ES2468250T3 - Compuestos antimicrobianos - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (II) AA1-AA2-AA1-X-Y-Z (II) en la que: AA2 es un aminoácido catiónico; AA2 es un aminoácido seleccionado de tributil triptófano (Tbt) o un derivado de bifenilalanina seleccionado de Phe (4-(2-Naftilo)), Phe (4-(1-Naftilo)), Bip (4-n-Bu), Bip (4-Ph) y Bip (4-T-Bu); X es un átomo de N, que puede estar sustituido con un grupo arilo o alquilo C1-C10 ramificado o sin ramificar, cuyo grupo puede incorporar hasta 2 heteroátomos seleccionados de N, O y S; Y representa -Ra-Rb- en la que Ra es C y Rb es C; cada uno de Ra y Rb puede estar sustituido con grupos alquilo C1-C4 o sin sustituir; y Z es un grupo que comprende 1 grupo cíclico de 5 ó 6 átomos distintos de hidrógeno, y el grupo cíclico puede estar sustituido; el resto Z incorpora un máximo de 15 átomos distintos de hidrógeno; y en la que el enlace entre Y y Z es un enlace covalente entre Ra o Rb de Y y un átomo distinto de hidrógeno del grupo cíclico de Z, en el que dicho compuesto es un péptido

Description

Compuestos antimicrobianos

La presente invención se refiere a moléculas bioactivas, en particular a p�ptidos que exhiben actividad antimicrobiana.

Los p�ptidos y sus derivados se han reconocido durante mucho tiempo como moléculas terapéuticamente interesantes. Una amplia diversidad de organismos usan p�ptidos como parte del mecanismo de defensa del hospedador. Se han aislado p�ptidos antimicrobianos de especies tan diversas como bacterias y mamíferos. En general, estos p�ptidos tienen una carga neta positiva y una propensión a formar estructuras anfif�licas de hélices α

o láminas β tras la interacción con la bicapa fosfolip�dica externa en las membranas de las células bacterianas. En la mayoría de los casos, se desconocen los mecanismos moleculares detallados de la acción de los antibióticos, aunque se cree que ciertos p�ptidos clasificados como p�ptidos de clase L (l�ticos) interaccionan con las membranas de las células bacterianas, probablemente formando canales de iones o poros.

La mayoría de los p�ptidos antibacterianos conocidos comprenden 10 o más, en general 20 o más amino�cidos, y este número de amino�cidos es necesario para proporcionar una longitud suficiente para que el p�ptido, en general en forma de hélice α, abarque la membrana celular bacteriana y forme un poro. Tal mecanismo es la manera generalmente aceptada en la que la mayoría de tales p�ptidos ejercen su actividad citot�xica.

La síntesis de los p�ptidos antibacterianos de la técnica anterior puede ser difícil, y en general requiere que los p�ptidos sean sintetizados por bacterias u otros organismos que se pueden cultivar y recolectar para proporcionar el p�ptido de interés, y normalmente son necesarias etapas de procesamiento adicionales tras el aislamiento del producto directo de la traducción. Si se pudieran identificar p�ptidos activos que fueran más cortos, esto posibilitar�a la fabricación económica mediante la síntesis a partir de los bloques de construcción de amino�cidos o di- o trip�ptidos disponibles. Además, los p�ptidos cortos ofrecerían ventajas para la bioadministraci�n. Existe una demanda creciente de antibióticos que se puedan administrar sin la necesidad de una inyección, tal como mediante inhalaci�n y absorción a través de los capilares sanguíneos de las fosas nasales.

La búsqueda de antibióticos nuevos se ha llevado a cabo con una urgencia particular, debido al número creciente de cepas bacterianas que est�n exhibiendo resistencia a los fármacos conocidos y usados de forma generalizada. Las personas que trabajan en los campos de la medicina, as� como en agricultura, protección medioambiental y seguridad alimentaria, necesitan constantemente agentes antibacterianos nuevos, y pueden tener que tratar a una población o lugar determinado con varios agentes antibacterianos diferentes para combatir de manera eficaz las bacterias indeseables.

Como se describió en el documento WO 01/66147, recientemente se ha demostrado que, de hecho, es posible generar moléculas antibióticas pequeñas, en particular p�ptidos, que se cree que actúan por medio de la desestabilizaci�n de la membrana.

Haug (Antibacterial peptides containing non-coded aromatic amino acids, , Universidad de Tromso) describe, entre otros, la preparación de di- y trip�ptidos antibacterianos cati�nicos.

Svenson et al. (J. Med. Chem., 2007, 50, 3334-3339) se ocupa de la unión a albúmina de microp�ptidos antimicrobianos cati�nicos cortos y su influencia sobre el efecto bactericida in vitro.

Haug et al. (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 17, (2007), 2361-2364) se ocupa de la aplicación del acoplamiento cruzado de Suzuki-Miyaura para incrementar la potencia antimicrobiana en la generación de agentes antibacterianos.

Los presentes inventores han identificado un pequeño grupo de p�ptidos modificados que exhiben una serie impresionante de características, en particular una combinación útil de actividad antimicrobiana, toxicidad baja y estabilidad, es decir, resistencia a la degradación enzim�tica.

As�, en un aspecto se proporciona un compuesto, que es un p�ptido, de fórmula (II)

AA1-AA2-AA1-X-Y-Z (II)

en la que:

AA1 es un amino�cido cati�nico, preferiblemente lisina o arginina, pero puede ser histidina o cualquier amino�cido no codificado genéticamente o modificado que porta una carga positiva a pH 7,0.

AA2 es un amino�cido con un grupo R lip�filo grande seleccionado de tributil tript�fano (Tbt) o un derivado de bifenilalanina seleccionado de Phe (4-(2-Naftilo)), Phe (4-(1-Naftilo)), Bip (4-n-Bu), Bip (4-Ph) y Bip (4-T-Bu);

X es un átomo de N, que puede estar sustituido, pero preferiblemente no est� sustituido, con un grupo arilo o alquilo C1-C10 ramificado o sin ramificar, p.ej. metilo, etilo o fenilo, y este grupo puede incorporar hasta 2 hetero�tomos seleccionados de N, O y S;

5 Y representa -Ra-Rb- en la que

Ra es C y

10 Rb es C; cada uno de Ra y Rb puede estar sustituido con grupos alquilo C1-C4 o sin sustituir, preferiblemente Y es -Ra-Rb- en el que Ra es C y -Ra-Rb- no est� sustituido; y

Z es un grupo que comprende 1 grupo cíclico de 5 � 6 átomos distintos de hidrógeno (preferiblemente átomos de C), el anillo puede estar sustituido y estas sustituciones pueden incluir, pero en general no incluirán, grupos polares, y

15 los grupos sustituyentes adecuados incluyen halógenos, preferiblemente bromo o flúor, y grupos alquilo C1-C4; el resto Z incorpora un máximo de 15 átomos distintos de hidrógeno, preferiblemente 5-12, lo más preferiblemente es fenilo;

el enlace entre Y y Z es un enlace covalente entre Ra o Rb de Y y un átomo distinto de hidrógeno del grupo cíclico de 20 Z.

Los amino�cidos no codificados genéticamente y los amino�cidos modificados adecuados que pueden proporcionar un amino�cido cati�nico incluyen los análogos de lisina, arginina e histidina, tales como homolisina, ornitina, ácido diaminobut�rico, ácido diaminopim�lico, ácido diaminopropi�nico y homoarginina, as� como trimetilisina y

25 trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidin-4-carbox�lico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidin-4-carbox�lico y 4guanidinofenilalanina.

Entre los compuestos anteriores, se prefieren ciertos compuestos. En particular, los compuestos en los que el amino�cido con un grupo R lip�filo grande, mencionado de manera conveniente en la presente memoria como AA2, 30 se selecciona de Phe (4-(2-Naftilo)) y Tbt, son los más preferidos.

Otro grupo preferido de compuestos son aquellos en los que Ra y Rb est�n sin sustituir.

Un grupo preferido adicional de compuestos son aquellos en los que -X-Y-Z juntos son el grupo -NHCH2CH2Ph.

35 Los compuestos incluyen todas las formas enantiom�ricas, amino�cidos D y L y enanti�meros resultantes de los centros quirales en los grupos R de los amino�cidos y los restos Y o Z.

Los compuestos más preferidos son los siguientes: 40

Compuesto 1

Compuesto 2

En un aspecto adicional, se proporcionan compuestos de fórmula (II), para el uso en la terapia, en particular para el

5 uso como un agente antimicrobiano (p.ej. antibacteriano), pero también como un agente anti-tumoral. Las moléculas de la invención también son eficaces como agentes antif�ngicos, y su uso como tales en el tratamiento (que incluye la prevención) de las infecciones f�ngicas constituye aspectos adicionales de la presente invención. La onicomicosis es especialmente adecuada para el tratamiento con las moléculas de la invención. Las moléculas preferidas de la invención son activas como agentes tanto antif�ngicos como antibacterianos.

