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ES2337530T3 - Aislamiento de cristales de carotenoide a partir de biomasa microbiana. - Google Patents

Aislamiento de cristales de carotenoide a partir de biomasa microbiana. Download PDF

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ES2337530T3
ES2337530T3 ES98922804T ES98922804T ES2337530T3 ES 2337530 T3 ES2337530 T3 ES 2337530T3 ES 98922804 T ES98922804 T ES 98922804T ES 98922804 T ES98922804 T ES 98922804T ES 2337530 T3 ES2337530 T3 ES 2337530T3
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ES98922804T
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Mieke Sibeijn
Robertus Mattheus De Pater
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    • C07C403/24Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by six-membered non-aromatic rings, e.g. beta-carotene
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

Un proceso para el aislamiento de un compuesto carotenoide cristalino a partir de una biomasa microbiana que comprende los pasos de desbaratar las paredes celulares microbianas, separar los restos celulares del residuo que contiene carotenoide, que incluye un lavado de la biomasa microbiana, la masa celular desbaratada o bien el residuo que contiene carotenoide con un disolvente adecuado para eliminar lípido, suspender los cristales carotenoides que se obtienen en agua para hacer flotar los cristales, recuperar los cristales, donde el residuo que contiene carotenoide se lava con un disolvente adecuado para eliminar lípido y con agua antes de eliminar lípido.

