ES2333845T3 - Metodo y composicion para la inhibicion de la angiogenesis. - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista que se une específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados pero se une a la forma de triple hélice nativa de cada uno de dicho colágeno o colágenos con afinidad sustancialmente reducida, en el que dicho antagonista inhibe la angiogénesis, en el que dicho antagonista es un anticuerpo para la fabricación de una composición para la inhibición de la angiogénesis en un tejido inducida por inflamación, psoriasis, degeneración macular o reestenosis o durante el crecimiento de tumor o metástasis.

Description

Método y composición para la inhibición de la angiogénesis.

Campo de la invención

La invención se refiere de forma general al campo de la medicina y se refiere específicamente a métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis en un tejido o detectar la angiogénesis usando antagonistas de formas desnaturalizadas o proteolizadas de colágeno que incluyen, pero sin limitación, los tipos I, II, III, IV y V. El documento WO 94/14070 describe un método para determinar la degradación de cartílago en una muestra biológica usando un anticuerpo monoclonal. Este método se describe como uno que mide la cantidad de colágeno no enrollado presente en una muestra biológica mediante la unión de colágeno no enrollado con un anticuerpo monoclonal.

Antecedentes

El crecimiento de tumor y la metástasis afectan a un gran número de personas cada año. De hecho, se estima que el siguiente año se diagnosticarán bastante más de 600.000 nuevos casos de cáncer solamente en los Estados Unidos (Varner, J. A., Brooks, P. C y Cheresh, D. A. (1995) Cell Adh. Commun. 3, 367-374). En gran medida, numerosos estudios han sugerido que el crecimiento de todos los tumores sólidos requiere crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para la expansión continuada de los tumores más allá de un tamaño mínimo (Varner et al. 1995; Blood, C. H. y Zetter, B. R. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1032: 89-118; Weidner, N. et al. (1992) J. Natl. Cancer Inst. 84: 1875-1887; Weidner, N. et al. (1991). N. Engl. J. Med. 324: 1 -7; Brooks, P. C. et al. (1995) J. Clin. Invest. 96: 1815-1822; Brooks, P. C. et al. (1994) Cell 79: 1157-1164; Brooks, P. C. et al. (1996). Cell 85, 683-693; Brooks, P. C. et al. (1998) Cell 92: 391-400. De forma significativa, una amplia diversidad de otras enfermedades humanas también están caracterizadas por desarrollo no regulado de vasos sanguíneos, incluyendo enfermedades oculares tales como degeneración macular y retinopatía diabética. Además, numerosas enfermedades inflamatorias también están asociadas con neovascularización incontrolada tal como artritis y psoriasis (Varner et al. 1995). La angiogénesis es el proceso fisiológico por el que se desarrollan nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes (Varner et al. 1995; Blood y Zetter 1990; Weidner et al. 1992). Este proceso complejo requiere la cooperación de una diversidad de moléculas que incluyen factores de crecimiento, receptores de adhesión celular, enzimas degradadoras de la matriz y componentes de la matriz extracelular (Varner et al. 1995; Blood y Zetter 1990; Weidner et al. 1992). Por tanto, las terapias diseñadas para bloquear la angiogénesis pueden afectar significativamente al crecimiento de tumores sólidos. De hecho, se han proporcionado pruebas claras de que el bloqueo de la neovascularización del tumor puede inhibir significativamente el crecimiento del tumor en diversos modelos animales y los datos clínicos humanos están comenzando a respaldar asimismo este argumento (Varner, J. A., Brooks, P. C. y Cheresh, D. A. (1995) Cell Adh. Commun. 3, 367-374). En gran medida, numerosos estudios han sugerido que el crecimiento de todos los tumores sólidos requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para la expansión continuada de los tumores más allá de un tamaño mínimo (Varner et al. 1995; Blood y Zetter 1990; Weidner et al. 1992; Weidner et al. 1991; Brooks et al. 1995; Brooks et al. 1994; Brooks et al. 1997).

Con este fin, muchos investigadores han centrado sus estrategias anti-angiogénicas hacia factores de crecimiento y citocinas que inician la angiogénesis (Varner et al. 1995; Blood y Zetter 1990; Weidner et al. 1992; Weidner et al. 1991; Brooks et al. 1995; Brooks et al. 1994; Brooks et al. 1997). Sin embargo, existe un gran número de distintos factores de crecimiento y citocinas que tienen la capacidad de estimular la angiogénesis. El beneficio terapéutico de bloquear una única citocina puede tener un beneficio solamente limitado debido a su redundancia. Sin embargo, se ha dirigido poca atención hacia otras dianas anti-angiogénicas. Estudios recientes han sugerido que la angiogénesis requiere remodelado proteolítico de la matriz extracelular (ECM) que rodea los vasos sanguíneas para proporcionar un microentorno que conduzca al desarrollo de nuevos vasos sanguíneos (Varner et al. 1995; Blood y Zetter 1990; Weidner et al. 1992; Weidner et al. 1991; Brooks et al. 1995; Brooks et al. 1994; Brooks et al. 1997). El colágeno de proteína de matriz extracelular representa más del 25% de la masa proteica total en los animales y la mayoría de la proteína dentro de la ECM. El colágeno es una proteína de triple hélice multicadena fibrosa que existe en numerosas formas (Olsen, B. R. (1995) Curr. Opin. Cell Biol. 7, 720-727; Van der Rest, M. y Garrone, R. (1991) FASEB 5, 2814-2823). Se han identificado al menos 18 tipos genéticamente distintos de colágeno, muchos de los cuales tienen distintas distribuciones tisulares y funciones (Olsen 1995; Van der Rest y Garrone 1991). El colágeno de tipo I es el tipo de colágeno más abundante en la matriz extracelular. Se ha demostrado que el colágeno de tipo I, tipo III, el colágeno de tipo IV y el colágeno de tipo V están asociados con todos los vasos sanguíneos pre-existentes in vivo. Los colágenos de tipo I y tipo IV están compuestos por cadenas principales denominadas \alpha1(I) y \alpha2(I) y \alpha1(IV) y \alpha2(IV) respectivamente. La molécula de colágeno maduro está compuesta por dos cadenas \alpha1 y una cadena \alpha2 enrolladas en una triple hélice. In vivo, el colágeno se encuentra normalmente en la forma de triple hélice madura. La desnaturalización de la estructura tridimensional nativa del colágeno de triple hélice maduro puede exponer regiones reguladoras crípticas que controlan la angiogénesis. El antagonismo de estas regiones reguladoras crípticas podría proporcionar un medio no reconocido para el diagnóstico y la inhibición de la angiogenésis.

Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis sería una terapia útil para restringir el crecimiento del tumor. La inhibición de la angiogénesis se ha propuesto por (1) inhibición de liberación de "moléculas angiogénicas" tales como \betaFGF (factor de crecimiento de fibroblastos), (2) neutralización de moléculas angiogénicas, tal como por el uso de anticuerpos anti-\betaFGF y (3) inhibición de la respuesta de células endoteliales a estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha obtenido atención y Folkman et al., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992), han descrito varios inhibidores de respuesta de células endoteliales, que incluyen inhibidores de colagenasa, inhibidores de renovación de membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de la angiogénesis obtenidos de hongos, factor plaquetario 4, trombospondina, fármacos para la artritis, tales como D-penicilamina y tiomalato de oro, análogos de vitamina D_{3}, interferón alfa y similares que se podrían usar para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores propuestos adicionales de la angiogénesis, véase Blood y Zetter 1990; Moses et al. (1990) Science 248: 1408-1410; Ingber et al. (1988) Lab. Invest., 59: 44-51; y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744 y 5.202.352. Ninguno de los inhibidores de la angiogénesis que se han descrito en las anteriores referencias se dirige a colágenos desnaturalizados o proteolizados.

Sumario

La presente invención proporciona el uso de antagonistas de anticuerpos de colágenos desnaturalizados o proteolizados para la fabricación de una composición que pueda inhibir la angiogénesis. Los antagonistas se unen específicamente a un colágeno desnaturalizado o proteolizado, pero se unen con afinidad sustancialmente reducida a formas nativas del mismo colágeno. Los antagonistas pueden ser específicos para cualquier colágeno desnaturalizado, incluyendo colágeno de tipo I desnaturalizado, colágeno de tipo II desnaturalizado, colágeno de tipo III desnaturalizado, colágeno de tipo IV desnaturalizado o colágeno de tipo V desnaturalizado o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en una realización, un antagonista es específico para colágeno de tipo I desnaturalizado con respecto al colágeno de tipo I de triple hélice nativo pero se une con afinidad sustancialmente reducida a otros colágenos desnaturalizados, tales como colágenos de tipo IV. En otra realización, un antagonista es específico para colágeno de tipo IV desnaturalizado. Un antagonista también puede ser específico para los colágenos de tipo I, II, III, IV y V
desnaturalizados.

Un antagonista de la invención es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que inmunorreacciona con colágeno desnaturalizado pero que inmunorreacciona en un alcance sustancialmente menor con la forma nativa del colágeno. Los anticuerpos pueden ser monoclonales. Un antagonista también podría ser un polipéptido o un péptido con especificidad por un colágeno desnaturalizado, pero no por una forma nativa del colágeno. Los antagonistas también podrían ser compuestos no peptídicos tales como una molécula orgánica pequeña o un oligonucleótido.

El tejido a tratar puede ser cualquier tejido en el que sea deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como tejido enfermo en el que tiene lugar la neo-vascularización: los tejidos ejemplares incluyen tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos que experimentan reestenosis y similares.

La invención también proporciona métodos para detectar la angiogénesis en un tejido poniendo en contacto un antagonista de la invención con el tejido. Tales métodos son apropiados para uso tanto ex vivo como in vivo.

También se proporciona un uso para detectar tejido tumoral, metástasis e invasión tumoral en un tejido poniendo en contacto un antagonista de la invención con un tejido ex vivo o in vivo.

La invención también proporciona métodos para seleccionar antagonistas que se unen específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados, pero que se unen con afinidad sustancialmente reducida a la forma nativa del colágeno o los colágenos y pueden inhibir la angiogénesis.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la reactividad del Mab HUI77 con componentes de la matriz extracelular en ELISA de fase sólida. Se recubrieron placas de microtitulación (96 pocillos) con componentes de la matriz extracelular que incluían colágeno de tipo I y tipo IV nativo, colágeno de tipo I y de tipo IV desnaturalizado, vitronectina, fibronectina y fibrinógeno, cada uno a una concentración de 10 microgramos (\mug) por mililitro (ml). Los pocillos de la placa de microtitulación se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. El Mab HUI77 se añadió a los pocillos a una concentración de 1 \mug/ml y se dejó incubar durante 2 horas a 37ºC. Después de la incubación, la inmunorreactividad se detectó por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa. La inmunorreactividad se midió con un lector de placa de ELISA a 490 nm usando c-fenilenodiamina como un sustrato. Col-I (colágeno de tipo I de triple hélice nativo). Col-I desnaturalizado (Colágeno de tipo I Desnaturalizado). Col-IV (colágeno de tipo IV de triple hélice nativo). Col-IV desnaturalizado (colágeno desnaturalizado, tipos. VN (Vitronectina). FN (Fibronectina). FB (fibrinógeno). Las barras de datos representan la Densidad Óptica (D.O.) media \pm desviaciones típicas de pocillos por triplicado.

La Figura 2 demuestra la reactividad del Mab HUI77 con formas genéticamente distintas de colágeno. Se recubrieron placas de microtitulación con formas distintas de colágeno a una concentración de 10 \mug/ml. Los pocillos de las placas de microtitulación se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. La inmunorreactividad se detectó por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa. La inmunorreactividad se midió determinando la densidad óptica con un lector de placa de ELISA a 490 nm. Col-I, Colágeno I de triple hélice. Col-I Den; Colágeno I desnaturalizado. Col-II; Colágeno II de triple hélice. Col-II Den; Colágeno II desnaturalizado. Col-III; Colágeno III de triple hélice. Col-III Den; Colágeno III desnaturalizado. Col-IV; Colágeno IV de triple hélice. Col-IV Den; Colágeno IV desnaturalizado. Col-V; Colágeno V de triple hélice. Col-V Den; Colágeno V desnaturalizado. Las barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado.

La Figura 3 muestra que el Mab HUI77 identifica el colágeno desnaturalizado que rodea los tumores de melanoma humano in vivo. La generación y localización de colágeno desnaturalizado in vivo se estudió por inmunofluorescencia indirecta en secciones tisulares congeladas de melanomas humanos tanto del modelo quimérico humano-ratón como de biopsias de tumor humano. Se fijaron secciones tisulares congeladas de melanomas humanos en acetona, se bloquearon con BSA al 1% y se co-tiñeron con Mab HUI77 y anticuerpo policlonal dirigido contra integrina \alpha_{\nu} expresada en células de melanoma humano. La unión de anticuerpo se detectó por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con FITC y de cabra anti-conejo conjugado con rodamina. Los paneles izquierdos indican la biopsia de tumor de melanoma humano (630X). Los paneles derechos indican la línea celular de melanoma humano M21 desarrollado en piel humana de espesor completo (200X). Rojo indica la expresión de integrina \alpha_{\nu} y verde indica expresión de colágeno desnaturalizado. Amarillo indica la co-localización de integrinas \alpha_{\nu} y colágeno desnaturalizado.

La Figura 4 muestra que el Mab HUI77 identifica el colágeno desnaturalizado que rodea los vasos sanguíneos asociados a tumor de melanoma humano. La generación y localización de colágeno desnaturalizado in vivo se estudió por inmunofluorescencia indirecta en secciones tisulares congeladas de biopsias de tumor de melanoma humano. Las secciones tisulares congeladas de melanomas humanos se fijaron en acetona, se bloquearon con BSA al 1% y se co-tiñeron con Mab HUI77 y anticuerpo policlonal dirigido contra el factor VIH, un marcador conocido de vasos sanguíneos. La unión del anticuerpo se detectó por incubación con anticuerpos secundarios de cabra anti-ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y de cabra anti-conejo conjugado con rodamina. El panel izquierdo muestra la tinción de biopsia de tumor de melanoma humano para factor VIII (Rojo) que perfila un vaso sanguíneo de tumor. El panel derecho muestra el colágeno desnaturalizado (Verde) que rodea el vaso sanguíneo asociado a tumor humano.