10 Tales moléculas antimicrobianas también tienen usos no terapéuticos, por ejemplo en agricultura o en situaciones domésticas o industriales como agentes esterilizantes para materiales susceptibles a la contaminación microbiana. As�, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso ex vivo de las moléculas de la invención como agentes antimicrobianos, en particular como agentes antibacterianos.

15 Las moléculas exhiben actividad antimicrobiana, en particular ejercen un efecto citot�xico por medio de un mecanismo directo que afecta a la membrana, y se pueden denominar agentes antimicrobianos que actúan sobre la membrana. Estas moléculas son l�ticas, y desestabilizan o incluso perforan la membrana celular. Esto ofrece una ventaja terapéutica diferente respecto de los agentes que actúan sobre o que interaccionan con los componentes

20 proteicos de las células seleccionadas como objetivo, p.ej. los receptores de la superficie celular. Aunque las mutaciones pueden dar como resultado formas nuevas de las proteínas seleccionadas como objetivo que conduzcan a la resistencia al antibiótico, es mucho menos probable que los cambios radicales en las membranas lip�dicas pudieran llegar a impedir el efecto citot�xico. El efecto l�tico provoca una muerte celular muy rápida, y as� tiene la ventaja de destruir las bacterias antes de que tengan la oportunidad de multiplicarse. Además, las moléculas pueden

25 tener otras propiedades útiles que destruyan o dañen a los microbios seleccionados como objetivo, p.ej. la capacidad de inhibir la síntesis de proteínas, y as� pueden tener actividad hacia múltiples objetivos.

Las moléculas de la invención se pueden usar para desestabilizar y/o permeabilizar las membranas celulares microbianas. 'Desestabilizar' significa una perturbación de la configuración tridimensional normal de la bicapa

30 lip�dica, que incluye, pero sin limitación, un estrechamiento de la membrana, una permeabilidad incrementada de la membrana (el general, sin implicar canales) al agua, iones o metabolitos, etc., que también altera los sistemas respiratorios de las bacterias.

Los amino�cidos β y γ, as� como los amino�cidos α, se incluyen en el término 'amino�cidos', que se pueden 35 considerar todos como unidades AA. Las moléculas de la invención incluyen los p�ptidos beta y depsip�ptidos.

Tambi�n se describen en la presente memoria los compuestos de fórmula (II) que son moléculas peptidomim�ticas de los p�ptidos descritos y definidos en la presente memoria. Una molécula peptidomim�tica se caracteriza en general por retener la polaridad, el tamaño tridimensional y la funcionalidad (bioactividad) de su equivalente 40 pept�dico, pero en la que se han sustituido los enlaces pept�dicos, a menudo por uniones más estables. 'Estable' significa más resistente a la degradación enzim�tica mediante enzimas hidrol�ticas. En general, el enlace que sustituye al enlace amida (sustituto del enlace amida) conserva muchas de las propiedades del enlace amida, p.ej. la conformación, el efecto est�rico, el carácter electrostático, la posibilidad de formación de puentes de hidrógeno, etc. El capítulo 14 de "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood 45 Acad. Pub., proporciona una discusión general de las técnicas para el diseño y la síntesis de moléculas peptidomim�ticas. En el presente caso, en el que la molécula va a reaccionar con una membrana en vez del sitio activo específico de una enzima, algunos de los problemas descritos sobre la imitación exacta de la afinidad y eficacia o la función del sustrato no son relevantes, y se puede preparar fácilmente una molécula peptidomim�tica basándose en una estructura pept�dica dada o en un motivo de grupos funcionales necesarios. Los sustitutos de los 50 enlaces amida adecuados incluyen los grupos siguientes: N-alquilaci�n (Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein

Res., 1995, 46, 47), amida retro-inversa (Chorev, M y Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), tioamida (Sherman D.B. y Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), tio�ster, fosfonato, cetometileno (Hoffman, R.V. y Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), hidroximetileno, fluorovinilo (Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), vinilo, metilenamino (Sasaki, Y y Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), metilentio (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), alcano (Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) y sulfonamido (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).

Los compuestos peptidomim�ticos descritos en la presente memoria pueden tener 3 subunidades identificables que son aproximadamente equivalentes en tamaño y función a los amino�cidos (unidades AA). El término 'amino�cido' se puede usar as� de manera conveniente en la presente memoria para hacer referencia a las subunidades equivalentes de un compuesto peptidomim�tico. Además, las moléculas peptidomim�ticas pueden tener grupos equivalentes a los grupos R de los amino�cidos, y la discusión de la presente memoria de grupos R adecuados y de grupos modificadores N- y C-terminales se aplica, mutatis mutandis, a los compuestos peptidomim�ticos.

Como se discute en el libro de texto mencionado anteriormente, al igual que la sustitución de enlaces amida, las moléculas peptidomim�ticas pueden implicar la sustitución de restos estructurales mayores con estructuras de moléculas di- o tri-peptidomim�ticas, y en este caso, se pueden usar restos miméticos que implican el enlace pept�dico, tales como moléculas miméticas derivadas de azol, como sustituciones de dip�ptidos. Sin embargo, se prefieren las moléculas peptidomim�ticas, y as� los esqueletos peptidomim�ticos en los que los enlaces amida se han sustituido como se discutió anteriormente.

Las moléculas peptidomim�ticas adecuadas incluyen p�ptidos reducidos en los que el enlace amida se ha reducido hasta una metilen-amina mediante tratamiento con un agente reductor, p.ej. borano o un hidruro reactivo tal como hidruro de litio y aluminio. Tal reducción tiene la ventaja añadida de incrementar la cationicidad global de la molécula.

Otras moléculas peptidomim�ticas incluyen peptoides formados, por ejemplo, mediante la síntesis por etapas de poliglicinas funcionalizadas con amida. Ciertos esqueletos peptidomim�ticos estarán fácilmente disponibles a partir de sus precursores pept�dicos, tales como los p�ptidos que se han permetilado, y Ostresh, J.M. et al. describe métodos adecuados en Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91, 11138-11142. Las condiciones muy básicas favorecerán la metilaci�n en N sobre la metilaci�n en O, y darán como resultado la metilaci�n de ciertos o todos los átomos de nitrógeno en los enlaces pept�dicos y el nitrógeno N-terminal.

Los esqueletos peptidomim�ticos preferidos incluyen los poli�steres, poliaminas y los derivados de los mismos, as� como los alcanos y alquenos sustituidos. Las moléculas peptidomim�ticas tendrán preferiblemente extremos N- y Cterminales que se pueden modificar tal como se discute en la presente memoria.

La invención proporciona las diversas moléculas de la invención para el uso en el tratamiento de infecciones microbianas. De forma similar, se describen las diversas moléculas de la invención para el uso en la desestabilizaci�n de las membranas celulares microbianas. La cantidad administrada debería ser eficaz para destruir todos o una proporción de los microbios seleccionados como objetivo, o para prevenir o reducir su velocidad de reproducción o de otra manera disminuir su efecto perjudicial en el cuerpo. El m�dico o el paciente deberían observar una mejora en uno o más de los parámetros o síntomas asociados a la infección. La administración también puede ser profiláctica.

Los p�ptidos de la invención se pueden sintetizar de cualquier manera adecuada. En general, los grupos reactivos presentes (por ejemplo amino, tiol y/o carboxilo) estarán protegidos durante toda la síntesis. La etapa final en la síntesis ser� as� la desprotecci�n de un derivado protegido de la invención.

En la construcción del p�ptido, se puede comenzar en principio en el extremo C-terminal o N-terminal, aunque se prefiere el procedimiento que comienza en el extremo C-terminal.

Los métodos de síntesis de p�ptidos son muy conocidos en la técnica, pero para la presente invención puede ser especialmente adecuado llevar a cabo la síntesis en un soporte de fase sólida, y tales soportes son muy conocidos en la técnica.

Se conoce una amplia selección de grupos protectores para amino�cidos, y los grupos protectores para amina adecuados pueden incluir carbobenzoxi (también denominado Z) t-butoxicarbonilo (también denominado Boc), 4metoxi-2,3,6-trimetilbenceno sulfonilo (Mtr) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (también denominado Fmoc). Se apreciar� que cuando el p�ptido se construye desde el extremo C-terminal, habr� presente un grupo protector de amina en el grupo α-amino de cada residuo nuevo añadido, y ser� necesario eliminarlo de manera selectiva antes de la siguiente etapa de acoplamiento.

