RU2431674C2 - БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА - Google Patents
БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2431674C2 RU2431674C2 RU2009145407/10A RU2009145407A RU2431674C2 RU 2431674 C2 RU2431674 C2 RU 2431674C2 RU 2009145407/10 A RU2009145407/10 A RU 2009145407/10A RU 2009145407 A RU2009145407 A RU 2009145407A RU 2431674 C2 RU2431674 C2 RU 2431674C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- arginine
- gene
- bacterium
- artj
- artpiqm
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims abstract description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 63
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims abstract description 55
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims abstract description 55
- 101150066673 artI gene Proteins 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 11
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 101150002692 artJ gene Proteins 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 101150070557 artM gene Proteins 0.000 description 9
- 101150117391 artQ gene Proteins 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150047533 artP gene Proteins 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 101150097746 araB gene Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 2
- 108010092494 Periplasmic binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 2
- -1 glucose and sucrose Chemical class 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OJJHFKVRJCQKLN-YFKPBYRVSA-N (4s)-4-acetamido-5-oxo-5-phosphonooxypentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@H](NC(=O)C)C(=O)OP(O)(O)=O OJJHFKVRJCQKLN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700021045 Acetylglutamate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010049445 Acetylornithine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000007610 Amino-acid N-acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010032178 Amino-acid N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000131329 Carabidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 230000000883 L-arginine transport Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101000859568 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) Carbamoyl-phosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000588771 Morganella <proteobacterium> Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 1
- 241000932831 Pantoea stewartii Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148062 Photorhabdus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 101100217185 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aruC gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101100022072 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) lysJ gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150072344 argA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070427 argC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150089042 argC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050866 argD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150029940 argJ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064934 argT gene Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 108010050322 glutamate acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150094164 lysY gene Proteins 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 101150088841 rlmC gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 101150035128 ybjP gene Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аргинина с использованием бактерии рода Escherichia, которая модифицирована таким образом, что в указанной бактерии инактивированы один или несколько генов, входящих в состав кластера artPIQM-artJ. Изобретение позволяет получать L-аргинин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аргинина. В способе используют бактерию семейства Enterobacteriaceae, модифицированную таким образом, что экспрессия генов, кодирующих траспортер L-аргинина, ослаблена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).
Другими методами увеличения продукции L-аминокислот являются ослабление экспресии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины и т.д.
Зависимая от связывающего белка, специфичная по отношению к аргинину система транспорта в Escherichia coli охарактеризована генетически и биохимически. Систему составляют пять расположенных подряд генов, artPIQMJ ("art" обозначает «транспорт аргинина (arginine transport)»), организованных в две транскриционных единицы (artPIQM. artJ). Продукты генов artI artJ, ArtI и ArtJ, периплазматические связывающие белки с последовательностью, сходной с последовательностью белков, связывающих полярные или основные аминокислоты. Продукты генов artQ, artM и artP сходны с известными трансмембранными белками и АТФазами транспортеров, активность которых зависит от связывания с белками (binding-protein-dependent carriers). Зрелые белки ArtI и ArtJ локализованы в периплазме, и в них отсутствует сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков. ArtI и ArtJ были выделены из штаммов - сверхпродуцентов. ArtJ специфически связывает L-аргинин с высокой аффинностью, и сверхпродукция ArtJ стимулировала поглощение L-аргинина бактериями. Субстрат для ArtI не известен, выделенный ArtI не связывал наиболее распространенные аминокислоты, различные основные нераспространенные аминокислоты или амины. Было сделано заключение о том, что гены artPIQM artJ кодируют третью систему поглощения аргинина в дополнение к известной системе argT hisJQMP в Salmonella typhimurium и Е.coli и переносчику аргинина (орнитина) (aps) в Е.coli (Wissenbach U. et al., Mol Microbiol.; 17(4):675-86(1995)).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование ослабления экспрессии генов, кодирующих траспортер L-аргинина, для получения L-аргинина.
