ES2471367T3 - Implante bioactivo - Google Patents

Abstract

Un implante bioactivo para la regeneración miocárdica y el sostén de la cámara ventricular, que comprende: I. una membrana de armazón microporosa elastomérica que comprende al menos un polímero sintético no degradable, un polímero sintético parcialmente degradable, y biomateriales de nanofibra, teniendo dicha membrana una porosidad comprendida entre 70% y 90%, estando los poros interconectados y teniendo diámetros comprendidos entre 80 micrómetros y 150 micrómetros, en la que a. dicho polímero sintético no degradable se selecciona del grupo que consiste en poliacrilato de etilo y poliacrilato de etilo copolimerizado con un comonómero de acrilato de hidroxietilo al 10% en peso o al 20% en peso; y b. dicho polímero sintético parcialmente degradable se selecciona del grupo que consiste en éster 2- (metilacriloiloxi)etílico de caprolactona o en éster 2-(metilacriloiloxi)etílico de caprolactona copolimerizado con acrilato de etilo en proporciones en peso de este último comonómero comprendidas entre 30% y 80%, en la que el porcentaje de polímeros no degradables frente a polímeros degradables está comprendido entre 10% en peso y 90% en peso, y II. un armazón de hidrogel de nanofibras.

Description

Implante bioactivo

La presente invención se refiere generalmente al campo de la reparación mioc�rdica, más particularmente a un método y a un implante bioactivo para reparar el miocardio y sostener la configuración y función de la cámara ventricular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La insuficiencia cardíaca (HF) es una afección de las personas ancianas, y de este modo el “envejecimiento de la población” ampliamente reconocido contribuye a incrementar la incidencia de HF. La incidencia de HF se aproxima al 10 por 1000 de la población después de los 65 años de edad, y aproximadamente el 80% de los pacientes hospitalizados con HF tienen más de 65 años de edad.

La insuficiencia cardíaca es un problema de salud pública importante y en crecimiento en los países desarrollados. En los Estados Unidos de América, aproximadamente 7 millones de pacientes tienen HF, y más de 550000 pacientes son diagnosticados con HF por primera vez cada año. El trastorno es la razón principal para 12 a 15 millones de visitas a los consultorios, y 6,5 millones de días hospitalarios cada año.

La insuficiencia cardíaca es el grupo más habitual relacionado con el diagnóstico del seguro m�dico para personas mayores (es decir, diagnóstico de alta hospitalaria), y se gastan más dólares del seguro m�dico para personas mayores para el diagnóstico y tratamiento de HF que para cualquier otro diagnóstico.

En Europa, la epidemiología no es bien conocida; se estima que alrededor de 30 millones de pacientes sufren insuficiencia cardíaca.

El transplante de células y la manipulación tisular mediante ingeniería al corazón enfermo surgen como estrategias prometedoras para prevenir o tratar insuficiencia cardíaca resistente al tratamiento que no se puede tratar satisfactoriamente mediante terapias convencionales. Los avances en biología celular, en manipulación biológica mediante ingeniería, y las nanotecnolog�as dan avances adicionales en esta opción. La implantación de células ex�genas sostenidas por armazones en el tejido cicatrizal mioc�rdico para sustituir las células dañadas o inhábiles es un enfoque terapéutico seguro y eficiente.

Nicho beneficioso para las células madre y migración e implantación celular

Tras el infarto de miocardio, los cambios no sólo afectan al elemento contráctil del miocardio (cardiomiocitos) sino también a la matriz extracelular. El porcentaje de col�geno tipo I disminuye de 80% a 40%, y este col�geno es responsable con los otros elementos del músculo cardíaco de la geometría ventricular normal.

La eficiencia de la terapia celular para aumentar la recuperación tras isquemia mioc�rdica depende del reclutamiento suficiente de células aplicadas al tejido diana. La migración e implantación en sitios de neovascularizaci�n activa es un proceso complejo que depende de la interacción orquestada en el tiempo y en el espacio entre quimiocinas (por ejemplo SDF-1), receptores de quimiocinas, se�alizaci�n intracelular, moléculas de adhesión (selectinas e integrinas) y proteasas.

Hasta ahora, el transplante celular para el sostén y regeneración cardíacos estaba limitado a efectos pobres en la función ventricular. Esto puede ser debido a la falta de uniones de salto entre el miocardio nativo y las células injertadas. También, el transplante celular parece estar limitado por la relocalización de células transplantadas para eliminar órganos y miocardio no infartado, y por la muerte de células transplantadas. La mayoría de la muerte celular se produce en los primeros pocos días tras el transplante, probablemente de una combinación de isquemia, apoptosis e inflamación. La apoptosis puede ser inducida por células dependientes del anclaje que se despegan de la matriz extracelular circundante.

El nicho beneficioso celular, un entorno especializado que rodea las células madre, proporciona un sostén crucial necesario para el mantenimiento de la célula. La función del nicho beneficioso comprometida puede conducir a la selección de células madre que ya no dependen de factores autorrenovables producidos por su entorno. Se han desarrollado estrategias para mejorar la supervivencia y diferenciación celulares, tales como la manipulación de tejidos mediante ingeniería genética.

Manipulaci�n de tejidos cardíacos mediante ingeniería

La remodelación de la matriz extracelular en insuficiencia cardíaca (degradación excesiva de la matriz y fibrosis mioc�rdica) contribuye a la dilatación del LV y a la disfunción cardíaca progresiva. La manipulación del tejido mioc�rdico mediante ingeniería debería proporcionar soporte estructural al corazón, armazones específicos deberían ayudar a normalizar el esfuerzo de la pared cardíaca en regiones lesionadas, mejorando la distribución de la tensión. Los materiales de la manipulación mediante ingeniería que requieren propiedades específicas de rigidez y resistencia a la deformación se pueden implantar o sembrar en el tejido mioc�rdico. Est�n compuestos de una estructura natural o sintética capaz de soportar formación de tejido tridimensional. La supervivencia e injerto de

c�lulas en el entorno del miocardio isqu�mico representa un reto para todos los tipos de células, independientemente de su estado de diferenciación. Las características de los armazones son críticas para recapitular el medio in vivo y permitir a las células que influyan sobre sus propios microentornos. Tales armazones sirven para al menos uno de los siguientes fines: permiten la unión y migración de las células, el suministro y

5 retención de células y factores bioquímicos, permiten la difusión de nutrientes celulares vitales y productos expresados, y ejercen ciertas influencias mecánicas y biológicas para modificar el comportamiento de la fase celular. Además, el desarrollo de uniones de salto dentro del nuevo tejido creado, as� como con el tejido mioc�rdico hospedante, son de gran interés funcional.

Terapias de restricción ventricular

10 Los pacientes con insuficiencia cardíaca desarrollan corazones sobredimensionados, dilatados, debido a mayores presiones de llenado. Con el tiempo, la carga de trabajo mayor del corazón puede conducir a un cambio denominado remodelación, que es el agrandamiento y adelgazamiento de los ventrículos. El músculo cardíaco que falla necesita ser sostenido para disminuir el esfuerzo de la pared ventricular. Se han usado dispositivos de envoltura de malla, que se implantan alrededor del corazón. Estos dispositivos est�n destinados a prevenir o invertir la progresión de la

15 insuficiencia cardíaca al mejorar la estructura y función del corazón, conduciendo a mejoras en la supervivencia y calidad de la vida del paciente. Por ejemplo, se han ensayado dispositivos implantables para la terapia de restricción ventricular, como un saco en forma de malla de poli�ster diseñado para la colocación alrededor del corazón, fabricado en un tricotado de malla de múltiples filamentos (dispositivo CorCap, Acorn). También se investigó una malla de nitinol para la envoltura ventricular (dispositivo HeartNet, Paracor). La experiencia de implantación

20 permanente de ambos dispositivos mostr� efectos adversos como la restricción en la función diast�lica y a falta de mejora de la función sistólica, sin signos de curación mioc�rdica. Estos resultados han limitado su gran aplicación clónica, incluyendo la decisión de la U.S. Food and Drug Administration (FDA) de “no aprobarlos”.

Investigaci�n traduccional

Se han llevado a cabo estudios experimentales y cl�nicos sobre terapia de células madre y enfoques de

25 manipulación de tejidos mediante ingeniería para el sostén y regeneración mioc�rdicos. Los resultados de estas investigaciones tienden a demostrar el interés de la terapia de células madre intrainfarto simultánea con la fijación de matrices sembradas de células en el epicardio de ventrículos infartados.