Los grupos protectores para carboxilo que se pueden emplear, por ejemplo, incluyen los grupos éster que se escinden fácilmente tales como los grupos bencilo (Bzl), p-nitrobencilo (ONb), pentaclorofenilo (OPClP), pentafluorofenilo (OPfp) o t-butilo (OtBu), as� como los grupos de acoplamiento en soportes sólidos, por ejemplo grupos metilo unidos a poliestireno.

Los grupos protectores para tiol incluyen p-metoxibencilo (Mob), tritilo (Trt) y acetamidometilo (Acm).

Existe una amplia diversidad de procedimientos para eliminar los grupos protectores de amina y carboxilo. Estos, sin embargo, deben ser coherentes con la estrategia sintética empleada. Los grupos protectores de las cadenas laterales deben ser estables en las condiciones usadas para eliminar el grupo protector de α-amino temporal antes de la siguiente etapa de acoplamiento.

Los grupos protectores para amina, tales como Boc, y los grupos protectores para carboxilo, tales como tBu, se pueden eliminar de manera simultánea mediante tratamiento con un ácido, por ejemplo con ácido trifluoroac�tico. Los grupos protectores para tiol, tales como Trt, se pueden eliminar de manera selectiva mediante el uso de un agente de oxidación tal como yodo.

Las referencias y técnicas para sintetizar compuestos peptidomim�ticos y las otras moléculas bioactivas se describen en la presente memoria, y as� son muy conocidas en la técnica.

Las formulaciones que comprenden uno o más compuestos de la invención mezclados con un diluyente, vehículo o excipiente adecuado constituyen un aspecto adicional de la presente invención. Tales formulaciones pueden ser, entre otros, para fines farmacéuticos (que incluyen los veterinarios) o agrícolas, o para el uso como agentes esterilizantes para materiales susceptibles a la contaminación microbiana, p.ej. en la industria alimentaria. El experto en la técnica conoce los diluyentes, excipientes y vehículos adecuados.

Los p�ptidos definidos en la presente memoria exhiben una amplia actividad antimicrobiana, y as� son también adecuados como agentes antivirales y antif�ngicos, que tendrán aplicaciones farmacéuticas y agrícolas, y como promotores de la cicatrización de heridas o espermicidas. Todos estos usos constituyen aspectos adicionales de la invención.

Los aspectos adicionales de la presente invención constituyen uno o más de los p�ptidos de la presente invención para el uso en el tratamiento o la prevención de infecciones bacterianas, virales o f�ngicas o en el tratamiento de tumores. El paciente puede ser un paciente humano o animal.

Las composiciones según la invención se pueden presentar, por ejemplo, en una forma adecuada para administración oral, nasal, parenteral, intravenosa, intratumoral o rectal.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "farmacéutico" incluye las aplicaciones veterinarias de la invención.

Los compuestos activos definidos en la presente memoria se pueden presentar en las formas farmacol�gicas convencionales de administración, tales como comprimidos, comprimidos revestidos, aerosoles nasales, disoluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida.

Los p�ptidos son especialmente adecuados para la administración típica, p.ej. en el tratamiento de úlceras diab�ticas o infecciones f�ngicas tales como la onicomicosis. Las formulaciones para la administración típica est�n preferiblemente en forma de un gel, crema, loción, pasta u otra preparación que es más viscosa que el agua. Las formulaciones adicionales para la aplicación típica incluyen vendajes, gasas, etc., que se han impregnado con un compuesto de la invención; cuando se impregnan tales materiales, no es necesario que la preparación que contiene un compuesto de la invención sea más viscosa que el agua. Se pueden emplear excipientes farmacéuticos convencionales, as� como los métodos habituales de producción, para la preparación de estas formas. Se pueden producir comprimidos, por ejemplo, mezclando el ingrediente o ingredientes activos con excipientes conocidos, tales como, por ejemplo, con diluyentes, tales como carbonato cálcico, fosfato cálcico o lactosa, disgregantes tales como almidón de maíz o ácido alg�nico, aglutinantes tales como almidón o gelatina, lubricantes tales como estearato magn�sico o talco, y/o agentes para obtener una liberación sostenida, tales como carboxipolimetileno, carboximetil celulosa, acetato-ftalato de celulosa, o poli(acetato de vinilo).

Los comprimidos, si se desea, pueden consistir en varias capas. Se pueden producir comprimidos revestidos revistiendo núcleos, obtenidos de una manera similar a los comprimidos, con agentes usados habitualmente para los revestimientos de comprimidos, por ejemplo, polivinil pirrolidona o goma laca, goma arábiga, talco, di�xido de titanio

o azúcar. Para obtener una liberación sostenida o para evitar incompatibilidades, el núcleo también puede consistir en varias capas. El revestimiento del comprimido puede consistir también en varias capas para obtener una liberación sostenida, en cuyo caso se pueden usar los excipientes mencionados anteriormente para los comprimidos.

Tambi�n se pueden usar sistemas de vehículos específicos de órganos.

Las disoluciones para inyección se pueden producir, por ejemplo, de manera convencional, tal como mediante la adición de agentes conservantes, tales como p-hidroxibenzoatos, o estabilizantes, tales como EDTA. Las disoluciones se rellenan después en viales o ampollas para inyección.

Los aerosoles nasales que son un método preferido de administración se pueden formular de forma similar en disolución acuosa y envasarlos en recipientes para aerosoles con un propelente de aerosol o proporcionar un medio

5 para la compresión manual. Se pueden producir cápsulas que contienen uno o varios ingredientes activos, por ejemplo, mezclando los ingredientes activos con vehículos inertes, tales como lactosa o sorbitol, y rellenando la mezcla en cápsulas de gelatina.

Se pueden producir supositorios adecuados, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo o combinaciones de

10 ingredientes activos con los vehículos convencionales previstos para este fin, tales como grasas naturales o polietilenglicol o derivados de los mismos.

Las unidades de dosis que contienen las moléculas activas contienen preferiblemente 0,1-10 mg, por ejemplo 1-5 mg del agente antimicrobiano. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además ingredientes activos

15 adicionales, que incluyen otros agentes citot�xicos tales como otros p�ptidos antimicrobianos. Otros ingredientes activos pueden incluir diferentes tipos de antibióticos, citocinas, p.ej., IFN-γ, TNF, CSF y factores de crecimiento, inmunomoduladores, agentes quimioter�picos, p.ej., cisplatino o anticuerpos.

Las moléculas bioactivas, cuando se usan en composiciones típicas, est�n presentes en general en una cantidad de

20 al menos un 0,1% en peso. En la mayoría de los casos, no es necesario emplear el p�ptido en una cantidad mayor del 1,0% en peso.

Al emplear tales composiciones de manera sist�mica (intramuscular, intravenosa, intraperitoneal), la molécula activa est� presente en una cantidad para alcanzar un nivel en suero de la molécula bioactiva de al menos alrededor de 5

25 μg/ml. En general, no es necesario que el nivel en suero supere 500 μg/ml. Un nivel en suero preferido es alrededor de 100 μg/ml. Tales niveles en suero se pueden alcanzar incorporando la molécula bioactiva en una composición que se va a administrar de manera sist�mica a una dosis de 1 a alrededor de 10 mg/kg. En general, no es necesario administrar la(s) molécula(s) a una dosis que supere 100 mg/kg.

30 También se describen métodos para tratar lugares o productos medioambientales o agrícolas, as� como productos alimenticios y lugares de producción de alimentos, o superficies o herramientas, p.ej. en un medio hospitalario con una o más de las moléculas de la invención para reducir el número de bacterias viables presentes o para limitar el crecimiento o la reproducción bacteriana.

35 La invención se describir� adicionalmente a continuación con referencia a los Ejemplos no limitantes siguientes y las Figuras, en las que

La Figura 1 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento t�pico de un día mediante el uso del compuesto 2 contra Staphylococcus aureus FDA486 en un modelo murino de infección cut�nea. El número de unidades

40 formadoras de colonias (UFC) se muestra en el eje Y, y el tipo de tratamiento t�pico aplicado a los ratones se muestra en el eje X.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento t�pico de un día mediante el uso del compuesto 2 contra Streptococcus pyogenes en un modelo murino de infección cut�nea. El número de unidades formadoras de

45 colonias (UFC) se muestra en el eje Y, y el tipo de tratamiento t�pico aplicado a los ratones se muestra en el eje X.

La Figura 3 es un gráfico que muestra una comparación de la recuperación de ATP tras el apagamiento inducido por las formulaciones, y su comparación con patrones de concentración conocida (Ejemplo 5).

50 La Figura 4 es un gráfico que muestra una comparación de la liberación de ATP tras la aplicación de diferentes formulaciones (Ejemplo 5).