Description

Aislamiento de cristales de carotenoide a partir de biomasa microbiana.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de compuestos carotenoides que se producen por métodos microbianos.
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Fundamentos de la invención
En la actualidad, los cristales de \beta-caroteno de alta pureza (96% o más) se producen por síntesis química. La mayoría de las veces, cuando se extrae de una fuente natural, el \beta-caroteno aparece en forma de extracto aceitoso (aceite de palma, aceite de alga). Aunque también es posible obtener cristales de \beta-caroteno a partir de fuentes naturales como los vegetales (por ejemplo, las zanahorias) o los microorganismos (por ejemplo, las algas (Dunallella) o los hongos (Blakeslea), los procesos de obtención de cristales relativamente puros a partir de dichas fuentes naturales disponibles en la actualidad acarrean importantes desventajas.
La purificación de cristales de \beta-caroteno a partir de fuentes naturales comprende la extracción de \beta-caroteno de dicha fuente con un extractante adecuado, seguido de pasos de purificación adicionales opcionales hasta obtener la pureza deseada.
La extracción se lleva a cabo con diversos extractantes: disolventes orgánicos como acetato de etilo, acetato de butilo, hexano; aceites vegetales o fluidos supercríticos como propano, etileno, CO_{2}. Después, los cristales de \beta-caroteno se pueden cristalizar directamente a partir del extracto que se obtiene tras la extracción con disolvente de dicha fuente natural, por ejemplo, por evaporación del disolvente.
Una importante desventaja del proceso de extracción con disolvente es que los cristales de \beta-caroteno se deben solubilizar en un disolvente primero, con lo cual, tras separar el residuo de biomasa del disolvente que contiene \beta-caroteno, los cristales de \beta-caroteno se deben cristalizar una vez más. Además, puede tener lugar fácilmente una pérdida sustancial de \beta-caroteno.
Para evitar el uso de grandes cantidades de disolvente necesarias para solubilizar el \beta-caroteno, sería deseable aislar directamente el \beta-caroteno, o cualquier otro carotenoide, en una forma cristalina a partir de una biomasa microbiana.
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Descripción de la invención
La presente invención describe un proceso para el aislamiento de un compuesto carotenoide a partir de una biomasa microbiana. El proceso de la invención se puede aplicar a una biomasa microbiana en la que estén presentes compuestos carotenoides en una forma cristalina. Según el proceso de la presente invención, los cristales de carotenoide se separan directamente de la biomasa microbiana. Una ventaja importante del proceso de la invención es que se puede aplicar sin usar grandes cantidades de disolvente. En particular, la cantidad de disolvente que se usa en el proceso de la invención se reduce considerablemente si se compara con las grandes cantidades de disolvente que se requieren para solubilizar el carotenoide usando un proceso normal de extracción con disolvente.
El proceso de la invención comprende en esencia los pasos de desbaratar las paredes celulares microbianas, separar los restos celulares del residuo que contiene carotenoide, que incluye un lavado de la biomasa microbiana, la masa celular desbaratada o bien el residuo que contiene carotenoide con un disolvente adecuado para eliminar lípido, hacer flotar los cristales de carotenoide que se obtienen en agua, donde el residuo que contiene carotenoide se lava con un disolvente adecuado para eliminar lípido y con agua antes de eliminar lípido.
Los siguientes pasos del proceso de la invención se describen con más detalle.
El microorganismo que contiene carotenoide puede ser un microorganismo bacteriano, de levadura, fúngico o de alga. Preferiblemente, el microorganismo que contiene carotenoide es una levadura, un hongo o una alga. De manera más preferible, es una levadura del género Phaffia, un hongo del orden Mucorales o una alga del género Dunaliella.
La biomasa microbiana que contiene carotenoide se obtiene de cualquier fermentación adecuada de un microorganismo elegido que produzca carotenoide, según se especifica anteriormente.
La biomasa microbiana que se somete al proceso de la invención puede aparecer en forma de una pasta de células húmeda o seca. Por razones económicas, se prefiere el uso de la pasta de células húmeda. La biomasa seca puede estar, por ejemplo, en forma de extruido, según se describe en la publicación WO 97/36996.
La disrupción celular puede ocurrir por métodos que se conocen en la técnica. La disrupción puede ocurrir física (mecánicamente), enzimática y/o químicamente. Preferiblemente, la disrupción celular se realiza por medios mecánicos. La disrupción mecánica puede tener lugar, por ejemplo, homogeneizando biomasa microbiana en un homogeneizador a alta presión o empleando un molino de bolas o sometiéndola a ultrasonidos. La disrupción química puede ocurrir en un entorno de pH alto o bajo, o añadiendo un disolvente como octanol. La disrupción enzimática puede tener lugar a causa de la actividad degradante de constituyentes de la pared celular microbiana por parte de una enzima o una mezcla de enzimas.
Para ejercer una disrupción celular eficaz, la biomasa puede tener normalmente un contenido en materia seca de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 g/l. Convenientemente, se use el caldo de fermentación que se obtiene directamente tras la fermentación, que tiene un contenido en materia seca de aproximadamente 50 g/l. Cuando el material de partida es una biomasa seca, dicha biomasa se mezcla con una cantidad de agua suficiente para obtener un contenido en materia seca de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 g/l, según se especifica anterior-
mente.
Para mejorar el rendimiento del proceso de recuperación de la invención se puede añadir, opcionalmente, un disolvente orgánico inmiscible con agua a la masa celular desbaratada antes de que se lleve a cabo cualquier otro paso de procesado más. Dependiendo del tipo de proceso de disrupción que se aplique, la adición de dicho disolvente comprenderá añadirlo antes, durante o después de la disrupción celular. Por ejemplo, en el caso en el que las células se desbaratan por homogeneización, el disolvente se añade preferiblemente después del paso de disrupción. El aceite o el disolvente se añade en una cantidad de 1% a 100% respecto a la cantidad de suspensión de biomasa o de masa celular desbaratada, preferiblemente de 3% a 10% respecto a la cantidad de suspensión de biomasa o de masa celular desbaratada. Un disolvente orgánico inmiscible con agua adecuado es, por ejemplo, un aceite, hexano o acetato de etilo. Preferiblemente, se añade un aceite a la masa celular desbaratada. Los ejemplos de aceites adecuados incluyen los aceites vegetales como el aceite de soja.
Se elimina decantando o centrifugando una parte sustancial de los restos celulares de la masa celular desbaratada resultante. Preferiblemente, se emplea un paso de centrifugación. Dicha centrifugación genera una capa superior sólida, media líquida e inferior sólida, conteniendo la capa sólida superior los cristales de carotenoide, la cual se denomina también el residuo que contiene carotenoide. Se pierde solamente una cantidad muy pequeña de carotenoide en este paso.
La capa sólida superior con el residuo que contiene carotenoide, dicho residuo estando formado esencialmente por cristales de carotenoide, lípido microbiano y restos celulares restantes, se lava una o más veces con agua para eliminar más restos celulares. Dicha agua puede contener, opcionalmente, una sal como cloruro de sodio. La sal puede estar presente en una concentración de hasta 25% (p/p). El proceso de la invención incluye además un paso de lavado con un disolvente adecuado para eliminar una parte sustancial del lípido microbiano y, opcionalmente, un aceite añadido anteriormente a las células desbaratadas.
Un disolvente adecuado para la eliminación de lípido es un disolvente miscible con lípido y agua en el que el carotenoide cristalino posee una solubilidad baja. Preferiblemente, dicho disolvente es un alcohol inferior como metanol, etanol, isopropanol o acetona. De manera más preferible, dicho disolvente es etanol. Debe tenerse en cuenta que la cantidad de disolvente requerida para eliminar lípido es sustancialmente inferior a la cantidad de disolvente requerida para la extracción con disolvente de un carotenoide a partir de una biomasa microbiana.
