ES2479090T3

ES2479090T3 - Identificación y uso de genes diana para el control de nematodos parásitos de plantas

Info

Publication number: ES2479090T3
Application number: ES07756833.5T
Authority: ES
Inventors: Andrey A. Boukharov; Zijin Du; Liang Guo; Michelle C. Hresko; David K. Kovalic; Zhaolong Li; Maolong Lu; James P. Mccarter; Nancy M. Miller; Mark Vaudin; Deryck J. Williams; Wei Wu
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2027-02-09
Also published as: US10829781B2; EP2044109B1; US9988642B2; US20140004088A1; ZA200806328B; CN101501199B; CA2637665A1; US20160376606A1; US20070250947A1; BRPI0707626A2; WO2007095469A8; US8519225B2; US10174340B2; WO2007095469A3; US9388409B2; AR059433A1; PL2044109T3; CN101501199A; EP2044109A2; US20190241906A1

Abstract

Un polinucleótido que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos, en el que la primera secuencia de polinucleótidos está seleccionada de: (a) un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1920, en el que la captación por un nematodo parásito de las plantas de una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que comprende al menos una hebra que es complementaria a dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicho nematodo y (b) un complemento de la secuencia de (a), en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en el que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar una molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada, en el que el polinucleótido está operativamente ligado a un vector heterólogo

Description

Identificación y uso de genes diana para el control de nematodos parásitos de plantas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al control genético de enfermedades de las plantas producidas por nematodos parásitos de las plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación de secuencias codificantes diana y al uso de tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir postranscripcionalmente la expresión de secuencias codificantes diana en las células de un nematodo parásito de las plantas para proporcionar un efecto protector de la planta.

2. Descripción de la técnica relacionada

Las plantas están sometidos a múltiples potenciales agentes causantes de enfermedad, que incluyen nematodos parásitos de las plantas, que son organismos activos flexibles alargados que viven en superficies húmedas o en entornos líquidos, que incluyen películas de agua dentro de la tierra y tejidos húmedos dentro de otros organismos. Hay numerosas especies de nematodos parásitos de las plantas, que incluyen diversos nematodos quísticos (por ejemplo, Heterodera sp.), nematodos del nudo de la raíz (por ejemplo, Meloidogyne sp.), nematodos de la lesión (por ejemplo, Pratylenchus sp.), nematodos daga (por ejemplo, Xiphinema sp.) y nematodos del tallo y los bulbos (por ejemplo, Ditylenchus sp.), entre otros. Los nematodos tilénquidos (miembros del orden Tylenchida), que incluyen las familias Heteroderidae, Meloidogynidae y Pratylenchidae, son el grupo más grande y más económicamente importante de los nematodos parásitos de las plantas. Otros nematodos parásitos de las plantas importantes incluyen nematodos dorilaimidos (por ejemplo, Xiphinema sp.), entre otros. Las especies de nematodos crecen mediante una serie de etapas del ciclo vital y mudas. Normalmente, hay cinco etapas y cuatro mudas: etapa de huevo; J1 (es decir, primera etapa juvenil); M1 (es decir, primera muda); J2 (segunda etapa juvenil; algunas veces eclosión del huevo); M2; J3; M3; J4; M4; A (adulto). Las etapas juveniles (“J”) también se denominan algunas veces estadios larvales (“L”). La expresión génica puede ser específica para una o más etapas del ciclo vital.

Algunas especies de nematodos han evolucionado como parásitos de gran éxito tanto en las plantas como en los animales y son responsables de pérdidas económicas significativas en la agricultura y ganado y de morbilidad y mortalidad en seres humanos. Los parásitos nematodos de las plantas pueden habitar en todas las partes de las plantas, que incluyen raíces, capullos de flores en desarrollo, hojas y tallos. Los parásitos de las plantas se clasifican basándose de sus hábitos alimenticios en las amplias categorías ectoparásitos migratorios, endoparásitos migratorios y endoparásitos sedentarios. Los endoparásitos sedentarios, que incluyen los nematodos del nudo de la raíz (Meloidogyne) y nematodos quísticos (Globodera y Heterodera), inducen sitios de alimentación (“sincitios”) y establecen infecciones a largo plazo dentro de las raíces que son frecuentemente muy dañinas para los cultivos. Se estima que los nematodos parásitos le cuestan a las industrias hortícolas y agrícolas más de 78 billones de dólares en el mundo al año, basándose en un promedio estimado del 12 % de pérdida anual, propagados a todos los cultivos principales. Por ejemplo, se estima que los nematodos producen pérdidas de soja de aproximadamente 3,2 billones de dólares anualmente en el mundo (Barker y col., 1994).

Se han proporcionado composiciones, procedimientos y agentes para controlar infestaciones por nematodos de varias formas. Se han intentado procedimientos de control biológico y cultural, que incluyen cuarentenas de plantas, en numerosos casos. En algunos cultivos se han identificado genes de resistencia de las plantas que permiten resistencia o tolerancia a nematodos. Normalmente se han aplicado composiciones químicas tales como nematicidas a la tierra en la que están presentes los nematodos parásitos de las plantas. Sin embargo, hay una necesidad urgente de controles de nematodos seguros y eficaces. Factores referentes a las desventajas de las actuales estrategias de control incluyen importancia fundamental de la sostenibilidad de la agricultura, y nuevas reglamentaciones gubernamentales que puedan prevenir o limitar duramente el uso de muchos agentes antihelmínticos agroquímicos disponibles.

Los agentes químicos son frecuentemente no selectivos, y ejercen sus efectos sobre organismos no diana, alterando eficazmente poblaciones de microorganismos beneficiosos, durante un periodo de tiempo tras la aplicación del agente. Los agentes químicos pueden persistir en el entorno y solo metabolizarse lentamente. Los fumigantes de tierra nematicidas tales como cloropicrina y bromuro de metilo y compuestos relacionados son altamente tóxicos, y el bromuro de metilo se ha identificado como compuesto destructor de ozono. Así, su registro para su uso en los Estados Unidos no se ha renovado. Estos agentes también pueden acumularse en la capa freática o la cadena alimentaria, y en especies de nivel trófico superior. Estos agentes también pueden actuar de mutágenos y/o carcinógenos para producir modificaciones genéticas irreversibles y perjudiciales. Así, cada vez se están estudiando más procedimientos alternativos para el control de nematodos, tales como procedimientos genéticos.

El organismo Caenorhabditis elegans, un nematodo bacterívoro, es el modelo genético de nematodo más ampliamente estudiado. Bases de datos públicas y privadas contienen una abundancia de información sobre su genética y desarrollo, pero el aplicar prácticamente esta información para el control de nematodos parásitos de las plantas sigue siendo un reto (McCarter y col., 2003; McCarter 2004). Previamente ha sido poco práctico identificar

rutinariamente un gran número de genes diana en nematodos distintos de C. elegans, tales como nematodos parásitos de las plantas, para el posterior análisis funcional, por ejemplo, por análisis de iARN. Por tanto, ha existido una necesidad de procedimientos mejorados de identificación de genes diana, cuya supresión de la expresión conduzca a controlar la infestación por nematodos.

Muchos genes en C. elegans tienen ortólogos en animales metazoarios que incluyen insectos y vertebrados, además de otros nematodos. En los últimos años se ha generado una colección de marcadores de secuencia expresada (EST) enormemente expandidas de más de 30 especies de nematodos parásitos de las plantas y animales (Parkinson y col., 2004). A partir de 2005 había aproximadamente 560.874 secuencias de nucleótidos en Genbank de nematodos distintos de especies de Caenorhabditis y están en proceso proyectos públicos para generar secuencias borrador de Meloidogyne hapla (nematodo del nudo de la raíz), Haemonchus contortus (parásito de ovejas), Trichinella spiralis (parásito de seres humanos y otros mamíferos) (430.000 trazas de secuencias enviadas) y Pristionchus pacificus (nematodo vivo libre) (149.000 trazas de secuencias enviadas). Los 20.109 EST están disponibles de Heterodera glycines que representan porciones de aproximadamente 9.000 genes (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 11/360.355 presentada el 23 de febrero de 2006). Se espera que genes conservados retengan frecuentemente las mismas funciones o funciones muy similares en diferentes nematodos. Esta equivalencia funcional se ha demostrado en algunos casos transformando C. elegans con genes homólogos de otros nematodos (Kwa y col., 1995; Redmond y col., 2001). Tal equivalencia se ha mostrado en comparaciones de filos cruzados para genes conservados y se espera que sea más robusta entre especies dentro de un filo.

La interferencia por ARN (iARN) es un procedimiento que utiliza rutas celulares endógenas, por lo que un gen diana específico para ARN bicatenario (ARNbc) produce la degradación del ARNm de interés. En los últimos años, la iARN se ha usado para realizar la “inactivación” de genes en varias especies y sistemas experimentales, del nematodo C. elegans, a plantas, a embriones de insecto y células en cultivo de tejido (Fire y col., 1998; Martinez y col., 2002; McManus y Sharp, 2002). La iARN funciona mediante una ruta endógena que incluye el complejo de la proteína Dicer que genera ARN interferente pequeño (ARNip) de ∼21 nucleótidos a partir del ARNbc original y el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que usa guías de ARNip para reconocer y degradar los ARNm correspondientes. Solo transcritos complementarios al ARNip se escinden y degradan, y así la inactivación de la expresión del ARNm es normalmente específica para secuencia. El efecto del silenciamiento de genes de iARN persiste durante días y, bajo condiciones experimentales, puede conducir a una disminución en la abundancia del transcrito elegido como diana del 90 % o más, con disminución consecuente en los niveles de la proteína correspondiente.

La supresión de genes mediada por ARNbc por iARN puede lograrse en C. elegans alimentando, remojando los nematodos en disoluciones que contienen moléculas de ARN bicatenario o interferente pequeño, y por inyección de las moléculas de ARNbc (Kamath y col., 2001; Maeda y col., 2001). Se han realizado varios sondeos a gran escala de genes de C. elegans por iARN de manera que la información de inactivación de iARN esté disponible para >90 % de los genes de C. elegans (Gonczy y col., 2000; Fraser y col., 2000; Piano y col., 2000; Maeda y col., 2001; Kamath y col., 2003; Simmer y col., 2003; Ashrafi y col., 2003; Sonnichsen y col., 2005).

Hasta la fecha solo existe información técnica o de patentes publicada limitada sobre la supresión de genes mediada por iARN en nematodos parásitos de las plantas, en la que las moléculas bicatenarias (ARNbc) o interferentes pequeñas (ARNip) se recogen de medios de crecimiento artificiales (in vitro) o de tejido vegetal (in planta). Se ha observado que la iARN funciona en varios nematodos parásitos que incluyen los parásitos de las plantas Heterodera glycines y Globodera pallida (Urwin y col., 2002; publicaciones de EE.UU. 2004/0098761; 2003/0150017; 2003/0061626 y 2004/0133943; Fairbaim y col., 2005), Meloidogyne javanica (documento WO2005/019408), y los parásitos de mamífero Nippostrongylus brasiliensis (Hussein y col., 2002), Brugia malayi (Aboobaker y col., 2003) y Onchocerca volvulus (Lustigman y col., 2004). Se ha sugerido la producción de ARNbc específico para parásito en células vegetales como una estrategia directa para el control de nematodos parásitos de las plantas que incluye el nematodo quístico de la soja, Heterodera glycines (por ejemplo, Fire y col., 1998; publicaciones de EE.UU. 2004/0098761 y 2005/0188438; documento WO 03/052110). La publicación de EE.UU. 2006/0037101 describe el uso de secuencias de H. glycines, tales como de pas5, para modular la expresión génica de NQS. Sin embargo, no se ha informado de ningún procedimiento sistemático para identificar genes de nematodos diana para su uso en tales estrategias, y solo se han propuesto un número limitado de genes de nematodos parásitos de las plantas como posibles dianas para estudios de supresión de genes mediada por iARN.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1: Sistema de clasificación del fenotipo de iARN de C. elegans.

FIG. 2: Resultados de estudios de alimentación de iARN de P0 de C. elegans.

FIG. 3A-3D: Lista de las 300 dianas principales de genes de H. glycines basándose en ortólogos de C. elegans.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para controlar enfermedades producidas por nematodos parásitos de las plantas. La presente invención proporciona composiciones de ácido nucleico a modo de

ejemplo que son homólogas a al menos una porción de una o más secuencias de ácidos nucleicos nativas en un nematodo parásito de las plantas diana. En ciertas realizaciones, el nematodo está seleccionado de Heterodera sp., Meloidogyne sp., Globodera sp., Helicotylenchus sp., Ditylenchus sp., Pratylenchus sp., Paratylenchus sp., Rotylenchus sp., Tylenchulus sp., Tylenchorhynchus sp., Hoplolaimus sp., Belonolaimus sp., Anguina sp., Subanguina sp. y Nacobbus sp. En particular, el nematodo puede ser una Heterodera sp., tal como H. glycines. Ejemplos específicos de tales ácidos nucleicos proporcionados por la invención se facilitan en el listado adjunto de secuencias como SEC ID Nº: 1920. Así, en un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos, en el que la primera secuencia de polinucleótidos está seleccionada de:

(a): un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1920, en el que la captación por un nematodo parásito de las plantas de una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que comprende al menos una hebra que es complementaria a dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicho nematodo y

(b): un complemento de la secuencia de (a), en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en la que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar una molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada,

en el que el polinucleótido está operativamente ligado a un promotor heterólogo. En otro aspecto más, la invención proporciona este polinucleótido aislado definido adicionalmente como comprendido de un vector de transformación de plantas. Como se usa en el presente documento, la captación por un nematodo parásito de las plantas incluye ingestión de una o más secuencias por el nematodo, por ejemplo, por alimentación. En realizaciones no limitantes específicas, la captación puede lograrse poniendo en contacto un nematodo parásito de las plantas con una composición que comprende uno o más ácidos nucleicos según la invención. Por ejemplo, la captación también puede lograrse remojando los nematodos parásitos de las plantas con una disolución que comprende el (los) ácido(s) nucleico(s).

La invención también se refiere a una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria producida a partir de la expresión del polinucleótido anterior, en el que la captación de dicha secuencia de ribonucleótidos por un nematodo parásito de las plantas inhibe el crecimiento de dicho nematodo. La invención proporciona además una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria producida preparando una secuencia de polinucleótidos recombinante que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos, en la que la primera secuencia de polinucleótidos comprende un polinucleótido aislado, cuya captación por un nematodo parásito de las plantas inhibe el crecimiento, alimentación o desarrollo de dicho nematodo, en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en el que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar la molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada. La inhibición del crecimiento de nematodos, alimentación o desarrollo puede llevarse a cabo inhibiendo la expresión de una secuencia de nucleótidos en el nematodo parásito de las plantas que es sustancialmente complementaria a la secuencia del primer polinucleótido.

La invención proporciona además un vector de transformación de plantas que comprende la secuencia de nucleótidos anteriormente mencionada, en el que la secuencia está operativamente ligada a un vector heterólogo funcional en una célula vegetal, y a células transformadas con el vector. Las células pueden ser procariotas o eucariotas. En particular, pueden ser células vegetales. También se contemplan plantas y semillas derivadas de tales células vegetales transformadas. La invención proporciona además un producto de materias primas producido a partir de una planta tal, en el que dicho producto de materias primas comprende una cantidad detectable del polinucleótido anterior o un ribonucleótido expresado a partir del mismo. También se contemplan procedimientos para producir un producto de materias primas tal, obteniéndose tales plantas transformadas y preparando alimentos

: o pienso a partir de ellas. En particular, el alimento o pienso se define como aceite, comida, proteína, almidón, harina

: o forraje.

La invención también se refiere a procedimientos para controlar una población de un nematodo parásito de las plantas, tal como H. glycines, que comprende proporcionar un agente que comprende una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que funciona tras ser captada por el nematodo para inhibir una función biológica dentro de dicho nematodo, en los que

(i): el agente comprende un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1920 o complementos de la misma; o

(ii): dichas secuencias de polinucleótidos presentan del 95 al 100 % de identidad de secuencias de nucleótidos a lo largo de al menos de 19 a 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de dicho nematodo y se hibrida con una segunda secuencia de polinucleótidos que es complementaria a dicha primera secuencia de polinucleótidos, y en el que dicha secuencia codificante derivada de dicho nematodo es SEC ID Nº:

1920 o complementos de la misma.

La invención también se refiere a un procedimiento de control de una población de nematodos parásitos de las plantas que comprende proporcionar en la planta huésped de un nematodo parásito de las plantas una célula vegetal transformada que expresa la secuencia de polinucleótidos anterior, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por el nematodo parásito de las plantas para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce disminución del crecimiento del nematodo o población de nematodos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.

La invención proporciona además un procedimiento de reducción del número de sitios de alimentación de Heterodera establecidos en el tejido de raíz de una planta huésped, que comprende proporcionar en la planta huésped de Heterodera sp. una célula vegetal transformada que expresa la secuencia de polinucleótidos anterior, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por Heterodera sp. para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce una disminución en el número de sitios de alimentación establecidos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.

La invención se refiere además a un procedimiento de control de la infestación por la plaga de nematodos de planta en una planta que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de nematodos de planta un ARNbc que comprende:

a) una secuencia de nucleótidos sentido; y

b) una secuencia de nucleótidos antisentido complementaria a dicha secuencia de nucleótidos sentido,

en el que dicha secuencia de nucleótidos sentido comprende la primera secuencia de nucleótidos como se ha definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de mejora del rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infección por nematodos parásitos de las plantas o mejora de la tolerancia a la sequía, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) introducir el polinucleótido anterior en dicha planta de cultivo; b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido, en el que la expresión de dicho polinucleótido inhibe la infección por nematodos parásitos de las plantas o crecimiento y pérdida de rendimiento debido a la infección por nematodos parásitos de las plantas o mejora la tolerancia a la sequía. En particular, la planta de cultivo puede ser soja (Glycine max) y el nematodo parásito de las plantas es un nematodo tilénquido tal como H. glycines.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento de modulación de la expresión de un gen diana en una célula de nematodo parásito de las plantas, comprendiendo el procedimiento: (a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARNbc de SEC ID Nº: 1920, operativamente ligado a un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, en el que dicho ARNbc inhibe la función del polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1920; (b) cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo de células vegetales que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas; (b) cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo de células vegetales que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas; (c) seleccionar células vegetales transformadas que han integrado la secuencia de ácidos nucleicos en sus genomas; (d) cribar las células vegetales transformadas para la expresión del ARNbc codificado por la secuencia de ácidos nucleicos; y (e) seleccionar una célula vegetal que expresa el ARNbc. También pueden regenerarse plantas a partir de tales células vegetales. En particular, “modular la expresión” puede comprender inhibir la expresión.

Descripción detallada de la invención

Lo siguiente es una descripción detallada de la invención proporcionada para ayudar a aquellos expertos en la materia en la práctica de la presente invención.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para el control genético de infestaciones por nematodos parásitos de las plantas. También se proporcionan procedimientos para identificar genes esenciales para el ciclo vital de un nematodo parásito de las plantas para su uso como diana para el control mediado por ARNbc de una población de nematodos. Los vectores de plásmido de ADN que codifican moléculas de ARNbc se diseñan para suprimir genes de nematodos esenciales para el crecimiento y desarrollo. Por ejemplo, la presente invención proporciona procedimientos y tecnologías de ADN recombinante para reprimir o inhibir pos-transcripcionalmente la expresión de una secuencia codificante diana en un nematodo parásito de las plantas para proporcionar un efecto protector que permite que el nematodo parásito de las plantas ingiera una o más moléculas de ácido ribonucleico (ARN) bicatenario o interferente pequeño transcritas de toda o una porción de una secuencia codificante diana, controlando así la infección. Por tanto, la presente invención se refiere a la inhibición específica para secuencia de la expresión de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNbc), que incluye ARN interferente pequeño (ARNip), para lograr los niveles previstos del control de nematodos.

Un procedimiento de inhibición de la función de genes diana dentro del nematodo quístico de la soja patógeno de las plantas, Heterodera glycines, también se proporciona por la presente invención, y puede llevarse a cabo por interferencia por ARN, produciendo la alteración del ciclo vital del patógeno. Genes diana óptimos para la alteración incluyen genes esenciales para el ciclo vital en los que la alteración produce alta muerte por penetración de las poblaciones de parásitos o “muerte genética” bloqueando la reproducción con daño por alimentación mínimo a la planta, reducción en el número de sitios de alimentación establecidos y mínimos gusanos que escapan viables que alcanzan la siguiente generación. Otro aspecto de la presente invención proporciona los ácidos nucleicos de cada uno de los 300 genes diana predichos que son esenciales para el crecimiento y/o desarrollo de H. glycines (FIG 3). Las características usadas para predecir tales dianas incluyen ortología con genes de C. elegans conocidos con fenotipos de interferencia por ARN fuertes y reproducibles, y patrón de expresión en H. glycines.

En otro aspecto más de la presente invención se proporciona un conjunto de secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas como se exponen en SEC ID Nº: 1920. La presente invención proporciona una molécula de ARNbc estabilizada para la expresión de uno o más ARN para la inhibición de la expresión de un gen diana en un nematodo parásito de las plantas, expresado a partir de estas secuencias y fragmentos de las mismas. Un ARNbc estabilizado, que incluye una molécula de ARNbc o ARNip, puede comprender al menos dos secuencias codificantes que están dispuestas en una orientación sentido y una antisentido con respecto a al menos un promotor, en el que la secuencia de nucleótidos que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante están enlazadas o conectadas por una secuencia espaciadora de al menos de cinco a mil nucleótidos, en el que la hebra codificante y la hebra no codificante puede ser de una longitud diferente, y en el que cada una de las dos secuencias codificantes comparte al menos el 80 % de identidad de secuencias, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o el 100 % de identidad de secuencias, con una cualquiera o más secuencias de nucleótidos expuestas en SEC ID Nº: 1920.

En otro aspecto más, la invención proporciona construcciones de ADN recombinante que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNbc descrita en el presente documento. El ARNbc puede formarse por transcripción de una hebra de la molécula de ARNbc de una secuencia de nucleótidos que es al menos del 80 % al 100 % idéntica a una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1920. Tales construcciones de ADN recombinante pueden definirse como que producen moléculas de ARNbc que pueden inhibir la expresión de gen(es) diana endógeno(s) en una célula de nematodo parásito de las plantas tras la ingestión. La construcción puede comprender una secuencia de nucleótidos de la invención operativamente ligada a una secuencia promotora que funciona en la célula huésped, tal como una célula vegetal. Un promotor tal puede ser específico para tejido y puede, por ejemplo, ser específico para un tipo de tejido que es el objeto del ataque de los nematodos parásitos de las plantas. En el caso de un patógeno de la raíz o foliar, respectivamente, por ejemplo, puede desearse usar un promotor que proporciona expresión preferida por la raíz u hoja, respectivamente.

Las construcciones de ácidos nucleicos según la invención puede comprender al menos una secuencia de nucleótidos que no se produce naturalmente que pueda transcribirse en un ARN monocatenario que pueda formar una molécula de ARNbc in vivo mediante hibridación intermolecular. Tales secuencias de ARNbc se auto-ensamblan y pueden proporcionarse en la fuente de nutrición de un nematodo parásito de las plantas para lograr la inhibición deseada.

Una construcción de ADN recombinante puede comprender dos secuencias que no se producen naturalmente diferentes que, cuando se expresan in vivo como secuencias de ARNbc y se proporcionan en los tejidos de la planta huésped de un nematodo parásito de las plantas, inhiben la expresión de al menos dos genes diana diferentes en el nematodo parásito de las plantas. En ciertas realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8 ó 10 o más ARNbc diferentes se producen en una célula o planta que comprende la célula, que tienen un efecto inhibidor de nematodos. Los ARNbc pueden expresarse a partir de múltiples construcciones introducidas en diferentes eventos de transformación o podrían introducirse en una única molécula de ácido nucleico. Los ARNbc pueden expresarse usando un único promotor o múltiples promotores. En una realización de la invención se producen ARNbc individuales que comprenden ácidos nucleicos homólogos a múltiples sitios dentro de un nematodo parásito de las plantas.

