ES2401183T3 - Balizas de ácidos nucleicos para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar unaestructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana, comprendiendo dicho ácido nucleico(a) una parte de ácido nucleico que comprende (a1) una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la secuencia de ácido nucleicodiana es una secuencia de ácido nucleico de un miocoroganismo, (a2) un par de dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo, (b) un efector y un inhibidor, en el que el inhibidor inhibe al efector cuando el ácido nucleico forma una estructura enhorquilla y en el que el efector es activo cuando el ácido nucleico no está formando una estructura en horquilla y enel que el efector es un marcador luminiscente, en particular un marcador fluorescente y el inhibidor es un extintor,caracterizado porque el ácido nucleico se construye en un método que comprende (i) diseñar la secuencia de (a1) de manera que la ΔG del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia dianaestá en el intervalo de aproximadamente -17 a aproximadamente -25 kcal/mol en condiciones de hibridación quecomprenden hibridación en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM, y (ii) diseñar las secuencias de (a2) de manera que la ΔG del híbrido de las secuencias de (a2) es menor de 0 enausencia de la secuencia diana y mayor que la ΔG del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana.

Description

Balizas de ácidos nucleicos para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip.

La presente invención se refiere a balizas para hibridación fluorescente in situ y tecnología de chip.

Antecedentes/técnica anterior

Debido al éxito generalizado de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los laboratorios de microbiología están esperando la aplicación de la biología molecular a la microbiología rutinaria. Esto se ha postergado por un problema inherente y fundamental de la biología molecular. Debido a su precisión, es necesario conocer qué herramientas (sondas) elegir. El prerrequisito es que se tiene que especificar una petición respecto a los organismos que se van a detectar. En las muestras clínicas, sin embargo, no se sabe cuál de los más de 2.000 patógenos clínicamente relevantes es el agente causal de una infección. Una estrategia racional resuelve el problema

•

Debe focalizarse en el 95% de los organismos que causan problemas

•

Si se conoce dónde se ha tomado la muestra, y existen datos clínicos, el número de organismos puede reducirse a entre 2 y 16.

•

El número de organismos para cubrir el percentil 95 en la mayor parte de las muestras clínicas es del orden de 100

Este razonamiento hace que sea económicamente factible realizar un ensayo basado en sonda de ADN de una manera rutinaria.

El agrupamiento de microorganismos y el ensayo muy rápido para presencia/ausencia de microorganismos específicos o un rango de microorganismos también es relevante en otros campos de los ensayos microbiológicos: Bancos de sangre, Industria farmacéutica, Industria cosmética e Industria alimentaria. Frecuentemente, los mismos organismos son relevantes en todas las disciplinas y por lo tanto se necesita estandarizar las condiciones de reacción para todas las sondas.

La detección de ARN ribosomal mediante Hibridación Fluorescente in situ (FISH) o utilizando tecnología de chip representa una manera eficaz de utilizar la sensibilidad y especificidad de las sondas de ADN sin tener que usar una etapa de amplificación enzimática. FISH se basa en dos estrategias para la detección in situ de dianas generando una señal lo suficientemente fuerte como para ser detectada con dispositivos de medición estándar tales como microscopio de epifluorescencia:

1.

En una célula están presentes moléculas idénticas en números suficientes como para unirse a una sonda específica de oligonucleótido o análogo de nucleótido con un fluoróforo cada una.

2.

Sondas grandes que portan una pluralidad de fluoróforos, por ejemplo, cósmidos marcados.

La tecnología FISH para la identificación de microorganismos en sus entornos respectivos es muy conocida en la técnica. La aplicación de FISH para la detección de patógenos tiene un interés especial para la microbiología clínica y la infectología, en las que FISH se distingue por su velocidad y rentabilidad.

La detección de ARNr con la tecnología de chip también exime de la necesidad de amplificar la diana. El ARNr total se extrae de una muestra y se pone en un chip. Se concentran sondas específicas en un área superficial pequeña y atraen las moléculas de ARNr respectivas para proporcionar señales específicas de presencia/ausencia. Con el fin de hacer que dichos chips sean económicamente viables necesitan ser usados repetidamente con las menores manipulaciones posibles. Además, la estandarización de las características de la sonda es primordial para la generación de resultados reproducibles.