Описание изобретения
Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аргинина и предоставление способа получения L-аргинина с использованием этих штаммов.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции L-аргинина.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аргинина, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что экспрессия гена artI в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что экспрессия гена artI в указанной бактерии ослаблена за счет инактивации гена artI.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия кластера artPIQM-artJ в ней ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия кластера artPIQM-artJ в ней ослаблена за счет инактивации кластера artPIQM-artJ.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аргинина, включающего:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, вызывающее продукцию и секрецию L-аргинина в культуральную жидкость; и
- выделение L-аргинина из культуральной жидкости.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Наилучший способ осуществления изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерия, согласно настоящему изобретению, - это бактерия-продуцент L-аргинина, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена.
"Бактерия-продуцент L-аргинина" означает бактерию, обладающую способностью к продукции и секреции L-аргинина в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.
Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аргинина и вызывает накопление L-аргинина в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и, предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде L-аргинин в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее, чем 1.0 г/л.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpos/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia", означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д.
Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество транспортера L-аргинина или любой его субъединицы по сравнению с немодифицированной бактерией, или это также может означать, что указанная бактерия не способна синтезировать транспортер L-аргинина или любую его субъединицу.
Транспортная система L-аргинина кодируется пятью сопряженными генами artPIQMJ, организованным в две транскрипционные единицы, artPIQM и artJ. Продукты генов artI и artJ, белки ArtI и ArtJ, являются периплазматическими связывающими белками и имеют последовательность, сходную с белками, связывающимися с полярными или основными аминокислотами. Продукты генов artQ, artM, и artP сходны с известными трансмембранными белками и АТФазой связывающих белков-переносчиков.
Фраза «инактивация гена» означает, что модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Возможно также, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции части гена, сдвига рамки считывания, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.
Наличие или отсутствие гена на хромосоме может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество и молекулярную массу белков, кодируемых генами, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.
Ген artP (синонимы: ECK0855, b0864) кодирует белок ArtP - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0864), локализованную в цитоплазме. Ген artP (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 902,229 по 902,957 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:1) расположен между геном ybjP и геном artI на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artP и аминокислотная последовательность белка ArtP, кодируемого геном artP, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.
Ген artI (синонимы: ECK0854, b0863) кодирует белок ArtI - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0863), локализованную в периплазматическом пространстве. Ген artI (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 901,480 по 902,211 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:3) расположен между геном artQ и геном artP на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artI и аминокислотная последовательность белка ArtI, кодируемого геном artI, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, соответственно.
Ген artQ (синонимы: ECK0853, b0862) кодирует белок ArtQ - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0862), локализованную на внутренней мембране. Ген artQ (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 900,757 по 901,473 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:5) расположен между геном artI и геном artM на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artQ и аминокислотная последовательность белка ArtQ, кодируемого геном artQ, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, соответственно.
Ген artM (синонимы: ECK0852, b0861) кодирует белок ArtM - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В08631), локализованную на внутренней мембране. Ген artM (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 900,089 по 900,757 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:1) расположен между геном artQ и геном artJ на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artM и аминокислотная последовательность белка ArtM, кодируемого геном artM, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно.
Ген artJ (синонимы: ECK0851, b0860) кодирует белок ArtJ - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В08630), локализованную в периплазматическом пространстве. Ген artJ (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 899,067 по 899,798 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:9) расположен между геном artM и геном rlmC на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artJ и аминокислотная последовательность белка ArtJ, кодируемого геном artJ, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно.
Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, кодирующие соответствующие белки. Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором сохраняется активность этого белка. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном artI, может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, или 10 при условии, что до инактивации белок способен во взаимодействии с остальными 4 или 5 белками дикого типа, входящими в состав транспортера L-аргинина, функционировать в качестве переносчика аргинина ABC.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
Кроме того, любой из генов artP, artI, artQ, artM или artJ может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, соответсвтенно, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что до инактивации он кодирует функциональный белок. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+(Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации и обычно составляет около 100-1000 п.н.
Экспрессия гена может быть ослаблена введением в ген такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка снижается по сравнению с немодифицированным штаммом. Мутации, результатом которых является ослабление экспрессии гена, включают замену одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делецию одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставку гена устойчивости к антибиотику, или делецию гена или его части (Qiu. Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена также может быть ослаблена модификацией экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, для введения мутаций путем генной рекомбинации могут применяться следующие методы. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается путем гомологичной рекомбинации мутантным геном, отбирается полученный штамм. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645(2000)) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Кроме того, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Инактивация гена также может быть осуществлена такими традиционными методами, как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и мутагенеза за счет вставки-делеции (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аргинина
Может быть использована бактерия, модифицированная таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена, и способная к продукции L-аргинина.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аргинина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции L-аргинина бактерии, в которой уже инактивирован один или несколько генов, кодирующих транспортер L-аргинина.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).
2. Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и секреции L-аминокислоты в питательную среду, и выделения L-аргинина из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аргинина из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислоту получают с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции выбранного микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 изображены относительные положения пар праймеров Р1 и Р2, Р5 и Р6 на плазмиде pMW118-attL-Cm-attR.
На Фигуре 2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген artI или artPIQM-artJ кластер.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном artI
1. Делеция гена artI
Делеция гена artI была выполнена с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой были сконструированы праймеры P1 (SEQ ID NO:11) и Р2 (SEQ ID NO:12), гомологичные областям, прилегающим к гену artI, и к гену в составе плазмиды-матрицы, обеспечивающему устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175). Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: денатурация в течение 30 сек при 95°С, отжиг в течение 30 сек при 54°С, элонгация в течение 40 сек при 72°С; и заключительная элонгация в течение 5 мин при 72°С.
Полученный ПЦР-продукт длиной 1.7 т.п.н. (Фиг.1) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора ParaB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD600≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной H2O. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора CmR-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции гена artI c помощью ПЦР
Мутанты с делегированным геном artI, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO:13) и Р4 (SEQ ID NO:14). Для этого свежевыращенные колонии суспендировали каждую в 20 мкл воды и 1 мкл полученной суспензии использовали в ПЦР. Использовали следующие температурные условия: денатурация при 95°С в течение 5 мин; профиль для 30 циклов: денатурация в течение 30 сек при 95°С, отжиг в течение 30 сек при 55°С, элонгация в течение 1 мин при 72°С; заключительный элонгация в течение 5 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма artI+ MG1655, составляла 803 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔartI::cat, составляла 1453 п.н. (Фиг.2).
Пример 2. Конструирование штамма с инактивированным artPIQM-artJ-кластером
1. Делеция artPIQM-artJ-кластера
Делеция кластера artPIQM-artJ была выполнена с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой были сконструированы праймеры Р5 (SEQ ID NO:15) и Р6 (SEQ ID NO:16), гомологичные областям, прилегающим к кластеру artPIQM-artJ и гену в составе плазмиды-матрицы, обеспечивающему устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175). Использовали температурный профиль для ПЦР, описанный выше.
Полученный ПЦР-продукт длиной 1.7 т.п.н. (Фиг.1) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Warmer, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора ParaB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
Электрокомпетентные клетки были получены с помощью описанного выше метода. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора CmR-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции artPIQM-кластера с помощью ПЦР
Мутанты с делегированным геном artI, содержащие ген Cm-устойчивости, были проверены методом ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров Р7 (SEQ ID NO:17) и Р8 (SEQ ID NO:18), как описано выше. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔartPIQM-artJ::cat, составляла 1,5 т.п.н. (Фиг.2).
Пример 3. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382ΔartI
Для оценки влияния инактивации гена artI или artPIQM-artJ-кластера на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанных выше штаммов Е.coli MG1655 Δartl::cat и Е.coli MG1655ΔartPIMQ-artJ перенесли в штамм-продуцент L-аргинина E.coli 382 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штаммов Е.coli 382ΔartI и 382ΔartPIMQ-artJ, соответственно.
Штаммы 382, 382-ΔartI и 382ΔartPIMQ-artJ, выращивали с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl2, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Состав ферментационной среды (г/л):
| Глюкоза | 48.0 |
| (NH4)2SO4 | 35.0 |
| KH2PO4 | 2.0 |
| MgSO4 7H2O | 1.0 |
| Тиамин HCl | 0.0002 |
| Дрожжевой экстракт | 1.0 |
| L-изолейцин | 0.1 |
| СаСО3 | 5.0 |
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют раздельно. СаСО3 стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.