La Figura 5 demuestra los efectos del Mab HUI77 sobre la adhesión de células endoteliales humanas. Las placas de microtitulación (96 pocillos) se recubrieron con colágeno de tipo I o de tipo IV nativo o desnaturalizado a una concentración de 10 \mug/ml. Los pocillos de la placa de microtitulación se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Después, se dejó que células endoteliales humanas (HUVEC) se unieran a los pocillos recubiertos en presencia o ausencia del Mab HUI77 purificado (50 \mug/ml) o un anticuerpo de control correspondiente a isotipo a una concentración de 50 \mug/ml durante 30 minutos. Las células no unidas se eliminaron por lavado y las células unidas se tiñeron con violeta cristal. La adhesión celular se cuantificó midiendo la densidad óptica (D.O.) del colorante eluído a 600 nm. Las Barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado. Los datos se representan como porcentaje de control.

La Figura 6 demuestra los efectos del Mab HUI77 sobre la migración de células endoteliales humanas. Se recubrieron membranas de cámaras de migración transwell con colágeno de tipo I o de tipo IV desnaturalizado a una concentración de 25 \mug/ml. Se dejó que células endoteliales humanas (HUVEC) migraran en presencia o ausencia del Mab HUI77 purificado o un anticuerpo de control correspondiente a isotipo (100 \mug/ml) durante un total de 6 horas. Las células que permanecían sobre el lado superior de la membrana se eliminaron y las células que habían migrado al lado inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal. La migración celular se cuantificó midiendo la densidad óptica (D.O.) del colorante eluído a 600 nm con un lector de microplaca. Las Barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado. Los datos se expresan como porcentaje de control.

La Figura 7 demuestra los efectos de la administración sistémica de Mab HUI77 purificado sobre la angiogénesis in vivo. Se pusieron discos de filtro saturados con \betaFGF sobre las membranas Corioalantoideas (CAM) de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa con 20 \mug de Mab HUI77 o un control. Al final de un periodo de incubación de 3 días, los discos de filtro y los tejidos de CAM circundantes se retiraron y la angiogénesis se cuantificó contando el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos dentro del área del disco de filtro. Se muestran los ejemplos de tejido de CAM de un experimento típico.

La Figura 8 muestra la cuantificación de los experimentos de la angiogénesis con el Mab HUI77. Las barras de datos representan la media \pm errores típicos de 5 a 10 embriones por condición. El índice de angiogénesis es igual al número de puntos de ramificación de embriones tratados experimentalmente menos el número de puntos de ramificación de CAM en ausencia de \betaFGF.

La Figura 9 muestra los efectos de la administración sistémica del Mab HUI77 purificado sobre el crecimiento del tumor in vivo. A). se inocularon células de tumor de melanoma CS-1 (5 x 10^{6}) en las CAM de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa con 100 \mug de Mab HUI77 purificado o un control. Los embriones se dejaron incubar durante un total de 7 días. Al final del periodo de incubación de 7 días, los tumores resultantes se extirparon y se determinaron los pesos en húmedo. Las fotografías muestran tumores representativos tomados de embriones tratados con o sin Mab HUI77.

La Figura 10 muestra la cuantificación del peso en húmedo de los tumores. Las barras de datos representan la media \pm los errores típicos de los pesos de los tumores de 5 a 12 embriones por condición.

La Figura 11 demuestra la reactividad del Mab HUIV26 con componentes de la matriz extracelular en ELISA de fase sólida. Las placas de microtitulación se recubrieron con componentes de la matriz extracelular, cada uno a una concentración de 25 \mug/ml. A). El Mab HUIV26 se añadió a una concentración de 1 \mug/ml, seguido 1 hora después de IgG de cabra anti-ratón marcada con peroxidasa. Se prepararon colágeno de tipo 1 y colágeno de tipo IV desnaturalizado por ebullición durante 15 minutos antes de recubrir las placas. Todos los datos se corrigieron para cualquier unión no específica de anticuerpo secundario. Las barras de datos representan la densidad óptica (D.O.) media \pm desviaciones típicas de pocillos por triplicado. B). Las placas de microtitulación se recubrieron con colágeno de tipo IV de triple hélice a 25 \mug/ml. Se añadió medio acondicionado para HUVEC concentrado (20x) a los pocillos en presencia o ausencia de EDTA, Aprotinina o ambos y se dejó incubar durante 1, 6 y 24 horas. A continuación, las placas se lavaron, se bloquearon y se incubaron con Mab HUIV26 o anticuerpo de control. Todos los datos se corrigieron para unión de anticuerpo secundario no específica. Las barras de datos representan la densidad óptica (D.O.) media \pm desviaciones típicas de pocillos por triplicado. Se usan las siguientes abreviaturas en la figura, Col-I, colágeno de tipo I; Col-IV, colágeno de tipo IV.

La Figura 12 demuestra que el Mab HUIV26 identifica colágeno IV desnaturalizado que Rodea Vasos Sanguíneos Angiogénicos Dentro de la Membrana Corioalantoidea de Pollo (CAM). La generación y localización de colágeno IV desnaturalizado in vivo se estudió por inmunofluorescencia indirecta en secciones tisulares congeladas de tejido de CAM de angiogénesis tanto inducida por bFGF como inducida por tumor. Las secciones tisulares de CAM congeladas se fijaron en acetona, se bloquearon con BSA al 1% y se co-tiñeron con Mab HUIV26 y anticuerpos policlonales dirigidos contra la enzima degradadora de colágeno IV MMP-2 o Factor VIII. La unión de anticuerpo se detectó por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con FITC y de cabra anti-conejo conjugado con rodamina. Los paneles superiores muestran la co-localización de colágeno-IV desnaturalizado y MMP-2 que rodea vasos sanguíneos angiogénicos. Los paneles inferiores muestran la co-localización de colágeno-IV desnaturalizado y factor VIII que rodea vasos sanguíneos angiogénicos. Los paneles izquierdos indican tejido de CAM estimulado con bFGF. Los paneles derechos indican tejido de CAM con tumores de melanoma CS1 creciendo en el mismo. El color rojo en los paneles superiores indica la expresión de MMP-2 y en los paneles inferiores indica la expresión de factor VIII. El color verde en los paneles tanto superior como inferior indica la expresión de colágeno-IV desnaturalizado. Amarillo indica la co-localización.

La Figura 13 muestra que el Mab HUIV26 identifica colágeno de tipo IV desnaturalizado que rodea vasos sanguíneos asociados a tumor de melanoma humano. La generación y localización de colágeno IV desnaturalizado in vivo se estudió por inmunofluorescencia indirecta en secciones tisulares congeladas de biopsias de tumor de melanomas humanos. Las secciones tisulares congeladas de melanomas humanos se fijaron en acetona, se bloquearon con BSA al 1% y se co-tiñeron con Mab HUIV26 y anticuerpo policlonal dirigido contra el factor VIII, un marcador conocido de vasos sanguíneos. La unión de anticuerpo se detectó por incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con FITC y de cabra anti-conejo conjugado con rodamina. Rojo indica la expresión de factor VIII y marca los vasos sanguíneos humanos. Verde indica colágeno IV desnaturalizado asociado específicamente con los vasos sanguíneos angiogénicos asociados con tumor.

La Figura 14 demuestra los efectos de Mab HUIV26 sobre la adhesión de célula endotelial humana. Las placas de microtitulación (96 pocillos) se recubrieron con colágeno de tipo IV nativo o desnaturalizado. Los pocillos de la placa de microtitulación a continuación se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37ºC. Después, se dejó que las células endoteliales humanas se unieron a los pocillos recubiertos en presencia o ausencia del Mab HUIV26 purificado o un anticuerpo de control correspondiente a isotipo a una concentración de 100 \mug/ml durante 30 minutos. Las células no unidas se eliminaron por lavado y las células unidas se tiñeron con violeta cristal. A continuación, las células se incubaron con ácido acético al 10% y la adhesión celular se cuantificó midiendo la densidad óptica (D.O.) de colorante eluído a 600 nm. Las Barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado.

La Figura 15 muestra los efectos del Mab HUIV26 sobre la migración de células endoteliales humanas. Las membranas de cámaras de migración transwell se recubrieron con colágeno de tipo IV nativo o desnaturalizado. Después, se dejó que las células endoteliales humanas migraran hasta el lado inferior de las membranas recubiertas en presencia o ausencia de Mab HUIV26 purificado o un anticuerpo de control correspondiente a isotipo (100 \mug/ml) durante un total de 6 horas. Las células que permanecían sobre el lado superior de la membrana se retiraron y las células que habían migrado al lado inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal. A continuación, las membranas se incubaron con ácido acético al 10% y la migración celular se cuantificó midiendo la densidad óptica (D.O.) de colorante eluído a 600 nm. Las Barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado.

La Figura 16 demuestra los efectos de la administración sistemática del Mab HUIV26 purificado sobre la angiogénesis in vivo. Se pusieron discos de filtro saturados con bFGF sobre las Membranas Corioalantoideas (CAM) de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa con 20 \mug de Mab HUIV26 o un control. Al final de un periodo de incubación de 3 días, se retiraron los discos de filtro y los tejidos de CAM circundantes y la angiogénesis se cuantificó contando el número de puntos de ramificación de vaso sanguíneo en el área del disco de filtro. La Figura 6 muestra ejemplos de tejido de CAM de un experimento típico.

La Figura 17 muestra la cuantificación de los experimentos de angiogénesis con el Mab HUIV26. Las Barras de datos representan la D.O. media \pm errores típicos de 5 a 10 embriones por condición. El índice de angiogénesis es igual al número de puntos de ramificación de embriones tratados experimentalmente menos el número de puntos de ramificación de CAM en ausencia de bFGF.

La Figura 18 muestra los efectos de la administración sistemática de Mab HUIV26 purificado sobre el crecimiento de tumor in vivo. Se inocularon células de tumor de melanoma CS-1 (5 x 10^{6}) en las CAM de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa de 20 \mug de Mab HUIV26 purificado o control. Los embriones se dejaron incubar durante un total de 7 días. Las fotografías representan ejemplos de tumores de embriones tratados con control o HUIV26 dentro del tejido de CAM.

La Figura 19 muestra la comparación del tamaño de tumores extirpados. Al final del periodo de incubación de 7 días, los tumores resultantes se extirparon y analizaron para tamaño global y peso en húmedo. La fotografía representa una comparación del tamaño de los tumores extirpados de embriones tratados con control o Mab HUIV26.

La Figura 20 muestra la cuantificación del peso en húmedo de los tumores. Las barras de datos representan la media \pm los errores típicos del peso del tumor de 5 a 10 embriones por condición.

La Figura 21 muestra los efectos del Mab HUIV26 sobre el crecimiento del tumor evaluado en un sistema de modelo de tumor de ratón SCID. A ratones SCID se inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{6} células de melanoma humano M21. Tres días después se inició un tratamiento de 24 días con inyecciones diarias intraperitoneales de 100 \mug de Mab HUIV26, un anticuerpo de control correspondiente a isotipo o sin tratamiento. El volumen del tumor se controló por mediciones de calibrador y se determinó el volumen de tumor. Se incluyeron cinco ratones en cada grupo. Los datos representan la media \pm los errores típicos de los volúmenes de tumor para cada condición experimental. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes en los que se incluyeron cinco o diez ratones en cada condición experimental.

La Figura 22 muestra un análisis de la reactividad de Mab HUIV26 con péptidos de colágeno que contienen RGD. Se recubrieron placas de microtitulación con 50 \mul de péptidos de colágeno que contienen RGD (100 \mug/ml) (A) o colágeno de tipo IV humano desnaturalizado (B). Las placas se bloquearon con BSA al 1% en PBS para evitar la unión no específica. Se dejó que el Mab HUIV26 (1,0 \mug/ml, 50 \mul/pocillo) se uniera a la placa recubierta durante 1 hora a 37ºC. La unión del Mab HUIV26 se detectó por incubación con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa. La inmunorreactividad se cuantificó midiendo la densidad óptica (D.O.) con un lector de placa de microtitulación. A). Inmunorreactividad de Mab HUIV26 purificado frente a péptidos de colágeno que contienen RGD. B. Inmunorreactividad de HUIV26 que se une a colágeno de tipo IV desnaturalizado inmovilizado en presencia o ausencia de péptidos de colágeno que contienen RGD solubles o colágeno de tipo IV desnaturalizado. Las barras de datos representan la D.O. media \pm desviación típica de pocillos por triplicado.

La Figura 23 muestra la formación de cordón endotelial humano sobre el Colágeno de tipo I desnaturalizado. Se recubrieron membranas flexibles Millipore con colágeno de tipo I humano nativo o desnaturalizado. Se dejó que células endoteliales humanas (HUVEC) interaccionaran con el colágeno durante 5 horas en ausencia de factores de crecimiento añadidos o suero.

La Figura 24 muestra el análisis de la supervivencia de células endoteliales sobre el colágeno de tipo I. Los pocillos de microtitulación se recubrieron con colágeno de tipo 1 humano nativo o proteolizado/desnaturalizado. A continuación, se dejó que las HUVEC se unieran a los pocillos en ausencia de factores de crecimiento añadidos o suero durante 5 horas. Al final de la incubación de 5 horas, las células unidas se eliminaron, fijaron y tiñeron para apoptosis con el kit ApopTag y se analizaron por citometría de flujo. Los datos indicaron la media \pm desviaciones típicas del porcentaje de células endoteliales humanas que estaban comenzando a experimentar apoptosis. Los datos se obtuvieron de pocillos por triplicado.