Con el fin de obtener aceptación en un entorno rutinario, las sondas deben diseñarse de manera tal que todas las sondas para un estado patológico puedan correrse simultáneamente bajo condiciones idénticas en un recipiente (chips, dispositivos microfluídicos o placas de microtitulación). En el diseño de las sondas y para preparar sondas económicamente viables, debe tenerse en cuenta que una sonda puede ser relevante para diferentes estados patológicos. Por lo tanto, no sólo un conjunto de sondas sino todas las sondas deben funcionar bajo condiciones de hibridación idénticas. Por consiguiente, deben ensayarse la secuencia y longitud de las sondas de trabajo.

La selección y definición de una sonda de trabajo no puede realizarse por una simple comparación de secuencia y determinación de un valor Tm teórico. Dependiendo del algoritmo aplicado, se obtiene un amplio conjunto de valores que no proporciona una guía respecto a la elección de la secuencia de la sonda adecuada para condiciones de hibridación estandarizadas.

La elección del algoritmo y de los factores que influyen en la calidad de una sonda se discute ampliamente en la técnica (1-7). Una guía adicional puede buscarse comparando secuencias y la posición real en la estructura tridimensional del ribosoma. En un intento de racionalizar el diseño de sondas, Behrens et al (8) investigaron lacorrelación entre los sitios de hibridación y la accesibilidad real con la ayuda del modelo tridimensional 3Å del ribosoma. Sus descubrimientos demostraron que el SDS usado en los procedimientos in situ tiene un efecto desnaturalizante predominante, no capturado por los algoritmos que predicen las estructuras secundarias.

Un problema adicional tanto en la tecnología FISH como de chip es que el procedimiento requiere una etapa de lavado astringente para eliminar las sondas no unidas, lo que requiere etapas de manipulación, reactivos y tiempo adicionales. El éxito de una hibridación puede depender ampliamente de la habilidad y precisión aplicadas en la etapa de lavado. Sin embargo, las aplicaciones rutinarias requieren etapas y manipulación mínimas, lo más importante es que deben ser independientes de las habilidades individuales.

Una solución a la reducción de etapas sería la aplicación de transferencia de energía resonante de fluorescencia ("FRET") en la formación de horquilla de un oligonucleótido o análogo de nucleótido (baliza molecular). En la técnica se conocen varias estrategias para el desarrollo de balizas y las descripciones generalizadas para su construcción están disponibles libremente (13). Las balizas se usan ampliamente en PCR en tiempo real, en la que se hibridan en disolución a un número creciente de moldes generados por las enzimas amplificadoras (15). Sólo se han hecho unos pocos intentos para generar balizas para la detección/identificación de bacterias en membranas (14). Se construyó una baliza exitosa para detectar E. coli en células completas con una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA). La sonda de ADN correspondiente no proporcionó un rendimiento adecuado (16). La producción de balizas de PNA adicionales está limitada debido a la baja solubilidad de los oligonucleótidos basados en PNA según se establece en las recomendaciones de diseño (17).

La Patente CA 2176266/EP 0745690 proporciona una guía para la construcción de tallos universales para PCR en tiempo real (9). Sorprendentemente, estas recomendaciones no proporcionan balizas de trabajo cuando se combinan con sondas diseñadas para identificar microorganismos in situ. La PCR en tiempo real se realiza en disolución mientras que tanto ISH (hibridación in situ) como los chips requieren dianas fijadas. Sus detalles termodinámicos no eran compatibles con los requerimientos de la hibridación in situ y FRET. Así, no pudieron predecirse tallos de trabajo universales para aplicaciones con dianas fijadas. Por lo tanto era necesario buscar empíricamente balizas específicas que se ajustaran a oligonucleótidos o análogos de nucleótidos individuales con el fin de conseguir una pluralidad de balizas que funcionaran bajo especificaciones ISH idénticas.

En la selección de balizas ISH debe tenerse cuidado para que el tallo no dificulte el equilibrio delicado de hibridación hacia ARN enrollado en grandes complejos proteína(ARN tales como ribosomas. La accesibilidad de los sitios de unión se discute ampliamente en la técnica y se resume en (1).

Las limitaciones adicionales en el diseño de una sonda baliza son proporcionadas por el tamaño de los poros generados en la pared celular durante el procedimiento ISH. La adición del mismo tallo a diferentes sondas resulta en balizas claramente individuales. Una pluralidad de sondas forman ya bucles en horquilla y la adición de un tallo no resulta en la formación de una "baliza". Además, la simple adición de bases para formar pares complementarios puede incrementar la Tm en un grado tal que termodinámicamente se prefiere la horquilla en lugar de la formación de híbridos. Hay que considerar tallos especiales que empujen a la secuencia a la formación de balizas a la vez que se mantiene la Tm en o por debajo de la del híbrido. Las enseñanzas respecto al diseño de balizas (13) muestra que el incremento de la longitud del tallo en un par de bases incrementa la Tm 50C y que la Tm del tallo debería ser 100C mayor que la Tm de la secuencia que hibrida.

