RU2475541C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans Download PDFInfo
- Publication number
- RU2475541C1 RU2475541C1 RU2011139309/10A RU2011139309A RU2475541C1 RU 2475541 C1 RU2475541 C1 RU 2475541C1 RU 2011139309/10 A RU2011139309/10 A RU 2011139309/10A RU 2011139309 A RU2011139309 A RU 2011139309A RU 2475541 C1 RU2475541 C1 RU 2475541C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carotenoids
- deinoxanthin
- ethanol
- deinococcus radiodurans
- deinoxanthine
- Prior art date
Links
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 8
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 claims abstract description 53
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- GJFBHWJTMDTLNX-UWCSZFODSA-N Deinoxanthin Chemical compound CC(O)(C)C/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(\C)/C=C/C=C(\C)/C=C/C1=C(C)C(=O)C[C@@H](O)C1(C)C GJFBHWJTMDTLNX-UWCSZFODSA-N 0.000 claims description 35
- XTLNYNMNUCLWEZ-UHFFFAOYSA-N ethanol;propan-2-one Chemical compound CCO.CC(C)=O XTLNYNMNUCLWEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 abstract 1
- 150000007854 aminals Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 abstract 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 abstract 1
- 230000003537 radioprotector Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 16
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 10
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 carotenoid compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000002035 hexane extract Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Substances OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000003819 low-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCYMWQIUHPXBKM-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;ethoxyethane Chemical compound CCOCC.CCN(CC)CC WCYMWQIUHPXBKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000718 radiation-protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012455 biphasic mixture Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007494 tgy medium Substances 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения каротиноидов, в частности деиноксантина, который применяется для разработки новых антиоксидантных и радиопротекторных препаратов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения заболеваний. Способ предусматривает проведение экстракции каротиноидов из бактериальной массы Deinococcus radiodurans смесью ацетон: этанол (в соотношении 1:1). Разделение каратиноидов с выделением деиноксантина на препаративных колонках жидкостного хроматографа низкого давления, где в качестве сорбента используют гидроксиаппатит, а в качестве элюента - этанол. Изобретение позволяет повысить количество и качество выделяемого деиноксантина. 2 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области продуцируемых микробами каротиноидных соединений и направлено на выделение каротиноидов, в частности деиноксантина, который может применяется для разработки новых антиоксидантных и радиопротекторных препаратов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения заболеваний, из микроорганизма Deinococcus radiodurans.
Уровень техники
Известен способ выделения кристаллического каротиноидного соединения из микробной каротиноидсодержащей биомассы (RU 2235783) (1), в котором производят разрушение микробных клеточных стенок в микробной каротиноидсодержащей биомассе, отделение клеточного дебриса в микробной каротиноидсодержащей биомассе от каротиноидсодержащего остатка, промывание каротиноидсодержащего остатка растворителем, подходящим для удаления липида, суспендирование полученного каротиноидсодержащего остатка в воде с целью флотирования каротиноидного соединения, выделение кристаллического каротиноидного соединения и дальнейшую очистку кристаллического каротиноидного соединения. Данный способ предназначен для выделения кристаллов каротина из микроорганизмов, содержащих каротиноиды внутри клеток в виде кристаллов, но непригоден для выделения каротиноидов, содержащихся в клетках в растворенном состоянии.
Непатогенный микроорганизм Deinococcus radiodurans известен устойчивостью к дозам радиации, в десятки раз превышающим летальные для изученных к настоящему времени микроорганизмов. Одной из характерных биохимических особенностей этого микроорганизма является синтез каротиноидов, в частности деиноксантина, придающего колониям характерную розово-оранжевую окраску. Это вещество обладает уникально высокой антиоксидантной активностью. Деиноксантин способен значительно эффективнее, чем β-каротин и α-токоферол, перехватывать синглетный кислород и гидроксильный радикал (наиболее опасные виды активных форм кислорода). Этот каротиноид представляет особый интерес с точки зрения разработки новых антиоксидантных и радиопротекторных препаратов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения заболеваний. В целях получения препарата деиноксантина необходимо решить ряд задач. В первую очередь это разработка недорогих способов разделения каротиноидов Deinococcus radiodurans.
