ITUB20159750A1 - Metodo per la promozione ed il miglioramento delle proprieta? del tessuto adiposo, tessuto e cellule ottenute tramite detto metodo - Google Patents

Description

"METODO PER LA PROMOZIONE ED IL MIGLIORAMENTO DELLE PROPRIETÀ' DEL TESSUTO ADIPOSO, TESSUTO E CELLULE OTTENUTE TRAMITE DETTO METODO"

TESTO DELLA DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la promozione delle proprietà anti-infiammatorie e di miglioramento della capacità di riparazione di un tessuto contenente cellule staminali mesenchimali (MSCs) , al tessuto ed alle cellule staminali mesenchimali ottenute con detto metodo.

E' nota la preparazione di tessuti che possono riparare , sostituire o ripristinare strutture e/o funzioni biologiche che sono venute meno a causa di difetti congeniti , dell 'invecchiamento, di malattie, o di loro distruzione (Haseltine , 2003; Gutmann et al., 2005, Greenwood. et al., 2006).

Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono cellule multi-potenti , capaci di auto rinnovarsi, e con la capacità di differenziarsi, in vitro, in cellule di origine mesenchimale , tra cui osteoblasti, adipociti e condrociti , e dare origine a tessuti quali ossa, grasso , cartilagine e muscolo, in vivo (Pittenger et al. , 1999). Studi recenti hanno dimostrato che la potenzialità di rigenerazione tissutale può essere migliorata utilizzando cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo umano (cosiddette hADSCs) (Gimble et al., 2011).

Il numero di cellule staminali mesenchimali sembra essere significativamente più elevato nel tessuto adiposo che in altri tessuti , come il midollo osseo (Bieback et al., 2004).

Infatti, il trapianto autologo di tessuto adiposo è una affermata procedura terapeutica , utilizzata per la riparazione di vari danni ai tessuti.

Inoltre , diverse recenti pubblicazioni affermano che le cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano (hADSCs) sono capaci , con una adeguata stimolazione , di differenziarsi in altri differenti tipi di cellule, come neuroni, cardiomiociti, epatociti e cellule pancreatiche (Schàffler et al., 2007; Strem et al., 2005) e possiedono un potenziale clinico per vasculogenesi (Madonna et al., 2009), 1 'osteogenesi (Shenaq et al., 2010) e modelli di riparazione neuronaie (Wakabayashi et al., 2010).

E' altresì noto che le forze meccaniche possono essere di importanza fondamentale per la plasticità dei tessuti adulti , come si verifica durante 1 'embriogenesi, il rimodellamento tissutale ed il comportamento mitotico e di motilità delle cellule (Vogel et al., 2006).

Le cellule percepiscono e rispondono a forze applicate dall esterno , e alle forze esercitate sulla matrice cellulare e sui contatti cellula-cellula .

Canali ionici attivati da stiramento, fattori di crescita , filamenti del citoscheletro , matrici extracellulari , adesioni focali , e tirosinchinasi appaiono coinvolti nella conversione di tali stimoli meccanici in segnali biochimici all 'interno delle cellule (meccano-trasduzione) che conducono agli eventi a valle (downstream) e , quindi , guidano i messaggi chiave sul destino al nucleo (E1 Haj et al., 1999, Na et al., 2008; Walker et al., 2000, Venkatesan Iyer et al., 2012, Chen et al., 2013).

Una sfida chiave nella medicina rigenerativa è la manipolazione minima delle cellule staminali, al fine di trasformare facilmente una linea cellulare specifica in terapia cellulare.

Con "manipolazione minima" (minimal manipulation) è stato definito un trattamento che non altera le caratteristiche rilevanti originali del tessuto relative all'utilità del tessuto per la ricostruzione, riparazione , o la sostituzione (www.ema.europa .eu ; www .fda.gov) .

Le agenzie di regolamentazione (FDA e EMA) e la società internazionale di ricerca sulle cellule staminali (ISCCR) sostengono che la terapia cellulare dovrebbe essere considerata come un medicinale quando c 'è più di una "manipolazione minima" delle cellule destinate all 'applicazione clinica o qualora 1 'uso previsto delle cellule è diverso da loro normale funzione nel corpo (www.ema.europa .eu; www.fda .gov; Hyun et al., 2008).

Le agenzie di regolamentazione sottolineano che la protezione dei pazienti è il cuore di queste regole. In aggiunta all applicazione delle stesse regole di sicurezza ed efficacia , come per tutti i medicinali, la qualità e la produzione di prodotti a base di cellule dichiarati nei requisiti della good-manufacturing practice (GMP) . Questi sono standards riconosciuti globalmente per la garanzia di qualità nella produzione e controllo dei medicinali . Qualsiasi uso di tali farmaci a base di cellule è soggetta ad autorizzazione e controlli , compresa la procedura per la loro fabbricazione (www .ema .europa.eu ; www.fda .gov). Secondo le agenzie di regolamentazione , durante la coltura cellulare in vitro , occorre tenere in considerazione dette regole per assicurare accettabile la crescita e la manipolazione delle cellule isolate . Le fasi di lavorazione devono essere adeguatamente progettate per preservare l'integrità e controllare la funzione delle cellule . Le procedure per qualsiasi manipolazione devono essere documentate in modo dettagliato e strettamente monitorate secondo controlli specifici di processo . La durata di coltura cellulare e il numero massimo di passaggi cellulari deve essere specificata in modo chiaro e convalidato. Le caratteristiche genotipiche e fenotipiche rilevanti delle colture cellulari primarie, delle linee cellulari stabilite ed i cloni cellulari derivati dovrebbero essere definiti e la loro stabilità , rispetto alla longevità colturale , determinata . Coerenza e ripetibilità del processo di coltura cellulare devono essere dimostrate e le condizioni di coltura, compresi i terreni (medium) e la durata devono essere ottimizzati rispetto alla funzione clinica prevista delle cellule . Per queste ragioni, la ricerca sulle cellule staminali applicata alla medicina rigenerativa ha 1 'obbligo di aderire al concetto fondamentale di "manipolazione minima" .

E' altresì noto che con 1 'invecchiamento della popolazione, la gestione della malattia di Parkinson è un aspetto sempre più importante e impegnativo della pratica medica per neurologi e medici di medicina generale .

Infatti la malattia di Parkinson (PD) è una comune malattia neurodegenerativa , una sinucleinopatia , con una diffusione di 160/100 000 unità in Europa occidentale , fino ad interessare circa il 4% della popolazione di ultraottantenni .

La comprensione della patogenesi della malattia è migliorata nel corso dell 'ultimo decennio e , ad esempio , sono stati compiuti notevoli progressi nella creazione di cellule che producono dopamina da cellule staminali ,

Scopo generale della presente invenzione è quello di attivare a livello molecolare e cellulare il tessuto adiposo asportato , ad esempio tramite liposuzione, in una maniera estremamente semplice , economica e particolarmente funzionale .

Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di avere una manipolazione minima delle cellule, in particolare delle cellule staminali mesenchimali , derivate da tessuto adiposo , senza digestione chimica del detto tessuto.

Altro scopo è quello di modificare lo stato infiammatorio di un tessuto adiposo , in particolare innescare proprietà anti-infiammatorie e sopprimere la produzione di citochine infiammatorie come le TNF-alfa (tumor necrosis factor-alpha) in tessuto adiposo umano ottenuto ad esempio tramite liposuzione , e di migliorare la capacità riparatoria del tessuto, tramite una procedura di manipolazione minima, in modo tale da poter utilizzare le cellule staminali mesenchimali ottenute da tessuto adiposo umano (cosiddette hADSCs) per scopi terapeutici .

In vista degli scopi suddetti, secondo la presente invenzione , si è pensato di realizzare un metodo per la promozione delle proprietà anti-infiammatorie e di miglioramento della capacità di riparazione di un tessuto contenente cellule staminali mesenchimali (MSCs) , un tessuto adiposo ottenuto tramite detto metodo e cellule staminali mesenchimali derivate da detto tessuto, aventi le caratteristiche esposte nelle rivendicazioni principali e sottorivendicazioni allegate .