Ejemplos

55 Ejemplo 1

Actividades in vitro de las moléculas de la invención

2.0 Materiales y Métodos 60

2.1 Antimicrobianos

Los viales de Compuesto 1 y Compuesto 2 pre-pesados fueron suministrados por Lytix Biopharma AS.

F�rmula general del compuesto: AA1-AA2-AA1-XYZ

AA1

AA2 XYZ

Compuesto 1

Arg Phe(4-(2-Naftilo)) NHCH2CH2Ph

Compuesto 2

Arg 2,5,7-tri-terc-butiltript�fano NHCH2CH2Ph

2.2 Aislamientos bacterianos

Los aislamientos bacterianos usados en este estudio fueron de diversas fuentes de todo el mundo almacenadas en

5 GR Micro Ltd. y mantenidas, con subcultivos mínimos, congeladas a -70 �C en forma de una suspensión densa en una matriz de contenido elevado de proteínas de suero de caballo sin diluir. La especie usada y sus características se enumeran en la Tabla 1. Estos incluyen 54 bacterias grampositivas, 33 bacterias gramnegativas y 10 hongos.

2.3 Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM)

10 Las CIMs se determinaron mediante el uso de los siguientes métodos de microdiluci�n en caldo para ensayar la susceptibilidad antimicrobiana publicada por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente NCCLS):

15 M7-A6 Vol. 23 N� 2, Enero de 2003, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Estándar Aprobado-Sexta Edición.

M100-S15 Vol. 25 N� 1, Enero de 2005, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Decimoquinto Suplemento Informativo.

20 M11-A6 Vol. 24 N� 2, Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Estándar Aprobado-Sexta Edición.

M27-A2 Vol. 22 N� 15, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Estándar 25 Aprobado-Segunda Edición.

M38-A Vol. 22 N� 16, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Estándar Aprobado.

30 Se llevaron a cabo las estimaciones de CIM mediante el uso de placas húmedas, que contenían los agentes antibacterianos o antif�ngicos, preparadas en GR Micro Ltd.

Se us� caldo Mueller-Hinton con ajuste de cationes (Oxoid Ltd., Basingstoke, R.U. y Trek Diagnostic Systems Ltd., East Grinstead, R.U.) (complementado con un 5% de sangre de caballo hemolizada para Streptococcus spp., 35 Corynebacterium jeikeium y Listeria monocytogenes) para las bacterias aerobias, con un in�culo inicial de aproximadamente 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL.

Se us� medio de ensayo de Haemophilus (caldo Mueller-Hinton que contenía un 0,5% de extracto de levadura y complemento de medio de ensayo de Haemophilus que contenía 15 mg/L de hematina y NAD, todo obtenido de 40 Oxoid Ltd., Basingstoke, R.U.) para Haemophilus influenza, y se inocul� con aproximadamente 105 UFC/mL.

Se us� caldo de Brucella complementado (SBB) para las cepas anaerobias con un in�culo de aproximadamente 106 UFC/mL. SBB es un caldo que consiste en 1% de peptona, 0,5% de 'Lab-lemco', 1% de glucosa y 0,5% de cloruro sádico complementado con 5 μg/L de hemina y 1 μg/L de vitamina K (ambas obtenidas de Sigma Aldrich Ltd.)

45 Se llevaron a cabo CIM de levaduras y hongos filamentosos en medio RPMI 1640 tamponado con MOPS (el tampón MOPS se obtuvo de Sigma Aldrich Ltd., RPMI 1640 se obtuvo de Invitrogen Ltd, Paisley, Escocia). Los in�culos de levadura estuvieron en el intervalo 7,5 x 102 - 4 x 103 UFC/mL, y los hongos filamentosos aproximadamente 8 x 103 1 x 105 UFC/mL

50 Siguiendo las prácticas normales, todas las placas que contenían caldo Mueller-Hinton se prepararon por adelantado, se congelaron a -70 �C el día de la preparación y se descongelaron el día del uso. Todas las determinaciones de CIM f�ngicas, de Haemophilus y anaerobias se llevaron a cabo en placas preparadas el mismo día.

55 Para determinar si la congelación afect� a la actividad de los p�ptidos, ciertas determinaciones de CIM se repitieron mediante el uso de placas que contenían caldo Mueller-Hinton recién preparado.

2.4 Cepas de control

60 Las siguientes cepas de control (referencia) se incluyeron en el panel de cepas ensayadas

Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Candida krusei ATCC 6258

Las cepas de control siguientes fueron adicionales al panel de cepas de ensayo, y se incluyeron donde fue adecuado para comprobar que los comparadores estuvieron dentro del intervalo.

Haemophilus influenzae ATCC 49247 Candida parapsilosis ATCC 22019 Bacteroides fragilis ATCC 25285 Eggerthella lenta ATCC 43055 5

3.0 Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 1 en forma de una lista de una sola línea. Los resultados de las cepas de control repetidas se muestran en la Tabla 2. Se puede observar que los resultados de las cepas de control fueron

10 muy reproducibles, lo que incluye los datos de las placas que contuvieron caldo Mueller Hinton almacenado congelado o usado fresco. La congelación de las placas tampoco tuvo efecto sobre la CIM para otras cepas bacterianas.

Los datos de CIM obtenidos son muy alentadores, e indican que los p�ptidos tienen un espectro de actividad 15 bastante amplio.

Tabla 1: Lista de una sola línea de la actividad in vitro de dos p�ptidos antimicrobianos nuevos y un comparador contra un panel de bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas y hongos.

Especie y propiedades

Compuesto 1 Compuesto 2

Candida albicans ATCC90028 - cepa de referencia

2 8

Candida albicans ATCC24433 - cepa de referencia

2 8

Candida tropicalis ATCC750 - cepa de referencia

2 4

Candida parapsilosis ATCC90018 - cepa de referencia

4 16

Candida (Issatchenkia) krusei ATCC6258 -cepa de referencia

4 4

Aspergillus niger-colección de G.R. Micro

4 8

Trichophyton mentagrophytes - colección de G.R. Micro

16 8

Trichophyton interdigitale - colección de G.R. Micro

8 8

Microsporum canis -colección de G.R. Micro

8 8

Cryptococcus neoformans - colección de G.R. Micro

4 4

Escherichia coli ATCC25922 - cepa de tipo sensible a antibióticos

32 8

Escherichia coli ATCC32518 - cepa de tipo positivo a β-lactamasa

32 8

Escherichia coli - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

32 8

Klebsiella aerogenes NCTC11228 - cepa de tipo sensible a antibióticos

32 16

Klebsiella aerogenes - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

64 16

Enterobacter sp - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 4

Enterobacter sp - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

64 16

Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 - tipo sensible a antibióticos

16 8

Pseudomonas aeruginosa - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

32 4

Stenotrophomonas maltophilia -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 8

Salmonella sp - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

16 8

Salmonella sp - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

16 8

Shigella sp - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 8

Morganella morganii -aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

≥128 16

Haemophilus influenzae - aislamiento cl�nico negativo a β-lactamasa

≥128 8

Haemophilus influenzae - aislamiento cl�nico positivo a β-lactamasa

≥128 8

Haemophilus influenzae - negativo a β-lactamasa resistente a ampicilina

≥128 8

Moraxella catarrhalis - aislamiento cl�nico positivo a β-lactamasa

4 4

Moraxella catarrhalis -susceptibilidad clónica reducida a fluoroquinolona

8 8

Acinetobacter baumanii -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 16

Staphylococcus aureus ATCC 29213 - control sensible a antibióticos

4 2

Staphylococcus aureus ATCC 25923 -control sensible a antibióticos

4 4

Staphylococcus aureus ATCC 43300 - cepa de control resistente a meticilina

4 2

Especie y propiedades

Compuesto 1 Compuesto 2

Staphylococcus aureus -aislamiento cl�nico resistente a meticilina

4 4

Staphylococcus aureus - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

8 4

Staphylococcus aureus -aislamiento cl�nico intermedio a teicoplanina

4 4

Staphylococcus epidermidis - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

16 8

Staphylococcus epidermidis - aislamiento cl�nico resistente a meticilina

2 4

Staphylococcus haemolyticus -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

4 4

Staphylococcus saprophyticus -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

1 1

Enterococcus faecalis ATCC 29212 - control sensible a antibióticos

4 4

Enterococcus faecalis - aislamiento cl�nico sensible a vancomicina

8 8

Enterococcus faecalis - aislamiento cl�nico resistente a vancomicina (VanA)

16 8

Enterococcus faecalis - aislamiento cl�nico resistente a vancomicina (VanB)

16 16

Enterococcus faecalis - aislamiento cl�nico resistente a gentamicina a nivel elevado

16 8

Enterococcus faecium - aislamiento cl�nico sensible a vancomicina

8 8

Enterococcus faecium - aislamiento cl�nico resistente a vancomicina (VanA)