Впервые деиноксантин был выделен из ацетон-метанольных экстрактов микробактерий Deinococcus radiodurans (Lemee L, Peuchant E. and Clerc M. Deinoxanthin: A New Carotenoid Isolated from Deinococcus radiodurans // Tetrahedron. 1997. V.53. т.3. Р.919-9260) (2). Способ включает центрифугирование и экстракцию бактериальной массы Deinococcus radiodurans смесью ацетон-метанол, вакуумное выпаривание растворителя, реэкстракцию сухого остатка этилацетом с последующей промывкой этилацетной фазы водой и ее сушкой над сульфатом магния. Разделение первичного экстракта осуществляется с помощью флэш - хроматографии на силикагеле (жидкая фаза: ацетон - петролейный эфир - триэтиламин; 20:80:1). Полученные фракции проверяются методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и обращенно-фазовой (ВЭЖХ). Фракция, содержащая целевой компонент, далее разделяется с использованием полупрепаративной обращенно-фазовой хроматографии. Окончательную очистку препарата выполняют, применяя обычную полупрепаративную ВЭЖХ. Недостатками данного способа являются трудоемкость, длительность, многостадийность, что влечет за собой потери каротиноидов, необходимость приобретения сложного дорогостоящего оборудования, использование больших количеств дорогостоящих реактивов и, как следствие, неэкономичность.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ выделения деиноксантина (Лысенко B.C. и др. Разделение и масс-спектрометрическая идентификация каротиноидов радиорезистентных бактерий Deinococcus radiodurans. - журнал Масс-спектрометрия, 2010, т.7 №4, с.278-273) (3), принимаемый авторами настоящего изобретения в качестве прототипа, в котором суспензию микробактерий Deinococcus radiodurans экстрагируют гексаном, затем дополнительно экстрагируют ацетонитрилом, двухфазную смесь отстаивают, отбрасывают верхний гексановый слой, имеющий слабую желтую окраску, ацетонитрильную фазу упаривают в токе азота до получения сухого остатка, который реэкстрагируют безводным ацетоном. Пробы наносят на препаративные пластины для тонкослойной хроматографии, покрытые слоем силикагеля с 2% крахмала. В качестве подвижной жидкой фазы для тонкослойной хроматографии используют смесь петролейный эфир-хлороформ-метанол (3:1:1). После хроматографирования окрашенные участки сорбента отделяют от пластины, экстрагируют ацетонитрилом и анализируют на масс-спектрометре. Недостатком способа является токсичность растворителей, используемых при экстракции и разделении каротиноидов Deinococcus radiodurans, что влечет за собой нежелательные последствия при использовании деиноксантина как в качестве фармакологического препарата, так и в качестве красителя для пищевого производства. Для достижения желаемой чистоты требуются последующие дополнительные этапы очистки деиноксантина, что может приводить к потерям, а также значительно повысит себестоимость получения деиноксантина. С другой стороны, избавление от растворителей приводит к значительным потерям деиноксантина. Кроме того, тонкослойная хроматография, используемая в известном способе, не позволяет брать для разделения вещества в препаративных количествах. Типичные количества разделяемых веществ для тонкослойной хроматографии составляют 10-7-10-2 г, что недостаточно для его практического применения. При этом препаративные пластины для тонкослойной хроматографии одноразовые, что удорожает способ.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является повышение качества и количества полученного деиноксантина, а также уменьшение его потерь в процессе выделения из биомассы микробактерий, за счет подбора менее токсичного растворителя, оптимального носителя и более производительного режима хроматографического разделения.
