ES2338097T3 - Procedimiento de identificacion selectiva. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende las etapas de (a) poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que dichos ligandos se unan a dicho anti-blanco; (b) separar los ligandos no unidos; (c) poner en contacto dichos ligandos no unidos con un blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco; (d) separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; y (e) identificar los ligandos unidos al blanco del complejo de ligando unido al blanco, en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo.

Description

Procedimientos de identificación selectiva.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de selección e identificación de compuestos capaces de unirse específicamente a un blanco en presencia de blancos de fondo no deseados (anti-blancos) usando librerías de compuestos similares. La presente invención se refiere a la selección de ligandos de librerías de péptidos. Los péptidos ligandos identificados según el procedimiento de la invención tienen una afinidad y selectividad de unión a un blanco similar a la afinidad y selectividad de unión de los anticuerpos.

La bibliografía está llena de ejemplos de avances recientes en procedimientos de cribado de grandes pools de librerías de compuestos, especialmente péptidos. También se han realizado avances en los procedimientos de cribado de estos compuestos para identificar moléculas que se unen a un blanco pre-seleccionado. Un procedimiento muy conocido es el biopanning, desarrollado por Smith, G.P., (1985), Science 228:1315. El biopanning es, en su forma más sencilla, un procedimiento de selección in vitro en el que una librería de péptidos expuestos en fagos se incuba con un blanco. Entonces, se deja que el blanco y el fago se unan y los fagos no unidos se eliminan. Los fagos específicamente unidos se eluyen en medio ácido. El pool eluído de fagos se amplifica in vivo y el procedimiento se repite. Después de varios ciclos, los clones individuales se aíslan y secuencian.

Se han descrito diversas variaciones de la técnica de biopanning presentada por Smith y se hace referencia a Christian y col., (1992) J. Mol. Biol., 227:711; Cwiria y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Cull y col., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865; Huls y col., (1996) Nature Biotechnol., 7:276; y Bartoli y col., (1998) Nature Biotechnol., 16:1068.

El documento Huls y col., 1996 supra, describe un procedimiento que comprende una selección sustractiva basada en citometría de flujo de anticuerpos en fagos sobre células tumorales intactas. Los anticuerpos expuestos en fagos permanecen unidos al blanco durante la selección por citometría de flujo. Sin embargo, antes de la amplificación, los fagos unidos a las células se eluyen del blanco. El documento WO98/54312 desvela la selección de anticuerpos en condiciones suaves con elevada afinidad por antígenos usando librerías de anticuerpos expuestos en ribosomas.

En muchos procedimientos de la técnica anterior generalmente se supone que la elución de los ligandos unidos al blanco es suficiente para identificar los ligandos con la unión más fuerte de una librería. Sin embargo, diversos artículos de investigación exponen ligantes de baja afinidad usando técnicas de elución (patente estadounidense nº 5.582.981). No obstante, la separación física de los ligandos del blanco antes de la amplificación o identificación es el procedimiento estándar para la selección de ligandos que se unen a un blanco pre-seleccionado.

El documento Balass y col., (1996) Anal. Biochem., 243:264, describe la selección de péptidos-fagos con elevada afinidad de librerías de péptidos-fagos usando un blanco biotinilado inmovilizado en una matriz de nitro-estreptavidina. Las partículas de fagos que interactuaban se liberaron mediante elución ácida/en ácido convencional. Además, después de la elución ácida, el complejo diana se analizó respecto a los fagos unidos. Estas partículas se expusieron a disoluciones alcalinas o biotina libre para liberar las partículas de fagos unidos al blanco del soporte sólido. Se descubrió que la afinidad de los fagos aislados era mayor que la de los fagos liberados por los procedimientos de elución ácida tradicionales. Sin embargo, los péptidos sintéticamente preparados exhibían una menor afinidad por el blanco que los péptidos preparados a partir de secuencias obtenidas de fagos eluídos en ácido.

Otros procedimientos de identificación incluyen, por ejemplo, el método SELEX. Este es un procedimiento en el que un oligonucleótido de una librería de secuencias aleatorizadas se embebe en un pool de ácidos nucleicos. Se realizan muchos ciclos de selección de afinidad por un blanco del oligonucleótido de la población de ARN o ADN heterólogo. El blanco y los ácidos nucleicos renaturalizados se dividen y amplifican. Para realizar la etapa de amplificación, los ácidos nucleicos seleccionados se deben liberar del blanco tras dividirlo (patente estadounidense nº 5.475.096).

El documento WO99/06542A describe un procedimiento para producir una librería de bacteriófagos modificados adecuada para usar en combinación con células de una cepa seleccionada que se han transformado para que expresen una proteína heteróloga (no nativa) en un procedimiento de cribado en el que se detecta una unión específica entre un bacteriófago individual de la librería y un sitio/TODOS de reconocimiento de la proteína heteróloga.

Aunque existen diversos procedimientos de cribado y selección de librerías de compuestos, son especialmente necesarios procedimientos mejorados que no requieran múltiples ciclos de selección para compuestos que a) se unen fuerte y específicamente a blancos que no están bien definidos a nivel químico, bioquímico o genético pero que tienen propiedades macroscópicas deseables de identificar, b) se unen fuerte y específicamente a blancos que no se pueden separar físicamente de forma sencilla de un gran fondo de blancos no deseados (anti-blancos), y c) se unen a blancos en condiciones severas, tales como pH ácido, concentración de detergentes elevada o temperatura elevada.

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El procedimiento de identificación selectiva según la invención soluciona algunas de las deficiencias anteriores de los procedimientos de la técnica anterior y, en concreto, ofrece la ventaja de identificar rápidamente péptidos, que se unen con gran afinidad y selectividad a un blanco.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que los ligandos se unan al anti-blanco; separar los ligandos no unidos y poner en contacto dichos ligandos no unidos con el blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco; separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; e identificar los ligandos unidos a blancos del complejo de ligando unido al blanco, en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo.

En una realización preferida, la selectividad de unión de ligando a un blanco en comparación con la unión de los ligandos a un anti-blanco es de aproximadamente al menos 10:1. En una segunda realización preferida, el ligando es un péptido pero no un anticuerpo y está unido al blanco con una K_{D} de al menos aproximadamente 10^{-7} M y, preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 10^{-7 }M a 10^{-10} M. La librería de ligandos es una librería de péptidos. Preferiblemente, los péptidos identificados según el procedimiento tienen una longitud de 25 aminoácidos y, preferiblemente, tienen una longitud de entre 4 y 15 aminoácidos. En una cuarte realización, k_{off} es de aproximadamente 10^{-4} s^{-1} o inferior.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Es un diagrama esquemático general del procedimiento de identificación selectiva desvelado en el presente documento. El procedimiento comprende las etapas de a) selección frente a anti-blancos, lo que proporciona una librería de ligandos carente de ligandos unidos a anti-blancos, b) selección del blanco mediante formación de un complejo de ligando unido al blanco, b) separación del complejo de ligando unido al blanco, d) identificación de los ligandos unidos a blancos, y e) secuenciación, opcionalmente, de los ligandos unidos a blancos, exponiendo los ligandos unidos a blancos a ciclos adicionales de identificación selectiva y/o diversificación.

Figuras 2A Y 2B. Son fotografías de un gel fragmentos de ADN amplificados por PCR después de la lisis del fago unido al blanco. La figura 2A ilustra un fago unido a TNF-\alpha y la figura 2B ilustra un fago unido a IL-6 e IL-8.

Figura 3. Es una fotografía de un gel de fragmentos de ADN amplificados por PCR para solo para los identificados.

Figura 4. Ilustra la unión, disociación y elución intentada del clon A1 del péptido-fago correspondiente a RYWQDIP (Sec. id. nº 3) del TNF-\alpha inmovilizado en una cubeta de un biosensor IAsys.

Figura 5. Ilustra los resultados del ensayo ELISA para la unión de 3 péptidos. LESTPKMK (Sec. id. nº 115) se une al pelo y FTQSLPR (Sec. id. nº 116) identifica selectivamente piel y no pelo (\blacksquare representa pelo y representa piel).

