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KR20130135869A - 항 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및 이를 포함하는 종양의 진단, 예방 또는 치료용 약제 - Google Patents

항 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및 이를 포함하는 종양의 진단, 예방 또는 치료용 약제 Download PDF

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KR20130135869A
KR20130135869A KR1020137014769A KR20137014769A KR20130135869A KR 20130135869 A KR20130135869 A KR 20130135869A KR 1020137014769 A KR1020137014769 A KR 1020137014769A KR 20137014769 A KR20137014769 A KR 20137014769A KR 20130135869 A KR20130135869 A KR 20130135869A
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KR
South Korea
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amino acid
seq
collagen
monoclonal antibody
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020137014769A
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English (en)
Inventor
마코토 모리타
아리히로 토무라
칸 사이가
토시히코 하야시
히데미츄 수지하라
카주히로 토쿠나가
타카미치 사토
야수타다 이마무라
Original Assignee
니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 filed Critical 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

단일 클론 항체로서, 상기 단일 클론 항체는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며, 그리고 상기 단일 클론 항체는 항-NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)의 하이브리도마 주에 의하여 생산되는 단일 클론 항체.

Description

항 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및 이를 포함하는 종양의 진단, 예방 또는 치료용 약제{ANTI SINGLE-STRAND TYPE-IV COLLAGEN POLYPEPTIDE ANTIBODY, AND PHARMACEUTICAL, OR AGENT FOR DIAGNOSING, PREVENTING OR TREATING TUMORS, CONTAINING SAME}
본 발명은 제4형 콜라겐 유전자 산물의 단쇄 형(single-chain form)으로 분비되는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 결합하고, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 종양 조직의 성장을 억제하는 단일 클론 항체(monoclonal antibody)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 포함하는 종양의 진단, 예방 또는 치료용 약제에 관한 것이다.
살아있는 조직은 생명의 단위인 세포들로 구성되어 있으며, 세포외 기질이 세포 주변 또는 세포 사이에 존재한다. 세포외 기질은 주로 콜라겐, 라미닌, 엘라스틴 및 프로테오글리칸과 같은 당-변형 단백질로 구성된 거대한 단백질 복합체이다. 콜라겐은 생체 단백질의 약 30%를 차지하고, 결합 조직들에서 풍부하게 발견된다. 또한, 콜라겐은 상피 조직과 결합 조직 사이의 경계 또는 내피 조직과 결합 조직 사이의 경계에서 기저막을 구성한다. 세포외 기질의 기능은 세포 성장 및/또는 분화를 조절하는 데 관여하는 것으로 알려져 있다. 세포외 기질과 세포 간의 상호작용은 정상 조직의 발달, 회복, 재생 등에 중요한 것으로 나타났다.
또한, 이러한 세포외 기질과 세포 간의 상호작용은 종양 형성 동안 종양 세포 성장 및 혈관신생에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 종양 세포들은 세포외 기질의 반복적인 분해 및 개조에 의해 세포외 미세환경을 재구성한다. 그 결과, 종양 세포의 성장 또는 신생 혈관의 형성이 촉진되어 종양 조직이 성장하게 된다. 또한, 종양 세포의 침윤 및/또는 전이가, 개조된 세포외 기질의 분해에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있다.
콜라겐은 20 여종 이상의 다양한 유전자형을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 제4형 콜라겐이 주로 기저막에 존재하는 반면, 제 1 형 콜라겐은 섬유 아세포(fibroblast), 간질 세포(interstitial cells) 등으로 구성된 결합 조직에 주로 존재한다.
제4형 콜라겐은, 섬유 아세포 또는 간질 세포외에도 상피 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 세포들로부터 분비된다. 분비된 제4형 콜라겐 분자들은 다른 것들과 연결되어 그물 구조를 갖는 기저막 골격을 구성하는 것으로 여겨진다. 정상 조직의 기저막은 상피 조직과 간질 조직 사이의 경계, 내피 조직과 간질 조직 사이의 경계 등에 존재하여 조직 형태 및 기능을 조절한다.
콜라겐 분자는, 3 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 우회선 삼중 나선구조(loose right-handed triple helix structure)를 갖고, 각각은 좌회선 나선(left-handed helix )을 형성한다. 제4형 콜라겐은 6 종의 유전자형을 포함한다. 이러한 6 개의 유전자들로부터 유래된 α1 내지 α6 폴리펩타이드 사슬들이 알려져 있고, 이들은 다양하게 결합하여 3 종 이상의 분자적 종류를 형성하는 것으로 생각된다. 가장 널리 발견된 기저막은, 분자간 이황화 결합(intermolecular disulfide bonds)을 통하여 교차-연결된(cross-linked) 2 개의 α1 폴리펩타이드 사슬과 1 개의 α2 폴리펩타이드 사슬을 갖는 제4형 콜라겐분자들의 집합체(aggregate)들로 구성되어 있다. 이와 대조적으로, α3 내지 α6 폴리펩타이드 사슬로 구성된 제4형 콜라겐 분자들은 조직 내 제한된 수의 기저막에서만 발견된다.
상술한 바와 같이, 제4형 콜라겐은 분자간 이황화 결합으로 교차-결합된 3 개의 α 폴리펩타이드 사슬들에 의하여 형성된 삼중 나선 구조를 갖는 삼량체(trimer) 분자 또는 이러한 삼량체 분자들의 집합체를 의미한다. 일반적으로, 제4형 콜라겐은 삼량체 분자로 세포외 분비되어 세포 외부에 집합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명자들은 배양된 인체 세포들이 제4형 콜라겐 뿐 만 아니라, 분자간 이황화 결합을 갖지 않거나 나선 구조를 갖지 않는 제4형 콜라겐의 단일 폴리펩타이드 사슬(이하, 또한“단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드”라고 한다) 또한 분비한다는 것을 발견하였다(참조 NPL 1). 특히, 비타민 C가 없는 배지에서 배양된 세포들은 제4형 콜라겐보다 더욱 많은 양의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 생산한다(참조 NPL 2). 또한, 제4형 콜라겐은 단백질-분해 효소(겔라티나제, 매트릭스 메탈로프로테아제-2, 등)에 의하여 분해되는 것으로 알려져 있다. 나선 구조의 결여 때문에, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 삼중 나선 구조를 갖는 제4형 콜라겐보다 분해 효소에 의하여 더욱 분해되기 쉽다. 따라서, 전체-길이의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인 비보 상에서 검출하는 것은 어렵다고 추측되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 인체 태반에서 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발견하였다(참조 NPL 3).