El documento WO2006/036826 describe un armazón para sustituir porciones del músculo cardíaco, que comprende un armazón microporoso que comprende un material biocompatible y un hidrogel nanofibroso formado por p�ptidos

30 autoensambladores. El armazón microporoso puede consistir en un pol�mero biodegradable o en un pol�mero no degradable. Los poros del armazón microporoso est�n llenos del hidrogel. El armazón puede comprender además marcadores radioopacos, células, factores de crecimiento, y otros compuestos bioactivos.

Los estudios experimentales sugieren que la inyección intramioc�rdica aut�loga simultánea de células madre y la fijación de una matriz de col�geno sembrada de células sobre el epicardio es factible. Sin embargo, la eficacia a

35 largo plazo de este enfoque se ve comprometida por la biodegradaci�n completa de la matriz de col�geno injertada.

En resumen, se encontraron los siguientes problemas en el campo de la reparación mioc�rdica.

1) Es difícil de reparar una gran cicatriz mioc�rdica.

2) La biorretenci�n celular y el injerto en el tejido cicatrizal es demasiado baja.

3) La mortalidad de las células implantadas en el miocardio isqu�mico es elevada.

40 4) La remodelación de la matriz extracelular en cardiopat�a isqu�mica (degradación excesiva de la matriz y fibrosis mioc�rdica) contribuye a la dilatación del LV y a la disfunción cardíaca progresiva.

5) La limitación terapéutica de la dilatación cardíaca y la recuperación de la forma elíptica nativa de las cámaras ventriculares son factores de pronóstico claves para la supervivencia en pacientes con HF.

6) En el transplante celular, la supervivencia y el injerto en el entorno del miocardio isqu�mico representa un 45 reto para todos los tipos de células, independientemente de su estado de diferenciación.

7) Hasta ahora, la combinación óptima célula-matriz para la restauración robusta y sostenida del miocardio no se ha identificado.

8) La eficacia a largo plazo del enfoque – inyección intramioc�rdica aut�loga de células madre y fijación de una matriz de col�geno sembrada con células en el epicardio – se ve comprometida por la biodegradaci�n

50 completa de la matriz de col�geno injertada.

9) Hay efectos indeseados de la administración de factores de crecimiento.

10) Viabilidad/evolución tisular con el tiempo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un implante bioactivo para reparar el miocardio y sostener la configuración y función de la cámara ventricular, y un método para preparar tal implante. El implante bioactivo se injerta sobre y/o en la pared ventricular para la regeneración mioc�rdica, para el sostén ventricular izquierdo o derecho, y para restaurar la forma elíptica de las cámaras ventriculares.

Los armazones se crean mediante la combinación de materiales biodegradables (biológicos o sintéticos) con materiales sintéticos no biodegradables (bioestables). Durante el procedimiento, se pueden sembrar células, por ejemplo células madre, en esta forma de molde, e inmediatamente o posteriormente se pueden injertar en el tejido mioc�rdico enfermo.

El método de la invención comprende las etapas de crear un armazón combinando materiales biodegradables con materiales no biodegradables, obtener células aut�logas o células de un donante, implantar las células en la matriz, e injertar los armazones celulares compuestos en el corazón.

El implante y método de la presente invención procura mejorar la función ventricular, limitar la dilatación crónica de las cámaras ventriculares, y restaurar la forma elíptica nativa del corazón como una nueva modalidad en el tratamiento de insuficiencia cardíaca.

Las ventajas de los objetos de la presente invención son las siguientes:

a) El transplante de células madre induce angiog�nesis y/o miog�nesis mioc�rdica, mejorando la viabilidad mioc�rdica y reduciendo la fibrosis cicatrizal.

b) El injerto de armazones de la matriz mejora el nicho de las células madre y la migración e implantación celular, incrementando consiguientemente el grosor de la cicatriz del infarto con tejidos viables. Este material compuesto ayuda a normalizar el esfuerzo de la pared cardíaca en regiones lesionadas. Además, la formación de nuevos vasos desde el epicardio y desde el miocardio bien irrigado circundante contribuye a la reducción de la fibrosis y al tamaño de las cicatrices del infarto, induciendo la regeneración de células que se contraen y de la matriz de col�geno extracelular.

c) El material de soporte cardíaco sintético sobre el corazón proporciona un impacto beneficioso a largo plazo sobre el tamaño y forma de la cámara ventricular, reduciendo tensión y promoviendo la limitación de la remodelación adversa. Además, este material ayuda a normalizar el esfuerzo de la pared cardíaca en regiones lesionadas, mejorando la distribución de la tensión, evitando discinesia cicatrizal, y el riesgo de formación de aneurismas ventriculares, ruptura de la pared ventricular e insuficiencia de la válvula mitral.

d) Envoltura ventricular adaptada. Los implantes bioactivos de la presente invención est�n diseñados para el sostén y regeneración ventricular izquierdo y/o ventricular derecho, incluyendo diferentes tamaños para envolturas ventriculares parciales o completas. Las características del implante (mecánicas, físicas, químicas, biológicas) se adaptan para la geometría, fisiología y patología del ventrículo izquierdo o del derecho.

e) Mantenimiento y supervivencia de las células implantadas in situ. La preparación y mantenimiento de la población celular de los implantes bioactivos se obtiene mediante terapia celular cardíaca antes, durante o después de injertar “implantes bioactivos” en el corazón. El transplante celular se lleva a cabo usando enfoques a base de catéter vía el endocardio (endoventricular), vía un procedimiento intravascular (a través de las arterias o venas coronarias), o inyectando las células a través del epicardio durante cirugía cardiotor�cica, toracoscop�a o procedimientos asistidos por computador-robótica. Adicionalmente, se usa una tensión reducida de oxígeno (por ejemplo, 5% a 15%) durante el crecimiento celular como un procedimiento de preacondicionamiento para mejorar la supervivencia mejorar tras el implante del parche en miocardio isqu�mico.

f) Prevención de la dilatación del LV y disfunción cardíaca progresiva. Según un aspecto de la invención, todo el órgano est� contenido con la membrana elastom�rica del implante bioactivo para evitar la dilatación cardíaca. De este modo, con una menor tensión de la pared ventricular, el tratamiento complementario de injertar tejido biológico (por ejemplo p�ptidos y células madre) puede lograr con éxito la regeneración mioc�rdica. Adicionalmente, se pueden usar electrodos de estimulaci�n en el método de la invención, y también se pueden incorporar en los implantes bioactivos y el miocardio nativo para la electroestimulaci�n simultánea del tejido implantado, y otros tratamientos electrofisiol�gicos (desfibrilaci�n, resincronizaci�n, etc.).

g) Tratamiento regenerativo en asociación con implantes en vista de la supervivencia e injerto. Los tratamientos regenerativos mioc�rdicos a base de células pueden estar asociados, es decir, transplante de células madre intramioc�rdicas e intrainfarto, con el implante de implantes bioactivos en el corazón. Método asociado para sembrar o implantar células madre en o sobre los implantes bioactivos usando los siguientes métodos: mecánico (agitaci�n, centrifugaci�n), químico (electroforesis), físico (electroporaci�n), etc. Células sembradas o implantadas que pueden ser angiog�nicas, cardiomiog�nicas o pluripotentes. Adicionalmente, los implantes bioactivos se pueden marcar con productos (colorantes, microesferas, radiois�topos, partículas

de hierro, etc.) para la evaluación de la biodegradaci�n, integración, proliferaci�n, diferenciación y función, usando métodos radiol�gicos, de ultrasonidos-ecocardiogr�ficos, radioisot�picos, metabólicos (PET), RMI, barrido de CT y de bioluminiscencia-fluorescencia (etc.).

h) Composición ajustada de los implantes bioactivos. La composición de los implantes bioactivos tiene un porcentaje de componentes no biodegradables (sintéticos) frente a componentes biodegradables (biológicos

o sintéticos), que oscila de 10% a 90%.

i) Para obviar el efecto sist�mico indeseado de factores de crecimiento, el material sintético se diseña para liberar localmente factores angiog�nicos tales como VEGF, HBEGF, bFGF. Adicionalmente, según una realización de la presente invención, los implantes bioactivos est�n dotados con un sistema para la liberación controlada de factores angiog�nicos y antiapopt�ticos.

j) Evaluación del crecimiento tisular y viabilidad. Se incorporan electrodos sensores en los implantes bioactivos y se conectan a un dispositivo de medida de la impedancia bioel�ctrica. El objeto de este monitor implantable es evaluar mediante telemetría la evolución del tejido manipulado mediante ingeniería en la regeneración cardíaca, y detectar edema pulmonar prematuro en pacientes con insuficiencia cardíaca.

