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ES2338164T3 - Compuestos para la inhibicion de la apoptosis. - Google Patents

Compuestos para la inhibicion de la apoptosis. Download PDF

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ES2338164T3
ES2338164T3 ES06820951T ES06820951T ES2338164T3 ES 2338164 T3 ES2338164 T3 ES 2338164T3 ES 06820951 T ES06820951 T ES 06820951T ES 06820951 T ES06820951 T ES 06820951T ES 2338164 T3 ES2338164 T3 ES 2338164T3
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phenyl
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Enrique Perez Paya
Maria Jesus Vicent Docon
Mar Orzaez Calatayud
Laura Mondragon Martinez
Angel Messeguer Paypoch
Alejadra Moure Fernandez
Gloria Sanclimens Perez De Rozas
Gema Malet Engra
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Laboratorios Salvat SA
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Laboratorios Salvat SA
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Abstract

Compuesto de fórmula general I, **(Ver fórmula)** sus estereoisómeros y mezclas de los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo, en la que: R1representa alquilo (C1-C5), alquenilo (C2-C5), -(CH2)1-3-NHCO-alquilo (C1-C3), -(CH2)1-3-CONRaRb, -(CH2)0-3-Cic (3-6), -(CH2)0-3-Hetcic (5-6), -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), -(CH2)1-3-Hetar (5-10), -(CH2)2-CH(fenilo)2, -(CH2)2-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH2)2-CH[Hetar (5-6)]2; R2 representa -(CH2)0-3-Cic (3-6), -(CH2)0-3-Hetcic (5-6), -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), -(CH2)1-3-Hetar (5-10), -(CH2)2-CH(fenilo)2, -(CH2)2-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH2)2-CH[Hetar (5-6)]2; R3 representa -(CH2)1-3-fenilo, -(CH2)1-3-(1-naftilo), -(CH2)1-3-(2-naftilo), o -(CH2)1-3-Hetar (5-6); alquilo (C1-C5) y -alquenilo (C2-C5) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de -O-alquilo (C1-C2), -S-alquilo (C1-C2), -NH2, -NH-alquilo (C1-C2) y -N[alquilo (C1-C2)]2; alquilo (C1-C3) puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno; Ra y Rb representan independientemente -H o -alquilo (C1-C3) Cic (3-6) representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros; Hetcic (5-6) representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N; Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3 y -OH; Hetar (5-6) y Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos, respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N; fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar (5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF3, -OH, -O-alquilo (C1-C3), -CO-alquilo (C1-C3), -alquil (C1-C5)-NRaRb, -NRaRb y -SO2NH2; con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.

Description

Compuestos para la inhibición de la apoptosis.
La presente invención se refiere a compuestos que actúan como inhibidores de la apoptosis, así como a procedimientos para su preparación, a composiciones farmacéuticas que los contienen y a su uso en medicina.
Técnica anterior
La apoptosis es un proceso biológico interesante debido a su importancia en una amplia variedad de sistemas biológicos, incluyendo el recambio celular normal, el sistema inmunitario y el desarrollo embrionario y su asociación con diferentes enfermedades. Una apoptosis inapropiada participa en muchas patologías humanas, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington, isquemia, trastornos autoinmunitarios y varias formas de cáncer (Reed J.C., Trends Mol. Med. 2001, 7: 314-319).
Diversos estímulos apoptóticos, incluyendo la activación de los receptores de muerte de la superficie celular, agentes anticancerígenos, irradiación, carencia de factores de supervivencia e isquemia (revisado en Strasser A. et al., Annu. Rev. Biochem. 2000, 69: 217-245) inducen cascadas de señalización que activan todas una familia de cisteína aspartil-proteasas denominadas caspasas. Estas proteasas ejecutan el proceso apoptótico.
Algunas señales apoptóticas activan la ruta intrínseca o mediada por mitocondrias que utiliza caspasa 9 como su iniciador. La formación del complejo macromolecular denominado apoptosoma es un acontecimiento clave en esta ruta.
El apoptosoma es un complejo multiproteico de holoenzima formado por Apaf-1 (factor de activación de proteasas apoptóticas) activado por el citocromo c, dATP y procaspasa 9 (Li P. et al., Cell 1997, 91: 479-489; Acehan D et al., Mol. Cell 2002, 9: 423-432; Rodríguez J. et al., Genes Dev. 1999, 13: 3179-3184; Srinivasula S.M. et al., Mol. Cell 1998, 1: 949-957). En este complejo macromolecular, se activa la caspasa 9 asociada al apoptosoma y entonces, a su vez, se activan caspasas efectoras. Para identificar moléculas que podrían mejorar la apoptosis asociada a enfermedad, los esfuerzos para el descubrimiento de fármacos han tenido como objetivo inicialmente la actividad caspasa, y por tanto, se buscaron inhibidores o activadores enzimáticos específicos (Scott C.W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304: 433-440; García-Calvo M, J. Biol. Chem. 1998, 273: 32608-32613), en lugar de moduladores en la ruta/cascada de activación superior.
No obstante, las interacciones proteína-proteína en un nivel superior a la activación de caspasas también pueden ser puntos de intervención relevantes para el desarrollo de moduladores de las rutas de apoptosis. En particular, datos recientes proponen la formación del apoptosoma como una diana interesante para el desarrollo de moduladores apoptóticos.
Por tanto, existe un interés por hallar moléculas que inhiben la activación de la apoptosis mediada por el apoptosoma.
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Descripción de la invención
Un aspecto de la presente invención se refiere a la provisión de nuevos compuestos de fórmula general I,
1
sus estereoisómeros y mezclas de los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo,
en la que:
R1
representa alquilo (C_{1}-C_{5}), alquenilo (C_{2}-C_{5}), -(CH_{2})_{1-3}-NHCO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb, -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
R2
representa -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
R3
representa -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), o -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6);
alquilo (C_{1}-C_{5}) y -alquenilo (C_{2}-C_{5}) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de -O-alquilo (C_{1}-C_{2}), -S-alquilo (C_{1}-C_{2}), -NH_{2}, -NH-alquilo (C_{1}-C_{2}) y -N[alquilo (C_{1}-C_{2})]_{2};
alquilo (C_{1}-C_{3}) puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
Ra y Rb representan independientemente -H o -alquilo (C_{1}-C_{3})
Cic (3-6) representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros;
Hetcic (5-6) representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3} y -OH;
Hetar (5-6) y Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos, respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar (5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo (C_{1}-C_{3}), -CO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -alquil (C_{1}-C_{5})-NRaRb, -NRaRb y -SO_{2}NH_{2};
con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto que es un conjugado de fármaco que comprende un radical de fórmula II
2
sus estereoisómeros y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo, conjugado a un polímero de poli(ácido glutámico), en los que R1, R2 y R3 tiene los significados definidos para el compuesto de fórmula I, sin la condición de R2; cada R4 representa independientemente una cadena lateral de cualquiera de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural, y n es 0,1, 2 ó 3.