En otro aspecto más, la invención proporciona una célula huésped recombinante que tiene en su genoma al menos una secuencia de ADN recombinante que se transcribe para producir al menos una molécula de ARNbc que funciona cuando se ingiere por un nematodo parásito de las plantas para inhibir la expresión de un gen diana en el nematodo. La molécula de ARNbc puede codificarse por cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento y como se expone en el listado de secuencias. La presente invención también proporciona una célula vegetal transformada que tiene en su genoma al menos una secuencia de ADN recombinante descrita en el presente documento. También se proporcionan plantas transgénicas que comprenden una célula vegetal transformada tal, que incluyen plantas de progenie de cualquier generación, semillas y productos vegetales, comprendiendo cada uno el ADN recombinante. Las moléculas de ARNbc de la presente invención pueden encontrarse en la célula vegetal transgénica, por ejemplo, en el citoplasma. También pueden encontrarse en un espacio apoplástico.

La invención también proporciona una o más secuencias de estabilización, o “pinzas”, que puede estar sin relacionar con el gen de interés. Una pinza comprende preferentemente una región rica en GC que sirve para estabilizar termodinámicamente la molécula de ARNbc, y puede aumentar el silenciamiento de genes.

Adicionalmente se proporciona por la invención un fragmento de una secuencia de ácidos nucleicos SEC ID Nº: 1920. El fragmento puede definirse como que causa la muerte, inhibición del crecimiento o cese de la infección o alimentación por un nematodo parásito de las plantas, cuando se expresa como un ARNbc y es captado por el nematodo. El fragmento puede comprender, por ejemplo, al menos 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 o más nucleótidos contiguos de SEC ID Nº: 1920, o un complemento de los mismos. Un segmento de ADN beneficioso para su uso en la presente invención tiene al menos de 19 a 23, o 23 a 100 nucleótidos, pero menos de 2000 nucleótidos, de longitud. Serán particularmente útiles las secuencias de ARNbc que incluyen 23 a 300 nucleótidos homólogos a una secuencia diana de nematodos. La invención también proporciona un ácido ribonucleico expresado de cualquiera de tales secuencias que incluyen un ARNbc. Una secuencia seleccionada para su uso en la expresión de un agente de supresión génico puede construirse a partir de una única secuencia derivada de una o más especies de nematodos parásitos de las plantas diana y prevista para su uso en la expresión de un ARN que funciona en la supresión de un único gen o familia de genes en el uno o más patógenos diana, o que la secuencia de ADN puede construirse como una quimera a partir de una pluralidad de secuencias de ADN.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento de modulación de la expresión de un gen diana en una célula de nematodo, comprendiendo el procedimiento: (a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARNbc operativamente ligado a un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción; (b) cultivar la célula vegetal transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo de células vegetal que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas; (c) seleccionar células vegetales transformadas que han integrado el vector en sus genomas; (d) cribar las células vegetales transformadas para la expresión del ARNbc codificado por el vector; (e) seleccionar una célula vegetal que expresa el ARNbc; (f) opcionalmente regenerar una planta a partir de la célula vegetal que expresa el ARNbc; por lo que la expresión del gen en la planta es suficiente para modular la expresión de un gen diana en una célula de un nematodo parásito de las plantas que se pone en contacto con la planta o célula vegetal transformada. La modulación de la expresión génica puede incluir supresión parcial o completa de tal expresión.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento de supresión de la expresión génica en un nematodo parásito de las plantas, que comprende la provisión en el tejido del huésped del nematodo de una cantidad supresora de genes de al menos una molécula de ARNbc transcrita de una secuencia de nucleótidos como se describe en el presente documento, al menos un segmento de la cual es complementario a una secuencia de ARNm dentro de las células del nematodo parásito de las plantas. El procedimiento puede comprender además observar la muerte o inhibición del crecimiento del nematodo parásito de las plantas, y el grado de la sintomatología del huésped. Una molécula de ARNbc, que incluye su forma modificada tal como una molécula de ARNip, ingerida por un microorganismo patógeno según la invención puede ser al menos el 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % idéntica a una molécula de ARN transcrita de una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1920.

Por tanto, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas que incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que no se producen naturalmente y construcciones de ADN recombinante para transcribir moléculas de ARNbc de la presente invención, que suprimen o inhiben la expresión de una secuencia codificante endógena o una secuencia codificante diana en el nematodo parásito de las plantas cuando se introduce en el mismo. También se contemplan plantas transgénicas que (a) contienen secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de ácidos nucleicos aisladas y sustancialmente purificadas y las construcciones de ADN recombinante que no se producen naturalmente para transcribir las moléculas de ARNbc para controlar infecciones por nematodos parásitos de las plantas, y (b) muestran resistencia y/o tolerancia potenciada a las infecciones. También están incluidas composiciones que contienen las secuencias de nucleótidos de ARNbc de la presente invención para su uso en aplicaciones tópicas sobre plantas o sobre animales o en el entorno de un animal para lograr la eliminación o reducción de la infección por nematodos parásitos de las plantas.

Las secuencias de ADNc que codifican proteínas o partes de proteínas esenciales para la supervivencia, tales como las secuencias de aminoácidos que participan en diversas rutas bioquímicas metabólicas o catabólicas, división celular, reproducción, metabolismo de la energía y digestión pueden seleccionarse para su uso en preparar moléculas de ARN bicatenario que van a proporcionarse en la planta huésped de un nematodo parásito de las plantas. Como se describe en el presente documento, la ingestión de composiciones por un organismo diana que contiene uno o más ARNbc, al menos un segmento del cual se corresponde con al menos un segmento de ARN sustancialmente idéntico producido en las células del patógeno diana, puede producir la muerte u otra inhibición de la diana. Estos resultados indican que una secuencia de nucleótidos, tanto ADN como ARN, derivada de un nematodo parásito de las plantas puede usarse para construir células vegetales resistentes a la infestación por el nematodo. La planta huésped del nematodo, por ejemplo, puede transformarse para contener una o más de las secuencias de nucleótidos derivadas del nematodo que se proporcionan en el presente documento. La secuencia de nucleótidos transformada en el huésped puede codificar uno o más ARN que se forman en una secuencia de ARNbc en las células o fluidos biológicos dentro del huésped transformado, proporcionando así el ARNbc si/cuando el nematodo parásito de las plantas forma/e una relación nutritiva con el huésped transgénico. Esto puede producir la supresión de la expresión de uno o más genes en las células del nematodo parásito de las plantas y, por último lugar, muerte o inhibición de su crecimiento o desarrollo.

La presente invención se refiere, en general, al control genético de nematodos parásitos de las plantas en

organismos huésped. Más particularmente, la presente invención incluye procedimientos para la administración de agentes de control de nematodos a nematodos parásitos de las plantas. Tales agentes de control producen, directamente o indirectamente, una alteración en la capacidad del nematodo parásito de las plantas para alimentarse, crecer o de otro modo producir enfermedad en un huésped diana. La presente invención proporciona en una realización un procedimiento que comprende la administración de moléculas de ARNbc estabilizadas a nematodos parásitos de las plantas como un medio para la supresión de genes elegidos como diana en el nematodo parásito de las plantas, consiguiendo así el control deseado de la enfermedad de la planta en el nematodo huésped.

En cumplimiento de lo anterior, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de un gen diana en un nematodo parásito de las plantas, produciendo el cese del crecimiento, desarrollo, reproducción y/o alimentación, y eventualmente puede producir la muerte del nematodo parásito de las plantas. El procedimiento comprende en una realización introducir moléculas de nucleótidos de ARN bicatenario (ARNbc) parciales o completamente estabilizadas, que incluyen sus formas modificadas tales como secuencias de ARN interferente pequeño (ARNip), en una composición nutritiva para el nematodo parásito de las plantas, y proporcionar la composición nutritiva o fuente de alimento para el nematodo parásito de las plantas. La ingestión de la composición nutritiva que contiene las moléculas bicatenarias o de ARNip produce la captación de las moléculas por las células del nematodo, produciendo la inhibición de la expresión de al menos un gen diana en las células del nematodo. La inhibición del gen diana ejerce un efecto perjudicial sobre el nematodo. Los procedimientos y composiciones asociadas pueden usarse para limitar o eliminar infección o parasitismo de una planta o célula vegetal por un nematodo, en o sobre cualquier tejido huésped o entorno en el que el nematodo esté presente proporcionando una o más composiciones que comprenden las moléculas de ARNbc descritas en el presente documento en el huésped del nematodo.

En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNbc proporcionadas por la invención comprenden secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia como se expone en SEC ID Nº: 1920, cuya inhibición en un nematodo parásito de las plantas produce la reducción o eliminación de una proteína o agente de secuencia de nucleótidos que es esencial para el crecimiento y desarrollo de nematodos u otra función biológica. La secuencia de nucleótidos seleccionada puede presentar del 80 % al 100 % de identidad de secuencias con las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 1920, que incluyen el complemento de las mismas. Tal inhibición puede describirse como específica porque se elige una secuencia de nucleótidos de una porción del gen diana de la que se transcribe el ARNbc o ARNip inhibidor. El procedimiento es eficaz en inhibir la expresión de al menos un gen diana y puede usarse para inhibir muchos tipos diferentes de genes diana en el nematodo parásito de las plantas.

Las secuencias identificadas como que tienen un efecto protector de nematodos pueden expresarse fácilmente como moléculas de ARNbc mediante la creación de construcciones de expresión apropiadas. Por ejemplo, tales secuencias pueden expresarse como una estructura de horquilla y de tallo y lazo tomando un primer segmento correspondiente a una secuencia de SEC ID Nº: 1920, o un fragmento de la misma, enlazando esta secuencia con una segunda región espaciadora de segmento que no es homóloga o complementaria al primer segmento, y enlazando ésta con un tercer segmento que transcribe un ARN, en el que al menos una porción del tercer segmento es sustancialmente complementaria al primer segmento. Una construcción tal forma una estructura de tallo y lazo por hibridación del primer segmento con el tercer segmento y se forma una estructura de lazo que comprende el segundo segmento (documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993). El ARNbc puede generarse, por ejemplo, en forma de una estructura bicatenaria tal como una estructura de tallo y lazo (por ejemplo, horquilla), por lo que la producción de ARNip elegido como diana por una secuencia de nematodos se potencia por co-expresión de un fragmento del gen elegido como diana, por ejemplo, en una casete expresable en planta adicional, que conduce a la producción de ARNip potenciada, o reduce la metilación para prevenir el silenciamiento de genes transcripcionales del promotor de la horquilla de ARNbc (por ejemplo, el documento WO05/019408).

Los procedimientos y composiciones de la presente invención pueden aplicarse a cualquier planta monocotiledónea y dicotiledónea, dependiendo del control de patógeno (por ejemplo, nematodo) deseado. Ejemplos de tales plantas incluyen, sin limitación, plantas de alfalfa, alcachofa, espárrago, cebada, judías, remolacha, brócoli, col, canola, zanahoria, yuca, coliflor, maíz, algodón, pepino, uva, avena, cebolla, guisante, cacahuete, patata, arroz, centeno, sorgo, soja, espinaca, calabaza alargada, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tabaco, tomate, hierba de césped y trigo.

Nematodos parásitos de plantas ejemplares de los que las plantas pueden protegerse por la presente invención, y sus plantas correspondientes, incluyen, pero no se limitan a: alfalfa: Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Pratylenchus spp., Paratylenchus spp., Xiphinema spp.; banana: Radopholus similis, Helicotylenchus multicinctus, M. incognita, M. arenaria, M. javanica, Pratylenchus coffeae, Rotylenchulus reniformis; judías y guisantes: Meloidogyne spp., Heterodera spp., Belonolaimus spp., Helicotylenchus spp., Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Trichodorus spp.; yuca: Rotylenchulus reniformis, Meloidogyne spp.; cereales: Anguina tritici (almidonero, centeno, trigo de espelta), Bidera avenae (avena, trigo), Ditylenchus dipsaci (centeno, avena), Subanguina radicicola (avena, cebada, trigo, centeno), Meloidogyne naasi (cebada, trigo, centeno), Pratylenchus spp. (avena, trigo, cebada, centeno), Paratylenchus spp. (trigo), Tylenchorhynchus spp. (trigo, avena); garbanzos: Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.; cítricos: Tylenchulus semipenetrans, Radopholus similis,

Radopholus citrophilus, Hemicycliophora arenaria, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp., Bolonolaimus longicaudatus, Trichodorus spp., Paratrichodorus spp., Xiphinema spp.; trébol: Meloidogyne spp., Heterodera trifolii; maíz: Pratylenchus spp., Paratrichodorus minor, Longidorus spp., Hoplolaimus columbus; algodón: Meloidogyne incognita, Belonolaimus longicaudatus, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus galeatus, Pratylenchus spp., Tylenchorhynchus spp., Paratrichodorus minor; uvas: Xiphinema spp., Pratylenchus vulnus, Meloidogyne spp., Tylenchulus semipenetrans, Rotylenchulus reniformis; céspedes: Pratylenchus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Xiphinema spp., Ditylenchus spp.; cacahuete: Pratylenchus spp., Meloidogyne hapla, Meloidogyne arenaria, Criconemella spp., Belonolaimus longicaudatus; guisante paloma: Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.; patata: Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Trichodorus primitivus, Ditylenchus spp., Paratrichodorus spp., Nacobbus aberrans; arroz: Aphelenchiodes besseyi, Ditylenchus angustus, Hirchmanniella spp., Heterodera oryzae, Meloidogyne spp.; frutos pequeños: Meloidogyne spp.; Pratylenchus spp., Xiphinema spp., Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Aphelenchoides spp.; soja: Heterodera glycines, Meloidagyne incognita, Meloidogyne javanica, Belonolaimus spp., Hoplolaimus columbus; remolacha azucarera: Heterodera schachtii, Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne spp., Nacobbus aberrans, Trichodorus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus spp.; caña de azúcar: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus spp., Heterodera spp., Hoplolaimus spp., Helicotylenchus spp., Scutellonema spp., Belonolaimus spp., Tylenchorhynchus spp., Xiphinema spp., Longidorus spp., Paratrichodorus spp.; tabaco: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Tylenchorhynchus claytoni, Globodera tabacum, Trichodorus spp., Xiphinema americanum, Ditylenchus dipsaci, Paratrichodorus spp.; y tomate: Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.

La invención también proporciona combinaciones de procedimientos y composiciones para controlar la infección por nematodos parásitos de las plantas. Un medio proporciona un procedimiento de ARNbc como se describe en el presente documento para proteger plantas de nematodos parásitos de las plantas junto con uno o más agentes químicos que presentan características diferentes de aquellas presentadas por los procedimientos de ARNbc y composiciones, y pueden interferir con el crecimiento o desarrollo de nematodos.

A. Composiciones y construcciones de ácido nucleico

La invención proporciona construcciones de ADN recombinante para su uso en conseguir la transformación estable de dianas huésped particulares. Las dianas huésped transformadas pueden expresar niveles eficaces de moléculas de ARNbc o de ARNip preferidas a partir de las construcciones de ADN recombinante. Pueden proporcionarse pares de secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas de información de bibliotecas de ADNc y/o bibliotecas genómicas. Los pares de secuencias de nucleótidos pueden derivarse de cualquier nematodo para su uso como cebadores de la amplificación térmica para generar las moléculas de ARNbc y de ARNip de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término “ácido nucleico” se refiere a un polímero mono o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas del extremo 5' al 3'. El “ácido nucleico” también puede contener opcionalmente bases de nucleótidos que no se producen naturalmente o alteradas que permiten la correcta lectura por una polimerasa y no reducen la expresión de un polipéptido codificado por ese ácido nucleico. El término “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácidos nucleicos” se refiere a tanto las hebras codificantes como no codificantes de un ácido nucleico como cualquier hebra única individual o en el dúplex. El término “ácido ribonucleico” (ARN) es inclusivo de iARN (ARN inhibidor), ARNbc (ARN bicatenario), ARNip (ARN interferente pequeño), ARNm (ARN mensajero), miARN (micro-ARN), ARNt (ARN de transferencia, tanto cargado como sin cargar con un aminoácido correspondiente acilado) y ARNc (ARN complementario), y el término “ácido desoxirribonucleico” (ADN) incluye ADNc y ADN genómico e híbridos de ADN-ARN. La palabras “segmento de ácido nucleico”, “segmento de la secuencia de nucleótidos”, o más generalmente “segmento”, se entenderán por aquellos expertos en la materia en término funcional que incluye tanto secuencias genómicas, secuencias de ARN ribosómico, secuencias de ARN de transferencia, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operones como secuencias de nucleótidos manipuladas más pequeñas que expresan o pueden adaptarse para expresar proteínas, polipéptidos o péptidos.

Según la invención se proporcionan secuencias de nucleótidos cuya expresión produce una secuencia de ARN que es sustancialmente homóloga a toda o parte de una molécula de ARN de un gen elegido como diana en un nematodo parásito de las plantas que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma del nematodo. Así, después de la ingestión de la secuencia de ARN estabilizada, la regulación por disminución de la secuencia de nucleótidos del gen diana en las células del nematodo parásito de las plantas puede obtenerse produciendo un efecto perjudicial sobre el crecimiento, viabilidad, proliferación o reproducción del nematodo.

Como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente homólogo” u “homología sustancial”, con referencia a una secuencia de ácidos nucleicos, incluye una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia codificante de SEC ID Nº: 1920, como se expone en el listado de secuencias, o los complementos de la misma. Secuencias que se hibridan bajo condiciones rigurosas o los complementos de la misma son aquellos que permiten que tenga lugar un alineamiento antiparalelo entre las dos secuencias, y entonces las dos secuencias son capaces, bajo condiciones rigurosas, de formar enlaces de hidrógeno con bases correspondientes en la cadena opuesta para formar una molécula dúplex que es

suficientemente estable bajo las condiciones rigurosas para ser detectable usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Secuencias sustancialmente homólogas tienen preferentemente del 70 % al 80 % de identidad de secuencias, o más preferentemente del 80 % al 85 % de identidad de secuencias, o lo más preferible del 90 % al 95 % de identidad de secuencias, al 99 % de identidad de secuencias, con las secuencias de nucleótidos referentes como se expone en SEC ID Nº: 1920, en el listado de secuencias, o los complementos de la misma.

Como se usa en el presente documento, el término “ortólogo” se refiere a un gen en dos o más especies que se ha desarrollado a partir de una secuencia de nucleótidos ancestral común y puede retener la misma función en las dos

o más especies.

Como se usa en el presente documento, el término “identidad de secuencias”, “similitud de secuencias” u “homología” se usan para describir relaciones de secuencias entre dos o más secuencias de nucleótidos. El porcentaje de “identidad de secuencias” entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas con una ventana de comparación, en el que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido se produce en ambas secuencias dando el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias. Una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia se dice que es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Una primera secuencia de nucleótidos cuando se observa en la dirección de 5' a 3' se dice que es un “complemento” de, o complementaria a, una segunda secuencia de nucleótidos o de referencia observada en la dirección de 3' a 5' si la primera secuencia de nucleótidos presenta complementariedad completa con la segunda secuencia o de referencia. Como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas de la secuencia de ácidos nucleicos presentan “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las secuencias leída de 5' a 3' es complementario a cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee de 3' a 5'. Una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de referencia presentará una secuencia idéntica a la secuencia de complemento inversa de la secuencia de nucleótidos de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la materia y son fácilmente entendidos por aquellos expertos habituales en la materia.

Como se usa en el presente documento, una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, normalmente 50 a 100, más normalmente 100 a 150, en las que una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén óptimamente alineadas. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 % o menos con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Aquellos expertos en la materia deben referirse a los procedimientos detallados usados para el alineamiento de secuencias en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., EE.UU.) o se refieren a Ausubel y col., (1998) para una discusión detallada del análisis de secuencias.

La presente invención proporciona secuencias de ADN que pueden expresarse como un ARN en una célula o microorganismo para inhibir la expresión de genes diana en una célula, tejido u órgano de un nematodo parásito de las plantas. Las secuencias comprenden una molécula de ADN que codifica una o más secuencias de nucleótidos diferentes, en las que cada una de las diferentes secuencias de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido. Las secuencias pueden estar conectadas por una secuencia espaciadora que codifica una molécula de ARNbc de la presente invención. La secuencia espaciadora puede constituir parte de la secuencia de nucleótidos sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido y se forma dentro de la molécula de ARNbc entre las secuencias sentido y antisentido. La secuencia de nucleótidos sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen diana o un derivado del mismo o una secuencia complementaria al mismo. La molécula de ADNbc puede ponerse operativamente bajo el control de una secuencia promotora que funciona en la célula, tejido u órgano del huésped que expresa el ADNbc para producir moléculas de ARNbc. En una realización, la secuencia de ADN puede derivarse de una secuencia de nucleótidos como se expone en SEC ID Nº: 1920, en el listado de secuencias.

La invención también proporciona una secuencia de ADN para la expresión en una célula de una planta que, tras la expresión del ADN a ARN e ingestión por un nematodo parásito de las plantas, consigue la supresión de un gen diana en una célula, tejido u órgano de un nematodo parásito de las plantas. El ARNbc puede comprender una o múltiples secuencias de genes estructurales, en las que cada una de las secuencias de genes estructurales comprende una secuencia de nucleótidos sentido y una secuencia de nucleótidos antisentido que pueden estar conectadas por una secuencia espaciadora que forma un lazo dentro de las secuencias complementarias y antisentido. La secuencia de nucleótidos sentido o la secuencia de nucleótidos antisentido es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen diana, derivado del mismo, o secuencia complementaria al mismo. La una o más secuencias de genes estructurales pueden ponerse operativamente bajo el control de una o más secuencias promotoras, al menos una de las cuales es operable en la célula, tejido u órgano de un organismo procariota o eucariota, particularmente una célula vegetal. Se conocen procedimientos para expresar una molécula de supresión de genes en plantas (por ejemplo, el documento WO06073727; publicación de EE.UU. 2006/0200878),

y puede usarse para expresar una secuencia de nucleótidos de la presente invención.

Una secuencia o fragmento de gen para el control de nematodos parásitos de las plantas según la invención puede clonarse entre dos promotores específicos para tejido, tales como dos promotores específicos para raíz que son operables en una célula vegetal transgénica y se expresan en el interior para producir ARNm en la célula vegetal transgénica que forman moléculas de ARNbc con ella. Ejemplos de promotores específicos para raíz se conocen en la técnica (por ejemplo, el promotor RB7 inducido por nematodos; patente de EE.UU. 5.459.252; Opperman y col., 1994). Las moléculas de ARNbc contenidas en tejidos vegetales son ingeridas por un nematodo parásito de las plantas de manera que se logre la supresión prevista de la expresión de genes diana.

El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor fuerte arquetípico común en aplicaciones en plantas transgénicas, o un promotor relacionado tal como el promotor E35S o FMV, pueden emplearse para accionar los genes de resistencia a nematodos, particularmente para nematodos quísticos (véase el Ejemplo 8). También se han identificado promotores que dirigen la expresión génica en estructuras de alimentación inducidas por nematodos dentro de una planta (por ejemplo, Gheysen y Fenoll, 2002). Así, puede utilizarse un promotor identificado de entre genes que se expresan reproduciblemente en sitios de alimentación. Ejemplos de genes regulados por incremento en sitios de alimentación (sincitios) formados por nematodos incluyen Hs1pro-1 (Thurau y col., 2003), AtSUC2 normalmente expresado en células acompañantes (Juergensen y col., 2003), At17.1 expresado en tejidos vasculares y puntas de la raíz (Mazarei y col., 2004), FGAM sintasa (fosforribosilformil-glicinamidina sintasa) (Vaghchhipawala y col., 2004) y ABI3 (De Meutter y col., 2005), entre otros. Los sincitios formados en respuesta a nematodos quísticos se han descrito como simplásticamente aislados que carecen de plasmodesmos para tejidos circundantes (Bockenhoff y Grundler 1994; Bockenhoff y col., 1996), sin embargo, se ha mostrado que macromoléculas de hasta 30 kD pueden moverse de las células acompañantes del floema al sincitio (Hoth y col., 2005). Por tanto, la expresión génica en el floema también puede ser adecuada para la administración de moléculas efectoras a los sitios de alimentación.