본 발명자들은 추가적으로, 세포로부터 분비된 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드가 제4형 콜라겐과는 상이한 번역후 변형(posttranslational modification)을 겪는다는 것을 밝혀냈다. 제4형 콜라겐에서의 프롤린 히드록실화(hydroxylation) 및 리신 히드록실화는 삼중 나선 구조의 형성 및/또는 안정화에 참여하는 반면, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에서의 프롤린 히드록실화(hydroxylation) 및 리신 히드록실화 정도가 제4형 콜라겐과 비교하여 낮은 것으로 알려져 있다. 또한, 제4형 콜라겐이 Agaricus bisporus agglutinin (ABA) 렉틴에 반응하지 않는 반면, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 당 사슬 Galß1-3GalNAc을 인식하는 Agaricus bisporus agglutinin (ABA) 렉틴에 반응한다.
상술한 바와 같이, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는, 제4형 콜라겐 또는 이들의 변성으로 초래된 폴리펩타이드와 상이한 화학적 구조를 갖는다. 따라서, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 제4형 콜라겐과 상이한 생물학적 기능을 갖는 것으로 추정된다.
고형 종양은 자신의 성장을 위하여 신생 혈관을 필요로 한다. 이러한 이유로, 혈관신생의 억제는 종양 성장을 억제하는 방법 중의 하나이다. 제4형 콜라겐은 교원성(collagenous) 및 비-교원성(non-collagenous) 구역을 갖는다. C-말단(C-terminal) 비-교원성 구역이 포함된 폴리펩타이드인 아레스텐(Arresten)은 점차적으로 내강(lumen) 형성을 억제하고 혈관 신생을 억제하여, 종양 성장의 억제를 초래한다(참조 NPL 4).
혈청 내 제4형 콜라겐을 검출하는 분석 키트에 포함된 JK199(참조 PTL 1) 및 항체들은 제4형 콜라겐에 대한 단일 클론 항체들로 보고된 바 있다(참조 NPL 5, NPL 6 및 PTL 2).
또한, 크립틱 콜라겐 위치(cryptic collagen site, 참조 PTL 3) 상에서 작용하는 항체가, 변성된 제4형 콜라겐에 대한 단일 클론 항체로 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 항체들이, 세포외 분비되어 안정적으로 존재하는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식하는 지에 대하여 개시되거나 제시된 바가 없다.
한편, JK132(참조 NPL 1 및 NPL 7)은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식하는 항체로서, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식하는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 이러한 보고들은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 생물학적 역할 또는 그것의 암과의 연관성을 밝히지 않고 있다. 따라서, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함하는 약제가 종양 진단제 및 치료제로 유용하다는 것이 개시되거나 제시된 바가 없다.
인용 목록
특허 문헌
PTL 1: Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A) No. 63-78067
PTL 2: JP-A No. 2-1553
PTL 3: JP-A No. 2009-240324
비-특허 문헌
NPL 1: Takahashi, S. et al., Connective Tissue (1999) vol. 31; pp. 161-168
NPL 2: Yoshikawa, K. et al., J. Biochem. (2001) vol. 129; pp. 929-936
NPL 3: Kajimura, D. et al., Biochemical and Biophisical Research Communication (2004) vol. 314; pp. 11-16
NPL 4: Thomas M. Mundel et al., Microvascular Research (2007) vol. 74; pp. 85-89
NPL 5: Instruction manual of the type IV collagen assay kit “Panassay IV-C Latex”; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. (2006 revised edition)
NPL 6: Obata, K. et al., Clinical Chimica Acta 181, pp. 293-304, 1989
NPL 7: Iwata, N. et al., Journal of Biochemistry (1995) vol. 117 (6); pp. 1298-1304
본 발명은 상술한 종래 기술들의 문제점들을 해결하고, 종양 조직 선택성에 있어서 탁월한 단일 클론 항체, 상기 단일 클론 항체를 포함한 약제 및 상기 단일 클론 항체를 포함한 암의 치료 또는 진단에 유용한 암 진단, 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명자들은 목적을 달성하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 다음과 같은 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다: 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 인간 암 세포주, 암-발생 동물의 암 조직 및 인체 임상 종양에서 높게 발현되며; 그리고 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체는 암-발생 동물의 암 조직의 성장을 억제하였다.
본 발명은 본 발명자들에 의하여 획득된 발견들을 기반으로 하며, 그 문제들을 해결하기 위한 수단은 다음과 같다:
<1> 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고, 항-NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)의 하이브리도마 주에 의하여 생산되는 단일 클론 항체.
<2> <1>에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<3> <1>에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<4> 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<5> 상기 <1>의 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하는 단일 클론 항체.
<6> <2>에 있어서, 상기 단일 클론 항체에 포함되는 상기 H 사슬은 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 L 사슬은 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<7> <3>에 있어서, 상기 단일 클론 항체에 포함되는 H 사슬은 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 L 사슬은 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<8> <4>에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<9> <5> 내지 <8> 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 인간화(humanized)된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<10> 상기 <1>의 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region), 및 인간 항체를 포함하며, 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 상기 인간 항체에 그래프팅 된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<11> 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체.
<12> 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체.
<13> GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체.
<14> <11> 내지 <13> 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 인간화(humanized)된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
<15> 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)인 하이브리도마 주.
<16> <1> 내지 <14> 중 어느 하나의 단일 클론 항체를 포함하는 약제.
<17> <1> 내지 <14> 중 어느 하나의 단일 클론 항체를 포함하는 종양 진단, 예방 또는 치료용 약제.