16 8

Enterococcus faecium - aislamiento cl�nico resistente a vancomicina (VanB)

8 4

Enterococcus gallinarum - aislamiento cl�nico resistente a vancomicina (VanC)

4 4

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - control sensible a antibióticos

32 16

Streptococcus pneumoniae -aislamiento cl�nico sensible a penicilina

64 32

Streptococcus pneumoniae -aislamiento cl�nico intermedio a penicilina

32 32

Streptococcus pneumoniae -aislamiento cl�nico resistente a penicilina

32 16

Streptococcus pneumoniae - aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

64 32

Streptococcus pyogenes -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos (MLS)

32 16

Streptococcus pyogenes -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos (tipo M)

32 16

Corynebacterium jeikeium - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 16

Corynebacterium jeikeium -aislamiento cl�nico multirresistente a fármacos

32 8

Listeria monocytogenes - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 16

MU50 Staphylococcus aureus (MRSA) - cepa de tipo VISA

4 4

EMRSA3 Staphylococcus aureus (MRSA) - SSCmec tipo 1

4 4

EMRSA16 Staphylococcus aureus (MRSA) - SSCmec tipo 2

4 4

EMRSA1 Staphylococcus aureus (MRSA) - SSCmec tipo 3

8 8

EMRSA15 Staphylococcus aureus (MRSA) - SSCmec tipo 4

4 4

HT2001254 Staphylococcus aureus (MRSA) - positivo a PVL

4 4

Streptococcus agalactiae - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

16 8

Streptococcus agalactiae -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

32 16

Streptococcus del Grupo C - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 16

Streptococcus del Grupo C - aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

64 32

Streptococcus del Grupo G - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 8

Streptococcus del Grupo G - aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

32 16

Streptococcus mitis - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 16

Streptococcus mitis - aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

≥128 32

Streptococcus constellatus -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 32

Streptococcus constellatus -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

64 32

Streptococcus oralis -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 32

Streptococcus oralis -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

32 32.

Streptococcus bovis -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 32

Streptococcus bovis - aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

8 8

Streptococcus sanguis - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

64 32

Streptococcus sanguis -aislamiento cl�nico resistente a macr�lidos

32 32

Clostridium perfringens -aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

≥128 32

Clostridium difficile - aislamiento cl�nico sensible a antibióticos

32 16

Tabla 2: Actividad in vitro de dos p�ptidos antimicrobianos nuevos y comparadores contra cepas de control de la ATCC

(Incluye las cepas de control de la ATCC además del panel de las cepas de ensayo) MHB, caldo Mueller Hinton; HTM, medio de ensayo de haemophilus; SBB, caldo Brucella complementado.

Cepa N�

Especie y propiedades Compuesto Tipo de placa

1

2

GP01

Staphylococcus aureus ATCC 29213 cepa de control sensible a antibióticos 8 4 MHB congelado

GP01

Staphylococcus aureus ATCC 29213 cepa de control sensible a antibióticos 4 4 MHB congelado

GP01

Staphylococcus aureus ATCC 29213 cepa de control sensible a antibióticos 4 2 MHB fresco

GN01

Escherichia coli ATCC 25922 cepa de tipo sensible a antibióticos 32 8 MHB congelado

GN01

Escherichia coli ATCC 25922 cepa de tipo sensible a antibióticos 32 8 MHB congelado

GN01

Escherichia coli ATCC 25922 cepa de tipo sensible a antibióticos 16 8 MHB fresco

GN10

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 cepa de tipo sensible a antibióticos 16 8 MHB congelado

GN10

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 cepa de tipo sensible a antibióticos 32 8 MHB congelado

GN10

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 cepa de tipo sensible a antibióticos 8 8 MHB fresco

GP11

Enterococcus faecalis - ATCC 29212 cepa de control sensible a antibióticos 8 8 MHB congelado

GP11

Enterococcus faecalis - ATCC 29212 cepa de control sensible a antibióticos 8 8 MHB congelado

GP11

Enterococcus faecalis - ATCC 29212 cepa de control sensible a antibióticos 4 4 MHB fresco

Haemophilus influenzae - ATCC 47247

32 4 HTM

Candida parapsilosis ATCC 22019

4 8 RPMI 1640

F05

Candida (Issatchenkia) krusei ATCC 6258 cepa de referencia 8 8 RPMI 1640

F05

Candida (Issatchenkia) krusei ATCC 6258 cepa de referencia 8 8 RPMI 1640

Bacteroides fragilis - ATCC 25285

64 64 SBB

Eggerthella lenta - ATCC 43055

16 32 SBB

Ejemplo 2 5 Síntesis de P�ptidos

Productos químicos

10 Los amino�cidos protegidos Boc-Trp-OH, Boc-Arg-OH, Boc-4-fenil-Phe y Ac-Arg-OH se adquirieron de Bachem AG, mientras Boc-4-yodofenilalanina, Boc-3,3-difenilalanina y Boc-(9-antril)alanina se adquirieron de Aldrich. Bencilamina, 2-feniletilamina, 3-fenilpropilamina, (R)-2-fenilpropilamina, (S)-2-fenilpropilamina, N,N-metilbencilamina, N,N-etilbencilamina y N,N-dibencilamina que constituyeron el extremo C-terminal del p�ptido se adquirieron de Fluka, excepto N-etilbencilamina, que se adquirió de Acros. Diisopropiletilamina (DIPEA), 1-hidroxibenzotriazol (1

15 HOBt), hexafluorofosfato de clorotripirrolidinofosfonio (PyCloP) y hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'tetrametiluronio (HBTU) se adquirieron de Fluka. ácido 4-n-butilfenilbor�nico, ácido 4-t-butilfenilbor�nico, ácido 4bifenilbor�nico, ácido 2-naftilbor�nico, tri orto-tolilfosfina, bromuro de bencilo y acetato de paladio se adquirieron de Aldrich. Los disolventes se adquirieron de Merck, Riedel-de Ha�n o Aldrich.

20 Preparación de amino�cidos

Preparaci�n de Boc-2,5,7-tri-terc-butiltript�fano-OH: Se agita una mezcla de H2N-Trp-OH (1,8 g, 8,8 mmol), t-BuOH (4,7 g, 63,4 mmol) en ácido trifluoroac�tico (19 mL) a 70 �C durante 3 horas. El volumen de la disolución translúcida de color marrón medio resultante se reduce en un rotavapor a temperatura ambiente durante 30 min, y después se

25 tritura añadiendo 60 mL de NaHCO3 del 7% (en peso) gota a gota. El sólido granular gris/blanco obtenido se recupera después mediante filtración a vacío y se seca a vacío a temperatura ambiente durante 24 horas. El producto se aísla mediante cristalización a partir de una mezcla casi en ebullición de un 40 % de etanol en agua. Los volúmenes son en general de aproximadamente 20 mL por gramo de producto bruto.

30 Una primera cristalización a partir del producto bruto produce el producto aislado con un 80 - 83 % de pureza (HPLC) con respecto a las demás sustancias de la muestra, y aproximadamente un 94-95 % de pureza con respecto a los análogos conocidos de TBT. Los rendimientos en esta etapa est�n en el intervalo del 60 - 65 %.

Bencilaci�n de Boc-4-yodofenilalanina. Se disolvió Boc-4-yodofenilalanina (1 equivalente) en metanol al 90% en 35 agua y se neutralizó mediante la adición de carbonato de cesio hasta un pH alcalino débil (determinado mediante

papel de tornasol). El disolvente se elimin� mediante evaporación rotatoria, y el agua restante de la sal de cesio de Boc-4-yodofenilalanina se redujo adicionalmente mediante destilación azeotr�pica repetida con tolueno. La sal seca resultante se disolvió en dimetilformamida (DMF), se a�adi� bromuro de bencilo (1,2 equivalentes) y la mezcla resultante se agit� durante 6 - 8 h. Al final de la reacción se elimin� la DMF a presión reducida, y se form� un aceite que contenía el compuesto del título. Este aceite se disolvió en acetato de etilo, y la disolución resultante se lav� con volúmenes iguales de una disolución de ácido cítrico (tres veces), una disolución de bicarbonato sádico y salmuera. El compuesto del título se aisl� en forma de un aceite amarillo pálido con un rendimiento del 85% mediante cromatograf�a rápida con el uso de diclorometano:acetato de etilo (95:5) como eluyente. Se pudo obtener Boc-4yodofenilalanina de bencilo cristalina mediante recristalizaci�n a partir de n-heptano.

Procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki: Se a�adi� Boc-4-yodofenilalanina de bencilo (1 equivalente), ácido arilbor�nico (1,5 equivalentes), carbonato sádico (2 equivalentes), acetato de paladio (0,05 equivalentes) y tri orto-tolilfosfina (0,1 equivalentes) a una mezcla desgasificada de dimetoxietano (6 ml/mmol de Boc-4-yodofenilalanina de bencilo) y agua (1 ml/mmol de Boc-4-yodofenilalanina de bencilo). La mezcla de reacción se mantuvo bajo argón y se calentó a 80 �C durante 4-6 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtra a través de una almohadilla corta de silicagel y carbonato sádico. La torta de filtración se lav� adicionalmente con acetato de etilo. Los filtrados se combinaron, y los disolventes se eliminaron a presión reducida. Los productos se aislaron mediante cromatograf�a rápida con el uso de mezclas de acetato de etilo y n-hexano como eluyente.

Preparaci�n de Boc-Bip(n-Bu)-OBn: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 53% a partir de ácido 4-n-butilfenilbor�nico mediante el uso del procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki. Boc-Bip(n-Bu)-OBn se aisl� mediante el uso de un eluyente de acetato de etilo:n-hexano 80:20.

Preparaci�n de Boc-Bip(t-Bu)-OBn: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 79% a partir de ácido 4-t-butilfenilbor�nico mediante el uso del procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki. Boc-Bip(t-Bu)-OBn se aisl� mediante el uso de un eluyente de acetato de etilo:n-hexano 80:20.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-Ph)-OBn: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 61% a partir de ácido 4-bifenilbor�nico mediante el uso del procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki. Boc-Bip(4-Ph)-OBn se aisl� mediante recristalizaci�n del producto bruto a partir de n-heptano.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-(2-Naftilo))-OBn: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 68% a partir de ácido 2-naftilbor�nico mediante el uso del procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki. Boc-Bip(4-(2Naftilo))-OBn se aisl� mediante recristalizaci�n del producto bruto a partir de n-heptano.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-(1-Naftilo))-OBn: El compuesto del título se prepar� a partir de ácido 2-naftilbor�nico mediante el uso del procedimiento general para los acoplamientos de Suzuki. Boc-Bip(4-(1-Naftilo))-OBn se aisl� mediante recristalizaci�n del producto bruto a partir de n-heptano.

Procedimiento general para la desesterificaci�n de los ésteres de bencilo: El éster de Bencilo se disuelve en DMF y se hidrogena durante 2 días a presión atmosférica mediante el uso de un 10% de Pd sobre carbono como catalizador. Al final de la reacción, el catalizador se elimina mediante filtración y el disolvente se elimina a presión reducida. Los ácidos libres se aíslan mediante recristalizaci�n a partir de éter diet�lico.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-n-Bu)-OH: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 61% a partir de Boc-Bip(n-Bu)-OBn mediante el uso del procedimiento general para la desesterificaci�n.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-t-Bu)-OH: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 65% a partir de Boc-Bip(t-Bu)-OBn mediante el uso del procedimiento general para la desesterificaci�n.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-Ph)-OH: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 61% a partir de Boc-Bip(4-ph)-OBn mediante el uso del procedimiento general para la desesterificaci�n.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-(2-Naftilo))-OH: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 68% a partir de Boc-Bip(4-(2-Naftilo))-OBn mediante el uso del procedimiento general para la desesterificaci�n.

Preparaci�n de Boc-Bip(4-(2-Naftilo))-OH: El compuesto del título se prepar� con un rendimiento del 68% a partir de Boc-Bip(4-(2-Naftilo))-OBn mediante el uso del procedimiento general para la desesterificaci�n.

Procedimiento general para la síntesis de p�ptidos en fase de disolución mediante el uso de HBTU. Los p�ptidos se prepararon en disolución mediante acoplamiento de amino�cidos por etapas con el uso de la estrategia de protección con Boc según el siguiente procedimiento general. La parte del p�ptido C-terminal con un grupo amino libre (1 eq) y el amino�cido protegido con Boc (1,05 eq) y 1-hidroxibenzotriazol (1-HOBt) (1,8 eq) se disolvieron en DMF (2-4 ml/mmol de componente amino) antes de la adición de diisopropiletilamina (DIPEA) (4,8 eq). La mezcla se enfri� en hielo y se a�adi� hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) (1,2 eq). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 1-2 h. La mezcla de reacción se diluyó mediante

acetato de etilo y se lav� con ácido cítrico, bicarbonato sádico y salmuera. El disolvente se elimin� a vacío y el grupo protector Boc del p�ptido resultante se desprotegi� en la oscuridad mediante el uso de TFA al 95% o cloruro de acetilo en metanol anhidro.

Formaci�n de amida en fase de disolución mediante el uso de PyCloP. Síntesis de Boc-Arg-N(CH2Ph)2. Se disolvió Boc-Arg-OH (1 eq), NH(CH2Ph)2 (1,1 eq) y PyCloP (1 eq) en DCM seco (filtrado a través de al�mina) (2 ml) y DMF (1 ml). La disolución se enfri� en hielo, y se a�adi� DIPEA (2 eq) con agitaci�n. Las disoluciones se agitaron durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evapor�, y se redisolvi� en acetato de etilo y se lav� con ácido cítrico, bicarbonato sádico y salmuera. El disolvente se elimin� a vacío y el grupo protector Boc del p�ptido resultante se desprotegi� en la oscuridad mediante el uso de TFA al 95%.

Purificaci�n y análisis de p�ptidos. Los p�ptidos se purificaron mediante el uso de HPLC de fase inversa en una columna C18 Delta-Pak (Waters) (100 �, 15 μm, 25 x 100 mm) con una mezcla de agua y acetonitrilo (que contenían ambos un 0,1% de TFA) como eluyente. Los p�ptidos se analizaron mediante RP-HPLC con el uso de una columna analítica C18 Delta-Pak (Waters) (100 �, 5 μm, 3,9 x 150 mm) y espectrometr�a de masas con electronebulizaci�n de iones positivos en un espectrómetro de masas de cuadrupolo VG Quattro (VG Instruments Inc., Altringham, R.U.).

Ejemplo 3 Estabilidad hacia la degradación con tripsina

Los compuestos de fórmula AA1-AA2-AA1-NHCH2CH2Ph se ensayaron en cuanto a su resistencia a tripsina y su actividad antimicrobiana.

Medidas y cálculo de la semivida de los p�ptidos

Cada p�ptido se disolvió en un tampón de NH4HCO3 0,1 M (pH 6,5) para producir una concentración final de p�ptido de 1 mg/ml. Se prepar� una disolución de tripsina disolviendo 1 mg de tripsina en 50 ml de tampón de NH4HCO3 0,1 M (pH 8,2). Para la determinación de la estabilidad, se incubaron 250 μl de disolución recién hecha de tripsina y 250 μl de disolución de p�ptido en 2 ml de tampón de NH4HCO3 0,1 M (pH 8,6) a 37 �C en un agitador orbital. Se tomaron alícuotas de 0,5 ml a diferentes intervalos de tiempo, se diluyeron con 0,5 ml de agua:acetonitrilo (60:40 v/v) que contenía un 1% de TFA y se analizaron mediante RP-HPLC como se describió anteriormente. Las muestras sin adición de tripsina tomadas a las 0 h y después de 20 h a 37 �C se usaron como controles negativos. Se us� la integración del área de los picos a 254 nm para las muestras tomadas durante las primeras 5 horas del ensayo para generar el τ1/2. Los p�ptidos que no exhibieron degradación durante las primeras 24 h se clasificaron como estables.

Ensayo antibacteriano

Las determinaciones de CIM en Staphylococcus aureus, cepa ATCC 25923, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), cepa ATCC 33591 y Staphylococcus epidermidis resistente a meticilina (MRSE), cepa ATCC 27626, fueron llevadas a cabo por Toslab AS mediante el uso de los métodos habituales. Amsterdam, D. (1996) Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media, en Antibiotics in Laboratory Medicine. 4� ed. (Lorian, V., Ed.) p�gs. 75-78, Williams and Wilkins Co, Baltimore.

Tabla 3. Estabilidad de los p�ptidos AA1-AA2-AA1-NHCH2CH2Ph hacia tripsina medida como la semivida (τ1/2) y actividades antibacterianas expresadas como CIM.