Por tanto, los compuestos de fórmula II comprenden diferentes restos: un radical de fórmula I, que forma un enlace amida a una cadena peptídica de n L-aminoácidos y un derivado de amida de L-lisina, en el que el N de su cadena lateral está unido al polímero de poli(ácido glutámico).
En las definiciones previas, las expresiones alquilo (C_{1}-C_{3}) y alquilo (C_{1}-C_{5}) representan cadenas hidrocarbonadas saturadas lineales o ramificadas que contienen desde uno hasta tres y desde uno hasta cinco átomos de carbono, respectivamente. Los ejemplos de alquilo (C_{1}-C_{3}) incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo. Los ejemplos de alquilo (C_{1}-C_{5}) incluyen adicionalmente y sin limitación butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, 1-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo y 2,2-dimetilpropilo.
La expresión alquenilo (C_{2}-C_{5}) representa una cadena carbonada lineal o ramificada insaturada, que contiene desde dos hasta cinco átomos de carbono y uno o más dobles enlaces, por ejemplo, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo y 1,3-butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metil-2-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil-1-butenilo, 1,1-dimetil-2-propenilo y 1,2-dimetil-1-propenilo.
Los grupos alquilo (C_{1}-C_{3}), alquilo (C_{1}-C_{5}) y alquenilo (C_{2}-C_{5}) pueden estar opcionalmente sustituidos según la descripción, siempre que sea apropiado desde un punto de vista químico.
La expresión Cic (3-6) representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros. Tal como se mencionó anteriormente, puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes, que pueden situarse en cualquier posición disponible del anillo. Los ejemplos de Cic (3-6) incluyen, sin limitación, radicales de ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, 1-ciclobuteno, 2-ciclobuteno, 1-ciclopenteno, 2-ciclopenteno, 1-ciclohexeno, 2-ciclohexeno y 3-ciclohexeno.
La expresión Hetcic (5-6) representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico de 5 a 6 miembros saturado o parcialmente insaturado que contiene uno o dos heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N, que puede estar sustituido según la descripción en cualquier posición disponible del anillo. Los ejemplos de Hetcic (5-6) incluyen, sin limitación, radicales de dihidrofurano, pirrolina, pirazolina, imidazolidina, isotiazolidina, isoxazolidina, oxazolidina, pirazolidina, pirrolidina, tiazolidina, dioxano, morfolina, piperazina, piperidina, pirano, tetrahidropirano, oxazina, oxazolina, pirrolina, tiazolina, pirazolina, imidazolina, isoxazolina e isotiazolina.
Las expresiones Hetar (5-6) y Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos, respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N, que puede estar sustituido según la descripción en cualquier posición disponible del anillo. Los ejemplos de Hetar (5-6) incluyen, sin limitación, radicales de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, isoxazol, isotiazol, oxazol, 1,2,4-oxadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,3,4-oxadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, piridina, pirimidina, piridazina y pirazina. Los ejemplos de Hetar (5-10) incluyen además, sin limitación, radicales de bencimidazol, benzofurano, benzotiazol, benzotiofeno, imidazopirazina, imidazopiridazina, imidazopiridina, imidazopirimidina, indazol, indol, isoindol, isoquinolina, pirazolopirazina, pirazolopiridina, pirazolopirimidina, purina, quinazolina, quinolina y quinoxalina.
La expresión "opcionalmente sustituido con uno o más" significa que un grupo puede estar o bien no sustituido o bien sustituido con uno o más, preferiblemente con 1, 2, 3 ó 4 sustituyentes, siempre que este grupo tenga 1, 2, 3 ó 4 posiciones susceptibles de sustituirse.
En toda la descripción y las reivindicaciones, el término "comprenden" y variaciones del término, tales como "que comprenden", no pretenden excluir otros aditivos, componentes, elementos o etapas.
Tal como se usa en ellas, la expresión "tratamiento" incluye tratamiento, prevención y control de tal estado. La expresión "farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a aquellos compuestos, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance del criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una razón riesgo/beneficio razonable.
En una realización particular de la invención, R1 representa alquilo (C_{1}-C_{5}), -(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb, -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6); -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6); -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo) o -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), todos ellos opcionalmente sustituidos.
En una realización particular de la invención, R1 representa -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10),
-(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo) o -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), todos ellos opcionalmente sustituidos.
En otra realización, R1 representa -(CH_{2})_{2}-fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno. En otra realización, R1 representa 2,4-diclorofenilo.
En otra realización, R2 representa -(CH_{2})_{1-3}-arilo opcionalmente sustituido, o -(CH_{2})_{2}-CH(Ph)_{2} opcionalmente sustituido, con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo. En otra realización, R2 representa 3,3-difenilpropilo, con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
En otra realización, R3 representa -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6) o -(CH_{2})_{2}-fenilo, ambos opcionalmente sustituidos. En otra realización, R3 representa -(CH_{2})_{2}-fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno. En otra realización, R3 representa 2,4-diclorofenilo.
En otra realización, R2 representa 3,3-difenilpropilo y R1 y R3 representan ambos 2,4-diclorofenilo.
Otra realización de la presente invención, se refiere a un compuesto que es un conjugado de fármaco que comprende un compuesto de fórmula II conjugado a un polímero de poli(ácido glutámico) tal como se definió previamente, en el que dicho polímero tiene un peso molecular de desde 20 hasta 60 kDa.
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Otra realización, de la invención se refiere a un compuesto de fórmula III que es un conjugado de polímero-fármaco
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en la que R1, R2, R3 y R4 tiene los significados descritos en la fórmula general II y la proporción de y con respecto a x es del 25-30% al 75-70% en peso.
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En otra realización, en un compuesto de fórmula III n representa 0. En otra realización, n representa 2 y R4 representa una cadena lateral de glicina. En otra realización, n representa 3 y R4 representa una cadena lateral de glicina, una cadena lateral de arginina y una cadena lateral de fenilalanina. En otra realización, n representa 3 y R4 representa una cadena lateral de valina, una cadena lateral de arginina y una cadena lateral de fenilalanina.