Secondo la presente invenzione il metodo comprende almeno un passo di attivazione meccanica eseguita tramite 1 applicazione di una forza di agitazione orbitale su tessuto adiposo lipoaspirato o asportato dal corpo.

Secondo la presente invenzione la forza applicata al tessuto adiposo lipoaspirato o asportato dal corpo ha una intensità compresa tra 40 e 120 x g.

In una forma esecutiva preferita detta forza applicata ha una intensità pari a 97 x g.

Detta forza è applicata per un tempo compreso tra 3 e 20 minuti.

Ad esempio detta forza è applicata per 10 minuti. E' possibile prevedere di applicare la forza al tessuto adiposo lipoaspirato o comunque asportato dal corpo umano o animale con una qualsiasi tecnica nota, e contenuto in un opportuno contenitore, una sola volta oppure è possibile prevedere che detta forza sia applicata due o più volte in maniera ripetuta nel tempo .

Per ciascuna ripetizione, 1'intensità della forza può essere uguale o diversa cosi come la durata di ciascuna applicazione .

Il metodo oggetto della presente invenzione può essere applicato sia a tessuto adiposo fresco sia a tessuto crioconservato .

La forza di agitazione orbitale può essere applicata al tessuto adiposo lipoaspirato o asportato dal corpo tramite un dispositivo composto da un motore con movimento orbitale provvisto di contenitore usa e getta e sterile, all'interno del quale è contenuto il tessuto adiposo lipoaspirato o asportato dal corpo avente una capacità fino a 500 mi.

Oggetto detta presente invenzione è anche un tessuto ottenuto tramite detto metodo e cellule staminali ottenute da detto tessuto tramite un ulteriore passo di

isolamento ed espansione di dette cellule staminali mesenchimali contenute in detto tessuto adiposo lipoaspirato o rimosso dal corpo (hADSCs).

In particolare il tessuto adiposo e le cellule staminali mesenchimali ottenute con il metodo oggetto della presente invenzione presentano migliorate proprietà anti -infiammatorie e migliorate capacità di riparazione , essendo in detto tessuto e cellule staminali mesenchimali :

eliminata 1'espressione di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ;

- aumentata sensibilmente 1'espressione del suo inibitore naturale TSG-6 e dell 'interleuchina 15;

migliorata notevolmente 1'espressione di leptina ,

ed essendo incrementati i parametri che definiscono la staminalità quali l'espressione di geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog), di beta-tubulina III e di TSG6 mRNA.

Il tessuto adiposo attivato meccanicamente, ossia asportato , conservato in un contenitore e sottoposto ad agitazione orbitale, è del tutto simile ad punto di vista strutturale al tessuto ottenuto da biopsia.

Oggetto della presente invenzione è anche 1 uso di detto tessuto e cellule staminali mesenchimali in terapia cellulare .

Le caratteristiche della presente invenzione ed i suoi vantaggi risulteranno ancora più chiari ed evidenti da un esame della descrizione seguente , riferita alle figure allegate che mostrano i risultati sperimentali .

Nelle figure :

- le figure 1A, 1B e 1C illustrano 1'espressione differenziale di citochine in tessuto adiposo lipoaspirato e in tessuto adiposo lipoaspirato dopo 1 ’attivazione meccanica secondo la presente invenzione : TSG6 è già osservabile dopo 3 minuti di stimolazione ed ha massima espressione entro i 6-10 minuti; TNF-alfa è soppresso in 6 minuti. La figura 1D mostra che tali effetti sono osservabili anche nel tessuto adiposo crioconservato ; TQ=tempo 0, P2A=paziente A, PZB=paziente B , TNF-a=tumor necrosis factor-alpha , LEPT=leptina, IL15= interluchina 15;

- la figura 2 illustra 1'espressione dei geni della pluripotenza (S0X2, 0CT4, Nanog), beta-tubulina III e TSG6 saggiati con real-time RT-PCR in campioni da biopsia di tessuto adiposo umano , lipoaspirato e lipoaspirato meccanicamente attivato con il metodo oggetto della presente invenzione (10 minuti). Tutti i geni indagati sono appena attivi nel tessuto bioptico regolare ossia non trattato secondo la presente invenzione (biopsia), e sono leggermente attivati eseguendo la nota procedura di Coleman dopo la liposuzione (lipoaspirato) . Diversamente 1 ’upregulation è incomparabilmente superiore dopo l'attivazione specifica secondo la presente invenzione per 10 minuti;

- la figura 3 mostra i risultati di una real-time PCT quantitativa di misurazione dei livelli di espressione di mRNA di geni della pluripotenza ; TQ=tempo 0, P2A=paziente A, PZB=paziente B;

- la figura 4 mostra che 1'applicazione di una forza meccanica al tessuto adiposo modifica l'interazione di S0X2 e di HuR con il promotore di geni specifici (bTUBIII=beta-tubulina III, TSG6, IL15=interluchina 15 e TNF-a=tumor necrosi s factoralpha) ;

- le figure 5A e 5B mostrano la morfologia in vivo di hADSCs ottenute dal tessuto adiposo trattato tramite agitazione orbitale secondo la presente invenzione (6 e 10 minuti, rispettivamente) ;

- le figure 6A e 6B mostrano 1'espressione di beta-tubulina III (TUJ 1) e di vimentina in hADSCs ottenute da tessuto adiposo trattato meccanicamente con agitazione orbitale secondo la presente invenzione ;

- la figura 7 mostra analisi FACS dell'espressione di marker mesenchimali in cellule staminali mesenchimali ottenute dal tessuto adiposo trattato o non trattato con una forza 97 x g; TQ=tempo 0;

le figure SA e 8B mostrano 1'analisi del cariotipo invariato in hADSCs (passaggi 2 e 9) ottenute da tessuto adiposo trattato con forza meccanica secondo la presente invenzione. Il micrografico si riferisce a hADSCs di un caso ed è rappresentativo della stessa analisi effettuata in altri tre casi; PZ59=paziente 59;

- la figura 9 mostra sferoidi formati da hADSCs derivate da tessuto adiposo attivato meccanicamente secondo la presente invenzione , dopo essere stato coltivato in un terreno per neurosfere per 21 giorni; NPCs=Cellule precursori neurali adulte murine;

- la figura 10 mostra che S0X2 interagisce con il promotore di geni specifici (btubIII=beta-tubulina III, TSG6, IL15=interluchina 15 e TNF-a=tumor necrosis factor-alpha) anche in cellule staminali mesenchimali (hADSCs) isolate da tessuto adiposo trattato con forza 97 x g;

la figura 11 mostra che cellule staminali mesenchimali (MSCs) isolate da tessuto adiposo attivato meccanicamente secondo la presente invenzione (hADSCs) sono in grado di ridurre il rilascio di IL-1 beta da cellule THP1; LPS= endo tossina batterica lipopolisaccaride ;

- la figura 12 mostra che hADSCs isolate dal tessuto adiposo attivato meccanicamente secondo la presente invenzione riducono efficacemente il rilascio di IL-1 beta da cellule THP1 che presentano un incremento mediato da LPS, contrariamente a quelle da lipoaspirato (LS);

- la figura 13 mostra livelli di mRNA di citochine pro-inf iammatorie e anti-infiammatorie . L 'esperimento è stato eseguito mediante real-time RT-PCR. I risultati sono la media di due differenti esperimenti di RT-PCR in real-time . Le hADSCs da tessuto adiposo attivato meccanicamente abbattono le citochine infiammatorie ILla e TNF-a=tumor necrosis factor-alpha ed incrementano TSG6 ;

la figura 14 mostra la valutazione della percentuale di errori nell'uso delle zampe anteriori. Questi dati sono stati ottenuti utilizzando 1'horizontal grid test . Le hADSCs ottenute con il metodo secondo la presente invenzione riducono la percentuale di errore in modello animale di Parkinson dopo trapianto ;

- la figura 15 mostra la valutazione del tempo necessario per scendere dalla parte superiore della griglia verticale in vertical grid test. Topi trattati con MPTP hanno impiegato più tempo per girarsi e scendere dalla griglia verticale . Il tempo è ridotto in modo significativo con 1'iniezione intrastriatale di hADSCs ottenute con il metodo secondo la presente invenzione ;