P�ptido AA1 AA2 τ1/2a (h) CIMb (μM)

S. aureusc MRSAd MRSFe

Compuesto 6f Arg Trp 7 145 97 81

Compuesto 5 Arg Bip(4-Ph) Estable 5 3 3

Compuesto 4 Lys 2,5,7-tri-terc-butiltript�fano Estable 3 <2

Compuesto 3 Arg Phe(4-(1-Naftilo)) 20 3 3

Compuesto 2 Arg 2,5,7-tri-terc-butiltript�fano Estable <3 <3 <3

Compuesto 1 Arg Phe(4-(2-Naftilo)) Estable 4 <3 <3

a Se us� la Calculadora M�dica de la Universidad de Cornell para calcular la semivida.

b Concentración inhibitoria mínima

c Staphilococcus aureus, cepa ATCC 25923

a Staphylococcus aureus resistente a meticilina ATCC 33591

e Staphylococcus epidermis resistente a meticilina ATCC 27626

f fuera del alcance de la invención

Ejemplo 4 Actividad in vivo del compuesto 2

Se infect� la piel de ratones con Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes, y posteriormente se administraron un total de tres tratamientos a intervalos de tres horas. Tres horas después del último tratamiento, se recogieron biopsias de piel y se determin� el número de unidades formadoras de colonias (UFCs) presentes en la muestra de piel. Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2, expresados como el número de unidades formadoras de colonias por ratón.

En el experimento 1 (Figura 1), se aplicó el compuesto 2 a la piel murina como parte de una crema o un gel que

5 contenía un 2% (p/p) de compuesto 2. Se us� la misma crema o gel sin el compuesto 2 como control negativo (placebo). Se puede observar claramente que el número de UFCs se redujo cuando se aplicó una crema o gel que contenía el compuesto 2 a la piel murina, en comparación con el control negativo, lo que indica que el compuesto 2 ejerció un efecto antimicrobiano contra Staphylococcus aureus. La naturaleza del vehículo, crema o gel, no tuvo un efecto significativo.

10 En el experimento 2 (Figura 2), se aplicó el compuesto 2 en dos concentraciones diferentes, en forma de un gel del 1% o del 2%. Se us� un gel placebo y un agente antibacteriano conocido, "bactroban", como controles. Se puede observar que los geles que contienen el compuesto 2 fueron más eficaces para reducir el número de UFCs que el gel placebo o el bactroban. El gel que contuvo un 2% de compuesto 2 fue más eficaz que el gel que contuvo

15 solamente un 1% de compuesto 2.

Ejemplo 5 Eficacia ex vivo del Compuesto 2 contra Tricophyton rubrum en un modelo de uña infectada

El objetivo de este estudio fue medir la eficacia antif�ngica del Compuesto 2 (como se definió en el Ejemplo 1) para 20 el tratamiento de la onicomicosis y compararlo con Loceryl�, comercialmente disponible, en el modelo de uña infectada TCCTTM in vitro de MedPharm mediante el uso de uñas humanas.

Materiales

25 El artículo de ensayo 1 es el Compuesto 2 en forma de una sal de HCl. El artículo de referencia 1 es la laca de uñas Loceryl�

Tabla 4: Lista de materiales usados en el estudio

Materiales

Proveedor

Anfotericina B

Sigma, R.U.

Patrones de ATP

Sigma, R.U.

BacTiter-Glo™

PROMEGA, R.U.

Etanol

Fisher, R.U.

Agar Sabouraud-Dextrosa

Oxoid, UK

Disoluci�n de Ringer

Oxoid, UK

Hidrocloruro de terbinafina

Hetero Labs Limited, India

Tween 80

Merck, Alemania

30 Sistemas de ensayo Sistema ChubTur� 35 ! El sistema de ensayo ChubTur� ha sido diseñado por MedPharm. ! El sistema de ensayo ChubTur� se estableció mediante el uso de T. rubrum como hongo de ensayo, y los detalles de la fuente se describen más adelante. 40 ! Los sistemas de ensayo ChubTur� se establecieron a temperatura ambiente. Sin embargo, la incubaci�n de las celdas finales es a 25 � 2 �C.

T. rubrum

45 Un tubo de agar Sabouraud-dextrosa (SDA) inclinado se inocul� con T. rubrum obtenido de la Universidad de Cardiff. El cultivo se aisl� en un principio de un paciente de onicomicosis. Tras la recepción, el organismo se subcultiv� en tubos de SDA inclinado a 25 �C durante 7 días, y las muestras de referencia se colocaron en una disolución de glicerol y se congelaron criog�nicamente. El organismo se ha subcultivado trimestralmente para mantener la viabilidad. Los cultivos se almacenan a 25 �C durante siete días después del subcultivo, y después se

50 almacenan a 2-8 �C hasta que son necesarios.

M�todos

Investigaci�n preliminar 55 Preparación de Compuesto 2

Se prepar� una disolución saturada del Compuesto 2 mediante el uso de 10 mg de Compuesto 2 en 1 ml de agua desionizada. Después de agitar durante la noche, la mezcla se centrifug� a 13.000 rpm durante 5 min, y el sobrenadante resultante se decant� y se almacen� a 2-8 �C durante un máximo de 14 días.

El placebo fue agua desionizada solamente.

Preparaci�n de suspensiones de organismos

Preparaci�n de agar Sabouraud-dextrosa

Brevemente, se añadieron 65 g de SDA en polvo a 1 L de agua desionizada. La mezcla se calentó hasta que el agar se disolvió visiblemente. Después se esterilizó a 121 �C durante 15 min en un autoclave, se dej� enfriar a 56 �C, antes de transferir 25 ml a placas Petri estériles de 90 mm. La placa Petri se dej� con la tapa ligeramente entreabierta (aprox. una apertura de 1 cm) durante 30 min bajo una cámara de flujo laminar antes del uso.

Preparaci�n de la disolución de Ringer

La disolución de Ringer se prepar� como se describió en el documento SOP 3080. La disolución se esterilizó después en un autoclave durante 15 min a 121 �C.

Preparaci�n de una suspensión de T. rubrum

(i)

Una placa de SDA de 90 mm se sembr� con T. rubrum retirando suavemente el micelio y las esporas con el uso de una torunda estéril de un cultivo inclinado, y transfiri�ndolas a la superficie del agar.

(ii)

La placa de agar se incub� después a 25 �C durante 7 días.

(iii) Las esporas blancas se arrastraron después de la superficie de la placa con disolución de Ringer (20 ml).

(iv)

La suspensión de esporas se filtr� después a través de una gasa estéril (Smith+Nephew, Propax, gasa de 7,5 cm x 7,5 cm 8 Ply, BP Tipo 13) para eliminar el micelio y los restos de agar.

(v)

Se llev� a cabo un recuento viable de la suspensión de esporas y el recuento de esporas se ajust� a aproximadamente 1 x 107 ufc/ml, diluyendo o concentrando las esporas adecuadamente en un volumen final de 20 ml.

Preparaci�n de uñas

Antes de cortar las uñas humanas distales en segmentos de 3 mm x 3 mm, las uñas se extrajeron del congelador y se colocaron en una cámara de flujo laminar durante 30 min para equilibrarlas a temperatura ambiente. Tras esto, las uñas se lavaron brevemente por separado como sigue:

(i)

Las uñas se sumergieron en una disolución en agua de etanol al 70% y se mezclaron en v�rtex durante 1 min.

(ii)

La disolución de etanol se decant� y se sustituyó con una disolución reciente de etanol al 70 %, y se mezcl� en v�rtex durante un minuto más.

(iii) La disolución de etanol se decant� y se sustituyó con disolución de Ringer, se mezcl� en v�rtex durante 1 min y se decant� y se sustituyó con disolución de Ringer reciente. Este proceso de lavado con disolución de Ringer se llev� a cabo tres veces, sustituyendo la disolución de lavado en cada fase.

(iv)

Una vez que se complet� el proceso de lavado, las uñas se colocaron en una placa Petri estéril sin tapa y se secaron al aire bajo una cámara de flujo laminar durante 30 min a temperatura ambiente.

Descripci�n del método: Celdas ChubTur� Las celdas ChubTur� se usaron como sigue:

(i)

Despu�s de preparar las uñas, se midió el grosor de cada uña mediante el uso de un calibre antes de montarlas en las celdas ChubTur�.

(ii)

Los segmentos de uñas se inocularon inicialmente en la parte inferior con T. rubrum (5 μL de ~1x107 ufc/ml), se secaron en una cámara de flujo laminar y después se montaron en una celda ChubTur� con el lado dorsal hacia arriba. El contenido de la cámara receptora (volumen de 4,4 � 0,24 cm3) se rellen� hasta la mitad con disolución de Ringer estéril.

(iii) Las celdas se incubaron después a 25 � 3 �C durante 14 días para permitir el crecimiento completo del organismo en la uña.

5 (iv) A los 14 días, las celdas ChubTur� se retiraron de la incubaci�n y se aplicaron 10 μL del Compuesto 2 y de Loceryl� por separado a la superficie de la uña en posición opuesta al lado en el que se inocul� a las uñas la suspensión de organismos. Una vez que el Compuesto 2 y Loceryl� se aplicaron a la superficie de las uñas, las celdas se devolvieron a la incubaci�n a 25 � 3 �C.