Descripción detallada de la invención

A. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la materia, a los que se dirige esta invención. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se usan para describir la invención en el presente documento.

El término "ligando" se refiere a una molécula o compuesto que es reconocido por un blanco o anti-blanco concretos. El término es independiente del tamaño molecular o características composicionales. El ligando puede servir como un sustrato para una reacción catalizada por un enzima, como un agonista, como un antagonista, actuar como un mensajero señalizador o estimular o inhibir rutas metabólicas. Los ligandos pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, derivados de péptidos, péptidos miméticos, polipéptidos, pequeñas moléculas orgánicas, carbohidratos y otras moléculas que se aíslan de una mezcla candidata que actúa sobre un blanco de una forma deseada. Preferiblemente, la forma deseada es unirse al blanco, pero podría incluir, por ejemplo, cambiar catalíticamente el blanco o reaccionar con el blanco de forma que modifica o altera el blanco. En una realización preferida, el ligando tiene una afinidad de unión por el blanco en el intervalo de una afinidad de unión de anticuerpos para un receptor seleccionado.

El término "librería" se refiere a una colección de entidades químicas o biológicas que se puede crear en un único depósito y cribar simultáneamente para una propiedad deseada. Tal como se usa en el presente documento, una librería puede tener un tamaño mínimo de al menos dos miembros y puede contener tantos como 10^{15 }miembros. En un aspecto, la librería tiene al menos 10^{2} miembros. En otro aspecto, la librería tiene al menos 10^{3} miembros. En otro aspecto más, la librería tiene al menos 10^{6} miembros. En un aspecto adicional, la librería tiene al menos 10^{9} miembros. El tamaño de la librería se refiere al número total de entidades que comprende la librería, tanto si los miembros son iguales como si son diferentes.

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Una "librería de péptidos" se refiere a un conjunto de péptidos y a los péptidos y a cualquier proteína de fusión que contenga esos péptidos. Se pueden usar procesos estocásticos o aleatorios para construir péptidos aleatorios. El término "aleatorio" no significa que la composición de la librería no sea conocida.

El término "péptido" se refiere a un oligómero en el que las unidades monoméricas son aminoácidos (típicamente, pero no necesariamente, L-aminoácidos) unidos mediante un enlace amida. Los péptidos pueden tener una longitud de dos o más aminoácidos. Los péptidos identificados según la invención tienen una longitud preferiblemente inferior a 50 aminoácidos, más preferiblemente una longitud inferior a 30 aminoácidos, también preferiblemente una longitud inferior a 25 aminoácidos y, preferiblemente, una longitud inferior a 20 aminoácidos. En una realización preferida los péptidos identificados según el procedimiento de la invención tienen una longitud de entre 4 y 15 aminoácidos. Sin embargo, en general, los péptidos pueden tener una longitud de hasta 100 aminoácidos. Los péptidos que tienen una longitud no superior a 100 aminoácidos se denominan generalmente polipéptidos. En el presente documento se usan las abreviaturas estándar para los aminoácidos (véase Singleton y col., (1987) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Segunda Ed., pág. 35, que se incorpora al presente documento como referencia).

Los péptidos o polipéptidos se pueden proporcionar como un péptido de fusión o proteína. Los péptidos incluyen análogos a péptidos sintéticos en los que la secuencia de aminoácidos es conocida. El término péptido no incluye moléculas estructuralmente relacionadas con péptidos miméticos, tales como derivados peptídicos o péptidos cuya estructura no se puede determinar mediante metodologías de secuenciación estándar, sino que se debe determinar mediante metodologías más complejas como procedimientos de espectrometría de masas. Los péptidos miméticos (también conocidos como miméticos de péptidos) son análogos a los péptidos pero son compuestos no peptídicos. Generalmente están sustituidos opcionalmente uno o más enlaces peptídicos (Evans y col., (1987) J. Med. Chem. 30:1229). El término "proteína" es muy conocido y se refiere a un polipéptido grande.

El término "ácido nucleico" significa ADN, ARN, monocatenario o bicatenario, y modificaciones químicas de los mismos. Las modificaciones pueden incluir, pero no están limitadas a, bases modificadas, modificaciones de la cadena principal, metilaciones, modificaciones de pares de bases no habituales y modificaciones de los extremos
(capping).

En el presente documento se desvelan ligandos de péptidos que tienen básicamente la misma capacidad de unión a un blanco que el péptido identificado mediante el procedimiento de identificación selectiva descrito en el presente documento. Básicamente la misma capacidad de unión a un blanco significa que la afinidad y la selectividad son aproximadamente iguales a la afinidad y la selectividad de los ligandos seleccionados mediante el procedimiento reivindicado en el presente documento.

Adicionalmente, un ligando que tiene básicamente la misma capacidad de unión a un blanco será básicamente homólogo al ligando identificado mediante el procedimiento de identificación selectiva desvelado. Respecto a una secuencia de ácido nucleico, básicamente homóloga a un ligando identificado significa que el grado de homología de la secuencia primaria es superior al 80%, preferiblemente superior al 85%, más preferiblemente superior al 90%, más preferiblemente superior al 95%, incluso más preferiblemente superior al 97% y, lo más preferiblemente, superior al 99%. Los expertos en la materia se darán cuenta de que, como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos de codificación de péptidos. Un péptido o polipéptido es básicamente homólogo a un péptido o polipéptido de referencia si tiene una identidad de secuencia al menos del 85%, preferiblemente una identidad de secuencia al menos del 90% al 95%, más preferiblemente al menos del 99%, idéntica o equivalente a la secuencia de referencia, cuando está alineada ópticamente. La alineación óptima de las secuencias se puede realizar mediante diversos procedimientos conocidos e implementación informatizada de algoritmos conocidos (por ejemplo, TFASTA, BESTFIT, del Wisconsin Genetics Software Package, Versión 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). Las categorías generales de aminoácidos equivalentes incluyen: 1) ácido glutámico y ácido aspártico; 2) lisina, arginina e histidina; 3) alanina, valina, leucina e isoleucina; 4) asparagina y glutamina; 5) treonina y serina; 6) fenilalanina, tirosina y triptófano; y 7) glicina y alanina. Entra en los conocimientos de los expertos en la materia determinar si una secuencia determinada básicamente homóloga a las identificadas en el presente documento tiene básicamente la misma capacidad de unión a un blanco.

Una pequeña molécula orgánica, como se define en el presente documento, es una molécula, preferiblemente una molécula no polimérica, que tiene un peso molecular de aproximadamente 1000 dalton y, más preferiblemente, de 500 dalton o menos. Un "peptoide" se define en el presente documento como un análogo a un péptido enzimáticamente resistente.

El término "blanco" o "anti-blanco" se refiere a piel o pelo que tienen una afinidad de unión como se describe en el presente documento para un ligando determinado.

La afinidad de unión de un ligando por su blanco o anti-blanco se puede describir con la constante de disociación (K_{D}), la concentración necesaria para una unión eficaz del 50% (CE_{50}), o la concentración necesaria para una inhibición del 50% de la unión de otro compuesto que se une al blanco (CI_{50}). K_{D} está definido por k_{off}/k_{on}. El valor k_{off} define la velocidad a la que el complejo ligando-blanco se rompe o separa. Este término a veces se denomina en la técnica estabilidad cinética del complejo ligando-blanco, o la relación de cualquier otra cantidad medible que refleje la relación de afinidades de unión, tales como una señal de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) o señal de marcado radioactivo. La selectividad se define por la relación de las afinidades de unión o k_{off} para la disociación del ligando-complejo (K_{D} del blanco/K_{D} del anti-blanco) El valor k_{on} describe la velocidad a la que el blanco y el ligando se combinan para formar el complejo ligando-blanco.

El término "poner en contacto" se define ampliamente y significa colocar una librería de ligandos y un blanco o anti-blanco en proximidad o asociación inmediatas e incluye contacto in vitro. El término incluye tocar, asociar, unir, combinar y similares. El término "separar" tal como se usa en el presente documento significa seleccionar, segregar, dividir, aislar, recoger, separar y desunir.