<18> <17>에 있어서, 상기 종양은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 암 세포들을 포함하는 종양인 것을 특징으로 하는 종양 진단, 예방 또는 치료용 약제.
<19> 상기 <1>, <2>, <4> 내지 <6>, <8> 내지 <11>, <13>, 및 <14> 중 어느 하나의 단일 클론 항체의 일부 구조(partial structure)로서, 상기 일부 구조는 상기 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하며, 그리고 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체의 일부 구조.
<20> 상기 <1>, <3> 내지 <5>, <7> 내지 <10>, 및 <12> 내지 <14> 중 어느 한 항의 단일 클론 항체의 일부 구조(partial structure)로서, 상기 일부 구조는 상기 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하며, 그리고 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체의 일부 구조.
본 발명은 상술한 종래 기술들의 문제점들을 해결하고 그 목적을 달성할 수 있다. 특히, 본 발명은 종양 조직 선택성에 있어서 탁월한 단일 클론 항체, 상기 단일 클론 항체를 포함한 약제 및 상기 단일 클론 항체를 포함한 암의 치료 또는 진단에 유용한 암 진단, 예방 또는 치료제를 제공한다.
도 1은 종양 세포주(인간 간암 세포주 HLF 또는 인간 신장암 세포주 UO31)에서의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현을 보여주는 도표이다. 웨스턴 블롯팅결과 JK132 및 Ab6586(Abcam plc. 제작) 모두는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식하는 항체로 나타났다. 용어 “삼중-사슬 COL4(triple-chain COL4)”는 3 개 사슬끼리 분자간 이황화 결합을 유지하는 SDS-변성 제4형 콜라겐을 의미한다. 용어 “단쇄 COL4(single-chain COL4)”는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 의미한다. 환원 처리 표시 “-”는 전기영동 시료용 완충액 용액에 2-머캅토에탄올이 없는 것을 의미한다. 환원 처리 표시 “+”는 전기영동 시료용 완충액 용액이 2-머캅토에탄올을 포함하는 것을 의미한다.
도 2는 암-발생(인간 폐암 Lu65A) 누드 랫트에서의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현을 보여주는 도표이다. 용어 “삼중-사슬 COL4(triple-chain COL4)”는 3 개 사슬끼리 분자간 이황화 결합을 유지하는 SDS-변성 제4형 콜라겐을 의미한다. 용어 “단쇄 COL4(single-chain COL4)”는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 의미한다. 환원 처리 표시 “-”는 전기영동 시료용 완충액 용액에 2-머캅토에탄올이 없는 것을 의미한다. 환원 처리 표시 “+”는 전기영동 시료용 완충액 용액이 2-머캅토에탄올을 포함하는 것을 의미한다.
도 3은 폐암 환자로부터 획득한 인간 임상 폐암 조직과 인간 임상 정상 폐 조직 간의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현 수준을 비교한 결과를 보여주는 도표이다. 용어 “삼중-사슬 COL4(triple-chain COL4)”는 3 개 사슬끼리 분자간 이황화 결합을 유지하는 SDS-변성 제4형 콜라겐을 의미한다. 용어 “단쇄 COL4(single-chain COL4)”는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 의미한다.
도 4는 인간 간암 세포주 HLF에 의해서 생산된 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 정제 산물을 보여주는 도표이다. 용어 “MW"는 분자량 마커를 의미한다.
도 5는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체(NK46141)가 특이적으로 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식한다는 것을 보여주는 도표이다. 용어 “Sup.”은 인간 간암 세포 HLF의 배양 상층액을 의미한다. 용어 “CNT"는 면역침강용 제1차 항체를 포함하지 않은 음성대조군으로 이용된 PBS를 의미한다. 용어 “IgG2b"는 마우스 IgG2b 이형 대조군을 의미한다.
도 6은 인간 폐암 Lu65A가 피하 이식된 누드 마우스 암 발생 모델에서 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체(NK46141)가 암의 성장을 억제한다는 것을 보여주는 도표이다. 열린 삼각형은 대조군을 의미한다. 열린 원은 본 발명의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체(NK46141)를 투여한 투여군을 의미한다.
도 7a는 전체-길이(full-length, FL) 야생형 제4형 콜라겐 α1 유전자(COL4A1) 및 변이체 COL4A1 발현 벡터들을 이용하여 발현된 야생형 재조합 단백질(FL) 및 변이체 재조합 단백질(Δ29-488, Δ29-989 및 Δ29-1,066)을 도식적으로 나타낸 도표이다.
도 7b는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체(NK46141)에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 좁히기 위하여 실시한 웨스턴 블롯팅 결과를 보여주는 도표이다. 용어 “Mock"은 음성 대조군을 의미한다. JK132는 유전자 발현 확인을 위한 대조군을 의미한다.
도 8a는 변이체 COL4A1 발현 벡터들을 이용하여 발현된 변이체 재조합 단백질들(990-1,066myc, 990-1,019myc 및 1,020-1,066myc)을 도식적으로 나타낸 도표이다. 용어 “myc"는 유전자 발현 확인을 위하여 추가한 마커를 의미하며, 이는 항-myc 항체에 의하여 인식된다.
도 8b는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체(NK46141)에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 좁히기 위하여 실시한 웨스턴 블롯팅 결과를 보여주는 도표이다. 용어 “Mock"은 음성 대조군을 의미한다. 항-myc 항체는 유전자 발현 확인을 위한 대조군을 의미한다.
도 9a는 전체-길이(full-length, FL) 야생형 COL4A1 및 변이체 COL4A1 발현 벡터들을 이용하여 발현된 야생형 재조합 단백질(FL) 및 변이체 재조합 단백질(Δ1,020-1,066, Δ1,020-1,049 및 Δ1,050-1,066)을 도식적으로 나타낸 도표이다.
도 9b는 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 좁히기 위하여 실시한 웨스턴 블롯팅 결과를 보여주는 도표이다. 용어 “Mock"은 음성 대조군을 의미한다. JK132는 유전자 발현 확인을 위한 대조군을 의미한다.