En una realización preferida de la invención, el residuo que contiene carotenoide que se obtiene tras la separación de los restos celulares se lava con dicho disolvente adecuado para eliminar lípido. Dicho lavado se lleva a cabo agitando el residuo que contiene carotenoide durante un periodo conveniente, por ejemplo, durante aproximadamente 10 minutos, con dicho disolvente y recuperando la capa sólida del fondo tras centrifugar. Opcionalmente, dicho lavado con dicho disolvente se repite una o más veces.
En otra realización de la invención, se puede eliminar lípido de la biomasa microbiana antes que tenga lugar la disrupción celular. Esta realización alternativa se puede emplear en particular si el material de biomasa de partida está en una forma seca. Normalmente, la biomasa seca se suspende en el disolvente elegido en una cantidad de 10 a 400 g de biomasa por litro de disolvente. Para aumentar la cantidad de lípido que se elimina, se puede emplear una temperatura elevada, por ejemplo de 50ºC. La biomasa tratada de este modo se separa del disolvente que contiene lípido por filtración o centrifugación. Se repite el tratamiento opcionalmente.
Lavar, según se usa en esta invención, incluye un paso de suspensión o agitación del material a lavar en una cantidad adecuada del disolvente elegido y un paso de decantación o centrifugación y la posterior recuperación de la capa apropiada.
Los cristales que se obtienen tras la eliminación de los restos celulares y lípido se suspenden después en agua, lo que hace que los cristales de carotenoide floten. El flote de los cristales se estimula haciendo burbujear gas a través de la suspensión. Normalmente, a modo de operación por lotes, se continúa haciendo burbujear gas hasta que la capa del fondo pierda considerablemente el color. El gas que se usa no es importante y puede ser, por ejemplo, aire o nitrógeno. Tras este paso de flote, los cristales se recuperan por centrifugación o decantación. De esta manera, los cristales, que se encuentran en la capa superior, se separan de cualquier resto celular restante, presente en la capa inferior, por medio de una capa media líquida.
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El flote de los cristales se puede mejorar en presencia de una sal o un aceite en el agua que se usa para suspender los cristales crudos. Por lo tanto, el agua puede contener, opcionalmente, una sal como cloruro de sodio y/o un aceite vegetal como aceite de soja. La sal puede aparecer en una concentración de hasta 25% (p/p), el aceite en una concentración de hasta 2%. Preferiblemente, en el agua en el cual se suspenden los cristales de carotenoide hay un aceite.
Los cristales crudos que se obtienen tras el lavado o los lavados con disolvente y el flote de los cristales en agua se secan o bien se siguen purificando hasta alcanzar el grado de pureza deseado.
Los pasos de purificación adicionales pueden comprender más pasos de lavado con un disolvente adecuado. Por ejemplo, se lleva a cabo de manera ventajosa un tratamiento adicional de los cristales empleando un disolvente en el cual el carotenoide cristalino posee una baja solubilidad. Dicho tratamiento con disolvente comprende los pasos de agitar los cristales de carotenoide crudos en dicho disolvente durante un periodo suficientemente largo para permitir la disolución de las impurezas, filtrar los cristales y lavar los cristales varias veces con disolvente fresco. Dicha agitación se puede realizar a cualquier temperatura deseada dentro de un intervalo de aproximadamente 20 a 80ºC. Preferiblemente, cuando se agita a una temperatura relativamente elevada, la mezcla se enfría antes de filtrar los
cristales.
Opcionalmente, este tratamiento se repite una o más veces, pudiéndose repetir el tratamiento con el mismo disolvente que se usó primero o uno diferente. Tras el último paso de lavado, el disolvente residual se evapora.
Los disolventes adecuados para seguir purificando son los disolventes en los cuales el carotenoide posee una solubilidad baja, es decir, una solubilidad de como mucho 1 g/l a 25ºC. Preferiblemente, el disolvente es agua o un disolvente orgánico. cuando se emplea agua, el pH del agua no es un factor importante en el tratamiento, aunque se prefiere que el pH esté por debajo de 7. De manera más preferible, el pH del agua es de 4-6. El disolvente orgánico es preferiblemente un alcohol inferior o un éster de acilo inferior de este, en los cuales se entiende que inferior comprende de 1 a 5 átomos de carbono, o acetona. De manera más preferible, el disolvente orgánico es etanol o acetato de
etilo.
El proceso de la presente invención se aplica de manera ventajosa a cualquier microorganismo en el cual esté presente predominantemente en forma cristalina un compuesto de carotenoide. Preferiblemente, el proceso de la invención se lleva a cabo empleando un microorganismo que contiene un carotenoide que esté al menos en un 50% en forma cristalina, de manera más preferible al menos en un 60% y de la manera más preferible al menos en un 70%.
Los carotenoides apolares en particular están presentes predominantemente en forma cristalina en la célula debido a su baja solubilidad en un entorno celular. Ejemplos de compuestos carotenoides apolares son fitoeno, presente en, por ejemplo, algunas cepas de Phaffia rhodozyma, o \beta-caroteno, presente en, por ejemplo, Blakeslea trispora o Phycomyces blakesleanus.
Los cristales de carotenoide que se obtienen cuando se aplica el proceso de la invención son de alta pureza y se usan de manera ventajosa en composiciones alimenticias, farmacéuticas y cosméticas.
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Ejemplo 1 Aislamiento directo de cristales de \beta-caroteno de Blakeslea trispora
Se homogeneizaron dos veces 2.0 L de caldo de fermentación de Blakeslea trispora con un contenido de 0.164% (p/p) en \beta-caroteno a una presión de 800-1000 bar. Tras centrifugar la mezcla, la capa superior se mezcló con 750 mL de agua desmineralizada. La mezcla se centrifugó y la capa superior se volvió a mezclar con 750 mL de agua desmineralizada. Tras centrifugar la mezcla, la capa superior se agitó con 750 mL de etanol durante 5 minutos. Tras centrifugar se decantó la capa superior. Se lavó posteriormente cuatro veces la capa del fondo con etanol (según se redactó anteriormente) y se agitó con 700 mL de agua desmineralizada (etapa 1) durante 10 minutos, lo cual indujo el flote de los cristales. Los cristales que se obtuvieron tras centrifugar se secaron al vacío.
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Ejemplo 2 Flote en presencia de sal o aceite
En vez de agua desmineralizada, se añadió en la etapa 1 agua salada (cloruro de sodio al 25% (p/p) en agua) o agua que contenía aceite de soja (1%). De este modo, se obtuvo un rendimiento global de \beta-caroteno más alto.
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Ejemplo 3 Purificación adicional de los cristales de \beta-caroteno
Se mezcló una cantidad de 7 g de la suspensión cristalina que se obtuvo tras el último paso de centrifugación (véase el Ejemplo 1) una vez con 45 mL de agua desmineralizada. Tras centrifugar se añadieron 300 mL de etanol a la capa superior y la mezcla se mezcló y se centrifugó. La capa superior se decantó y se mezclaron 300 mL de etanol con la capa del fondo. Se volvió a decantar la capa superior, tras lo cual la capa del fondo (suspensión cristalina) se mezcló con 20 mL de acetato de etilo a 50ºC en una atmósfera de nitrógeno durante 30 minutos. La suspensión se enfrió a 5ºC en 30 minutos. Los cristales se fueron filtrando sucesivamente, se lavaron con 5 mL de acetato de etilo a 5ºC y se agitaron con 20 mL de etanol a 50ºC en una atmósfera de nitrógeno durante 30 minutos. La suspensión se enfrió a 20ºC en 30 minutos. Los cristales se filtraron, se lavaron dos veces con 5 mL de etanol y se secaron al vacío a temperatura ambiente para dar 1.22 g de \beta-caroteno con una pureza de 93.3% determinada por HPLC (92.8% de \beta-caroteno y 1.1% de 13-cis-\beta-caroteno).
El rendimiento global fue de 35%.