FISH con microorganismos individuales, tales como bacterias, basado en secuencias de ARNr específicas, puede ser difícil debido al impedimento estérico del ARNr en el ribosoma. En otras palabras, una baliza que forme una horquilla puede hibridar mal con la secuencia diana de ARNr incluida.

Es por lo tanto la materia de la presente invención proporcionar balizas moleculares que superen las desventajas descritas anteriormente al menos parcialmente. La solución proporcionada en la presente invención y las realizaciones preferidas de ésta se describen en las reivindicaciones.

La materia de la presente invención es un ácido nucleico capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar una estructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana, comprendiendo dicho ácido nucleico

(a) una parte de ácido nucleico que comprende

(a1) una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana,

(a2) un par de dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo,

(b) un efector y un inhibidor, en el que el inhibidor inhibe al efector cuando el ácido nucleico forma una estructura en horquilla y en el que el efector es activo cuando el ácido nucleico no está formando una estructura en horquilla.

El ácido nucleico de la presente invención capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar una estructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana también se refiere en la presente memoria como "baliza", "baliza molecular", "horquilla" o "bucle de horquilla", en el que la forma "abierta" (no se forma tallo) así como la forma "cerrada" (la baliza forma un tallo) están incluidas. La forma abierta incluye una baliza que no forma un híbrido con una secuencia diana y una baliza que forma un híbrido con la secuencia diana.

En particular, las dos secuencias complementarias (a2) están flanqueando la secuencia (a1), es decir, la primera secuencia (a2) está unida al extremo 3' de la secuencia (a1) y la segunda secuencia (a2) está unida al extremo 5' de la secuencia (a1).

El híbrido de la secuencia (a1) con la secuencia diana también se refiere en la presente memoria como "híbrido con la secuencia cognada" o como "híbrido cognado".

En la presente invención, el efector puede estar unido a una de las dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo, mientras que el inhibidor puede estar unido a la otra de las dos secuencias complementarias, de manera que el inhibidor esencialmente inhibe la actividad del efector cuando se forma un tallo, y el efector es activo cuando la horquilla está abierta. Preferiblemente, el efector está unido al extremo 5' o al extremo 3' de la baliza, respectivamente, o a una posición que está a 1, 2, 3, 4, ó 5 nucleótidos de distancia del extremo 5' o del extremo 3', respectivamente. El inhibidor está unido preferiblemente al otro extremo no cubierto por el efector, es decir, al extremo 3' o al extremo 5', respectivamente, o a una posición que está a 1, 2, 3, 4, ó 5 nucleótidos de distancia del extremo 3' o del extremo 5', respectivamente.

El diseño de los bucles de horquilla descritos en la presente memoria se diferencia por lo tanto fundamentalmente de las balizas muy conocidas en la técnica.

La hibridación de la baliza de la presente invención con la secuencia diana puede tener lugar en condiciones en las que el bucle está abierto. Una baliza que no forma un tallo cuando hibrida es capaz de hibridar con una secuencia de ARNr diana, por ejemplo, y por lo tanto puede conseguir una hibridación exitosa.

Este objetivo se consigue, por ejemplo, por una Tm de la baliza (es decir, la Tm del tallo) que es esencialmente igual a o menor que la Tm del híbrido cognado (es decir, el híbrido de la baliza con la secuencia diana). Así, la hibridación con la secuencia diana tiene lugar cuando el tallo está abierto, por ejemplo, si la hibridación tiene lugar en condiciones esencialmente sin Mg2+.

"Tm esencialmente igual" del híbrido cognado y el tallo de la baliza se refiere a temperaturas de fusión que se diferencian en menos de 50C, preferiblemente menos de 30C, más preferiblemente menos de 20C, más preferiblemente menos de 10C, más preferiblemente menos de 0,50C, incluso más preferiblemente menos de 0,20C, lo más preferiblemente menos de 0,10C.

Con el fin de conseguir una inhibición del efector por el inhibidor, formando los dos parte de la baliza, en aquellas moléculas de baliza que no hibridan con la secuencia diana, la formación del tallo debe inducirse después de la reacción de hibridación. Esto puede conseguirse, por ejemplo, con una baliza que tiene una �G < 0, de manera que la horquilla se formará espontáneamente. Además, la formación del tallo puede introducirse lavando con un tampón que contiene Mg2+ como se describe en la presente memoria.

