleccionar los recombinantes CmR. A continuación, para eliminar el plásmido pKD46, se llevaron a cabo dos pases son L-agar con Cm a 42ºC y las colonias se sometieron a ensayo para la sensibilidad a la ampicilina.
2. Verificación de la deleción del complejo artPIQM-artJ mediante PCR
Los mutantes en los que se había delecionado el complejo artPIQM-artJ y que se encontraban marcados con el gen de resistencia Cm, se verificaron mediante PCR utilizando los cebadores específicos de locus P7 (SEC ID nº 17) y
25 P8 (SEC ID nº 18) tal como se ha indicado anteriormente. El producto de PCR obtenido en la reacción de PCR utilizando las células de la cepa mutante MG1655-artJ::cat como el molde presentaba una longitud de
LartPiQM
1,5 kb (figura 2). La cepa mutante se denominó MG1655LartPiQM-artJ.
Ejemplo 3. Producción de L-arginina por parte de E. coli 382.artl y E. coli 382.artPlMQ-artJ
30 Para someter a ensayo el efecto de la inactivación del gen artI o del complejo artPIMQ-artJ sobre la producción de la L-arginina, se transfirieron fragmentos de ADN del cromosoma de los anteriormente indicados E. coli MG1655Larti y
E. coli MG1655LartPiMQ-artJ a la cepa productora de -arginina E. coli 382 mediante transducción de P1 (Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, (1972)) con el fin de obtener las
35 cepas de E. coli 382Larti y 382LartPiMQ-artJ, respectivamente. La cepa 382 ha sido depositada en la colección nacional rusa de microorganismos industriales (VKPM) (Rusia, 117545 Moscú, 1 Dorozhny proezd, 1) el 10 de abril de 2000 bajo el número de acceso VKPM B-7926 y después convertida en un depósito bajo el Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001.
40 Las cepas de E. coli 382, 382Larti y 382LartPiMQ-artJ se cultivaron separadamente bajo agitación a 37ºC durante 18 horas en 3 ml de caldo nutritivo y se inocularon 0,3 ml de los cultivos en 2 ml de un medio de fermentación en tubos de ensayo de 20x200 mm y se cultivaron a 32ºC durante 48 horas en un agitador rotatorio.
Tras el cultivo, la cantidad de L-arginina que se había acumulado en el medio se determinó mediante cromatografía
45 de papel utilizando la fase móvil siguiente: butanol:ácido acético:agua=4:1:1 (v/v). Se utilizó una solución de ninhidrina (al 2%) en acetona como agente de visualización. Se recortó un punto que contenía L-arginina, se eluyó la L-arginina con solución acuosa al 0,5% de CdCl2 y se estimó espectrofotométricamente a 540 nm la cantidad de L-arginina.
50 La composición del medio de fermentación (g/l) era la siguiente:
Glucosa 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSO4·7H2O 1,0 HCl de tiamina 0,0002 Extracto de levadura 1,0 L-isoleucina 0,1 CaCO3 5,0
Se esterilizaron la glucosa y el sulfato de magnesio separadamente. El CaCO3 se esterilizó con calor seco a 180ºC durante 2 horas. El pH se ajustó a 7,0.
55 Los resultados de las fermentaciones en tubos de ensayo se muestran en la Tabla 1. Tal como puede observarse en la Tabla 1, las cepas con gen artI o complejo artPIMQ-artJ inactivado causaron un nivel de acumulación más alto de L-arginina que la cepa parental productora de L-arginina E. coli 382.
Tabla 1
- Cepa
- Cantidad de L-arginina (g/l)
- 382
- 12,0 ± 0,1
- 382Larti
- 14,3 ± 0,1
- 382LartPiMQ-artJ
- 13,4 ± 0,1
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-ARGININA UTILIZANDO UNA BACTERIA DE LA FAMILIA DE LAS ENTEROBACTERIÁCEAS, QUE PRESENTA UNA EXPRESIÓN ATENUADA DE GENES CODIFICANTES DE UN TRANSPORTADOR DE LA L-ARGININA
<130> EPA-64841
<160> 18
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 729
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (729)
<400> 1 <210> 2
<211> 242
5 <212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
<210> 3
<211> 732
<212> ADN 15 <213> Escherichia coli
<220>
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<223> cebador
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aggcctgata agcgtagcgc
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para producir L-arginina, que comprende:
- -
- cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas en un medio, y
- -
- recoger la L-arginina del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen artI mediante la inactivación del gen artI.
-
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho gen artI codifica una proteína que presenta una homología no inferior a 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos entera de SEC ID nº 4.
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del complejo artPIQM-artJ.
-
- 4.
- Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la expresión del complejo artPIQM-artJ se atenúa mediante la inactivación del complejo artPIQM-artJ.
-
- 5.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
-
- 6.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria pertenece al género Pantoea.
-
- 7.
- Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha bacteria es la Escherichia coli.
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