En el conjugado de polímero-fármaco, el poli(ácido glutámico) puede ser poli(ácido L-glutámico), poli(ácido D-glutámico) o poli(ácido DL-glutámico). En una realización de la invención, el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico).
Además, todas las posibles combinaciones de las realizaciones mencionadas anteriormente también forman parte de esta invención.
Los compuestos de fórmula I comprenden al menos un centro quiral. La presente invención incluye tanto los compuestos racémicos como los compuestos enantioméricos de fórmula I, es decir, compuestos en los que la configuración del carbono quiral unido a R1 es (S) y compuestos en los que la configuración del carbono quiral unido a R1 es (R) tal como se muestra a continuación.
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Los compuestos de fórmula II comprenden al menos dos centros quirales. La presente invención también incluye tanto mezclas de estereoisómeros como los estereoisómeros aislados de fórmula II.
Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más átomos de nitrógeno básicos y, por tanto, pueden formar sales con ácidos, que también forman parte de esta invención. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, sales de adición con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, perclórico, sulfúrico y fosfórico, así como sales de adición de ácidos orgánicos tales como ácido acético, metanosulfónico, trifluorometanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, mandélico, oxálico, succínico, fumárico, tartárico y maleico. Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más protones ácidos y, por tanto, pueden formar sales con bases, que también forman parte de esta invención. Los ejemplos de estas sales incluyen sales con cationes metálicos, tales como por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalinotérreo o un ion de aluminio; o puede coordinarse con una base orgánica o inorgánica. Una base orgánica aceptable incluye entre otros dietilamina y trietilamina. Una base inorgánica aceptable incluye hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio e hidróxido de sodio. Puede haber más de un catión o anión dependiendo del número de funciones con carga y de la valencia de los cationes y aniones.
Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-
etilmorfolina, etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina, y similares.
No existe limitación del tipo de sal que puede usarse, siempre que éstas sean farmacéuticamente aceptables cuando se usan para fines terapéuticos. Las sales pueden sintetizarse a partir del compuesto original que contiene un resto ácido o básico mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, pueden prepararse sales de este tipo haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, tal como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo o en una mezcla de ambos. Los compuestos de fórmula I o fórmula III y sus sales difieren en algunas propiedades físicas pero son equivalentes para los fines de la presente invención.
Algunos de los compuestos de fórmula I o fórmula III de la presente invención pueden existir en formas no solvatadas así como solvatadas tales como, por ejemplo, hidratos. La presente invención engloba todas las formas de este tipo mencionadas anteriormente que son farmacéuticamente activas.
Algunos de los compuestos de fórmula general I pueden presentar polimorfismo, englobando la presente invención todas las posibles formas polimórficas, y mezclas de las mismas. Pueden prepararse diversos polimorfos mediante cristalización en diferentes condiciones o calentando y fundiendo el compuesto seguido por enfriamiento gradual o rápido. Puede determinarse la presencia de polimorfos mediante espectroscopía de RMN de sólidos, espectroscopía IR, calorimetría diferencial de barrido, difracción de rayos X de polvo u otras técnicas de este tipo.
Los compuestos de fórmula I de la presente invención comprenden al menos un centro quiral. Adicionalmente, pueden tener centros quirales adicionales. La presente invención incluye cada uno de los posibles estereoisómeros y mezclas de los mismos, particularmente mezclas racémicas de los mismos. Puede prepararse un enantiómero individual mediante cualquiera de los procedimientos usados comúnmente, por ejemplo, mediante separación cromatográfica de la mezcla racémica con una fase quiral estacionaria, mediante resolución de la mezcla racémica mediante técnicas de cristalización fraccionada de las sales diastereoméricas de los mismos, mediante síntesis quiral, mediante resolución enzimática o mediante biotransformación. Esta resolución puede llevarse a cabo con cualquier producto intermedio sintético quiral o con productos de fórmula general I. Alternativamente, puede obtenerse cualquier enantiómero de un compuesto de la fórmula general I mediante síntesis enantioespecífica usando materiales de partida ópticamente puros o reactivos de configuración conocida.
Los compuestos de fórmula I o fórmula III pueden existir como varios diastereoisómeros, y pueden separarse mediante técnicas convencionales tales como cromatografía o cristalización fraccionada. Algunos compuestos de la presente invención pueden presentar isómeros cis/trans. La presente invención incluye cada uno de los isómeros geométricos y sus mezclas. La presente invención cubre todos los isómeros y mezclas de los mismos (por ejemplo, mezclas racémicas) ya se obtengan mediante síntesis y también mediante el mezclado físico de los mismos.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de los compuestos novedosos citados anteriormente, sus formas tautoméricas, sus estereoisómeros, sus polimorfos o sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse usando los métodos descritos a continuación, así como mediante otros procedimientos conocidos en el campo de la síntesis orgánica. Los métodos preferidos incluyen, pero no se limitan a, los procedimientos generales mostrados en los esquemas adjuntos. A menos que se establezca lo contrario, los grupos R1, R2, R3, R4, n, x e y tienen el significado descrito en fórmulas generales I, II y III.
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Los compuestos de fórmula I pueden obtenerse usando el siguiente método:
Método A
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Según el método A, tras desprotección del grupo fluorenilmetoxicarbonilo, se acila la amina de soporte sólido IV con un agente acilante V, en el que X representa un grupo saliente, por ejemplo, halógeno e Y representa -OH o halógeno. Cuando Y representa halógeno, por ejemplo, cloruro de cloroacetilo, puede llevarse a cabo la reacción en presencia de una base terciaria como trietilamina. Cuando Y representa -OH, por ejemplo, ácido bromoacético, puede llevarse a cabo la reacción en presencia de un agente de acoplamiento adecuado, por ejemplo, N,N'-diisopropilcarbodiimida. En ambos casos, puede realizarse la reacción en un disolvente inerte que puede hinchar correctamente la resina, tal como N,N'-dimetilformamida o diclorometano y a temperatura ambiente o usando irradiación de microondas, disminuyendo el tiempo de reacción. Entonces, se acopla una amina VIa usando una amina terciaria como base. Puede llevarse a cabo la reacción mediante calentamiento, por ejemplo, a 60ºC, o mediante irradiación de MW.