En particular, los bucles de la horquilla se construyen de una manera tal que en condiciones de hibridación estandarizadas (por ejemplo, en condiciones esencialmente sin Mg2+) el tallo de la baliza está abierto de manera que las posibles limitaciones estéricas no dificultan el proceso de hibridación. Por ejemplo, las limitaciones estéricas pueden estar presentes cuando la secuencia diana es una secuencia de ARNr. Si el efector es un fluoróforo, el fluoróforo no se extinguirá por la gran proximidad de las proteínas ribosomales.

Las condiciones adecuadas para la inducción de la formación del tallo después de la hibridación incluyen un tampón que contiene Mg2+, por ejemplo que contiene aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+, más particular aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mM Mg2+, incluso más particular aproximadamente 8 a aproximadamente 12 mM Mg2+, lo más particular aproximadamente 10 mM Mg2+. El tampón puede tener un pH > 8.

Además, las balizas funcionan en su totalidad y no pueden diseccionarse en tallo y bucle ya que el efecto del vecino más próximo y apilamiento tiene una gran influencia en sus propiedades termodinámicas. Las balizas preferidas dela presente invención se resumen en la Tabla 1. Éstas muestran claramente que la secuencia tallo preferida es independiente de la �G, Tm, contenido de GC o longitud de la secuencia elegida para identificar una especie.

En la presente invención, se establecen las especificaciones termodinámicas para la construcción individual de las balizas adecuadas para condiciones estandarizadas: La energía de Gibbs (�G) para la formación de la baliza tiene que diseñarse de manera tal que

•

La baliza se formará espontáneamente (�G < 0) en ausencia de una secuencia diana cognada en condiciones de hibridación.

•

La �G del híbrido cognado es significativamente menor (es decir, más negativa) que la �G de la baliza.

•

La G respectiva de la baliza es menor que un emparejamiento erróneo o secuencia no cognada.

•

La Tm para la formación de la baliza tiene que diseñarse de manera tal que la Tm de la baliza sea menor que o esencialmente la Tm del híbrido.

Se prefiere que la G del híbrido cognado esté en el intervalo de aproximadamente -17 a aproximadamente -25 kcal/mol, preferiblemente aproximadamente -18 a aproximadamente -24 kcal/mol, más preferiblemente aproximadamente -19 a aproximadamente -23 kcal/mol, lo más preferiblemente aproximadamente -20 a aproximadamente -22 kcal/mol en condiciones de hibridación.

También se prefiere que la G de los híbridos cognados en condiciones de hibridación no varíe más de 5 kcal/mol, preferiblemente no más de 3 kcal/mol, más preferiblemente 2 kcal/mol y lo más preferiblemente 1 kcal/mol.

Ocasionalmente, las secuencias cognadas pueden formar bucles de horquilla espontáneos, en los que sólo necesita ser suplementado un brazo para conseguir la formación de la baliza. Si la secuencia diana es una secuencia de ARNr, esto, sin embargo, da lugar al efector, por ejemplo el fluoróforo, en gran proximidad con proteínas del ribosoma potencialmente extintoras. En una configuración preferida, el tallo se extiende. Con el fin de ajustarse a dichas especificaciones termodinámicas como se describe en la presente memoria incluso con un tallo extendido, se concibió un método para mantener tanto la Tm como la G dentro de las especificaciones. Según la presente invención, esto puede conseguirse por la introducción de al menos un nucleótido o análogo de nucleótido no emparejado. En la presente invención, la introducción de al menos un nucleótido no emparejado puede aumentarse por la introducción de un nucleótido o análogo de nucleótido adicional, de manera que las dos secuencias complementarias tienen una longitud diferente y el tallo se "dobla" (véase por ejemplo la posición 36 en SEQ ID NO: 1) o/y puede conseguirse por un reemplazo de un nucleótido o análogo de nucleótido emparejado por un nucleótido

o análogo de nucleótido no emparejado (véase por ejemplo la posición 5 en SEQ ID NO: 7). Así, en la presente invención, las "secuencias complementarias capaces de formar un tallo" también pueden incluir al menos un nucleótido no emparejado, preferiblemente 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos no emparejados.

Como puede verse en la Tabla 2 ninguna de las secuencias descritas aquí podría concebirse como balizas de PNA debido a las limitaciones mencionadas en la construcción de oligonucleótidos de PNA. Siendo la limitación principal la longitud del oligonucleótido requerida para tener tanto suficiente especificidad como una longitud de tallo suficiente para asegurar el re-plegamiento del bucle cuando no hibrida. Es por lo tanto necesario concebir balizas de ADN que sean capaces de hibridar con afinidad y velocidad suficientes para permitir la identificación in situ de microorganismos.