"Amplificar" significa un proceso o combinación de etapas de proceso que aumentan la cantidad o número de copias de una molécula o clase de moléculas. En un aspecto, la amplificación se refiere a la producción de copias adicionales de secuencias de ácidos nucleicos que se llevan a cabo usando la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) muy conocida en la técnica. En otro aspecto, la amplificación se refiere a la producción de viriones de fagos por infección de un huésped.

Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el singular "un", "una" y "el", "la" incluye las referencias a plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una proteasa" puede incluir una pluralidad de proteasas.

Las siguientes referencias describen las técnicas generales empleadas en el presente documento: Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis y col., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (1990), Academic Press, Inc.; Kay y col., (1996) Phage Display of Peptides and Proteins, Academic Press; Ausubel y col., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene-Publishing & Wiley interscience NY (Ampliado en 1999); Berger y Kimmel, (1987) Methods In Enzymology, Vol. 152. Academic Press Inc., San Diego, CA.

El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en esta solicitud se incorporan a la misma en su totalidad como referencia.

B. Procedimiento general

En el presente documento se describe un procedimiento de identificación selectiva para el cribado de una librería de ligandos de péptidos que tienen una afinidad y selectividad de unión por un blanco seleccionado. En su forma más básica, el procedimiento de identificación selectiva se puede definir como se indica a continuación. Preparar u obtener una librería de ligandos, preferiblemente péptidos de diferentes secuencias y, más preferiblemente, una librería de péptidos aleatorios. Deseleccionar los ligandos que se unen con un anti-blanco poniendo en contacto la librería de ligandos de péptidos con un anti-blanco en condiciones favorables para la unión entre los ligandos de la librería y el anti-blanco; permitir que el anti-blanco se una con los ligandos; y separar los no ligantes del anti-blanco (ligandos no unidos) de las moléculas unidas del ligandos y anti-blanco y cualquier ligando libre. Poner en contacto los no ligantes del anti-blanco con un blanco seleccionado en condiciones adecuadas y permitir que se unan. Los ligandos con afinidad por el blanco se unirán para formar un complejo de ligando unido al blanco. La eliminación de ligandos unidos al anti-blanco y la eliminación de ligandos de unión débil con el blanco se puede denominar, de forma general, como agotamiento de la librería. El complejo de ligando unido al blanco se separa entonces de la mezcla restante, incluyendo los ligandos no unidos, y se identifican los ligandos unidos al blanco. El complejo de ligando unido al blanco o los ligandos unidos al blanco se pueden someter entonces, opcionalmente, a amplificación, secuenciación o ciclos adicionales de selección (figura 1). La solicitud también desvela algunos ligandos identificados según el procedimiento de identificación selectiva de la invención.

En la puesta en práctica de la invención generalmente se proporcionará una librería de ligandos de péptidos que se ensayará. Una librería de ligandos puede incluir, pero no está limitada a, librerías de péptidos aleatorios, librerías combinatorias de péptidos miméticos o péptidos sintéticos, librerías de bucles de péptidos y librerías químicas combinatorias. Estas librerías son muy conocidas en la técnica, así como los procedimientos para crear dichas librerías. Se hace referencia a los documentos Barbas, C.F. (1993) Current Opinion In Biotech., 4: 526; Cwirla y col., (1990) supra; Scott y Smith, (1990) Science, 249:386; Cull y col., (1992) supra; Pinlile y col., (1994) Biochem. J. 301:847; Sambrook y col., (1989) supra; Ausubel y col., (1987) supra; y Gubler y Hoffman, (1983) Gene 25:263; cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia.

Un tipo preferido de librería incluye librerías de péptidos aleatorios (también denominadas a veces en la técnica librerías de epitopos). Estas librerías pueden incluir librerías expuestas en la superficie celular, por ejemplo, exposición en levaduras (Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol., 15:553); librerías de péptidos insertadas en proteínas (Lenstra y col., (1992) J. Immunol. Methods, 152:149 y patente estadounidense nº 5.837.500); cribado directo de péptidos en polisomas (Tuerk y col., (1990) Science 249:505) y librerías expuestas en fagos (Delvin y col., (1990) Science 249:404; WO91/18980; Dower y col. WO91/19818; y Parmley y col., (1988) Gene 73:305). Son especialmente preferibles las librerías expuestas en fagos. Una librería expuesta en fagos es una librería en la cual numerosos péptidos son expuestos en la superficie de un bacteriófago, tal como un fago filamentoso. El péptido o proteína se expresa como una fusión con una proteína superficial del bacteriófago, dando como resultado la exposición de la proteína de fusión en la superficie del virión, mientras que el ADN que codifica la fusión reside dentro del virión. Ejemplos no limitativos adecuados de vectores para la construcción de librerías de fagos incluyen fAFF1; la serie fUSE, tal como fUSE5; vectores de fagos lambda; y vectores de fagos (no filamentosos) T7select (Smith y Scott (1993) Methods Enzymol. 217:228; y Cwirla y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378). Hay disponibles kits de librerías de fagos-péptidos y se hace referencia a Chiron Corp. (Emeryville, CA), New England BioLabs Inc., Catálogo nº 8100 (Beverly, MA) y Catálogo Novagen nº 70550-3 (Madison WI). Aunque se conocen diversas librerías de anticuerpos, incluyendo librerías de exposición de anticuerpos en fagos (de Bruin y col., (1999) Nat. Biotechnol., 17:397), según un aspecto preferido de la presente invención, la librería de ligandos usados en el procedimiento de identificación selectiva según la invención no incluirá anticuerpos.

Otro tipo de librería de péptidos codificada por ácidos nucleicos incluye una librería en la que el péptido se expresa como una fusión con otra proteína, por ejemplo, bien una proteína superficial de una célula o bien una proteína interna de un huésped. Los nucleótidos que codifican el péptido se insertan en un gen que codifica la proteína interna. Diversos ejemplos de este tipo de librería incluyen la fusión de péptidos con un represor lac, GAL4, tiorredoxina y diversos anticuerpos (patentes estadounidenses nº 5.283.173, 5.270.181 y 5.292.646). El documento Cull y col., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:1865, enseña la construcción de un gen de fusión que codifica una proteína de fusión de los miembros de una librería de péptidos y Lacl. Los ácidos nucleicos que codifican una librería de péptidos se insertan en un gen que codifica el Lacl. La proteína de fusión y el plásmido de fusión que codifica la proteína de fusión se unen físicamente mediante unión de los péptidos con la secuencia del operador lac en un plásmido. Las células huésped se pueden transformar con los plásmidos de la librería. Las células que expresan la proteína de fusión se rompen liberando la proteína de fusión y el ADN asociado (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.733.731). La librería se puede entonces cribar o seleccionar. También se conocen librerías barajadas (shuffled) con ADN que se construyen mediante intercambio homólogo de fragmentos de ADN durante los procedimientos de recombinación de ADN o mediante procedimientos de síntesis (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.605.793 y el documento Stemmer (1994), Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91:10747).

Las denominadas librerías ancladas se han descrito en los documentos PCT US96/09383 y WO97/22617. Ésta es una librería de péptidos en la que los péptidos tienen regiones no continuas de aminoácidos aleatorios separados por aminoácidos específicamente designados. Estas librerías se crean por medios genéticos o químicos.

Una librería química combinatoria, y especialmente una librería de péptidos, también se puede sintetizar directamente mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la síntesis de arrays. (Foder y col., (1991) Science 251:767); síntesis sobre soportes sólidos (WO97/35198); y otros procedimientos químicos tales como los desvelados en Lam y col., (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:419, Tjoeng y col., (1990) Int. J. Pept. Protein Res. 35:141, y WO96/33010.