- le figure 16A-16D mostrano 1'espressione di lncRNA-C0X2 in aree del cervello di topi. L'espressione è stata studiata 4 giorni dopo iniezione intrastriatale di hADSCs ottenute con il metodo secondo la presente invenzione nei topi in cui il Parkinson è stato indotto con MPTP. MPTP provoca la comparsa di Linc-C0X2 in corteccia e striato (aree colpite dal Parkinson indotto da MPTP) , che viene eliminata dal trattamento intrastriatale del topo con cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo attivato secondo la presente invenzione . Questo è correlato con il miglioramento della funzione degli arti;

la figura 17 mostra la localizzazione nel cervello di LnRNA C0X2 in topo sano (NT); in topo con Parkinson (MPTP) e topi con Parkinson trattati con hADSCs ottenute con il metodo secondo la presente invenzione (MPTP MSCs). L'analisi è stata effettuata 4 giorni dopo 1 'iniezione intrastriatale di hADSCs. LnRNA-C0X2 è mostrato in verde e hADSCs in rosso (marcato con PKH26);

- la figura 18 mostra l'espressione di IL-6 mRNA: topi con Parkinson (MPTP) e topi con Parkinson trattati con hADSCs ottenute con il metodo secondo la presente invenzione (MPTP MSCs). L'analisi è stata effettuata 4 giorni dopo 1'iniezione intrastriatale di hADSCs e mostra 1'abbattimento di IL-6;

- le figure 19A e 19B mostrano il trattamento con MPTP e cellule microgliali primarie LPS attivate;

- la figura 20 mostra reai time RT-PCR di IL6 mRNA, lnRNA C0X2 e In RNA CCND1 (usato come controllo negativo) di microglia in coltura e trattata con LPS o MPTP. Il terreno di coltura che era stato esposto alle cellule hASDCs ottenute da grasso attivato (SUP), abbatte la produzione di IL-6 e Ln-C0X2;

le figure 21A-21C mostrano 1 'azione antiinfiammatoria con 1 'abbattimento delle citochine esercitata dal tessuto oggetto della presente invenzione nel midollo spinale a 48 ore dalla lesione traumatica ;

la figura 22 mostra il recupero funzionale (scala BMS) degli arti posteriori in topo con lesione spinale trapiantato con tessuto adiposo lipoaspirato (LS) e con tessuto adiposo meccanicamente attivato secondo la presente invenzione (MALS) comparata con trattamento con salina. MALS promuove un recupero funzionale progressivo e significativo;

- la figura 23 illustra l'innesto nel midollo leso di tessuto adiposo meccanicamente attivato secondo la presente invenzione .

Il metodo oggetto della presente invenzione consente 1'attivazione meccanica di tessuto adiposo asportato dal corpo umano, in particolare delle cellule staminali mesenchimali in esso presenti.

Secondo una delle tecniche note , il tessuto adiposo da trattare con il metodo oggetto della presente invenzione può essere ottenuto da procedure di liposuzione elettive in anestesia locale.

Il prodotto finale sarà chiamato tessuto adiposo lipoaspirato (lipoaspirato) .

E' ovviamente possibile utilizzare anche altre procedure di estrazione del tessuto adiposo.

Nel presente testo si fa riferimento a tessuto adiposo umano ma ovviamente il metodo oggetto della presente invenzione è applicabile anche a tessuto adiposo animale .

Un esempio di procedura comporta una fase di infiltrazione , in cui una soluzione salina contenente il vasocostrittore epinefrina (2 mg / mi) viene infusa nel tessuto adiposo per minimizzare la perdita di sangue e la contaminazione del tessuto da parte delle cellule del sangue periferico.

Secondo una forma esecutiva della presente invenzione , per 1 'attivazione meccanica , 10 mi di tessuto adiposo lipoaspirato lavato è stato raccolto in un tubo da 50 mi e sottoposto ad agitazione orbitale con una forza pari a 97 x g per tempi diversi ossia 3, 6, 10 e 20 minuti, a temperatura ambiente .

Secondo la presente invenzione infatti le proprietà anti -infiammatorie del tessuto adiposo , in particolare del tessuto adiposo umano contenente cellule staminali mesenchimali , possono essere attivate attraverso 1 'applicazione di uno specifico movimento , avente una specifica forza (intensità) e durata .

Considerando che 1'accumulo di tessuto adiposo è di fatto considerato un processo infiammatorio , i fattori prò- ed anti-infiammatori sono stati valutati in tessuto adiposo lipoaspirato ottenuto dallo stesso gruppo di pazienti e sottoposti a forze meccaniche specifiche per un numero variabile di minuti.

Il grasso lipoaspirato non trattato è stato utilizzato come controllo .

Come illustrato in figura 1, la proteina TSG6 è già osservabile dopo 3 minuti di stimolazione ed ha massima espressione entro i 6-10 minuti; TNF-alfa è soppresso in 6 minuti.

I risultati sperimentali mostrano che 1 'applicazione di una forza di 97 x g ("x g" ossia, come è noto , multiplo della forza di gravità terrestre) :

elimina la tipica espressione del tessuto adiposo di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ;

- aumenta sensibilmente il suo inibitore naturale TSG6 e 1 'interleuchina 15, che sono presenti a livello marginale nel tessuto adiposo normale ossia non trattato ;

- migliora notevolmente l'espressione di leptina, il soppressore del desiderio di cibo prodotto dal grasso .

Detta espressione migliorata di leptina dimostra che detta forza può anche essere applicata in vivo sulle superfici del corpo dove detto ormone gioca un ruolo cruciale .

Con riferimento alla figura 1, i dati dimostrano che :

- la massima espressione di TSG6 viene raggiunta entro 6 e 10 minuti di attivazione meccanica con forza 97 x g (Figura lb),

- la produzione di TNF-alfa è inibita entro 6 minuti nelle stesse condizioni (Figura le).

Inoltre la massima espressione di beta-tubulina III viene raggiunta in 20 minuti di attivazione meccanica con forza 97 x g.

Forze inferiori sono meno efficaci.

Secondo la presente invenzione per ottenere una promozione delle proprietà anti-infimmatorie ed un miglioramento delle capacità di riparazione del tessuto adiposo lipoaspirato è possibile applicare una forza di intensità compresa tra 40 e 120 x g.

L 'attivazione meccanica di processi antinfiammatori è efficace anche quando il tessuto adiposo è crioconservato a -80°C per diversi mesi, come illustrato in figura 1D.

Quando la forza 97 x g è applicata per 3 minuti sul tessuto adiposo che è stato crioconservato , TNF-alfa è cancellato mentre TSG6 e leptina aumentano marcatamente come nel tessuto fresco.

La semplice procedura di lipoaspirazione produce una attivazione meccanica blanda che si osserva attraverso 1 'espressione di alcuni geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog) , di betatubulina III e di TSG6 mRNA, come determinato mediante real-time RT-PCR.

I risultati ottenuti in tessuto adiposo umano da biopsia , in tessuto adiposo umano lipoaspirato , e tessuto adiposo umano lipoaspirato e meccanicamente attivato (10 minuti) sono mostrati in figura 2.

La figura 2 illustra 1'espressione dei geni della pluripotenza (S0X2, 0CT4, Nanog), beta-tubulina III e TSG6 saggiati con real-time RT-PCR in campioni da biopsia di tessuto adiposo umano , lipoaspirato e lipoaspirato meccanicamente attivato con il metodo oggetto della presente invenzione (10 minuti). Tutti i geni indagati sono appena attivi nel tessuto bioptico regolare ossia non trattato secondo la presente invenzione (biopsia), e sono leggermente attivati eseguendo la nota procedura di Coleman dopo la liposuzione (lipoaspirato) . Diversamente l 'upregulation è incomparabilmente superiore dopo l'attivazione specifica secondo la presente invenzione per 10 minuti,

Tutti i geni indagati sono appena attivi nel tessuto bioptico regolare , non manipolato meccanicamente secondo la presente invenzione, e tale attivazione è leggermente migliorata tramite la nota procedura di Coleman dopo la liposuzione (lipoaspirato) . Tuttavia 1 'applicazione della forza meccanica specifica , qui descritta e rivendicata , per 10 minuti provoca una up-regulation incomparabilmente superiore .