La baliza de la presente invención no es una baliza de PNA. El núcleo de la baliza es preferiblemente un núcleo de ácido nucleico. La baliza puede comprender un análogo de ácido nucleico tal como un análogo de desoxirribonucleótido o un análogo de ribonucleótido en la parte de ácido nucleico o/y en el conector si está presente un conector. Este análogo es preferiblemente un análogo de nucleótido modificado en el resto de azúcar, la base o/y los grupos fosfato. El análogo de nucleótido no es preferiblemente un bloque de estructura PNA.

Según el mencionado percentil 95 en muestras clínicas, los patógenos pueden agruparse en grupos relacionados por enfermedad. Las sondas frente a estos organismos deben funcionar simultáneamente en las condiciones mencionadas, especialmente si todas las sondas van a utilizarse en un chip. La aplicación en chip requiere una estandarización estricta tanto de las características del cognado como del tallo. Si se emplea una combinación de más de una sonda, es decir, al menos dos sondas, todas las sondas tienen que diseñarse para funcionar en el mismo porta/chip simultáneamente.

Otra materia de la presente invención es una combinación que comprende al menos 2, preferiblemente al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 balizas. La combinación puede comprender pero no está limitada a todas las balizas de la Tabla 1, preferiblemente como máximo 100, como máximo 80, como máximo 70, como máximo 60, como máximo 50, como máximo 40, como máximo 30 o como máximo 20 balizas.

En una combinación de la presente invención, las balizas pueden tener la misma o diferentes secuencias diana. Se prefiere que las secuencias diana de las balizas individuales sean diferentes.

En una combinación de balizas de la presente invención, la diferencia en G de las balizas individuales del híbrido de las secuencias de (a2) o/y el híbrido de la secuencia de (a1) con una secuencia diana puede ser como máximo aproximadamente 4 kcal/mol, preferiblemente como máximo aproximadamente 3 kcal/mol, más preferiblemente como máximo aproximadamente 2 kcal/mol, y lo más preferiblemente como máximo aproximadamente 1 kcal/mol respecto a la secuencia cognada.

En una combinación, los valores de Tm de las balizas individuales respecto a su secuencia cognada respectiva pueden diferenciarse como máximo aproximadamente 30C, preferiblemente como máximo aproximadamente 20C, más preferiblemente como máximo aproximadamente 10C.

Se prefiere que en la combinación de la presente invención los ácidos nucleicos individuales funciones uniformemente. "Funcionar uniformemente" significa que la hibridación exitosa puede conseguirse con diferentes sondas de ácidos nucleicos de la presente invención en las mismas condiciones de hibridación, por ejemplo, en condiciones de hibridación estandarizadas. En otras palabras, los ácidos nucleicos que funcionan uniformemente de la presente invención no requieren la optimización individual de las condiciones de hibridación.

Dependiendo del estado patológico, determinados patógenos son, lo más frecuentemente, los agentes causales y pueden así reunirse en grupos de diagnóstico. Puede requerirse la adición u omisión de determinados patógenos dependiendo de la epidemiología regional con el fin de alcanzar el percentil 95. El listado preferido de la Tabla 1 abarca los requerimientos de Europa y la mayor parte de América del Norte.

Se describe aún más un kit o chip que puede contener al menos dos balizas de la Tabla 1 requeridas para detectar los organismos listados opcionalmente junto con los reactivos de hibridación requeridos. Preferiblemente, el chip o kit contiene al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 balizas. El kit o chip puede contener como máximo todas las balizas de la Tabla 1, preferiblemente como máximo 100, como máximo 80, como máximo 70, como máximo 60, como máximo 50, como máximo 40, como máximo 30 o como máximo 20 balizas.

La lista de agrupaciones y kits resultantes para la detección, enumeración e identificación de los organismos listados se reúne en la Tabla 1.

Las balizas pueden aplicarse en ensayos diseñados para realizarse en tubos, placas de microtitulación, pocillos de microtitulación de filtración, portas y chips. La detección puede hacerse con fluorescencia, fluorescencia en tiempo resuelto, con una pluralidad de fluoróforos y utilizando enzimas electroquímicas.

En la realización preferida para FISH, el ensayo se realiza en portas de vidrio diseñados para contener y separar varias muestras.