Результаты ферментации в пробирках представлены в таблице. Как видно из таблицы, в штаммах с инактивированным геном artI или кластером artPIMQ-artJ наблюдался более высокий уровень накопления L-аргинина по сравнению с родительским штаммом Е.coli 382 - продуцентом L-аргинина.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
| Штамм | Количество L-аргинина, г/л |
| 382 | 12.0±0.1 |
| 382ΔartI | 14.3±0.1 |
| 382ΔartPIMQ-artJ | 13.4±0.1 |
Claims (6)
1. Бактерия-продуцент L-аргинина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивированы один или несколько генов, входящих в состав кластера artPIQM-artJ.
2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что в указанной бактерии инактивирован ген artI.
3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанный ген artI инактивирован за счет делеции указанного гена artI в хромосоме бактерии.
4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что в указанной бактерии инактивирован artPIQM-artJ-кластер.
5. Бактерия по п.4, отличающаяся тем, что указанный artPIQM-artJ-кластер инактивирован за счет делеции artPIQM-artJ-кластера в хромосоме бактерии.
6. Способ получения L-аргинина, включающий:
- выращивание бактерии по любому из пп.1 - 5 в питательной среде, вызывающее продукцию и секрецию L-аргинина в культуральную жидкость; и
- выделение L-аргинина из культуральной жидкости.
- выращивание бактерии по любому из пп.1 - 5 в питательной среде, вызывающее продукцию и секрецию L-аргинина в культуральную жидкость; и
- выделение L-аргинина из культуральной жидкости.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009145407/10A RU2431674C2 (ru) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009145407/10A RU2431674C2 (ru) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008148283/13A Substitution RU2008148283A (ru) | 2008-12-09 | 2008-12-09 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА artI |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009145407A RU2009145407A (ru) | 2011-06-20 |
| RU2431674C2 true RU2431674C2 (ru) | 2011-10-20 |
Family
ID=44737397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009145407/10A RU2431674C2 (ru) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2431674C2 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4430430A (en) * | 1980-06-13 | 1984-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine by fermentation |
| RU2208640C2 (ru) * | 2000-07-06 | 2003-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА |
| RU2276686C2 (ru) * | 2003-08-29 | 2006-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-аргинина и способ получения l-аргинина |
| WO2008004682A1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-10 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the yrah-r cluster |
-
2009
- 2009-12-08 RU RU2009145407/10A patent/RU2431674C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4430430A (en) * | 1980-06-13 | 1984-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine by fermentation |
| RU2208640C2 (ru) * | 2000-07-06 | 2003-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА |
| RU2276686C2 (ru) * | 2003-08-29 | 2006-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-аргинина и способ получения l-аргинина |
| WO2008004682A1 (en) * | 2006-07-04 | 2008-01-10 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the yrah-r cluster |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009145407A (ru) | 2011-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maupin-Furlow et al. | Genetic analysis of the modABCD (molybdate transport) operon of Escherichia coli | |
| US8647838B2 (en) | Method for producing L-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an L-arginine transporter | |
| EP1016710B1 (en) | Method for producing L-amino acids | |
| US9051591B2 (en) | Bacterium of enterobacteriaceae family producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites and a method for producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites | |
| RU2496867C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии | |
| JP2005137369A (ja) | エシェリヒア属細菌を用いたｌ−システインの製造法 | |
| RU2471870C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA | |
| CN108463555A (zh) | 生产苯甲醛的方法 | |
| RU2392322C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yahN | |
| RU2550269C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, СОДЕРЖАЩЕЙ N-АЦЕТИЛОРНИТИНДЕАЦЕТИЛАЗУ С НАРУШЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| JP5907076B2 (ja) | リジン／アルギニン／オルニチントランスポーターをコードする遺伝子の弱化された発現を有する腸内細菌科の細菌を使用するｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| RU2276686C2 (ru) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-аргинина и способ получения l-аргинина | |
| RU2431674C2 (ru) | БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА | |
| EP3797167B1 (en) | A method of producing the tripeptide gamma-glu-val-gly using enterobacteriaceae | |
| RU2468083C1 (ru) | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина | |
| RU2215784C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) | |
| RU2420586C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia | |
| US20070166807A1 (en) | Method for Producing Aromatic L-Amino Acid Using Bacterium Belonging to the Genus Methylophilus | |
| BRPI0904892A2 (pt) | bactéria produtora de l-arginina da famìlia de enterobacteriaceae, e, método para produzir l-arginina | |
| WO2020067487A1 (en) | Method for producing l-methionine using a bacterium |