I geni regolatori della pluripotenza S0X2 , NANOG e 0CT4 sono completamente attivati entro 6 minuti di attivazione meccanica con forza 97 x g.

Quindi, oltre alle proprietà antinfiammatorie , anche i parametri che definiscono la staminalità di cellule staminali mesenchimali presenti nel tessuto adiposo sono incrementate tramite 1'attivazione meccanica , in maniera dipendente da forza e tempo (Figura 3).

E' noto che Sox2 abbia un ruolo fondamentale nel mantenimento delle cellule staminali embrionali e neurali .

Inoltre , è stato osservato (Go et al., 2008) che Sox2 non è essenziale solo per la pluripotenza e 1'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali , ma è anche espresso in cellule staminali somatiche con potenziale di espansione e di differenziazione superiore (Vai et al., 2008).

S0X2 è un fattore di trascrizione (34kDa) che contiene un HMG box per il legame al DNA e forma complessi trimerici con 0ct4 di controllo dell'espressione di un certo numero di geni.

Secondo la presente invenzione la specifica attivazione meccanica del tessuto adiposo regola direttamente 1 'espressione genica guidata dal fattore di trascrizione S0X2 sulla regione del promotore di diversi geni che codificano per le citochine sopra descritte .

Inoltre, il Chip-Seq su 1'immuno-precipitato S0X2 mostra un' elevata efficienza di legame di S0X2 sul promotore IL-6 nel glioblastoma o cellule ES (Fang et al. , 2011). E' stato analizzato in silico la regione del promotore -3000bp di beta-tubulina III, TSG6, TNF-alfa , IL1B , ILIO, IL15 e leptina, alla ricerca di sequenza consenso per S0X2 e sono stati progettati saggi ChIP (immunoprecipitazione della cromatina) per rilevare il legame del fattore di trascrizione in fase liquida. Il test Chip mostra che S0X2 e HuR legano alla regione del promotore di beta-tubulina III, IL15 e TSG6 e che l'applicazione meccanica di 97 x g regola in modo differenziale tale interazione (Figura 4).

S0X2 non vincola più il promotore beta-tubulina III dopo 20 minuti di applicazione della forza sopra citata , quindi la trascrizione di beta-tubulina III è migliorata .

La trascrizione incrementata di TSG6 appare regolata dalla perdita del legante HuR, mentre IL15 è probabilmente regolata da altri fattori diversi da Sox2 e HuR.

Le cellule staminali da tessuto adiposo sono state purificate da grasso umano raccolto attraverso microliposuzione in anestesia locale tumescente con microcannule di Coleman .

E' ovviamente possibile utilizzare anche altre procedure di asportazione del tessuto adiposo.

Seguendo questa procedura , il tessuto adiposo lipoaspirato è stato centrifugato in un sistema chiuso sterile a 2000 rpm per 10 minuti e il pellet è stato digerito con collagenasi per mezz'ora a 37°C.

Il digerito viene centrifugato per separare la popolazione fluttuante di adipociti maturi dalla frazione vascolare stromale (SVF) .

Dopo 24 ore su piastra in un terreno standard (Dulbecco Modified Eagle Medium con aggiunta di 10% fetale bovino) , le cellule non aderenti sono state rimosse .

La popolazione di cellule che aderiscono alla plastica individua le cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) .

Partendo dal tessuto adiposo sottoposto ad una forza 97 x g, un metodo efficace , che evita il trattamento enzimatico , e riproducibile per 1 'isolamento e 1 'espansione di hADSCs (human adipose deriva ted stem cells, cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano) è stato sviluppato attraverso la modifica dei metodi descritti da Matsumoto et al., 2007 e Perrini S. et al., 2013.

Il tessuto adiposo lipoaspirato e trattato con una forza di 97 x g è stato posto in fiasche di coltura da 25 cm2 (NUNC, Roskilde , Danimarca) completamente riempite di terreno di coltura . Questo permette 1 'adesione del tessuto al soffitto della piastra.

Dopo 2 settimane di coltura il tessuto adiposo viene rimosso , la fiasca viene capovolta e le cellule vengono mantenute in coltura.

Le cellule raggiungono la confluenza del 90% in 30 giorni.

La resa di cellule è circa 5,5-6 x 105 cellule per ogni piastra contenente 2 mi di tessuto adiposo trattato meccanicamente.

La morfologia in vivo (catturata mediante apparecchiature a microscopio EVOS®, AMG, USA) di queste cellule mostra un fenotipo tipo-fibroblasti paragonabile a quello delle cellule ottenute con metodi classici (figura 5A e 5B).

Queste cellule staminali mesenchimali mostrano la tipica espressione di beta-tubulina III (TUJ1) e vimentina (Figura 6).

Le cellule hADSCs (human adipose derivated stem cells , cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano) isolate attraverso il protocollo sopra descritto esprimono i marcatori mesenchimali secondo 1 'analisi FACS (figura 7) con valori elevati (90-100%) per i noti marcatori mesenchimali tipici (come CD44, CD73, CD90 e CD166) , un valore medio per il tessuto endoteliale (CD31 , CD34, CD144, CD146, KDR) e una rappresentazione minima per il tessuto ematopoietico (CD45, CD133, CD56) (Figura 7). Ciò potrebbe suggerire che queste cellule possono anche essere soggette a un destino endoteliale.

Per studiare la stabilità cromosomica di hADSCs ottenute dal tessuto adiposo attivato meccanicamente secondo la presente invenzione , è stato eseguito un bandeggio QFQ . Le cellule non hanno presentato alcun riarrangi amento cromosomico e il numero dei cromosomi era normale dopo ben 9 passaggi in coltura (Figura 8A e 8B).

La generazione di sferoidi è normalmente limitata a cellule staminali neurali , qui è stato dimostrato che anche hADSCs da grasso attivato secondo la presente invenzione formano neurospere.

Le hADSCs (human adipose derivated stem cells, cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano) sono state incubate con terreno privo di siero normalmente utilizzato per la formazione di neurosfere (Gritti et al., 2002).

Il saggio di formazione delle sfere è stato eseguito con piastratura 5xl03/cm2 . Circa il 50% delle hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente , secondo la presente invenzione , ha formato grandi sferoidi raggiungendo un diametro medio di 100 micron a 21 giorni di coltura (Figura 9).

Circa il 50% delle hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente hanno formato grandi sferoidi che hanno raggiunto un diametro medio di 100 micron a 21 giorni di coltura, e formando una media di 100,95 ± 10,89 sfere / cm2 entro 21 giorni (Figura 9).

Cellule precursori neurali adulte murine (NPCs) ottenute dalla zona sub ventricolare sono state usate come controllo positivo: in questo caso la formazione di sfere era ovviamente superiore (Figura 9).

Il coinvolgimento di S0X2 nel regolare 1 'espressione delle citochine sopra citate è stato anche studiato in cellule isolate da tessuto adiposo trattato con una forza 97 x g.

Il saggio Chip mostra che S0X2 lega alla regione promotore di beta-tubulina III , IL15 e TSG6 (Figura 10) . Così 1 'attivazione in vivo è mantenuta anche da hADSCs derivate dal metodo oggetto della presente invenzione .

Rapporti recenti suggeriscono che le MSCs (mesenchimal stem cells , cellule staminali mesenchimali) sono in grado di modulare l'infiammazione (Prockop et al., 2013).

THP-1 è una categoria di cellule in sospensione singola e rotonda, con marcatori monocitici distinti e somiglianti a monociti primari e macrofagi nella morfologia e nella proprietà di differenziazione (Tsuchiya et al., 1980).

L 'interleuchina-ΐβ (IL-Ιβ) è un potente mediatore dell 'infiammazione e della risposta immunitaria , prodotta principalmente dai monociti attivati (Dinarello, 1994) .