Техническим результатом изобретения является снижение себестоимости выделенного деиноксантина, повышение его качества и возможность получения в количестве, достаточном для практического применения.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения деиноксантина - каротиноида микроорганизма Deinococcus radiodurans, включающем экстракцию каратиноидов из суспензии микробактерий Deinococcus radiodurans, разделение каротиноидов на сорбенте и элюирование с выделением деиноксантина, согласно изобретению, экстракцию проводят ацетон-этанолом, разделение каротиноидов производят на препаративных колонках жидкостного хроматографа низкого давления, где в качестве сорбента используют гидроксиаппатит, а в качестве элюента - этанол.
Использование в предлагаемом способе малотоксичных экстрагента и элюэнта повышает качество выделенного деиноксантина и уменьшает его потери в процессе получения.
Разделение каротиноидов на препаративных колонках жидкостного хроматографа низкого давления позволяет брать вещества в более значительных количествах, чем в прототипе, что значительно увеличит количество выделенного деиноксантина. (Типичные количества разделяемых веществ для жидкостной хроматографии низкого давления составляют 10-4-102 г). Кроме того, препаративные колонки многоразовые, что удешевляет способ.
Неизвестно использование ацетон-этанола и этанола в качестве растворителей для выделения деиноксантина из суспензии микробактерий Deinococcus radiodurans, и разделение каротиноидов с помощью препаративной жидкостной хроматографии низкого давления, где в качестве сорбента используется гидроксиаппатит, что является отличительными признаками предлагаемого способа.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведен график хроматографического профиля каротиноидов Deinococcus radiodurans, полученных заявленным способом (носитель - гидроксиаппатит, элюэнт - этанол).
На фиг.2 приведен график хроматографического профиля каротиноидов Deinococcus radiodurans, полученных методом ВЭЖХ в экспериментах LeMee с соавт. (1997) (носитель - силикагель, элюэнт - ацетон - петролейный эфир - триэтиламин; 20:80:1).
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом:
Эксперименты проводились на хроматографе низкого давления <Хроматографическая система BioLogic LP> фирмы <Bio-Rad>. Для получения бактериальной массы Deinococcus radiodurans с целью экстракции каротиноидов и их дальнейшего разделения был использован непатогенный штамм Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, приобретенный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП <ГосНИИГенетика>. Выращивание культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ 8209 проводили в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл среды TGY следующего состава (г/л): триптон - 5,0; глюкоза - 1,0; дрожжевой экстракт - 3,0; вода дистиллированная - 1,0 л. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°С и 150 об/мин в течение 48 часов. Суспензию бактерий экстрагировали смесью ацетон-этанол (1:1) - 3-6 мл на 1 г сырой массы бактерий с выделением каротиноидов. Далее проводили разделение каротиноидов и элюирование с выделением деиноксантина на хроматографе низкого давления в препаративном варианте. В качестве сорбента использовали гидроксиаппатит, в качестве элюэнта - этанол 96%. Для выбора оптимальных и наименее токсичных растворителей был проведен ряд экспериментов. Оценку эффективности системы растворителей определяли по двум доминирующим пикам хроматограммы гексанового экстракта D. radiodurans как Rf1-Rf2, где Rf - индексы удерживания соответственно основного (преобладающего) и второго по амплитуде пика. Полученная зависимость от типа растворителя показана в табл.1.