La Figura 25 muestra los efectos de dominios de colágeno de tipo I crípticos sobre la formación de cordón endotelial. El análisis de la secuencia de aminoácidos de colágeno I humano y la estructura tridimensional pusieron de manifiesto dominios crípticos potenciales que serían inaccesibles dentro del colágeno I de triple hélice maduro. Se generaron péptidos sintéticos correspondientes a 5 de estos dominios crípticos potenciales de colágeno I humano. Estos dominios crípticos se inmovilizaron en pocillos de microtitulación y se realizaron ensayos de formación de cordón endotelial como se ha descrito anteriormente. Como se muestra, los 5 péptidos de colágeno soportaron adhesión de células endoteliales durante 1 hora después del sembrado. Sin embargo, se mostró que el péptido de colágeno humano 2 facilita la formación de cordón endotelial y potencia la supervivencia de células endoteliales después de 18 horas, mientras que los demás péptidos mostraron poca, si es que mostraron alguna, actividad en el punto de tiempo de 18 horas.

La Figura 26 muestra que los dominios crípticos de colágeno de tipo I soportan adhesión de células endoteliales por distintos receptores de integrina. Los péptidos que representan dominios crípticos de colágeno humano I se inmovilizaron sobre pocillos de microtitulación. Se dejó que células endoteliales se unieran a los péptidos en presencia o ausencia de anticuerpos de bloqueo de función dirigidos contra integrinas específicas. Todos los péptidos soportaron la adhesión celular a niveles variables. La adhesión celular a los 5 péptidos era dependiente de la ligación de la integrina \alpha\nu\beta3 ya que el Mab LM609 dirigido contra \alpha\nu\beta3 bloqueó la adhesión celular. Sorprendentemente, la adhesión celular al péptido 2 también era dependiente de una integrina \beta1, ya que la adhesión celular a este péptido también estaba bloqueada por P4C10 dirigido contra integrinas \beta1.

La Figura 27 demuestra la generación de Mab reactivos con dominios crípticos de colágeno de tipo I. Los dominios crípticos de colágeno de tipo I se usaron para generar Mab. Uno de estos Mab denominado XL313 se usó para un estudio adicional. Se inmovilizaron péptidos de colágeno I humanos sobre pocillos de microtitulación y se evaluó la unión de Mab XL313 purificado. Como se muestra a continuación, el Mab XL313 reconoció específicamente el péptido de colágeno humano 2. Además, el Mab XL313 también reconoció el péptido de colágeno 4, sin embargo, el péptido de colágeno 4 no está presente en el colágeno I maduro. XL313 no reaccionó con otros péptidos de colágeno de tipo I similares.

La Figura 28 muestra que el Mab XL313 reconoce específicamente el colágeno de tipo I humano desnaturalizado. Se recubrieron placas de microtitulación con colágeno de tipo I o de tipo IV humano nativo o desnaturalizado. La capacidad de Mab XL313 de unirse a colágeno de tipo I humano nativo o desnaturalizado y colágeno de tipo IV desnaturalizado se ensayó por ELISA de fase sólida. El Mab XL313 reconoció específicamente el colágeno de tipo I humano desnaturalizado pero no el colágeno de tipo I nativo. Además, el Mab XL313 no consiguió unirse al colágeno de tipo IV humano nativo o desnaturalizado.

La Figura 29 muestra que el Mab XL313 inhibe la angiogénesis en el pollo. La angiogénesis estaba inducida en la CAM de embriones de pollo de 10 días de edad con bFGF. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección IV con 50 \mug del Mab XL313 o un control correspondiente a isotipo. Tres días después, la angiogénesis se cuantificó contando el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos dentro del área del disco de filtro. A; ejemplos representativos de tejido de CAM de un experimento típico.

La Figura 30 muestra la cuantificación de los experimentos de angiogénesis de la Figura 29. Las barras de datos representan la media \pm errores típicos de 5 a 10 embriones por condición.

La Figura 31 muestra los efectos de la administración sistémica de Mab XL313 sobre el crecimiento de tumor de fibrosarcoma humano. Se inocularon células de fibrosarcoma humano HT1080 (5 x 10^{6}) en las CAM de embriones de pollo de 10 días de edad. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una única inyección intravenosa de Mab XL313 purificado a concentraciones de 50 \mug por embrión. Después de siete días, los tumores se extirparon y se determinaron los pesos en húmedo. Cuantificación de peso de tumores. Las barras de datos representan la media \pm errores típicos de 5 a 10 embriones por condición.

La Figura 32 muestra que la mutación en el sitio de escisión de MMP del colágeno I inhibe el crecimiento de tumor de melanoma in vivo. Se usaron ratones transgénicos que alojan una mutación en el sitio de escisión de MMP dentro del colágeno I para determinar si la proteolisis de colágeno de tipo I puede desempeñar un papel en el crecimiento del tumor y la angiogénesis. Los ratones transgénicos Col al tienen una mutación que inhibe la unión de MMP y la escisión del colágeno de tipo I. A ratones transgénicos B6 Col al o ratones B6 de control de tipo silvestre se inyectaron por vía subcutánea células de tumor de melanoma transgénicas B 16. Los tumores se dejaron desarrollar durante 11 días y se controló el tamaño del tumor con calibradores. Como se muestra a continuación, las células de melanoma B16 formaron grandes tumores proliferativos en ratones que pueden proteolizar fácilmente el colágeno de tipo I. Por el contrario, las células de melanoma B16 mostraron poca o ninguna capacidad de formar tumores en los ratones transgénicos B6 Col al en los que se inhibe la proteolisis de colágeno de tipo I. Los datos representan la media \pm errores típicos de los volúmenes de tumor de 5 ratones por condición.

La Figura 33 muestra que el Mab XL313 inhibe el crecimiento del tumor en ratones B6. El crecimiento de tumores de carcinoma de pulmón de Lewis se examinó en ratones B6 de tipo silvestre o en ratones transgénicos Col al. A; Se inyectaron células de carcinoma de pulmón de Lewis por vía subcutánea en ratones B6 de tipo silvestre o ratones transgénicos B6 Col al. B; Comparación de crecimiento de tumor de carcinoma de pulmón de Lewis en ratones B6 de tipo silvestre o transgénicos B6 Col al. C; A ratones de control B6 de tipo silvestre se inyectaron células de carcinoma de pulmón de Lewis. Veinticuatro horas después, los ratones se trataron por vía sistémica con Mab XL313 o un anticuerpo de control correspondiente a isotipo (100 \mug/por inyección). Se dejó que los tumores se desarrollaran durante 11 días y los tamaños del tumor se controlaron con calibradores. Los datos representan la media \pm errores típicos de los volúmenes de tumor de 5 ratones por condición.

Descripción de la invención Colágenos

La composición de la invención es adecuada para el uso con varias moléculas de colágeno, incluyendo las de cualquier animal. En una realización, los colágenos son colágenos Humanos. Los colágenos también pueden ser de cualquier mamífero tal como rata, ratón, cerdo, conejo, etc. o de un ave tal como un pollo. Generalmente, un colágeno es una proteína de matriz extracelular que contiene una secuencia [Gly-Xaa-Xaa]_{n}. Los tipos de colágeno se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Olsen, B. R. (1995) Curr. Op. Cell. Biol. 5: 720-727; Kucharz, E. J. The Collagens: Biochemistry and Pathophysiology, Springer-Verlag, Berlín, 1992; Kunn, K. en Structure and Function of Collagen Types, eds. R. Mayne y R. E. Burgeson, Academic Press, Orlando). Los colágenos humanos son los colágenos preferidos. El colágeno desnaturalizado se refiere a colágeno que se ha tratado de tal forma que ya no sigue adoptando predominantemente la forma de triple hélice nativa. La desnaturalización se puede conseguir calentando el colágeno. En una realización, el colágeno se desnaturaliza calentando durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 100ºC. La desnaturalización también se puede conseguir tratando el colágeno con un agente caotrópico. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen, por ejemplo, sales de guanidinio. La desnaturalización de un colágeno se puede controlar, por ejemplo, mediante cambios espectroscópicos en las propiedades ópticas tales como absorbancia, dicroísmo circular o fluorescencia de la proteína, por resonancia magnética nuclear, por espectroscopia Raman o mediante cualquier otra técnica adecuada. El colágeno desnaturalizado se refiere a colágenos de longitud completa desnaturalizados así como a fragmentos de colágeno. Un fragmento de colágeno puede ser cualquier secuencia de colágeno más corta que una secuencia de colágeno nativo. Para fragmentos de colágeno con estructura sustancialmente nativa, la desnaturalización se puede realizar como para un colágeno de longitud completa nativo. Los fragmentos también pueden tener un tamaño de tal forma que no posean una estructura nativa significativa o posean regiones sin estructura nativa significativa de la forma de triple hélice nativa. Tales fragmentos se desnaturalizan completamente o en parte sin requerir el uso de calor o de un agente caotrópico. La expresión colágeno desnaturalizado incluye colágeno proteolizado. El colágeno proteolizado se refiere a un colágeno que se ha fragmentado mediante la acción de una enzima proteolítica. En particular, el colágeno proteolizado se puede preparar tratando el colágeno con una metaloproteinasa, tal como MMP-1, MMP-2 o MMP-9, o tratando el colágeno con un extracto celular que contiene actividad de degradación de colágeno o es el que ocurre de forma natural en los sitios de neovascularización en un tejido.

Un epítopo críptico dentro de un colágeno es una secuencia que no está expuesta a reconocimiento dentro de un colágeno nativo, pero es capaz de ser reconocido por un antagonista de un colágeno desnaturalizado. La secuencia de epítopos crípticos se puede identificar determinando la especificidad de un antagonista. Los epítopos crípticos candidatos también se pueden identificar, por ejemplo, examinando la estructura tridimensional de un colágeno de triple hélice nativo. Las secuencias peptídicas que no se exponen a disolvente o que se exponen solamente parcialmente a disolvente en la estructura nativa son potenciales epítopos crípticos.

Un epítopo es la secuencia o las secuencias de aminoácidos que son reconocidas por un antagonista de la invención. Un epítopo puede ser una secuencia peptídica lineal o puede estar compuesto por secuencias de aminoácidos no contiguas. Un antagonista puede reconocer una o más secuencias, por lo tanto, un epítopo puede definir más de una diana de secuencia de aminoácidos distinta. Los epítopos reconocidos por un antagonista se pueden determinar por mapeo de péptidos y técnicas de análisis de secuencia bien conocidas por el especialista en la técnica.

Antagonistas

Los antagonistas de la invención se unen a un colágeno desnaturalizado pero se unen con afinidad sustancialmente reducida a la forma nativa del colágeno. Una "afinidad sustancialmente reducida" es una afinidad aproximadamente 3 veces menor que la afinidad por el colágeno desnaturalizado, más preferiblemente aproximadamente 5 veces menor e incluso más preferiblemente aproximadamente 10 veces menor y aún más preferiblemente más de 10 veces menor. Asimismo, "sustancialmente menos" indica una diferencia de al menos aproximadamente una diferencia de 3 veces cuando se refiere a afinidades relativas. Los antagonistas son preferiblemente específicos para uno cualquiera de los colágenos de tipo I, II, III, IV o V desnaturalizados y combinaciones de los mismos. En una realización, un antagonista se une a colágeno de tipo I desnaturalizado pero se une con afinidad sustancialmente reducida a colágeno de tipo I nativo y a colágenos de tipo II, III, IV y V desnaturalizados. En otra realización, un antagonista se une a colágeno de tipo IV desnaturalizado pero se une con afinidad sustancialmente reducida a colágeno de tipo de tipo IV nativo. En otra realización, un antagonista se une a los colágenos de tipo I, de tipo II, de tipo III, de tipo IV y de tipo V desnaturalizados pero se une con afinidad sustancialmente reducida a los colágenos de tipo I, de tipo II, de tipo III, de tipo IV y de tipo V nativos.

Las afinidades aparentes se pueden determinar mediante métodos tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o cualquier otra técnica familiar para el especialista en la técnica. Las afinidades verdaderas se pueden medir mediante técnicas conocidas por el especialista en la técnica.

En una realización, los péptidos que contienen epítopos reconocidos por un antagonista se pueden usar por sí mismos. En una realización, los epítopos definidos por los anticuerpos monoclonales HUI77, HUIV26 y XL313 por sí mismos se usan como composiciones antiangiogénicas.

Ensayos de Unión

La invención también proporciona métodos de ensayo para identificar antagonistas candidatos de colágeno desnaturalizado para el uso de acuerdo con la presente invención. En estos métodos de ensayo se evalúan antagonistas candidatos para determinar su capacidad de unirse tanto a colágeno desnaturalizado como a colágeno nativo y, además, se pueden evaluar para determinar su potencia en la inhibición de la angiogénesis en un tejido.

ELISA

El primer ensayo mide la unión de antagonistas a colágenos desnaturalizados o nativos en la fase sólida por ELISA. El ensayo es útil con una diversidad de tipos de colágenos, por ejemplo, el ensayo se puede usar con los colágenos de tipo I, II, III, IV y V, así como para otros componentes de la matriz extracelular.

El ensayo también se puede usar para identificar compuestos que muestren especificidad para formas desnaturalizadas pero no nativas de colágeno. El ensayo de especificidad se realiza procesando ELISA en paralelo en los que selecciona un antagonista potencial de forma concurrente en cámaras de ensayo separadas para determinar la capacidad de unirse a colágenos desnaturalizados y nativos.