La stimolazione dei monociti con endotossina batterica lipopolisaccaride (LPS) induce la produzione di IL-Ιβ tramite attivazione del gene pro-IL-1 , espressione del pro-IL-Ιβ mRNA, e successiva traduzione del messaggio pro-IL-Ιβ.

Pro-IL-Ιβ viene processato verso il maturo e biologicamente attivo IL-Ιβ dall'enzima di conversione cisteina proteasi interleuchina-1 (Kostura et al., 1989) .

L'azione anti-infiammatoria di hADSCs ottenute da tessuto adiposo meccanicamente attivato è stata valutata in un test di co-coltura (trans -well®) con cellule THP1 attivate con LPS (10 microgrammi/mi ; per 3 ore).

Come riportato in figura 11 il rilascio di IL-Ιβ è massimo 3 ore dopo la stimolazione con LPS, e la presenza di hADSCs ottenute da tessuto adiposo meccanicamente attivato ha ridotto significativamente la secrezione di chemochina (Figura 11).

Un esperimento simile basato sulla reazione di rilascio di IL-lbeta da monociti THP1 attivati da LPS ( (10 microgrammi/ml ; per 3 ore) (CTRL ) è stato eseguito per confrontare 1 'azione di hADSCs ottenute dal tessuto adiposo attivato (celi 10) con quelli da tessuto adiposo lipoaspirato (LS) .

In figura 12 è mostrato che THP1 rilascia IL-lbeta e tale rilascio è raddoppiato dall 'aggiunta di LPS. L 'aumento del rilascio di IL-lbeta viene eliminato dalle cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo attivato meccanicamente secondo il metodo della presente invenzione , mentre quelle da lipoaspirato hanno un effetto marginale trascurabile (Figura 12) .

L 'attività anti-infiammatoria di hADSCs da tessuto adiposo attivato secondo il metodo oggetto della presente invenzione viene anche evidenziato dai seguenti esperimenti riportati di seguito .

Nella figura 13 è mostrato che monociti attivati da LPS (THP1 LPS) esprimono alti livelli di citochine infiammatorie , anche in presenza di cellule staminali derivate da lipoaspirato (LS); questi livelli si riducono drasticamente quando questi monociti sono coltivati in presenza di hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione (Figura 13) . E' anche dimostrato che la produzione del peptide antiinfiammatorio TSG6 è fortemente implementata da hADSCs derivate da tessuto adiposo attivato con il metodo oggetto della presente invenzione.

Oggetto della presente invenzione sono le hADSCs ossia di cellule staminali mesenchimali ottenute da tessuto adiposo , umano od animale , attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione per l'uso come medicamento.

In particolare trovano applicazione in terapia cellulare applicata sia all'uomo che all'animale.

Oggetto della presente invenzione sono anche le hADSCs ossia di cellule staminali mesenchimali ottenute da tessuto adiposo , umano od animale , attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione per 1'uso nel trattamento di disfunzioni motorie e di coordinazione , ad esempio in pazienti affetti da Parkinson.

Il recupero di disfunzioni motorie in un modello di malattia di Parkinson è stato studiato mediante test con griglia orizzontale e verticale ("horizontal grid test" e "vertical grid test").

Il grafico riportato in figura 14 mostra che i topi perdono rapidamente il coordinamento degli arti anteriori e posteriori dopo esposizione a MPTP , tale disfunzione è consolidata al 10° giorno post lesione, quando viene eseguito 1 'innesto cellulare intrastriatale .

Già 3 giorni dopo il trapianto (13° giorno) le hADSCs ottenute con il metodo oggetto della presente invenzione avviano un graduale miglioramento della coordinazione degli arti, mostrando un decremento nella percentuale di errori di movimento delle zampe anteriori, che 10 giorni dopo è del 60-70% negli animali MPTP e circa il 25% in animali trattati con hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione .

Questi risultati positivi sono stati osservati anche eseguendo il test "vertical grid".

Un tempo significativamente maggiore per girarsi sulla griglia e scendere verso il basso sulla griglia posta verticalmente sono stati rilevati nei topi trattati con MPTP, rispetto al controllo (Figura 15).

Topi trattati con hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione mostrano un miglioramento già al giorno 3 dopo l'iniezione (Figura 15).

Le prestazioni degli animali è nettamente migliorata anche nei giorni successivi.

E ' noto che le cellule di microglia , cellule dell 'immunità innata residenti nel cervello , sono implicate come collaboratori attivi al danno neuronaie nelle malattie neurodegenerative , in cui la sovraattivazione e la disregolazione delle microglia potrebbe comportare disastrose progressive conseguenze neurotossiche .

L 'infiammazione è un componente di base di una vasta gamma di malattie neurodegenerative e della loro neuropatologia associata , e sempre maggiori evidenze suggerisce che le microglia siano un fattore causale chiave in questo processo.

La microglia attivata é presente vicino a neuroni in degenerazione nella substantia nigra di pazienti con malattia di Parkinson e di quelli con altri sindromi parkinsoniane (McGeer et al., 1988, Langston et al., 1999, Inamura et al., 2003).

L'attivazione di microglia in questa malattia non è limitata alla substantia nigra , ma si trova anche nel putamen , nell 'ippocampo , nell corteccia transentorinale , nella corteccia cingolata e nella corteccia temporale (Inamura et al., 2003).

La perdita selettiva di neuroni dopaminergici (DA) nella substantia nigra potrebbe essere dovuto a molti eventi negativi , come carenza glutatione per neuroni dopaminergici (risultante in una ridotta capacità antiossidante) , elevato contenuto di DA (molecola attiva redox) nei neuroni nella substantia nigra (Sigmund et al., 2002), elevate concentrazioni di ferro (Secca et al ., 2004) (elementi redox attivi) ed un incremento di microglia nella substantia nigra (Lawson et al., 1990) rispetto ad altre regioni.

Pertanto , neuroni dopaminergici nella substantia nigra potrebbero essere particolarmente vulnerabili agli attacchi infiammatori a causa della loro equilibrio redox precario e co-localizzazione con una grande popolazione di microglia.

Il trapianto in topo di hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente tramite il metodo oggetto della presente invenzione modifica il profilo genetico del cervello del topo.

In particolare , si è osservato 1 'effetto del trapianto sulla regolamentazione dei long non-coding RNA coinvolti nei processi infiammatori, come lincRNA-Cox2 (Gomez et al., 2013).

Il genoma di mammifero "junk DNA" codifica per molte migliaia di grandi trascritti non codificanti , tra cui una classe di grandi RNAs non codificanti intergenici (lincRNAs) , tra di essi alcuni sono stati funzionalmente caratterizzati per il loro ruolo biologico da Guttman e collaboratori (Guttman et al., 2011) che ha eseguito studi sulla perdita di funzione su lincRNAs espressi nelle cellule staminali embrionali di topo (ESCs) e caratterizzato gli effetti sull 'espressione genica.

Recenti studi hanno individuato migliaia di lunghi RNAs non codificanti (lncRNAs) in genomi di mammifero (Birney et al., 2007, Guttman et al., 2009-2012), che regolano 1 'espressione genica in diversi processi biologici (Guttman et al., 2011). LncRNAs sono regolati in modo differenziale nelle cellule infettate da virus e cellule dendritiche dopo stimolazione con lipopolisaccaride (LPS) .

L 'espressione lincRNA-C0X2 è stata studiata mediante RT-PCR in un 'area del cervello differente (nella corteccia , nello striato e nell 'ippocampo di animali con Parkinson indotto da MPTP e 4 giorni dopo 1 'iniezione di cellule staminali). L 'espressione di lncRNA-C0X2 è indotta in topi affetti di Parkinson e la sua espressione sembra essere in relazione con la presenza HuR come dimostrato dalla sua coimmunoprecipitazione nel saggio RIP (RNA ImmunoPrecipitazione) eseguita su striato omogeneizzato .

L 'espressione lncRNA-C0X2 è fortemente downregolata dalla iniezione intrastriatale di hADSCs ottenute dal tessuto adiposo attivato meccanicamente con il metodo oggetto della presente invenzione (MPTP/MSC; figure 16A-D) . La down-regolazione di lncRNA-C0X2 è strettamente correlata con il recupero della funzione da parte dell animale, come dimostrato dalle prove comportamentali (figure 16A-D) .