DEFINICIONES

Una membrana es un material que tiene una de sus tres dimensiones (su grosor) mucho más pequeño que sus otras dos dimensiones (su longitud y anchura), siendo estas últimas comparables en magnitud. Un elast�mero es un material macromolecular reticulado que, en las condiciones de trabajo, est� por encima de su temperatura de transición vítrea, y de este modo es capaz de recuperar fácilmente sus dimensiones no estresadas originales tras el cese de la carga mecánica que no exceda un valor crítico. Una membrana elastom�rica es una membrana hecha de un elast�mero. Un gel, o hidrogel, es, para los fines del presente documento, un material macromolecular, mediante el cual las interacciones de reticulación física o química producen un componente a base de macromoléculas, capaz de retener grandes cantidades de moléculas de agua. Una membrana elastom�rica microporosa es una membrana elastom�rica en la que el elast�mero configura un sistema de espacios vacíos interconectados, los poros, por todo el grueso de la membrana, teniendo los poros dimensiones lineales en el intervalo de varias decenas a unos pocos cientos de micrómetros. Dichas células hospedantes de los poros, y la matriz extracelular producida por ellos, configurando un entorno tridimensional capaz de transportar estímulos mecánicos a las células y para facilitar interacciones célula a célula tridimensionales. Los poros de la membrana elastom�rica microporosa también pueden estar llenos de un gel. Un pol�mero es una macromolécula que consiste en la repetición de unas pocas unidades diferentes (si una, un homopol�mero; si más de una, un copol�mero). Un pol�mero sintético es un pol�mero no presente de forma natural en el sistema biológico. Un pol�mero bioestable o no degradable es un pol�mero que permanece químicamente inalterado in vivo. Un pol�mero sintético degradable es un pol�mero sintético que sufre in vivo reacciones de despolimerizaci�n (escisión), cuyos productos pueden ser tóxicos o no tóxicos, que pueden ser metabolizados o no metabolizados por los tejidos u órganos del hospedante. Un pol�mero parcialmente degradable es un pol�mero compuesto de fragmentos de moléculas bioestables y biodegradables. Un p�ptido autoensamblador es una clase de p�ptidos con propiedades autocomplementarias capaces de sufrir espontáneamente una transición de fase desde un estado de sol desordenado hasta un estado más ordenado, en el que el estado ordenado final consiste en estructuras semejantes a cristales o un material amorfo colapsado. Dicha transición es accionada por parámetros medioambientales tales como el umbral de pH o pK, la temperatura, etc. Un gel de p�ptido autoensamblador es el ensamblaje espontáneo de p�ptidos autocomplementarios que se desarrollan en cadena o dominios ordenados con formas y dimensiones alargados en el intervalo de unos pocos a decenas de nanometros, y de este modo se denomina nanofibras.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un implante bioactivo para la regeneración mioc�rdica y el sostén cardíaco. El implante comprende I. una membrana (parche) de armazón microporosa elastom�rica que comprende al menos un pol�mero sintético no degradable (a), un pol�mero sintético parcialmente degradable (b) y biomateriales de dimensiones de fibras nanoporosas o de nanoescala, y II. un hidrogel de nanofibra de p�ptido. La porosidad de dicha membrana est� comprendida entre 70% y 90%, estando dichos poros interconectados, y teniendo diámetros preferidos comprendidos entre 80 micrómetros y 150 micrómetros.

M�s específicamente, el pol�mero sintético no degradable o bioestable (a) se selecciona del grupo que consiste en polietilacrilato o polietilacrilato copolimerizado con un comon�mero de hidroxietilacrilato del 10% en peso o 20% en peso. Este pol�mero se produce ventajosamente mediante el método de lixiviaci�n del molde, usando como molde una disposición de esferas sinterizadas y/o tejidos de fibras. El pol�mero sintético parcialmente degradable (b) se selecciona del grupo que consiste en éster 2-(metacriloiloxi)etílico de caprolactona o éster 2-(metacriloiloxi)etílico de caprolactona copolimerizado con etilacrilato, en proporciones en peso de este último comon�mero comprendidas entre 30 y 80%. Este pol�mero se produce ventajosamente mediante el método de lixiviaci�n del molde, usando como molde una disposición de esferas sinterizadas y/o tejidos de fibras. El porcentaje de pol�meros no degradables frente a pol�meros degradables est� comprendido entre 10 y 90% en peso; preferiblemente est� comprendido entre 10 y 48% en peso.

En una realización preferida, el hidrogel de nanofibra puede ser degradable, biológica o químicamente, o no degradable, e incluye ventajosamente moléculas naturales matrices derivadas de tales como proteína, p�ptido, oligosac�rido, polisac�rido, o proteoglicano tales como col�genos, fibrinas, alginatos, quitosanos, ácido hialur�nico, y/o cualquier molécula sintética que se desarrollar� en una red de nanofibras con propiedades de gel/hidrogel, tal como un armazón de hidrogel de nanofibras pept�dico; una clase de p�ptidos anfif�licos autocomplementarios autoensambladores en nanofibras ilustra tales p�ptidos. El siguiente p�ptido AcN-RADARADARADARADA-COONH2 comercialmente disponible es un ejemplo de esta clase de p�ptidos.

En una realización preferida, el gel/hidrogel de fibras nanoporoso o de nanoescala llena completamente los poros de la membrana elastom�rica, llena parcialmente los poros formando un recubrimiento de capa para las superficies internas de los poros de la membrana.

En un aspecto específico de la invención, el pol�mero sintético bioestable no degradable se trata en la superficie para injertar moléculas de adhesión tales como p�ptidos funcionales como p�ptidos RGD (Arg-Gly-Asp), azúcares o lípidos funcionales, y proteínas tales como laminina o fragmentos de laminina.

El implante bioactivo de la invención se diseña para presentar propiedades mecánicas para que sean suficientemente elásticas para corresponderse a la actividad de contracción/distracción del miocardio para permitir una biointegraci�n estructural y funcional profunda.

El implante de la invención tiene una membrana elastom�rica que contiene todo el órgano, para prevenir la dilatación cardíaca (es decir, una menor tensión de la pared ventricular).

El implante bioactivo en un aspecto particular de la invención comprende adicionalmente un sistema para la liberación o absorbancia controlada de moléculas activas tales como cualquier molécula orgánica (pequeña molécula, p�ptido, lípido, azúcar, proteína, proteoglicano) con actividad angiog�nica, antiangiog�nica, prorregenerativa, antirregenerativa, apopt�tica, necr�tica, antiapopt�tica y antinecr�tica, tal como VEGF, IL-6, IL-10, IGF-1, FGF-2.

El sistema de liberación o absorbancia puede consistir en:

(a)

la molécula encapsulada en micropart�culas degradables hechas de pol�meros tales como quitosano, ácido hialur�nico, complejos de estos dos últimos pol�meros, o un poli�ster degradable, tal como poli�cido glic�lico, poli�cido l�ctico, o policaprolactona; llenando o recubriendo dichas micropart�culas embebidas en el gel los poros de la membrana;

(b)

la molécula incluida en el gel que llena o recubre los poros de la membrana asociados específica o no específicamente con la estructura del material de llenado de gel;

(c)

la molécula enlazada covalentemente o no covalentemente al p�ptido autoensamblador que llena o recubre los poros de la membrana;

(d)

la molécula con capacidad de absorbancia para eliminar cualquier molécula orgánica con actividad antiangiog�nica, antirregenerativa, apopt�tica, necr�tica.

En otro aspecto, el implante bioactivo de la invención, comprende adicionalmente citocinas y p�ptidos antiapopt�ticos angiog�nicos.

Tiene capacidad de unión de componentes segregados por el tejido necr�tico. En consecuencia, tiene la capacidad para modular y neutralizar el efecto de componentes tales como midquina (MDK), un regulador negativo de la angiog�nesis.

El implante de la invención se puede funcionalizar con motivos activos biológicos (p�ptidos y glucop�ptidos) para promover respuestas celulares, en particular instrucción mioc�rdica para mantener fenotipo, permitir el contacto célula con célula, y establecer uniones de salto.

El implante bioactivo de la invención se puede diseñar para restaurar la forma elíptica o c�nica del corazón, en el cual ambos ventrículos est�n completamente envueltos por el dispositivo. La estructura de este dispositivo consiste en refuerzos especiales a nivel de las bandas anatómicas, formando dos bucles helicoidales de “pol�meros sintéticos bioestables no degradables” para la restauración de la forma c�nica. La enfermedad geométrica en cardiomiopat�a dilatada isqu�mica es la cámara esférica, que es diferente de la forma del corazón normal elíptica o c�nica.

El implante bioactivo de la presente invención puede comprende adicionalmente células.

Las células pueden ser células miog�nicas o cardiomiog�nicas. Según esta realización, las células se seleccionan del grupo que consiste en mioblastos esquel�ticos, células del músculo liso, cardiomiocitos fetales y neonatales, cardiomiocitos ventriculares adultos, cardiosferas y progenitores epic�rdicos.