Se hace reaccionar un ácido carboxílico VIII, en el que PG representa un grupo protector, tal como alilo, con la amina VII para producir la amida IX usando un agente de acoplamiento, por ejemplo, la combinación de N,N'-diisopropilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol. Luego, se introduce una amina VIb mediante la reacción de Michael usando una base y un disolvente tal como N,N'-dimetilformamida o dimetilsulfóxido para obtener el producto intermedio X. Tras la repetición de la acilación y la aminación de la misma manera en que se describió para el producto intermedio VII, se obtiene XI. La desprotección llevada a cabo usando PhSiH_{3} y Pd(PPh_{3})_{4} en diclorometano como disolvente (Tetrahedron Lett 1999, 40:2505-2508; Tetrahedron Lett 1997, 38:7275-7278) o con KOH acuoso en dioxano produce XII. Se fomenta la ciclación mediante la formación de la amida usando reactivos de acoplamiento habituales para procedimientos con enlaces peptídicos en fase sólida como la combinación de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris-pirrolidinofosfonio y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base terciaria como N,N-diisopropiletilamina. Puede liberarse el compuesto final I de la resina usando una mezcla de ácido trifluoroacético, diclorometano y agua.
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Una estrategia alternativa para obtener un compuesto de fórmula I supone la acilación de las aminas IV y X con aminoácidos de fórmulas XIIIa y XIIIb, respectivamente (método B).
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Método B
Tal como será obvio para un experto en la técnica, es posible combinar algunas etapas del método A con algunas etapas del método B para obtener un compuesto de fórmula I.
Las aminas primarias de partida VIa, VIb y VIc están disponibles comercialmente o pueden obtenerse mediante métodos conocidos (March, Advanced Organic Chemistry, 1991, Ed. John Wiley & Sons) o usando por ejemplo, el esquema descrito a continuación.
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Esquema 1
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Puede obtenerse una amina mediante la reacción de Mitsunobu partiendo de un alcohol y ftalimida potásica en presencia de, por ejemplo, azodicarboxilato de dietilo (DEAD) y trifenilfosfina en tetrahidrofurano como disolvente y escisión adicional con hidrato de hidrazina (Mitsunobu, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 679-680).
Pueden sintetizarse glicinas N-sustituidas XIIIa y XIIIb mediante los métodos mostrados a continuación, o bien mediante aminación reductora de la correspondiente glicina con el aldehído adecuado (esquema 2) usando agentes reductores tales como NaBH_{4}, NaBH_{3}CN o NaBH(AcO)_{3}, o bien mediante sustitución nucleófila de un éster con la amina adecuada E-NH2 (esquema 3).
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Esquema 2
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Esquema 3
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Los compuestos de fórmula II pueden obtenerse usando reacciones análogas a las descritas anteriormente.
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Por tanto, con el fin de obtener el correspondiente ácido carboxílico de fórmula I, es decir, un compuesto de fórmula Ia, se usa la misma secuencia para la síntesis de un compuesto de fórmula I (usando los métodos A y/o B), excepto porque el soporte sólido de partida (IVa) tiene átomos de halógeno reactivos en lugar de un grupo amino.
También se obtiene el péptido XVI que va a unirse al compuesto usando reacciones habituales para la síntesis de péptidos. Por tanto, se hace reaccionar en primer lugar la amina de soporte sólido IV con una lisina protegida (XIVa) y opcionalmente se hace reaccionar posteriormente con otro aminoácido protegido (XIVb). Tras el acoplamiento, se elimina el grupo protector. Puede repetirse esta secuencia hasta tres veces.
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Entonces se hace reaccionar el ácido carboxílico Ia con la amina XVI y tras la desprotección, se obtiene el compuesto IIa. El acoplamiento de amida entre IIa y el poli(ácido glutámico) XVIIa (obtenido a partir de la correspondiente sal XVII) produce el conjugado de fármaco III.
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Los compuestos de la presente invención son inhibidores de apaf-1. Por tanto, son útiles para el tratamiento o la prevención de un estado asociado con el exceso de apoptosis.
En los adultos, las células posmitóticas, tales como neuronas y células del músculo cardiaco rara vez se renuevan. Así, su pérdida puede producir trastornos neurológicos y cardiacos. Estas células experimentan muerte celular apoptótica en una variedad de enfermedades degenerativas agudas y crónicas. De manera similar, el choque séptico, la isquemia y la intoxicación pueden producir una apoptosis masiva en múltiples órganos. Las infecciones pueden producir un elevado recambio apoptótico de tipos celulares específicos, por ejemplo, linfocitos en el SIDA o células de la mucosa gástrica en la infección por Helicobacter pylori. Los acontecimientos de apoptosis también son de gran importancia en procedimientos para la reperfusión isquémica y de conservación en el trasplante de órganos. Por tanto, estas enfermedades son candidatos para la supresión terapéutica de la muerte celular.
Otras enfermedades o estados relacionados con la apoptosis incluyen, sin limitación, accidente cerebrovascular, traumatismos, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, meningitis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, esclerosis múltiple, enfermedades relacionadas con priones, así como otras enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, patologías relacionadas con el alcohol y tratamiento de la alopecia.
Por tanto, la presente invención se refiere al uso de estos compuestos para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las enfermedades o estados mencionados anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I, sin la condición de R2, o un compuesto que es un conjugado de polímero-fármaco tal como se definió previamente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o estado asociado con la apoptosis.
También se describe un método para el tratamiento o la prevención de un estado asociado con la inhibición de la apoptosis que comprende administrar un compuesto de fórmula I, sin la condición de R2, o un compuesto que es un conjugado de polímero-fármaco tal como se definió previamente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
También se decribe un método para el tratamiento o la prevención de accidente cerebrovascular, traumatismos, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, meningitis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, esclerosis múltiple, enfermedades relacionadas con priones, isquemia miocárdica, así como otras enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, trasplante de órganos, patologías relacionadas con el alcohol y tratamiento de la alopecia, que comprende administrar un compuesto de fórmula I, sin la condición de R2, o un compuesto que es un conjugado de polímero-fármaco tal como se definió previamente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula I o un compuesto que es un conjugado de polímero-fármaco tal como se definió previamente, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, o bien en dosis únicas o bien múltiples. Los ejemplos de los excipientes mencionados a continuación se facilitan únicamente a modo de ilustración y no han de considerarse como limitantes del alcance de la invención.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma de cualquier formulación farmacéutica. La formulación farmacéutica dependerá de la naturaleza del compuesto activo y su vía de administración. Puede usarse cualquier vía de administración, por ejemplo, tal como administración oral, bucal, pulmonar, tópica, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa), transdérmica, ocular (oftálmica), por inhalación, intranasal, ótica, transmucosa, con implante o rectal. Sin embargo, se prefieren la administración oral, tópica o parenteral.