도 10은 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 좁히기 위하여 실시한 도트 블롯 결과를 보여주는 도표이다. #1은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 37을 나타내고; #2는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 38을 나타내며; #3은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 39을 나타내고; #4는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 40을 나타내며; #5는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 41을 나타내고; 그리고 #6은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 42을 나타낸다.
(단일 클론 항체)
본 발명의 단일 클론 항체(이하, “항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체” 또는 “NK46141”으로도 부른다)은 하기 구현예 1-3을 포함한다.
구현예 1에 따른 단일 클론 항체는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체로, 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)의 하이브리도마 주에 의하여 생산된 항체이다. 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141의 하이브리도마 주를 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (receipt date: October 5, 2010)에 국제적으로 기탁하였다.
구현예 2에 따른 단일 클론 항체는 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체 또는 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체이다.
구현예 3에 따른 단일 클론 항체는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체이다.
구현예 1-3의 모든 단일 클론 항체는 특이적으로 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 결합한다. 이러한 단일 클론 항체들이 상술한 바와 같이 각각의 특징을 갖는 한, 구현예 1-3의 단일 클론 항체는 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
본 발명에서, “단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드”는 세포로부터의 제4형 콜라겐 유전자 산물의 단쇄 형태로 분비되는 단백질을 의미한다. 일반적으로, “제4형 콜라겐”은 분자간 이황화 결합을 통하여 교차-연결된 3 개의 제4형 콜라겐 유전자 산물들로 구성된 삼중 나선 구조를 갖는 단백질을 의미한다. 이와 대조적으로, “단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드”는 분자간 이황화 결합을 갖지 않는다.
단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(분자량: 약 180kDa)은 제4형 콜라겐(분자량: 약 500kDa)의 환원에 의하여 획득된 단량체(monomer) 또는 이들의 변성으로 초래된 폴리펩타이드와는 상이한 화학적 구조를 갖는다. 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 제4형 콜라겐보다 하이드록실화된 프롤린 잔기 또는 하이드록실화된 리신 잔기가 적은 비율을 차지한다. 제4형 콜라겐과 달리, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 Agaricus bisporus agglutinin (ABA) 렉틴에 의하여 인식되는 당 사슬 Galß1-3GalNAc을 갖는다. 또한 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드는 유전적 다형성 형태(polymorphic form), 유전자 변이체(gene variant), 스플라이싱 변이체(splicing variant) 및 이들의 번역후 변형(posttranslational modification) 변이체도 포함한다.
단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 생산하는 세포는 자연적으로 발생한 세포 또는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 세포일 수 있다. 세포는, 상기 세포들이 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 생산하는 한 특별히 제한되지 않는다. 재조합 세포는 당업계에 공지된 접근법에 의하여 획득될 수 있다.
본 발명에서, “단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체”(항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체)는, 상기 항체가 제4형 콜라겐을 인식하지 않고 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 한 그의 기원, 유형, 형태 등에 의해 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 단일 클론 항체에 제한되지 않는다. 다클론 항체도 본 발명의 범위에 포함된다.
다클론 항체는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드로 감작화된(sensitized) 동물의 혈청 면역글로불린 분획물로부터 당업계에 공지된 접근법에 의하여 획득될 수 있다. 이 점에서, 감작화된 동물은, 상기 동물이 다클론 항체를 생산하는 한 그의 종에 의하여 제한되지 않는다.
<구현예 1>
구현예 1에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)의 하이브리도마 주에 의하여 생산되는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 그 자체일 수 있다. 또한, 예를 들어, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부 구조를 포함하는 키메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체 또는 마우스 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 항체들 중, 인간화 항체 또는 인간 항체가 특히 바람직하다.
일부 구조는, 상기 일부 구조가 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부인 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 구조는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)에 결합하는 Fab, F(ab’)2, 가변 부위(variable region, V region), CDR(complementarity determining region) 및 단쇄 항체(single-chain antibody, scFv)를 포함하는 일부 구조를 포함한다.
“키메릭 항체”는 2 개 이상의 상이한 항체로부터 유래된 부위를 포함하는 항체를 의미한다. 일 구현예에서, 키메릭 항체는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 가변 부위로부터 유래된 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 키메릭 항체는 다수의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체로부터 유래된 가변 부위를 포함한다.
“인간 항체”는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 부위를 갖는 항체를 의미한다. 또한 인간 항체를 제작하는 기술은 당업계에 공지되었으며, 유전자 공학 방법에 기반한 제작 방법은 이미 정립되어 있다.
“인간화 항체”는 1 개 이상의 비-인간 포유류(예컨대, 마우스) 항체의 CDR을 인간 항체의 CDR 상으로 그래프팅(grafting)함으로써 제작된 항체를 의미한다. 이들의 일반적인 유전자 재조합 방법들 또한 공지되어있다(참조 EP Patent Application Publication No. EP125023 및 International Publication No. WO 96/02576).
특히, 공지된 방법은 다음과 관련이 있다: 인간 항체 프래임워크 부위(Framework Regions, FRs)에 결합되는 마우스 항체 CDR을 코딩하는 DNA 서열의 디자인; CDR 및 FR 모두의 말단 부위를 오버랩핑(overlapping)하는 부위를 갖도록 제작된 여러 개 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하는 PCR에 의한 DNA 서열의 합성; 및 상기 합성된 DNA 서열을 이용하는 인간화 항체의 생산(International Publication No. WO 98/13388에 개시된 방법 참조).
CDR을 통하여 결합되는 인간 항체 FR은, 항원에 대하여 높은 결합 친화성을 갖는 항체의 항원-결합 부위(antigen-binding site)를 형성한 것들로부터 선택된다. 필요하다면, 항체 가변 부위의 FR의 아미노산를 치환하여 항원에 대하여 높은 결합 친화성을 갖는 항체의 항원-결합 부위를 형성할 수 있다.
CDR은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 부위에서 발견되는 비연속적인 항원-결합 부위를 의미한다. 이러한 특정 부위는 당업계에 공지되었으며, Kabat et al. (J. Biol. Chem., 252: 6609-6616 (1977)), Kabat et al. (United States Department of Health and Human Services (HHS), “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)), Chothia et al. (J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)), 및 MacCallum et al. (J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996))에 의해서 서술되었다.