Las células, como alternativa, pueden ser células angiog�nicas, tales como la fracción mononuclear de médula ósea

y sangre periférica, progenitores endoteliales de médula ósea y sangre periférica, células endoteliales, células mesoteliales del omento, células madre derivadas de adipocitos, células madre de tejido epic�rdico adiposo, y células estr�micas de sangre menstrual multipotentes.

Las células también pueden ser células madre pluripotentes. En esta realización, las células se seleccionan del grupo que consiste en células embri�nicas, células madre fetales, células del cordón umbilical, células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), células madre mesenquimatosas de la médula ósea (MSCs), células madre pluripotentes de testículos de adulto, y células madre de fluido amni�tico de ser humano (hAFSCs). A este respecto, el implante bioactivo se diseña para hospedar células educadas o entrenadas que se espera que crezcan, se multipliquen, se diferencien y se organicen en una fibra de nanoescala dentro de la estructura microporosa del parche, y que se conecten con el miocardio nativo. La combinación del elemento del implante bioactivo junto con las células es tal que presenta una tensión de la pared ventricular reducida, y puede lograr con éxito la regeneración mioc�rdica.

Las fuentes adecuadas de células para la siembra del implante bioactivo y la inyección intrainfarto dependerán de los tipos de enfermedades a tratar. Para infarto de miocardio reciente, ser�n deseables células angiog�nicas que reduzcan la necrosis mioc�rdica y aumenten el flujo sanguíneo vascular. Para insuficiencia cardíaca crónica, ser�n útiles células que sustituyan o promuevan la miog�nesis, inviertan mecanismos apopt�ticos inversos, y reactiven procesos celulares durmientes. Para cardiomiopat�a isqu�mica crónica, se asociarán células tanto angiog�nicas como cardiomiog�nicas.

Seg�n la presente invención, es posible embeber células en una estructura tridimensional que replica la matriz extracelular, lo que es crucial para la restauración tisular completa y la prevención de la remodelación ventricular. La traducción clónica de la terapia celular requiere evitar fármacos y citocinas potencialmente dañinos, y la rápida disponibilidad de células en las estanterías. La combinación de células prediferenciadas en un armazón funcionalizado, que libera localmente moléculas personalizadas para promover la terminación in situ de la diferenciación y mejorar la migración e implantación, supervivencia, y funciones, evita los efectos sist�micos indeseados potenciales de la administración de factores de crecimiento, y mejora la restauración tisular.

Las células sembradas en el armazón de la matriz y sostenidas por un dispositivo de sostén ventricular sintético tratadas con moléculas de adhesión mejoran la recuperación funcional de corazones infartados y mejoran la evolución a largo plazo al proporcionar regeneración mioc�rdica y un sostén no agresivo.

La combinación de célula-matriz asociada con un material no absorbible de restricción ventricular (envoltura cardíaca de malla), situada sobre el miocardio enfermo, mejora la función ventricular y reduce la remodelación adversa de la cámara.

La presente invención combina un enfoque biológico regenerativo con un dispositivo de sostén cardíaco prost�tico. Las células madre asociadas con un armazón de matriz manipulado tisularmente y combinadas con una envoltura cardíaca de malla deberían reducir fibrosis post-isqu�mica y ayudar a la recuperación de la viabilidad y cumplimiento mioc�rdico. Este procedimiento se puede proponer para el tratamiento de cardiomiopat�a isqu�mica, asociando un enfoque biológico regenerativo con un dispositivo de sostén prost�tico.

La presente invención constituye una plataforma única para manipular mediante ingeniería tejidos contráctiles muy eficientes y potenciar la terapia celular.

Para la presente invención, las células se pueden obtener de cualquier fuente adecuada. Se pueden aislar de una fuente adecuada mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden cultivar según métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden añadir al medio de cultivo, el cual puede comprender adicionalmente factores de crecimiento, suero, antibióticos, o cualquiera de una variedad de componentes de cultivo celular conocidos por los expertos en la técnica.

La cardiomiopat�a isqu�mica induce alteración geométrica de la cavidad ventricular, que cambia desde una forma elíptica hasta una forma esférica. La enfermedad geométrica en cardiomiopat�a dilatada isqu�mica es la cámara esférica, que es diferente de la forma elíptica o c�nica normal del corazón. El índice de esfericidad cuantifica esta alteración de la forma geométrica al comparar el eje ventricular transversal (corto) y el eje largo; una elipse tiene una relación de 0,5 (la longitud es el doble de la anchura), y la esfera es 1,0 debido a dimensiones transversales y longitudinales similares.

Seg�n una realización de la invención, la estructura del implante bioactivo de la presente invención consiste en refuerzos especiales a nivel de las bandas anatómicas, que forman dos bucles helicoidales de pol�meros sintéticos no degradables bioestables. Esta realización de la presente invención pretende cubrir ambos ventrículos para cardiomiopat�a dilatada isqu�mica. Las bandas artificiales ventriculares helicoidales para la restauración de la forma elíptica del LV usando implantes bioactivos son útiles en el contexto de las estrategias bioquir�rgicas indicadas para manejar pacientes con enfermedades mioc�rdicas avanzadas. Una ventaja importante de esta técnica es el hecho de que la cirugía se lleva a cabo sin el riesgo de abrir las cámaras ventriculares, es decir, sin circulación extracorp�rea.

En otro aspecto, la presente invención trata de un método para preparar el implante bioactivo de la invención, que comprende las siguientes etapas de llenar una membrana de armazón microporosa elastom�rica con un armazón de hidrogel de nanofibra de p�ptido, para obtener un constructo bioactivo; el llenado se realiza, por ejemplo, colocando la membrana en una jeringuilla llena del gel y evacuando suavemente el aire en los poros; después, dicho constructo se cultiva en condiciones mecánicas biof�sicas (es decir, compresión y alargamiento).

En un aspecto adicional, el método descrito anteriormente comprende además una etapa de sembrar o implantar células sobre o en dicho constructo bioactivo usando los siguientes métodos: mecánico (agitaci�n, centrifugaci�n), químico (electroforesis), físico (electroporaci�n). Las células que se pueden usar son células madre miog�nicas, cardiomiog�nicas, angiog�nicas o pluripotentes.

Otro método para preparar el implante bioactivo de la invención comprende las etapas de obtener células madre miog�nicas, cardiomiog�nicas, angiog�nicas o pluripotentes, cultivar dichas células in vitro; mezclar dichas células con un armazón de hidrogel de nanofibra de p�ptido; llenar una membrana de armazón microporosa elastom�rica con dicho armazón de hidrogel de nanofibra de p�ptido, para obtener un constructo bioactivo; y cultivar dicho constructo bioactivo bajo electroestimulaci�n local in vitro.

En un aspecto específico del método, las células se cultivan bajo tensión de oxígeno reducida.

En todavía un aspecto específico de dicho método, el implante bioactivo se cultiva para adaptarlo al sostén y regeneración ventricular izquierdo y/o ventricular derecho, para envolturas ventriculares parciales completas.

La presente invención también se refiere a un método para reparar el miocardio de un individuo, que comprende las etapas de preparar un implante bioactivo según la invención e implantar el implante bioactivo en y/o sobre el miocardio.

En un aspecto más específico, el método para reparar el miocardio comprende una etapa adicional que consiste en inyectar células a través del epicardio durante cirugía cardiotor�cica, toracoscopia o procedimientos asistidos por ordenador-robótica. Las células inyectadas pueden ser células madre aut�logas, cultivadas en condiciones hip�xicas.

Ejemplo 1: Evaluación biológica de membranas de armazón elastom�ricas. Cuantificación de la proliferaci�n celular

Ensayo de MTT

El sistema de MTT es un medio simple, exacto, reproducible de medir la actividad de células vivas vía actividad de deshidrogenasa mitocondrial. El componente clave es bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio o MTT. Las disoluciones de MTT solubilizadas en medios de cultivo tisular o en disoluciones salinas balanceadas, sin rojo fenol, tienen un color amarillento. Las deshidrogenasas mitocondriales de células viables escinden el anillo de tetrazolio, produciendo cristales de MTT formazano de color violeta, que son insolubles en disoluciones acuosas. Los cristales se pueden disolver en isopropanol acidificado. La disolución violeta resultante se mide espectrofotom�tricamente. Un incremento en el número de células da como resultado un incremento en la cantidad de MTT formazano formada, y un incremento en la absorbancia.