Los procedimientos para crear librerías químicas combinatorias también son conocidos en la técnica. Las librerías combinatorias incluyen variantes químicas para los péptidos (Schultz y col., (1995) Science, 288:1738). La estructura de un núcleo se modificará añadiendo sustituyentes o uniendo diferentes bloques de construcción molecular. Las librerías pueden incluir moléculas libres en disolución, unidas a partículas sólidas o perlas, o estar dispuestas en superficies u organismos modificados. Se puede modificar prácticamente cualquier clase de compuesto variando los sustituyentes de la molécula del núcleo. Un ejemplo no limitativo de clases de compuestos para una librería combinatoria es las prolinas de mercaptoacilo. Aunque los procedimientos para crear librerías combinatorias están bien documentados en la bibliografía, estos procedimientos llevan mucho tiempo. Diversas empresas fabrican ahora instrumentación para generar librerías combinatorias mediante síntesis tanto en disolución como en fase sólida (CombiChem Inc. (San Diego, CA); Advanced ChemTech (Louisville); Zymark Corp. (MA); y Hewlett Packard (CA)). Una vez que se ha generado una librería, se puede purificar opcionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Cuando una pequeña molécula orgánica se ha cribado e identificado según el procedimiento de identificación selectiva de la invención, se puede producir a gran escala mediante síntesis orgánica conocida en la técnica.

Como se enseña en el presente documento, no sólo son muy conocidos procedimientos estándar para la generación de librerías, sino que también se pueden obtener librerías de ligandos comercialmente, por ejemplo, de Sigma (St. Louis Mo.) o de diversas fuentes públicas tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH).

Blancos y anti-blancos adecuados usados en el procedimiento de identificación selectiva según la invención son piel y pelo.

Fuentes de piel y pelo incluyen humanos y animales.

Se pueden usar blancos y anti-blancos que no estén bien caracterizados. Ejemplos no limitativos de blancos potencialmente mal caracterizados incluyen piel y pelo humanos.

En algunas aplicaciones, el blanco y el anti-blanco se pueden invertir dependiendo de la aplicación específica de interés. Por ejemplo, puede haber múltiples aplicaciones en las que sea deseable identificar piel humana y no pelo. Por tanto, el anti-blanco sería pelo. En una aplicación similar puede ser deseable identificar pelo humano y no el correspondiente anti-blanco, piel.

Las concentraciones tanto del blanco como del anti-blanco usadas en el procedimiento de identificación selectiva variarán dependiendo del tipo de librería de ligandos, del anti-blanco y del blanco usados. La concentración útil en el procedimiento puede variar de aproximadamente 1,0 M a 10^{-15} M; preferiblemente, la concentración es del orden de 10^{-9} M. En general, es necesaria una cantidad en exceso de anti-blanco respecto a la cantidad de blanco. Sin pretender limitar la invención, esta cantidad en exceso puede estar en el intervalo desde al menos 10 veces más hasta más de 1000 veces más. Una concentración inicial de blanco se puede proporcionar preferiblemente en el intervalo de 10^{-3} M a 10^{-15} M.

Según un aspecto, la invención se refiere al cribado e identificación de ligandos que se unen a un blanco seleccionado para formar un complejo ligando-blanco no covalente con una afinidad de unión en el intervalo de las afinidades de los anticuerpos por los antígenos. La afinidad de unión del ligando según la presente invención para K_{D}, CE_{50} o CI_{50} está en el intervalo de entre aproximadamente 10^{-7} M a 10^{-15} M, aunque se pueden lograr afinidades de unión mayores o menores. Según un aspecto, la afinidad es del orden de al menos aproximadamente 10^{-7} M, también de la menos aproximadamente 10^{-8} M, preferiblemente de al menos aproximadamente 10^{-9} M y, también preferiblemente, de al menos aproximadamente 10^{-12} M. En otra realización, la afinidad es inferior a 10^{-7} M. Según otro aspecto, los valores de k_{off} para el complejo ligando-blanco serán inferiores a aproximadamente 10^{-3} s^{-1} , inferiores a aproximadamente 10^{-4} s^{-1} y también inferiores a aproximadamente 10^{-6} s^{-1}. Los ligandos identificados según el procedimiento de identificación selectiva de la invención no se unirán significativamente al anti-blanco. Sin pretender limitar la invención, un ligando preferido identificado según el procedimiento de identificación selectiva descrito en el presente documento puede tener una K_{D} para el anti-blanco mayor que aproximadamente 10^{-4} M y, preferiblemente, mayor que aproximadamente 10^{-1} M.

El procedimiento de identificación selectiva según la invención puede estar caracterizado no solo por la afinidad de unión de un ligando al blanco, sino que también puede estar caracterizado por la selectividad del complejo ligando-blanco. La selectividad de unión del ligando con un blanco en comparación con la unión del ligando con un anti-blanco se puede definir por una relación entre K_{D}, CE_{50} o CI_{50} en el intervalo de aproximadamente 3:1 a 500:1. Según un aspecto, la selectividad es de al menos aproximadamente 5:1, preferiblemente de al menos aproximadamente 10:1, más preferiblemente de al menos aproximadamente 20:1, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 30:1, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 50:1 y, todavía más preferiblemente, de al menos aproximadamente 100:1.

Según otro aspecto, el procedimiento de identificación selectiva se puede usar para seleccionar ligandos con una baja afinidad por el blanco pero con una gran selectividad del blanco. En este aspecto, la selectividad de afinidad de unión de los ligandos para el blanco en comparación con dicha unión de los ligandos con un anti-blanco sería de al menos aproximadamente 5:1, preferiblemente de al menos aproximadamente 10:1, también preferiblemente de al menos aproximadamente 20:1, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50:1 y, incluso más preferiblemente, de al menos aproximadamente 100:1. Sin embargo, la afinidad de unión con el blanco estaría en el intervalo de aproximadamente 10^{-3} M a 10^{-7} M.

Los procedimientos para medir afinidades y selectividad de unión son muy conocidos en la técnica y estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la medida mediante ensayos de liberación y competición con radio-marcado; mediante calorimetría de valoración isotérmica; ensayos de unión con biosensores (Morton & Myszka, (1998) Methods Enzymol. 295:268-294); mediante espectroscopia de fluorescencia y quimioluminiscencia; y mediante espectrofotometría de masas (Gao y col., (1996), J. Med, Chem., 39:1949).

Según un aspecto, el anti-blanco se combina con la librería de ligandos y se deja incubar antes de exponer la librería de ligandos al blanco.

El procedimiento de identificación selectiva tal como se describe en el presente documento se puede realizar in vitro.

Cuando se realiza in vitro, la librería de ligandos y el anti-blanco (y, opcionalmente, el blanco) se combinan en o sobre un recipiente. El recipiente puede ser cualquier material adecuado o receptáculo tal como una placa, tubo de cultivo, placa de microtitulación, chip microfluídico, placa de petri y similares.

Preferiblemente, el anti-blanco y el blanco están disponibles en un entorno en el que las situaciones de unión no específica están minimizadas. Esto se puede lograr por diversos medios incluyendo, pero sin limitarse a, 1) recubriendo un recipiente que contiene la librería de ligandos y el blanco/anti-blanco con BSA, leche desnatada u otra proteína adsorbente para bloquear la unión no específica, 2) marcando la molécula blanco con un agente de captura tal como un compuesto biotinilado, por ejemplo, biotina, avidina o formas mutadas de los mismos, que puede ser capturado posteriormente por estreptavidina o un derivado de la estreptavidina, tal como la nitroestreptavidina, 3) exponer el blanco/anti-blanco en perlas magnéticas que se pueden separar físicamente de la librería, o 4) usando vectores de exposición de la librería con propiedades de baja adsorción de fondo. Estos procedimientos son conocidos en la técnica y se hace referencia a los mismos en el documento Parmley y col. (1988) supra; y Bayer y col., (1990) Methods Enzymol. 184 :138.

Una composición que incluye una librería de ligandos y un anti-blanco se puede combinar con compuestos adicionales tales como tampones y, opcionalmente, detergentes y disolventes orgánicos en condiciones adecuadas que permitan la unión de los ligandos con el anti-blanco. Los expertos en la materia conocen bien tampones útiles. Ejemplos no limitativos incluyen tampones de tris(hidroximetil)aminometano (Tris); tampones de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES); tampones de ácido morfolino-etanosulfónico (MES); disoluciones salinas tampón, tales como ácido N,N-bis[2-hidroxietil]2-aminoetanosulfónico (BES), Tris y disolución salina tampón fosfato (PBS), preferiblemente disoluciones salinas tampón (Sambrook y col., (1989) supra). Hay disponibles tampones comerciales, por ejemplo, SuperBlock^{TM} (Pierce, Rockford, IL). En las disoluciones se pueden usar otros ingredientes, tales como detergentes, por ejemplo, Tween y Triton.