Las composiciones sólidas para la administración oral incluyen entre otros comprimidos, granulados y cápsulas de gelatina dura, formuladas tanto como formulaciones de liberación inmediata como de liberación modificada.
Alternativamente, los compuestos de la presente invención pueden incorporarse en preparaciones líquidas orales tales como emulsiones, disoluciones, dispersiones, suspensiones, jarabes, elixires o en forma de cápsulas de gelatina blanda. Pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente, tales como agua purificada, etanol, sorbitol, glicerol, polietilenglicoles (macrogoles) y propilenglicol. Las composiciones auxiliares también pueden contener coadyuvantes tales como agentes humectantes, de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, conservantes, tampones, agentes quelantes y antioxidantes.
Las preparaciones inyectables para la administración parenteral comprenden disoluciones, suspensiones o emulsiones estériles en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener coadyuvantes, tales como agentes de suspensión, estabilización o tonicidad o agentes dispersantes.
El compuesto también puede formularse para su aplicación tópica. Las formulaciones incluyen cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, preparaciones de champú, pasta oral, preparaciones de colutorio y parches, en los que se disuelve o dispersa el compuesto en excipientes adecuados.
En una realización de la invención, la composición farmacéutica está en forma de nanoesferas, micropartículas y nanopartículas.
Puede variar la dosificación eficaz de principio activo dependiendo del compuesto particular administrado, la vía de administración, la naturaleza y gravedad de la enfermedad que va a tratarse, así como la edad, el estado general y el peso corporal del paciente, entre otros factores. Un ejemplo representativo de un intervalo de dosificación adecuado es desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, que pueden administrarse como una dosis única o dosis divididas. Sin embargo, la dosificación administrada se dejará generalmente a criterio del médico.
Toxicidad y recuperación célula a través del ensayo de MTT
El ensayo de MTT mide la proliferación celular así como la reducción de la viabilidad celular cuando acontecimientos metabólicos conducen a apoptosis o necrosis. También puede usarse para evaluar la tasa de supervivencia de una línea celular dada cuando se incuba en presencia de compuestos xenobióticos. La reducción de sales de tetrazolio se acepta como una manera fiable de analizar la proliferación celular. El MTT de tetrazolio amarillo (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio) se reduce por células metabólicamente activas y da como resultado la formación intracelular de formazán púrpura que puede medirse espectrofotométricamente tras la solubilización con DMSO.
Se usó el ensayo de MTT en esta invención para evaluar la toxicidad de los compuestos a diferentes concentraciones. Para analizar su posible alteración de la viabilidad celular, se añadieron los compuestos a las líneas celulares Saos-2 y U937 a diferentes concentraciones y se incubaron a diferentes tiempos. Se expresan los resultados mediante la viabilidad celular en porcentaje.
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También se usó el ensayo de MTT para evaluar la recuperación celular mediante la adición de compuestos en líneas celulares con inducción de apoptosis. Para la línea celular Saos-2, se llevó a cabo la inducción de apoptosis mediante la adición de doxiciclina 2 \muM; en el caso de U937, HeLa, U2-OS, se indujo apoptosis mediante doxorubicina 0,25 \muM, 1,5 \muM, 2 \muM, respectivamente. Se expresan los resultados como el % de viabilidad celular considerando que la adición de doxiciclina y doxorubicina induce un 100% de muerte celular y un 0% de recuperación celular en Saos-2 y HeLa, U2-OS o U937, respectivamente.
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Ensayo de inhibición de caspasa
Se analizó la inhibición de caspasa dependiente del tiempo inducida por los compuestos descritos en esta invención. Se hicieron crecer líneas celulares en presencia o ausencia de los compuestos (50 \muM) a diferentes tiempos. Se sometió a ensayo la actividad caspasa usando extractos de células Saos-2 o U937 y Ac-DEVD-afc (N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-afc (7-amino-4-trifluorometilcumarina)) como sustrato (20 \muM). Se monitorizó de manera continua la actividad caspasa mediante la liberación de afc fluorescente usando un fluorímetro Cytofluor 4000 (excitación a 400 nm; emisión a 508 nm) durante 1 hora. Se expresó el efecto de los compuestos sobre la actividad caspasa como el porcentaje de inhibición en la señal de fluorescencia de las células tratadas frente a las células no tratadas (control).
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Inhibición de la apoptosis inducida por Apaf-1
Se evaluó la actividad de los compuestos con respecto a su diana específica dentro de la maquinaria apoptótica. La oligomerización de Apaf-1 es un acontecimiento molecular que conduce a la activación de la formación del apoptosoma, que termina en la inducción de apoptosis. Se realizaron estos experimentos en ensayos celulares y libres de células.
Para los ensayos libres de células, se prepararon extractos citoplasmáticos de Hek-293 tal como se describió anteriormente (Malet et al, 2005) y se llevó a cabo una división de extracto de células completas. De manera concomitante, se purificó Apaf-1 recombinante según Malet et al, 2005. Se incubó la fracción FT (que contenía caspasa 3 y 9 pero que carecía de Apaf-1), con Apaf-1 recombinante en presencia de diferentes concentraciones de los compuestos (véase la figura 1). Se analizó la actividad de los compuestos mediante la inhibición de la actividad caspasa (véase anteriormente).
Para los ensayos celulares, se trataron células Saos-2 y U937 con un activador del apoptosoma (Nguyen y Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100:7533-7538), que induce específicamente la oligomerización de Apaf-1. Después, se añadieron los compuestos a las células (50 \muM) y se incubaron durante 24 ó 48 horas. Se analizó la capacidad de los compuestos de inhibir la apoptosis inducida por Apaf-1 mediante la inhibición de la actividad caspasa (véase anteriormente).
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Unión de IIa.1 al dominio CARD de Apaf-1: ensayo de polarización de fluorescencia
Se realizaron mediciones de la polarización de fluorescencia en un contador Victor2V 1420 Multilabel HTS. Se valoró una disolución 60 nM de IIa.1 marcado con 5'-6'-carboxifluoresceína (denominado CF-IIA.1; \lambdaexc=480 nm; \lambdaem=535 nm) en tampón A (el volume de reacción total era de 200 \mul) con disoluciones de proteínas concentradas. Se registraron los datos usando un software Wallac 1420 Workstation. Se calcularon los valores de Kd usando un modelo de dos estados (véase la figura 2).