Otra materia de la presente invención es un método de hibridación que comprende

(a)

poner en contacto al menos un ácido nucleico de cualquiera de la presente invención o una combinación de ácidos nucleicos de la presente invención con una muestra biológica,

(b)

hibridar el ácido nucleico o la combinación de ácido nucleico de (a) con la muestra en condiciones en las que el tallo del ácido nucleico está abierto, por ejemplo, hibridar con un tampón esencialmente sin Mg2+, e

(c)

inducir condiciones que permitan la formación del tallo en aquellas moléculas de ácido nucleico de (a) que no forman un híbrido con la muestra, por ejemplo, lavar con un tampón que contiene magnesio, por ejemplo a pH>8 o/y a temperatura ambiente.

La muestra puede ser cualquier muestra de origen biológico, tal como una muestra clínica o alimentaria, que se sospecha que comprende un ácido nucleico para detectarse por la baliza. La muestra puede ser una muestra que comprende microorganismos, tales como bacterias, levaduras y mohos, en particular bacterias Gram positivas o/y Gram negativas.

También puede emplearse en el método de hibridación un kit o chip como se describe en la presente memoria.

"Esencialmente sin Mg2+" se refiere a una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM, preferiblemente menos de 0,1 mM, más preferiblemente menos de 0,05 mM, lo más preferiblemente menos de 0,01 mM.

El tampón en la etapa (c) puede contener aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+, más particular aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mM Mg2+, incluso más particular aproximadamente 8 a aproximadamente 12 mM Mg2+, lo más particular aproximadamente 10 mM Mg2+.

Puede aplicarse cualquier protocolo de hibridación adecuado que comprende la aplicación de una disolución esencialmente sin Mg2+ y una disolución que contiene Mg2+ como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, puede usarse el protocolo siguiente: Se aplican alicuotas de muestras clínicas a campos definidos en los portas. Preferiblemente, se aplica una cantidad definida de 10 !l y se seca.

1.

Las muestras se fijan con calor a los portas.

2.

Los organismos Gram positivos se someten a una digestión con Lisozima/Lisostafina según especificaciones publicadas. En una realización preferida, la digestión se lleva a cabo durante 7 minutos a 460C en una cámara humidificada.

3.

Se forman poros por ejemplo sumergiendo el porta en 100% metanol o etanol durante varios minutos. En una realización preferida, el metanol o etanol se enfría en hielo y el tiempo de inmersión es 7 minutos para organismos Gram negativos y 3 minutos para organismos Gram positivos.

4.

El porta se seca en un secador de portas, por ejemplo a 550C.

5.

Las balizas se disuelven en un tampón de hibridación (que puede ser esencialmente sin Mg2+) y se aplican a cada campo del porta mientras están en el secador de portas.

6.

El porta se pone en una cámara de hibridación, humidificada con tampón de hibridación. En una realización preferida, el porta se cubre con un cubre portas hidrofóbico y se pone en un secador de portas cubierto a 460C durante 12 minutos.

7.

El porta se lava con un tampón que contiene magnesio, por ejemplo a pH>8 o/y a temperatura ambiente. El tampón puede contener aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+, más particular aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mM Mg2+, incluso más particular aproximadamente 8 a aproximadamente 12 mM Mg2+, lo más particular 10 mM Mg2+.

8.

El porta se seca y puede montarse con fluido de montaje y puede leerse bajo un microscopio de epifluorescencia con un aumento total, por ejemplo, de 400x, 600x ó 1.000x.

Si se usan otros recipientes para la hibridación, la detección puede ser mediante citometría de flujo o lector de fluorescencia automatizado muy conocido en la técnica.

Otra realización más comprendida se refiere a aplicaciones de chip de las balizas de la presente invención. Para las aplicaciones de chip, es necesario unir covalentemente las balizas a una superficie transportadora. Para facilitar esto, la base 3' terminal de las balizas diseñadas puede biotinilarse o unirse mediante un reactivo hetero-bifuncional a una enzima usando métodos muy conocidos en la técnica de la química de proteínas y ácidos nucleicos. Las balizas biotiniladas pueden añadirse a chips recubiertos con estreptavidina que pueden obtenerse libremente de fuentes comerciales (19). En esta aplicación, los bucles de horquilla biotinilados respectivos pueden unirse a una pluralidad de campos distintos de un chip, por ejemplo al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 200 o al menos 500 campos o como máximo 500, como máximo 400 o como máximo 300 campos. El ARN total puede extraerse de las muestras usando kits disponibles comercialmente (20) y puede aplicarse al chip en condiciones de hibridación. Después de la hibridación, el chip puede lavarse brevemente con un tampón que contiene magnesio, por ejemplo a pH>8. La fluorescencia en un campo indica la presencia de la secuencia diana específica, por ejemplo, un ARN específico que indica la presencia de un organismo respectivo en la muestra.