또한, 이러한 부위들은 IMGT/LIGM-DB 데이터 베이스[Giudicelli et al., 2006, Nucleic Acids Research 34 (Database Issue): D781-D784; and Lefranc et al., 1995, LIGM-DB/IMGT: An Integrated Database of Ig and TcR, Part of the Immunogenetics Database. Annual of the New York Academy of Science 764 (1), 47-47 doi; 10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x (http://www.imgt.org/IMGTlect/)], IMGT Repertoire database (http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/), IMGT/GENE-DB 데이터 베이스 [Giudicelli et al., 2005, Nucleic Acids Res., 2005 Jan 1; 33 (Database Issue): D256-61 (http://www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect)], 및 Kabat 데이터 베이스 (http://www.kabatdatabase.com)와 같은 일부 데이터 베이스로부터 이용가능하다.
구현예 1에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 바람직하게는 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열 및 제 11서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열 및 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 L 사슬을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 L 사슬의 조합, 또는 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 CDR을 포함하는 L 사슬의 조합이다.
구현예 1에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체에서의 서열목록 제 5 서열 내지 제 16 서열의 CDR 아미노산 서열 중 최소 어느 하나는, 1 개 또는 여러 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 추가에 의한 아미노산 서열 유도체일 수 있다.
또한, 구현예 1에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 바람직하게는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 항체이다. 상기 에피토프에서, SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열은, 1 개 또는 여러 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 추가에 의한 아미노산 서열 유도체일 수 있다.
구현예 1에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 자체 이외에도, 예컨대, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부 구조 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
일부 구조는, 상기 일부 구조가 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부인 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 구조는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)에 결합하는 Fab, F(ab’)2, 가변 부위(variable region, V region), CDR(complementarity determining region) 및 단쇄 항체(single-chain antibody, scFv)를 포함하는 일부 구조를 포함한다.
< 구현예 2>
구현예 2에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 그것이 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체, 또는 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체인 한 특별히 제한되지 않는다. 구현예 2에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
구현예 2에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 예를 들어,본 발명의 범위에 속하는 H 사슬 및 L 사슬을 포함하는 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 마우스 항체도 포함한다.
구현예 2에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체에서의 서열목록 제 5 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열 중 최소 어느 하나는, 1 개 또는 여러 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 추가에 의한 아미노산 서열 유도체일 수 있다.
구현예 2에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 자체 이외에도, 예컨대, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부 구조 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
일부 구조는, 상기 일부 구조가 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부인 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 구조는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)에 결합하는 Fab, F(ab’)2, 가변 부위(variable region, V region), CDR(complementarity determining region) 및 단쇄 항체(single-chain antibody, scFv)를 포함하는 일부 구조를 포함한다.
< 구현예 3>
구현예 3에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 그것이 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 한특별히 제한되지 않는다. 구현예 3에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
구현예 3에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는, 예를 들어,본 발명의 범위에 속하는 SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열을 인식하는 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 마우스 항체도 포함한다. 이러한 항체들 중, 인간화 항체 또는 인간 항체가 특히 바람직하다.
상기 에피토프에서, SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열은, 1 개 또는 여러 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 추가에 의한 아미노산 서열 유도체일 수 있다.
구현예 3에 따른 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 자체 이외에도, 예컨대, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부 구조 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
일부 구조는, 상기 일부 구조가 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 일부인 한 특별히 제한되지 않는다. 일부 구조는 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)에 결합하는 Fab, F(ab’)2, 가변 부위(variable region, V region), CDR(complementarity determining region) 및 단쇄 항체(single-chain antibody, scFv)를 포함하는 일부 구조를 포함한다.
본 발명에서, “에피토프(epitope)”는 항체가 결합하는 단백질(항원)의 특정 부위를 의미한다. 이 특정 부위는 선형(linear) 및 비선형(nonlinear) 에피토프 모두를 포함한다.
당업계에 공지된 분자 생물학, 세포 공학 또는 생화학적 방법은 에피토프를 식별하는 방법으로 이용될 수 있다.
이하, 에피토프를 식별하는 방법은 예로써 보여줄 수 있다.
총 RNA를 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 생산하는 인간 세포주로부터 획득하고, 상기 총 RNA를 이용하여 전체-길이 제4형 콜라겐 α1 유전자(COL4A1, NCBI Gene ID: 1282)를 클로닝해서 COL4A1 발현 벡터(야생형)을 제작한다. 다음으로, 클로닝된 COL4A1 cDNA를 주형으로 하여 다양한 변이체 COL4A1 발현 벡터(변이체)들도 제작한다. 상기 제작된 야생형 또는 각 변이체 COL4A1 발현 벡터를 적절한 배양된 세포주(예, 인간 세포주)에 도입하여 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 일시적으로 과발현시킨다. 상기 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 일시적으로 과발현하도록 배양된 세포의 상층액 또는 추출액은, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 제1차 항체로 하는 웨스턴 블롯팅에 이용하여 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체에 의하여 인지되는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 에피토프를 확인할 수 있다.
이 방법외에도, 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 일부 서열을 갖는 펩타이드를 화학적으로 합성하고, 상기 펩타이드를 이용하는 도트 블롯, ELISA 등에 의하여, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체에 의해 인지되는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 에피토프를 확인할 수 있다.
택일적으로, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체에 의하여 인지되는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 에피토프는 이러한 2 가지 방법의 조합에 의하여 확인할 수 있다.
<<항- 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 제작 방법>>
구현예 1-3의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 제작 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 방법들 중에서 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 면역학적 방법, 파지 디스플레이(phage display) 방법 및 리보솜 디스플레이(ribosome display) 방법을 포함한다. 이들 방법 중에서, 면역학적 방법이 바람직하다.
다음으로, 면역학적 방법에 의한 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 제작은 예로써 보여줄 수 있다.