Material y método

Se emplearon trozos de membranas porosas de poliacrilato de etilo (PEA100 en lo sucesivo) y un copol�mero de acrilato de etilo y acrilato de hidroxietilo con una relación música de 90:10 de ambos mon�meros (en lo sucesivo PEA90). Las membranas se cortaron en trozos de dimensiones 25 mm x 25 mm, con un grosor aproximado de 1,0 mm (PEA100 y PEA90A) y de 0,7 mm (PEA90B). Los poros de las membranas consistieron en capas de familias ortogonales de canales cilíndricos paralelos, con un diámetro del canal de 150 micrómetros y una separación de los canales de 300 micrómetros. Se generaron dejando que los precursores de los pol�meros reaccionasen dentro de un molde de la estructura porosa, y disolviendo después el molde.

Protocolo de acondicionamiento de los armazones

Debido tanto a su naturaleza hidrófoba como a su estructura microporosa, los armazones elastom�ricos necesitan ser prehidratados antes de la siembra de las células. El procedimiento de acondicionamiento consiste en una inmersión durante 24 h en una disolución de PBS. Puede ser necesario el vacío para mejorar la penetraci�n del fluido en los poros, colocando la muestra en un tubo cerrado herméticamente con una tapa agujereada por la aguja de una jeringuilla, y realizando vacío con la jeringuilla. La muestra prehidratada se sumerge entonces en el medio de cultivo. Si el pH cambia, el medio se renueva hasta que el valor del pH de referencia permanece estable.

Siembra de las células

Se aislaron células madre mesenquimatosas de médula ósea (BMC) en condiciones estériles de los huesos del fémur y de la tibia de ratas Wistar. Después de 2 semanas de cultivos in vitro en medio completo DMEM con Lglutamina, piruvato sádico y 15% de suero fetal bovino (1� pasada) se sembraron 10.000 células, diluidas en 0,5 ml

de medio, en los armazones de PEA90 y PEA100 y en matriz de col�geno tridimensional tipo I (n=5 para cada muestra). Después de la siembra cuidadosa de las células usando una micropipeta, los armazones elastom�ricos y la matriz de col�geno se mantuvieron 20 minutos sin movimiento, para comenzar la adhesión celular. En la siguiente etapa, y a fin de promover una distribución regular de BMC en los poros de la matriz, se agitaron continuamente durante 10 minutos a 80 g placas de Petri que contienen los armazones/matrices elastom�ricos y de col�geno, usando un agitador Orbital (Stuart Scientific, Stone, Staffordshire, UK). Después, los armazones sembrados con las células se incubaron una hora a 37�C. Finalmente, se a�adi� medio completo DMEM a la cápsula de Petri, y los armazones/matriz sembrados con las células se cultivaron durante 3 semanas a 37�C, 5% de CO2.

Cuantificaci�n de la propagación celular

Los cultivos se retiraron de la incubadora a una campana de flujo laminar. El sobrenadante se elimin�, y después los armazones se lavaron con PBS dos veces. Los armazones se transfirieron a nuevos tubos (Falcon de 15 ml). Se a�adi� as�pticamente la disolución de MTT en una cantidad igual a 10% del volumen de cultivo (1800 microlitros de medio libre de rojo fenol + 180 microlitros de MTT), y los cultivos se incubaron durante 3 horas a 37�C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se añadieron dos ml de disolución o disolvente de solubilizaci�n, y después se sometió a v�rtice durante 5 min. Esto provocó la liberación desde el armazón del MTT, que fue reducido activamente por células viables, adquiriendo una coloración amarilla. Cada muestra se centrifug� a 15.000 g durante 5 min., y el sobrenadante se leyó a 570 nm usando un espectrofotómetro de múltiples pocillos.

Resultados

Las evaluaciones espectrofotom�tricas mostraron valores de densidad óptica (OD) de 0,13 +/-0,02 para la matriz de col�geno; 0,22 +/-0,04 para los armazones de PEA90A; 0,11 +/-0,03 para los armazones de PEA90B; y 0,34 +/0,05 para los armazones de PEA100.

Estos resultados mostraron que la proliferaci�n celular estaba bien desarrollada en los armazones elastom�ricos, presentando una mejor proliferaci�n que los armazones de col�geno tridimensional. Hasta ahora, los armazones de col�geno se han usado en manipulación de tejido mioc�rdico experimental y cl�nico como un patrón oro.

EJEMPLO 2: Evaluación electrofisiol�gica de las membranas de armazón elastom�ricas

Medidas de la impedancia eléctrica

Conducci�n eléctrica

La impedancia eléctrica mioc�rdica ha demostrado ser un indicador eficaz de las características del tejido mioc�rdico y de la interfaz del tejido con el electrodo. Se han demostrado modificaciones significativas durante la isquemia tisular.

La resistividad eléctrica (también conocida como resistencia eléctrica específica o resistividad volumétrica) es una medida de cuán fuertemente se opone un material al paso de la corriente eléctrica. Una baja resistividad indica un material que permite fácilmente el movimiento de carga eléctrica. La unidad en el SI de la resistividad eléctrica es el ohmio [!].

Materiales y métodos

Se emplearon trozos de membranas porosas de poliacrilato de etilo (PEA100 en lo sucesivo) y un copol�mero de acrilato de etilo y acrilato de hidroxietilo con una relación música de 90:10 de ambos mon�meros (en lo sucesivo PEA90). Las membranas se cortaron en trozos de dimensiones 25 mm x 25 mm, con un grosor aproximado de 1,0 mm (PEA100 y PEA90A) y de 0,7 mm (PEA90B). Los poros de las membranas consistieron en capas de familias ortogonales de canales cilíndricos paralelos, con un diámetro de los canales de 150 micrómetros y una separación de los canales de 300 micrómetros. Se generaron dejando que los precursores de los pol�meros reaccionasen dentro de un molde de la estructura porosa, y disolviendo después el molde.

Prehidrataci�n de los armazones

Los armazones elastom�ricos necesitan 2 días de prehidrataci�n según lo siguiente: inmersión durante 24 h en una disolución de PBS e inmersión durante 24 h en medio de cultivo. El vacío podría ser necesario para mejorar la hidratación tisular, colocando la muestra en un tubo con una tapa y realizando vacío con una jeringuilla. Una vez que se observa cambio de pH, las muestras deberían estar toda la noche en medio de cultivo reciente.

Estudios electrofisiol�gicos

Dos electrodos que tienen agujas curvas para una inserción fácil se suturaron en los bordes opuestos de los armazones elastom�ricos y de una matriz de col�geno tridimensional tipo I (n = 5 para cada muestra). Estos electrodos se concibieron para ser implantados para estimulaci�n cardíaca postoperatoria temporal en cirugía cardíaca. Los armazones y los electrodos implantados se sumergieron en cápsulas de Petri que contienen medio de cultivo celular DMEM. Después de 30 minutos, se llevaron a cabo estudios electrofisiol�gicos conectando los

electrodos a un Pacing System Analyzer Model 5311 (Medtronic Inc.). Se suministr� electroestimulaci�n balanceada de carga bipolar usando los siguientes parámetros: amplitud del pulso 1 voltio, anchura del pulso 0,5 ms, frecuencia de la estimulaci�n 70 pulsos por minuto (ppm). La estimulaci�n se suministr� sólo para el ensayo. Después, se evalu� la impedancia eléctrica con los armazones.

Resultados

Se llevaron a cabo medidas eléctricas en cada grupo de preparación, es decir, medio celular solo, matriz de col�geno, armazón de PEA90A, armazones de PEA90B, armazones de PEA100. Cada grupo consistió en 5 muestras.

Las medidas de la impedancia mostraron los siguientes valores: medio de cultivo celular 292 +/-25 ohmios, matriz de col�geno 230 +/-21 ohmios; armazones de PEA90A 321 +/-34 Ohmios; armazones de PEA90B 345 +/-33 ohmios; armazones de PEA100 340 +/-29 ohmios.

Medio celular

Matriz de col�geno Armazón de PEA90A Armazón de PEA90B Armazón de PEA100

Impedancia [!]

292 230 321 345 340

Corriente [mA]

3,42 4,35 3,11 2,90 2,94

Pulso de la estimulaci�n; 1,0 V, 0,5 ms.

Estos resultados mostraron que todos los materiales evaluados presentan propiedades de conducción eléctrica, es decir, resistencia, similares a las encontradas con tejidos cardíacos, y de este modo estos armazones tienen el potencial para ser usados para la sustitución mioc�rdica.

EJEMPLO 3

El músculo cardíaco que falla necesita ser sostenido cr�nicamente para disminuir el esfuerzo de la pared ventricular y también para ser regenerado para mejorar la función ventricular. Este Ejemplo demuestra que la asociación de células madre con una matriz de col�geno y una malla de poli�ster para el envoltorio cardíaco proporciona mejores resultados que la implantación de una malla de poli�ster sola.