Una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención puede comprender una repetición invertida separada por una “secuencia espaciadora” La secuencia espaciadora puede ser una región que comprende cualquier secuencia de nucleótidos que facilita la formación de la estructura secundaria entre cada repetición, donde esto se requiera. En una realización de la presente invención, la secuencia espaciadora es parte de la secuencia codificante sentido o antisentido para ARNm. La secuencia espaciadora puede comprender alternativamente cualquier combinación de nucleótidos u homólogos de los mismos que pueda enlazarse covalentemente con una molécula de ácido nucleico. La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de al menos 10-100 nucleótidos de longitud, o alternativamente al menos 100-200 nucleótidos de longitud, al menos 200-400 nucleótidos de longitud, o al menos 400-500 nucleótidos de longitud.

Las moléculas de ácidos nucleicos o fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos u otras moléculas de ácidos nucleicos en el listado de secuencias pueden hibridarse específicamente con otras moléculas de ácidos nucleicos en ciertas circunstancias. Como se usa en el presente documento, dos moléculas de ácidos nucleicos se dice que son capaces de hibridarse específicamente con otra si las dos moléculas pueden formar un estructura de ácido nucleicos bicatenaria antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el complemento de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Se dice que dos moléculas son “mínimamente complementarias” si pueden hibridase con otra con suficiente estabilidad para permitir que sigan hibridadas entre sí bajo al menos condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. Similarmente, se dice que las moléculas son complementarias si pueden hibridarse entre sí con estabilidad suficiente para permitir que sigan hibridadas entre sí bajo condiciones convencionales de “alta rigurosidad”. Condiciones de rigurosidad convencionales se describen por Sambrook y col., (1989), y por Haymes y col., (1985).

Por tanto, son permisibles desviaciones de la complementariedad completa, en tanto que tales desviaciones no excluyan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Así, con el fin de que una molécula de ácido nucleico o un fragmento de la molécula de ácido nucleico sirva de cebador o sonda, necesita ser solo suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable bajo el disolvente particular y las concentraciones de sales empleadas.

Condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a 45 ºC, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 ºC, son conocidas para aquellos expertos en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology (1989). Por ejemplo, la concentración de sales en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de 2,0 x SSC a 50 ºC a una alta rigurosidad de 0,2 x SSC a 50 ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, 22 ºC, a condiciones de alta rigurosidad a 65 ºC. Puede variarse tanto la temperatura como la sal, o tanto la temperatura como la concentración de sales pueden mantenerse constante mientras que se cambia la otra variable. Un ácido nucleico para su uso en la presente invención puede hibridarse específicamente con una o más moléculas de ácidos nucleicos de un nematodo o complementos de las mismas bajo tales condiciones. Preferentemente, un ácido nucleico para su uso en la presente invención presentará al menos a partir del 80 %, o al menos a partir del 90 %, o al menos a partir del 95 %, o al menos a partir del 98 % o incluso del 100 % de identidad de secuencias con una o más moléculas de ácidos nucleicos como se expone en SEC ID Nº: 1920, en el listado de secuencias.

Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden sintetizarse, tanto completamente como en parte, especialmente si se desea proporcionar secuencias preferidas para plantas, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Así, toda o una porción de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden sintetizarse usando codones preferidos por un huésped seleccionado. Codones preferidos para especies pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones usados más frecuentemente en las proteínas expresadas en una especie de huésped particular. Otras modificaciones de las secuencias de nucleótidos pueden producir mutantes que tienen actividad ligeramente alterada. Las secuencias de nucleótidos de ARNbc o de ARNip comprenden hebras dobles de ribonucleótido polimerizado y pueden incluir modificaciones a tanto el esqueleto fosfato-azúcar como el nucleósido. Las modificaciones en la estructura de ARN pueden confeccionarse para permitir inhibición genética específica. En una realización, las moléculas de ARNbc pueden modificarse mediante un proceso enzimático de manera que puedan generarse moléculas de ARNip. El ARNip puede mediar eficazmente en el efecto de regulación por disminución para algunos genes diana en algunos patógenos. Este proceso enzimático puede llevarse a cabo utilizando una enzima RNAsa III o una enzima DICER, presente en las células de un insecto, un animal vertebrado, un hongo o una planta en la ruta de iARN eucariota (Elbashir y col., 2001; Hamilton y Baulcombe, 1999). Este proceso también puede utilizar una DICER o RNAsa III recombinante introducida en las células de un insecto diana mediante técnicas de ADN recombinante que son fácilmente conocidas para el experto en la materia. Tanto la enzima DICER como RNAsa III, que se producen naturalmente en un patógeno o que se preparan mediante técnicas de ADN recombinante, escinden hebras de ARNbc más grandes en oligonucleótidos más pequeños. Las enzimas DICER cortan específicamente las moléculas de ARNbc en trozos de ARNip siendo cada uno de 19-25 nucleótidos de longitud mientras que las enzimas RNAsa III normalmente escinden las moléculas de ARNbc en ARNip de 12-15 pares de bases. Las moléculas de ARNip producidas por cualquiera de las enzimas tienen 2 a 3 nucleótidos protuberantes en 3', y extremos fosfato en 5' e hidroxilo de 3'. Las moléculas de ARNip generadas por la enzima RNAsa III son las mismas que aquellas producidas por enzimas Dicer en la ruta de iARN eucariota y, por tanto, son elegidas como diana y degradadas por un mecanismo de degradación de ARN celular inherente después de desenrollarse posteriormente, separarse en ARN monocatenario e hibridarse con las secuencias de ARN transcritas por el gen diana. Este procedimiento produce la eficaz degradación o eliminación de la secuencia de ARN codificada por la secuencia de nucleótidos del gen diana en el patógeno. El resultado es el silenciamiento de una secuencia de nucleótidos particularmente elegida como diana dentro del patógeno. Descripciones detalladas de procesos enzimáticos pueden encontrarse en Hannon (2002).

Una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede grabarse en medios legibles por ordenador. Como se usa en el presente documento, “medios legibles por ordenador” se refiere a cualquier medio tangible de expresión que pueda leerse y al que pueda accederse directamente por un ordenador. Tales medios incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético tales como disquetes, disco duro, medio de almacenamiento y cinta magnética; medios de almacenamiento ópticos tales como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctrico tales como RAM y ROM; archivos de ordenador formateados de reconocimiento óptico de caracteres, e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnético/óptico. Un experto puede apreciar fácilmente que cualquiera de los medios legibles por ordenador presentemente conocidos puede usarse para crear una fabricación que comprende medio legible por ordenador que tiene grabado en él una secuencia de nucleótidos de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, “grabado” se refiere a un procedimiento de guardar información en el medio legible por ordenador. Un experto puede adoptar fácilmente cualquiera de los procedimientos presentemente conocidos para grabar información en el medio legible por ordenador para generar medios que comprenden la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Una variedad de estructuras de almacenamiento de datos están disponibles para un experto para crear un medio legible por ordenador que tiene grabado en él una secuencia de nucleótidos de la presente invención. La elección de la estructura de almacenamiento de datos se basará generalmente en el medio elegido para acceder a la información grabada. Además, puede usarse una variedad de programas y formatos de procesadores de datos para guardar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención en el medio legible por ordenador. La información de secuencia puede representarse en un archivo de texto de procesamiento por palabras, formateado en software comercialmente disponible tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representarse en forma de un archivo de texto ASCII, guardado en una aplicación de base de datos, tal como DB2, Sybase u Oracle. El experto puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos de estructuración de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) con el fin de obtener medio legible por ordenador que tenga grabado en él la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención.

Está públicamente disponible software informático que permite que un experto acceda a la información de secuencia proporcionada en un medio legible por ordenador. Puede usarse software que implementa los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul y col., 1990) y BLAZE (Brutlag y col., 1993) en un sistema Sybase para identificar marcos de lectura abiertos (ORF) dentro de secuencias tales como Unigenes y EST que se proporcionan en el presente documento y que contienen homología con ORF o proteínas de otros organismos. Tales ORF son fragmentos que codifican proteínas dentro de las secuencias de la presente invención y son útiles en la producción de proteínas comercialmente importantes tales como enzimas usadas en la biosíntesis de aminoácidos, metabolismo, transcripción, traducción, procesamiento de ARN, ácido nucleico y una degradación de proteínas, modificación de proteínas y replicación, restricción, modificación, recombinación y reparación de ADN.

La presente invención proporciona además sistemas, particularmente sistemas basados en ordenador, que contienen la información de secuencia descrita en el presente documento. Tales sistemas se diseñan para identificar fragmentos comercialmente importantes de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Como se usa en el presente documento, “un sistema basado en ordenador” se refiere al medio de hardware, medio de software y medio de almacenamiento de datos usado para analizar la información de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. El medio de hardware mínimo de los sistemas basados en ordenador de la presente invención comprende una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto puede apreciar fácilmente que uno cualquiera del sistema basado en ordenador actualmente disponible es adecuado para su uso en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, “un motivo estructural diana” o “motivo diana” se refiere a cualquier secuencia racionalmente seleccionada o combinación de secuencias en las que las secuencias o secuencia(s) se eligen basándose en una configuración tridimensional que se forma tras el plegamiento del motivo diana. Hay una variedad de motivos diana conocidos en la técnica. Los motivos diana de proteína incluyen, pero no se limitan a, sitios activos enzimáticos y secuencias señal. Los motivos diana de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras, elementos en cis, estructuras de horquilla y elementos de expresión inducibles (secuencias de unión de proteína).

B. Vectores recombinantes y transformación de células huésped

Un vector de ADN recombinante puede ser, por ejemplo, un plásmido circular lineal o cerrado. El sistema de vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que va a introducirse en el genoma del huésped bacteriano. Además, un vector bacteriano puede ser un vector de expresión. Moléculas de ácidos nucleicos como se exponen en SEC ID Nº: 1920, o fragmentos de las mismas, pueden, por ejemplo, insertarse adecuadamente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o más huéspedes microbianos para accionar la expresión de una secuencia codificante ligada u otra secuencia de ADN. Muchos vectores están disponibles para este fin, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que va a insertarse en el vector y la célula huésped particular que va a transformarse con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped particular con la que es compatible. Los componentes de vector para transformación bacteriana generalmente incluyen uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcadores de selección y un promotor inducible que permite la expresión de ADN exógeno.

Los vectores de expresión y de clonación generalmente contienen un gen de selección, también denominado un marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para bacilos. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con una proteína heteróloga o fragmento de la misma producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y así sobreviven la pauta de selección.

Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor inducible que es reconocido por un organismo huésped bacteriano y está operativamente ligado al ácido nucleico. Promotores inducibles adecuados para su uso con huéspedes bacterianos incluyen promotor de -lactamasa, promotores PL y PR del fago  de E. coli y promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), y el promotor del operón de lactosa y variaciones de los mismos y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores inducibles bacterianos conocidos.

El término “operativamente ligada”, como se usa en referencia a una secuencia reguladora y una secuencia de nucleótidos estructural, significa que la secuencia reguladora produce expresión regulada de la secuencia de nucleótidos estructural ligada. “Secuencias reguladoras” o “elementos de control” se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 5' (secuencias no codificantes de 5'), dentro de, o en la dirección 3' (secuencias no traducidas de 3') de una secuencia de nucleótidos estructural, y que influyen en el momento correcto y nivel o cantidad de transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia de nucleótidos estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, potenciadores, estructuras de tallo-lazo, secuencias de unión a represor y secuencias de reconocimiento de la poliadenilación.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente enumerados emplea técnicas de ADN recombinante convencionales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, se confeccionan y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Ejemplos de vectores de expresión bacterianos disponibles incluyen los vectores de clonación y expresión multifuncionales de E. coli tales como Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA) en los que, por ejemplo, un ácido nucleico, o fragmento del mismo, mostrado en la FIG. 3 puede ligarse en el vector en marco con secuencias para la Met del extremo amino y los 7 residuos posteriores de -galactosidasa de manera que se produzca una proteína híbrida; y vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989).

La presente invención también contempla la transformación de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en una planta para lograr niveles de expresión inhibidores de nematodos de una o más moléculas de ARNbc. Un vector de transformación puede prepararse fácilmente usando procedimientos disponibles en la materia. El vector de transformación comprende una o más secuencias de nucleótidos que puede/pueden transcribirse en una molécula de ARN y que es/son sustancialmente homóloga/s y/o complementaria/s a una o más secuencias de nucleótidos codificadas por el genoma del nematodo diana, de forma que tras la captación del ARN transcrito de la una o más secuencias de nucleótidos por el nematodo parásito de las plantas haya regulación por disminución de la expresión de al menos una de las secuencias de nucleótidos respectivas del genoma del nematodo.

El vector de transformación puede llamarse una construcción de ADNbc y también puede definirse como una molécula recombinante, un agente de control de enfermedades, una molécula genética o una construcción genética quimérica. Una construcción genética quimérica de la presente invención puede comprender, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican uno o más transcritos antisentido, uno o más transcritos sentido, uno o más de cada uno de los anteriormente mencionados, en los que todo o parte de un transcrito de la misma es homólogo a toda o parte de una molécula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma de un patógeno.

En una realización, un vector de transformación de plantas comprende una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor heterólogo operativamente ligado a una o más secuencias de nucleótidos de la presente invención. La secuencia de nucleótidos es SEC ID Nº: 1920, como se exponen en el listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos incluye un segmento que codifica todo o parte de un ARN presente dentro de un transcrito de ARN de nematodo elegido como diana y puede comprender repeticiones invertidas de toda o una parte de un ARN de nematodo elegido como diana. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede contener una secuencia de intrón funcional posicionada tanto en la dirección 5' de la secuencia codificante como incluso dentro de la secuencia codificante, y también puede contener una secuencia conductora sin traducir de cinco prima (5') (es decir, una UTR o 5'-UTR) posicionada entre el promotor y el punto de iniciación de la traducción.

Un vector de transformación de plantas puede contener secuencias de más de un gen, permitiendo así la producción de más de un ARNbc para inhibir la expresión de dos o más genes en células de un nematodo diana. Un experto en la materia apreciará fácilmente que segmentos de ADN cuya secuencia se corresponde con la presente en diferentes genes pueden combinarse en un único segmento de ADN compuesto para la expresión en una planta transgénica. Alternativamente, un plásmido de la presente invención que ya contiene al menos un segmento de ADN puede modificarse por la inserción secuencial de segmentos de ADN adicionales entre las secuencias de potenciador y promotor y terminador. En el agente de control de enfermedades de la presente invención diseñado para la inhibición de múltiples genes, los genes que van a inhibirse pueden obtenerse de la misma especie de nematodos parásitos de las plantas con el fin de potenciar la eficacia del agente de control. En ciertas realizaciones, los genes pueden derivarse de diferentes nematodos parásitos de las plantas con el fin de ensanchar el intervalo de nematodos contra los que el (los) agente(s) es (son) eficaz (eficaces). Si se eligen múltiples genes como diana para la supresión o una combinación de expresión y supresión, puede fabricarse un elemento de ADN policistrónico como se ilustra y desvela en la publicación de EE.UU. 2004-0029283.

Promotores que funcionan en diferentes especies de plantas también son muy conocidos en la técnica. Promotores útiles para la expresión de polipéptidos en plantas incluyen aquellos que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos como se describe en Odell y col. (1985), y/o promotores que son temporalmente regulados, espacialmente regulados y espaciotemporalmente regulados. Promotores preferidos incluyen los promotores de CaMV35S potenciados, y el promotor de FMV35S. También puede preferirse un fragmento del promotor de CaMV35S que presenta especificidad por raíz. Con el fin de la presente invención puede ser preferible alcanzar los mayores niveles de expresión de estos genes dentro de los tejidos de raíz de las plantas. Se han identificado varios promotores específicos para raíz y se conocen en la técnica (por ejemplo, patentes de EE.UU. 5.110.732; 5.837.848 y 5.459.252; Hirel y col., 1992).

Un vector o construcción de ADN recombinante de la presente invención puede comprender un marcador de selección que confiere un fenotipo de selección a células vegetales. Los marcadores de selección también pueden usarse para seleccionar plantas o células vegetales que contienen los ácidos nucleicos exógenos que codifican polipéptidos o proteínas de la presente invención. El marcador puede codificar resistencia a biocidas, resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina) o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato). Ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero no se limitan a, un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, G418; un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen EPSP sintasa mutante que codifica resistencia a glifosato; un gen nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen acetolactato sintasa (ALS) mutante que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea; y un gen DHFR resistente a metotrexato. Están disponibles múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina y tetraciclina. Ejemplos de tales marcadores de selección se ilustran en las patentes de EE.UU. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.

Un vector recombinante o construcción de la presente invención también puede incluir un marcador de selección. Los marcadores de selección pueden usarse para monitorizar la expresión. Marcadores de selección a modo de ejemplo incluyen un gen -glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos

cromogénicos (Jefferson y col., 1987); un gen de sitio R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y col., 1988); un gen -lactamasa (Sutcliffe y col., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen luciferasa (Ow y col., 1986), un gen xylE (Zukowsky y col., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen -amilasa (Ikatu y col., 1990); un gen tirosinasa (Katz y col., 1983) que codifica una enzima que puede oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez condensa a melanina; una -galactosidasa, que cataliza un sustrato de -galactosa cromogénico.

Vectores de transformación de plantas preferidos incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.536.475; 4.693.977; 4.886.937 y 5.501.967; y EP 0122791). Los plásmidos de Agrobacterium rhizogenes (o “Ri”) también son útiles y conocidos en la técnica. Otros vectores de transformación de plantas preferidos incluyen los desvelados, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) y el documento EP 0120516.

En general puede preferirse introducir un ADN recombinante funcional en una localización no específica en un genoma de planta. En casos especiales puede ser útil insertar una construcción de ADN recombinante por integración específica para sitio. Existen varios sistemas de recombinación específicos para sitio que son conocidos por implantes funcionales, que incluyen cre-lox como se desvela en la patente de EE.UU. 4.959.317 y FLP-FRT como se desvela en la patente de EE.UU. 5.527.695.

Se cree que los procedimientos adecuados para la transformación de células huésped para su uso con la presente invención incluyen prácticamente cualquier procedimiento por el que el ADN pueda introducirse en una célula (véase, por ejemplo, Miki y col., 1993), tal como por transformación de protoplastos (patente de EE.UU. nº 5.508.184; Omirulleh y col., 1993), por capación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y col.,1985), por electroporación (patente de EE.UU. nº 5.384.253), por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; patentes de EE.UU. nº 5.302.523 y 5.464.765), por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de EE.UU. nº 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840 y 6.384.301) y por aceleración de partículas recubiertas con ADN (patentes de EE.UU. nº 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 y 6.403.865; Padgette y col., 1995). Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, las células de prácticamente cualquier especie pueden transformarse establemente. En el caso de especies pluricelulares, las células transgénicas pueden regenerarse en organismos transgénicos. El procedimiento más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (por ejemplo, Horsch y col., 1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de la tierra patógenas para plantas que transforman genéticamente células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responsables de la transformación genética de la planta. Descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y procedimientos para transferencia génica mediada por Agrobacterium se proporcionan por numerosas referencias, que incluyen Gruber y col., 1993; Miki y col., 1993, Moloney y col., 1989, y las patentes de EE.UU. nº: 4.940.838 y 5.464.763. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium y Mesorhizobium que interaccionan con plantas naturalmente pueden modificarse para mediar en la transferencia génica a varias plantas diversas. Estas bacterias simbióticas asociadas a plantas pueden hacerse competentes para la transferencia génica por adquisición de tanto un plásmido Ti desarmado como un vector binario adecuado (Broothaerts y col., 2005).

Se conocen procedimientos para la creación de plantas transgénicas y expresión de ácidos nucleicos heterólogos en plantas en particular y pueden usarse con los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento para preparar plantas transgénicas que presentan susceptibilidad reducida a alimentación por un nematodo diana. Los vectores de transformación de plantas pueden prepararse, por ejemplo, insertando los ácidos nucleicos productores de ARNbc desvelados en el presente documento en vectores de transformación de plantas e introduciendo éstos en plantas. Un sistema de vector conocido se ha derivado modificando el sistema de transferencia de genes natural de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende grandes plásmidos Ti (inductores de tumores) que contienen un gran segmento, conocidos como T-ADN, que se transfiere a plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia de T-ADN. La región de T-ADN está limitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados los genes inductores de tumor se han delecionado y las funciones de la región vir se utilizan para transferir ADN extraño limitado por las secuencias de frontera de T-ADN. La región T también puede contener un marcador de selección para la eficaz recuperación de plantas y células transgénicas, y un sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para la transferencia tal como un ácido nucleico que codifica ARNbc.

Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación con Agrobacterium normalmente contiene una simple secuencia de ADN recombinante individual insertada en un cromosoma y se denomina un evento transgénico. Puede denominarse que tales plantas transgénicas son heterocigóticas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homocigótica con respecto a un transgén puede obtenerse apareando sexualmente (autofecundando) una planta transgénica segregante independiente que contiene una única secuencia de genes exógena consigo misma, por ejemplo, una planta F0, para producir semilla F1. Un cuarto de la semilla F1 producida será homocigótica con respecto al transgén. La germinación de la semilla F1 produce plantas que pueden probarse para heterocigosidad, normalmente usando un ensayo de SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigotos y homocigotos (es decir, un ensayo de cigosidad). El cruce de una planta heterocigótica consigo misma u otra planta heterocigótica solo produce progenie heterocigótica.

C. Expresión de ácido nucleico y supresión de genes diana

La presente invención proporciona, como ejemplo, una planta huésped transformada de un organismo diana patógeno, células vegetales transformadas y plantas transformadas y su progenie. Las células vegetales transformadas y plantas transformadas pueden manipularse para expresar una o más de las secuencias de ARNbc

o ARNip, bajo el control de un vector heterólogo, descritas en el presente documento para proporcionar un efecto protector para patógenos. Estas secuencias pueden usarse para la supresión génica en un patógeno, reduciendo así el nivel o incidencia de enfermedad producida por el patógeno en un organismo huésped transformado protegido. Como se usa en el presente documento, el término “supresión génica” pretende referirse a cualquiera de los procedimientos muy conocidos para reducir los niveles de proteína producida como resultado de la transcripción génica a ARNm y posterior traducción del ARNm.

La supresión génica también pretende significar la reducción de la expresión de proteínas de un gen o una secuencia codificante que incluye supresión génica pos-transcripcional y supresión transcripcional. La supresión génica pos-transcripcional está mediada por la homología entre todo o una parte de un ARNm transcrito de un gen o secuencia codificante elegida como diana para la supresión y el ARN bicatenario correspondiente usado para la supresión, y se refiere a la reducción sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible disponible en la célula para la unión por ribosomas. El ARN transcrito puede estar en la orientación sentido para efectuar lo que se llama la co-supresión, en la orientación antisentido para efectuar lo que se llama la supresión antisentido, o en ambas orientaciones producir un ARNbc para efectuar lo que se llama interferencia por ARN (iARN). La supresión transcripcional está mediada por la presencia en la célula de un agente de supresión de gen de ARNbc que presenta identidad de secuencias sustancial con una secuencia de ADN promotora o el complemento de la misma para efectuar lo que se denomina supresión trans del promotor. La supresión génica puede ser eficaz contra un gen de planta nativo asociado a un rasgo, por ejemplo, para proporcionar plantas con niveles reducidos de una proteína codificada por el gen nativo o con niveles potenciados o reducidos de un metabolito afectado. La supresión génica también puede ser eficaz contra genes diana en un nematodo parásito de las plantas que puede ingerir o ponerse en contacto con material de planta que contiene agentes de supresión génica, específicamente diseñados para inhibir o suprimir la expresión de una o más secuencias homólogas o complementarias en las células del nematodo. La supresión génica pos-transcripcional por ARN orientado antisentido o sentido para regular la expresión génica en células vegetales se desvela en las patentes de EE.UU. nº 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184 y 5.231.020. El uso de ARNbc para suprimir genes en plantas se desvela en los documentos WO 99/53050, WO 99/49029, publicaciones de EE.UU. 2003/0175965 y 2003/0061626, solicitud de patente de EE.UU. nº 10/465.800, y las patentes de EE.UU. nº 6.506.559 y 6.326.193.