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Los antagonistas de colágeno desnaturalizado también se pueden identificar por su capacidad de competir por la unión con un antagonista de la invención. Por ejemplo, se pueden seleccionar supuestos antagonistas controlando su efecto sobre la afinidad de un antagonista conocido, tal como HUI77, HUIV26 o XL313, en un ensayo de unión, tal como ELISA. Tales antagonistas probablemente tienen la misma especificidad que HUI77 y reconocen el mismo epítopo críptico. Los supuestos antagonistas seleccionados por un método de exploración de este tipo se pueden unir al colágeno o al antagonista. Los antagonistas se pueden seleccionar de los supuestos antagonistas mediante ensayos de unión convencionales para determinar los que se unen al epítopo de colágeno desnaturalizado pero no al antagonista conocido.

Los antagonistas también se pueden identificar por su capacidad de unirse a una matriz sólida que contiene un colágeno desnaturalizado. Tales supuestos antagonistas se recogen después de alterar las condiciones de la solución, tales como concentración de sales, pH, temperatura, etc. Los supuestos antagonistas se identifican adicionalmente por su capacidad de atravesar, en condiciones de solución apropiadas, una matriz sólida a la que se ha fijado un colágeno nativo.

Ensayos de Angiogénesis

Los antagonistas de la invención también se pueden ensayar para determinar su capacidad de modular la angiogénesis en un tejido. Se puede usar cualquier ensayo adecuado conocido por el especialista en la técnica para controlar tales efectos. Varias de tales técnicas se describen en este documento.

El segundo ensayo mide la angiogénesis en la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) y se denomina el ensayo de CAM. El ensayo de CAM se ha descrito con detalle por otros y se ha usado adicionalmente para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización de tejidos tumorales. Véase Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975) y Ossonski et al., Cancer Res., 40: 2300-2309 (1980).

El ensayo de CAM es un modelo de ensayo bien reconocido para angiogénesis in vivo debido a que tiene lugar la neovascularización de tejido completo y los vasos sanguíneos de embrión de pollo propiamente dichos crecen en la CAM o en el tejido desarrollado sobre la CAM.

Como se demuestra en este documento, el ensayo de CAM ilustra la inhibición de neovascularización basándose tanto en la cantidad como en el alcance de crecimiento de nuevos vasos. Además, es fácil controlar el crecimiento de cualquier tejido trasplantado en la CAM, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil debido a que existe un control interno para la toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo está expuesto a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del embrión es una indicación de la toxicidad.

Un tercer ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ojo de conejo in vivo y se denominado el ensayo de ojo de conejo. El ensayo de ojo de conejo se ha descrito con detalle por otros y se ha usado adicionalmente para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización en presencia de inhibidores angiogénicos tales como talidomida. Véase D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 4082-4085.

El ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para angiogénesis in vivo debido a que el proceso de neovascularización, ilustrado por vasos sanguíneos de conejo que crecen desde el borde de la córnea al interior de la córnea, se visualiza de forma sencilla a través de la córnea transparente de forma natural del ojo.

Adicionalmente, tanto el alcance como la cantidad de estimulación o inhibición de neovascularización o regresión de neovascularización se pueden controlar de forma sencilla a lo largo del tiempo.

Finalmente, el conejo se expone a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del conejo es una indicación de la toxicidad del reactivo de ensayo.

Un cuarto ensayo mide la angiogénesis en el modelo quimérico de ratón:humano de ratón y se denomina el ensayo quimérico de ratón. El ensayo se ha descrito con detalle por otros y se ha descrito adicionalmente en este documento para medir la angiogénesis, neovascularización y regresión de tejidos tumorales. Véase Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 986-996.

El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para angiogénesis in vivo debido a que los injertos de piel trasplantados se parecen de forma estrecha a la piel humana normal histológicamente y tiene lugar la neovascularización de tejido completo donde los vasos sanguíneos humanos propiamente dichos crecen desde la piel humana injertada al tejido tumoral humano sobre la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización en el injerto humano se puede demostrar por tinción inmunohistoquímica de la neovasculatura con marcadores de células endoteliales específicos de ser humano.

El ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de la neovascularización basándose tanto en la cantidad como en el alcance de la regresión de crecimiento de nuevos vasos. Además, es sencillo controlar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido trasplantado sobre la piel injertada, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil debido a que existe un control interno para toxicidad en el sistema de ensayo. El ratón quimérico se expone a cualquier reactivo de ensayo y, por lo tanto, la salud del ratón es una indicación de la toxicidad.

Anticuerpos

La presente invención describe, en una realización, antagonistas de colágeno desnaturalizado en forma de anticuerpos que se unen a colágeno desnaturalizado pero que se unen a colágeno nativo con una afinidad sustancialmente reducida. Los antagonistas de anticuerpo también pueden inhibir la angiogénesis.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoclonales o policlonales. En una realización, los anticuerpos usados son monoclonales. Un anticuerpo monoclonal de esta invención comprende moléculas de anticuerpo que inmunorreacionan con colágeno desnaturalizado aislado, pero que inmunorreaccionan con una afinidad sustancialmente reducida con la forma nativa del colágeno. En una realización, un anticuerpo de la invención reconoce colágeno de tipo I desnaturalizado con una afinidad de al menos aproximadamente 3 veces, más preferiblemente de al menos aproximadamente 5 veces y mucho más preferiblemente de al menos aproximadamente 10 veces más que la afinidad por colágeno de tipo I desnaturalizado. Un anticuerpo de la invención también puede unirse preferiblemente a colágeno de tipo IV desnaturalizado y se une con afinidad sustancialmente reducida a colágeno de tipo IV nativo. Los anticuerpos de la invención también pueden unirse a cada uno de los colágenos de tipo I, II, III, IV y V y unirse a las formas nativas de cada colágeno con afinidad sustancialmente reducida.

Los anticuerpos monoclonales preferidos que se unen preferentemente a colágeno desnaturalizado incluyen anticuerpos monoclonales que tienen las características de inmunorreacción del mAb HUI77, mAb HUIV26 o mAb XL313.

Los antagonistas de anticuerpos de la invención se pueden generar de acuerdo con varios métodos conocidos por el especialista en la técnica. Por ejemplo, un animal se puede inmunizar con un colágeno desnaturalizado o un fragmento del mismo. Los anticuerpos generados de este modo se pueden seleccionar tanto por su capacidad de unirse a colágeno proteolizado desnaturalizado como por una afinidad sustancialmente reducida por la forma nativa del mismo colágeno. Los anticuerpos se pueden generar, por ejemplo, mediante el método de "inmunización sustractiva" (véase, por ejemplo, Brooks, P. C. et al. (1993) J. Cell. Biol. 122: 1351-1359).

La expresión "anticuerpo o molécula de anticuerpo" en las diversas formas gramaticales se usa en este documento como un sustantivo colectivo que se refiere a una población de moléculas de inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de combinación con anticuerpo o paratopo.

Un "sitio de combinación con anticuerpo" es la porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida por regiones variables e hipervariables de cadena pesada y ligera que se unen específicamente a antígeno.

Los anticuerpos ejemplares para el uso en la presente invención son moléculas de inmunoglobulina intacta, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intacta y las porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, incluyendo las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')_{2} y (F(v) y también se denominan fragmentos de anticuerpo.

En otra realización preferida, la invención contempla una molécula de inmunoglobulina truncada que comprende un fragmento Fab procedente de un anticuerpo monoclonal de esta invención. El fragmento Fab, que carece de un receptor Fc, es soluble y proporciona ventajas terapéuticas en la semivida sérica y ventajas de diagnóstico en los modos de usar el fragmento Fab soluble. La preparación de un fragmento Fab soluble se conoce generalmente en la técnica inmunológica y se puede conseguir mediante una diversidad de métodos.

Por ejemplo, se preparan porciones (fragmentos) Fab y F(ab')_{2} de anticuerpos mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en anticuerpos sustancialmente intactos mediante métodos que se conocen bien. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.342.566 de Theofilopolous y Dixon. Las porciones de anticuerpos Fab' también se conocen bien y se producen a partir de porciones F(ab')_{2} seguido de reducción de los enlaces disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol y seguido de la alquilación de la proteína resultante mercaptano con un reactivo tal como yodoacetamida. Se prefiere un anticuerpo que contiene moléculas de inmunoglobulina intacta y se utiliza como ilustrativa en este documento.

La expresión "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular. Un anticuerpo monoclonal, por lo tanto, puede contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico.

Un anticuerpo monoclonal está compuesto típicamente por anticuerpos producidos por clones de una sola célula denominada un hibridoma que secreta (produce) solamente un tipo de molécula de anticuerpo. La célula de hibridoma se forma fusionando una célula productora de anticuerpos y una línea celular de mieloma u otra línea celular con auto-perpetuación. La preparación de tales anticuerpos se describió por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Se describen métodos adicionales por Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987). Los sobrenadantes de hibridoma preparados de este modo se pueden explorar para detectar la presencia de moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con colágenos desnaturalizados.

En resumen, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la composición de anticuerpo monoclonal, una línea celular del mieloma u otra línea celular con auto-perpetuación se fusiona con linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con una fuente de colágeno desnaturalizado.

Se prefiere que la línea celular de mieloma usada para preparar un hibridoma sea de la misma especie que los linfocitos. Típicamente, un ratón de la cepa 129 GIX.sup.+ es el mamífero preferido. Los mielomas de ratón adecuados para el uso en la presente invención incluyen las líneas celulares sensibles a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) P3X63-Ag8.653 y Sp2/0-Ag14 que están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., con las denominaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente.

Los esplenocitos típicamente se fusionan con células de mieloma usando polietilenglicol (PEG) 1500. Los híbridos fusionados se seleccionan por su sensibilidad frente a un medio de cultivo selectivo, tal como medio HAT (hipoxantina aminopterina timidina). Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención se identifican usando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) descrito en los Ejemplos.

Un anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede producir iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de la especificidad apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio. El medio que contiene anticuerpo después se recoge. Las moléculas de anticuerpo se pueden aislar después adicionalmente mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones se conocen bien en la técnica y están disponibles en el mercado e incluyen medio de cultivo sintético, ratones endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396, 1959) complementado con 4,5 g/l de glucosa, glutamina 20 nM y suero fetal de ternero al 20%. Una cepa de ratón endogámico ejemplar es el Balb/c.

Otros métodos para producir un anticuerpo monoclonal, una célula de hibridoma o un cultivo de células de hibridoma también se conocen bien. Véase, por ejemplo, el método para aislar anticuerpos monoclonales de un repertorio inmunológico como se describe por Sastry et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732; y Huse et al. (1989) Science, 246: 1275-1281.

También se considera por esta invención la célula de hibridoma y cultivos que contienen células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales de esta invención. Se prefiere particularmente una línea celular de hibridoma que secrete el anticuerpo monoclonal mAb HUI77, mAb HUIV26 o mAb XL313.

La invención considera, en una realización, un anticuerpo monoclonal que tiene las características de inmunorreacción de mAb HUI77, mAb HUIV26 o mAb XL313.

También es posible determinar, sin experimentación excesiva, si un anticuerpo monoclonal tiene una especificidad equivalente (características de inmunorreacción) a un anticuerpo monoclonal de esta invención evaluando si el primero evita que el último se una a una molécula diana preseleccionada. Si el anticuerpo monoclonal que se está ensayando compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal de la invención en ensayos de competición convencionales por la unión a la molécula diana cuando está presente en la fase sólida, entonces es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítopo o a uno estrechamente relacionado.

Un modo adicional para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención es determinar la secuencia de resto aminoacídico de las regiones CDR de los anticuerpos en cuestión. Las moléculas de anticuerpo que tienen secuencias de resto aminoacídico idénticas o funcionalmente equivalentes en sus regiones CDR tienen la misma especificidad de unión. En la técnica se conocen bien los métodos para secuenciar polipéptidos. Esto no sugiere que los anticuerpos con distintas regiones CDR no se puedan unir al mismo epítopo.

La inmunoespecificidad de un anticuerpo, su capacidad de unión a molécula diana y la afinidad relacionada que el anticuerpo muestra por el epítopo se definen por el epítopo con el que inmunorreacciona el anticuerpo. La especificidad de epítopo se define al menos en parte por la secuencia de resto aminoacídico de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina, el anticuerpo y, en parte, por la secuencia del resto aminoacídico de la región variable de la cadena ligera.

El uso de la expresión "que tiene la especificidad de unión de" indica que anticuerpos monoclonales equivalentes muestran características de inmunorreacción (unión) iguales o similares y compiten por la unión a un epítopo diana preseleccionado.

Los anticuerpos monoclonales humanizados ofrecen ventajas particulares con respecto a los anticuerpos monoclonales murinos, particularmente en la medida en la que se pueden usar terapéuticamente en seres humanos. Específicamente, los anticuerpos humanos no se aclaran de la circulación tan rápidamente como antígenos "extraños" y no activan el sistema inmune del mismo modo que los antígenos extraños y anticuerpos extraños. En la técnica generalmente se conocen bien los métodos para preparar anticuerpos "humanizados" y se pueden aplicar de forma sencilla a los anticuerpos de la presente invención.

Por tanto, la invención considera, en una realización, un anticuerpo monoclonal de esta invención que está humanizado injertando para introducir componentes del sistema inmune humano sin interferir sustancialmente con la capacidad del anticuerpo de unirse a antígeno.

El anticuerpo del uso de la invención también puede ser un anticuerpo completamente humano tal como los generados, por ejemplo, por selección de una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos que presenta anticuerpos de cadena única o cadena doble humanos tales como los descritos en Haard, H. J. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 18218-30 y en Winter, G. et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55.

Polipéptidos

Los antagonistas de colágeno desnaturalizado también pueden ser polipéptidos o péptidos. El término polipéptido se refiere a una secuencia de 3 o más aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre el grupo amino alfa y el grupo carboxi de restos aminoacídicos contiguos. El término péptido como se usa en este documento se refiere a una serie lineal de dos o más conectados entre sí como en un polipéptido.