Con el fin de ampliar los ensayos de hibridación a aplicaciones rutinarias a gran escala, es necesario analizar una pluralidad de muestras secuencialmente en un chip reusable. El diseño del chip debe permitir la producción a gran escala, un control de calidad eficaz y una vida larga a temperatura ambiente.

Con el fin de cumplir con estas especificaciones, en otra realización de la presente invención, una baliza de la presente invención se une covalentemente a una enzima que produce una señal catalizando una reacción específica. En particular, la enzima puede producir una señal electroquímica. Las enzimas adecuadas comprenden, pero no están limitadas a, tirosinasa, peroxidasa, sulfito oxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, guanina oxidasa. En una realización preferida, la enzima se obtiene recombinantemente de una secuencia genómica de un organismo termo o hipertermofílico para volverla estable en condiciones de hibridación y temperaturas elevadas (21). La enzima puede estar unida a la baliza en un extremo de la molécula de baliza. En el otro extremo de la molécula, puede estar unido un inhibidor que es capaz de inhibir la actividad de la enzima. Cuando no está presente ninguna secuencia cognada para dichos bucles de horquilla el inhibidor inhibe la enzima y no se genera ninguna señal. En presencia de una secuencia cognada el bucle permanecerá no plegado con el inhibidor alejado de la enzima y la enzima producirá una señal electroquímica que puede detectarse por dispositivos bien descritos en la técnica. Puede emplearse un conector para la unión de la enzima o/y el inhibidor, en particular para la unión del inhibidor.

En una realización preferida adicional, la glucosa oxidasa se une a un extremo de dichos bucles de horquilla y un inhibidor de la glucosa oxidasa, tal como un nucleótido de adenina o análogo de nucleótido de adenina, se une al otro extremo del bucle de horquilla. Los nucleótidos de adenina son inhibidores conocidos de la glucosa oxidasa (22, 23). Puede emplearse un conector para la unión de la glucosa oxidasa o/y el inhibidor de la glucosa oxidasa, en particular para la unión del inhibidor de la glucosa oxidasa. Cuando no está presente ninguna secuencia cognada para dichos bucles de horquilla, el inhibidor, en particular el nucleótido de adenina, inhibe la enzima y no se genera ninguna señal. En presencia de una secuencia cognada, el bucle permanecerá no plegado con el inhibidor alejado de la enzima y la enzima producirá una señal electroquímica que puede detectarse por dispositivos bien descritos en la técnica.

Para realizar dicho ensayo, se han desarrollado una gran pluralidad de secuencias con características idénticas (Tabla 1), que pueden aplicarse a posiciones definidas en el dispositivo de detección (chip) respectivamente. El ARN total se extrae de una muestra utilizando un procedimiento de extracción y kits fácilmente disponibles en el mercado

(20) y se pone en el chip en condiciones de hibridación. Después de la hibridación, el chip se lava con tampón de sustrato a 460C y se lee la señal. Al final del ciclo, todo el ARN hibridado se elimina por lavado con tampón de hibridación a temperatura elevada. Preferiblemente, la temperatura de lavado se elige 100C por encima de la Tm respectiva. En una realización preferida, el chip se lava a 600C con tampón de hibridación. La temperatura puede bajarse entonces hasta 460C para equilibrar para el siguiente ciclo analítico.

Leyendas

La Tabla 1 describe secuencias de baliza de la presente invención. Abreviaturas: R&G: un marcador fluorescente rojo o/y verde puede unirse a la baliza, tal como Cy3 o FITC o un derivado de éstos.

La Tabla 2 describe que las balizas de PNA no son adecuadas en la presente invención. Los cálculos se realizaron

5 con las secuencias de la Tabla 1 asumiendo que la baliza era una baliza de PNA. A diferencia de las balizas de ADN, todos los cinco criterios siguientes tienen que cumplirse: contenido de GC < 60%, < 3 bases autocomplementarias, 4 purinas seguidas, longitud máxima de 18, palíndromos de secuencia inversa o repeticiones u horquillas. "Sí" ("No") en la Tabla 2 indica que el criterio se cumple (no se cumple). La columna "Final" indica si una baliza PNA es adecuada en la presente invención ("Sí") o no ("No"). "No" en final indica que uno de los cinco

10 criterios no se cumple. "Sí" indicaría que todos los criterios se cumplen. Se juzga que todas las secuencias de la Tabla 2 son "No". Así, ninguna de las secuencia de la Tabla 1 sería adecuada en una baliza PNA.