면역학적 방법에 이용되는 항원은 특별히 제한되지 않으며, 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 화학적 합성된 항원, 재조합 항원 및 생물학적 시료로부터 정제된 항원을 포함한다. 이러한 항원들은 단독, 또는 2 종 또는 그 이상의 조합으로 이용될 수 있다. 이들 항원들 중에서, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 전체-길이 아미노산 서열을 갖는 단백질이 항원으로 바람직하게 이용된다. 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 제작에서, 효과적인 면역-유도 효과는 항원의 저분자량으로 인하여 예측되지 않을 수 있다. 이러한 경우, 담체(carrier) 단백질과 콘쥬게이션(conjugated)된 항원이 바람직하게 이용된다.
담체 단백질은 특별히 제한되지 않으며, 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 KLM(keyhole light hemocyanin), BSA(bovine serum albumin) 및 OVA(ovalbumin)을 포함한다. 이러한 담체 단백질들은 단독, 또는 2 종 또는 그 이상의 조합으로 이용될 수 있다.
항원과 담체 단백질을 콘쥬게이션하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 carbodiimide 방법, glutaraldehyde 방법, diazo condensation 방법 및 maleimidobenzoyloxy-succinimide (MBS) 방법을 포함한다.
택일적으로, 항원을, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(또는 이의 일부)와 GST, β-갈락토시다제, 말토즈-결합 단백질 또는 히스티딘 태그의 융합 단백질로 발현시키고, 항원으로 이용할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 종래 널리 이용되는 방법에 의하여 정제될 수 있다.
면역학적 방법에 의하여 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 제작하는 방법의 구체적인 예로는 다음과 같은 관련 방법을 포함한다: 항원으로 대상 동물을 감작; 필요시, 감작에 의한 면역화(immunization) 반복; 충분한 항체 역가 상승 후 동물로부터 혈액 채집; 및 원심분리 처리에 의한 혈청 획득. 항체-생산 세포들은, 항체 역가가 충분히 상승된 후 면역화된 동물로부터 분리한다.
다음으로, 상기 획득된 항체-생산 세포들을 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 획득한다. 이어서, 이러한 하이브리도마를 단일 클론으로 제작한다. 그 후, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 대하여 높은 특이성을 갖는 항체를 생산하는 클론을 선별한다. 선별된 클론의 배양액을 정제하여 목표로 하는 항체를 획득한다.
택일적으로, 하이브리도마를 원하는 수 또는 그 이상으로 성장시키고, 동물에게 복강 내 이식한 후, 복수액을 정제하여 목표로 하는 항체를 획득한다.
배양액의 정제물 또는 복수액의 정제물은, 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A를 이용하는 친화성 크로마토그래피를 실시할 수 있다. 택일적으로, 이러한 친화성 크로마토그래피는 고상에 고정화된 항원으로 실시될 수 있다. 또한, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 분획법 및 원심분리와 같은 방법들을 이용할 수 있다. 이러한 방법들은 단독 또는 임의의 조합으로 이용된다.
단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체의 예로는 본 발명의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 뿐만 아니라 JK132(참조 NPL1 및 NPL7)와 같이 당업계에 공지된 항체들도 포함한다. 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)에 대하여 높은 친화성을 갖기 때문에, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체는 당업계에 공지된 항체들보다 더욱 유리하다.
( 하이브리도마 주)
본 발명의 하이브리도마 주를 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141 주로 명명하고, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan)에 국제적으로 기탁하여 기탁 번호(Accession No: FERM BP-11300 (receipt date: October 5, 2010)를 부여받았다.
하이브리도마 주는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 생산할 수 있다.
(약제)
본 발명의 약제는 최소한 본 발명의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조를 포함하고, 추가적으로 필요시, 추가적인 성분들을 포함한다. 본 발명에서, 일부 구조는 바람직하게는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 CDR 또는 항원 인식 부위, 즉, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 항원-결합 부위를 포함한다.
본 발명의 약제는, 바람직하게는 하기와 같이 본 발명의 암의 진단, 예방 또는 치료용 약제(예컨대, 항암제)로 이용된다.
본 발명의 약제는 또한, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 외에 약제학적 용도를 위하여 담체를 추가적으로 포함한다.
약제학적 용도의 담체는, 상기 담체가 인간 또는 비-인간 포유류에게 투여하는 데 적합하고 생리적으로 허용되는 한 어떠한 용매, 분산매, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 강장제, 흡수-지연제도 특별히 제한되지 않는다.
약제학적 용도의 담체의 구체적인 예로는 단독 또는 조합으로 이용되는 물, 식염수, 인산-완충 식염수, 글루코오스, 글리세린 및 에탄올을 포함한다. 많은 경우, 상기 조성물은, 바람직하게는 강장제의 역할을 하는 물질, 예컨대, 당류, 다가 알코올(예를 들어,만니톨 또는 소르비톨) 또는 소디윰 클로라이드를 포함한다. 약제학적 용도의 담체는 추가적으로 미량의 습윤제, 유화제, 방부제 또는 완충제를 보조 물질을 포함한다. 이러한 물질들은 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 또는 이의 일부 구조의 저장 안정성 또는 효율성을 향상시키는데 유리하다.
<제형>
약제의 제형은 특별히 제한되지 않는다. 약제학적 제약은, 예컨대, 액체, 반고체 및 고체 제형이다. 이들의 구체적인 예로는 용액(예, 주사 용액 및 불용성 용액), 분산제, 현탁제, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌약을 포함한다.
제형은 투여 경로 및 지시에 따라 적합하게 선택된다. 주사 제형이 바람직하다. 주사 제형의 바람직한 조성의 예로는 주사 용액 또는 불용성 용액의 제형을 포함하고, 특히 근육 내 주사에 적합한 제형을 포함하며, 바람직하게는 피하 주사이다.
또한, 약제는, 상기 약제가 생산 및 저장 조건하에서 살균 및 안정화되는 한 제한 없이 투여에 적합한 어떠한 용액, 마이크로유화제, 분산제, 리포좀 형태 및 다른 형태일 수 있다. 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조는 필요한 양의 적합한 용매를 포함하고, 필요시에는 상술한 성분들의 단독 또는 조합을 포함한다. 그 후에, 상기 혼합물을 여과함으로서 멸균하여 주사 멸균 용액을 제조할 수 있다.