10 (v) Se emple� un régimen de dosis múltiples en el que se aplicaron dosis a las celdas a intervalos de 24 h durante 5 días (Tabla 5). Antes de aplicar las dosis, se lav� la superficie de las uñas con disolución de Ringer estéril para eliminar cualquier exceso de Compuesto 2 y de Loceryl� de la dosis previa. Una vez que se hizo esto, se aplicó una dosis fresca de 10 μL de Compuesto 2 y de Loceryl� a las celdas adecuadas según el régimen de dosificación de la tabla 5.

15 Tabla 5: Tabla que muestra un resumen de las muestras a investigar:

Sistemas Experimentales

Artículo de ensayo Régimen de dosificación

A (n=3)

Compuesto 2 Diario durante 5 días

B (n=3)

Loceryl�

C (n=3)

Placebo

D (n=2)

Control Infectado -

E (n=2)

Control Sin Infectar -

(vi) Después de la dosificación de 5 días, cuando fue posible se elimin� el exceso de Compuesto 2 y de Loceryl�

20 de la superficie de las uñas, y las uñas se desmontaron de la junta de las celdas ChubTur�. Las uñas se analizaron después en busca de la presencia de ATP de los hongos viables.

Resultados y discusión

25 Investigación de interferencia: Efecto del apagamiento en presencia de la formulación.

Cualquier efecto de apagamiento de los Artículos de Ensayo se ensay� añadiendo 10 μL de Compuesto 2, Loceryl� y placebo a un patrón de calibración de ATP de concentración conocida (n=3) y comparándolo con el patrón solo (que no contiene Artículos de Ensayo). Se gener� una curva de regresión lineal que muestra la concentración frente

30 a las unidades de luminiscencia para los patrones de calibración de ATP en el intervalo de 10 mg/mL a 1000 ng/mL. La comparación entre el patrón de ATP en presencia de diversas matrices se presenta en la Figura 3. Se puede observar a partir del gráfico que el Compuesto 2 y Loceryl mostraron apagamiento cuando se añadieron a una concentración conocida de disolución patrón de ATP (750 ng/mL), ya que la unidad de absorbancia para las dos formulaciones mostr� una disminución notable en comparación con el patrón solo. El placebo no mostr� efecto de

35 apagamiento, ya que no hubo una diferencia evidente entre el placebo y el patrón solo.

Recuperaci�n de ATP tras la aplicación del fármaco

La Figura 4 muestra la variación en la liberación de ATP de muestras de uñas infectadas tras la aplicación de los

40 Artículos de Ensayo (n=3) y su comparación con muestras de uñas de control infectadas y sin tratamiento, y sin infectar y sin tratamiento (los controles se ensayaron a n=2). Se debería indicar que cuanto menor fue la cantidad de ATP recuperada, mayor fue la eficacia del Artículo de Ensayo contra el organismo de ensayo. Se puede observar a partir del gráfico que el control infectado y sin tratar produjo una recuperación de ATP elevada esperada, mientras el control sin infectar y sin tratar produjo niveles muy bajos de ATP. También se observ� que el Compuesto 2 y

45 Loceryl� produjeron una recuperación baja de ATP en comparación con el control infectado y el placebo, lo que indica una eficacia elevada contra el organismo de ensayo. No hubo una diferencia evidente entre el placebo y el control infectado y sin tratar.

Ejemplo 6

50 Se prepar� un compuesto adicional de la invención y se obtuvieron los valores de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) contra una diversidad de bacterias.

H-Arg-Tbt-Arg-NH (CH2)2(2-Br-fenilo)

55 Saponificaci�n de Boc-Arg-Tbt-Arg-OMe

Se a�adi� LiOH�H2O (373 mg, 8,9 mmol) a una disolución incolora de BocArgTbtArg-OMe �2 HCl (2,5 g, 2,9 mmol, preparada como se describió en el documento WO 01/66147) en una mezcla de H2O (5 ml) y THF (20 ml), y la reacción se agit� a temperatura ambiente durante 30 min, durante lo cual se desarroll� rápidamente un color amarillo. Se a�adi� HCl diluido (52 ml) y salmuera saturada (35 ml), y la mezcla resultante se extrajo con DCM. El DCM se evapor� y el material orgánico se redisolvi� en DCM, se secó sobre Na2SO4, se filtr� y se concentr�. Masa

5 obtenida de BocArgTbtArg-OH: 2,46 g, 93%.

Acoplamiento mediado por PyBOP

La sal de TFA de BocArgTbtArgCO2H (365 mg, 0,35 mmol) se mezcl� con 2-bromo fenil etil amina (53 μl) en DMF

10 (0,9 ml), y se a�adi� DIPEA (120 μl). La mezcla de reacción se agit� a temperatura ambiente durante 5 min antes de añadir PyBOP (194 mg, 0,37 mmol), y después se dej� durante 3 horas. Antes del procesamiento, la mezcla se diluyó con EtOAc (20 ml) y se lav� con 2x30 ml de disol. de ácido cítrico del 5%, 2x30 ml de disol. de NaHCO3 del 5%, 30 ml de salmuera sat., seguido de secado sobre Na2SO4, filtración y concentración. El producto bruto se aisl� en forma de un aceite (432 mg) que contuvo un subproducto del reactivo de acoplamiento. El grupo Boc se elimin�

15 disolviendo el producto bruto en 15 ml de HCl 4 M en 1,4-dioxano y agitándolo durante 30 min a temperatura ambiente antes de la concentración y purificación final mediante cromatograf�a de fase inversa.

Pureza: >95%, Espectrometr�a de masas con electronebulizaci�n (m/z, i�n molecular protonado): 866,48/868,56 (calculado), 866,5/868,5 (observado).

20 Datos microbiol�gicos

Concentraci�n inhibitoria mínima (mg/l), H-Arg-Tbt-Arg-NH-Y-Z

Y-Z

E. coli S. aureus MRSA Str. pyogenes

-(CH2)2-(2-BrPh)

6 3 3 3

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de fórmula (II)

   5 AA1-AA2-AA1-X-Y-Z (II)

   en la que:

   AA2 es un amino�cido cati�nico;

   10 AA2 es un amino�cido seleccionado de tributil tript�fano (Tbt) o un derivado de bifenilalanina seleccionado de Phe (4-(2-Naftilo)), Phe (4-(1-Naftilo)), Bip (4-n-Bu), Bip (4-Ph) y Bip (4-T-Bu);

   X es un átomo de N, que puede estar sustituido con un grupo arilo o alquilo C1-C10 ramificado o sin ramificar, cuyo 15 grupo puede incorporar hasta 2 hetero�tomos seleccionados de N, O y S;

   Y representa -Ra-Rb- en la que

   Ra es C y

   20 Rb es C; cada uno de Ra y Rb puede estar sustituido con grupos alquilo C1-C4 o sin sustituir; y

   Z es un grupo que comprende 1 grupo cíclico de 5 � 6 átomos distintos de hidrógeno, y el grupo cíclico puede estar sustituido; el resto Z incorpora un máximo de 15 átomos distintos de hidrógeno; y en la que

   25 el enlace entre Y y Z es un enlace covalente entre Ra o Rb de Y y un átomo distinto de hidrógeno del grupo cíclico de Z,

   en el que dicho compuesto es un p�ptido. 30
2. 2. Un compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 1, en el que dichos amino�cidos cati�nicos son lisina y/o arginina.

3. 3.

   Un compuesto de fórmula (II) según cualquier reivindicación precedente, en el que X est� sin sustituir. 35

4. 4. Un compuesto de fórmula (II) según cualquier reivindicación precedente, en el que Y es -Ra-Rb- y est� sin sustituir, preferiblemente Y es -CH2-CH2-.

5. 5.

   Un compuesto de fórmula (II) según cualquier reivindicación precedente, en el que Z es fenilo. 40

6. 6.

   Un compuesto según cualquier reivindicación precedente, en el que -X-Y-Z juntos son -NHCH2CH2Ph.

7. 7.

   Un compuesto según cualquier reivindicación precedente y que tiene la fórmula estructural

   o
8. 8. Un compuesto según cualquier reivindicación precedente para el uso en la terapia. 5
9. 9. Un compuesto según cualquier reivindicación precedente para el uso como agente antimicrobiano, antif�ngico

   o antitumoral.

10. 10.

    El uso ex vivo de un compuesto según cualquier reivindicación precedente como agente antimicrobiano. 10

11. 11. Una formulación que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 mezclado con un diluyente, vehículo o excipiente adecuado.

12. 12.

    Una formulación según la reivindicación 11, que es una formulación farmacéutica que es preferiblemente 15 adecuada para la administración típica.

    Crema Comp. 2, Comp. 2, Gel placebo 2% en crema 2% en gel placebo

    Figura 1

    Gel Bactroban Comp. 2, Comp. 2, placebo 1% en gel 2% en gel

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4