Dependiendo del blanco, la composición que incluye la librería de ligandos y el anti-blanco se incuba durante un periodo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 96 horas para permitir que los ligandos se unan con el anti-blanco. Sin embargo, se pueden usar periodos de tiempo mayores dependiendo de la estabilidad del blanco o del anti-blanco. El componente que contiene los ligandos del anti-blanco no unidos se separa de los ligandos unidos al anti-blanco después de la incubación. Aunque no es esencial, el componente separado que incluye los ligandos del anti-blanco no unidos se puede transferir opcionalmente a un nuevo recipiente, incluyendo el anti-blanco, e incubar y, entonces, el componente que contiene los ligandos del anti-blanco no unidos se puede separar de nuevo de los ligandos del anti-blanco unidos. Este proceso de transferencia se puede repetir muchas veces, por ejemplo, se puede repetir entre 2 y 10 veces o más. La etapa de transferencia repetida reduce además el número de ligandos que se unen al anti-blanco. Sin embargo, la puesta en contacto de la librería de ligandos con el anti-blancos y la separación de los ligandos unidos al anti-blanco de los ligandos no unidos se puede realizar una sola vez. La puesta en contacto que incluye incubación, y las etapas de separación, tanto si se completan de una sola vez o de varias veces, generalmente se pueden denominar deselección.

En general, las condiciones de temperatura durante la deselección pueden ser de entre 2 y 30ºC. La temperatura está limitada por la estabilidad de los componentes y su determinación está dentro de los conocimientos de un experto en la materia.

Los ligandos del anti-blanco no unidos se pueden separar de los ligandos unidos al anti-blanco mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Algunos de estos procedimientos incluyen la transferencia de líquido, lavado, centrifugación, filtrado, cromatografía, microdisección y clasificación celular por activador de fluorescencia (FACS).

La librería de ligandos, carente de ligandos de unión al anti-blanco y que contiene ligandos no unidos, se transfiere a un recipiente, incluyendo el blanco, en condiciones adecuadas que permitirán que uno o más miembros de la librería de ligandos se unan con el blanco, formando así un complejo de ligando unido al blanco. Según un aspecto, los ligandos se pueden poner en contacto con el mismo blanco. Según otro aspecto, los ligandos se pueden poner en contacto con un array de blancos al mismo tiempo. Los ligandos se incuban en condiciones que permiten su unión con el blanco y, generalmente, durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 98 horas. El tiempo de incubación depende de la estabilidad del blanco. El recipiente puede incluir adicionalmente tampones como se describió anteriormente en el presente documento. El intervalo de temperaturas es generalmente de entre aproximadamente 2 y 30ºC y, preferiblemente, de aproximadamente 18 a 25ºC.

Un experto en la materia conoce las referencias que describen el cultivo tisular, de órganos y celular, y se hace referencia al mismo en los documentos Atlas y Perks (ed.) (1993), The Handbook of Microbiological Media, CRC Press, Boca Raton FL; Gamborg y Phillips (ed.) (1995) Plant Cell Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Springer Lab Manual Springer-Verlag.

El complejo de ligando unido al blanco se puede someter a una o más etapas de lavado. Los compuestos de lavado puede incluir tampones (tal como TBS y PBS), detergentes, ácidos (glicina), disolventes orgánicos, bases, enzimas, ultrasonidos o combinaciones de los mismos, en los que se lavan los ligandos no unidos. Cuando el complejo de ligando unido al blanco se somete a una elución ácida, el pH de la elución ácida puede estar en el intervalo de aproximadamente 1,5 a 4,5, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2,0 a 3,5. La elución ácida puede tener lugar durante de 2 a 20 minutos y, generalmente, durante no más de aproximadamente 10 minutos. La etapa de lavado se puede repetir varias veces y, en general, se puede repetir entre 2-6 veces, dependiendo del blanco y de la librería de ligandos específicos. Especialmente cuando la etapa de lavado es con un ácido, el lavado será generalmente seguido de neutralización con diversos compuestos y tampones muy conocidos, tales como TRIS-HCL. La etapa de lavado da como resultado un complejo de ligando unido al blanco que comprende ligandos fuertemente unidos que tienen valores de K_{D}, k_{off} y selectividad como se definen en el presente documento.

La separación de los ligandos unidos al blanco de los ligandos no unidos al anti-blanco o ligandos libres en la mezcla se puede realizar también con medios muy conocidos en la técnica y estos procedimientos incluyen cromatografía de afinidad; centrifugación, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); filtrado, tal como filtrado en gel; ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA); y clasificación celular por activador de fluorescencia (FACS). La elección del procedimiento de separación depende de diversos factores, tales como el blanco, el anti-blanco y las moléculas de ligando. La elección del procedimiento de separación está dentro de los conocimientos de un experto en la materia y hay comercialmente disponibles diversos instrumentos usados en estos procedimientos de separación (véase Kenny y Fowell (ed.) (1992) Practical Protein Chromatography Methods in Molecular Biology, vol. 11, Humana Press, Totowa NJ).

El ligando unido al blanco del complejo de ligando unido al blanco se puede identificar mediante diversas técnicas, incluyendo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), espectrofotometría de masas (EM), resonancia de plasmones de superficie, inmunoprecipitación y espectroscopía por resonancia magnética nuclear (RMN). (patente estadounidense nº 4.683.202; Szabo y col., (1995) Curr. Opin. Struct. Bio.) 5:699; Harlow y col., (1999) Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; y Hajduk y col., (1999) J. Med Chem., 42:2315). La PCR asimétrica se puede usar también para la identificación del ligando unido al blanco, en la que se puede usar una única especie de cebador o cebadores con una concentración diferencial. También es conocido por los expertos en la materia, cuando los miembros de la librería están unidos genéticamente al péptido o proteína, que el ADN o ARNm se pueden amplificar mediante PCR y la correspondiente secuencia se puede subclonar en un vector para secuenciación e identificación.

Durante el procedimiento de la etapa de identificación, el ligando unido al blanco se puede separar del complejo de ligando unido al blanco, pero la etapa de identificación no necesita separación y, preferiblemente, el ligando unido al blanco no es separado del complejo de ligando unido al blanco antes de la identificación del ligando. Por ejemplo, en espectrofotometría de masas (EM), una vez que el complejo de ligando unido al blanco se inyecta en el espectrofotómetro de masas, el ligando unido al blanco se puede separar del complejo del blanco. Adicionalmente, la PCR se puede llevar a cabo directamente sobre el complejo de ligando unido al blanco.

El procedimiento de identificación selectiva según la invención preferiblemente incluye PCR para identificar los péptidos unidos al blanco. Según la invención, el uso de la PCR tiene como resultado la recuperación de péptidos no recuperados mediante procedimientos de biopanning convencionales que utilizan elución ácida. En general, un ligando que codifica un ADN se amplifica mediante PCR con cebadores adecuados.

La presencia de productos de PCR específicos indica que el ligando unido al blanco que codifica ADN está presente. La cantidad de ligando unido al blanco se determina mediante PCR cuantitativa. El grado de rigor de lavado se puede controlar para un nivel deseado y para niveles de detección muy bajos, por ejemplo, niveles de atomoles. Los ligantes de ligandos no específicos se eliminan, por ejemplo, añadiendo fagos tipo nativo y diseñando cebadores que solo amplifiquen la librería de ligandos. Para evitar el deterioro de la relación señal-ruido, las secuencias que flanquean el ligando que codifica el ADN pueden cambiar frecuentemente durante los ciclos de selección. La sensibilidad para el análisis de ligandos unidos al blanco se puede controlar cambiando la concentración de blanco, el número de ciclos de amplificación por PCR, la especificidad de los cebadores de PCR y el procedimiento de detección de los productos de PCR.

Se pueden minimizar diversas reacciones inhibitorias de PCR mediante la adicción de excipientes, incluyendo albúmina de suero bobino, aminas catiónicas y disolventes orgánicos y se hace referencia a los mismos en Roux, (1995) "Optimization and Troubleshooting In PCR" in PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Se pueden usar DMSO y glicerol para mejorar la eficacia de amplificación y la especificidad de la PCR. El ADN del ligando unido al blanco también se puede extraer y purificar usando técnicas estándar.