Claims (10)

1. Un proceso para el aislamiento de un compuesto carotenoide cristalino a partir de una biomasa microbiana que comprende los pasos de desbaratar las paredes celulares microbianas, separar los restos celulares del residuo que contiene carotenoide, que incluye un lavado de la biomasa microbiana, la masa celular desbaratada o bien el residuo que contiene carotenoide con un disolvente adecuado para eliminar lípido, suspender los cristales carotenoides que se obtienen en agua para hacer flotar los cristales, recuperar los cristales, donde el residuo que contiene carotenoide se lava con un disolvente adecuado para eliminar lípido y con agua antes de eliminar lípido.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde el disolvente adecuado para eliminar lípido es un alcohol inferior o acetona, preferiblemente etanol.
3. El proceso de la reivindicación 1 ó 2, donde se añade un disolvente inmiscible con agua a las células microbianas antes, durante y después de desbaratar las paredes celulares.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde se añade dicho disolvente inmiscible con agua a la masa celular desbaratada tras desbaratar las paredes celulares.
5. El proceso de la reivindicación 3 ó 4, donde dicho disolvente inmiscible con agua es un aceite, preferiblemente un aceite vegetal.
6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el flote de los cristales se mejora haciendo burbujear un gas a través de la suspensión.
7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el agua para hacer flotar los cristales contiene además una sal y/o un aceite.
8. El proceso de la reivindicación 7, donde el agua para hacer flotar los cristales contiene un aceite vegetal.
9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la biomasa microbiana es de Blakeslea trispora.
10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el compuesto carotenoide es \beta-caroteno.
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