Para ilustrar esta realización, quince ovejas sufrieron 1 hora de isquemia mioc�rdica quirúrgica seguido de reperfusi�n. Se crearon tres grupos: Grupo 1: oclusión coronaria sin tratamiento (grupo de control). Grupo 2: restricción del LV usando una malla de poli�ster para envoltura cardíaca. Grupo 3: el área isqu�mica se trat� asociando células madre, una matriz de col�geno y una malla de poli�ster. Células madre aut�logas derivadas de tejido adiposo (ASC), cultivadas en condiciones hip�xicas (5%), se marcaron con BrdU y se inyectaron en el área infartada y en una matriz de col�geno. A los 3 meses, los animales se evaluaron con estudios de ecocardiograf�a e histopatol�gicos.

Extracci�n de biopsias

En 15 ovejas Rambouillet hembras que pesan 32 a 37 kg (media 35 � 2,2 kg), se retir� tejido graso subcutáneo para el aislamiento y expansión de células madre. Se usaron células aut�logas todo el tiempo a fin de evitar cualquier problema de histocompatibilidad. Las biopsias de tejido adiposo se obtuvieron mediante retirada de tejido graso subcutáneo (40-60 gramos) de la pared torácica derecha, y se almacenaron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente hasta el procesamiento.

Aislamiento y cultivo hip�xico de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Las muestras tisulares se picaron finamente y se digirieron mediante incubaci�n con 0,14 unidades W�nsch/ml de disolución Liberase Blendzyme 2 (Roche Applied Science, Hvidovre, Dinamarca) a 37�C durante dos horas. Las digestiones se centrifugaron a 400 g durante 10 min., y el fluido superior y las capas de grasa se desecharon. Los eritrocitos contaminantes se lisaron resuspendiendo el pelete en agua milli-Q estéril durante 20 segundos, después de lo cual la concentración de sal se ajust� mediante la adición de 10x PBS. Las células se filtraron a través de un colador celular de 100 ∀m, se centrifugaron a 400g durante 10 min., y se resuspendieron en 25 ml de medio de crecimiento, que consiste en medio esencial mínimo alfa (A-MEM) (GIBCO/Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), y penicilina (10 U/ml), estreptomicina (10 mg/ml), gentamicina (10 mg/ml) (todas ellas de GIBCO/Invitrogen). Las células se sembraron en un matraz T75 y se transfirieron a una incubadora de CO2 toda la noche, después de lo cual se eliminaron las células no adherentes. Los matraces se transfirieron entonces a un banco de trabajo/incubadora hip�xica (Xvivo; Biospherix, Lacona, NY), que permite el cultivo celular sin interrupciones y el paso en una atmósfera controlada de 5% de O2 y 5% de CO2 balanceado con nitrógeno. Durante la expansión de las células, el medio se cambi� dos veces a la semana. Cuando las células tuvieron una confluencia

de 90%, las células se despegaron de los matraces de cultivo usando 0,125% de tripsina/0,01% de EDTA, y se transfirieron a nuevos matraces.

Marcaje con bromodesoxiuridina

Para cada muestra, las células se expandieron hasta que ocho matraces de cultivo T175 tuvieron una confluencia de 75%, y entonces las células se marcaron con bromodesoxiuridina (BrdU). De forma breve, las células se incubaron con medio de crecimiento que contiene 10 microgramos de BrdU (Sigma) durante 48 horas, y después las células se lavaron varias veces con PBS y se congelaron en alícuotas de aproximadamente 10 x 106 células.

Lesi�n mioc�rdica experimental

Tras la medicaci�n preoperatoria y la inducción de la anestesia (el mismo protocolo que las biopsias de tejido graso), los animales se intubaron y se ventilaron mecánicamente con un sistema Aestiva/5 (Datex-Ohmeda, Helsinki, Finlandia). El electrocardiograma se monitoriz� durante la operación. Se colocó una línea venosa central a través de la vena yugular externa para la administración de infusiones de fluidos y de fármacos. Se llev� a cabo una toracotom�a izquierda a nivel del 5� espacio intercostal, y se expuso el corazón. Para reducir el riesgo de cicatrización ventricular, se realizó durante todo el procedimiento quirúrgico una perfusi�n continua IV (2 mg/kg por hora) de xiloca�na al 1% (Lidoca�na, AstraZeneca). En todos los animales, se cre� quirúrgicamente una isquemia mioc�rdica del LV mediante ligación transitoria (60 minutos) de la rama diagonal principal de la arteria coronaria izquierda, seguido de la reperfusi�n. Se hizo pasar una sutura de Prolene no absorbible 4-0 por debajo de la rama de la arteria coronaria, el caudal se interrumpió usando una compresa de tefl�n comprimida por un oclusor de poliuretano. Este oclusor se liber� después de 60 minutos, y de este modo se reperfusion� el territorio isqu�mico mioc�rdico. Cambios del EKG significativos, incluyendo una mayor anchura del complejo QRS y la elevación del segmento ST, y cambios de color y cinéticos del área de riesgo fueron considerados indicativos de oclusión coronaria.

Grupos de tratamiento

Los animales se distribuyeron al azar en 3 grupos:

Grupo 1 (n = 5): isquemia mioc�rdica sin tratamiento (grupo de control).

Grupo 2 (n = 5): implantación tras la isquemia de un dispositivo de envoltura ventricular de malla.

Grupo 3 (n = 5): inyección intrainfarto tras la isquemia de células madre, implantación de una matriz de col�geno como interfaz, e implantación del dispositivo de envoltura ventricular de malla.

Inyecci�n de células e implantación de matriz de col�geno

En los animales del Grupo 3, 1 hora después del infarto, se inyectaron células en la zona infartada usando una aguja de calibre 27. Las inyecciones consistieron en 99 +/-12 millones de células, 50% (2 ml) inyectadas en el infarto y 50% (5 ml) sembradas en una matriz de col�geno tridimensional tipo I.

Para el tratamiento mioc�rdico, se usaron seis puntos de agujas de inyección en cada animal, y la hinchazón sobre el área del infarto mioc�rdico se confirm� en cada caso tras la inyección. Los criterios para guiar las inyecciones epic�rdicas fueron la decoloración de la superficie ventricular y la hipocinesia.

Preparaci�n de la matriz de col�geno

Se prepar� matriz de col�geno a partir de un kit de col�geno comercialmente disponible CE Mark (Pangen 2, Urgo Laboratory, Chenove, Francia). Esta matriz biodegradable tridimensional (tamaño: 5 x 7 x 0,6 cm) se fabricó usando un col�geno nativo tipo I no desnaturalizado, liofilizado. Los poros de la matriz midieron 50 a 100 ∀m. En el quirófano y en condiciones de esterilidad elevada, la matriz se colocó en una cápsula de Petri; después, la suspensión celular (50 � 6 millones de células diluidas en 5 ml de medio) se sembr� sobre la matriz. Para promover una distribución regular de ASC en los poros de la matriz, las cápsulas de Petri que contienen la matriz de col�geno se agitaron continuamente durante 10 minutos a 160g usando un agitador orbital (Stuart Scientific, Stone, Staffordshire, UK).

Envoltura cardíaca de malla

Para evitar inestabilidad hemodin�mica y arritmias durante la implantación, se comenzó por fijar la envoltura cardíaca de malla (dispositivo de poli�ster (CorCap) antes de la creación de la isquemia mioc�rdica. En todos los casos se escogió el CorCap modelo Gen2 CSD Tamaño B (Acorn Cardiovascular Inc, St Paul, MN, USA), después se abrió longitudinalmente, se deslizó por detrás de los ventrículos y se fij� con 2 suturas epic�rdicas laterales (Prolene 4-0). Después, se cre� la isquemia seguido de reperfusi�n. Una hora más tarde, se inyectaron las células, se implant� la matriz de col�geno, y la parte anterior del CorCap se cerr� usando una sutura continua (Prolene 2-0). La fijación del dispositivo se termin� mediante múltiples suturas individuales a lo largo del surco anterior auriculoventricular.