Para caracterizar inicialmente el sitio de unión de los peptoides al apoptosoma, se sintetizó un análogo fluorescente de IIa.1 (CF-IIa.1). CF-IIa.1 se unió al dominio CARD de Apaf-1, pero no al citocromo c y otras proteínas control (Malet et al, 2005), con una constante de disociación (Kd) de 60 nM tal como se determinó en un ensayo de polarización de fluorescencia (figura 2). No obstante, se contrastó el valor de la constante de unión con la concentración de IIa.1 que se necesitaba para inhibir el 50% de la actividad caspasa en los ensayos (CI_{50} \approx 30 \muM, figura 1). Una supuesta explicación para conciliar estos datos es que el lisado de reticulocitos usado para la traducción in vitro de la procaspasa 9 contenía componentes que disminuían la concentración eficaz de IIa.1.
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Ejemplos
Se han usado las siguientes abreviaturas en los ejemplos:
Boc: terc-butoxicarbonilo
DCM: diclorometano
DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIPEA: diisopropiletilamina
DMF: N,N'-dimetilformamida
eq.: equivalente molar
EtOAc: acetato de etilo
Fmoc: fluorenilmetoxicarbonilo
Glicina: G
HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
HOBT: 1-hidroxibenzotriazol
Lisina: K
PGA: poli(ácido L-glutámico)
Fenilalanina: F
PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris-pirrolidinofosfonio
R: Arginina
tr: tiempo de retención
TFA: ácido trifluoroacético
Valina:V
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La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se facilitan únicamente a modo de ilustración y no han de interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Se adquirió la resina de poliestireno AM RAM (0,75 mmol/g) de Rapp Polymere GmbH (Alemania). Se adquirió la resina de cloruro de 2-clorotritilo (1,4 mmol/g) de Novabiochem. Se llevó a cabo una RP-HPLC semipreparativa con un sistema Waters (Milford, MA, EE.UU.) usando una columna X-Terra C_{18} (19 \times 25 cm, 5 \mum); eluyente: A = TFA al 0,1% en agua; B = TFA al 0,1% en acetonitrilo, gradiente: 0 min. 20% de B - 20 min. 80% de B. Se registraron los espectros de masas de alta resolución (EMAR-FAB) en el Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de Santiago de Compostela (España).
La nomenclatura usada en este documento está basada en AUTONOM (nomenclatura automática), un sistema informatizado del Instituto Beilstein para la generación de la nomenclatura sistemática de la IUPAC.
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Producto intermedio VIII
VIII: Éster monoalílico del ácido (Z)-but-2-enodioico
A una disolución de 2 g de anhídrido maleico (20 mmol) en cloroformo, se añadieron 1,8 ml de alcohol alílico (26 mmol, 1,3 eq.). Se agitó la mezcla de reacción a 60ºC durante 50 min. con irradiación de microondas. Se trató la disolución resultante con HCl 1 N y se extrajo con cloroformo. Se lavaron los extractos orgánicos con salmuera y luego se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se filtraron. Se eliminó por destilación el disolvente a presión reducida y se purificó el residuo obtenido mediante cromatografía en columna para obtener el producto intermedio VIII como un aceite (95% de pureza, 85% de rendimiento).
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Compuestos de fórmula I
I.1: Carbamoilmetil-[2-(2,4-diclorofenil)-etil]amida del ácido 1-[2-(2,4-diclorofenil)etil]-4-(3,3-difenilpropil)-3,7- dioxo [1,4]-diazepan-5-carboxílico
Se trató la resina Rink-amida con 3 ml de piperidina al 20% en DMF y se agitó la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min. a 60ºC. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Se trató la resina con una disolución de ácido bromoacético (V, 275 mg, 5 eq.) y DIC (306 \mul, 5 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 2 min. a 60ºC en un reactor de microondas. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la resina una disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIa, diclorofenetilamina (VIa, 300 \mul, 5 eq.) y trietilamina (275 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y se agitó la suspensión durante 2 min. a 90ºC con activación de microondas. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con una disolución de éster monoalílico del ácido (Z)-but-2-enodioico (VIII, 310 mg, 5 eq.), HOBT (267 mg, 5 eq.) y DIC (306 \mul, 5 eq.) en DCM:DMF (2:1, 3 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 min., se filtró y se repitió la reacción en las mismas condiciones. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Después, se añadió a la resina una disolución de 3,3-difenilpropilamina (VIb, 418 mg, 5 eq.) y trietilamina (275 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y se agitó la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se repitió la reacción durante la noche a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con una disolución de ácido bromoacético (V, 275 mg, 5 eq.) y DIC (306 \mul, 5 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 2 min. a 60ºC en un reactor de microondas. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la resina una disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 200 \mul, 5 eq.) y trietilamina (210 \mul, 5 eq.) en 3 ml de DMF y se agitó la suspensión durante 2 min. a 90ºC con activación de microondas. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (46 mg, 0,1 eq.) y fenilsilano (490 \mul, 10 eq.) en DCM anhidro durante 15 min. a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Se repitió tres veces este procedimiento. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Se fomentó la ciclación mediante tratamiento con PyBOP (308 mg, 1,5 eq.), HOBT (80 mg, 1,5 eq.) y DIPEA (203 \mul, 3 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16 h y se filtró. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de TFA/DCM/agua 60:40:2 liberó una mezcla de reacción bruta que contenía el compuesto del título I.1, que se filtró. Se eliminaron los disolventes del filtrado mediante evaporación a presión reducida seguido por liofilización. Se purificó el residuo obtenido mediante una RP-HPLC semipreparativa usando un gradiente de acetonitrilo acuoso (42% de acetonitrilo \rightarrow 80% de acetonitrilo, 35 min.) para dar 91 mg del producto deseado (30% de rendimiento, pureza
\geq 98%).
EMAR (M + H)^{+}: Calc. para C_{39}H_{38}Cl_{4}N_{4}O_{4}, 767,1647; hallado, 767,1720.