Un procedimiento beneficioso de supresión génica pos-transcripcional frente a un nematodo parásito de las plantas emplea tanto ARN transcrito orientado sentido como orientado antisentido que se estabiliza, por ejemplo, como una estructura de horquilla y tallo y lazo. Una construcción de ADN preferida para efectuar la supresión génica postranscripcional es una en la que un primer segmento codifica un ARN que presenta una orientación antisentido que presenta identidad sustancial con un segmento de un gen elegido como diana para la supresión, que está enlazado con un segundo segmento que codifica un ARN que presenta complementariedad sustancial con el primer segmento. Una construcción tal forma una estructura de tallo y lazo por hibridación del primer segmento con el segundo segmento y una estructura de lazo de las secuencias de nucleótidos que enlazan los dos segmentos (véanse los documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993). También puede emplearse co-expresión con un segmento de gen diana adicional, como se observa anteriormente (por ejemplo, el documento WO05/019408).

Según una realización de la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos, para la que la expresión in vitro produce la transcripción de una secuencia de ARN estabilizada que es sustancialmente homóloga a una molécula de ARN de un gen elegido como diana en un nematodo parásito de las plantas que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia de nucleótidos dentro del genoma del nematodo. Así, después de que el nematodo parásito de las plantas ingiera la secuencia de ARN estabilizada, se efectúa una regulación por disminución de la secuencia de nucleótidos correspondiente al gen diana en las células de un nematodo diana.

En ciertas realizaciones de la invención puede utilizarse la expresión de un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1920, que incluye la expresión de un fragmento de hasta 21, 36, 60, 100, 550 ó 1000 nucleótidos contiguos, o secuencias que muestran el 90-100 % de identidad con tales secuencias, o sus complementos. En realizaciones específicas, un nucleótido proporcionado por la invención puede comprender una secuencia seleccionada del grupo descrito en la Tabla 4, que incluye una localización en tal secuencia que engloba los nucleótidos como se describen en la Tabla 4. En todavía otras realizaciones, un nucleótido proporcionado por la invención puede describirse como que comprende uno o más de nucleótidos 1-21, 22-50, 51-100,101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 11511200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 2001-2050, 2051-2100, 23-75, 76-125, 126-175, 176-225, 226-275, 276-325, 326-375, 376-425, 426-475, 476-525, 526-575, 576-625, 626-675, 676-725, 726-775, 776-825, 826-875, 876-925, 926-975, 976-1025, 1026-1075, 1076-1125, 1126-1175, 1176-1225, 1226-1275, 1276-1325, 1326-1375, 1376-1425, 1426-1475, 1476-1525, 1526-1575, 1576-1625, 1626-1675, 1676

1725, 1726-1775, 1776-1825, 1826-1875,1876-1925, 1926-1975, 1976-2025, 2026-2075, 2076-2125, 1-550, 200750, 300-850, 400-950, 500-1050, 600-1150, 700-1250, 800-1350, 900-1450, 1000-1550, 1100-1650, 1200-1750, 1300-1850, 1400-1950, 1500-2050, hasta la longitud completa de la secuencia, de SEC ID Nº: 1920. Procedimientos para seleccionar sub-secuencias específicas como dianas para supresión génica mediada por ARNip se conocen en la técnica (por ejemplo, Reynolds y col., 2004).

La inhibición de un gen diana usando la tecnología de ARNbc estabilizado de la presente invención es específica para secuencias en las que secuencias de nucleótidos correspondientes a la región de dúplex del ARN son elegidas como diana para la inhibición genética. Para la inhibición se prefiere ARN que contiene una secuencia de nucleótidos idéntica a una parte del gen diana. También se ha encontrado que las secuencias de ARN con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales individuales con respecto a la secuencia diana también son eficaces para inhibición. En la realización de la presente invención se prefiere que el ARNbc inhibidor y la porción del gen diana compartan al menos el 80 % de identidad de secuencias, o el 90 % de identidad de secuencias, o el 95 % de identidad de secuencias, o el 99 % de identidad de secuencias, o incluso el 100 % de identidad de secuencias. Alternativamente, la región de dúplex del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con una parte del gen diana transcrito. Una secuencia de longitud inferior a completa que presenta una mayor homología compensa una secuencia más larga menos homóloga. La longitud de las secuencias de nucleótidos idénticas puede ser al menos 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos 1000 bases. Normalmente debe usarse una secuencia de más de 20-100 nucleótidos, aunque se preferiría una secuencia de más de 200-300 nucleótidos, y una secuencia de más de 500-1000 nucleótidos sería especialmente preferida dependiendo del tamaño del gen diana. La invención tiene la ventaja de poder tolerar variaciones de secuencia que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepas o divergencia evolutiva. La molécula de ácido nucleico introducida puede no necesitar tener homología absoluta, puede no necesitar ser de longitud completa, con respecto a tanto el producto de transcripción primario como al ARNm completamente procesado del gen diana. Por tanto, aquellos expertos en la materia necesitan darse cuenta de que, como se ha desvelado en el presente documento, no se requiere el 100 % de la identidad de secuencias entre el ARN y el gen diana para poner en práctica la presente invención.

La inhibición de la expresión génica diana puede cuantificarse midiendo tanto el ARN diana endógeno como la proteína producida por traducción del ARN diana y las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse por examen de las propiedades externas de la célula u organismo. Las técnicas para cuantificar ARN y proteínas son muy conocidas para un experto habitual en la materia. En ciertas realizaciones preferidas, la expresión génica se inhibe al menos el 10 %, preferentemente al menos el 33 %, más preferentemente al menos el 50 %, y todavía más preferentemente al menos el 80 %. En realizaciones particularmente preferidas de la invención, la expresión génica se inhibe al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 %, o por al menos el 99 % dentro de células en el patógeno de manera que tenga lugar una inhibición significativa. Inhibición significativa pretende referirse a la inhibición suficiente que produce un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento, alimentación, desarrollo, mortalidad) o una disminución detectable en ARN y/o proteína correspondiente al gen diana que se inhibe. Aunque en ciertas realizaciones de la invención la inhibición se produce en sustancialmente todas células del nematodo parásito de las plantas, en otras realizaciones preferidas la inhibición se produce en solo un subconjunto de células que expresan el gen.

Las moléculas de ARNbc pueden sintetizarse tanto in vivo como in vitro. El ARNbc puede formarse por una única hebra de ARN autocomplementaria o a partir de dos hebras de ARN complementarias. La ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar en la transcripción in vivo, o puede usarse ARN polimerasa clonada para transcripción in vivo o in vitro. La inhibición puede elegirse como diana por transcripción específica en un órgano, tejido o tipo de célula; estimulación de una condición medioambiental (por ejemplo, infección, estrés, temperatura, inductores químicos); y/o transcripción por ingeniería en una etapa o edad de desarrollo. Las hebras de ARN pueden o pueden no estar poliadeniladas; las hebras de ARN pueden o pueden no ser capaces de ser traducidas en un polipéptido por un aparato traduccional de células.

Un ARN, ARNbc, ARNip o miARN de la presente invención puede producirse químicamente o enzimáticamente por un experto en la materia mediante reacciones manuales o automatizadas o in vivo en otro organismo. El ARN también puede producirse por síntesis orgánica parcial o total; cualquier ribonucleótido modificado puede introducirse por síntesis enzimática u orgánica in vitro. El ARN puede sintetizarse por una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6). El uso y producción de una construcción de expresión se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, documento WO 97/32016; patentes de EE.UU. nº 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693). Si se sintetiza químicamente o por síntesis enzimática in vitro, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, el ARN puede purificarse de una mezcla por extracción con un disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía, o una combinación de los mismos. Alternativamente, el ARN puede usarse sin o con un mínimo de purificación para evitar pérdidas debidas al procesamiento de muestras. El ARN puede secarse para almacenamiento o disolverse en una disolución acuosa. La disolución puede contener tampones o sales para promover la hibridación, y/o estabilización de las hebras dúplex.

Para la transcripción de un transgén in vivo o una construcción de expresión, una región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador, silenciador y poliadenilación) puede usarse para transcribir la hebra (o hebras) de ARN. Por tanto, en una realización, las secuencias de nucleótidos para su uso en producir las moléculas de ARN pueden ligarse operativamente a una o más secuencias de promotores funcionales en un microorganismo, un hongo o una célula

huésped de planta. Idealmente, las secuencias de nucleótidos se colocan bajo el control de un promotor endógeno, normalmente residente en el genoma huésped. La secuencia de nucleótidos de la presente invención, bajo el control de una secuencia de promotor operativamente ligada, puede flanquearse adicionalmente por secuencias adicionales que afectan ventajosamente su transcripción y/o la estabilidad de un transcrito resultante. Tales secuencias se localizan generalmente en la dirección 5' del promotor operativamente ligado y/o en la dirección 3' del extremo 3' de la construcción de expresión y pueden producirse tanto en la dirección 5' del promotor como en la dirección 3' del extremo 3' de la construcción de expresión, aunque también se contempla solo una secuencia tal en la dirección 5'.

Como se usa en el presente documento, el término “agente de control de enfermedades”, o “agente de supresión génica” se refiere a una molécula de ARN particular que consiste en un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN ligado por un tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmentos de ARN se encuentran dentro de la longitud de la molécula de ARN y son repeticiones sustancialmente invertidas entre sí y están ligados juntos por el tercer segmento de ARN. La complementariedad entre el primer y el segundo segmentos de ARN produce la capacidad de los dos segmentos para hibridarse in vivo e in vitro para formar una molécula bicatenaria, es decir, un tallo, ligado junto a un extremo de cada uno del primer y segundo segmentos por el tercer segmento que forma un lazo, de manera que la estructura entera forme una estructura de tallo y lazo, o incluso estructuras que se hibridan más estrechamente pueden formar una estructura anudada de tallo-lazo. El primer y el segundo segmentos se corresponden invariablemente y no respectivamente con una secuencia sentido y antisentido con respecto al ARN diana transcrito a partir del gen diana en el patógeno diana que se suprime por la ingestión de la molécula de ARNbc. El agente de control de insectos también puede ser una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada (o aislada) y más específicamente moléculas de ácidos nucleicos o moléculas de fragmentos de ácido nucleico de las mismas de un ADN genómico (ADNg) o biblioteca de ADNc. Alternativamente, los fragmentos pueden comprender oligonucleótidos más pequeños que tienen de 15 a 250 residuos de nucleótidos, y más preferentemente 15 a 30 residuos de nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, el término “genoma” como se aplica a células de un nematodo parásito de plantas o un huésped engloba no solo ADN cromosómico encontrado dentro del núcleo, sino ADN de orgánulos encontrado dentro de componentes subcelulares de la célula. Por tanto, el ADN de la presente invención introducido en células vegetales puede estar tanto cromosómicamente integrado como localizado en orgánulos. El término “genoma” como se aplica a bacterias engloba tanto el cromosoma como los plásmidos dentro de una célula huésped bacteriana. Por tanto, el ADN de la presente invención introducido en células huésped bacterianas puede estar tanto cromosómicamente integrado como localizado en plásmidos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “nematodo parásito de las plantas” se refiere a aquellos nematodos que pueden infectar, colonizar, parasitar o producir enfermedad en el material de planta huésped transformado a expresar o recubiertos con un agente de supresión génica bicatenario. Como se usa en el presente documento, un rasgo de “resistencia a nematodos” es una característica de una planta transgénica, animal transgénico, u otro huésped transgénico que hace que el huésped sea resistente al ataque de un nematodo que normalmente puede ocasionar daño o pérdida al huésped. Tal resistencia puede producirse a partir de una mutación natural o más normalmente a partir de incorporación de ADN recombinante que confiere resistencia de nematodos parásitos de las plantas. Para conferir resistencia a nematodos a una planta transgénica, un ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en un molécula de ARN que forma una molécula de ARNbc dentro de los tejidos o fluidos de la planta recombinante. La molécula de ARNbc comprende en parte un segmento de ARN que es idéntico a un segmento de ARN correspondiente codificado a partir de una secuencia de ADN dentro de un nematodo parásito de plantas que prefiere causar la enfermedad en la planta recombinante. La expresión del gen dentro del nematodo parásito de las plantas diana se suprime por el ARNbc, y la supresión de la expresión del gen en el nematodo parásito de las plantas diana hace que la planta sea resistente al nematodo. Fire y col. (patente de EE.UU. nº 6.506.599) describe genéricamente la inhibición de la infestación de plagas, proporcionando detalles solo sobre varias secuencias de nucleótidos que eran eficaces para la inhibición de la función génica en la especie de nematodos Caenorhabditis elegans. Similarmente, el documento US 2003/0061626 describe el uso de ARNbc para inhibir la función génica en una variedad de plagas de nematodos. El documento US 2003/0150017 describe usar secuencias de ADNbc para transformar células huésped para expresar secuencias de ARNbc correspondientes que son sustancialmente idénticas a secuencias diana en plagas específicas, y particularmente describen la construcción de plantas recombinantes que expresan tales secuencias de ARNbc para ingestión por diversos nematodos parásitos de las plantas, facilitando la regulación por disminución de un gen en el genoma del organismo diana y mejorando la resistencia de la planta al nematodo parásito de las plantas.

El efecto modulador del ARNbc es aplicable a una variedad de genes expresados en el nematodo parásito de las plantas que incluye, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o transformación celular, que incluye genes de mantenimiento, factores de transcripción, genes relacionados con la muda, y otros genes que codifican polipéptidos que participan en el metabolismo celular o crecimiento y desarrollo normal.

Como se usa en el presente documento, el término “inhibición de la expresión génica” o “inhibir la expresión de un gen diana en la célula de un nematodo parásito de las plantas” se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de proteína y/o producto de ARNm del gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin manifestar efectos sobre otros genes de la célula y sin ningún efecto sobre ningún gen dentro de la célula que está produciendo la molécula de ARNbc. La inhibición de la expresión génica del gen diana en los nematodos parásitos de las plantas puede producir rasgos fenotípicos novedosos en el nematodo.

La presente invención proporciona en parte un sistema de administración para la administración de los agentes de control de nematodos por ingestión de células huésped o el contenido de las células. Según otra realización, la presente invención implica generar una célula vegetal transgénica o una planta que contiene una construcción de ADN recombinante que transcribe las moléculas de ARNbc estabilizadas de la presente invención. Como se usa en el presente documento, “captación” se refiere al proceso de que un agente se ponga en contacto con células de un organismo diana, tal como un nematodo. Esto puede producirse, por ejemplo, por alimentación de nematodos, por remojo, o por inyección. Como se usa en el presente documento, el término “generar una célula vegetal o una planta transgénica” se refiere a los procedimientos de emplear las tecnologías de ADN recombinante fácilmente disponibles en la materia (por ejemplo, por Sambrook y col., 1989) para construir un vector de transformación de plantas que transcribe las moléculas de ARNbc estabilizadas de la presente invención, para transformar la célula vegetal o la planta y para generar la célula vegetal transgénica o la planta transgénica que contienen las moléculas de ARNbc estabilizadas transcritas.

Se contempla que las composiciones de la presente invención pueden incorporarse dentro de las semillas de una especie de planta tanto como un producto de expresión de un gen recombinante incorporado en un genoma de las células vegetales, como incorporado en un recubrimiento o tratamiento de semilla que se aplica a la semilla antes de sembrarla. La célula vegetal que contiene un gen recombinante se considera en el presente documento que es un evento transgénico.

La presente invención proporciona en parte un sistema de administración para la administración de agentes de control de enfermedades a nematodos parásitos. Las moléculas de ARNbc o de ARNip estabilizado de la presente invención pueden introducirse directamente en las células de un nematodo parásitos de las plantas. Los procedimientos para introducción oral pueden incluir mezcla directa de ARN con tejido del huésped para el nematodo parásito de las plantas, además de enfoques de ingeniería en los que una especie que es un huésped se manipula para expresar el ARNbc o ARNip. En una realización, el ARN puede pulverizarse sobre una superficie de la planta. En todavía otra realización, el ARNbc o ARNip puede expresarse por microorganismos y los microorganismos pueden aplicarse sobre una superficie de la planta o introducirse en una raíz, tallo por un medio físico tal como una inyección. En todavía otra realización, una planta puede manipularse genéticamente para expresar el ARNbc o ARNip en una cantidad suficiente para destruir los nematodos parásitos de las plantas que se sabe que infestan la planta.

También se anticipa que los ARNbc producidos por síntesis química o enzimática pueden formularse de un modo de acuerdo con prácticas agrícolas comunes y usarse como productos de pulverización para controlar enfermedad de la planta. Las formulaciones pueden incluir los adhesivos y humectantes apropiados requeridos para cobertura foliar eficaz, además de protectores de UV para proteger el ARNbc de daño por UV. Tales aditivos se usan comúnmente en la industria de los bioinsecticidas y son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales aplicaciones podrían combinarse con otras aplicaciones de insecticidas de pulverización, biológicamente basadas o no, para potenciar la fitoprotección de nematodos parásitos de las plantas.

La presente invención también se refiere a construcciones de ADN recombinante para la expresión en un microorganismo. Ácidos nucleicos exógenos de los que se transcribe un ARN de interés pueden introducirse en una célula microbiana huésped, tal como una célula bacteriana o una célula fúngica, usando procedimientos conocidos en la técnica.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de huéspedes de microorganismos procariotas y eucariotas para producir las moléculas de ARNbc o de ARNip estabilizado. El término “microorganismo” incluye especies microbianas procariotas y eucariotas tales como bacterias y hongos, además de nematodos. Hongos incluyen levaduras y hongos filamentosos, entre otros. Procariotas ilustrativos, tanto Gramnegativos como Gram-positivos, incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, Erwinia y Serratia; Bacillaceae; Rhizobiaceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como fotobacteria, Zymomonas; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tal como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomycetales y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas están hongos, tales como ficomicetos y ascomicetos, que incluyen Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y basidiomicetos, tales como Rhodotorula, Aureobasidium.

D. Plantas transgénicas

La presente invención proporciona semillas y plantas que tienen uno o más eventos transgénicos. Combinaciones de eventos se denominan eventos transgénicos “apilados”. Estos eventos transgénicos apilados pueden ser eventos que están dirigidos al mismo organismo diana, o pueden estar dirigidos a diferentes patógenos o plagas diana. En una realización, una semilla que tiene la capacidad para expresar un ácido nucleico proporcionado en el presente documento también tiene la capacidad para expresar al menos otro agente que incluye, pero no se limita a, una molécula de ARN cuya secuencia se deriva de la secuencia de un ARN expresado en un patógeno diana tal como un nematodo y que forma una estructura de ARN bicatenario con la expresión en la semilla o células de una planta cultivada a partir de la semilla, en el que la ingestión de una o más células de la planta por la diana produce la supresión de la expresión del ARN en las células de la diana.

En ciertas realizaciones, una semilla que tiene la capacidad para expresar una secuencia de ARNbc que se deriva de un nematodo parásito de las plantas diana también tiene un evento transgénico que proporciona tolerancia a herbicidas.

Un ejemplo beneficioso de un gen de tolerancia a herbicidas proporciona resistencia a glifosato, N(fosfonometil)glicina, que incluye la forma de sal de isopropilamina de tal herbicida.

Beneficios proporcionados por la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a: la facilidad de introducir ARNbc en las células de nematodos parásitos de las plantas, la baja concentración de ARNbc que puede usarse, la estabilidad del ARNbc y la eficacia de la inhibición. La capacidad para usar una baja concentración de un ARNbc estabilizado evita varias desventajas de interferencia antisentido. La presente invención no se limita a uso in vitro o a composiciones de secuencia específica, a un conjunto particular de genes diana, una porción particular de la secuencia de nucleótidos del gen diana o un transgén particular o a un procedimiento de administración particular, a diferencia de algunas de las técnicas disponibles conocidas en la técnica, tal como antisentido y co-supresión. Además, la manipulación genética es posible en organismos que no son modelos genéticos clásicos.

Con el fin de lograr la inhibición de un gen diana selectivamente dentro de una especie de nematodos parásitos de las plantas que se desea controlar, el gen diana debe presentar preferentemente un bajo grado de identidad de secuencias con genes correspondientes en una planta o un animal vertebrado. Preferentemente, el grado de la identidad de secuencias es inferior al 80 %. Más preferentemente, el grado de la identidad de secuencias es inferior al 70%. Lo más preferentemente, el grado de la identidad de secuencias es inferior al 60 %.

Además de la transformación directa de una planta con una construcción de ADN recombinante, las plantas transgénicas pueden prepararse cruzando una primera planta que tiene una construcción de ADN recombinante con una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, el ADN recombinante para supresión génica puede introducirse en la primera línea de planta que es aceptada para transformación para producir una planta transgénica que puede cruzarse con una segunda línea de planta para introgresar el ADN recombinante para supresión génica en la segunda línea de planta.

La presente invención puede combinarse, en la práctica, con otros rasgos de control de las enfermedades en una planta para lograr rasgos deseados para el control potenciado de enfermedad de las plantas. El combinar los rasgos de control de las enfermedades que emplean distintos modos de acción puede proporcionar plantas transgénicas protegidas con superior durabilidad con respecto a plantas que alojan un único rasgo de control debido a la reducida probabilidad de que la resistencia se desarrolle en el campo.

La invención también se refiere a productos de materias primas que contienen una o más de las secuencias de la presente invención, y se producen a partir de una planta o semilla recombinante que contiene una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención, se contemplan específicamente como realizaciones de la presente invención. Un producto de materia prima que contiene una o más de las secuencias de la presente invención está previsto que incluya, pero no se limita a, harinas, aceites, granos molidos o enteros o semillas de una planta, o cualquier producto alimenticio que comprenda cualquier harina, aceite o grano molido o entero de una planta o semilla recombinante que contiene una o más de las secuencias de la presente invención. La detección de una o más de las secuencias de la presente invención en una o más materias primas o los productos de materias primas contemplados en el presente documento es de hecho una prueba de que la materia prima o producto de materia prima está compuesto por una planta transgénica diseñada para expresar una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención con el fin de controlar enfermedad de la planta usando procedimientos de supresión génica mediada por ARNbc.

E. Obtención de ácidos nucleicos

La presente invención proporciona procedimientos de obtención de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos para producir un ARNbc o ARNip. En una realización, un procedimiento tal comprende: (a) analizar uno o más genes diana para su expresión, función y fenotipo tras la supresión génica mediada por ARNbc en un nematodo; (b) sondar una biblioteca de ADNc o ADNg con una sonda de hibridación que comprende toda o una porción de una secuencia de nucleótidos o un homólogo de la misma de un nematodo elegido como diana que muestra un fenotipo de crecimiento o desarrollo de nematodos alterado, por ejemplo, reducido, en un análisis de supresión mediada por ARNbc; (c) identificar un clon de ADN que se hibrida con la sonda de hibridación; (d) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (e) secuenciación del ADNc o fragmento de ADNg que comprende el clon aislado en la etapa (d) en el que la molécula de ácido nucleico secuenciada transcribe toda o una porción sustancial de la secuencia de ácidos nucleicos de ARN o un homólogo de la misma.

En otra realización, un procedimiento de la presente invención para obtener un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos para producir una porción sustancial de un ARNbc o ARNip comprende:

(a) sintetizar primero y segundo cebadores de oligonucleótidos correspondientes a una porción de una de las secuencias de nucleótidos de un patógeno elegido como diana; y (b) amplificar un inserto de ADNc o ADNg presente en un vector de clonación usando el primer y segundo cebadores de oligonucleótidos de la etapa (a) en el que la molécula de ácido nucleico amplificada transcribe una porción sustancial de una porción sustancial de un ARNbc o ARNip de la presente invención.

En la práctica de la presente invención, un gen diana puede derivarse de H. glycines u otro nematodo. Se contempla que puedan emplearse varios criterios en la selección de genes diana preferidos. El gen de H. glycines puede ser uno que tiene un ortólogo de C. elegans con una probabilidad de un fenotipo fuerte tras la inactivación de la

expresión de iARN, que incluye un fenotipo P0. Tales dianas son frecuentemente aquellas con productos de proteína que participan en procesos celulares centrales tales como replicación de ADN, ciclo celular, transcripción, procesamiento de ARN, traducción, tráfico de proteínas, secreción, modificación de proteínas, estabilidad y degradación de proteínas, producción de energía, metabolismo intermedio, estructura celular, transducción de señales, canales y transportadores, y endocitosis. En ciertas realizaciones es ventajoso seleccionar un gen para el que una pequeña disminución en el nivel de expresión produce efectos perjudiciales para el patógeno.

Como se usa en el presente documento, el término “derivado de” se refiere a una secuencia de nucleótidos especificada que puede obtenerse a partir de una fuente especificada particular o especie, no obstante no necesariamente directamente de esa fuente o especie especificada.