Para facilitar la secuenciación de los clones deseados o la separación de fagos no específicos no deseados, los productos de polinucleótidos generados por PCR se pueden marcar, por ejemplo, con biotinilo o restos de marcado fluorescente mediante incorporación durante la catálisis mediada por polimerasas. Cuando el producto de la PCR deseado se va a clonar en un vector para ciclos adicionales de identificación selectiva según el procedimiento de la invención, puede ser deseable introducir diversidad mediante procedimientos de PCR mutagénicos (véase Stemmer, In Kay y col. supra). Éstos incluyen mutagénesis por casetes, PCR proclive a errores (error-prone PCR), barajado de ADN (shuffling), ITCHY-SCRATCY y similares, como saben los expertos en al material. También se hace referencia al documento Tillett y Nellan, (1999) "Enzyma-free Cloning: A Rapid Method to Clone PCR Products Independent of Vector Restriction Enzyme Site": Nucl. Acids. Res., 27:26e.

Como se mencionó anteriormente y es muy conocido en la técnica, los fragmentos de PCR se pueden clonar en varios vectores para secuenciación y, a continuación, se pueden usar en la formación de fusiones de proteínas de péptidos o clonar en vectores de exposición adicionales.

Los miembros de la librería unidos a blancos también se pueden identificar, preferiblemente, mediante procedimientos de espectrometría de masas. Esta es una identificación rápida y precisa de la estructura de un compuesto basada en la masa del compuesto y en fragmentos del compuesto generado en la espectrometría de masas. El uso de espectrometría de masas para identificar la estructura de compuestos se ha descrito en Cao y col., (1997) Techniques In Protein Chemistry Vill, Academic Press pág. 177-184; y Youngquist y col., (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:3900. También se hace referencia a Cheng y col., (1995) J. Am. Chem. Soc., 117:8859 y Walk y col., (1999) Angew. Che. Int. Ed., 36:1763. Una técnica de espectrometría de masas es espectrometría de masas tándem (EM/EM o MS/MS) en la que la espectrometría de masas se realiza junto con cromatografía líquida. Para purificar y separar el ligando de interés, este tipo de EM se usa preferiblemente para cribar ligandos unidos al blanco diferentes a los péptidos tipo fagos, debido a la necesidad de separar y purificar ligandos de un sistema biológico antes de la inyección de los ligandos en un espectrómetro de masas. Hay disponibles diversas técnicas de EM recientemente desarrolladas para la identificación de los ligandos unidos a blancos (véase Wu y col., (1997) In Chemistry and Biology, vol. 14(9):653, Marshall y col., (1998), Mass Spectrometry Reviews 17:1, y Nelson y col., (1999) J. Mol. Recognition, 12:77).

Después del cribado de uno o más ligandos de péptidos, la secuencia de aminoácidos de los péptidos se puede determinar según técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia tales como secuenciación directa de aminoácidos del péptido seleccionado usando secuenciadores de péptidos, MS/MS, o manualmente, o determinando la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido. También se desvelan en el presente documento péptidos unidos al blanco identificados según el procedimiento de identificación selectiva.

Cuando se seleccionan múltiples ligandos de la librería inicial de ligandos de péptidos, las secuencias de aminoácidos de los ligandos, cuando se alinean, no exhiben necesariamente una región conservada o un motivo del péptido, lo que se define en el presente documento como una secuencia de consenso de aminoácidos que representa secuencias de aminoácidos preferidas en todos los péptidos seleccionados.

En una realización concreta, el procedimiento implica seleccionar péptidos de una librería de péptidos que tienen una afinidad de unión por un blanco de entre aproximadamente 10^{-7} M y aproximadamente 10^{-10} M, que comprende poner en contacto una librería de péptidos con un anti-blanco para permitir que los péptidos de la librería se unan al anti-blanco; separar los péptidos no unidos de los péptidos unidos al anti-blanco; poner en contacto los péptidos no unidos separados con un blanco en condiciones que permitan la unión de los péptidos no unidos con el blanco para formar un complejo péptido unido al blanco; separar el complejo de péptido unido al blanco de los péptidos que no se unen al blanco; e identificar los péptidos unidos en el complejo de péptido unido al blanco, en el que los péptidos tienen una longitud inferior a 50 aminoácidos, no son anticuerpos y tienen una selectividad en el intervalo de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1. Preferiblemente, los péptidos identificados en el complejo de péptido unido al blanco tiene una longitud de menos de 25 aminoácidos con una selectividad del orden de aproximadamente 20:1.

Una vez que se han identificado los ligandos unidos al blanco, los ligandos se pueden exponer a repetidos ciclos del procedimiento de identificación selectiva, y se hace referencia a la figura 1. Los ligandos unidos al blanco se pueden someter a diversificación. La diversificación que incluye diversidad química puede incluir diversas técnicas de mutagénesis. Véase Salki y col., (1988) Science 239:487; Zoller y col., (1982) Nucl. Acids. Res. 10:6487: y Smith (1985) Ann Rev. Genetics. 19:423. Los ligandos unidos al blanco se pueden secuenciar para determinar la identidad de los ligandos unidos y, a continuación, los oligonucleótidos se pueden basar en las secuencias pero incluyendo pequeñas variaciones. La PCR se puede usar para realizar pequeños cambios en las secuencias de codificación de los nucleótidos para los ligandos. Esta mutagénesis por PCR puede producir una mutación en cualquier posición en la secuencia de codificación. La diversificación también puede realizarse mediante mutagénesis de un pequeño subconjunto de ligandos identificados. En general, los ligandos diversificados tendrán una identidad de secuencia de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% a nivel de nucleótidos respecto al ligando unido al blanco. Cuando el ligando es un péptido, el péptido diversificado tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% respecto al péptido identificado unido al blanco. Los ligandos diversificados se pueden exponer a uno o varios ciclos del procedimiento de identificación selectiva de la presente invención. Los ligandos diversificados se pueden cribar con otros ligandos unidos al blanco identificado, de los que se derivan, y ensayar en aplicaciones adecuadas para las que los ligandos se cribaron originalmente.

En una aplicación concreta, el procedimiento de identificación selectiva descrito en el presente documento se puede usar para identificar los ligandos que se unen a un blanco en condiciones severas. Una condición severa puede incluir, pero no está limitada a, pH ácido, temperatura elevada y exposición a detergentes, tales como los que se encuentran en los detergentes domésticos para ropa.

En una aplicación concreta, el procedimiento de identificación selectiva según la invención se puede usar para identificar los ligandos de péptidos útiles en aplicaciones de cuidado personal, por ejemplo, cuidado de la piel o cuidado del pelo.

Por consiguiente, los siguientes ejemplos se ofrecen de modo ilustrativo y no pretenden limitar la invención de modo alguno. Los expertos en la materia se darán cuenta o serán capaces de determinar usando únicamente experimentación rutinaria muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención.

Ejemplos

Los procedimientos para la digestión restrictiva, ligado, preparación de células competentes usando cloruro de calcio, preparación de 20 mg/ml de isopropilo (IPTG), preparación de 20 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido (X-gal) y preparación de disolución salina tampón fosfato (PBS) se realizaron según procedimientos muy conocidos en la técnica y se pueden encontrar en el documento Sambrook y col., (1989) supra. La librerías de exposición en fagos (7-mer cíclico, 7-mer lineal y 12-mer lineal) fueron suministradas por New England Biolabs ((NEB; Beverly, MA). Las endonucleasas de restricción Eagl y Acc651, el tampón 10x NEBuffer 3, la ligasa T4 de ADN, la fosfatasa alcalina intestinal bovina, la cepa huésped ER2537 de E. coli y el vector de clonación M13KE gIII fueron suministrados por NEB y usados según las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La polimerasa Taq, el tampón (10x PCR Buffer) y la mezcla dNTP fueron suministrados por Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). La PCR se llevó a cabo usando un termociclador HYBAID Omn-E de E&K Scientific Products (Campbell, CA).