REFERENCIAS

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un ácido nucleico capaz de formar un híbrido con una secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar una estructura en horquilla si no se forma ningún híbrido con la secuencia diana, comprendiendo dicho ácido nucleico

   (a) una parte de ácido nucleico que comprende

   (a1) una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico de un miocoroganismo,

   (a2) un par de dos secuencias complementarias capaces de formar un tallo,

   (b)

   un efector y un inhibidor, en el que el inhibidor inhibe al efector cuando el ácido nucleico forma una estructura en horquilla y en el que el efector es activo cuando el ácido nucleico no está formando una estructura en horquilla y en el que el efector es un marcador luminiscente, en particular un marcador fluorescente y el inhibidor es un extintor,

   caracterizado porque el ácido nucleico se construye en un método que comprende

   (i)

   diseñar la secuencia de (a1) de manera que la G del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana está en el intervalo de aproximadamente -17 a aproximadamente -25 kcal/mol en condiciones de hibridación que comprenden hibridación en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM, y

   (ii)

   diseñar las secuencias de (a2) de manera que la G del híbrido de las secuencias de (a2) es menor de 0 en ausencia de la secuencia diana y mayor que la G del híbrido de la secuencia de (a1) con su secuencia diana.

2. 2.

   El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la Tm del híbrido de las secuencias de (a2) es esencialmente igual a o menor que la Tm del híbrido de la secuencia de (a1) con la secuencia diana, por ejemplo, como máximo aproximadamente 50C, aproximadamente 40C, aproximadamente 30C, aproximadamente 20C o aproximadamente 10C menor en particular en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM.

3. 3.

   El ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en el que la G del híbrido de las secuencias de (a2) es menor que la

   G de un híbrido del ácido nucleico con una secuencia que se empareja erróneamente o/y una secuencia diferente de la secuencia diana.

4. 4.

   El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la formación del tallo tiene lugar en presencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+, en particular en presencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mM Mg2+, más particular en presencia de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 mM

   Mg2+ .

5. 5.

   El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la parte de ácido nucleico (a) consiste en ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o/y análogos de desoxirribonucleótidos, siendo dichos análogos de nucleótidos diferentes de bloques estructurales de PNA.

6. 6.

   El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la parte de ácido nucleico (a) se selecciona de las secuencias baliza de la Tabla 1.

7. 7.

   Una combinación que comprende al menos dos ácidos nucleicos según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. 8.

   La combinación de la reivindicación 7, en la que los valores G del híbrido de las secuencias de (a2) o/y el híbrido de la secuencia de (a1) con una secuencia diana de los ácidos nucleicos individuales se diferencia como máximo aproximadamente 4kcal/mol, o/y en el que los valores de Tm del híbrido de las secuencias de (a2) o/y el híbrido de la secuencia de (a1) con una secuencia diana de los ácidos nucleicos individuales se diferencia como máximo aproximadamente 30C.

9. 9.

   La combinación de la reivindicación 7 u 8, en la que los ácidos nucleicos individuales funcionan uniformemente en las condiciones de hibridación requeridas para hibridar en condiciones de hibridación in situ.

10. 10.

    Un método de hibridación in situ que comprende

    (a)

    poner en contacto al menos un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una combinación de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 con una muestra biológica,

    (b)

    hibridar el ácido nucleico o la combinación de ácido nucleico de (a) con la muestra en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de menos de 1 mM de manera que el tallo del ácido nucleico está abierto, e

    (c)

    inducir condiciones que permitan la formación del tallo en aquellas moléculas de ácido nucleico de (a) que no forman un híbrido con la muestra, en el que la formación del tallo tiene lugar en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM Mg2+.

11. 11.

    El método de la reivindicación 10, en el que la formación del tallo tiene lugar en un tampón que tiene una concentración de Mg2+ de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mM Mg2+, en particular aproximadamente 8 a aproximadamente 10 mM Mg2+.

12. 12.

    Uso de al menos un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o/y una combinación de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el método de la reivindicación 10 u 11 para identificar la presencia o ausencia de uno o una pluralidad de organismos, en particular microorganismos, en una muestra biológica tal como una pluralidad de materia viva o muerta de origen humano, animal o/y alimentario.

13. 13.

    Uso de la reivindicación 12, que es un uso diagnóstico.