Con el fin de la presente invención, las moléculas de ARNbc o de ARNip pueden obtenerse por amplificación de la cadena de polimerasa (PCR™) de secuencias de un gen diana derivadas de una biblioteca de ADNg o de ADNc o porciones de la misma. La biblioteca de ADN puede prepararse usando procedimientos conocidos para el experto habitual en la materia y puede extraerse ADN/ARN. Las bibliotecas de ADN genómico o de ADNc generadas a partir de un organismo diana pueden usarse para amplificación por PCR™ para la producción del ARNbc o ARNip.

Los genes diana pueden entonces amplificarse por PCR™ y secuenciarse usando los procedimientos fácilmente disponibles en la materia. Un experto en la materia puede poder modificar las condiciones de PCR™ para garantizar la formación óptima de productos de PCR™. El producto de PCR™ confirmado puede usarse como molde para la transcripción in vitro para generar ARN sentido y antisentido con los promotores mínimos incluidos. En una realización, la presente invención comprende secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas que pueden usarse como agentes de control de nematodos parásitos de las plantas. Las secuencias de nucleótidos aisladas y purificadas pueden comprender aquellas que se exponen en el listado de secuencias.

Como se usa en el presente documento, el término “secuencia codificante”, “secuencia de nucleótidos estructural” o “molécula de ácido nucleico estructural” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se traduce en un polipéptido, normalmente mediante ARNm, cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación de la traducción en el extremo 5' y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias de ADN genómico, ADNc, EST y de nucleótidos recombinantes.

El término “ADN recombinante” o “secuencia de nucleótidos recombinante” se refiere a ADN que contiene una modificación genéticamente manipulada mediante manipulación mediante mutagénesis o enzimas de restricción.

Para muchos de los nematodos parásitos de las plantas que son posibles dianas para el control por la presente invención puede haber información limitada referente a las secuencias de la mayoría de los genes o el fenotipo resultante de la mutación de genes particulares. Por tanto, se contempla que la selección de genes apropiados para su uso en la presente invención puede llevarse a cabo mediante el uso de información disponible del estudio de los genes correspondientes en un organismo modelo tal como en C. elegans, en el que los genes se han caracterizado, según los análisis descritos en los Ejemplos 1-8. En algunos casos será posible obtener la secuencia de un gen correspondiente de un nematodo diana buscando bases de datos tales como GenBank usando tanto el nombre del gen como la secuencia de, por ejemplo, un nematodo a partir del cual se ha clonado el gen. Una vez la secuencia se obtiene, puede usarse PCR™ para amplificar un segmento del gen apropiadamente seleccionado en el nematodo diana para su uso en la presente invención. Pueden diseñarse cebadores de PCR™ basándose en la secuencia como se encuentra en otro organismo a partir del cual se ha clonado el gen. Los cebadores se diseñan para amplificar un segmento de ADN de longitud suficiente para su uso en la presente invención. El ADN (tanto ADN genómico como ADNc) se prepara a partir del nematodo parásito de las plantas diana, y los cebadores de PCR™ se usan para amplificar el segmento de ADN. Las condiciones de amplificación se seleccionan de manera que se produzca la amplificación incluso si los cebadores no coinciden exactamente con la secuencia diana. Alternativamente, el gen (o una porción del mismo) puede clonarse a partir de una biblioteca de ADNg o de ADNc preparada a partir de una especie de nematodo parásito de las plantas, usando el gen conocido como sonda. Se conocen técnicas para realizar PCR™ y clonación de bibliotecas. Más detalles del procedimiento por el que segmentos de ADN de especies de nematodos parásitos de las plantas diana pueden aislarse basándose en la secuencia de genes previamente clonada de otras especies se proporcionan en los ejemplos. Un experto habitual en la materia reconocerá que puede usarse una variedad de técnicas para aislar segmentos de genes de nematodos parásitos de las plantas que se corresponden con genes previamente aislados de otras especies.

Ejemplos

Los inventores en el presente documento han identificado un medio para controlar nematodos parásitos de las plantas proporcionando moléculas de ácidos ribonucleicos bicatenarios para nematodos parásitos de las plantas, y un medio para seleccionar secuencias que codifican estas moléculas de ácidos ribonucleicos bicatenarios. Las moléculas de ácidos ribonucleicos bicatenarios que funcionan tras la ingestión para inhibir una función biológica en un nematodo pueden producir, por ejemplo, uno o más de los siguientes atributos: reducción en el crecimiento de un nematodo, inhibición del desarrollo de un nematodo, o reducción de la viabilidad. Una cualquiera o cualquier combinación de estos atributos puede producir una inhibición eficaz de la infección o colonización de plantas, y en el

caso de un nematodo patógeno de las plantas, la inhibición de la enfermedad de las plantas y/o reducción en la gravedad de los síntomas de la enfermedad. Ejemplos referentes a materia no englobada por las reivindicaciones son para fines ilustrativos.

Ejemplo 1

Criterios para la selección de genes diana

Para ordenar genes por esencialidad probable de la función en el ciclo vital de los nematodos, la información de experimentos de interferencia por ARN (iARN) de C. elegans disponibles en wormbase.org se combinó con información experimental adicional. Usando los datos >40.000 fenotipos en wormbase, todos los ~20.000 genes de

C. elegans se ordenaron para su potencia de fenotipo, nivel de confianza en el fenotipo y probabilidad de efectos en múltiples etapas en el ciclo vital. 715 genes de C. elegans con homología de aminoácidos por BLAST por H. glycines de al menos e-10 (véase la determinación de ortología más adelante) tuvieron puntuaciones en este sistema de puntuación de fenotipos de 44 o mejor, siendo 1 la mejor. A continuación se proporcionan estadísticas de fenotipos para solo las dianas que eventualmente constituyen la lista de los 300 principales (usando todos los criterios). Como la clasificación del fenotipo depende de la información actualmente disponible, no quiere decir que estén incluidos todos los genes que capturan cada gen que pueda ser una buena diana, sino más bien que proporciona una lista de dianas de alta calidad que probablemente sea satisfactoria en iARN de H. glycines basándose en información en mano.

Los siguientes análisis de fenotipos evidentes siguiendo el tratamiento de iARN se realizaron antes de la reciente publicación del sondeo de iARN del genoma de C. elegans de Sonnichsen y col. (Sonnichsen y col., 2005). Este grupo probó 19.075 genes mediante inyección de ARNbc en las gónadas de hermafroditas de la cepa N2 natural de

C. elegans y buscó efectos sobre ese animal y su progenie. Encontraron efectos para solo 1.668 genes (8,7 %). Proporcionando soporte adicional a la robustez de la lista de los 300 principales (FIG 3), 293 estuvieron entre los genes probados por Sonnichsen y col., y 257 tuvieron fenotipos (87,7 %) que incluyen 176-Emb (embrionario letal), 34 Lva (detención larval), 34 Ste (estéril), 8 Lvl (larval letal), 2 Stp (progenie estéril), 1 Bmd (defecto morfológico del cuerpo), 1 Dpy (regordete), 1 Egl (deposición de huevos anormal). 36 tuvieron informes naturales (WT). Los informes naturales aumentaron hacia el final de la lista: 7 informes WT en 1-100, 13 WT en 101-200, 16 WT en 201-300.

Los informes de fenotipo de iARN se clasificaron en cuatro grupos. Primero, los informes de letalidad en el estadio larval (letal = let, letal de larvas = lvl, parada de larvas = lva) se pusieron juntos y se les dio el mayor peso. Tales fenotipos, si imitados en H. glycines sería ventajoso como administración de ARNbc de la planta al nematodo, empezarían como el gusano juvenil de segunda etapa, una etapa análoga a la larva dauer, entra en la planta. La administración continuaría durante el desarrollo de las etapas juveniles J2, J3 y J4 o estadios larvales en el sitio de alimentación. La alteración de la fisiología de los nematodos durante estos estadios larvales podría prevenir la formación del sitio de alimentación en las raíces de la planta en la generación P0 (primaria).

Segundo, informes de defectos de muda (mlt), formación de ampollas (bli) y rotura (rup) se pusieron juntos y se les dio el segundo mayor peso. Tales fenotipos son raros con respecto a otros efectos más comúnmente observados tales como letalidad o esterilidad. Los nematodos, que incluyen tanto C. elegans como H. glycines, están cubiertos por una cutícula de colágeno. Los defectos de muda bloquearían la caída y re-formación de la cutícula entre estadios larvales (J2 -> J3, J3 -> J4, J4 ->A) y, por tanto, la progresión del desarrollo. Los fenotipos de ampolla frecuentemente también implican defectos en la cutícula. Los fenotipos de rotura en C. elegans no están bien entendidos, pero pueden implicar la pérdida de integridad corporal o desplazamientos osmóticos. Los fenotipos de rotura son particularmente atractivos para el control de NQS ya que es probablemente irreversible sin oportunidad de que el gusano se recupere como puede ser el caso de bloqueos temporales al metabolismo o desarrollo.

Tercero, fenotipos de letalidad estéril (ste) y embrionaria (emb) se pusieron juntos y se les dio el tercer mayor peso. En C. elegans, el tejido de la línea germinal, en el que muchos genes implicados en fertilidad y desarrollo embrionario son activos (factores maternos), es particularmente sensible a iARN. En el contexto de una infección del NQS, un bloqueo letal estéril o embrionario al ciclo vital solo prevendría la formación de una segunda generación, pero permitiría la formación del sitio de alimentación inicial y el daño al sistema de raíces de la planta. Cuarto, otros defectos importantes en la fisiología que incluyen crecimiento defectuoso (gro), fenotipos enfermo (sck), descoordinado (unc), paralizado (prl, prz) se pusieron juntos y se les dio el cuarto mayor peso. En H. glycines hembra, una vez se forma un sitio de alimentación, el gusano deja de moverse y la musculatura de la pared del cuerpo desempeña una función limitada en la supervivencia. Sin embargo, gusanos masculinos se vuelven móviles como los adultos de manera que pueden buscar, encontrar y fecundar hembras. Por tanto, el bloqueo de las estructuras musculares y del sistema nervioso importantes para el movimiento normal podría interferir con la fecundación y formación de una segunda generación. Para los fines de esta clasificación no se incluyeron otros fenotipos de iARN no letales (regordete, corto, largo, defecto de la morfología del cuerpo, etc.). Tampoco se usaron fenotipos observados por mutación genética en este sistema de clasificación.

Para clasificar genes basándose en la información de iARN de wormbase, genes con múltiples informes fenotípicos y múltiples fenotipos diferentes se favorecieron con respecto a genes con informes fenotípicos únicos y fenotipos únicos. Los múltiples informes de fenotipos son útiles, ya que añaden confianza a la asignación de fenotipo a un

gen. Basándose en los experimentos de múltiples grupos, experimentos de iARN de C. elegans tiene una tasa de negativos falsos y positivos falsos del ~10-15 %. La evidencia de fenotipos de más de un informe disminuye la probabilidad de inclusión de positivos falsos en la lista. Debido a que la iARN de C. elegans no produce eliminación de transcritos completa (la inactivación se estima al 90 %) y es frecuentemente no uniforme durante toda la población, experimentos de iARN de genes individuales frecuentemente producen la observación de múltiples fenotipos durante el transcurso del ciclo vital. Por tanto, informando el fenotipo de un gen dado como “ste, emb, lvl” puede significar que se requiere durante todo el ciclo vital mientras que un fenotipo de “emb” solo puede significar que el gen solo se requiere para una etapa en el desarrollo embrionario. Para los fines del control de parásitos, genes requeridos para múltiples etapas y múltiples procesos en el ciclo vital son dianas más atractivas que aquellas requeridas en solo una etapa ya que esto proporciona más oportunidades para un ARNbc para interferir con el ciclo vital y bloquear la infección.

En cada una de estas cuatro categorías, los informes de iARN de C. elegans se totalizaron y ponderaron. Al primer informe de un fenotipo en un contexto de N2 (natural) para un gen de un laboratorio dado se le dio un peso de 1. Al segundo, tercer, etc. informe de un fenotipo de ese mismo laboratorio se le dio un peso rebajado de 0,7. Por tanto, informes independientes de dos laboratorios (puntuación = 2) estarían favorecidos con respecto a dos informes del mismo laboratorio (puntuación = 1,7) que podría ser vulnerable a un error sistemático (por ejemplo, clon equivocado seleccionado y usado dos veces). A los informes de fenotipos en el contexto genético rrf-3(-/-) que es más sensible a iARN que N2 se les dio una puntuación rebajada de 0,6.

Con estas categorías y ponderaciones, las dianas se clasificaron en una escala de una puntuación de 1 a 44 o mayor basándose en su registro en la matriz formada en la FIG 1. Por ejemplo, para recibir una puntuación de 3, las dianas tuvieron que tener un puntuación de let lvl Iva de ≥ 2, una puntuación de mlt bli rup de X ≥ 1, una puntuación de ste emb de ≥ 2 y otra puntuación de fenotipo de ≥ 1. La mayoría de los genes en C. elegans tienen una puntuación peor a 44. 715 genes tuvieron una puntuación de 44 o mejor y un posible homólogo en H. glycines. De las 300 dianas principales, siguiendo la clasificación en todos los criterios, la puntuación promedio del fenotipo fue 22 ± 9. La puntuación principal fue 3 (6 dianas) y solo 10 dianas tuvieron una puntuación inferior a 10. Las categorías más comunes fueron puntuaciones de 10 (61 dianas con una puntuación de let lvl Iva de ≥ 2, una puntuación de mlt bli rup de 0, una puntuación de ste emb de ≥ 2 y otra puntuación de fenotipo de ≥ 1), 15 (23 dianas), 24 (26 dianas), 26 (93 dianas) y 33 (19 dianas). Los promedios y desviaciones estándar para los registros en cada categoría fueron puntuación de let lvl lva = 1,9 ± 1, puntuación de mlt bli rup = 0,3 ± 0,7, puntuación de ste emb = 2,8 ± 1,7, y otra puntuación de fenotipo = 1,6 ± 1,3. mlt bli rup fueron los fenotipos más raros con solo 56 dianas que tienen una puntuación ≥ 0. Los totales de dianas con puntuaciones ≥ 0 en las otras categorías fueron 284 para let lvl lva, 281 para puntuación de ste emb de ≥ 2 y 258 para otro fenotipo.

Además de informes de fenotipos visibles de wormbase también se registraron informes de fenotipo natural (es decir, sin fenotipo) para cada diana. Los hallazgos naturales se consideraron un negativo para la clasificación de dianas y la mayoría de las dianas con altos números de informes naturales se eliminaron de la consideración para la lista de los 300 principales. A todos los informes de natural se les dio una puntuación de 1, excepto aquellos de Vidal y col., a los que se les dio una puntuación de 0,3 ya que esta metodología de grupo parece haber producido un mayor porcentaje de informes de natural que todos los otros grupos de informe. Además de los registros de natural totales, también se calculó el % de natural con respecto a todos los otros informes. Para las 300 dianas principales, los promedios y desviaciones estándar para registro de natural y porcentaje de natural fueron 0,14 ± 0,41 y 1,9 ± 5,1 %. 250 de las 300 dianas no tuvieron informes de natural. Para las 50 dianas con informes de natural, los registros y porcentajes de natural fueron 0,85 ± 0,65 y 11,3 ± 7,3 %. En solo 24 casos fueron los informes de natural >10 % de todos los informes, siendo el mayor del 33 %.

A continuación, los datos de iARN se compararon con los disponibles en wormbase. Los experimentos de iARN se han realizado en más de 1.500 genes de C. elegans de interés en ensayos de alimentación con N2, rrf-3, y otras cepas. De los 715 genes de C. elegans en consideración con homología de aminoácidos por BLAST con las puntuaciones de fenotipo de H. glycines y de wormbase de 44 o mejor (FIG 1), estuvo disponible información para aproximadamente 75. Adicionalmente, a la lista se añadieron 3 genes con efectos de P0 (primera generación) en ensayos no en la lista de los 715. 10 genes diana de los 715 originales no mostraron fenotipo en un ensayo (múltiples duplicados con confirmación de secuencia de construcciones) y, por tanto, se excluyeron de los 300 principales. Se observaron fenotipos para 39 genes diana en los 300 principales que incluyen fenotipos lvl, lva, rup, ste, emb, unc, sck y adicionales no incluidos en el sistema de clasificación tal como crecimiento defectuoso (gro), progenie estéril (stp), regordete (dpy) y defecto de la morfología del cuerpo (bmd).

Ejemplo 2

Cribados de iARN de P cero (P0) de C. elegans

Además del ensayo de iARN convencional, se realizaron cribados de iARN de C. elegans adicionales. Uno de estos fue un cribado letal de P0.

P cero (P0) o efectos de iARN de rápida aparición en C. elegans

Para controlar Heterodera glycines proporcionando ARNbc de una planta de soja transgénica, el encontrar genes que sean sensibles a los efectos de iARN de rápida aparición podrían ser útil. Tales genes podrían bloquear la formación del sitio de alimentación maduro por J2 mientras que los genes de lenta aparición podrían no mostrar un efecto hasta la siguiente generación. Los genes de C. elegans en los que se observan efectos en el animal expuesto, los llamados efectos de la generación P0 (P cero), podrían predecir ortólogos de H. glycines con alta y rápida sensibilidad a iARN.

Todos los cribados a gran escala para efectos de iARN en C. elegans han expuesto gusanos iniciales como L4s o adultos (la generación P0 (P cero) genética) a ARNbc y buscado fenotipos en su progenie, la generación F1 y F2. La esterilidad del animal P0 inicial también se observó en muchos casos. Ninguno de los cribados de microinyección (Gonczy y col., 2000; Piano y col., 2000; Piano y col., 2002) o cribados de alimentación (Fraser y col., 2000; Kamath y col., 2003) observa efectos sobre los animales P0 distintos de esterilidad. Asimismo, en un cribado de más de

1.200 genes de C. elegans por alimentación desde el principio de L4, no se observaron fenotipos de P0 distintos de esterilidad. Los registros de wormbase (www.wormbase.org) de fenotipos de iARN no mencionan incluso la generación en la que se observa un efecto (P0, F1, F2, etc.), por lo que encontrar candidatos de P0 de estos registros no es posible. Maeda y col., 2000 realizaron iARN en 2.500 genes de C. elegans por remojo de L4. De forma interesante, en el material en línea suplementario que acompaña a la publicación, Maeda y col. mencionan 26 casos en los que se observaron efectos de P0 distintos de esterilidad que oscilan de enfermo a crecimiento lento a letalidad. Estas dianas se investigaron experimentalmente para ver si alguno de los genes era en realidad válido para efectos de P0 (FIG 2).

De las 26 entradas de Maeda y col., 21 se correspondieron con entradas de wormbase.org mientras que 5 fueron clones de origen poco claro. 19 genes se han clonado satisfactoriamente en construcciones de alimentación de E. coli de iARN y la secuencia se verificó mientras que 2 tuvieron dificultades de clonación. Hasta la fecha se han probado 17 de los 19 clones completados para fenotipos de P0. Están en progreso experimentos para terminar de probar dos clones más y repetir la prueba de otros seis que solo se han probado una vez para confirmar resultados. Adicionalmente, se probaron 7 dianas de interés en el mismo ensayo para un total de 24. Se recogieron datos de dos puntos de inicio del ciclo vital. Primero, se realizó un inicio de P0 L4 para imitar tanto el ensayo de Maeda como el ensayo de alimentación de E. coli convencional. Segundo, se realizó un inicio de huevo de P0 para exponer el animal P0 a ARNbc durante todo el desarrollo, una situación similar a la que puede encontrarse por un nematodo de Heterodera glycines tras la infección de una planta que produce un ARNbc. Para el inicio del huevo, la suposición es que la primera exposición de ARNbc se produce a medida que la larva L1 eclosiona y empieza a alimentarse.

De los 17 candidatos de Maeda y col., (2001) probados y 7 dianas adicionales, se encontró que 6 tenían fenotipos de P0 distintos de esterilidad de un inicio de huevo en el ensayo de alimentación (3 de Maeda y 3 de la lista adicional). Estos fueron Y57G11C.15 (sec61 alfa), C47E12.5 (uba-1) y R07E4.6 (kin-2) de Maeda y C34G6.6 (pan1), F52B11.3 (pan-2) y T25C8.2 (act-5) de la lista adicional. Para el inicio de L4, solo tres genes mostraron un fenotipo de P0 distintos de esterilidad. Los genes con fenotipos de inicio de F4 fueron un subconjunto de los 6 que muestran un fenotipo de inicio de huevo: Y57G11C.15 (sec61 alfa) y R07E4.6 (kin-2) de Maeda y T25C8.2 (act-5) de la lista adicional. De los genes restantes probados hasta la fecha de los candidatos de Maeda, 4 tuvieron fenotipos menos graves tales como esterilidad y parada de larvas F1 mientras que 9 son completamente naturales y fueron probablemente positivos falsos en el cribado de Maeda. Sin embargo, sigue siendo posible que los genes que carecen de un fenotipo en un ensayo de alimentación bacteriano tuvieran un fenotipo en un ensayo de remojo.

Además de los estudios con gusano N2 de C. elegans (cepa estándar de laboratorio), también se realizaron estudios para 22 de los genes en un contexto mutante fog-2(q71). fog-2(q71) es un mutante que feminiza la línea germinal del hermafrodita y se mantiene como cepa masculina/femenina. Se recogieron aparte gusanos hembra de machos como larva antes de la fecundación. Tales gusanos hembra virgen son fáciles de mantener durante muchos días a medida que envejecen ya que no hay generación F1 presente para cubrir demasiado la placa y pueden, por tanto, ayudar a ver efectos de aparición posteriores en el gusano adulto P0. Los resultados de P0 observados en fog2(q71) fueron idénticos a aquellos observados en N2 y no se detectaron fenotipos adicionales. Por tanto, se suspendieron las pruebas de fog-2 en genes posteriores.

Los estudios mostraron que en C. elegans obtener un fenotipo de P0 distinto de esterilidad de un inicio de F4 es un evento muy raro, pero que existen ejemplos tales como Y57Gl1C.15 (sec61 alfa), R07E4.6 (kin-2) y T25C8.2 (act-5) (FIG 2). La evidencia sugiere que la mayoría de los fenotipos de P0 distintos de esterilidad registrados por Maeda y col. en sus materiales complementarios fueron positivos falsos. Esto está respaldado por otra evidencia: además de los presentes datos, al menos seis genes se han probado por otros laboratorios y se encontró que tenían solo fenotipos naturales en todas las generaciones (P0, F1, etc.). Los fenotipos de P0 distintos de esterilidad de un inicio de F4 son supuestamente raros, ya que el adulto ya tiene muchas de las proteínas necesarias para supervivencia y la lenta cinética de iARN necesita tiempo para degradar todos los transcritos. Genes que muestran un efecto bajo tales condiciones pueden ser aquellos en los que el gusano es especialmente sensible a su alteración y, por tanto, se clasificó muy alto entre las dianas a considerar. Los fenotipos de P0 distintos de esterilidad de un inicio de huevo son menos raros y se observan en varias de las dianas de interés conocidas por tener fenotipos graves (por ejemplo, pan-1, pan-2). Supuestamente, un mayor sondeo de dianas con fuertes fenotipos encontraría más.

De las seis dianas en las que se confirmó un fenotipo letal P0, todas tienen razonablemente fuertes ortólogos entre las secuencias de H. glycines. Ya se había confirmado que kin-2 tenía un fenotipo de P0 y, por tanto, se clasificó en los 10 principales. pan-1 y pan-2 están ambos ya entre los 100 principales usando el sistema de clasificación de fenotipos de iARN de wormbase de los presentes inventores (FIG 1) e información de secuencia de H. glycines adicional y también se considerarán. Pan-1, que careció de EST, se ha identificado recientemente en H. glycines basándose en la secuenciación de Genome Survey. act-5, uba-1 y sec61 alfa no estaban todavía entre los varios de cientos de dianas principales usando el sistema de clasificación de fenotipos de iARN de wormbase debido a que carecieron de informes de fenotipo let, lvl., lva, mlt, bli y rup en wormbase. Las posiciones de clasificación final de estas seis dianas entre los 300 principales son Y57G11C.15 (sec61 alfa) = nº 2, C47E12.5 (uba-1) = nº 3 y R07E4.6 (kin-2) = nº 4, C34G6.6 (pan-1) = nº 7, F52B11.3 (pan-2) = nº 30 y T25C8.2 (act-5) = nº 21.