Tanto el kit de extracción de gel QIAquick como el kit de purificación por PCR QIAquick se obtuvieron de QIAGEN (Valencia, CA). Las gemas para PCR AmpliWax^{TM} se obtuvieron de Perkin Elmer. Las extracciones con fenol/cloroformo se llevaron a cabo usando Phase Lock Gels^{TM} I (suave) de 5 Prime 3 Prime, Inc. (Boulder, CO). Los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (8%) y los marcadores D-15 de ADN se obtuvieron de Novex (San Diego, CA).

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Ejemplo de referencia 1

Selección de fagos-péptidos que se unen al factor de necrosis tumoral a (TNF-\alpha) usando PCR para la identificación de clones fago-péptido de elevada actividad

Un tubo fino para PCR se revistió con el blanco humano (h)TNF-\alpha (BioSouce International; Camarillo, CA) mediante incubación de 100 \mul de TNF-\alpha purificado de 0,5 mg/ml en PBS durante toda la noche a 4ºC en el tubo para PCR. Se eliminó el exceso de TNF-\alpha no unido y el tubo se revistió durante toda la noche a 4ºC con 100 \mul del tampón de bloqueo SuperBlock^{TM} (Pierce: Rockford, IL) en disolución salina tampón Tris (TBS). El anti-blanco (tampón de bloqueo SuperBlock^{TM}) se preparó en tubos para PCR independientes revestidos durante toda la noche a 4ºC con 100 \mul de SuperBlock^{TM}. Se diluyó una librería de péptidos aleatorios 7-mer expuestos en fagos (10 \mul de 2x10^{13} unidades formadoras de placa (pfu/ml) en 50 \mul de PBS y se incubó a 4ºC con agitación durante 30 minutos en el tubo para PCR del anti-blanco. El sobrenadante se transfirió a otro tubo para PCR de anti-blanco y este procedimiento se repitió 3 veces hasta reducir en gran medida el número de péptidos expuestos en fagos que se unían al anti-blanco.

El sobrenadante que contenía la librería de fagos-péptidos (carente de ligantes del anti-blanco) se transfirieron al tubo para PCR con el blanco revestido de TNF-\alpha y se incubó durante 4 horas a 4ºC con agitación para permitir que los péptidos expuestos en fagos se uniesen al blanco. Los fagos no unidos se eliminaron lavando el tubo 5 veces con 150 \mul de PBS que contenía el 0,1% de Tween-20 a temperatura ambiente. Los ligantes de baja afinidad se lavaron mediante incubación con 60 \mul de glicina 0,2 M (pH 2,2) durante 6 minutos seguida de neutralización con 9 ml de Tris-Cl 1 M (pH 9,1). La población lavada con ácido se conservó para análisis adicionales. El tubo se lavó de nuevo 3 veces con 150 \mul de PBS.

A los fagos-péptidos restantes unidos al TNF-\alpha se añadieron 54 ml de tampón de lisis A (Lysis Buffer A) (10 mM de Tris-Cl, pH 8,4, Triton-X100 al 0,1%) y una gema de PCR AmpliWax^{TM} (Perkin Elmer, Norwalk, USA.) El tubo se calentó hasta 96ºC durante 15 min y, a continuación, se dejó enfriar. A continuación se añadieron los siguientes reactivos para PCR:

100

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La amplificación se realizó usando 20 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s, renaturalización a 55ºC durante 20 s y extensión a 72ºC durante 3 s. Las secuencias de los cebadores eran (sintetizadas por GIBCO BRL):

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CMM13-01	5' CCTCGAAAGCAAGCTGATAAC 3'	Sec. Id. nº: 1
CMM13-02	5'CATTCCACAGACAACCCTCATAG3'	Sec. Id. nº: 2

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El producto de la PCR (267 pares de bases (pb)) se analizó en un gel de poliacrilamida al 8% junto con el producto de la PCR de un único clon de péptido en fagos (control positivo) y marcadores de peso molecular (figura 2). Se observó un producto más lento que apareció como una banda difusa a aproximadamente 500-700 pb. Esto fue debido a demasiadas plantillas (es decir, fagos) en la reacción de PCR y se puede paliar disminuyendo la concentración de fagos o disminuyendo el número de ciclos de PCR (figura 3). Para disminuir la cantidad de banda difusa a 500-700 pb, el producto de PCR se diluyó adecuadamente para reacciones posteriores de PCR de este material de partida para generar más productos con fines de sub-clonaje. Una vez que amplificado el producto deseado (267 pb), se digirió con las endonucleasas de restricción Eagl y Acc651 para producir un fragmento de 45 pb que contenía el ADN que codifica el péptido aleatorio. El fragmento de 45 pb se sub-clonó entonces en el vector M13KE (New England Biolabs; Beverly, MA) en los sitios de restricción Eagl y Acc65I usando técnicas estándar (Sambrook y col., (1988) supra). Después del ligado del fragmento de 45 pb al vector M13KE, la reacción de ligado se transformó en células químicamente competentes de E. coli ER2537. Las células se hicieron competentes con cloruro de calcio usando un protocolo estándar (Sambrook y col, (1989) supra). El ADN M13 se aisló desde varios transformantes usando un protocolo modificado del protocolo de New England Biolab para la preparación de ADN M13 y posterior secuenciación. La modificación incluye el uso de placas de 96 pocillos en vez de tubos. Las correspondientes secuencias peptídicas se muestran en la tabla 1.

TABLA 1

1

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Ejemplo de referencia 2

Caracterización de la afinidad y selectividad de unión de fagos-péptidos que se unen a TNF-\alpha

La unión y la disociación del clon de fago A1, con secuencia de aminoácidos: RYWQDIP; tabla 1, (Sec. Id. nº: 3) con TNF-\alpha se controló usando un biosensor IAsys AutoPlus siguiendo el protocolo de IAsys de Labsystems Affinity Sensors 2.4 "Immobilization to Protein Layer: Thlol coupling to avidin" (Thermo BioAnalysis Corp. Franklin, MA). Primero se revistieron dos cubetas con avidina y una (la de control) se bloqueó con blotina. Esto fue seguido de activación de los grupos de lisina. Se añadió una alícuota de 15 \mul de una disolución de (h)TNF-\alpha de 1 mg/ml a cada cubeta. No se observó unión de la proteína a la superficie en la cubeta de control, pero el (h)TNF-\alpha quedó claramente inmovilizado en la cubeta revestida con avidina no bloqueada (no mostrada). Este complejo era estable y no se disoció durante un periodo de tiempo de 10 minutos. Después de bloqueo y lavado, se añadió el clon del fago A1, RYWQDIP (Sec. Id. nº: 3), para proporcionar una titulación final de 5 x 1011 pfu/ml. Como se muestra en la figura 4, hay una unión significativa del fago al TNF-\alpha en la cubeta de la muestra, mientras que hay muy poca unión del fago en la cubeta de control.

La disociación del fago del TNF-\alpha es muy lenta, con la constante de disociación estimada como k_{off} < 10^{-4} s^{-1} (HEPES 10 mM/Tween 0,05%). El lavado con un concentrado tampón 10 veces (a los 70 minutos) solo eliminó una pequeña parte del fago. Lavados adicionales con HCl 10 mM no lograron eliminar completamente el fago-péptido del blanco. La unión de la secuencia del péptido expuesto en fago RYWQDIP (Sec. Id. nº: 3) es específica, puesto que los fagos tipo nativo a los que les falta inserto no se unen al TNF inmovilizado.