Пример 1
Выделение деиноксантина из суспензии бактерий Deinococcus radiodurans проводили способом, описанным в прототипе. Суспензию бактерий центрифугировали 10 мин при 2000 g, осадок экстрагировали ацетоном - 10 мл на 1 г сырой массы бактерий. Экстракт смешивали с насыщенным раствором NaCl до концентрации ацетона 50 об. %, добавляли 2 мл гексана и интенсивно перемешивали. Отделившийся после отстаивания верхний гексановый слой извлекали из смеси и центрифугировали 10 мин при 3000 g. Дальнейшую обработку полученного гексанового экстракта осуществляли следующим образом. К 10 мл полученного гексанового экстракта добавляли 2 мл ацетонитрила. Полученную двухфазную смесь встряхивали, переносили в делительную воронку и оставляли на 30 мин для отстаивания. Нижний слой (ацетонитрил), окрашенный в интенсивно красный цвет, отделяли и использовали для дальнейшего анализа и очистки. Верхний гексановый слой, имеющий слабую желтую окраску, отбрасывали. Ацетонитрильную фазу, содержащую небольшую примесь воды, упаривали в токе азота до получения сухого остатка, который реэкстрагировали 50-100 мкл безводного ацетона. Пробу наносили на препаративные пластины покрытых слоем толщиной 0,5 мм силикагеля с 2% крахмала. В качестве подвижной жидкой фазы использовали смесь петролейный эфир-хлороформ-метанол (3:1:1). После хроматографирования и высушивания пластинки фотографировали. Полученные цифровые графические файлы в формате JPEG анализировали средствами программного пакета ImageJ. Изображение конвертировали в формат 8-bit BMP, инвертировали по яркости и выделяли интересующий участок изображения (полосу, соответствующую хроматограмме индивидуальной пробы). Получали хроматографический профиль и соответствующий файл численных данных (*.xsl). Затем осуществляли количественную оценку индивидуальных разделяемых компонентов по площади пиков хроматографического профиля, используя ранее полученный файл численных данных и программный пакет Origin 8.0. Данные приведены в табл.1.
Пример 2
Аналогично примеру 1 был проведен опыт, в котором экстракцию с выделением каротиноидов, разделение каротиноидов и оценку относительного выхода фракций проводили так же, как в примере 1. Использовали гексановый экстракт, в качестве носителя - силикагель с 2% крахмала, и другой элюэнт - ПЭ-хлороформ-этанол 3:1:1. Данные приведены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что при носителе - силикагель с 2% крахмала, максимальная эффективность разделения была выявлена в примере 1, где в качестве растворителя была использована система ПЭ-хлороформ-метанол 3:1:1. Однако используемые в примере 1 растворители токсичны, что требует дополнительных этапов очистки для достижения желаемой чистоты деиноксантина. Это неэкономично, т.к. требует дополнительных затрат. Кроме того, неизбежны потери деиноксантина.
Пример 3
Аналогично примеру 1 был проведен опыт с недорогим и нетоксичным растворителем - 96% этанолом. Использовали гексановый экстракт. В качестве носителя был использован силикагель с 2% крахмала. Экстракцию с выделением каратиноидов, разделение каратиноидов и оценку относительного выхода фракций проводили так же, как в примере 1. Полученные данные приведены в таблице 1. Результаты опыта показали, что разделения каротиноидов D. radiodurans не произошло. На пластине все каротиноиды D. radiodurans регистрируются в виде одного окрашенного пятна. Следовательно, деиноксантин не был выделен. Т.е., на силикагеле при использовании этанола в качестве элюента разделение экстракта и выделение деиноксантина не происходит.
Пример 4
Были проведены исследования, в котором использовали малотоксичный экстрагент - ацетон-этанол (1:1) и элюент - этанол 96%, в качестве сорбента - гидроксиаппатит. Суспензию бактерий центрифугировали 10 мин при 2000 g, осадок экстрагировали смесью ацетон-этанол (1:1) - 3-6 мл на 1 г сырой массы бактерий. Экстракт центрифугировали 10 мин при 3000 g. Далее проводили колоночную хроматографию на хроматографе низкого давления <Biologic LP> фирмы <Bio-Rad>. Условия хроматографического разделения: колонка - диаметр 2 см, длина 3 см, поток элюента - 0,7 мл/мин (0,2-0,3 мл/мин на 1 см2). Нанесение экстракта бактериальной массы Deinococcus radiodurans на колонку такого размера составляет - 3-5 мл. Хроматография осуществлялась в препаративном варианте. Для хроматографии в качестве сорбента использовали гидроксиаппатит, в качестве элюента - этанол 96%.