Resultados

No se observ� mortalidad. El tratamiento hip�xico para cultivos celulares demostr� una mejora bastante drástica de la tasa de proliferaci�n: bajo hipoxia, las células crecieron más rápido. La electrocardiograf�a mostr� una dilatación del volumen de LVED (dimensión diast�lica del extremo ventricular izquierdo) en ambos grupos tratados (malla de poli�ster sola 35,6 � 5 ml, y con terapia celular 32,6 � 4 ml) frente al control (65 � 6,3 ml, p < 0,01 para ambas comparaciones). La EF (fracción de eyección) fue significativamente mayor en los corazones tratados con la malla de poli�ster + células/col�geno (55,8 � 3,8%), en comparación con aquellos que reciben solamente la envoltura de poli�ster (44,1 # 2,3%) (p = 0,04) o sin tratamiento (34,8 � 3,6%) (p = 0,01). El tiempo de desaceleraci�n (DT) de la válvula mitral derivado por d�pler mejor� de 140 � 6,3 ms a 195 � 9,5 ms (p = 0,03) en el grupo de CorCap de células-col�geno, pero no en los otros grupos. La histología mostr�, en el grupo tratado con células, áreas isqu�micas multifocales mucho menos prominentes que en otros grupos, con focos de angiog�nesis y células injertadas viables. Se observ� en el Grupo 3 interfaz de fibrosis mínima entre la malla de poli�ster y el epicardio, probablemente debido a la interposición del col�geno sembrado con células.

Comentarios

En el modelo isqu�mico, las células madre asociadas con una matriz de col�geno y una malla de poli�ster para la envoltura cardíaca mejora la EF y la función diast�lica, reduciendo la remodelación y la fibrosis adversas. Este procedimiento que asocia un enfoque biológico regenerativo con un dispositivo de sostén prost�tico parece ser apropiado para el tratamiento de insuficiencia cardíaca isqu�mica avanzada.

EJEMPLO 4

Este Ejemplo cl�nico demuestra que una matriz de col�geno sembrada de células asociada con terapia celular intrainfarto proporciona mejores resultados que la célula madre sola.

Preparaci�n de la matriz

Se prepar� una matriz biodegradable tridimensional (tamaño: 5 x 7 x 0,7 cm) fabricada usando col�geno bovino liofilizado tipo I. Los poros de la matriz midieron 50 a 100 ∀m. En el quirófano y bajo condiciones de esterilidad elevada, la matriz se colocó en una cápsula de Petri; después, la suspensión celular (250 � 28 millones de células diluidas en 10 ml de medio) se sembr� sobre y en la matriz. Para promover una distribución regular de células en la matriz, las cápsulas de Petri que contienen la matriz se agitaron continuamente durante 10 minutos a 160g usando un agitador orbital (Stuart Scientific, Stone, Staffordshire, UK).

Procedimiento quirúrgico

En 10 pacientes (edad media 52,6 años), tras la esternotom�a, se llev� a cabo un único OP-CABG (injerto de derivación de la arteria coronaria sin bomba) usando arteria mamaria interna izquierda (LIMA). Al final de la cirugía, se inyectaron 250 � 28 millones de células, diluidas en 5 ml de medio, en el área infartada y en la zona de los bordes, usando una aguja oft�lmica retrobulbar de 25G x 40 mm. Después se colocó la matriz sembrada de células, cubriendo el área infartada, y se fij� al epicardio con 6 suturas PDS (6-0).

En otro grupo de 10 pacientes (edad media 56,8 años), se llev� a cabo un único OP-CABG. Se inyectaron células madre en la cicatriz del infarto, pero no se us� matriz sembrada en este grupo.

Resultados

No hubo mortalidad y ningún suceso adverso relacionado (seguimiento 10 � 3,5 meses). NYHA FC mejor� en ambos grupos de 2,3 � 0,5 a 1,3 � 0,5 (matriz, p = 0,0002) frente a 2,4 � 0,5 a 1,5 � 0,5 (sin matriz, p = 0,001). El volumen diast�lico del extremo del LV evolucion� de 142,4 � 24,5 a 112,9 � 27,3 ml (matriz, p = 0,02) frente a 138,9 � 36,1 a 148,7� 41 ml (sin matriz, p = 0,57), el tiempo de desaceleraci�n de llenado del LV mejor� significativamente en el grupo de la matriz de 162 � 7 ms a 198 � 9 ms (p = 0,01) frente al grupo sin matriz (de 159 � 5 ms a 167 � 8 ms, p = 0,07). El grosor del área cicatrizal progresa de 6 � 1,4 a 9 � 1,1 mm (matriz, p = 0,005) frente a 5 � 1,5 a 6 � 0,8 mm (sin matriz, p = 0,09). La EF mejor� en ambos grupos, de 25,3 � 7,3 a 32 � 5,4% (matriz, p = 0,03) frente a 27,2 � 6,9 a 34,6 � 7,3% (sin matriz, p = 0,031).

Comentarios

Este estudio cl�nico mostr� que el transplante celular asociado con una matriz de col�geno sembrada de células aument� el grosor de la cicatriz del infarto con tejidos viables, y ayud� a normalizar el esfuerzo de la pared cardíaca en regiones lesionadas (efecto de armazón), limitando as� la remodelación ventricular y mejorando la función diast�lica. Los pacientes tratados sin la matriz de col�geno sembrada con células no mostraron limitación de remodelación post-isqu�mica ni mejoras en la función diast�lica.

EJEMPLO 5: PREPARACIÓN DE UN MATERIAL HÍBRIDO PARA EL CULTIVO TRIDIMENSIONAL CON PROPIEDADES MECÁNICAS MEJORADAS QUE LLENA MEMBRANAS ELASTOM�RICAS CON P�PTIDOS

SINT�TICOS AUTOENSAMBLADORES RESUSPENDIDOS EN AGUA

PROPIEDADES MECÁNICAS DE ARMAZONES TRIDIMENSIONALES

Durante las últimas décadas, la cardiomioplastia celular se ha convertido en un estado de la técnica para afecciones cardíacas. Consiste en introducir células mioc�rdicas o células madre (con y sin matrices tridimensionales) en los ventrículos infartados, tratando de recuperar la función perdida. El inconveniente es que se demostr� que había un número bajo de células capaces de sobrevivir en estas condiciones; parcialmente debido a que no pueden soportar las fuerzas mecánicas del tejido receptor.

Los armazones tridimensionales como RAD16-I (p�ptidos autoensambladores resuspendidos en agua) permiten a las células formar una red funcional en el armazón de lámina ∃ formado, pero adicionalmente es indispensable que el armazón pueda soportar el latido del corazón. Las membranas elastom�ricas pueden ofrecer estas propiedades mecánicas.

TINCI�N CON ROJO CONGO

La tinción con rojo Congo es un método simple para apreciar la formación de láminas ∃ de autoensamblaje RAD16-I típica. El reactivo est� en forma de sal sádica del ácido bencidindiazo-bis-1-naftilamina-4-sulf�nico (fórmula: C32H22N6Na2O6S2), y su configuración permite el enlace de hidrógeno de los grupos azo y amina del colorante a radicales hidroxilo separados similarmente, dando una coloración roja.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se emplearon trozos de membranas porosas de poliacrilato de etilo (PEA100 en lo siguiente) y un copol�mero de acrilato de etilo y acrilato de hidroxietilo con una relación música de 90:10 de ambos mon�meros (en lo sucesivo PEA90) como membranas elastom�ricas. Las membranas se cortaron en trozos de dimensiones 0,5 cm X 0,5 cm, con un grosor aproximado de 1,0 mm (PEA100 y PEA90). Los poros de las membranas consistieron en capas de familias ortogonales de canales cilíndricos paralelos, con diámetro de los canales de 150 micrómetros y separación de los canales de 300 micrómetros. Se generaron dejando que los precursores de los pol�meros reaccionasen dentro de un molde de la estructura porosa, y disolviendo después el molde.

El p�ptido autoensamblador RAD16-I se us� como armazón tridimensional. El lote se prepar� en una disolución al 1% de sacarosa al 10%, evitando el autoensamblado producido por el incremento de la fuerza iónica. La disolución madre se diluyó hasta la concentración deseada en sacarosa al 10% para cada experimento.

Prehidrataci�n de los armazones

Los armazones elastom�ricos necesitan ser preacondicionados antes de la adición del p�ptido. Inicialmente, las membranas se esterilizaron usando tres lavados con EtOH al 70%, y dejándolas secar en aire durante 10 min. Después de este pretratamiento, los armazones se hidrataron según lo siguiente: 30 min. de inmersión durante 30 min. en una disolución de PBS con vacío, y tres lavados con sacarosa al 10%. El vacío fue necesario para asegurar que todos los poros est�n llenos con la disolución acuosa, y la disolución isot�nica fue necesaria para evitar el autoensamblado durante el primer contacto entre las membranas y el p�ptido. Después de este tratamiento, las membranas se secaron hasta humedad, puesto que el secado completo volvería a las membranas a su hidrofobia inicial.