L 'espressione di lncRNA C0X2 è stato anche indagato tramite FISH (ibridazione fluorescente in situ) un approccio che permette di individuare e localizzare specifici RNA target (mRNA, lncRNA e miRNA) nelle cellule , cellule tumorali circolanti, e carpioni di tessuto (Figura 17).

Recentemente è stato dimostrato che linRNA Cox2 up-regola 1 'espressione di IL-6, agendo sul suo promotore (Carpenter et al 2013).

I livelli di espressione di IL-6 mRNA sono stati studiati mediante real-time RT-PCR in aree cerebrali di topi affetti da Parkinson e topi affetti da Parkinson trattati con hASDCs oggetto della presente invenzione .

Come indicato in figura 181'espressione di IL-6 è significativamente aumentata ed è fortemente contrastata dall'iniezione intrastriale di hADSCs oggetto della presente invenzione.

E' stato studiato il meccanismo con cui le hADSC possono down-regolare 1'espressione di lincRNA-C0X2 dopo essere state innestate nel cervello danneggiato del ricevente , e poi guidare il processo di recupero.

LincRNA-C0X2 è stato studiato in esperimenti in vitro su glia primarie attivate con MPTP.

L 'espressione di lncRNA- C0X2 è stata studiata mediante RT-PCR ed è stata indotta dal trattamento con MPTP di colture primarie di glia (3 ore a 37°C).

Analisi FISH hanno confermato che lncRNA- C0X2 è espresso in cellule GFAP positive (cioè cellule girali) e la sua localizzazione cellulare è correlata alla distribuzione cellulare HuR (Rna ImmunoPrecipitazione) .

La proteina legante RNA HuR / ELAVL1 si lega agli elementi AU-rich (AREs) promuovendo la stabilizzazione e la traduzione di un certo numero di mRNA nel citoplasma , determinando il loro destino (D 'Agostino et al., 2013).

Gli esperimenti eseguiti mostrano che 1 'interazione con HuR sembra necessaria anche per 1 'attivazione di microglia , come indicato dalla colorazione per IBA1 .

IBA1 è una proteina specificatamente espressa in macrofagi/microglia ed è up-regolata in microglia dopo lesione del nervo , ischemia del sistema nervoso centrale , e diverse altre patologie del cervello . L'incubazione di colture primarie di cellule girali con MPTP o LPS per 3 ore aumenta notevolmente la colorazione con anticorpi specifici anti-IBAl (Figure 19A-B) .

Il trattamento con diidrotansione (DI) , un inibitore di HuR biding RNAs che provoca la sua mislocalizzazione nel citoplasma determina la lnRNA-Cox2 down-regulazione sia in cellule trattate con MPTP o LPS (Figure 19A-B). Tale diminuzione corrisponde alla contrazione dell 'aumento di IL-6 mRNA (Figure 19A-B).

Anche il trattamento BAY11-7083, un inibitore specifico di lnRNA-C0X2 tramite il blocco di NFkB , contrasta 1 'aumento dei livelli di IL6 mRNA.

Inoltre , nelle stesse condizioni sperimentali , cellule microgliali sono state incubate con il supernatante delle colture di hADSCs.

La figura 20 mostra che il supernatante condizionato con hADSCs, derivate dal grasso attivato meccanicamente , è in grado di contrastare in particolare 1 'espressione di lnRNA C0X2 e IL-6 in cellule girali primarie MPTP o LPS attivate.

L'espressione di lnRNA CONDÌ, un long non coding RNA riferito al promotore della ciclina DI, utilizzato come controllo negativo , non è stato modificato in nessuna delle condizioni sperimentate .

Il recupero delle funzioni motorie degli arti posteriori dopo trauma spinale è stato osservato nei topi dopo trapianto del tessuto adiposo meccanicamente attivato (MALS), mentre il lipoaspirato risulta inefficace (figure 21 e 22).

Il trauma spinale , indotto da una contusione provocata da un pistone del diametro di 1 mm che colpisce il midollo spinale toracico esposto a livello T9 con una forza di 70 Kdyne per 1 secondo, causa paralisi negli arti posteriori che migliora parzialmente , meno di 3 punti secondo la scala BMS (Basso Mouse Scale) (figura 22). Il trapianto di grasso lipoaspirato (LS)non provoca miglioramenti significativi , mentre il trattamento con MALS porta ad un grande miglioramento che supera i 6 punti secondo la scala BMS. 9 punti indicano una deambulazione normale .

Il tessuto adiposo meccanicamente attivato (MALS) oggetto della presente invenzione è stato applicato superficialmente sopra il midollo leso, ove penetra gradualmente riempiendo la zona di lesione e congiungendo i due monconi del midollo leso e permettendo la rigenerazione nervosa .

L'azione anti infiamma toria del tessuto adiposo meccanicamente attivato (MALS) è rapida e sopprime la produzione di citochine infiammatorie nel midollo leso. A 48 ore dalla lesione , i fattori rilasciati dal midollo leso abbattono la produzione di IL-1 alfa, IL-1 beta e IL-6 nel sito di lesione e nei monconi rostrali e caudali del midollo leso.

Da quanto sopra descritto, e con riferimento alle figure , appare evidente come 1'applicazione di una forza di agitazione orbitale con una intensità e per un tempo descritto e rivendicato nella presente invenzione consenta di attivare, con una manipolazione minima delle cellule, le proprietà antiinfiamma torie e le proprietà staminali delle cellule staminali mesenchimali presenti nel tessuto adiposo lipoaspirato od asportato con qualsiasi altra procedura dal corpo umano .

Il tessuto adiposo e/o le cellule staminali oggetto della presente invenzione possono essere quindi utilizzate a scopi terapeutici, od anche cosmetici, per la preparazioni di medicamenti da utilizzare nel corso di terapie cellulari.

Il tessuto e/o le cellule staminali mesenchimali ottenuto con il metodo oggetto della presente invenzione possono essere:

- per uso come medicamento,

- per l'uso nel trattamento di disfunzioni motorie e di coordinazione,

per 1'uso nel trattamento del morbo di Parkinson,

- per l'uso nel trattamento di traumi spinali. In particolare il trapianto di tessuto e/o cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo umano hADSCs , attivate meccanicamente come qui descritto e rivendicato , possono promuovere il rapido ripristino delle funzionalità motorie in pazienti che hanno perso o ridotto tale mobilità, come ad esempio in pazienti affetti dal morbo di Parkinson. Inoltre il tessuto adiposo attivato risulta molto efficace nel promuovere il recupero funzionale dopo lesione midollare grazie alle sue proprietà antiinfiamma torie e alla sua abilità di penetrare nella lesione e promuovere la rigenerazione nervosa.

Procedure sperimentali

Coltura cellulare

Due mi di tessuto adiposo attivato meccanicamente sono state inoculati in fiasche da 25 cm2 completamente riempite con terreno di coltura noto come "Dulbecco's modified Eagle' s Medium" (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) integrato con 20% di siero fetale bovino (FBS, JRH Bioscience , Lenexa , KS, Lot 6G2146) e incubate a 37°C in 5% di C02. Le fiasche sono state capovolte in modo che le cellule galleggino e aderiscano alla superficie superiore interna della parte in alto della fiasca. Dopo 15 giorni , il medium e il tessuto sono stati rimossi , e le fiasche capovolte in modo che le cellule possano ora essere sul fondo . Il medium è stato sostituito ogni 4 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza (90-95% dopo circa 30 giorni) .