Далее методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в препаративном варианте анализировали хроматограмму выделенных каротиноидов. Результаты анализа показали, что каротиноиды Deinococcus radiodurans разделились в процессе хроматографии на две фракции - в первой выходит преимущественно деиноксантин, во второй - остальные каротиноиды и продукты распада деиноксантина. В первой фракции на пластине регистрируется одно основное пятно, соответствующее деиноксантину, и небольшое количество окрашенных минорных компонентов; во второй фракции - множество окрашенных пятен, содержащих другие каротиноиды, липиды и продукты их распада. Полученные данные приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Эффективность разделения каротиноидов D.radiodurans в различных растворителях и носителях. | ||||
| №/№ | Носитель | Растворитель | Эффективность разделения | Rf доминирующего компонента |
| 1 | силикагель с 2% крахмала | ПЭ-хлороформ-метанол 3:1:1 | 0,15 | 0,36 |
| 2 | силикагель с 2% крахмала | ПЭ-хлороформ-этанол 3:1:1 | 0,07 | 0,27 |
| 3 | силикагель с 2% крахмала | Этанол | 0 | 0,18 |
| 4 | гидроксиаппатит | Этанол | 0,14 | 0,13 |
| 1 - В препаративном варианте | ||||
Из таблицы 1 видно, что при носителе - гидроксиаппатите, эффективность разделения приблизительно такая же, как и в системе ПЭ-хлороформ-метанол 3:1:1. Однако в примере 4 для экстракции суспензии бактерий использовали малотоксичный эстрагент - ацетон-этанол (1:1), и далее для разделения выделенных каротиноидов - растворитель - этанол 96%. Выделенный таким способом деиноксантин не требует дополнительной очистки от токсичных веществ, что уменьшает потери его, а также удешевляет способ его получения.
После разделения каротиноидов колонку регенерировали следующим образом: промывка - 3-5 объемов деионизированной воды, регенерация - 5-7 объемов 500 mМ натрий-фосфатного буфера, снова 3-5 объемов деионизированной воды, затем колонка уравновешивалась 96% этанолом.
Хроматограмма каротиноидов на ТСХ-пластинах примера 4 после разделения на гидроксиаппатите (фиг.1) в основном совпадала с хроматограммой, полученной методом ВЭЖХ в экспериментах LeMee (фиг.2).
Однако предлагаемый способ позволяет более простым и дешевым способом выделить деиноксантин из Deinococcus radiodurans.
Связано это с тем, что в колоночной хроматографии на гидроксиаппатите используется дешевый малотоксичный растворитель (этанол), который позволяет применять выделенный препарат деиноксантина без дальнейшей очистки, что является экономически более эффективным.
Разделение каротиноидов проводят на препаративных колонках, размеры которых можно в значительной степени варьировать. Соответственно будет меняется и площадь сечения сорбента, и количество пропускаемого через колонку вещества, что позволит значительно увеличить количество выделяемого деиноксантина. Препаративные колонки после каждого использования регенерируются для дальнейшего их использования.
Разработанный способ выделения деиноксантина позволяет обеспечить, по сравнению с известными способами, экономически более эффективную наработку препаративных количеств деиноксантина без применения токсичных органических растворителей в достаточных количествах для проведения дальнейших фармакологических исследований и практического его применения.
Источники информации
1. Патент РФ №2235783, МПК 7 С12Р 23/00, С12N 1/14, С07С 403/24.
2. Lemee L, Peuchant E. and Clerc M. Deinoxanthin: A New Carotenoid Isolated from Deinococcus radiodurans // Tetrahedron. 1997. V.53. №3. P.919-9260.
3. Лысенко B.C. и др. Разделение и масс-спектрометрическая идентификация каротиноидов радиорезистентных бактерий Deinococcus radiodurans. - журнал Масс-спектрометрия, 2010, т.7. №4, с.278-273 (прототип).