En una realización, la invención considera antagonistas de colágeno desnaturalizado en forma de polipéptidos. Un antagonista polipeptídico de colágeno desnaturalizado puede ser cualquier péptido o polipéptido capaz de unirse a un colágeno desnaturalizado, pero se une a la forma nativa del colágeno con afinidad sustancialmente reducida.

La identificación de péptidos antagonistas de colágeno desnaturalizado preferido que tienen selectividad por colágeno desnaturalizado se puede identificar fácilmente en una inhibición típica de ensayo de unión, tal como en el ensayo ELISA descrito en los Ejemplos.

Se pueden generar antagonistas de péptido y polipéptido mediante varias técnicas conocidas por el especialista en la técnica. Por ejemplo, un sistema de dos híbridos (por ejemplo, Fields, S. (1989) Nature 340: 245-6) puede usar un fragmento de un colágeno como un "cebo" para seleccionar antagonistas proteicos de una biblioteca que se une al péptido de colágeno. La biblioteca de potenciales antagonistas se puede producir a partir de una genoteca de ADNc, por ejemplo. En otra realización, los potenciales antagonistas pueden ser variantes de proteínas de unión a colágeno conocidas. Tales proteínas se pueden mutagenizar de forma aleatoria o someter a combinación de genes u otras técnicas disponibles para generar diversidad de secuencia.

También se pueden generar antagonistas de péptido y polipéptido mediante técnicas de evolución molecular. Las bibliotecas de proteínas se pueden generar por mutagénesis, combinación de genes u otras técnicas disponibles para generar diversidad molecular. Las combinaciones de proteína que representan numerosas variantes se pueden seleccionar por su capacidad de unirse a colágeno desnaturalizado, por ejemplo, pasando tales combinaciones de proteínas sobre una matriz sólida a la que se ha unido un colágeno desnaturalizado. La elución con gradientes de sal, por ejemplo, puede proporcionar purificación de variantes con afinidad por el colágeno desnaturalizado. También se puede incidir una etapa de selección negativa por la que tales combinaciones se pasan sobre una matriz sólida a la que se han unido colágenos nativos. El filtrado contendrá las variantes dentro de la combinación que tengan una afinidad reducida por la forma nativa del colágeno.

También se pueden generar antagonistas de péptido y polipéptido por presentación en fagos. Se puede expresar un péptido o una proteína aleatorizada sobre la superficie de una partícula de fagémido como una fusión con una proteína de envuelta de fago. Las técnicas de presentación en fagos monovalentes están disponibles de forma amplia (véase, por ejemplo, Lowman H. B. et al. (1991) Biochemistry 30: 10832-8.). Las bibliotecas de péptido o proteína aleatorizada que expresan los fagos se pueden cribar con una matriz sólida a la que se ha unido una molécula de colágeno nativo. El fago remanente no se une a colágenos nativos o se une a colágenos nativos con una afinidad sustancialmente reducida. Después, el fago se criba frente a una matriz sólida a la que se ha unido un colágeno desnaturalizado. El fago unido se aísla y se separa de la matriz sólida por un cambio en las condiciones de solución o, para una construcción diseñada de forma adecuada, por escisión proteolítica de una región enlazadora que conecta la proteína de envuelta del fago con la biblioteca de péptido o proteína aleatorizada. El fago aislado se puede secuenciar para determinar la identidad del antagonista seleccionado.

Un polipéptido incluye cualquier análogo, fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de resto aminoacídico se muestra en este documento siempre que el polipéptido sea un antagonista de colágeno desnaturalizado, pero no de colágeno nativo. Por lo tanto, un presente polipéptido se puede someter a diversos cambios, sustituciones, inserciones y deleciones cuando tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. A este respecto, un polipéptido antagonista de colágeno desnaturalizado de esta invención se corresponde a, en vez de ser idéntico a, la secuencia de un péptido indicado cuando se realizan uno o más cambios y conserva la capacidad de funcionar como un antagonista de colágeno desnaturalizado en uno o más de los ensayos como se definen en este documento.

Por tanto, un polipéptido puede estar en cualquiera de una diversidad de formas de derivados peptídicos, que incluyen amidas, conjugados con proteínas, péptidos ciclados, péptidos polimerizados, análogos, fragmentos, péptidos químicamente modificados y derivados similares.

Otros Antagonistas

Los antagonistas también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, tales como los productos naturales o los compuestos sintetizados por síntesis orgánica convencional o síntesis orgánica de combinación. Los compuestos se pueden ensayar para determinar su capacidad de unirse a un colágeno desnaturalizado, por ejemplo, mediante del uso de la técnica de unión a columna que se ha descrito anteriormente. Los compuestos también se seleccionan por afinidad reducida por la forma nativa del colágeno mediante una técnica de unión a columna similar.

Los antagonistas también pueden ser compuestos no peptídicos. Los compuestos no peptídicos adecuados incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos. Oligonucleótidos como se usa en este documento se refiere a cualquier material heteropolimérico que contiene purina, pirimidina y otras bases aromáticas. Los oligonucleótidos de ADN y ARN son adecuados para el uso con la invención, como lo son los oligonucleótidos con modificaciones con azúcar (por ejemplo, ribosas 2' alquiladas) y de cadena principal (por ejemplo, oligonucleótidos fosforotioato). Los oligonucleótidos pueden presentar las bases encontradas de forma común purina y pirimidina, tales como adenina, timina, guanina, citidina y uridina, así como bases modificadas con la porción de anillo heterocíclico (por ejemplo, 7-desazaguanina) o en posiciones exocíclicas. Oligonucleótido también incluye heteropolímeros con estructuras distintas que también presentan bases aromáticas, que incluyen ácidos nucleicos poliamida y similares.

Se puede generar un antagonista de oligonucleótido mediante varios métodos conocidos por el especialista en la técnica. En una realización se genera una combinación de oligonucleótidos que contiene un gran número de secuencias. Las combinaciones se pueden generar, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida usando mezclas de monómeros como una etapa de elongación. La combinación de oligonucleótidos se clasifica pasando una solución que contiene la combinación sobre una matriz sólida a la que se ha fijado un colágeno desnaturalizado o un fragmento del mismo. Las secuencias dentro de la combinación que se unen a colágeno desnaturalizado se retienen en la matriz sólida. Estas secuencias se eluyen con una solución de diferente concentración salina o pH. Las secuencias seleccionadas se someten a una segunda etapa de selección. La combinación seleccionada se pasa sobre una segunda matriz sólida a la que se ha fijado colágeno nativo. La columna retiene las secuencias que se unen al colágeno nativo, enriqueciendo de este modo la combinación en secuencias específicas para el colágeno desnaturalizado. La combinación se puede amplificar y, si fuera necesario, mutagenizar y el proceso se puede repetir hasta que la combinación muestre las características de un antagonista de la invención. Se pueden identificar antagonistas individuales secuenciando miembros de la combinación de oligonucleótidos, habitualmente después de clonar dichas secuencias en un organismo hospedador tal como E. coli.

Tratamiento de Enfermedad

La presente invención se refiere de forma general al descubrimiento de que la ligación de ciertos epítopos en colágenos desnaturalizados pero no colágenos nativos inhibe la angiogénesis. Este descubrimiento es importante debido al papel que desempeña la angiogénesis en una diversidad de procesos patológicos. Inhibiendo la angiogénesis se puede intervenir en la enfermedad, mitigar los síntomas y en algunos casos, curar la enfermedad.

Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de o contribuye a la patología asociada con una enfermedad, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos perjudiciales de la enfermedad. Los ejemplos incluyen psoriasis, artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias, reestenosis, degeneración macular y similares. Cuando se requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para soportar el crecimiento de un tejido perjudicial, la inhibición de la angiogénesis reducirá el suministro de sangre al tejido y, por lo tanto, contribuirá a la reducción en la masa tisular basándose en los requisitos de suministro de sangre. Los ejemplos incluyen el crecimiento de tumores donde la neovascularización es un requisito continuo para que el tumor crezca más allá de unos pocos milímetros de espesor y para el establecimiento de metástasis de tumor sólido.

El uso de la presente invención es eficaz en parte debido a que la terapia es altamente selectiva para angiogénesis y no para otros procesos biológicos. Como se muestra en los Ejemplos, solamente el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos se inhibe por antagonistas de colágenos desnaturalizados y, por lo tanto, los métodos terapéuticos no afectan de forma adversa a vasos maduros. Como también se muestra en los Ejemplos, un antagonista se une a sitios angiogénicos en tumores pero no a tejidos circundantes normales.

El descubrimiento de que la ligación o colágenos desnaturalizados solos pueden inhibir de forma eficaz la angiogénesis permite el desarrollo de composiciones terapéuticas con especificidad potencialmente alta y, por lo tanto, toxicidad relativamente baja. Por tanto, aunque la invención describe el uso de antagonistas basados en anticuerpos que tienen la capacidad de ligar uno o más colágenos desnaturalizados, se pueden diseñar otros antagonistas que también pueden ligar específicamente colágenos desnaturalizados, pero no colágenos nativos.

Antes de los descubrimientos de la presente invención, no se conocía que la angiogénesis y cualquiera de los procesos dependientes de la angiogénesis se podrían inhibir in vivo mediante el uso de reactivos que antagonizan epítopos crípticos en colágenos, es decir, los encontrados en colágenos proteolizados o desnaturalizados, pero no en formas nativas de los mismos colágenos.

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Métodos para la Inhibición de la Angiogénesis

La invención proporciona el uso de un antagonista para la fabricación de una composición para la inhibición de la angiogénesis en un tejido y, por lo tanto, la inhibición de acontecimientos en el tejido que dependen de la angiogénesis. Generalmente, el método comprende administrar al tejido una composición que comprende una cantidad inhibidora de angiogénesis de un antagonista de colágeno desnaturalizado.

Como se ha descrito anteriormente, la angiogénesis incluye una diversidad de procesos que implican la neovascularización de un tejido que incluye el "crecimiento rápido", vasculogénesis o aumento de vasos, procesos de la angiogénesis que implican todos la alteración del colágeno de matriz extracelular en vasos sanguíneos. Con la excepción de curación de heridas traumáticas, formación de cuerpo lúteo y embriogénesis, se piensa que la mayoría de los procesos de la angiogénesis están asociados con procesos patológicos y, por lo tanto, el uso de los presentes métodos terapéuticos son selectivos para la enfermedad.

Existe una diversidad de enfermedades en las que la angiogénesis se piensa que es importante, denominadas enfermedades angiogénicas, que incluyen, pero sin limitación, trastornos inflamatorios tales como inflamación inmune y no inmune, reumatismo articular crónico y psoriasis, trastornos asociados con invasión inapropiada o inoportuna de vasos tales como retinopatía diabética, glaucoma neovascular, reestenosis, proliferación capilar en placas ateroescleróticas y osteoporosis y trastornos asociados con cáncer, tales como tumores sólidos, metástasis de tumores sólidos, angiofibromas, fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y cánceres similares que requieren neovascularización para soportar el crecimiento del tumor. Otros tumores adecuados incluyen melanoma, carcinoma, sarcoma, fibrosarcoma, glioma y astrocitoma.

Por tanto, los métodos que inhiben la angiogénesis en un tejido enfermo mitigan los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la cura de la enfermedad. En una realización, la invención considera el uso de un antagonista para la fabricación de una composición para la inhibición de la angiogénesis, per se, en un tejido. El alcance de la angiogénesis en un tejido y, por lo tanto, el alcance de la inhibición conseguida por los presentes métodos, se pueden evaluar por una diversidad de métodos, tales como los que se describen en los Ejemplos para detectar estructuras de vasos inmaduros y nacientes inmunopositivas a colágeno proteolizado o desnaturalizado por inmunohistoquímica.

Como se describe en este documento, cualquiera de una diversidad de tejidos u órganos comprendidos por tejidos organizados puede soportar la angiogénesis en afecciones patológicas que incluyen piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y tejidos similares en los que los vasos sanguíneos pueden invadir después de estímulos angiogénicos. Tejido, como se usa en este documento, también incluye todos los fluidos corporales, secreciones y similares, tales como suero, sangre, líquido cefalorraquídeo, plasma, orina, líquido sinovial, humor vítreo.

Por tanto, un tejido a tratar es un tejido inflamado y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis de tejido inflamado cuando existe neovascularización del tejido inflamado. En esta clase, el método considera la inhibición de la angiogénesis en tejidos artríticos, tales como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático y similares.

El paciente de forma deseable es un paciente humano, aunque se tiene que entender que los principios indican que el uso de la invención es eficaz con respecto a todos los mamíferos, que tienen por objeto estar incluidos en el término "paciente". En este contexto, se comprende que un mamífero incluye cualquier especie de mamífero en el que es deseable el tratamiento de enfermedades asociadas con angiogénesis, particularmente especies de mamíferos agrícolas y domésticos. Tal paciente puede ser, por ejemplo, un cerdo, una vaca, un caballo, una cabra, una oveja, un mulo, un burro, un perro, un gato, un conejo, un ratón y una rata.

En otra realización relacionada, un tejido a tratar es un tejido retiniano de un paciente con retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis del tejido retiniano donde existe neovascularización de tejido retiniano.

En una realización relacionada adicional, un tejido a tratar es un tejido tumoral de un paciente con un tumor sólido, una metástasis, un cáncer cutáneo, un cáncer de mama, un hemangioma o angiofibroma y cáncer similar y la angiogénesis a inhibir es angiogénesis de tejido tumoral donde existe neovascularización de un tejido tumoral. Los tejidos de tumor sólido típico que se pueden tratar por los presentes métodos incluyen pulmón, páncreas, mama, colon, laríngeo, ovárico, sarcoma de Kaposi y tejidos similares. La angiogénesis de tejido tumoral ejemplar, y la inhibición de la misma, se describen en los Ejemplos.