Analisi istologiche di controllo e tessuti trattati meccanicamente lipoaspirato

Le analisi istologiche sono state eseguite sul tessuto adiposo fresco (con o senza trattamento meccanico) su campioni provenienti dal medesimo soggetto . In breve, campioni di tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina sono stati processati per 1 'esame istopatologico convenzionale e immunoistochimica . Sezioni di tessuto di spessore standard 4 micron colorate con ematossilina e eosina (H £ E) sono state esaminate al microscopio con luce diretta ad ampio campo. Per 1'immunoistochimica quattro campioni di paraffina sono stati sezionati (4pm spessore) , de-paraffinati , e ri-idratati in xilene e graduate concentrazioni di etanolo ad acqua distillata. Poi sono stati sciacquati con PBS , trattate con soluzione bloccante (PBS 1% V / V siero fetale bovino per 1 ora a temperatura ambiente) e incubate con anticorpi primari per una notte a 4°C. Dopo il trattamento con anticorpi primari , le sezioni sono state lavate con PBS e incubate con appropriati anticorpi secondari. L'attività perossidasica endogena è stata spenta con 3% di perossido di idrogeno in acqua distillata per 10 min. La colorazione è stata eseguita con 3,3 'diaminobenzidina (DAB) come cromogeno (kit di rilevamento DAKO EnVision) . Nelle valutazioni di controllo , gli anticorpi primari sono stati omessi e sostituiti con concentrazioni equivalenti di IgG non correlati , della stessa sottoclasse . Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: Vimentina (1: 5000; Dako Cytomatic) ; S100 (1: 2000; Novocastra) ; βtubulina III (1: 6000, Covance); Nestin umana (1: 2000; Millipore) ; Nanog (1: 1000; Novus).

Per gli studi di immunofluorescenza , le cellule sono state lavate con PBS, fissate con paraformaldeide (4% in PBS) trattati con una soluzione bloccante e incubate con 1 'anticorpo primario anti β-tubulina III (1: 6000; Covance) per una notte a 4 ° C.

Dopo il trattamento con 1 'anticorpo primario, le sezioni sono state lavate con PBS e incubate con anti corpo secondario (Alexa Fluor® 555 di capra antitopo 1: 200 Molecular Probes® , Invitrogen , Life Technologies Italia, Monza , Italia) per 2 ore a temperatura ambiente . I nuclei sono stati colorati con DAPI (Hoechst 1/1000) e poi montati utilizzando il reagente Fluor Save (Calbiochem, Merck chimica , Darmstadt , Germania) e analizzati al microscopio immunofluorescenza (Leica 5500) . Come riferimento negativo per 1 'analisi confocale è stata usata una sezione consecutiva che era stata colorata omettendo 1 'anticorpo primario anti β-tubulina III e rimpiazzandola con concentrazioni equivalenti di IgG non correlato , della stessa sottoclasse.

Estrazione di RNA e analisi qRT-PCR.

RNAs cellulari sono stati estratti utilizzando TRI Reagent® (Sigma -Aldrich, St. Luis, MO, USA) secondo le istruzioni del produttore . Purezza e quantità dell'RNA sono state valutate tramite NanoDr op (Fisher Scientific) (A260/A280 1,8-2 è stato considerato adatto per ulteriori analisi), la possibile contaminazione del DNA è stato rimossa, e cDNA è stato preparato da 1 mg di RNA usando il kit "high Capaci ty RNA-to-cDNA" (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA).

Espressione genica nei tessuti adiposi.

Risultati quantitativi sono stati ottenuti tramite il saggio SYBR-Green in tempo reale (Euroclone spa Milano, ITALIA) su RNA totale estratto utilizzando TRI Reagent® (Sigma -Aldrich, St. Luis , MO , USA) trattato con DNasi I - RNasi free (Ambion ine . Foster City CA, USA) e retro trascritto utilizzando il kit "high Capacity cDNA Reverse Kit Transcription" (Ambion ine . Foster City CA, USA) come raccomandato dal produttore . I geni espressi in maniera differenziale sono stati riconosciuti applicando una soglia di significatività sul t test a varianza diseguale ChIP sul tessuto adiposo

Immunoprecipitazione di cromatina è stata eseguita su 1 mi di tessuto adiposo lipoaspirato trattato meccanicamente o non trattato, come descritto in Haim et al., 2013.

Analisi G-banding del cariotipo

Analisi citogenetiche sono state effettuate su colture "in situ" ottenute inoculando hADSCs direttamente su un vetrino all 'interno piastre Petri contenenti 2 mi di terreno (ccMEM). Le cellule sono state trattate con Colcemid (0,02 ml/ml) (Life Technologies a Carlsbad, California , Stati Uniti d'America) per 90 minuti, soluzione ipotonica (1:1 Na citrato 1% : NaCl 0,3%) (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, Stati Uniti d'America ) e soluzione fissativa di 3:1 metanolo :acido acetico (VWR International Radnor , Pennsylvania , Stati Uniti d'America), sostituita due volte. Almeno venticinque QFQ metafasi QFQ banding sono state osservate per ogni campione. L 'immagine è stata acquisita utilizzando un microscopio a fluorescenza (BX 60 Olympus) e analizzata con il sistema Powergene PSI.

Formazione sferoidi

hADSCs derivate da tessuto lipoaspirato attivato meccanicamente sono state coltivate in terreno alfa-MEM con siero fetale bovino (20%) per raggiungere 85% di confluenza al passaggio 1 .Il terreno Alpha MEM è stato rimosso , le cellule sono state lavate due volte con PBS sterile, quindi è stato aggiunto terreno per neurosfere contenente bFGF (20 ng / mi) e FEG (10 ng / mi) in assenza di siero (Gritti et al 2002).

Coltura cellulare THP-1 le cellule cultura e attivazione con LPS

Cellule THP-1 (202-TIB, ATTC, Rockville, MD) sono state coltivate in sospensione in RPMI 1640 media integrato con 10% di siero fetale bovino (FCS), 50 U/ml di penicillina, e 50 mg/ml di streptomicina in fiasche da 150 cm2 . Le colture cellulari e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 37°C in 5% di C02 e 95% aria ambiente. Le cellule sono state passate ogni 3 giorni e utilizzate tra i passaggi 3 e 12. L 'azione anti -infiammatoria delle cellule hADSCs è stata analizzata nel sistema di coltura trans-well ® su 6 piastre .

hADSCs sono state piastra te nel pozzetto sotto alla densità di 1 ,5x104 cellule/pozzetto in terreno alfa-MEM. Ventiquattro ore dopo la loro adesione le cellule THP-1 sono state aggiunte nel superiore alla densità di 75 x 104 cellule/pozzetto. Per indurre il rilascio di IL-1 beta , il lipopolisaccaride (LPS) è stato somministrato alla concentrazione finale di 10 microgrammi /mi . Dopo tre ore di incubazione , i surna tanti sono stati raccolti in ghiaccio ed immediatamente congelati. Il rilascio IL-1 beta è stato studiato mediante immunoblotting.

Modello animale sperimentale per la malattia di Parkinson e iniezione cellulare

MPTP (l-metil-4-fenil-l ,2,3,6-tetraidropiridina) è un precursore di neurotossina MPP+, che causa sintomi permanenti del morbo di Parkinson, distruggendo neuroni dopaminergici nella substantia nigra del cervello. E' stato utilizzato per studiare modelli di malattia in vari studi su animali.

L'iniezione di MPTP provoca una rapida insorgenza del parkinsonismo , quindi gli utenti di MPPP contaminati con MPTP svilupperanno questi sintomi. Dopo due mesi, i topi C5BL/6J sono stati sottoposti a una prima iniezione i .p . di MPTP (36 mg/kg). Disfunzioni motorie sono state valutate ogni 2 giorni per i seguenti 7 giorni , poi gli animali sono stati sottoposti a una seconda iniezione (20mg/kg). Dopo 3 giorni (giorno 10) 1 'iniezione di cellule è stata eseguita tramite chirurgia stereotassica nello striato . Coordinate in relazione al bregma erano: 0,1 millimetri posteriori, 2,4 millimetri mediolaterale, e 3,6 millimetri dorsale. Il gruppo di controllo è stato iniettato con solo 5 mi di PBS sterile o con hADSCs ottenute da tessuto adiposo attivato meccanicamente .

Marcatura delle cellule PKH26

I kit "PKH26 celi linker" forniscono marcatura fluorescente di cellule vive per un periodo di tempo, prolungato senza effetti tossici apparenti . I kit "fluorescent linker" sono efficaci per una varietà di tipi cellulari e non mostrano perdite significative, o transfer da cellula a cellula. Forniscono una marcatura delle cellule fluorescente stabile , chiara, intensa, precisa e riproducibile . Per esperimenti di trapianto sono state iniettate 1x105 cellule in ogni animale .