Claims (1)
- Способ получения деиноксантина - каротиноида микроорганизма Deinococcus radiodurans, включающий экстракцию каротиноидов из бактериальной массы Deinococcus radiodurans, разделение каротиноидов на сорбенте и элюирование с выделением деиноксантина, отличающийся тем, что экстракцию каротиноидов проводят смесью ацетон-этанол (1:1), разделение каротиноидов проводят на препаративных колонках жидкостного хроматографа низкого давления, в котором в качестве сорбента используют гидроксиаппатит, а в качестве элюента - этанол.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011139309/10A RU2475541C1 (ru) | 2011-09-26 | 2011-09-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011139309/10A RU2475541C1 (ru) | 2011-09-26 | 2011-09-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2475541C1 true RU2475541C1 (ru) | 2013-02-20 |
Family
ID=49120979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011139309/10A RU2475541C1 (ru) | 2011-09-26 | 2011-09-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2475541C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITUB20160035A1 (it) * | 2016-01-22 | 2017-07-22 | Univ Degli Studi Cagliari | USO DELLA PROTEINA SlpA DA DEINOCOCCUS RADIODURANS COME SCHERMO PER LA RADIAZIONE ULTRAVIOLETTA |
| RU2648452C1 (ru) * | 2016-12-07 | 2018-03-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения индивидуальных каротиноидов |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU391174A1 (ru) * | 1971-12-21 | 1973-07-25 | Отдел микробиологии Белорусской ССР | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Sporoboiomyces pararoseus Т-ПРОДУЦЕНТ КАРОТИНОИДОВ |
| RU1028064C (ru) * | 1981-08-03 | 1994-12-15 | АО "Экотех" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАСЛЯНОГО ПРЕПАРАТА β -КАРОТИНА |
| RU2112808C1 (ru) * | 1995-10-24 | 1998-06-10 | Акционерное общество открытого типа "Уралбиофарм" | Способ получения кристаллического бета-каротина |
| RU2235783C2 (ru) * | 1997-05-02 | 2004-09-10 | ДСМ Ай Пи АССЕТС Б.В. | Выделение кристаллов каротиноида из микробной биомассы |
| RU2407786C1 (ru) * | 2009-05-25 | 2010-12-27 | Марина Александровна Сазыкина | Питательная среда для выращивания deinococcus radiodurans |
| RU2418061C2 (ru) * | 2009-04-13 | 2011-05-10 | Марина Александровна Сазыкина | ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Deinococcus radiodurans |
-
2011
- 2011-09-26 RU RU2011139309/10A patent/RU2475541C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU391174A1 (ru) * | 1971-12-21 | 1973-07-25 | Отдел микробиологии Белорусской ССР | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Sporoboiomyces pararoseus Т-ПРОДУЦЕНТ КАРОТИНОИДОВ |
| RU1028064C (ru) * | 1981-08-03 | 1994-12-15 | АО "Экотех" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАСЛЯНОГО ПРЕПАРАТА β -КАРОТИНА |
| RU2112808C1 (ru) * | 1995-10-24 | 1998-06-10 | Акционерное общество открытого типа "Уралбиофарм" | Способ получения кристаллического бета-каротина |
| RU2235783C2 (ru) * | 1997-05-02 | 2004-09-10 | ДСМ Ай Пи АССЕТС Б.В. | Выделение кристаллов каротиноида из микробной биомассы |
| RU2418061C2 (ru) * | 2009-04-13 | 2011-05-10 | Марина Александровна Сазыкина | ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Deinococcus radiodurans |
| RU2407786C1 (ru) * | 2009-05-25 | 2010-12-27 | Марина Александровна Сазыкина | Питательная среда для выращивания deinococcus radiodurans |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LEMEE L., CLERC M., et al. Deinoxanthin: A new carotenoid isolated from Deinococcus radiodurans, Tetrachedron., 1997, v.53, No.3, p.919-926. * |
| ЛЫСЕНКО B.C., ЗИМАКОВ Д.В., и др. Выделение и масс-спектрометрическая идентификация каратиноидов радиорезистентных бактерий суспензии Deinococcus radiodurans. Масс-спектрометрия, 2010, т.7, No.4, с.278-281. * |