El uso de un antagonista para la fabricación de una composición para la inhibición de angiogénesis de tejido tumoral es una realización particularmente preferida debido al importante papel que la neovascularización desempeña en el crecimiento del tumor. En ausencia de neovascularización de tejido tumoral, el tejido tumoral no obtiene los nutrientes requeridos, ralentiza su crecimiento, suspende el crecimiento adicional, regresa y finalmente se convierte en necrótico dando como resultado la destrucción del tumor.

Dicho con otras palabras, la presente invención proporciona una composición para inhibir la neovascularización del tumor inhibiendo la angiogénesis del tumor o para inhibir el crecimiento del tumor.

Los métodos también son particularmente eficaces contra la formación de metástasis debido a que (1) su formación requiere vascularización de un tumor primario de tal forma que las células de cáncer metastásicas puedan salir del tumor primario y (2) su establecimiento en un sitio secundario requiere neovascularización para soportar el crecimiento de las metástasis.

En una realización relacionada, la invención considera la composición junto con otras terapias tales como quimioterapia convencional dirigida contra tumores sólidos y para el control del establecimiento de metástasis. La administración de inhibidor de angiogénesis se realiza típicamente durante o después de quimioterapia, aunque es preferible inhibir la angiogénesis después un régimen de quimioterapia en momentos en los que el tejido tumoral responderá al ataque tóxico induciendo la angiogénesis para recuperar la previsión de un suministro de sangre y nutrientes al tejido tumoral. Además, se prefiere administrar los métodos de inhibición de angiogénesis después de la cirugía en la que se hayan eliminado los tumores sólidos como una profilaxis contra metástasis.

En la medida en la que las presentes composiciones se aplican a la inhibición de la neovascularización del tumor, las composiciones también se pueden aplicar a la inhibición del crecimiento de tejido tumoral, a inhibición de formación de metástasis de tumor y a la regresión de tumores establecidos.

La reestenosis es un proceso de migración de células de músculo liso (SMC) y proliferación en el sitio de angioplastia coronaria transluminal percutánea que obstaculiza el éxito de la angioplastia. La migración y proliferación de SMC asociada con vasos sanguíneos durante la reestenosis está relacionada con el proceso de angiogénesis que se inhibe por los presentes métodos. Por lo tanto, las composiciones también consideran la inhibición de la reestenosis inhibiendo procesos relacionados con la angiogénesis en un paciente después de procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de la reestenosis, la composición se administra típicamente después del procedimiento de angioplastia durante aproximadamente 2 a aproximadamente 28 días, y más típicamente durante aproximadamente los primeros 14 días después del procedimiento.

Los intervalos de dosificación para el antagonista de colágeno desnaturalizado dependen de la forma del antagonista y su potencia, como se describe adicionalmente en este documento, y son cantidades lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que se mitigan la angiogénesis y los síntomas de la enfermedad mediados por la angiogénesis. La dosificación no debe ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, afección, sexo y alcance de la enfermedad en el paciente y se puede determinar por el especialista en la técnica. La dosificación también se puede ajustar por el médico individual en el acontecimiento de cualquier complicación.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de antagonista de colágeno desnaturalizado suficiente para producir una inhibición medible de la angiogénesis en el tejido que se está tratando, es decir, una cantidad inhibidora de la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis se puede medir in situ mediante inmunohistoquímica, como se describe en este documento, o mediante otros métodos conocidos por el especialista en la técnica.

La potencia de un antagonista de colágeno desnaturalizado se puede medir mediante una diversidad de medios que incluyen la inhibición de la angiogénesis en el ensayo de CAM, en el ensayo de ojo de conejo in vivo, en el ensayo quimérico de ratón: humano in vivo y ensayos similares.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de colágeno desnaturalizado para el uso en la invención en forma de un anticuerpo monoclonal es típicamente una cantidad tal, que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para conseguir una concentración plasmática de aproximadamente 0,01 microgramo (\mug) por mililitro (ml) a aproximadamente 100 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 5 \mug/ml y habitualmente aproximadamente 5 \mug/ml. Dicho de otro modo, la dosificación puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días.

Cuando el antagonista está en forma de un fragmento de un anticuerpo monoclonal, la cantidad se puede ajustar de forma sencilla basándose en la masa del fragmento con respecto a la masa del anticuerpo completo. Una concentración plasmática preferida en molaridad es antagonista de anticuerpo de aproximadamente 2 micromolar (\muM) a aproximadamente 5 milimolar (mM) y preferiblemente de aproximadamente 100 \muM a 1 mM.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de colágeno desnaturalizado para el uso de la invención en forma de un polipéptido, o molécula pequeña, es típicamente una cantidad de polipéptido tal, que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para conseguir una concentración plasmática de aproximadamente 0,1 microgramo (\mug) por mililitro (ml) a aproximadamente 200 \mug/ml, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 150 \mug/ml. Basándose en un polipéptido que tiene una masa de aproximadamente 500 gramos por mol, la concentración plasmática preferida en molaridad es antagonista de polipéptido de aproximadamente 2 micromolar (\muM) a aproximadamente 5 milimolar (mM) y preferiblemente de aproximadamente 100 \muM a 1 mM. Dicho de otra manera, la dosificación por peso corporal puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg y preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días.

Los anticuerpos monoclonales o polipéptidos para el uso de la composición de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. Aunque el tejido a tratar puede ser accesible típicamente en el cuerpo por administración sistémica y, por lo tanto, se puede tratar con frecuencia mediante administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se consideran otros tejidos y medios de suministro cuando existe una probabilidad de que el tejido fijado como objetivo contenga la molécula diana. Por tanto, los antagonistas que incluyen anticuerpos monoclonales, polipéptidos y derivados de los mismos se pueden administrar por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intracavitaria, por vía transdérmica, por vía tópica, por vía intraocular, por vía oral, por vía intranasal y se pueden suministrar por medios peristálticos.

Las composiciones terapéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal o un polipéptido de esta invención se administran de forma convencional por vía intravenosa, como por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria" cuando se usa con referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, excipientes o vehículo.

En una realización como se muestra en los Ejemplos, el antagonista de colágeno desnaturalizado se administra en una única dosificación por vía intravenosa.

Las composiciones se administran de un modo compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar y la sincronización dependen del paciente a tratar, la capacidad del sistema del paciente de utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas requeridas de ingrediente activo a administrar dependen del criterio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, en este documento se describen intervalos de dosificación adecuados para aplicación sistémica y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas por una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, se considera una infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para terapias in vivo.

Como se demuestra por los presentes Ejemplos, la inhibición de la angiogénesis y la regresión del tumor tienen lugar tan temprano como 7 días después de la puesta en contacto inicial con el antagonista. La exposición adicional o prolongada a antagonista es preferible durante 7 días a 6 semanas, preferiblemente de aproximadamente 14 a 28 días.

Composiciones Terapéuticas

La presente invención considera composiciones terapéuticas. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un vehículo fisiológicamente tolerable junto con un antagonista de colágeno desnaturalizado o proteolizado como se describe en este documento, disuelto o dispersado en el mismo como un ingrediente activo. La composición antagonista de colágeno desnaturalizado terapéutica no es inmunógena cuando se administra a un paciente mamífero o humano con propósitos terapéuticos.

Como se usa en este documento, las expresiones "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de las mismas, cuando se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan de forma intercambiable y representan que los materiales son capaces de administración a o sobre un mamífero.

La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma se comprende bien en la técnica y no se tiene que limitar basándose en la formulación. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes del uso. La preparación también se puede emulsionar.

El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los métodos terapéuticos descritos en este documento. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de taponamiento de pH y similares que mejoran la eficacia del ingrediente activo.

La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en este documento. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formados con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden obtener a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares. Se prefieren particularmente las sales de TFA y HCl.

Los vehículos fisiológicamente tolerables se conocen bien en la técnica. Son ejemplares de vehículos líquidos las soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua o que contienen un tampón tal como fosfato sódico a valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tales como solución salina tamponada con fosfato. Aún adicionalmente, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal de tampón, así como sales tales como cloruro sódico y potásico, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos.

Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además y para la exclusión de agua. Son ejemplares de tales fases líquidas adicionales la glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua-aceite.

Una composición terapéutica contiene una cantidad inhibidora de la angiogénesis de un antagonista de colágeno desnaturalizado de la presente invención, formulado típicamente para contener una cantidad de al menos el 0,1 por ciento en peso de antagonista por peso de composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una proporción en peso de inhibidor a composición total. Por tanto, por ejemplo, el 0,1 por ciento en peso son 0,1 gramos de inhibidor por 100 gramos de composición total.

Un anticuerpo se puede conjugar con citotoxinas, agentes citotóxicos, para el suministro a un tumor u otro tejido que experimenta angiogénesis. Tales conjugados se pueden preparar con una citolisina o una hexotoxina, por ejemplo, ricina A, toxina diftérica A o exotoxina de Pseudomonas y fragmentos de las mismas. El agente citotóxico también se puede marcar radiactivamente con un isótopo a fin de suministrar de forma local una dosis tóxica de radiactividad a un tejido angiogénico.

Los antagonistas de la invención también se pueden usar para suministrar una enzima a una diana en la que la enzima sea capaz de convertir un profármaco en una forma activa del fármaco. Terapia de profármaco activado por enzima dirigida a anticuerpo (ADEPT) (véase, por ejemplo, Syrigos, K. N. (1999) Anticancer Res. 19: 605-13). En resumen, un antagonista de la invención se conjuga con una enzima, tal como una lactamasa, proteasa o esterasa, que puede convertir un profármaco no tóxico o inactivo en un fármaco tóxico o activo. Debido a que el antagonista de la invención se localiza en sitios de angiogénesis y, particularmente, en sitios de tumores o metástasis, los fármacos tóxicos se pueden dirigir a los

Métodos de Detección

Los antagonistas de la invención también son adecuados para el uso para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de la angiogénesis en tejidos.

Por ejemplo, cuando el antagonista es un anticuerpo, el antagonista se puede usar en técnicas inmunohistoquímicas para teñir ex vivo tejidos. Las técnicas inmunológicas tales como la inmunotinción y ELISA se describen, por ejemplo, en Receptor Binding Techniques, Methods in Molecular Biology, 106. ed. M. Keen. Humana Press, 1999; Brooks et al. (1998) Cell 92: 391-400; Brooks et al. (1996) Cell 85: 683-693; y Brooks et al. (1993) J. Cell. Biol. 122: 1351-1359.

El antagonista usado en la invención, una vez unido al tejido diana, se puede detectar directamente o indirectamente. La detección directa se puede realizar en antagonistas que comprenden un marcador detectable tal como un fluorocromo, un marcador radiactivo, un metal pesado paramagnético o un colorante de diagnóstico.

Alternativamente, la detección puede tener lugar mediante una interacción secundaria. Por ejemplo, un anticuerpo marcado de forma detectable que reconoce el antagonista se puede usar para visualizar la localización del antagonista. Por ejemplo, si el antagonista es un anticuerpo monoclonal de origen de ratón, se puede usar un anticuerpo de cabra anti-ratón que esté marcado de forma adecuada. Los ejemplos describen el uso, por ejemplo, de un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa. El especialista en la técnica puede determinar anticuerpos secundarios adecuados para el uso con diversos antagonistas.

Para la detección in vivo, es preferible usar un antagonista marcado de forma detectable. El antagonista marcado se administra a un paciente por vía intravenosa, por vía intramuscular, etc. Los marcadores adecuados para la detección en un paciente se prefieren particularmente. Por ejemplo, los marcados paramagnéticamente se pueden detectar mediante formación de imágenes por resonancia magnética. También se pueden detectar antagonistas marcados de forma radioactiva.

Ejemplos Ejemplo 1 Anticuerpo monoclonal HUI77

Este ejemplo describe la generación de un anticuerpo monoclonal específico para colágeno desnaturalizado, mAb HUI77.

El mAb HUI77 se generó y aisló mediante la técnica inmunológica denominada inmunización sustractiva (S.I). La técnica de inmunización sustractiva permite manipular experimentalmente la respuesta inmune en ratones para mejorar selectivamente una respuesta inmune a un epítopo poco frecuente y/o poco abundante en una mezcla de epítopos comunes altamente antigénicos. En resumen, a ratones hembra BALB/c se inyectó por vía intraperitoneal colágeno de tipo I o de tipo IV de triple hélice humano nativo. 24 y 48 horas después de las inyecciones de colágeno de triple hélice, a los ratones se inyectó el agente tolerizante ciclofosfamida para destruir células B activadas que producirían anticuerpos dirigidos contra epítopos inmunodominantes comunes en colágeno de tipo I y de tipo IV de triple hélice nativo. Después del protocolo de tolerización, a continuación, a los ratones se inyectó colágeno de tipo I o tipo IV humano desnaturalizado térmicamente para estimular una respuesta inmune a los epítopos expuestos después de la desnaturalización térmica. El colágeno se desnaturalizó por ebullición durante 15 minutos. Las inyecciones de colágeno de tipo I y tipo IV desnaturalizado térmicamente se administraron cada tres semanas durante un total de 4 a 5 inyecciones. Los sueros de cada ratón se ensayaron para inmunorreactividad con colágenos tanto de triple hélice nativos como desnaturalizados. Los ratones que demostraban el mayor título para reactividad frente a colágeno desnaturalizado en comparación con el colágeno de triple hélice se usaron para la producción de hibridomas. Se fusionaron células de bazo de los ratones seleccionados con células de mieloma mediante técnicas convencionales. Los clones de hibridoma individuales se ensayaron para la producción de anticuerpo frente a colágeno de tipo I y tipo IV de triple hélice o desnaturalizado. Se seleccionaron los clones de hibridoma que producían anticuerpos que demostraron una reactividad selectiva frente a colágeno de tipo I o tipo IV desnaturalizado en comparación con colágeno de tipo I y tipo IV de triple hélice nativo. Los Mab se purificaron mediante técnicas convencionales.