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Siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el ejemplo I.1, pero usando diferentes aminas, se obtuvieron los siguientes productos:
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Producto intermedio Ia
Ia: Ácido {[2-(2,4-diclorofenil)etil]-[1-[2-(2,4-diclorofenil)etil]-4-(3,3-di-fenilpropil)-3,7-dioxo[1,4]diazepan-5-carbonil]amino}acético
Se trató la resina de cloruro de 2-clorotritilo (IVa, 700 mg, 0,98 mmol) con una disolución de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en DCM (4 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h, se extinguió la reacción con metanol (550 \mul) y se prolongó la agitación durante 10 min. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió una disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIa, 740 \mul, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF a la resina y se agitó la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con una disolución de éster monoalílico del ácido (Z)-but-2-enodioico (VIII) (765 mg, 5 eq.), HOBT (662 mg, 5 eq.) y DIC (760 \mul, 5 eq.) en DCM:DMF 2:1 (4 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 30 min. a temperatura ambiente, se filtró y se repitió en las mismas condiciones. Después, se añadió a la resina una disolución de 3,3-difenilpropilamina (VIb, 1,0 g, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF y se agitó la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se repitió la reacción, se prolongó la agitación hasta 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con una disolución de ácido cloroacético (V, 463 mg, 5 eq.) y DIC (760 \mul, 5 eq.) en DCM:DMF 2:1 (4 ml). Se agitó la mezcla de reacción durante 30 min. a temperatura ambiente. Se escurrió la resina y se lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se añadió a la resina una disolución de 2,4-diclorofenetilamina (VIc, 740 \mul, 5 eq.) y DIPEA (840 \mul, 5 eq.) en 4 ml de DMF y se agitó la suspensión durante 3 h a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Después, se trató la resina con tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (114 mg, 0,1 eq.) y fenilsilano (1,2 ml, 10 eq.) en DCM anhidro durante 15 min. a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. Ésta etapa sintética se llevó a cabo por triplicado. Se eliminó el sobrenadante y se escurrió el residuo y lavó con DCM (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DMF (3 x 3 ml). Se fomentó la ciclación mediante tratamiento con PyBOP (765 mg, 1,5 eq.), HOBT (199 mg, 1,5 eq.) y DIPEA (505 \mul, 3 eq.) en DMF (4 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 48 h y se filtró. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de TFA/DCM 5:95 liberó una mezcla de reacción bruta que se filtró. Se eliminaron los disolventes del filtrado a presión reducida seguido por liofilización para dar el compuesto Ia (460 mg, 61% de rendimiento, pureza \geq 55%) como un sólido incoloro.
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Productos intermedios IIa
Se desprotegió la resina Rink-amida (IV, 505 mg, 0,4 mmol) con 3 ml de piperidina al 20% en DMF. Se agitó la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min. a 60ºC. Se filtró la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Se unió Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (XIVa, 2 eq) a la resina usando HOBT (108 mg, 2 eq.) y DIC (125 \mul, 2 eq.). Se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). Tras la eliminación del grupo Fmoc con 3 ml de piperidina al 20% en DMF (30 min.), se lavó la resina con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). En caso necesario, se acoplaron los otros aminoácidos (XIVb) en las mismas condiciones tal como se describió anteriormente para producir el producto intermedio XVI.
Al producto intermedio XVI hinchado con DMF, se le añadió el ácido Ia (460 mg, 1,5 eq.) en presencia de HATU (228 mg, 1,5 eq.) y DIPEA (205 \mul, 3 eq.) en DMF (3 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 16 h y se filtró. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (3 x 3 ml), alcohol isopropílico (3 x 3 ml) y DCM (3 x 3 ml). El tratamiento de la resina con una mezcla de TFA/DCM/agua/triisopropilsilano 80:20:2,5:2,5 permitió la liberación de una mezcla de reacción bruta que contenía el compuesto IIa, que se filtró. Se eliminaron los disolventes del filtrado a presión reducida, seguido por liofilización. Se purificó el residuo obtenido mediante RP-HPLC semipreparativa usando una mezcla en gradiente de acetonitrilo acuoso.
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Compuestos de fórmula III
III.1: PGA-IIa.1
A una disolución de sal de sodio de PGA (XVII, 0,1 g, 0,5 mmol) con un intervalo de peso molecular (M_{w}) de 17000-43000 Da en agua, se le añadió HCl 0,2 M, hasta que se ajustó el pH de la reacción hasta 2,0. Se recogió el precipitado, se dializó frente a agua y se liofilizó. Después se disolvió el PGA en su forma protonada (XVIIa) en DMF seca (7,5 ml) y se añadieron DIC (3 eq.) y HOBt (3 eq.) y se dejaron agitando durante 15 min. Después, se añadió el producto intermedio IIa.1 (0,052 mmol (12% molar) 1 eq.) y se ajustó el pH hasta 8 con DIPEA (1,5 ml). Se dejó avanzar la reacción a temperatura ambiente durante 36 h. La cromatografía en capa fina (CCF, sílice) mostró una conversión completa de IIa.1 (R_{f} = 0,5) en el conjugado de polímero (R_{f} = 0, MeOH:H_{2}O:AcOH = 85:10:5). Para detener la reacción, se vertió la mezcla en CHCl_{3}. Se recogió el precipitado resultante y se secó a vacío. Se obtuvo la sal de sodio del conjugado de PGA-peptoide III.1 disolviendo el producto en NaHCO_{3} 1,0 M. Esta disolución acuosa se dializó frente a agua destilada (M_{W}CO de 6.000-8000 Da). La liofilización del dializado proporcionó el producto como un polvo blanco. El contenido de peptoide total en el polímero tal como se determinó mediante UV (\lambda = 282 nm) estaba en el intervalo del 25-30% (p/p) (funcionalización del 10-12%), contenido de fármaco libre < 1% en peso de fármaco total.
Se analizaron el peso molecular promedio (Mw), la polidispersidad (Mw/Mn) y el comportamiento de III.1 y el control XVII en la disolución mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) y ultracentrifugación analítica (AUC). Ambas técnicas mostraron a III.1 como una estructura conformacional más compacta con un menor volumen hidrodinámico y un mayor coeficiente de sedimentación (S) que XVII (tr = 12,5 min. y S = 3,5 \pm 0,4 s frente a tr = 11,6 min. y S = 1,9 \pm 0,1 s para III.1 y XVII, respectivamente). Se determinó el Mw mediante equilibrio de sedimentación como de 26700 Da para XVII y 58600 Da para III.1, sin embargo se determinaron Mw de 36000 Da (Mw/Mn = 1,8) y 38000 Da (Mw/Mn = 1,5) para XVII y III.1, respectivamente, mediante CPG usando patrones de
PEG.
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Determinación del contenido total en fármaco mediante espectroscopía UV
Se preparó una disolución madre de IIa en MeOH (1 mg/ml). Para obtener una curva de calibrado, se diluyeron muestras usando MeOH para proporcionar un intervalo de concentración de 0-1 mg/ml. Se determinó la carga de fármaco total de los conjugados midiendo la densidad óptica a 272 nm y 281 nm en H_{2}O. Se usó PGA en H_{2}O como blanco, en el mismo intervalo de concentración (0-5 mg/ml) que el conjugado III analizado. El coeficiente de extinción hallado para IIa a 281 nm en MeOH a TA fue \varepsilon = 713 l mol^{-1} cm^{-1}.