Prima di ogni trapianto le hADSCs sono state marcate con PKH26 e la colorazione è stata eseguita secondo il protocollo del produttore (Sigma - Aldrich ®) . Per l'iniezione cellule positive PKH26 sono state sciolte in PBS sterile a una concentrazione di 1 x 105 cellule/5pl .

Valutazione delle disfunzioni motorie Cambiamenti nel livello di deficit motorio possono essere utilizzati come un modo non invasivo di valutazione di alterazioni nel numero di neuroni DArgic e/o nellala quantità di DA in modelli animali di PD , come topi somministrati sistematicamente con 1-metil-4-fenil 1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) . In questo studio deficit motori DA-associati sono stati valutati con "vertical grid test" e "horizontal grid test".

Nel dispositivo per "horizontal grid test" quando il topo ha afferrato saldamente le griglie con tutte e quattro le zampe, il dispositivo è stato capovolto e 1 'animale è stato videoregistrato per una durata massima di 30 secondi.

Ad ogni passo, la zampa può cadere o scivolare tra il filo della griglia. Questo è stato registrato come "passo- sbagliato" . Sono stati registrati il numero totale di passi (movimento di ogni zampa anteriore) che il topo ha utilizzato per attraversare la griglia, e il numero totale di sbagli per ogni zampa anteriore.

Il test su griglia verticale è stato eseguito posizionando il topo a 3 cm dal bordo superiore di una griglia verticale , rivolto verso 1 'alto, ed è stato filmato mentre ruotava su se stesso e scendeva giù lungo la griglia. E' stato misurato il tempo impiegato per scendere giù partendo da detto bordo superiore.

Il recupero delle funzioni motorie degli arti posteriori dopo trauma spinale , indotto da una contusione provocata da un pistone del diametro di 1 mm che colpisce il midollo spinale toracico esposto a livello T9 con una forza di 70 Kdyne per 1 secondo, è stato valutato osservando 1'uso degli arti posteriori nel test di " free locomotion" o " deambulazione libera". La scala utilizzata (BMS, Basso Mouse Scale) descrive i vari livelli di recupero della motilità da 0 che indica paralisi degli arti posteriori a 9, che indica camminata normale . Il valore raggiunto dal trattamento con salina e dal lipoaspirato era intorno ai 3 punti (posizionamento plantare della zampa con scarsa abilità di supporto del corpo) mentre MALS portava a superare i 6 punti di scala corrispondente ad un frequente o consistente posizionamento plantare e prevalentemente coordinato delle zampe con supporto del corpo.

Claims (2)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per la promozione delle proprietà antiinfi aromatorie e di miglioramento della capacità di riparazione di un tessuto contenente cellule staminali mesenchimali (MSCs) caratterizzato dal fatto che comprende almeno un passo di attivazione meccanica eseguita tramite 1 'applicazione di una forza di agitazione orbitale su tessuto adiposo lipoaspirato od asportato dal corpo.
2. 2) Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la forza applicata ha una intensità compresa tra 40 e 120 x g, 3) Metodo secondo 1a rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che la forza applicata ha una intensità pari a 97 x g. 4) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detta forza è applicata per un tempo compreso tra 3 e 20 minuti. 5) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detta forza è applicata per 10 minuti. 6) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detto passo di attivazione meccanica con applicazione di una forza di scuotimento orbitale è ripetuto due o più volte con intensità di forza per ciascun passo uguale o diversa e/o con durata di applicazione della forza per ciascun passo uguale o diversa. 7) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che detto tessuto adiposo lipoaspirato è crioconservato . 8) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede un passo di isolamento ed espansione delle cellule staminali mesenchimali contenute in detto tessuto adiposo lipoaspirato o rimosso dal corpo (ADSCs). 9) Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che il passo isolamento ed espansione delle cellule staminali mesenchimali contenute in detto tessuto adiposo lipoaspirato o rimosso dal corpo (ADSCs) comprende : - inoculazione di 2 mi di tessuto adiposo attivato meccanicamente in una fiasca da 25 cm2 completamente riempita con terreno di coltura "Dulbecco' s modified Eagle 's Medium" (DMEM) integrato con 20% di siero fetale bovino; - incubazione a 37°C in 5% di C02; capovolgimento della fiasca in modo che le cellule galleggino e aderiscano alla superficie superiore interna della parte in alto della fiasca; - rimozione del terreno di coltura e del tessuto dopo 15 giorni e capovolgimento della fiasca in modo che le cellule possano ora essere sul fondo; sostituzione del terreno di coltura ogni 4 giorni fino al raggiungimento della confluenza cellulare del 90-95%. 10) Tessuto adiposo lipoaspirato o rimosso dal corpo contenente cellule staminali mesenchimali (MSCs) caratterizzato dal fatto che è ottenuto con un metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 8, il quale tessuto presenta migliorate proprietà anti -infiammatorie e migliorata capacità di riparazione, essendo in detto tessuto: eliminata 1'espressione di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ; - aumentata sensibilmente 1'espressione del suo inibitore naturale TSG6 e dell 'interleuchina 15; migliorata notevolmente 1'espressione di leptina , ed essendo incrementati i parametri che definiscono la staminalità quali l'espressione di geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog), di beta-tubulina III e di TSG6 mRNA. 11) Cellule staminali mesenchimali contenute in tessuto adiposo lipoaspirato o rimosso dal corpo (ADSCs) caratterizzate dal fatto che sono ottenute con un metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 9, le quali cellule presentano migliorate proprietà anti -infiammatorie e migliorata capacità di riparazione , essendo in detto tessuto: eliminata 1'espressione di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ; - aumentata sensibilmente 1'espressione del suo inibitore naturale TSG6 e dell 'interleuchina 15; migliorata notevolmente 1'espressione di leptina , ed essendo incrementati i parametri che definiscono la staminalità quali l'espressione di geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog), di beta-tubulina III e di TSG6 mRNA. 12) Tessuto adiposo lipoaspirato od asportato dal corpo contenente cellule staminali mesenchimali (MSCs) ottenuto con un metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 8, il quale tessuto presenta migliorate proprietà anti -infiammatorie e migliorata capacità di riparazione , essendo in detto tessuto : eliminata 1'espressione di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ; - aumentata sensibilmente 1'espressione del suo inibitore naturale TSG6 e dell 'interleuchina 15; migliorata notevolmente 1'espressione di leptina , ed essendo incrementati i parametri che definiscono la staminalità quali l'espressione di geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog), di beta-tubulina III e di TSG6 mRNA, il quale tessuto è per l'uso come medicamento, 13) Tessuto secondo la rivendicazione 12 per l'uso nel trattamento di disfunzioni motorie e di coordinazione . 14) Tessuto secondo la rivendicazione 12 per l'uso nel trattamento del morbo di Parkinson . 15) Tessuto secondo la rivendicazione 12 per l'uso nel trattamento di traumi spinali. 16) Cellule staminali mesenchimali contenute in tessuto adiposo lipoaspirato od asportato dal corpo contenente ed ottenute con un metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 9, le quali cellule presentano migliorate proprietà antiinfiammatorie e migliorata capacità di riparazione , essendo in dette cellule: eliminata 1'espressione di citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-alpha (TNF-alfa) ; - aumentata sensibilmente 1'espressione del suo inibitore naturale TSG6 e dell 'interleuchina 15; migliorata notevolmente 1'espressione di leptina , ed essendo incrementati i parametri che definiscono la staminalità quali l'espressione di geni legati alla pluripotenzialità (S0X2, 0CT4, Nanog), di beta-tubulina III e di TSG6 mRNA, le quali cellule sono per l'uso come medicamento. 17) Cellule staminali mesenchimali secondo la rivendicazione 16 per 1'uso nel trattamento di disfunzioni motorie e di coordinazione. 18) Cellule staminali mesenchimali secondo la rivendicazione 16 per 1'uso nel trattamento del morbo di Parkinson. 19) Cellule staminali mesenchimali secondo la rivendicazione 16 per 1'uso nel trattamento di traumi spinali.