Como se muestra en la Figura 1, se mostró que HUI77 reconoce específicamente los colágenos de tipo I y tipo IV desnaturalizado pero se une a colágenos de tipo I y tipo IV de triple hélice nativos con afinidad sustancialmente reducida. En particular, HUI77 se une a colágeno de tipo I desnaturalizado con una reactividad aparente de al menos aproximadamente 10 veces superior a la de colágeno de tipo I nativo como se mide por ELISA. HUI77 también se une a colágeno de tipo IV desnaturalizado con una afinidad de aproximadamente 10 veces superior que la de colágeno de tipo IV nativo. Además, el mAb HUI77 no se une sustancialmente a otros componentes de matriz, tales como laminina, fibronectina, vitronectina o fibrinógeno, demostrando por tanto su especificidad por un epítopo críptico dentro de los colágenos de tipo I y tipo IV.

El mAb HUI77 también es específico para otros colágenos desnaturalizados y se une a las formas nativas de estos colágenos con afinidad sustancialmente reducida. Como se muestra en la Figura 2, HUI77 también se une a los colágenos III, IV y V desnaturalizados aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces y aproximadamente 10 veces más estrechamente que las formas nativas respectivas de estos colágenos usando ELISA.

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Ejemplo 2 Detección de Tumores Sólidos

Este ejemplo muestra que los antagonistas de la invención se pueden usar para detectar colágenos desnaturalizados en tejido tumoral. Se usó el anticuerpo monoclonal HUI77, descrito en el Ejemplo 1 para inmunoteñir indirectamente tejido normal y tumoral. Como se muestra en la Figura 3, el análisis de inmunofluorescencia indirecta usando el mAb HUI77 de biopsias de tumor de melanoma humano así como tumor de melanoma M21 desarrollado en piel humana de espesor completo indica la generación de formas desnaturalizadas de colágenos asociadas con tumores de melanoma humano in vivo. En gran medida, se detectó poca o ninguna evidencia de colágeno desnaturalizado en tejidos normales en ausencia de tumores, sugiriendo que el colágeno desnaturalizado puede ser un marcador específico de tumores humanos sólidos.

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Ejemplo 3 Detección de Angiogénesis en Tumores Humanos

Este ejemplo demuestra que los antagonistas de la invención se pueden usar para detectar angiogénesis en tumores humanos. El análisis de inmunofluorescencia indirecta, mostrado en la Figura 4, de biopsias de tumor de melanoma humano demuestra la generación y localización de colágeno desnaturalizado que rodea vasos sanguíneos asociados a tumor humano in vivo. En gran medida, se detectó poca o ninguna evidencia de colágeno desnaturalizado rodeando el mAb HUI77 los vasos sanguíneos normales en ausencia de tumores, sugiriendo que el colágeno desnaturalizado puede ser un marcador específico de vasos sanguíneos asociados a tumor angiogénico.

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Ejemplo 4 Antagonistas que Inhiben la Adhesión y Migración de Células Endoteliales

Este ejemplo demuestra que ciertos antagonistas de la invención pueden inhibir la adhesión de células endoteliales humanas a colágenos desnaturalizados.

El mAb HUI77 mostró la capacidad de inhibir la adhesión de células endoteliales humanas a colágeno de tipo I desnaturalizado aproximadamente el 40% en comparación con el anticuerpo de control. Estos hallazgos, resumidos en la Figura 5, sugieren que el mAb HUI77 se une a un epítopo críptico en el colágeno de tipo I que está implicado al menos parcialmente en la adhesión de células endoteliales a colágeno I desnaturalizado. Ya que los procesos de adhesión de células endoteliales se piensa que desempeñan un papel en el crecimiento de tumor y la angiogénesis, este anticuerpo de bloqueo de función puede tener un efecto sobre la angiogénesis y el crecimiento del tumor
in vivo.

El mAb HUI77 también mostró la capacidad de inhibir la migración de células endoteliales humanas en colágeno I desnaturalizado aproximadamente el 80% en comparación con anticuerpo de control o ningún tratamiento, como se muestra en la Figura 6. Estos hallazgos sugieren que el mAb HUI77 se une a un epítopo críptico en el colágeno de tipo I que desempeña un papel significativo en la migración celular en colágeno I desnaturalizado. Dado que se piensa que la migración celular desempeña un papel importante en la metástasis de tumor y en la angiogénesis y que el colágeno desnaturalizado se detecta en asociación con células tumorales malignas y vasos sanguíneos angiogénicos, este anticuerpo de bloqueo de función puede tener un impacto significativo sobre la angiogénesis y el crecimiento del tumor y la metástasis in vivo.

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Ejemplo 6 Inhibición de Angiogénesis por el Anticuerpo Monoclonal HUI77

Este ejemplo muestra que los antagonistas de la invención inhiben de forma eficaz la angiogénesis en el ensayo de CAM de pollo.

Además, la administración sistémica del mAb HUI77 inhibió la angiogénesis inducida por \betaFGF aproximadamente el 90% en comparación con controles (Figuras 7 y 8). El índice angiogénico se midió contando el número de puntos de ramificación de vaso sanguíneo en el ensayo de CAM de pollo (Figura 8). En gran medida, no se observaron efectos secundarios tóxicos en los embriones durante el periodo de ensayo. Además, se observaron pocos o ningún efecto de este Mab en vasos sanguíneos quiescentes normales. Es posible que se pueda usar una concentración mucho menor de Mab y dar como resultado efectos similares. Estos hallazgos indican que el Mab HUI77 es un reactivo anti-angiogénico potente que puede tener aplicaciones clínicas significativas.

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Ejemplo 7 Inhibición de Crecimiento Tumoral por el Mab HUI77

Este ejemplo muestra que los antagonistas de la invención inhiben de forma eficaz el crecimiento del tumor en tumores de melanoma in vivo.

La administración sistémica del mAb HUI77 inhibió el crecimiento del tumor de melanoma aproximadamente el 53% en comparación con los controles, como se muestra en las Figuras 9 y 10. En gran medida, no se observaron efectos secundarios tóxicos en los embriones durante el periodo de ensayo. Además, se observaron pocos o ningún efecto de este Mab en el tejido adyacente. Es posible que se puedan usar concentraciones mucho menores del Mab y dar como resultado efectos similares. Estos hallazgos indican que el Mab HUI77 es un reactivo anti-tumoral potente que puede tener aplicaciones clínicas significativas.

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Ejemplo 8 Anticuerpo Monoclonal HUIV26

El Mab HUIV26 se generó mediante la técnica inmunológica denominada inmunización sustractiva (S.I.) como se ha indicado en el Ejemplo I. Como se muestra en la Figura 11, se mostró que HUIV26 reconoce específicamente el colágeno de tipo IV desnaturalizado pero no se une a colágeno de tipo I o tipo IV de triple hélice nativo. Además, el Mab HUIV26 no se une a otros componentes de matriz tales como Laminina, Fibronectina, Vitronectina o fibrinógeno, demostrando por tanto su especificidad por un epítopo críptico dentro del colágeno de tipo IV.

Como se muestra en la Figura 11B, en sitio o los sitios crípticos en el colágeno de tipo IV reconocidos por el Mab HUIV26 se ponen de manifiesto después de la exposición a medio acondicionado para HUVEC. La cantidad de reactividad con el Mab HUIV26 aumentó a lo largo del periodo de 24 horas examinado. Esto indica que estas células endoteliales secretan una proteasa capaz de desenmascarar el sitio críptico en colágeno de tipo IV reconocido por el Mab HUIV26. La proteasa producida por HUVEC que desenmascara el sitio críptico en el colágeno de tipo IV está inhibido por el quelante EDTA (Figura 11B). Esto sugiere que una metaloproteasa es responsable de iniciar el desenmascaramiento del sitio o los sitios crípticos en colágeno de tipo IV. Como se muestra en la Figura 12, la metaloproteasa, MMP-2, se colocaliza con el sitio o los sitios crípticos en colágeno de tipo IV que reacciona con el Mab HUIV26 en sitios angiogénicos en el tejido de CAM. El inhibidor de serina proteasa, aprotinina, tiene poco efecto sobre el desenmascaramiento del sitio o los sitios crípticos en colágeno de tipo IV después de una hora de incubación con medio acondicionado para HUVEC (Figura 11B). En los puntos de tiempo de 6 y 24 horas, la presencia de aprotinina bloqueó el 40 y el 70 por ciento respectivamente de la reactividad observada en ausencia del inhibidor de proteasa. Esto sugiere que en los puntos de tiempo posteriores (6 y 24 horas), las serina proteasas contribuyen al desenmascaramiento del sitio o los sitios crípticos en el colágeno de tipo IV.

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Ejemplo 9 Detención de la Angiogenésis y Tumores con HUIV26

Este ejemplo muestra que se puede usar un antagonista para detectar procesos angiogénicos en tejidos.

Como se muestra en la Figura 12, el análisis de inmunofluorescencia indirecta de tejido de CAM de pollo indica la generación y localización del colágeno de tipo IV desnaturalizado asociado con vasos sanguíneos angiogénicos inducidos por \betaFGF o tumor in vivo. En gran medida, se detectó poca o ninguna evidencia de colágeno IV desnaturalizado en tejidos de CAM normales en ausencia de bFGF o tumores, sugiriendo que el colágeno IV desnaturalizado puede ser un marcador específico de vasos sanguíneos angiogénicos in vivo.

El análisis de inmunofluorescencia indirecta, mostrado en la Figura 13, de biopsias de tumor de melanoma humano demuestra la generación y localización de colágeno IV desnaturalizado que rodea vasos sanguíneos asociados a tumor humano in vivo. En gran medida, se detectó poca o ninguna evidencia de colágeno IV desnaturalizado que rodea vasos sanguíneos normales en ausencia de tumores, sugiriendo que el colágeno desnaturalizado puede ser un marcador específico de vasos sanguíneos asociados a tumor angiogénico.

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Ejemplo 10 Inhibición de Migración y Adhesión Celular por el Mab HUIV26

Este ejemplo muestra que un antagonista de Mab puede inhibir la migración y adhesión de células endoteliales.

El Mab HUIV26 mostró la capacidad de inhibir la adhesión de células endoteliales humanas a colágeno IV desnaturalizado aproximadamente el 70% en comparación con el anticuerpo de control (Figura 14). Estos hallazgos sugieren que el Mab HUIV26 se une a un epítopo críptico en el colágeno de tipo IV que está implicado al menos parcialmente en la adhesión de células endoteliales a colágeno IV desnaturalizado. Dada la distribución tisular del colágeno de tipo IV y el hecho de que los procesos de adhesión celular se piensa que desempeñan un papel en el crecimiento del tumor y la angiogénesis, este anticuerpo de bloqueo de función puede tener un efecto significativo sobre la angiogénesis y el crecimiento del tumor in vivo.

El Mab HUIV26 mostró la capacidad de inhibir la migración de células endoteliales humanas en colágeno IV desnaturalizado aproximadamente el 70% en comparación con el anticuerpo de control o ningún tratamiento. Estos hallazgos sugieren que el Mab HUIV26 se une a un epítopo críptico en el colágeno de tipo IV que desempeña un papel significativo en la migración celular en colágeno IV desnaturalizado. Dado que la migración celular se piensa que desempeña un papel importante en la metástasis tumoral y la angiogénesis y que el colágeno desnaturalizado se detectó en asociación con vasos sanguíneos angiogénicos, este anticuerpo de bloqueo de función puede tener un impacto significativo sobre la angiogénesis, el crecimiento del tumor y la metástasis in vivo.

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Ejemplo 11 Inhibición de Angiogénesis por Administración Sistémica de HUIV26

La administración sistémica del Mab HUIV26 inhibió la angiogénesis inducida por bFGF aproximadamente el 90% en comparación con los controles, como se muestra en las Figuras 16 y 17. En gran medida, no se observaron efectos secundarios tóxicos en los embriones durante el periodo de ensayo. Además, se observaron pocos o ningún efecto de este Mab sobre vasos sanguíneos quiescentes normales. Es posible que se pueda usar una concentración mucho menor de Mab y dar como resultado efectos similares. Estos hallazgos indican que el Mab HUIV26 es un reactivo anti-angiogénico potente que puede tener aplicaciones clínicas significativas.

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Ejemplo 12 Inhibición de Crecimiento del Tumor

La administración sistémica del Mab HUIV26 inhibió el crecimiento del tumor de melanoma aproximadamente el 80% en comparación con los controles (Figura 18). En gran medida, no se observaron efectos secundarios tóxicos en los embriones durante el periodo de ensayo. Además, se observaron pocos o ningún efecto de este Mab sobre tejido adyacente. Actualmente se están realizando experimentos adicionales para determinar un valor de CI50 ya que es posible que se pueda usar una concentración mucho menor de Mab y dar como resultado efectos similares. Estos hallazgos indican que el Mab HUIV26 es un reactivo anti-tumoral potente y que puede tener aplicaciones clínicas significativas.

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La administración sistémica del Mab HUIV26 inhibió el crecimiento de tumor de melanoma en ratones SCID. Después de 24 días de tratamiento, los ratones tratados con el Mab HCTIV26 tenían un volumen de tumor promedio menor del 5 por ciento al observado en ratones tratados con un Mab de control o en ratones que no reciben tratamiento.

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Ejemplo 13 Especificidad de Epítopo de HUIV26

Este ejemplo muestra que HUIV26 no se une a secuencias RGD en colágenos desnaturalizados.

Como se muestra en la Figura 22, el Mab HUIV26 no es capaz de reaccionar con ninguno de los péptidos que contienen RGD (arginina-glicina-ácido aspártico) inmovilizados encontrados en colágeno de tipo IV (Tabla 1). Seis péptidos que contienen RGD solubles diferentes encontrados en colágenos no consiguieron bloquear el reconocimiento del colágeno de tipo IV desnaturalizado inmovilizado por el Mab HUIV26 (Figura 22). Estos datos sugieren que el Mab HUIV26 no reconoce secuencias de RGD encontradas en colágeno de tipo IV.