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Determinación del contenido en fármaco libre mediante HPLC
Se prepararon disoluciones acuosas de III.1 (1 mg/ml) y se añadió una alícuota (100 \mul) a un tubo de polipropileno y se enrasó hasta 1 ml con agua. Se ajustó el pH de las muestras hasta 8 con tampón formiato de amonio (100 \mul, 1 M, pH 8,5) y después se añadió CHCl_{3} (5 ml). Se extrajeron después las muestras meticulosamente mediante agitación con vórtex (3 x 10 s). Se eliminó cuidadosamente la fase acuosa superior y se evaporó el disolvente bajo N_{2}. Se disolvió el residuo seco en 200 \mul de acetonitrilo de calidad para HPLC. Se llevó a cabo el mismo procedimiento en paralelo para el compuesto original IIa.1 (usando 200 \mul de una disolución madre acuosa de 1 mg/ml). La adición de 1 ml de acetonitrilo para redisolver el producto dio una disolución madre de 200 \mug/ml a partir de la que se preparó un intervalo de concentraciones (de 2 a 100 \mug/ml). Se determinó la cantidad libre de fármaco en los conjugados mediante HPLC usando una columna Lichrospher® C18 (150 x 3,9 mm). La velocidad de flujo era de 1 ml/min usando un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1% acuoso (desde un 20 hasta un 100% de acetonitrilo en 20 min). El tiempo de retención fue tr = 14,3 min. para IIa.1 (\lambda = 220 nm).
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Siguiendo este procedimiento como para III.1, se obtuvieron los siguientes ejemplos:
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Descripción de los dibujos
Figura 1: Ensayo de inhibición de caspasa libre de células usando la fracción citoplasmática FT de Hek-293 incubada con Apaf-1 recombinante en presencia de diferentes concentraciones del compuesto IIa.1.
Figura 2: Análisis de la interacción CARD/IIa.1. Se valoró una disolución 240 nM de CF-IIa.1 en tampón PBS con concentraciones crecientes de CARD-Apaf y se midió la polarización de fluorescencia a 30ºC. Se registraron los datos (media, d.e.; n=3) en unidades de milipolarización (mP).

Claims (11)

1. Compuesto de fórmula general I,
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sus estereoisómeros y mezclas de los mismos, sus polimorfos y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo,
en la que:
R1
representa alquilo (C_{1}-C_{5}), alquenilo (C_{2}-C_{5}), -(CH_{2})_{1-3}-NHCO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -(CH_{2})_{1-3}-CONRaRb, -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
R2
representa -(CH_{2})_{0-3}-Cic (3-6), -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, -(CH_{2})_{2}-CH(fenil)[Hetar (5-6)] o -(CH_{2})_{2}-CH[Hetar (5-6)]_{2};
R3
representa -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo), -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), o -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6);
alquilo (C_{1}-C_{5}) y -alquenilo (C_{2}-C_{5}) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de -O-alquilo (C_{1}-C_{2}), -S-alquilo (C_{1}-C_{2}), -NH_{2}, -NH-alquilo (C_{1}-C_{2}) y -N[alquilo (C_{1}-C_{2})]_{2};
alquilo (C_{1}-C_{3}) puede estar opcionalmente sustituido con uno o más átomos de halógeno;
Ra y Rb representan independientemente -H o -alquilo (C_{1}-C_{3})
Cic (3-6) representa un radical de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3 a 6 miembros;
Hetcic (5-6) representa un radical con C o N de un anillo carbocíclico saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros que contiene desde uno o dos heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
Cic y Hetcic pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3} y -OH;
Hetar (5-6) y Hetar (5-10) representan un radical con C o N de un anillo de 5 ó 6 miembros y un anillo de 5 a 10 miembros aromáticos, respectivamente; que contiene desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N;
fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, Hetar (5-6) y Hetar (5-10) pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de halógeno, -CF_{3}, -OH, -O-alquilo (C_{1}-C_{3}), -CO-alquilo (C_{1}-C_{3}), -alquil (C_{1}-C_{5})-NRaRb, -NRaRb y -SO_{2}NH_{2};
con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
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2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 representa -(CH_{2})_{0-3}-Hetcic (5-6), -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-10), -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo) o -(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo), todos ellos opcionalmente sustituidos.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que R2 representa -(CH_{2})_{1-3}-fenilo, -(CH_{2})_{1-3}-(1-naftilo),
-(CH_{2})_{1-3}-(2-naftilo) o -(CH_{2})_{2}-CH(fenilo)_{2}, todos ellos opcionalmente sustituidos, con la condición de que R2 no representa 2-(4-fluorofenil)etilo.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R3 representa -(CH_{2})_{1-3}-Hetar (5-6) o -(CH_{2})_{2}-fenilo, ambos opcionalmente sustituidos.
5. Compuesto que es un conjugado de fármaco que comprende un radical de fórmula II
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sus estereoisómeros y mezclas de los mismos y los solvatos y sales de adición farmacéuticamente aceptables del mismo, conjugado a un polímero de poli(ácido glutámico), en el que R1, R2 y R3 tiene los significados según se definen en la reivindicación 1, sin la condición de R2; cada R4 representa independientemente una cadena lateral de cualquiera de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural y n es 0,1, 2 ó 3.
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6. Compuesto de fórmula III que es un conjugado de fármaco según la reivindicación 2,
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en el que la proporción de y con respecto a x es del 25-30% al 75-70% en peso.
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7. Compuesto según la reivindicación 5 ó 6, en el que el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico); n representa 2 y R4 representa una cadena lateral de glicina.
8. Uso de compuesto de fórmula I según la reivindicación 1, sin la condición de R2, o un compuesto según la reivindicación 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un estado asociado con la inhibición de la apoptosis.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el estado se selecciona de accidente cerebrovascular, traumatismos, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, meningitis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy, esclerosis múltiple, enfermedades relacionadas con priones, isquemia miocárdica, así como otras enfermedades cardiovasculares agudas o crónicas, trasplante de órganos, patologías relacionadas con el alcohol o tratamiento de la alopecia.
10. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I según la reivindicación 1 o un compuesto según la reivindicación 5, una sal o solvato farmacéuticamente aceptables de los mismos, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, en forma de nanoesferas, micropartículas y nanopartículas.
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