일반적으로, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조는 기본적인 분산 배지 및 상술한 필수 추가 성분(들)을 포함하는 멸균 배지에 포함되어 분산제를 제조한다. 주사 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조에 의한 획득과 관련이 있고, 임의의 필요한 추가 성분들과 활성 성분의 분말은 용액으로부터 이미 여과하여 멸균했다. 예를 들어, 분산시 필요한 입자 크기는 레시틴과 같은 코팅제를 이용하여 유지할 수 있는 반면, 용액의 적합한 분산성은 표면 활성 물질을 이용하여 유지할 수 있다. 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수-지연제는 조성물에 포함되어 주사 조성물의 지속적인 흡수를 달성할 수 있다.
<투여>
약제학적 제약의 투여 경로는 바람직하게는 정맥, 피하, 복강, 근육 투여를 포함하는 비경구적 경로가 바람직하다. 피하 투여가 바람직하다. 주사 외에, 임플란트 및 경피 패치를 이용할 수 있다. 마이크로캡슐 전달 시스템을 포함하는 조절-방출 제조법과 같이, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이들의 일부 구조의 빠른 방출을 막는 담체를 이용하여 활성 화합물을 제조할 수 있다(참조 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). 에틸렌-비닐 아세테이트, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜 에시드, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 또는 폴리락틱 에시드과 같은 생분해성 또는 생체 적합성 고분자를 이용할 수 있다.
택일적으로, 약제는 경구로 투여될 수 있다. 이 경우, 바람직하게는, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조를, 화합물의 불활성을 막는 물질로 코팅한다. 또는 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조를, 불화성을 막는 물질과 동시에 투여한다.
예를 들어, 약제는 하드 또는 소프트 젤라틴 캡슐로 밀봉(enclosed)되고/또는 압축되어 정제를 제조할 수 있다. 선택적으로, 약제는 비활성 희석제 또는 흡수 및 식용가능한 담체와 함께 경구로 투여할 수 있다. 또한, 약제는 시험 대상의 음식에 직접적으로 포함시킬 수 있다. 치료를 위한 경구 투여와 연관하여, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조는 부형제로 포함될 수 있으며, 정제, 설하 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁제, 시럽제 또는 카체트제(cachet)와 같은 섭취용 제형으로 이용될 수 있다.
약제의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조의 내용물은 특별히 제한되지 않으며, 치료 또는 예방 목적에 따라 적합하게 조정된다.
이들의 실제 용량은, 예컨대, 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중에 따라 적절하게 조정된다. 본 발명에서, 예방용 투여는 수술 후 재발 예방 또는 질병의 초기 단계에서 악화를 억제하기 위한 투여를 의미한다.
일회량은 특별히 제한되지 않으며, 목적에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 일회량은 일반적으로 0.1 mg/kg-250 mg/kg이며, 보다 바람직하게는 0.5 mg/kg-50 mg/kg, 특히 바람직하게는 약 5 mg/kg이다. 용량은 치료 될 수 있는 증상에 따라 각각의 투여시마다 조정할 수 있다. 택일적으로, 이 범위를 벗어나는 용량은 환자의 증상, 일반적인 상태 등에 따라 고려하여 적용할 수 있다.
약제의 투여 일정은 어떠한 일회성 투여 및 연속적인 투여도 될 수 있다. 또한, 기간 동안 투여 후 약제를 투여하지 않는 휴약기를 둘 수 있으며, 그 후 투여를 재개할 수 있다.
약제학적 투여는 1 종 또는 그 이상의 추가적인 약제의 조합으로 이용될 수 있다. 조합될 수 있는 약제는 증상 또는 부작용을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에서, 겸용은 또한 본 발명의 약제와 추가적인 약제의 제형 뿐 만 아니라 본 발명의 약제와 추가적인 약제의 동시적 투여 또는 거의 동시적 투여도 포함한다.
본 발명의 약제와 결합 할 수 있는 약제는 증상에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들의 예로는 다음을 포함한다: 항암 활성을 갖는 약제, 예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 플라티늄-포함 약제; 시클로포스파미드 및 멜팔란과 같은 알킬화제; 젬시타빈, TS-1, 5-플루오로우라실 및 메토트렉세이트와 같은 대사성 길항제; 블레오마이신, 다우노마이신, 아드리아마이신과 같은 항암 항생제; 이리노테칸, 파클리탁셀, 에토포시트 및 빈크리스틴과 같은 알칼로이드; 호르몬과 같은 항암제; 에를로티닙, 제피티닙 및 소라페닙과 같은 분자적 타겟 약제; 및 트라스투주맙 및 베바시주맙과 같은 항체 약제.
예방용 약제 또는 약제학적 조성물로 이용되는 약제의 제형, 투여 경로, 복용량, 투여 일정은 치료 용도와 동일하다.
본 발명의 약제는 또한 치료용 키트를 포함한다. 상기 치료용 키트는 본 발명의 약제 또는 약제학적 조성물 및 이의 겸용을 위한 1 종 또는 그 이상의 추가적인 약제를 포함한다.
본 발명의 진단, 예방 또는 치료에 의한 타겟은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 진단, 예방 또는 치료는 폐암, 위암, 간암, 대장암, 신장암, 췌장암, 담낭암 및 난소암과 같은 모든 고형암과 조혈 기관 종양에 적용될 수 있다. 본 발명에 의하여, 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드가 발현되는 것으로 확인된 환자를 진단, 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 진단, 예방 또는 치료를 실시하기 위하여, 본 발명의 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및/또는 이의 일부 구조 단독, 본 발명의 약제 및 본 발명의 약제학적 조성물을 이용할 수 있다.
예방을 위한 약제 및 약제학적 조성물로서 본 발명의 약제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 상기 약제 및 약제학적 조성물은 고형암 수술 후 전이 예방 및 재발 예방을 위한 예방제로 효과적으로 이용된다.