Llenado de las membranas con el p�ptido RAD16-I

Las membranas pretratadas se introdujeron dentro de un inserto de cultivo celular de 9 mm de diámetro (PICM01250, Millipore, Billerica, MA). Después, se cargó el p�ptido RAD16-I al 0,15% en sacarosa al 10%, con cuidado, sobre la parte superior de la membrana usando una micropipeta. Después de cargar el p�ptido, se colocaron fuera del inserto 500 ∀l de medio completo DMEM con L-glutamina, piruvato de sodio y suero fetal bovino al 15%. El p�ptido se dej� autoensamblar en la cabina de flujo durante 20 min. En este punto, el medio penetra en el inserto desde la membrana inferior, induciendo un autoensamblado de RAD16-I desde la parte inferior hasta la parte superior dentro de la membrana. Para eliminar por lavado la sacarosa restante, el medio se a�adi� en etapas secuenciales sobre la parte superior del ensamblaje, y se dej� infiltrar. Finalmente, se cargaron 500 ∀l dentro del inserto, y 2,5 ml en el pocillo fuera del inserto.

RESULTADOS Y COMENTARIOS

Ambas membranas, PEA100 y PEA90, se llenaron con el p�ptido RAD16-1. Cada grupo consistió en 2 muestras. Por lo tanto, se consider� un material compuesto: membranas elastom�ricas + p�ptidos autoensambladores.

Los resultados mostraron que la membrana de PEA100 permitió a RAD16-I llenar más fácilmente los poros que la membrana de PEA90. De este modo, parece que el pol�mero PEA100 más hidrófobo es preferible en principio, a fin de obtener el sistema combinado con propiedades mecánicas mejoradas en comparación con aquellos del gel pept�dico, que permitiría mantener el latido del corazón.

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10 Buckberg GD, Weisfeldt ML, Ballester M, Beyar R, Burkhoff D, Coghlan HC, Doyle M, Epstein ND, Gharib M, Ideker RE, Ingels NB, LeWinter MM, McCulloch AD, Pohost GM, Reinlib LJ, Sahn DJ, Sopko G, Spinale FG, Spotnitz HM, Torrent-Guasp F, Shapiro EP. Left ventricular form and function: scientific priorities and strategic planning for development of new views of disease. Circulation. 2004;110:e333-6.

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Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un implante bioactivo para la regeneración mioc�rdica y el sostén de la cámara ventricular, que comprende:

   I. una membrana de armazón microporosa elastom�rica que comprende al menos un pol�mero sintético no degradable, un pol�mero sintético parcialmente degradable, y biomateriales de nanofibra, teniendo dicha

   5 membrana una porosidad comprendida entre 70% y 90%, estando los poros interconectados y teniendo diámetros comprendidos entre 80 micrómetros y 150 micrómetros, en la que

   a. dicho pol�mero sintético no degradable se selecciona del grupo que consiste en poliacrilato de etilo y poliacrilato de etilo copolimerizado con un comon�mero de acrilato de hidroxietilo al 10% en peso o al 20% en peso; y

   10 b. dicho pol�mero sintético parcialmente degradable se selecciona del grupo que consiste en éster 2(metilacriloiloxi)etílico de caprolactona o en éster 2-(metilacriloiloxi)etílico de caprolactona copolimerizado con acrilato de etilo en proporciones en peso de este último comon�mero comprendidas entre 30% y 80%,

   en la que el porcentaje de pol�meros no degradables frente a pol�meros degradables est� comprendido entre 15 10% en peso y 90% en peso, y

   II. un armazón de hidrogel de nanofibras.
2. 2. El implante bioactivo de la reivindicación 1, en el que dicho armazón de hidrogel de nanofibras incluye moléculas naturales seleccionadas del grupo que consiste en matrices derivadas de proteína, p�ptido, oligosac�rido, polisac�rido, o proteoglicano tales como col�genos, fibrinas, alginatos, quitosanos, ácido hialur�nico y/o moléculas

   20 sintéticas que se desarrollarán en una red de nanofibras con propiedades de gel/hidrogel, seleccionadas del grupo que consiste en armazones de hidrogel de nanofibras pept�dicas tales como el p�ptido AcN-RADARADARADARADA-COONH2.
3. 3. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente células miog�nicas o cardiomiog�nicas.

   25 4. El implante bioactivo de la reivindicación 3, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en mioblastos esquel�ticos, células del músculo liso, cardiomiocitos fetales y neonatales, cardiomiocitos ventriculares adultos, cardiosferas y progenitores epic�rdicos.

4. 5.

   El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente células angiog�nicas.

5. 6.

   El implante bioactivo de la reivindicación 5, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en una

   30 fracción de células de la médula ósea y de células mononucleares de sangre periférica, células progenitoras endoteliales de la médula ósea y de sangre periférica, células endoteliales, células mesoteliales del omento, células madre derivadas de adipocitos, células madre de tejido adiposo epic�rdico, y células estr�micas multipotentes de sangre menstrual.
6. 7. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, en el que la membrana de armazón microporosa elastom�rica se

   35 trata en la superficie para injertar moléculas de adhesión seleccionadas del grupo que consiste en p�ptidos funcionales tales como p�ptidos RGD, azúcares o lípidos funcionales, y proteínas tales como laminina o fragmentos de laminina.
7. 8. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, en el que el armazón de hidrogel nanoporoso o de nanofibras es un pol�mero natural seleccionado del grupo que consiste en col�geno, alginato, quitosano, p�ptido autoensamblador,

   40 ácido hialur�nico o fibrina. El gel de pol�mero natural llena completamente los poros de la membrana elastom�rica, o forma una capa que recubre las superficies internas de los poros de la membrana.
8. 9. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, en el que la composición del implante bioactivo tiene un porcentaje de pol�mero no degradable frente a degradable que oscila de 10% en peso a 48% en peso.
9. 10. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente electrodos de estimulaci�n para 45 la electroestimulaci�n simultánea o tratamientos electrofisiol�gicos tales como desfibrilaci�n y resincronizaci�n.
10. 11. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente marcadores tales como colorantes, microesferas, radiois�topos, partículas de hierro, para evaluación de la biodegradaci�n, integración, proliferaci�n, diferenciación y/o función, usando métodos radiol�gicos, ecocardiogr�ficos de ultrasonidos, radioisot�picos, metabólicos, RMI, de barrido CT o bioluminiscentes-fluorescentes.

    50 12. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente un sistema para la liberación o absorbancia controlada de moléculas activas seleccionadas del grupo que consiste en pequeñas moléculas orgánicas, p�ptidos, lípidos, azúcares, proteínas, proteoglicanos que tienen actividad angiog�nica, antiangiog�nica,

    prorregenerativa, antirregenerativa, apopt�tica, necr�tica, antiapopt�tica y antinecr�tica, tales como VEGF, IL-6, IL10, IGF-1, FGF-2, HBEGF y bFGF.
11. 13. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que comprende adicionalmente citocinas y p�ptidos antiapopt�ticos angiog�nicos.

    5 14. El implante bioactivo de la reivindicación 1 � 2, que tiene bucles helicoidales de pol�meros sintéticos bioestables no degradables para que el implante presente una forma c�nica.
12. 15. Un método para preparar el implante bioactivo de la reivindicación 3 � 5, que comprende las siguientes etapas: -una membrana de armazón microporosa elastom�rica según la reivindicación 1 se llena con un armazón de

    hidrogel de nanofibras pept�dicas, para obtener un constructo bioactivo; 10 -dicho constructo se cultiva en condiciones mecánicas biof�sicas.
13. 16. El método de la reivindicación 15, que comprende adicionalmente sembrar o implantar células sobre o en dicho constructo bioactivo usando los siguientes métodos: mecánico (agitaci�n, centrifugaci�n), químicos (electroforesis), físicos (electroporaci�n).
14. 17. El método de la reivindicación 16, en el que dicho método se selecciona del grupo que consiste en agitaci�n, 15 centrifugaci�n, electroforesis y electroporaci�n.
15. 18. Un método para preparar el implante bioactivo de la reivindicación 3 � 5, que comprende las etapas de:

    a.

    obtener células miog�nicas, cardiomiog�nicas o angiog�nicas;

    b.

    cultivar dichas células in vitro;

    c.

    mezclar dichas células con un armazón de hidrogel de nanofibras pept�dicas;

    20 d. llenar la membrana de armazón microporosa elastom�rica según la reivindicación 1 con dicho armazón de hidrogel de nanofibras pept�dicas de la etapa c, para obtener un constructo bioactivo.

16. 19.

    M�todo según la reivindicación 18, que comprende además una etapa e, que es cultivar dicho constructo bioactivo bajo electroestimulaci�n local in vitro.

17. 20.

    El método de la reivindicación 18, en el que se usa tensión de oxígeno reducida durante la etapa b.

    25 21. El método de la reivindicación 18, en el que el implante bioactivo se fabrica para ser adaptado al sostén y regeneración ventricular izquierdo y/o ventricular derecho, para envolturas ventriculares parciales completas.