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Ejemplo 3 Estabilidad de librerías expuestas en fagos en una matriz con detergente

Para examinar el efecto de detergentes domésticos para ropa en la estabilidad de las librerías de péptidos en fagos, una disolución previa de una librería de péptidos 12-mer expuestos en fagos filamentosos M13 (New England Blolabs, Beverly MA, USA) que contenía 10^{13} pfu/ml se diluyó hasta 10^{12} pfu/ml en a) Tris HCl 100 mM, pH 7,5, Tween-20 al 0.1% (control TBST); b) 0,7 g/L de Arlel Futur (Procter & Gamble, Cincinnati, OH) con una dureza de 3 gramos por galón, gpg, (51,3 ppm), y c) 3,4 g/L de Arlel Futur con una dureza de 15 gpg (256,5 ppm). Se añadieron alícuotas (100 \mul) a los pocillos de una placa de microtitulación de fondo plano y 96 pocillos (Costar, cat nº 3598) que se bloqueó con tampón de bloqueo Superblock en TBS (Pierce, cat nº 37535). Las muestras se incubaron a 25ºC con agitación suave durante 90 minutos. Se eliminaron alícuotas de 10 ml y se diluyeron en serie en caldo LB para la titulación de fagos según procedimientos estándar (Kay y col., (1996) supra). No se observó pérdida en la titulación de fagos en la disolución de detergente respecto a la librería de fagos de control en TBST.

TABLA 8

2

Ejemplo 4 Cribado de péptidos seleccionados para identificar piel humana y no pelo

Se colocaron dos trozos de pelo humano moreno de 3 pulgadas (7,62 cm) (International Hair Importers & Products, White Plains, NY) en tubos cónicos de 50 ml bloqueados con BSA que contenían 10 ml de una disolución de lavado corporal Neutrogena® (Neutrogena Corp.) al 2% en agua DI. Se añadieron 10 ml de librerías de péptidos 7-mer cíclico o 12-mer lineal (10^{10} pfu/\mul) o fagos tipo nativo (10^{9} pfu/\mul) y las muestras se mezclaron a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación rotativa (30 rpm). El sobrenadante no unido se transfirió a un nuevo tubo que contenía dos trozos adicionales de pelo moreno de 3 pulgadas (7,62 cm) y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. con agitación rotativa. Después de esta segunda incubación de pelo se transfirieron 500 \mul de la disolución a la superficie de tejidos cutáneos humanos (EpiDerm^{TM}, MatTek Corp. Ashland, MA) en una placa de cultivo de 6 pocillos que contenía 0,9 ml de medio de cultivo tisular (MatTek Corp) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Los tejidos cutáneos se eliminaron y lavaron 2 veces en 50 ml de jabón corporal al 2% durante 5 min cada uno y 3 veces en 50 ml de PBS durante 5 min cada uno en tubos cónicos de 50 ml bloqueados. Después del lavado final con PBS, los tejidos tisulares se congelaron a -20ºC seguido de PCR del fago con ligando unido al blanco.

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Ejemplo 5 Cribado de péptidos seleccionados para identificar pelo humano y no piel

Se colocaron tejidos cutáneos pre-equilibrados en una placa de cultivo de 6 pocillos que contenían 0,9 ml de medio fresco de cultivo tisular y 300 ml de jabón corporal Neutrogena® al 2% que contenía 10 ml de librerías de péptidos 7-mer cíclico o 12-mer lineal (10^{10} pfu/\mul), o se añadieron fagos tipo nativo (10^{9} pfu/\mul) a la superficie de la piel. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min con agitación suave. El sobrenadante no unido se transfirió a un nuevo pocillo que contenía tejido cutáneo y el procedimiento se repitió. La disolución de incubación se transfirió a tubos de 60 ml con nueve trozos de pelo moreno de 3 pulgadas (7,62 cm) (International Hair Importers &Products, White Plains, NY) que contenían 10 ml de jabón corporal al 2% durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación rotativa (30 rpm). Las muestras de pelo se lavaron entonces una vez con 50 ml, 2 veces con 50 ml o 4 veces con 50 ml de jabón corporal al 2%; a continuación se realizaron ciclos de lavado en PBS (1 X 25 ml durante 5 min, 1 X 25 ml durante 2 min, 2 X 50 ml durante 5 min cada uno, 150 ml en total). Después del lavado final con PBS, las muestras de pelo que contenían los péptidos-fagos unidos se congelaron a -20º.

La amplificación por PCR del fago unido al blanco se llevó a cabo como se describe en el ejemplo de referencia 1, con modificaciones menores. Las reacciones de PCR contenían 50 \mug de BSA para evitar la inhibición de las reacciones de PCR por el pelo o la piel.

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Ejemplo 6 Ensayo ELISA para unión selectiva de péptidos que identifica pelo humano y no piel o que identifica piel y no pelo

Las secuencias de los péptidos identificadas en los ejemplos 4 y 5, junto con un péptido de control aleatorio, se marcaron en el C terminal con la secuencia GGGK (biotina). La secuencia LESTPKMK (Sec. Id. nº: 116) contiene la secuencia de consenso LEST y se aisló en el pelo. La secuencia FTQSLPR (Sec. Id. nº: 116) contiene la secuencia de consenso TQSL y se aisló en la piel. La secuencia YGGFMTSE (Sec. Id. nº: 117) es un péptido de
control.

Se colocaron pelo marrón oscuro (3 pulgadas (7,62 cm) de longitud, 4 de cada uno) humedecido con jabón corporal al 2% y tejidos tisulares humanos pre-equilibrados en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Se añadió 1 ml de una disolución 200 \muM del péptido biotinilado en jabón corporal Neutrogena a las muestras de pelo y de piel y se incubaron 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. La disolución se extrajo con pipeta y las muestras de pelo y de piel se transfirieron con pinzas limpias a un tubo cónico de 50 ml, se lavaron una vez con 50 ml de jabón corporal, dos veces con 50 ml de agua y una vez con 50 ml de PBS; cada etapa de lavado duró 5 min y se realizó en un agitador rotativo a 20 rpm. Las muestras de pelo y de piel se transfirieron entonces con pinzas limpias a una placa nueva de 24 pocillos, a la que se añadió 1 ml de peroxidasa de rábano picante HRP conjugada con estreptavidina (diluida 1/1000 en PBS) durante 1 ha temperatura ambiente con agitación suave. El exceso de HRP y estreptavidina se eliminó lavando dos veces con 50 ml de PBS (5 min, 20 rpm cada una) en un tubo cónico de 50 ml. Las muestras de pelo y de piel se transfirieron a pocillos nuevos y se añadió 1 ml de H_{2}O_{2}/OPD y se dejó que cambiase el color a temperatura ambiente. La figura 5 muestra que la unión del péptido es selectiva para los blancos respectivos respecto al péptido de control.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9854312 A [0004]

\bullet US 5292646 A [0034]

\bullet US 5582981 A [0005]

\bullet US 5733731 A [0034]

\bullet US 5475096 A [0007]

\bullet US 5605793 A [0034]

\bullet WO 9906542 A [0008]

\bullet US 9609383 W [0035]

\bullet US 5837500 A [0033]

\bullet WO 9722617 A [0035]

\bullet WO 9118980 A [0033]

\bullet WO 9735198 A [0036]

\bullet WO 9119818 A, Dower [0033]

\bullet WO 9633010 A [0036]

\bullet US 5283173 A [0034]

\bullet US 4683202 A [0060]

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Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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Claims (9)

1. Procedimiento para el cribado de una librería de ligandos de péptidos que comprende las etapas de

(a) poner en contacto la librería de ligandos con un anti-blanco para permitir que dichos ligandos se unan a dicho anti-blanco;

(b) separar los ligandos no unidos;

(c) poner en contacto dichos ligandos no unidos con un blanco seleccionado para permitir que dichos ligandos no unidos se unan al blanco para formar un complejo de ligando unido al blanco;

(d) separar dicho complejo de ligando unido al blanco de los ligandos que no se unen a dicho blanco; y

(e) identificar los ligandos unidos al blanco del complejo de ligando unido al blanco,

en el que el anti-blanco es pelo y el blanco es piel, o en el que el anti-blanco es piel y el blanco es pelo.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que k_{off} es aproximadamente 10^{-4} s^{-1} o inferior.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ligando unido al blanco se une con una selectividad correspondiente a al menos 10:1 y tiene una K_{D} de al menos aproximadamente 10^{-7} M.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cada etapa (a), (b), (c) o (d) se repite entre 2 y 10 veces.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los ligandos unidos al blanco son péptidos de longitud inferior a 25 aminoácidos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el blanco es piel.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el blanco es pelo.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de identificación comprende emplear PCR del ligando unido al blanco.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos ligandos son para uso en una aplicación de cuidado personal.