Ejemplo 3

Cribado de iARN específico para intestino de C. elegans

También se realizó un segundo cribado adicional para ayudar en la selección de genes diana (Tabla 1). Previamente se generó una cepa de C. elegans que es sensible a iARN solo en el intestino. Esta cepa puede usarse para cribar rápidamente el conjunto de genes que se mostró previamente que era esencial para la viabilidad y desarrollo por iARN para identificar aquellos que son esenciales específicamente en el intestino. Tales genes pueden ser dianas ventajosas con iARN de H. glycines administrado por plantas ya que se cree que el intestino es el primer tejido que se pone en contacto con el ARNbc que entra. Además, genes que codifican proteínas secretadas y transmembrana pueden ser vulnerables a alteración por la expresión en la planta de proteínas nematicidas que alteran la función de estos productos génicos.

La cepa de iARN específica para intestino de C. elegans se generó introduciendo un transgén que acciona la expresión del gen sid-1 natural bajo el control de un promotor específico para el intestino en un contexto de otro modo sid-1 menos (cepa HC75). sid-1 es esencial para la iARN sistémica en C. elegans y codifica una proteína transmembrana que es un transportador de ARNbc putativo (Winston y col., 2002). Se han probado tres líneas, cada una que acciona la expresión de un promotor intestinal diferente, para sensibilidad a iARN. Los promotores usados son regiones de 5' de elt-2, ges-1 e ile-1. La alimentación de ARNbc de unc-54 (músculo de la pared del cuerpo), dpy-7 (hipodermis) y act-1 (múltiples tejidos) no mostró fenotipo en estas cepas, aunque los tres ARNbc produjeron el fenotipo esperado en controles de gusanos naturales (N2). Por otra parte, la alimentación de ARNbc de act-5, una actina específica para el intestino, e ile-1, un gen con localización intestinal, en estas cepas produjo esterilidad. Estas observaciones respaldan la conclusión de que estas cepas son sensibles a iARN en el intestino, pero no en varios otros tejidos. La cepa ges-1::sid-1 se seleccionó para cribado. Los fenotipos en esta cepa son más débiles que en N2 incluso para genes que solo tienen funciones en el intestino, probablemente debido a que la expresión de ges-1 es no uniforme o más débil que la expresión intestinal de SID-1 endógena de forma que SID-1 no está siempre presente a los niveles en los que estaría en N2. Sin embargo, fenotipos, tales como el 50 % de esterilidad, se puntúan fácilmente con respecto a controles y son reproducibles. Se han examinado 130 genes hasta la fecha en la cepa de iARN intestinal, basándose en las dianas secretadas y transmembrana, y se han observado que 57 tienen fenotipos (Tabla 1). De los 715 genes diana en consideración para la lista de los 300 principales, 24 tuvieron fenotipos en la cepa de iARN intestinal mientras que 3 fueron neutros. En la clasificación de dianas de otro modo igualmente ponderadas se dio preferencia a genes que mostraron fenotipos de cepas de iARN intestinal y 14 de tales genes constituyeron la lista de los 300 principales. Los 10 que ni tuvieron fenotipos de iARN intestinal débil (por ejemplo, 25 % estériles) ni otros inconvenientes (homología débil, no ortología, etc.).

Tabla 1. Fenotipos de la cepa de iARN intestinal de C. elegans

Gen: Fenotipo de iARN intestinal Gen Fenotipo de iARN intestinal

act-5: 80 % estéril C01G8.5 40 % estéril

Ile-1: 80 % estéril R13H4.4 30 % estéril

C16A3.3: 20-70 % estéril C25A11.4 40 % estéril

C47E12.5: 40-99 % estéril T26FE3.3 15 % estéril

C48E7.6: 20-40 % estéril F54G8.3 20 % estéril

D1014.3: 30-80 % estéril ZK1058.2 50-80 % estéril

D1069.3: 15-50 % estéril K07D8.1 25 % estéril

T10H9.3: 20-40 % estéril H19M22.2 45 % estéril

(continuación)

Gen: Fenotipo de iARN intestinal Gen Fenotipo de iARN intestinal

T24H7.1: 15-35 % estéril F42C5.10 65 % estéril

ZK973.6: 20-30 % estéril T03E6.7 EMB

C01F1.2: 15-40 % estéril R03E1.2 75 % estéril

C54G4.8: 50-80 % estéril Y55H10A.1 LVA, 80 % estéril

F10D7.5: 15-40 % estéril C23H3.4 80 % estéril

F11G11.5: 15-50 % estéril F43D9.3 55 % estéril

F32B5.8: 20-25 % estéril Y57G11C.15 80 % estéril

F33A8.1: 60-97 % estéril F49C12.13 155 % estéril

F34D10.2: 20-30 % estéril T01H3.1 60 % estéril

F39B2.11: 20-25 % estéril T04A8.9 20-80 % estéril

F54C9.2: 15-25 % estéril H19M22.2 45-55 % estéril

F55A11.2: 10-15 % estéril K02B12.3 20-50 % estéril

F55A12.7: 50-60 % estéril W04A4.5 25-50 % estéril

F55A12.8: 20 % estéril Y47G6A.23 25-50 % estéril

F55F10.1: 20-25 % estéril C16D9.2 30-35 % estéril

K07A12.3: 15-25 % estéril F52C6.3 35 % estéril

K07B1.5: 25-30 % estéril F53B8.1 65 % estéril

K07D8.1: 25 % estéril C49C3.11 35 % estéril

K12D12.2: 40-70 % estéril F41G3.4 35 % estéril

R04F11.2: 40-70 % estéril Y57G11C.31 25 % estéril

T01B11.3: 10-30 % estéril

Ejemplo 4

Información sobre los ortólogos de genes de C. elegans -Función molecular putativa

5 Además del fenotipo, información adicional extraída de wormbase incluyó nombre del gen, ID de proteína de Wormpep, patrón de expresión, localización subcelular, motivos prominentes, breve identificación, descripción concisa y términos de ontología del gen. Se dio preferencia para la clasificación a genes diana con función molecular conocida con respecto a aquellos con función completamente desconocida. Los presentes inventores observaron que genes con fuertes fenotipos fueron en general aquellos con productos de proteína que participaban en procesos

10 nucleares centrales tales como replicación de ADN, ciclo celular, transcripción, procesamiento de ARN, traducción que incluye función de ribosomas y ARNt, tráfico de proteínas, secreción, modificación de proteínas, estabilidad y degradación de proteínas, producción de energía que incluye función mitocóndrica, metabolismo intermediario, estructura celular, transducción de señales, canales y transportadores, y endocitosis. De las 300 dianas seleccionadas, 275 pertenecen a una de estas categorías (Tabla 2). De las 100 principales, 98 pertenecieron a una

15 de estas categorías. Las categorías más frecuentemente observadas entre dianas con fuertes fenotipos fueron traducción / ribosoma / ARNt, transcripción / procesamiento de ARN, y estabilidad de proteínas / degradación / proteosoma.

Tabla 2. Clasificación de las 300 dianas principales de C. elegans por función celular putativa

Replicación de ADN, reparación, modificación, ciclo celular, cromatina: Transcripción / procesamiento de ARN Traducción / ribosoma / ARNt Tráfico de proteínas / secreción / importación nuclear / exportación Modificación de proteínas Estabilidad de proteínas / degradación / proteosoma Producción de energía / mitocondria Metabolismo / otras enzimas Estructura celular / matriz extracelular Receptores / transducción de señales / cinasas Canales / transportadores Endocitosis Otros / desconocidos

Totales 1 -300: 22 41 65 22 3 31 14 28 21 20 1 8 25

%: 7 % 14 % 22 % 7 % 1 % 10 % 5 % 9 % 7 % 7 % 0 % 3 % 8 %

1-100: 7 13 14 4 2 13 8 13 8 11 0 6 2

101-200: 5 14 34 6 0 11 3 8 6 4 0 1 8

201-300: 10 14 17 12 1 7 3 7 7 5 1 1 15

El seguimiento de la función celular putativa asegura que se mantenga la diversidad adecuada en la lista de las dianas principales y que la lista de diana no se vuelva demasiado dependiente de uno o algunos procesos que 5 podrían funcionar de manera diferente en H. glycines que en C. elegans. En idea, se da prioridad baja a procesos de desarrollo que se cree que evolucionan rápidamente en nematodos tales como la determinación del sexo, ya que es menos probable que tales procesos se conserven entre H. glycines y C. elegans. En la práctica, algunas de tales puntuaciones de genes son suficientes en el fenotipo de iARN para considerarse para la lista de los 300 principales. De forma interesante, considerando la intensidad del fenotipo de C. elegans solo (puntuación de 1-44 e informes de 10 natural) incluso antes de la inclusión de información sobre la conservación de secuencias, dianas altamente clasificadas representan enormemente por exceso procesos celulares centrales que implican grandes complejos de múltiples unidades tales como el ribosoma y el proteosoma. Esto puede resultar simplemente de la importancia de la traducción y degradación de proteínas para la supervivencia celular. Una interpretación adicional de este hallazgo es que las subunidades de grandes complejos tienden a tener fuerte fenotipo tras la inactivación de iARN y que son

15 más sensibles a la dosificación que las proteínas que no actúan en complejos. Por ejemplo, aunque una enzima de monómero pueda retener flujo adecuado mediante una ruta metabólica con solo el 10 % de su dosis de proteína normal, el desequilibrio entre dosis subunitarias en un gran complejo puede producir ensamblaje erróneo complejo u otro fallo funcional. Los recientes hallazgos en S. cerevisiae respaldan esta interpretación (Papp y col., 2003).

Ejemplo 5

20 Homología de secuencias, identidad y asignación de ortología

Para identificar ortólogos de Heterodera glycines de genes de C. elegans caracterizados se realizaron búsquedas de homología usando el paquete de aplicaciones BLAST (Altschul y col., 1990). Usando secuencias de proteínas

predichas para genes de C. elegans (Wormpep) se usó TBLASTN para buscar tanto EST agrupados de H. glycines como otras secuencias disponibles de Genbank, además de secuencias de sondeo del genoma patentado recientemente generadas. Se siguieron Puntuación de bits, valor de e y % de identidad. Para consideración como diana, un gen de C. elegans tuvo que tener una coincidencia de TBLASTN con un ortólogo u homólogo en H. glycines con un valor de e de al menos e-10 o mejor. 715 genes de C. elegans con fenotipos de iARN que se clasifican de 1-44 (FIG 1) cumplen este criterio mínimo. Para estos 715 genes, las coincidencias de H. glycines fueron:

BLAST Media ± DE Intervalo

%ID 56± 18 96 -22 Puntuación de bits 184 ± 141 1031 -52 Valor de e e-48 (mediana) 0 -e-11

Para construir la lista de los 300 principales (FIG 3), la secuencia al nivel de aminoácidos favorable similar entre C. elegans y H. glycines fue el segundo factor más importante en la clasificación después del fenotipo de iARN. Las características de dianas de % ID, puntuación de bits y valor de e se dividieron en cuartiles. Las dianas principales de la clasificación, además de tener fuertes fenotipos de iARN, también tuvieron características de homología favorables indicativas de ortología: puntuación de bits (>100), valor de e (<e-20) y porcentaje de identidad (>40 %). Para asegurar la asignación de ortología, las dianas también se probaron para coincidencia de BLAST recíproca de manera que cuando la secuencia de H. glycines seleccionada se volvió a comprobar por BLAST con la lista de Wormpep de C. elegans (BLASTX), se identificó la secuencia de inicio original. 25 genes que de otro modo han constituido los 300 principales suspendieron esta prueba de BLAST recíproca que indica que fue poco probable que los genes en C. elegans y H. glycines fueran ortólogos. De los 300 finales, 296 parecieron ser claros ortólogos con las principales coincidencias de BLAST recíprocas en ambas direcciones, 1 empató para coincidencia principal (2 homólogos próximos en C. elegans) y 3 estuvieron dentro del 5 % de la mejor puntuación de bits (estos se mantuvieron debido a fuertes fenotipos entre todos los principales homólogos de C. elegans). Para los 300 genes principales, las coincidencias de H. glycines fueron:

BLAST Media ± DE Intervalo

% de ID: 65 ± 15 96 -30

Puntuación de bits: 253 ± 158 1031 -71

Valor de e: e-61 (mediana) 0 -e-13

De las 300 dianas principales, 63 parecen haberse identificado específicamente debido a la secuenciación de Genome Survey. Las coincidencias en EST u otras secuencias públicamente disponibles están tanto ausentes como son de puntuaciones sustancialmente más débiles (principalmente parálogos). La clasificación de estos genes entre los 300 principales es la siguiente:

23 en los 100 principales: 1, 5, 7, 9, 15, 33, 35, 37, 38, 40, 44, 51, 53, 58, 60, 67, 68, 75, 80, 82, 83, 88, 96 15 en los 2º 100: 102, 115, 134, 142, 148, 151, 152, 156, 163, 164, 191, 193, 199, 200 26 en los 3º 100: 206, 208, 211, 219, 226, 231, 237, 241, 242, 247, 251, 254, 256, 258, 260, 261, 263, 267, 271, 272, 280, 281, 289, 292, 298, 300.

Ejemplo 6

Expresión génica en H. glycines y otros tilénquidos

También se monitorizó la expresión de genes diana en H. glycines y otros nematodos parásitos de las plantas tilénquidos. Incluso dentro de H. glycines, este procedimiento fue impreciso ya que el transcrito identificado de la lista de los 300 principales puede ser el gen real de interés en los casos en los que el éxito principal fuera un EST (237 de las 300) o un homólogo relacionado en el que la principal coincidencia fuera con la secuencia genómica (63 de las 300). Asimismo, las coincidencias en tilénquidos relacionados pueden ser ortólogos u homólogos. Sin embargo, esta información proporciona un punto de partida para buscar en el estado de expresión. La expresión en J2, J3 y J4 es particularmente atractiva ya que la administración de ARN bicatenario debe ser posible a partir de la planta en estas etapas mediante el sitio de alimentación mientras que se está formando el quiste. De los genes con representación de EST en H. glycines, el 47 % estuvieron representados por un único EST. El 53 % de los genes estuvieron representados por dos o más EST. El 64 % tuvo representación en las etapas J2, J3 o J4. 165 de las 300 dianas tuvieron ortólogos u homólogos entre EST y otra secuenciación disponible de otros nematodos parásitos de las plantas tilénquidos que incluyen Heterodera schachtii, Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne paranaensis, Pratylenchus vulnus, Pratylenchus penetrans, Radopholus similis (Tabla 3).

Tabla 3: Evidencia de la expresión de las 300 dianas principales en H. glycines y otras especies de tilénquidos.

EST de H. g. total: EST de H. g. de J2, J3, J4 ETS total de otras especies

media: 4,7 2,3 14,0

de: 22,0 5,3 64,3

mediana: 1 1 1

ceros: 22 122 135

unos: 131 66 38

doses: 43 46 12

tres o más: 102 64 113

Ejemplo 7

5 Lista de dianas para iARN de H. glycines

La alteración de la función de genes diana dentro del nematodo quístico de soja patógeno de la planta, Heterodera glycines, puede llevarse a cabo por interferencia por ARN y puede producir alteración del ciclo vital del patógeno. Genes diana óptimos para la alteración incluyen genes esenciales del ciclo vital en los que la alteración produce alta muerte por penetración de las poblaciones de parásitos o “muerte genética” bloqueando la reproducción con daño 10 mínimo a la planta y gusanos de escape viables mínimos que alcanzan la siguiente generación. Los inventores han proporcionado un procedimiento para seleccionar dianas de iARN y una lista de 300 genes diana predichos por ser esenciales para la reproducción de H. glycines. Características clave usadas para predecir dianas incluyen ortología con genes conocidos de C. elegans con fenotipos de interferencia por ARN fuertes y reproducibles. La lista de las 300 dianas principales completa se proporciona en la FIG 3. La Tabla 4 enumera dianas de genes seleccionados

15 para ensayar en tejidos vegetales.

Tabla 4: Dianas de genes seleccionados para raíz pilosa de la soja y en ensayos in planta

Nombre del gen: Secuencia de nucleótidos coincidente Localización en la secuencia de nucleótidos Secuencia de péptidos

Bli-3: SeqID_1304 12-552 SeqID_1889

Bli-3: SeqID_1487 12-552 SeqID_1889

C23H3.4: SeqID_510 925-735 SeqID_1056

C23H3.4: SeqID_814 586-776 SeqID_1056

C26E6,4: SeqID_539 2836-3029 SeqID_1051

C34G6.6: SeqID_511 3917-3429 SeqID_1233

C34G6.6: SeqID_790 244-732 SeqID_1233

Cct-4: SeqID_1318 193-568 SeqID_1741

Cct-4: SeqID_1537 193-568 SeqID_1741

(continuación)

Cgh-1: SeqID_1289 319-795 SeqID_1722

Cqh-1: SeqID_1513 280-756 seqID_1722

Cgh-1: SeqID_1289 1587-1761 SeqID_1722

Crs-1: SeqID_535 1783-1487 SeqID_1035

Crs-1: SeqID_792 1353-1649 SeqID_1035

Cyc-1: SeqID_513 1375-1154 SeqID_1046

Cyc-1: seqID_804 529-750 SeqID_1046

F01G10.1: SeqID_509 3122-3454 SeqID_1055

F01G10.1: SeqID_813 690-1022 SeqID_1055

F52B11.3: SeqID_508 3280-3088 SeqID_1053

F52B11.3: SeqID_811 1036-1228 SegID_1053

F54B3.3: SeqID_524 2457-2222 SeqID_1058

F54B3.3: SeqID_816 266-501 SeqID_1058

Kin-2: SeqID_506 1310-1023 SeqID_1032

Kin-2: SeqID_787 79-366 SeqID_1032

Kin-2: SeqID_1921 15-464 SeqID_1931

Kin-2: SeqID_1921 465-714 SeqID_1931

Kin-2: SegID_1926 211-460 SeqID_1931

Kin-2: SeqID_787 265-514 SeqID_1032

Kin-2: SeqID_787 514-663 SeqID_1032

Kin-2: SeqID_1921 340-586 SeqID_1931

Kin-2: SeqID_1926 86-332 SeqID_1931

Kin-2: SeqID_787 140-386 SeqID_1032

Let-767: SeqID_1306 328-687 SeqID_1735

Let-767: SeqID_1528 295-654 SeqID_1735

Pas-4: SeqID_1292 564-894 SeqID_1724

Pas-6: SeqID_1290 314-859 SeqID_1723

Ran-1: SeqID_1307 550-777 SeqID_1736

Rpt-1: SeqID_1310 328-581 SeqID_1737

Rpt-1: SeqID_1531 328-581 SeqID_1737

Rpt-1: SeqID_523 1356-1609 SeqID_1047

Rpt-1: SeqID_805 668-921 SeqID_1047

(continuación)

Sec61 alfa: SeqID_1330 93-488 SeqID_1751

Sec61 alfa: SeqID_1548 93-488 SeqID_1751

Top-1: SeqID_1298 1-449 SeqID_1729

Top-1: SeqID_1521 1-449 SeqID_1729

Top-1: SeqID_1920 1569-2017 SeqID_1930

Top-1: SeqID_1925 1565-2013 SeqID_1930

Uba-1: SeqID_1923 1977-2184 SeqID_1933

Uba-1: SeqID_1928 1715-1922 SeqID_1933

Uba-1: SeqID_505 2500-2708 SeqID_1031

Uba-1: SeqID_786 1562-1770 SeqID_1031

Vab-10: SeqID_542 2871-3759 SeqID_1028

Vab-10: SeqID_788 444-1332 SeqID_1028

Vha-12: SeqID_1303 44-496 SeqID_1733

Vha-12: SeqID_1526 1-453 SeqID_1733

Vha-12: SeqID_793 1-453 SeqID_1036

Vha-13: SeqID_1312 16-255 SeqID_1906

Vha-13: SeqID_1533 16-255 SeqID_1906

Vha-13: SeqID_514 1979-2218 SeqID_1048

Vha-13: SeqID_806 707-946 SeqID_1048

Vha-15: SeqID_519 1318-1137 SeqID_1033

Vha-15: SeqID_789 997-1178 SeqID_1033

Y48B6A.3: SeqID_1302 1755-2384 SeqID_1732

Y48B6A.3: SeqID_1525 1697-2326 SegID_1732

Y55H10A.1: SeqID_1327 524-830 SeqID_1748

Y55H10A.1: SeqID_1545 524-830 SeqID_1748

ZK1127.5: SeqID_538 285-535 SeqID_1050

ZK1127.5: SeqID_808 50-300 SeqID_1050

Ejemplo 8

Genes de H. glycines seleccionados que muestran eficacia en bloquear la infección de soja por el nematodo quístico de la soja

Los resultados de los ensayos de remojo muestran que los ortólogos (y fragmentos de tales ortólogos) de pas-4 (por ejemplo, encontrado en los nucleótidos 1-544 de SEC ID Nº: 1292), pas-5 (por ejemplo, encontrado en SEC ID Nº: 525, 569, 797, nucleótidos 1-672 de SEC ID Nº: 1293, o en SEC ID Nº: 1516), pas-6 (por ejemplo, encontrado en los nucleótidos 314-859 de SEC ID Nº: 1290) y cgh-1 (por ejemplo, encontrado en los nucleótidos 931-1567 de SEC ID

Nº: 1289), entre otros, demuestran eficacia en bloquear la reproducción del nematodo quístico de la soja (NQS). Cada uno de estos genes se encuentra entre las 16 entradas principales en la FIG 3.

También se probaron genes seleccionados o fragmentos de genes en un ensayo de raíz pilosa de la soja (por ejemplo, Narayanan y col., 1999) y tejidos vegetales demostraron resistencia a NQS como se muestra en la Tabla 5:

Tabla 5. Resultados de ensayos en raíz pilosa que demuestran actividad de resistencia a NQS.

Nombre del gen: Locus Clase I Clase II Clase III Clase IV Exp total

Sec61 alfa: Y57G11C.15 2 1 2 0 7

Uba-1: C47E12.5 8 2 2 0 16

Kin-2: R07E4.6 20 8 3 4 32

Vab-10: ZK1151.1 1 1 2 0 7

Vha-15: T14F9.1 4 2 1 0 8

C34G6.6
C34G6.6: 1 2 0 1 7

Y48B6A.3
Y48B6A.3: 0 1 0 0 2

Crs-1: Y23H5A.7 1 0 0 0 2

Vha-12: F20B62 0 1 0 0 4

Pas-4: C36B1.4 2 0 0 0 6

Bli-3: F56C11.1 3 0 0 0 3

Cgh-1: C07H6.5 1 0 0 1 9

Let-767: C56G2.6 3 0 1 0 4

Pas-6: CD4.6 2 5 0 1 7

Ran-1: K01G5.4 2 2 0 0 5

Cyc-1: C54G4.8 1 0 0 0 2

Rpt-1: C52E4.4 2 0 0 0 6

Vha-13: Y49A3A.2 3 2 1 0 8

Top-1: M01E5.5 18 8 2 4 26

ZK1127.5
ZK1127.5: 0 2 0 0 2

C26E6.4
C26E6.4: 1 1 1 0 3

F52B11.3
F52B11.3: 2 1 1 0 3

F01G10.1
F01G10.1: 6 1 3 1 10

C23H3.4
C23H3.4: 2 1 0 0 5

Cct-4: K01C8.10 3 1 0 0 4

F54B3.3
F54B3.3: 0 1 0 0 2

Y55H10A.1
Y55H10A.1: 3 1 1 0 6

Clasificación de eficacia para la Tabla 5 Clase IV: superior o igual al 50 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para control natural por vector vacío transgénico; Clase III: 35 -49 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para control natural por vector vacío transgénico; Clase II: 20 -34 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para control natural por vector vacío transgénico Clase I: que tiene eventos de transformación individuales con mayor eficacia que la mayor eficacia del evento observada con control natural por vector vacío transgénico

Pas-5, Cgh-1 o Pas-6, y estas plantas se probaron para resistencia a NQS. Los resultados se muestran en la Tabla 6, que demuestran la eficacia en reducir la infección y/o reproducción por NQS.