TABLA 1 Dominios RGD de Colágeno de Tipo IV Humano

1

Ejemplo 14 Anticuerpo Monoclonal XL313

El Mab XL313 se generó por inmunización con un péptido sintético, cuya secuencia se obtuvo del colágeno de tipo I humano. La secuencia se eligió debido a que está incluida dentro de la estructura tridimensional de colágeno de tipo I. La secuencia del péptido sintético de 11 restos aminoacídicos usado era:

SEC ID Nº 12:

CysGlnGlyProArgGlyAspLysGlyGluCys

La secuencia KGE (LysGlyGlu) se observó que era muy importante para el reconocimiento de XL313. El Mab XL313 se une específicamente a los péptidos de la SEC ID Nº 1, pero tiene una afinidad de unión sustancialmente disminuida por péptidos en los que se ha mutado la secuencia KGE:

SEC ID Nº 13:

CysGlnGlyProArgGlyAspAlaAlaAlaCys

El Mab denominado XL313 es un anticuerpo altamente específico que reacciona con colágeno de tipo I proteolizado/desnaturalizado. En gran medida, el XL313 no reacciona con la forma de triple hélice nativa del colágeno de tipo I. Como se muestra en la Figura 27, el Mab XL313 reconoce un dominio críptico de colágeno humano I, pero no otros péptidos similares. Estos datos sugieren que el Mab XL313 puede ser un reactivo útil para evaluar el papel del dominio de colágeno críptico definido por el péptido de colágeno humano 2 en la angiogénesis y crecimiento del tumor. Como se muestra en la Figura 28, el Mab XL313 reconoce específicamente un dominio críptico en el colágeno I humano que no está expuesto en la conformación de triple hélice madura. Además, este dominio críptico parece ser específico para el colágeno I ya que XL313 no presenta reactividad cruzada con colágeno IV de triple hélice nativo.

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Ejemplo 15 El Mab XL313 Inhibe la Adhesión y Migración Celular

Como se muestra en la Figura 23, al final de 5 horas de incubación, las HUVEC que se habían dejado unir a colágeno I nativo formaron una monocapa confluente. Por el contrario, las HUVEC unidas a colágeno desnaturalizado comenzaron a migrar y a reorganizarse morfológicamente para formar estructuras similares a cordón. Estos datos sugieren que los dominios crípticos ocultos en la estructura tridimensional del colágeno I humano, que no se pueden evaluar en su estado de triple hélice nativo, pueden desempeñar un papel en morfogénesis y formación de cordón endotelial.

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Ejemplo 16 El Colágeno Desnaturalizado Suprime la Apoptosis

Como se muestra en la Figura 24, las interacciones de células endoteliales humanas con colágeno proteolizado suprimen la apoptosis en comparación con colágeno I nativo o células endoteliales mantenidas en suspensión. Estos datos sugieren que los dominios crípticos ocultos en la estructura tridimensional de colágeno I humano, que no se pueden evaluar en su estado de triple hélice nativo, pueden desempeñar un papel en la supervivencia de células endoteliales.

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Ejemplo 17 El Epítopo Reconocido por XL313

Como se muestra en la Figura 25, el péptido críptico de colágeno humano 2 parece soportar la supervivencia de células endoteliales y la formación de cordón, mientras que péptidos crípticos similares presentes en colágeno I humano muestran poco o ningún efecto. Estos datos sugieren que la región críptica del colágeno I definido por el péptido 2 puede desempeñar un papel importante en la angiogénesis y el crecimiento de tumor in vivo.

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Ejemplo 18 Papel de Integrinas

Como se muestra en la Figura 26, la integrina \alpha\mu\beta3 parece desempeñar un papel principal en la mediación de las interacciones celulares con todos los dominios de péptido críptico de colágeno I ensayados. De manera interesante, el péptido 2 también era dependiente de la interacción de la integrina \beta1. Estos datos sugieren que el péptido 2 soporta interacciones celulares por 2 integrinas distintas.

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Ejemplo 19 El Mab XL313 Inhibe la Angiogénesis y el Crecimiento del Tumor

Como se muestra en las Figuras 29 y 30, la administración Sistémica del Mab XL313 inhibió la angiogénesis el modelo de CAM de pollo en más del 95% en comparación con controles. Estos datos sugieren que el dominio críptico de colágeno I definido por el Mab XL313 desempeña un papel importante en la angiogénesis.

Como se muestra en la Figura 31, el Mab XL313 inhibe potencialmente el crecimiento de tumor de fibrosarcoma HT1080 in vivo. Estos hallazgos indican que el dominio críptico definido por el Mab XL313 puede desempeñar un papel significativo en la regulación del crecimiento de tumor in vivo.

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Ejemplo 20 La Proteolisis de Colágeno es Importante para el Crecimiento del Tumor

Como se muestra en la Figura 32, en este experimento se usaron ratones transgénicos en los que se introdujo una mutación en el sitio de escisión de MMP de la molécula de colágeno I, ya que esos ratones tienen una capacidad alterada de proteolizar su colágeno I. En gran medida, las células de melanoma B16 mostraron poca, o ninguna, capacidad de formar tumores en ratones que muestran proteolisis de colágeno I alterada en comparación con ratones de control de tipo silvestre. Estos datos sugieren que la proteolisis de colágeno I desempeña un papel importante en el crecimiento del tumor in vivo.

Como se demostró con células de melanoma B16, las células de carcinoma de pulmón de Lewis mostraron poca o ninguna capacidad de formar tumores cuando se inyectaron en ratones transgénicos B6 Col al que tenían capacidad alterada de proteolizar su colágeno I, mientras que las células de carcinoma de pulmón de Lewis forman tumores de crecimiento rápido en ratones B6 de control (Figura 33). En gran medida, el Mab XL313, dirigido específicamente a un dominio críptico en el colágeno I que se expone solamente después de proteolisis, inhibió el crecimiento del tumor de carcinoma de pulmón de Lewis en ratones B6 de tipo silvestre aproximadamente el 80%. Los hallazgos sugieren que la exposición proteolítica del dominio críptico de colágeno I in vivo puede desempeñar un papel importante en el crecimiento del tumor. Además, estos datos sugieren que el Mab XL313 es un inhibidor específico de la angiogénesis y el crecimiento del tumor in vivo.

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<110> Universidad de California del Sur

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<120> Método y composición para la inhibición de la angiogénesis

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<130> UNI 31061

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<140> 00904246.6

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<141> 06-01-2000

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<150> US 60/114 877

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<151> 06-01-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/114 878

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<151> 06-01-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/143 534

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<151> 13-07-1999

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<150> US 60/152 496

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<151> 02-09-1999

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<160> 13

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 1

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\hskip1cm

3

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 2

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\hskip1cm

4

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 3

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\hskip1cm

5

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 4

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\hskip1cm

6

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 5

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\hskip1cm

7

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 6

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\hskip1cm

8

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 7

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\hskip1cm

9

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 8

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\hskip1cm

10

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<210> 9

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 9

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\hskip1cm

11

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<210> 10

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 10

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\hskip1cm

12

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<210> 11

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Colágeno de Tipo IV Humano

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<400> 11

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\hskip1cm

13

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<210> 12

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de colágeno de tipo-I humano

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<400> 12

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\hskip1cm

14

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<210> 13

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia ID Nº 12 en la que se ha mutado la secuencia (LysGlyGlu)

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<400> 13

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\hskip1cm

15

Claims (30)

1. Uso de un antagonista que se une específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados pero se une a la forma de triple hélice nativa de cada uno de dicho colágeno o colágenos con afinidad sustancialmente reducida, en el que dicho antagonista inhibe la angiogénesis, en el que dicho antagonista es un anticuerpo para la fabricación de una composición para la inhibición de la angiogénesis en un tejido inducida por inflamación, psoriasis, degeneración macular o reestenosis o durante el crecimiento de tumor o metástasis.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha afinidad reducida es aproximadamente 3 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado, preferiblemente aproximadamente 5 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado, más preferiblemente aproximadamente 10 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho colágeno desnaturalizado es colágeno de tipo I desnaturalizado, colágeno de tipo II desnaturalizado, colágeno de tipo III desnaturalizado, colágeno de tipo IV desnaturalizado o colágeno de tipo V desnaturalizado.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que tiene la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma HUI77 (Número de Acceso de ATTC PTA-6551), HUIV26 (Número de Acceso de ATTC PTA-6563) o XL313 (Número de Acceso de ATTC PTA-6552).

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado o modificado químicamente.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicho antagonista se conjuga con agentes citotóxicos o citostáticos.

8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha composición se administra por vía intravenosa, por vía transdérmica, por vía intrasinovial, por vía intramuscular, por vía intratumoral, por vía intraocular, por vía intranasal, por vía intratecal, por vía tópica, por vía oral, en conjugación con quimioterapia o junto con radiación.

9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tejido está presente en un mamífero, especialmente en el que el tejido es artrítico, ocular, retiniano o hemangioma.

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tumor o la metástasis es un melanoma, carcinoma, sarcoma, fibrosarcoma, glioma o astrocitoma.

11. Un antagonista, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados pero que se une a la forma de triple hélice nativa de cada uno de dicho colágeno o colágenos con afinidad sustancialmente reducida, en el que dicho antagonista inhibe la angiogénesis y es un anticuerpo que tiene la especificidad de unión de anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma HUI77 (Número de Acceso de ATTC PTA-6551), HUIV26 (Número de Acceso de ATTC PTA-6563) o XL313 (Número de Acceso de ATTC PTA-6552).

12. El antagonista de la reivindicación 11, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado o modificado químicamente.

13. El antagonista de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.

14. El antagonista de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que dicho antagonista se conjuga con agentes citotóxicos o citostáticos.

15. Uso de un antagonista que se une específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados pero que se une a la forma de triple hélice nativa de cada uno de dicho colágenos o colágenos con afinidad sustancialmente reducida, en el que dicho antagonista inhibe la angiogénesis y en el que dicho antagonista es un anticuerpo para la preparación de una composición de diagnóstico, donde dicha composición es capaz de detectar angiogénesis, tumores o inversión tumoral en un tejido poniendo en contacto la composición con dicho tejido.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha afinidad reducida es aproximadamente 3 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado, preferiblemente aproximadamente 5 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado, más preferiblemente aproximadamente 10 veces menor que la de para dicho colágeno desnaturalizado.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho colágeno desnaturalizado es colágeno de tipo I desnaturalizado, colágeno de tipo II desnaturalizado, colágeno de tipo III desnaturalizado, colágeno de tipo IV desnaturalizado o colágeno de tipo V desnaturalizado.

18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que tiene la especificidad de unión de anticuerpo monoclonal HUI77 (Número de Acceso de ATTC PTA-6561), HUIV26 (Número de Acceso de ATTC PTA-6563) o XL313 (Número de Acceso de ATTC PTA-6552).

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado o modificado químicamente.

20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo monoclonal.

21. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que dicho tejido está ex vivo o en el que dicho tejido está in vivo y dicho antagonista se administra por vía intravenosa, por vía transdérmica, por vía intrasinovial, por vía intramuscular, por vía intratumoral, por vía intraocular, por vía intranasal, por vía intratecal, por vía tópica o por vía oral.

22. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que dicho antagonista se conjuga con un fluorocromo, marcador radioactivo, metal pesado paramagnético, colorante de diagnóstico o enzima.

23. Un método para seleccionar antagonistas que se unen específicamente a un colágeno o colágenos desnaturalizados para inhibir la angiogénesis que comprende:

(a)

proporcionar un supuesto antagonista;

(b)

medir la primera afinidad de dicho supuesto antagonista por un colágeno desnaturalizado seleccionado entre el grupo que consiste en los colágenos de tipo I, II, III, IV y V;

(c)

medir la segunda afinidad de dicho supuesto antagonista por un colágeno nativo seleccionado entre el grupo que consiste en los colágenos de tipo I, II, III, IV y V, en el que dicho colágeno nativo seleccionado es la forma nativa del colágeno desnaturalizado seleccionado;

(d)

seleccionar al menos un antagonista de colágeno desnaturalizado de la pluralidad de supuestos antagonistas que tienen dicha segunda afinidad que es sustancialmente menor que dicha primera afinidad;

(e)

medir la inhibición de la angiogénesis en presencia de dicho al menos un antagonista de colágeno desnaturalizado; y

(f)

seleccionar un antagonista de colágeno desnaturalizado que inhiba la angiogénesis.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho supuesto antagonista es un compuesto no peptídico, preferiblemente un compuesto orgánico pequeño o un oligonucleótido.

25. El método de la reivindicación 23, en el que dicho supuesto antagonista es un polipéptido, un péptido lineal o un péptido cíclico.

26. El método de la reivindicación 23, en el que dicho supuesto antagonista es un anticuerpo monoclonal o uno policlonal.

27. El método de la reivindicación 23, en el que dicha primera y dicha segunda afinidad se miden por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

28. El método de la reivindicación 23, en el que dicha segunda afinidad es aproximadamente 3 veces menor que dicha primera afinidad, preferiblemente, dicha segunda afinidad es aproximadamente 5 veces menor que dicha primera afinidad, en particular, dicha segunda afinidad es aproximadamente 10 veces menor que dicha primera afinidad.

29. Un método para explorar antagonistas de colágeno desnaturalizado que comprende seleccionar un antagonista por la capacidad de competir con un antagonista de la reivindicación 13 por la unión a un epítopo en colágeno desnaturalizado.

30. Un péptido que consiste en una secuencia que codifica un epítopo reconocido por un antagonista de la reivindicación 11, en el que dicho péptido es la SEC ID Nº: 12.