| ЛЫСЕНКО B.C., ЗИМАКОВ Д.В., и др. Выделение и масс-спектрометрическая идентификация каратиноидов радиорезистентных бактерий суспензии Deinococcus radiodurans. Масс-спектрометрия, 2010, т.7, №4, с.278-281. LEMEE L., CLERC M., et al. Deinoxanthin: A new carotenoid isolated from Deinococcus radiodurans, Tetrachedron., 1997, v.53, №3, p.919-926. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITUB20160035A1 (it) * | 2016-01-22 | 2017-07-22 | Univ Degli Studi Cagliari | USO DELLA PROTEINA SlpA DA DEINOCOCCUS RADIODURANS COME SCHERMO PER LA RADIAZIONE ULTRAVIOLETTA |
| WO2017125886A1 (en) * | 2016-01-22 | 2017-07-27 | Università Degli Studi Di Cagliari | Use of slpa protein from deinococcus radiodurans as a screen against ultraviolet radiation |
| RU2648452C1 (ru) * | 2016-12-07 | 2018-03-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения индивидуальных каротиноидов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grung et al. | Algal carotenoids 51. Secondary carotenoids 2. Haematococcus pluvialis aplanospores as a source of (3 S, 3′ S)-astaxanthin esters | |
| Ragonese et al. | Characterisation of lipid fraction of marine macroalgae by means of chromatography techniques coupled to mass spectrometry | |
| Talontsi et al. | Zoosporicidal metabolites from an endophytic fungus Cryptosporiopsis sp. of Zanthoxylum leprieurii | |
| Soares et al. | Improvement of the extraction process for high commercial value pigments from Desmodesmus sp. microalgae | |
| Mulders et al. | Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO | |
| Deli et al. | Carotenoid composition of three bloom-forming algae species | |
| Manning et al. | Isolation of polyketides from Prymnesium parvum (Haptophyta) and their detection by liquid chromatography/mass spectrometry metabolic fingerprint analysis | |
| Móricz et al. | Layer chromatography-bioassays directed screening and identification of antibacterial compounds from Scotch thistle | |
| Donot et al. | Analysis of neutral lipids from microalgae by HPLC-ELSD and APCI-MS/MS | |
| Erdoğan et al. | Composition of carotenoids in Scenedesmus protuberans: Application of chromatographic and spectroscopic methods | |
| Glombitza et al. | Fucols and phlorethols from the brown alga Scytothamnus australis Hook. et Harv.(Chnoosporaceae) | |
| Cho et al. | The presence of 12β-deoxydecarbamoylsaxitoxin in the Japanese toxic dinoflagellate Alexandrium determined by simultaneous analysis for paralytic shellfish toxins using HILIC-LC–MS/MS | |
| RU2475541C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕИНОКСАНТИНА - КАРОТИНОИДА МИКРООРГАНИЗМА Deinococcus radiodurans | |
| López-Rodríguez et al. | An integrated approach for the efficient separation of specialty compounds from biomass of the marine microalgae Amphidinium carterae | |
| López-Angulo et al. | Bioactive components and antimutagenic and antioxidant activities of two Echeveria DC. species | |
| Gayathri et al. | Spectral characterization of β, ε-carotene-3, 3′-diol (lutein) from marine microalgae Chlorella salina | |
| RU2469732C1 (ru) | Способ получения каротиноидного комплекса из морских звезд | |
| Hani et al. | Anticancer compounds from Chaetomium globosum | |
| Zarnowski et al. | Alkylresorcinol homologs in Pisum sativum L. varieties | |
| Erden et al. | Chemical and biological activities of some Scorzonera species: An in vitro study | |
| RU2411939C1 (ru) | Способ получения 2,3,6,7-тетрагидроксинафтазарина | |
| Hadda et al. | Production and qualitative analysis of triterpenoids and steroids of Ganoderma species harvested from cork oak forest of North-Eastern Algeria | |
| Collins et al. | Sterols produced by Synura petersenii (Chrysophyta) | |
| Grabski et al. | Chlorophyll catabolites in conditioned media of green microalga Desmodesmus subspicatus | |
| Suzuki | Chemistry and detection of okadaic acid/dinophysistoxins, pectenotoxins and yessotoxins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140927 |