Tabla 6. Análisis de plantas transgénicas para resistencia a NQS

Nombre del gen: Locus Promotor Línea de soja Clase I Clase II Clase III Clase IV Eventos totales probados

Pas-4: C36B1.4 FMV Lee 74 6 3 1 0 12

A3244: 6 2 0 0

Pas-5: F25H2.9 FMV Lee 74 4 5 5 1 18

A3244: 0 1 0 0

Pas-5: F25H2.9 E35S Lee 74 2 4 4 2 16

A3244: 1 1 1 0

Cgh-1: C07H6.5 FMV Lee 74 4 2 2 2 11

A3244: 0 2 1 1

Cgh-1: C07H6.5 E35S Lee 74 5 13 2 2 27

A3244: 6 2 0 2

Pas-6: CD4.6 FMV Lee 74 5 1 2 1 14

A3244: 1 1 2 0

Pas-6: CD4.6 E35S Lee 74 7 5 0 0 20

A3244: 3 1 0 0

Clasificación de eficacia para la Tabla 6: Clase I: 10-20 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para Lee 74 o A3244; Clase II: 20 -35 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para Lee 74 o A3244; Clase III: 36 -50 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para Lee 74 o A3244; Clase IV: >50 % de reducción en el número de quistes medio con respecto al número de quistes medio para Lee 74 o A3244

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<210> 451

<400> 451 000

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<400> 452 000

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<210> 461

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<400> 463

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<210> 471

<400> 471 000

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<400> 480 000

<210> 481

<400> 481 000

<210> 482

<400> 482 000

<210> 483

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<400> 484 000

<210> 485

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<400> 489 000

<210> 490 <400> 490 000

<210> 491

<400> 491 000

<210> 492

<400> 492 000

<210> 493

<400> 493 000

<210> 494

<400> 494 000

<210> 495

<400> 495 000

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<400> 496 000

<210> 497

<400> 497 000

<210> 498

<400> 498 000

<210> 499

<400> 499 000

<210> 500

<400> 500 000

<210> 501

<400> 501 000

<210> 502

<400> 502 000

<210> 503

<400> 503 000

<210> 504

<400> 504 000

<210> 505

<211> 4554

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_544; coordenadas = 414..516 ,571..770,826..999,1053..1206,1261..1487,1533..1646,1694..1879,1940..2062,2107..222 0,2273..2438,2500..2708,2757..2861,2912..3058 ,3115..3189,3234..3438,...

<220>

<223> coordenadas de ADNc genómica virtual = 3490..3677,3725..3931,3990..4076,4126..4226,4274..4409

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_786; coordenadas = 414..516,571..770,826..999 ,1053..1206,1261..1487,1533..1646,1694..1879,1940..2062,2107..2220 ,2273..2438,2500..2708,2757..2861,2912..3058,3115..3189,3234..3438 ,3490..3677,3725..3931,...

<220>

<223> coordenadas codificantes = 3990..4076,4126..4226,4274..4409

<220>

<223> Secuencia peptídico = SecID_1031

<400> 505

<210> 506

<211> 2252 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_545; 10 coordenadas = 1699..1622 ,1310..1023,967..884,837..651,604..518,466..350,298..206,150..71

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_787; coordenadas = 1699..1622,1310..1023,967..884,

837..651,604..518,466..350,298..206,150..71 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1032 <210> 507

5 <400> 507 000

<210> 508

<211> 7265 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual= SecID_547;

15 coordenadas = 6173..6048 ,5864..5722,5653..5485,5422..5376,5037..4901,4511..4426,4078..3892 ,3420..3089,27 42..2623,2119..2008,1908..1860,1404..1174,452..296 ,117..1

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_811;

20 coordenadas = 6173..6048,5864..5722 ,5653..5485,5422..5376,5037..4901,451.1..4926,4078..3892,3420..3089 ,27 42..2623,2119..2008,1908..1860,1404..1174,452..296,117..1

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1053

<400> 508

<210> 509

<211> 4406 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_548; 10 coordenadas = 1563..1778 ,2003..2279,2504..2699,3122..3454,3556..3696,3885..3998,4064..4269

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_813;

coordenadas = 1563..1778,2003..2279 ,2504..2699,3122..3454,3556..3696,3885..3998,4064..4269

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1055

<400> 509

<210> 510

<211> 2359 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_549; 10 coordenadas = 2122..2072 ,1912..1809,1752..1659,1599..1492,1401..1296,1237..1116,925..735

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_814;

coordenadas = 2122..2072,1912..1809 ,1752..1659,1599..1492,1401..1296,1237..1116,925..735 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1056

<210> 511

<211 > 5091

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_550; coordenadas = 4426..4285 ,4185..4085,3917..3429,3274..3130,3087..2964,2907..2848,2792..2547 ,2493..2376,23 20..2235,2181..2083,2037..1863,1681..1549,1161..1097 ,1046..965,914..840,697..495,453..304,204..1

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_790; coordenadas = 4426..4285,4185..4085 ,3917..3429,3274..3130,3087..2964,2907..2848,2792..2547,2493..2376 ,23 20..2235,2181..2083,2037..1863,1681..1549,1161..1097,1046..965 ,914..840,697..495,453..304,204..1

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1233

<210> 512

5 <400> 512 000

<210> 513

<211> 3796 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual= SecID_552; coordenadas = 3606..3564 ,3501..3338,2995..2869,2319..2122,1375..1154,455..258

<220>

5 <223> Secuencia codificante = SecID_804; coordenadas = 3602..3564,3501..3338 ,2995..2869,2319..2122,1375..1154,455..258

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1046 10

<400> 513

<210> 514

<211> 3395 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_553; 10 coordenadas = 669..708 ,755..883,927..1076,1125..1327,1393..1576,1979..2218,2281..2518 ,2569..2706

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_806;

coordenadas = 669..708,755..883,927..1076 ,1125..1327,1393..1576,1979..2218,2281..2518,2569..2706 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1048

<400> 514

<210>: 515

<210>: 516

<400> 516 000

<210> 517

<400> 517 000

<210> 518

<400> 518 000

<210> 519

<211> 3041

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual= SecID_559; coordenadas = 2870..2753 ,2689..2444,2348..2235,2089..1982,1939..1776,1623..1374,1318..1137 ,1082..981,928. .843,783..536

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_789; coordenadas = 2866..2753,2689..2444 ,2348..2235,2089..1982,1939..1776,1623..1374,1318..1137,1082..981 ,928. .843,783..668

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1033

<400> 519

<210>: 520

<210>: 521

<210>: 522

<400>: 521 000

<400> 522 000

<210> 523

<211> 2986

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_564; coordenadas = 2..38,93..310 ,542..703,1004..1150,1207..1242,1289..1609,1859..1945,2013..2083 ,2142..2179,226 3..2366,2475..2604

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_805; coordenadas = 2..38,93..310,542..703 ,1004..1150,1207..1242,1289..1609,1859..1945,2013..2083,2142..2179

,226 3..2366,2475..2528

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1047

<400> 523

<210> 524

<211> 3451 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_565;

10 coordenadas = 3450..3418 ,3349..3248,3029..2900,2457..2222,1770..1558,1374..1249,1145..1021 ,957..835,583.. 492,371..165

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_816;

15 coordenadas = 3450..3418,3349..3248 ,3029..2900,2457..2222,1770..1558,1374..1249,1145..1021,957..835 ,583.. 492,371..165

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1058

<400> 524

<210> 525

<211> 3201 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual= SecID_569; 10 coordenadas = 725..844 ,889..1015,1574..1695,1752..1793,2207..2386,2438..2566,2616..2807

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_797; coordenadas = 749..844,889..1015,1574..1695 ,1752..1793,2207..2386,2438..2566,2616..2675

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1040

<400> 525

<210> 526

5 <400> 526 000

<210> 527

10 <400> 527 000

<210> 528 15 <400> 528 000

<210> 529

<400> 529 000

<210> 530

<400> 530 000

<210> 531

<400> 531 000

<210> 532

<400> 532 000

<210> 533

<400> 533 000

<210> 534

<400> 534 000

<210> 535

<211> 5201

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_580; coordenadas = 3891..3838 ,3752..3586,3506..3342,3201..3025,2979..2832,2739..2593,2526..2445 ,2394..2273,22 17..2024,1930..1837,1785..1487,1351..1234,1183..928 ,562..411

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_792; coordenadas = 3891..3838,3752..3586 ,3506..3342,3201..3025,2979..2832,2739..2593,2526..2445,2394..2273 ,22 17..2024,1930..1837,1785..1487,1351..1234,1183..928,562..411

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1035

<400> 535

<210> 536

5 <400> 536 000

<210> 537

10 <400> 527 000

<210> 538

<211> 2477 15 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_583; 20 coordenadas = 182..230 ,285..535,578..742,784..869,918..1077,1515..1618,1661..1937

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_808; coordenadas = 182..230,285..535,578..742 ,784..869,918..1077,1515..1618,1661..1844

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1050

<400> 538

<210> 539

<211> 5202

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_584; coordenadas = 399..494 ,600..667,712..910,956..1089,1136..1330,1390..1498,1560..1700 ,1742..1891,1953..2108, 2153..2314,2359..2617,2669..3028,3086..3371 ,3418..3538,3589..3740,...

<220>

<223> coordenadas de ADNc genómica virtual = 3788..4064,4114..4224,4279..4434 ,4497..4615,4660..4834,4895..5063

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_809; coordenadas = 399..494,600..667,712..910 ,956..1089,1136..1330,1390..1498,1560..1700,1742..1891,1953..2108 , 2153..2314,2359..2617,2669..3028,3086..3371,3418..3538,3589..3740 ,3788..4064,4114..4224,...

<220>

<223> coordenadas codificantes = 4279..4434,4497..4615,4660..4834,4895..5005

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1051

<400> 539

<210>: 540

<210>: 541

<210>: 542

<400>: 541 000

<211> 4451

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica virtual = SecID_558; coordenadas = 2428..4112

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_788; coordenadas = 2428..4112

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1028

<400> 542

<210>: 543

<210>: 544

<400> 544 000

<210> 545

<400> 545 000

<210> 546

<400> 546 000

<210> 547

<400> 547 000

<210> 548

<400> 548 000

<210> 549

<400> 549 000

<210> 550

<400> 550 000

<210> 551

<400> 551 000

<210> 552

<400> 552 000

<210> 553

<400> 553 000

<210> 554

<400> 554 000

<210> 555

<400> 555 000

<210> 556

<400> 556 000

<210> 557

<400> 557 000

<210> 558

<400> 558 000

<210> 559

<400> 559 000

<210> 560

<400> 560 000

<210> 561

<400> 561 000

<210> 562

<400> 562 000

<210> 563

<400> 563 000

<210> 564

<400> 564 000

<210>: 565 5

<400> 565 000

<210>: 566 10

<400> 566 000

<210>: 567 15

<400> 567 000

<210>: 568 20

<400> 568 000

<210>: 569 25 <211> 912

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220> 30 <223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_525; Secuencia codificante = SecID_797

<400> 569

<210> 570

<400> 570 000

<210> 571

<400> 571 000

<210> 572

<400> 572 000

<210> 573

<400> 573 000

<210> 574

<400> 574 000

<210> 575

<400> 575 000

<210> 576

<400> 576 000

<210> 577

<400> 577 000

<210> 578

<400> 578 000

<210> 579

<400> 579 000

<210> 580

<400> 580 000

<210> 581

<400> 581 000

<210> 582

<400> 582 000

<210> 583 <400> 583 000

<210> 584

<400> 584 000

<210> 585

<400> 585 000

<210> 586

<400> 586 000

<210> 587

<400> 587 000

<210> 588

<400> 588 000

<210> 589

<400> 589 000

<210> 590

<400> 590 000

<210> 591

<400> 591 000

<210> 592

<400> 592 000

<210> 593

<400> 593 000

<210> 594

<400> 594 000

<210> 595

<400> 595 000

<210> 596

<400> 596

<210> 597

<400> 597 000

<210> 598

<400> 598 000

<210> 599

<400> 599 000

<210> 600

<400> 600 000

<210> 601

<400> 601 000

<210> 602

<400> 602 000

<210> 603

<400> 603 000

<210> 604

<400> 604 000

<210> 605

<400> 605 000

<210> 606

<400> 606 000

<210> 607

<400> 607 000

<210> 608

<400> 608 000

<210> 609

<400> 609 000

<210> 610

<400> 610 000

<210> 611

<400> 611 000

<210> 612

<400> 612 000

<210> 613

<400> 613 000

<210> 614

<400> 614 000

<210> 615

<400> 615 000

<210> 616

<400> 616 000

<210> 617

<400> 617 000

<210> 618

<400> 618 000

<210> 619

<400> 619 000

<210> 620

<400> 620 000

<210> 621

<400> 621 000

<210> 622

<400> 622 000

<210> 623 <400> 623 000

<210> 624

<400> 624 000

<210> 625

<400> 625 000

<210> 626

<400> 626 000

<210> 627

<400> 627 000

<210> 628

<400> 628 000

<210> 629

<400> 629 000

<210> 630

<400> 630 000

<210> 631

<400> 631 000

<210> 632

<400> 632 000

<210> 633

<400> 633 000

<210> 634

<400> 634 000

<210> 635

<400> 635 000

<210> 636

<400> 636

<210> 637

<400> 637 000

<210> 638

<400> 638 000

<210> 639

<400> 639 000

<210> 640

<400> 640 000

<210> 641

<400> 641 000

<210> 642

<400> 642 000

<210> 643

<400> 643 000

<210> 644

<400> 644 000

<210> 645

<400> 645 000

<210> 646

<400> 646 000

<210> 647

<400> 647 000

<210> 648

<400> 648 000

<210> 649

<400> 649 000

<210> 650

<400> 650 000

<210> 651

<400> 651 000

<210> 652

<400> 652 000

<210> 653

<400> 653 000

<210> 654

<400> 654 000

<210> 655

<400> 655 000

<210> 656

<400> 761 000

<210> 657

<400> 657 000

<210> 658

<400> 658 000

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<400> 561 000

<210> 786

<211> 3021

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_505; Secuencia de ADNc = SecID_544

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1031

<400> 786

<210> 787

<211> 1014 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_506; Secuencia de ADNc = SecID_545 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1032

<400> 787

<210> 788

<211> 1685

<212> ADN 10 <213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_542; Secuencia de ADNc = SecID_558

15 <220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1028

<400> 788 <210> 789

<211> 1482 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_519; Secuencia de ADNc = SecID_559 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1033

<400> 789

5 <210> 790

<211> 2697

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

10 <220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_511; Secuencia de ADNc = SecID_550

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1233 15

<400> 790

<210> 791

5 <400> 791 000

<210> 792

<211> 2175 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_535; Secuencia de ADNc = SecID_580 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1035 <210> 793

<211> 1506 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_532; Secuencia de ADNc = SecID_576 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1036

<400> 793 <210> 794

5 <400> 794 000

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10 <400> 795 000

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<210> 797

<211> 756 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_525; Secuencia de ADNc = SecID_569 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1040

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20 <400> 798 000

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40 <400> 802 000

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<400> 803 000

<210> 804 5 <211> 948

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220> 10 <223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_513; Secuencia de ADNc = SecID_552

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1046

15 <400> 804

<210> 805 20 <211> 1275

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220> 25 <223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_523; Secuencia de ADNc = SecID_564

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1047

30 <400> 805 <210> 806

<211> 1322 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_514; Secuencia de ADNc = SecID_553 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1048

<400> 806 15

<210> 807

5 <400> 807 000

<210> 808

<211> 999 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_538; Secuencia de ADNc = SecID_583 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1050

<400> 808 20

<210>: 809

<210>: 810

<210>: 811

<400>: 810 000

<211> 2013

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_508; Secuencia de ADNc = SecID_547

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1053

<400> 811

<210> 812

<400> 812

000 5

<210> 813

<211> 1483

<212> ADN

<213> Heterodera glycines 10

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_509; Secuencia de ADNc = SecID_548

<220> 15 <223> Secuencia peptídica = SecID_1055

<400> 813

<210> 814

<211> 776

<212> ADN

<213> Heterodera glycines 5

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_510; Secuencia de ADNc = SecID_549

<220> 10 <223> Secuencia peptídica = SecID_1056

<400> 814

<210> 815

<400> 815

000 20

<210> 816

<211> 1387

<212> ADN

<213> Heterodera glycines 25

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_524; Secuencia de ADNc = SecID_565

<220> 30 <223> Secuencia peptídica = SecID_1058

<400> 816 <210> 817

5 <400> 817 000

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<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220> 15 <223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_434; Secuencia de ADNc = SecID_716

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1175

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<210> 1207

<400> 1207 000

<210> 1208

<400> 1208 000

<210> 1209

<400> 1209 000

<210> 1210

<400> 1210 000

<210> 1211

<400> 1211 000

<210> 1212

<400> 1212 000

<210> 1213

<400> 1213

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<400> 1214 000

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<400> 1215 000

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<400> 1225 000

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<400> 1232 000

<210> 1233

<211> 899

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<221> misc_feature

<222> (600)..(600)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature <222> (618)..(618)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> misc_feature

<222> (834)..(834)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<223> Secuencia de ADNc genómica = SecID_511; Secuencia codificante = SecID_790

<400> 1233

<210> 1234

<400> 1234 000

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<400> 1235 000

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<400> 1236 000

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<400> 1237 000

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<400> 1238 000

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<400> 1239 000

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<400> 1244 000

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<400> 1256 000

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<400> 1259

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<400> 1266 000

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<400> 1268 000

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<400> 1269 000

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<400> 1273 000

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<400> 1276 000

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<400> 1283 000

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<400> 1284 000

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<400> 1285 000

<210> 1286 <400> 1286 000

<210> 1287

<400> 1287 000

<210> 1288

<400> 1288 000

<210> 1289

<211> 1808

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1513; coordenadas = 40-1380

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1722

<400> 1289

<210> 1290

<211> 953

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1514; coordenadas = 52-795

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1723

<400> 1290

<210> 1291

<400> 1291

000 15

<210> 1292

<211> 947

<212> ADN

<213> Heterodera glycines 20

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1515; coordenadas = 26-790

<220> 25 <223> Secuencia peptídica = SecID_1724

<400> 1292 <210> 1293

<211> 946 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1516; coordenadas = 30-785 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1725

<400> 1293 15 <210> 1294

<400> 1294 000

<210> 1295

<400> 1295 000

<210> 1296

<400> 1296 000

<210> 1297

<400> 1297 000

<210> 1298

<211> 1028

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1521; coordenadas = 1-767

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1729

<400> 1298 <210> 1299

<400> 1299 000

<210> 1300

<400> 1300 000

<210> 1301

<400> 1301 000

<210> 1302

<211> 3516

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1525; coordenadas = 59-3334

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1732

<400> 1302

<210> 1303

<211> 1751 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1526; coordenadas = 44-1549 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1733

<400> 1303 15

<210> 1304

<211> 1040 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1487; coordenadas = 1-824

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1889

<400> 1304

<210> 1305

10 <400> 1305 000

<210> 1306

<211> 1094 15 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1528; coordenadas = 34-987 20

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1735

<400> 1306 25

<210> 130

<211> 872 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1529; coordenadas = 63-713 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1736

<400> 1307 15

<210> 1308

<400> 1308 000

<210> 1309

<400> 1309 000

<210> 1310

<211> 1045

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1531; coordenadas = 1-935

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1737

<400> 1310 <210> 1311

5 <400> 1311 000

<210> 1312

<211> 1188 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1533; coordenadas = 1-1074 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1906

<400> 1312 20

<210> 1313

<400> 1313 000

<210> 1314

<400> 1314 000

<210> 1315

<400> 1315 000

<210> 1316

<400> 1316 000

<210> 1317

<400> 1317 000

<210> 1318

<211> 1745

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

5 <220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1537; coordenadas = 1-1629

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1741 10

<400> 1318 <210> 1319

5 <400> 1319 000

<210> 1320

10 <400> 1320 000

<210> 1321

15 <400> 1321 000

<210> 1322

20 <400> 1322 000

<210> 1323

<400> 1323 000

<210> 1324

<400> 1324 000

<210> 1325

<400> 1325 000

<210> 1326

<400> 1326 000

<210> 1327

<211> 1083

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1545; coordenadas = 1-960

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1748

<400> 1327 <210> 1328

<400> 1328 000

<210> 1329

<400> 1329 000

<210> 1330

<211> 1452

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1548; coordenadas = 1-1283

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1751

<400> 1330 <210> 1331

5 <400> 1331 000

<210> 1332

10 <400> 1332 000

<210> 1333

15 <400> 1333 000

<210> 1334

<400> 1334 000

<210> 1335

<400> 1335 000

<210> 1336

<400> 1336 000

<210> 1337

<400> 1337 000

<210> 1338

<400> 1338 000

<210> 1339

<400> 1339 000

<210> 1340

<400> 1340 000

<210> 1341

<400> 1341 000

<210> 1342

<400> 1342 000

<210> 1343

<400> 1343 000

<210> 1344

<400> 1344 000

<210> 1345

<400> 1345 000

<210> 1346

<400> 1346 000

<210> 1347 <400> 1347 000

<210> 1348

<400> 1348 000

<210> 1349

<400> 1349 000

<210> 1350

<400> 1350 000

<210> 1351

<400> 1351 000

<210> 1352

<400> 1352 000

<210> 1353

<400> 1353 000

<210> 1354

<400> 1354 000

<210> 1355

<400> 1355 000

<210> 1356

<400> 1356 000

<210> 1357

<400> 1357 000

<210> 1358

<400> 1358 000

<210> 1359

<400> 1359 000

<210> 1360

<400> 1360

<210> 1361

<400> 1361 000

<210> 1362

<400> 1362 000

<210> 1363

<400> 1363 000

<210> 1364

<400> 1364 000

<210> 1365

<400> 1365 000

<210> 1366

<400> 1366 000

<210> 1367

<400> 1367 000

<210> 1368

<400> 1368 000

<210> 1369

<400> 1369 000

<210> 1370

<400> 1370 000

<210> 1371

<400> 1371 000

<210> 1372

<400> 1372 000

<210> 1373

<400> 1373 000

<210> 1374

<400> 1374 000

<210> 1375

<400> 1375 000

<210> 1376

<400> 1376 000

<210> 1377

<400> 1377 000

<210> 1378

<400> 1378 000

<210> 1379

<400> 1379 000

<210> 1380

<400> 1380 000

<210> 1381

<400> 1381 000

<210> 1382

<400> 1382 000

<210> 1383

<400> 1383 000

<210> 1384

<400> 1384 000

<210> 1385

<400> 1385 000

<210> 1386

<400> 1386 000

<210> 1387 <400> 1387 000

<210> 1388

<400> 1388 000

<210> 1389

<400> 1389 000

<210> 1390

<400> 1390 000

<210> 1391

<400> 1391 000

<210> 1392

<400> 1392 000

<210> 1393

<400> 1393 000

<210> 1394

<400> 1394 000

<210> 1395

<400> 1395 000

<210> 1396

<400> 1396 000

<210> 1397

<400> 1397 000

<210> 1398

<400> 1398 000

<210> 1399

<400> 1399 000

<210> 1400

<400> 1400

<210> 1401

<400> 1401 000

<210> 1402

<400> 1402 000

<210> 1403

<400> 1403 000

<210> 1404

<400> 1404 000

<210> 1405

<400> 1405 000

<210> 1406

<400> 1406 000

<210> 1407

<400> 1407 000

<210> 1408

<400> 1408 000

<210> 1409

<400> 1409 000

<210> 1410

<400> 1410 000

<210> 1411

<400> 1411 000

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<400> 1412 000

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<400> 1413 000

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<400> 1414 000

<210> 1415

<400> 1415 000

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<400> 1416 000

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<400> 1417 000

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<400> 1418 000

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<400> 1420 000

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<400> 1422 000

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<400> 1423 000

<210> 1424

<400> 1424 000

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<400> 1428 000

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<400> 1430 000

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<400> 1431 000

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<400> 1432 000

<210> 1433

<400> 1433 000

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<400> 1486 000

<210> 1487

<211> 824

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1304; Secuencia peptídica = SecID_1889

<400> 1487 <210> 1488

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<400> 1510 000

<210> 1511

<400> 1511 000

<210> 1512

<400> 1512 000

<210> 1513

<211> 1341

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1289; Secuencia peptídica = SecID_1722

<400> 1513 <210> 1514

5 <400> 1514 000

<210> 1515

10 <400> 1515 000

<210> 1516

<211> 756 15 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1293; Secuencia peptídica = SecID_1725 20

<400> 1516 <210> 1517

<400> 1517 000

<210> 1518

<400> 1518 000

<210> 1519

<400> 1519 000

<210> 1520

<400> 1520 000

<210> 1521

<211> 767

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1298; Secuencia peptídica = SecID_1729

<400> 1521 <210> 1522

<400> 1522 000

<210> 1523

<400> 1523 000

<210> 1524

<400> 1524 000

<210> 1525

<211> 3276

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1302; Secuencia peptídica = SecID_1732

<400> 1525

<210> 1526

<211> 1506 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1303; Secuencia peptídica = SecID_1733 10

<400> 1526 <210> 1527

5 <400> 1527 000

<210> 1528

<211> 954 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1306; Secuencia peptídica = SecID_1735 15

<400> 1528 <210> 1529

5 <400> 1529 000

<210> 1530

10 <400> 1530 000

<210> 1531

<211> 935 15 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1310; Secuencia peptídica = SecID_1737 20

<400> 1531 <210> 1532

5 <400> 1532 000

<210> 1533

<211> 1074 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1312; Secuencia peptídica = SecID_1906 15

<400> 1533 <210> 1534

<400> 1534 000

<210> 1535

<400> 1535 000

<210> 1536

<400> 1536 000

<210> 1537

<211> 1629

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1318; Secuencia peptídica = SecID_1741

<400> 1537

<210> 1538

5: <400> 1538 000

<210> 1539

10: <400> 1539 000

233

<210> 1540

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<210> 1541

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<210> 1544

<400> 1544 000

<210> 1545

<211> 960

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1327; Secuencia peptídica = SecID_1748

<400> 1545 <210> 1546

5 <400> 1546 000

<210> 1547

10 <400> 1547 000

<210> 1548

<211> 1283 15 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1330; Secuencia peptídica = SecID_1751 20

<400> 1548 <210> 1549

<400> 1549 000

<210> 1550

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<210> 1702

<400> 1702 000

<210> 1703

<400> 1703 000

<210> 1704

<400> 1704 000

<210> 1705

<400> 1705 000

<210> 1706

<400> 1706 000

<210> 1707

<400> 1707 000

<210> 1708

<400> 1708 000

<210> 1709

<400> 1709 000

<210> 1710

<400> 1710 000

<210> 1711

<400> 1711 000

<210> 1712

<400> 1712 000

<210> 1713

<400> 1713 000

<210> 1714 <400> 1714 000

<210> 1715

<400> 1715 000

<210> 1716

<400> 1716 000

<210> 1717

<400> 1717 000

<210> 1718

<400> 1718 000

<210> 1719

<400> 1719 000

<210> 1720

<400> 1720 000

<210> 1721

<400> 1721 000

<210> 1722

<211> 446

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1289; Secuencia codificante = SecID_1513

<400> 1722

<210> 1723

<211> 247 5 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1290; Secuencia codificante = SecID_1514 10

<400> 1723 <210> 1724

<211> 254 5 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1292; Secuencia codificante = SecID_1515 10

<400> 1724 <210> 1725

5 <400> 1725 000

<210> 1726

10 <400> 1726 000

<210> 1727

15 <400> 1727 000

<210> 1728

<400> 1728 000

<210> 1729 5 <211> 254

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220> 10 <223> Secuencia de ADNc = SecID_1298; Secuencia codificante = SecID_1521

<400> 1729

<210> 1730

<400> 1730

000 5

<210> 1731

<400> 1731

000 10

<210> 1732

<211> 1091

<212> PRT

<213> Heterodera glycines 15

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1302; Secuencia codificante = SecID_1525

<400> 1732 20

<210> 1733

<211> 501 5 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1303; Secuencia codificante = SecID_1526 10

<400> 1733

<210> 1734

5 <400> 1734 000

<210> 1735

<211> 317 10 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1306; Secuencia codificante = SecID_1528 15

<400> 1735

<210> 1736

<211> 216 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1307; Secuencia codificante = SecID_1529

<400> 1736

<210> 1737

<211> 310

<212> PRT

<213> Heterodera glycines 15

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1310; Secuencia codificante = SecID_1531

<400> 1737 20

<210> 1738

<400> 1738 000

<210> 1739

<400> 1739 000

<210> 1740

<400> 1740 000

<210> 1741

<211> 542

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1318; Secuencia codificante = SecID_1537

<400> 1741

<210> 1742

<400> 1742 000

<210> 1743

<400> 1743 000

<210> 1744

<400> 1744 000

<210> 1745

<400> 1745 000

<210> 1746

<400> 1746 000

<210> 1747

<400> 1747 000

<210> 1748

<211> 319

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1327; Secuencia codificante = SecID_1545

<400> 1748

<210> 1749

<400> 1727

000 5

<210> 1750

<400> 1750

000 10

<210> 1751

<211> 426

<212> PRT

<213> Heterodera glycines 15

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1330; Secuencia codificante = SecID_1548

<400> 1751 20

<210> 1752

5 <400> 1752 000

<210> 1753

10 <400> 1753 000

<210> 1754

15 <400> 1754 000

<210> 1755

20 <400> 1755 000

<210> 1756 <400> 1756 000

<210> 1757

<400> 1757 000

<210> 1758

<400> 1758 000

<210> 1759

<400> 1759 000

<210> 1760

<400> 1760 000

<210> 1761

<400> 1761 000

<210> 1762

<400> 1762 000

<210> 1763

<400> 1763 000

<210> 1764

<400> 1764 000

<210> 1765

<400> 1765 000

<210> 1766

<400> 1766 000

<210> 1767

<400> 1767 000

<210> 1768

<400> 1768 000

<210> 1769

<400> 1769

<210> 1770

<400> 1770 000

<210> 1771

<400> 1771 000

<210> 1772

<400> 1772 000

<210> 1773

<400> 1773 000

<210> 1774

<400> 1774 000

<210> 1775

<400> 1775 000

<210> 1776

<400> 1776 000

<210> 1777

<400> 1777 000

<210> 1778

<400> 1778 000

<210> 1779

<400> 1779 000

<210> 1780

<400> 1780 000

<210> 1781

<400> 1781 000

<210> 1782

<400> 1782 000

<210> 1783

<400> 1783 000

<210> 1784

<400> 1784 000

<210> 1785

<400> 1785 000

<210> 1786

<400> 1786 000

<210> 1787

<400> 1787 000

<210> 1788

<400> 1788 000

<210> 1789

<400> 1789 000

<210> 1790

<400> 1790 000

<210> 1791

<400> 1791 000

<210> 1792

<400> 1792 000

<210> 1793

<400> 1793 000

<210> 1794

<400> 1794 000

<210> 1795

<400> 1795 000

<210> 1796 <400> 1796 000

<210> 1797

<400> 1797 000

<210> 1798

<400> 1798 000

<210> 1799

<400> 1799 000

<210> 1800

<400> 1800 000

<210> 1801

<400> 1801 000

<210> 1802

<400> 1802 000

<210> 1803

<400> 1803 000

<210> 1804

<400> 1804 000

<210> 1805

<400> 1805 000

<210> 1806

<400> 1806 000

<210> 1807

<400> 1807 000

<210> 1808

<400> 1808 000

<210> 1809

<400> 1809

<210> 1810

<400> 1810 000

<210> 1811

<400> 1811 000

<210> 1812

<400> 1812 000

<210> 1813

<400> 1813 000

<210> 1814

<400> 1814 000

<210> 1815

<400> 1815 000

<210> 1816

<400> 1816 000

<210> 1817

<400> 1817 000

<210> 1818

<400> 1818 000

<210> 1819

<400> 1819 000

<210> 1820

<400> 1820 000

<210> 1821

<400> 1821 000

<210> 1822

<400> 1822 000

<210> 1823

<400> 1823 000

<210> 1824

<400> 1824 000

<210> 1825

<400> 1825 000

<210> 1826

<400> 1826 000

<210> 1827

<400> 1827 000

<210> 1828

<400> 1828 000

<210> 1829

<400> 1829 000

<210> 1830

<400> 1830 000

<210> 1831

<400> 1831 000

<210> 1832

<400> 1832 000

<210> 1833

<400> 1833 000

<210> 1834

<400> 1834 000

<210> 1835

<400> 1835 000

<210> 1836 <400> 1836 000

<210> 1837

<400> 1837 000

<210> 1838

<400> 1838 000

<210> 1839

<400> 1839 000

<210> 1840

<400> 1840 000

<210> 1841

<400> 1841 000

<210> 1842

<400> 1842 000

<210> 1843

<400> 1843 000

<210> 1844

<400> 1844 000

<210> 1845

<400> 1845 000

<210> 1846

<400> 1846 000

<210> 1847

<400> 1847 000

<210> 1848

<400> 1848 000

<210> 1849

<400> 1849

<210> 1850

<400> 1850 000

<210> 1851

<400> 1851 000

<210> 1852

<400> 1852 000

<210> 1853

<400> 1853 000

<210> 1854

<400> 1854 000

<210> 1855

<400> 1855 000

<210> 1856

<400> 1856 000

<210> 1857

<400> 1857 000

<210> 1858

<400> 1858 000

<210> 1859

<400> 1859 000

<210> 1860

<400> 1860 000

<210> 1861

<400> 1861 000

<210> 1862

<400> 1862 000

<210> 1863

<400> 1863 000

<210> 1864

<400> 1864 000

<210> 1865

<400> 1865 000

<210> 1866

<400> 1866 000

<210> 1867

<400> 1867 000

<210> 1868

<400> 1868 000

<210> 1869

<400> 1869 000

<210> 1870

<400> 1870 000

<210> 1871

<400> 1871 000

<210> 1872

<400> 1872 000

<210> 1873

<400> 1873 000

<210> 1874

<400> 1874 000

<210> 1875

<400> 1875 000

<210> 1876 <400> 1876 000

<210> 1877

<400> 1877 000

<210> 1878

<400> 1878 000

<210> 1879

<400> 1879 000

<210> 1880

<400> 1880 000

<210> 1881

<400> 1881 000

<210> 1882

<400> 1882 000

<210> 1883

<400> 1883 000

<210> 1884

<400> 1884 000

<210> 1885

<400> 1885 000

<210> 1886

<400> 1886 000

<210> 1887

<400> 1887 000

<210> 1888

<400> 1888 000

<210> 1889

<211> 273

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1304; Secuencia codificante = SecID_1487

<400> 1889 <210> 1890

<400> 1890 000

<210> 1891

<400> 1891 000

<210> 1892

<400> 1892 000

<210> 1893

<400> 1893 000

<210> 1894

<400> 1894 000

<210> 1895

<400> 1895 000

<210> 1896

<400> 1896 000

<210> 1897

<400> 1897 000

<210> 1898

<400> 1898 000

<210> 1899

<400> 1899 000

<210> 1900

<400> 1900 000

<210> 1901

<400> 1901 000

<210> 1902

<400> 1902 000

<210> 1903 <400> 1903 000

<210> 1904

<400> 1904 000

<210> 1905

<400> 1905 000

<210> 1906

<211> 353

<212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<221> misc_feature <222> (262)..(262)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1312; Secuencia codificante = SecID_1533

<400> 1906

<210> 1907

<400> 1907 000

<210> 1908

<400> 1908 000

<210> 1909

<400> 1909 000

<210> 1910

<400> 1910 000

<210> 1911

<400> 1911 000

<210> 1912

<400> 1912 000

<210> 1913

<400> 1913 000

<210> 1914 <400> 1914 000

<210> 1915

<400> 1915 000

<210> 1916

<400> 1916 000

<210> 1917

<400> 1917 000

<210> 1918

<400> 1918 000

<210> 1919

<400> 1919 000

<210> 1920

<211> 2335

<212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1925; coordenadas = 5-2335

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1930

<400> 1920

<210> 1921

<211> 1263 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1926; coordenadas = 255-1214 10

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1931

<400> 1921 15

<210> 1922

5 <400> 1922 000

<210> 1923

<211> 3557 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia codificante = SecID_1928; coordenadas = 263-3433 15

<220>

<223> Secuencia peptídica = SecID_1933

<400> 1923 20

<210> 1924

5 <400> 1924 000

<210> 1925

<211> 2331 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1920; Secuencia peptídica = SecID_1930 15

<400> 1925 <210> 1926

<211> 960 5 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1921; Secuencia peptídica = SecID_1931 10

<400> 1926 <210> 1927

5 <400> 1927 000

<210> 1928

<211> 3171 10 <212> ADN

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1923; Secuencia peptídica = SecID_1933 15

<400> 1928

<210> 1929

5 <400> 1929 000

<210> 1930

<211> 776 10 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1920; Secuencia codificante = SecID_1925 15

<400> 1930

<210> 1931

<211> 319 5 <212> PRT

<213> Heterodera glycines

<220>

<223>: Secuencia de ADNc = SecID_1921; Secuencia codificante = SecID_1926 10

<220>

<221 > misc_feature

<222> (163)..(163)

<223>: Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15

<400> 1931 <210> 1932

<400> 1932 000

300 <210> 1933

<211> 1056

<212> PRT 5 <213> Heterodera glycines

<220>

<223> Secuencia de ADNc = SecID_1923; Secuencia codificante = SecID_1928

10 <400> 1933

<210> 1934

<400> 1934 000

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos, en el que la primera secuencia de polinucleótidos está seleccionada de:

(a)

un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1920, en el que la captación por un nematodo parásito de las plantas de una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que comprende al menos una hebra que es complementaria a dicho fragmento inhibe el crecimiento de dicho nematodo y

(b)

un complemento de la secuencia de (a), en el que la tercera secuencia de polinucleótidos está enlazada a la primera secuencia de polinucleótidos por la segunda secuencia de polinucleótidos, y en el que la tercera secuencia de polinucleótidos es sustancialmente el complemento inverso de la primera secuencia de polinucleótidos de forma que la primera y tercera secuencias de polinucleótidos se hibridan cuando se transcriben en un ácido ribonucleico para formar una molécula de ribonucleótido bicatenario estabilizada por la segunda secuencia de ribonucleótidos enlazada,

en el que el polinucleótido está operativamente ligado a un vector heterólogo.
2.

El polinucleótido de la reivindicación 1, está definido como que comprende un vector de transformación de plantas.
3.

Una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria obtenible por la expresión de un polinucleótido según la reivindicación 1, en la que la captación de dicha secuencia de ribonucleótidos por un nematodo parásito de las plantas inhibe el crecimiento de dicho nematodo.
4.

La secuencia de ribonucleótidos bicatenaria de la reivindicación 3,

(i)

que es obtenible transcribiendo una secuencia de polinucleótidos recombinante que comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1, en un ácido ribonucleico para formar la molécula de ribonucleótido bicatenario; o

(ii)

en la que la captación de la secuencia de polinucleótidos por el nematodo parásito de las plantas inhibe la expresión de una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a dichas secuencias de polinucleótidos.
5.

Un vector de transformación de plantas que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 1.
6.

Una célula o una planta que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.
7.

La célula de la reivindicación 6, definida como

(i)

célula procariota; o

(ii)

una célula eucariota a condición de que dicha célula eucariota no sea una célula madre embrionaria humana y/o célula germinal; o

(iii) una célula vegetal.
8.

Una semilla de la planta de la reivindicación 6, en la que la semilla comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.
9.

La planta de la reivindicación 6, en la que dicho polinucleótido se expresa en la célula vegetal como una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria, preferentemente

(i)

el nematodo parásito de las plantas es Heterodera glycines; o

(ii)

la captación de la cantidad inhibidora del nematodo parásito de las plantas de la secuencia de ribonucleótidos bicatenaria inhibe el crecimiento del nematodo.
10.

Un procedimiento de control de una población de nematodos parásitos de las plantas que comprende proporcionar un agente que comprende una secuencia de ribonucleótidos bicatenaria que funciona tras ser captada por el nematodo para inhibir una función biológica dentro de dicho nematodo, en el que

(i)

el agente comprende un fragmento de al menos 21 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1920 o complementos de la misma; o

(ii)

dichas secuencias de polinucleótidos presentan de aproximadamente el 95 a aproximadamente el 100 % de identidad de secuencias de nucleótidos a lo largo de al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de dicho nematodo y se hibrida con una segunda secuencia de polinucleótidos que es complementaria a dicha primera secuencia de polinucleótidos, y en el que dicha secuencia codificante derivada de dicho nematodo es SEC ID Nº: 1920 o complementos de la misma.
11.

El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho nematodo es Heterodera glycines.
12.

Un procedimiento de controla de una población de nematodos parásitos de las plantas que comprende proporcionar en la planta huésped de un nematodo parásito de las plantas una célula vegetal transformada que expresa una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por el nematodo parásito de las plantas para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce la disminución del crecimiento del nematodo o población de nematodos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.
13.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que

(i)

el nematodo presenta disminución del crecimiento tras la infección de la planta huésped; o

(ii)

dicho nematodo está seleccionado del grupo que consiste en Heterodera sp., Meloidogyne sp., Globodera sp., Helicotylenchus sp., Ditylenchus sp., Pratylenchus sp., Paratylenchus sp., Rotylenchus sp., Tylenchulus sp., Tylenchorhynchus sp., Hoplolaimus sp., Belonolaimus sp., Anguina sp., Subanguina sp. y Nacobbus sp., preferentemente el nematodo es Heterodera glycines.
14.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el polinucleótido funciona tras ser captado por el nematodo parásito de las plantas para suprimir un gen que realiza una función esencial para la supervivencia o crecimiento de nematodos, siendo dicha función la replicación de ADN.
15.

Un procedimiento de reducción del número de sitios de alimentación de Heterodera establecidos en el tejido de raíz de una planta huésped, que comprende proporcionar en la planta huésped de una Heterodera sp. una célula vegetal transformada que expresa una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido se expresa para producir un ácido ribonucleico bicatenario que funciona tras ser captado por Heterodera sp. para inhibir la expresión de una secuencia diana dentro de dicho nematodo y produce una disminución en el número de sitios de alimentación establecidos, con respecto al crecimiento en un huésped que carece de la célula vegetal transformada.
16.

Un procedimiento de control de la infestación por la plaga de nematodos de planta en una planta que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de nematodos de planta un ARNbc que comprende:

a) una secuencia de nucleótidos sentido; y b) una secuencia de nucleótidos antisentido complementaria a dicha secuencia de nucleótidos sentido, en el que dicha secuencia de nucleótidos sentido comprende la primera secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.
17.

El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha dieta comprende una célula de planta transformada para expresar dicha secuencia de nucleótidos sentido y dicha secuencia de nucleótidos antisentido.
18.

Un procedimiento de mejora del rendimiento de un cultivo producido a partir de una planta de cultivo sometida a infección por nematodos parásitos de las plantas, o de mejora de la tolerancia a la sequía de una planta de cultivo sometida a infección por nematodos parásitos de las plantas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) introducir un polinucleótido según la reivindicación 1 en dicha planta de cultivo; b) cultivar la planta de cultivo para permitir la expresión de dicho polinucleótido; en el que la expresión del polinucleótido inhibe la infección por nematodos parásitos de las plantas o crecimiento y pérdida de rendimiento debido a infección por nematodos parásitos de las plantas, o mejora la tolerancia a la sequía de la planta de cultivo.
19.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la planta de cultivo es soja (Glycine max).
20.

El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la expresión del polinucleótido produce una molécula de ARN que suprime al menos un primer gen diana en un nematodo parásito de las plantas que se ha puesto en contacto con una porción de dicha planta de cultivo, en el que el gen diana realiza una función esencial en la replicación de ADN.
21.

El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el nematodo parásito de las plantas es un nematodo tilénquido, preferentemente el nematodo parásito de las plantas es Heterodera sp., lo más preferentemente el nematodo parásito de las plantas es Heterodera glycines.
22.

Un procedimiento de producción de alimento o pienso que comprende obtener una planta según la reivindicación 6 o una parte de la misma, y preparar alimento o pienso de la planta o parte de la misma.
23.

El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el alimento o pienso se define como aceite, comida, proteína, almidón, harina o forraje.
24.

Un procedimiento de modulación de la expresión de un gen diana en una célula de nematodo parásito de las plantas, comprendiendo el procedimiento:

(a) transformar una célula de planta con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARNbc de SEC ID Nº: 1920, operativamente ligado a un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, en el que dicho ARNbc inhibe la función del polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1920;

5 (b) cultivar la célula de planta transformada en condiciones suficientes para permitir el desarrollo de un cultivo de células de planta que comprende una pluralidad de células vegetales transformadas;

(c) seleccionar células vegetales transformadas que han integrado la secuencia de ácidos nucleicos en sus genomas;

(d) cribar las células vegetales transformadas para la expresión del ARNbc codificado por la secuencia de 10 ácidos nucleicos; y

(e) seleccionar una célula de planta que expresa el ARNbc.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, que comprende además regenerar una planta a partir de la célula de planta que expresa el ARNbc; por lo que la expresión del gen en la planta es suficiente para modular la expresión de un gen diana en una célula de nematodo parásito de las plantas que pone en contacto la planta o célula de planta

15 transformada.

Locus Descripción Inicio de huevo de N2 Inicio de L4 de N2 Resultado

control

actina adultos móviles, estériles P0-WT, poca progenie control positivo

control

GFP WT, >200 progenie WT, >200 progenie WT, >200 progenie WT, >200 progenie control negativo

R03E1.2 Y57E12AL.a

VACI WT, 20e WT,75e P0-WT, poca progenie P0-WT, camada red. Fenotipo, no P0 letal Fenotipo, no P0 letal

C34G6.6

PANI muertos, 0e adultos móviles, LVL P0 letal de inicio de huevo

F52B11.3

PAN2 muertos, 0e adultos móviles, LVL P0 letal de inicio de huevo

F54D11.1

MT P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA P0-WT, LVA Fenotipo, no P0 letal

T25C8.2

act-5 P0 muy enfermos, estériles P0 enfermos, estériles o algunos F1 todos LVA muertos, 0e P0-WT, LVL-LVA P0 enfermo, estéril o algunos F1 todos LVA P0 WT, F1 LVL/LVA P0 letal de inicio de huevo

Y57G11C.15

Proteína de transporte Sec61 muy enfermos, estériles muy enfermos, estériles, muertos adultos móviles, estériles RUP, muertos P0 letal de inicio de huevo y L4

C47E12.5

uba-1 muertos, 0e muertos, 0e P0-WT, LVL P0 WT, F1 LVL P0 letal de inicio de huevo

Y41E3.1**

WT WT reducción del 30 % de la camada WT WT WT Todavía sin efecto

Y57E12AL.6

Bag-o-worms+larvas P0 camada red., F1 enfermos LVA adultos móviles, Fl LVA adultos móviles, Fl LVA En progreso

C32E12.4

adultos móviles, estériles WT WT WT En progreso

Y48B6A.1*

WT WT WT WT WT WT Todavía sin efecto

Y48B6A.1*

En progreso

R07E4.6*

kin-2 Muy DPY, enfermos, estériles Muy DPY, estériles, muertos Muy DPY, estériles, muertos P0 DPY. camada red, F1 25% de DPY P0 DPY, camada red, F1 75% de DPY P0 DPY, camada red, F1 90% de DPY P0 letal / DPY de inicio de huevo y L4

K11D9.2a

sca-1 P0 WT, cámara red. – F1 LVA P0 estériles, crecimiento, enfermos P0 DPY, camada red., F1 LVA P0 móviles, huevos red., F1 LVA ¿P0 enfermo de inicio de huevo?

ZK20.3**

WT WT WT WT Todavía sin efecto

K07B1.7**

WT WT WT WT Todavía sin efecto

C38D4.6

P0WT.F1 LVL P0 WT, F1 LVL Fenotipo, no P0 letal

T02E1.5**

dhs-3 WT WT WT WT Todavía sin efecto

F17E9.5***

WT WT En progreso

C25D7.2***

WT WT En progreso

K06B4.1

WT WT En progreso

F08B1.1a

reducción del 85 % de la camada WT Fenotipo, no P0 letal

C34F11.6

WT WT En progreso

T14G10.5

En progreso

F28D9.8

por hacer por hacer En progreso

W09G12.7

En progreso

C37C3.2

por hacer por hacer En progreso

FIG. 2