(종양 진단 또는 예방제 또는 항암제)
본 발명의 종양 진단제 또는 예방제 또는 항암제는 최소한 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 포함한다. 종양 진단제는 진단용 키트의 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 본 발명에 포함된다.
종양 진단 키트는 최소한 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 포함하며, 필요시, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체가 있는 표지 물질 또는 고상 시약 또는 이의 고정화된 표지 산물을 추가적으로 포함할 수 있다.
항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 표지 산물은 효소, 방사성 동위 원소, 형광 화합물 또는 화학 발광 화합물로 표지된 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 의미한다. 상기 키트는 효소-표지 산물의 경우, 상술한 성분들 외에도, 검출용 다른 시약들, 예를 들어, 효소 기질(발색 기질), 효소 기질-분리 용액, 효소 반응 정지 용액, 또는 시료 희석제를 추가적으로 포함한다.
항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 이용하는 종양 검출은 다음에 의해서 실시될 수 있다: 항원-항체 반응을 통한 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 또는 이들의 구조와 시료(시험 대상으로부터 획득된 생물학적 시료, 예컨대, 혈액)의 결합; 및 결합된 항체의 양을 기초로 하여 시료 내의 목표로 하는 항원(단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드)의 양 측정.
항원의 양은 당업계에 공지된 면역학적 분석에 따라 검출될 수 있다. 예컨대, 면역 침강법, 면역응집법(immunoagglutination), 표지 면역분석법, 면역비탁법(immunonephelometry), 웨스턴 블롯팅 및 유세포분석법을 이용할 수 있다.
표지 면역분석법에서, 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 시그널은, 표지 항체를 이용하여 직접적으로 검출된 표지의 양에 의하여 나타나고, 공지된 농도 또는 공지된 항체 역가를 갖는 항체의 기준 용액을 이용하여 상대적인 값으로 나타낼 수 있다. 특히, 기준 용액 및 시료는 측정기를 이용하여 분석되며, 시료 내 항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체의 시그널은 기준 용액의 값에 대한 상대적인 값으로 나타낼 수 있다. 표지 면역분석법의 예로는 ELISA, EIA, RIA, 형광 면역분석법(FIA) 및 발광 면역분석법을 포함한다. 이들 방법들 중에서, ELISA가 편의성 및 고감도 측면에서 바람직하다.
항-단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체를 이용한 종양 검출을 기반으로, 검출 방법에 의하여 획득된 검출결과를 지표로 하여 종양의 상태를 평가하거나 또는 진단할 수 있다. 예를 들어, 소정의 기준치와 동일하거나 낮은 검출 결과를 갖는 시료는 종양-음성이고 반면, 소정의 기준치를 초과하는 검출 결과를 갖는 시료는 종양-양성으로 제공된다. 상기 양성 시료는, 어떠한 종양에 의하여 이미 영향을 받았을 가능성이 있는 것으로 결정하고 종양의 상태에 대하여 평가할 수 있다.
종양의 상태는 진행된 종양의 존재 유무 또는 그것의 진행 정도를 의미한다. 이들의 예로는 진행된 암의 존재 유무, 그것의 진행 정도, 악성 정도, 전이 유무 및 재발 유무를 포함한다. 상기 평가를 위하여, 종양의 이러한 상태들 중 하나가 선택될 수 있거나, 2 개 또는 그 이상의 적합한 조합으로 선택될 수 있다.
종양의 존재 유무를 평가하기 위하여, 진행된 종양의 존재 유무는 검출 결과들을 기초로 한 역치값인 소정의 기준치로 확인된다. 종양의 악성 정도는 암이 진행된 정도를 나타내는 지표로 사용된다. 악성 정도는 검출 결과를 기초로 한 단계 분류에 의하여 평가되거나 초기 암 및 진행 암으로의 분류에 의하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 지표인 검출 결과들로서 종양을 초기 암 또는 진행 암으로 평가할 수 있다. 종양의 전이는, 최초의 종양이 있는 위치에서 떨어진 위치에서 신생 종양이 나타나는 지의 여부를 기초로 한 검출 결과들을 지표로 하여 평가된다. 종양의 전이는, 암의 휴식 기간 또는 차도 후 획득된 결과가 소정의 기준치를 초과하는 지의 여부를 기초로 하여 평가된다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 별도로 기술되어 있지 않는 한, 실시예에 상술된 상업적으로 이용 가능한 시약들은 제조사가 제공하는 지시에 따라 이용하였다.
(실시예 1)
인간 간암 세포주 HLF(RIKEN CELL BANK로부터 획득) 및 인간 신장암 세포주 UO31(국립암연구소에서 제작)을 37℃, 5% CO2 조건하에서 10% FBS(Tissue Culture Biologicals Inc.)가 보충된 RPMI1640 배지(Mediatech Inc.)를 이용하여 각각 배양하였다. 세포가 일정 수로 증식하게 되면, 배지를 혈청-제거 RPMI1640 배지로 바꾸고 48 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양 상층액을 회수하였다. 상기 배양 상층액에 전기영동 시료용 4 X 완충액[8(질량/부피)% 소디윰 도데실 설페이트(SDS), 40(부피)% 글리세롤, 20(부피)% 2-머캅토에탄올, 0.008(질량/부피)% 브롬페놀 블루, 0.25 M 트리스-HCl, pH 6.8(하기 실시예에서 이용된 전기 영동 시료용 완충액은 본 조성과 동일한 조성으로 이용하였다)]을 1/4(부피 대비)의 양으로 첨가하였고, 상기 혼합물을 90℃에서 5 분간 가열하여 시료를 준비하였다[환원 처리(+)]. 또한, 2-머캅토에탄올을 첨가하지 않은 전기영동 시료용 4 X 완충액으로 상술한 바와 동일한 방법으로 시료를 준비하였다[환원 처리(-)].
이러한 시료들은 XV PANTERA MP 시스템(D.R.C. Co.,Ltd.)를 이용하여 4.5(질량/부피)% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 수행하고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 트랜스퍼시켰다. 각 시료 당 2 개의 PVDF 막을 준비하여 5(질량/부피)% 탈지유로 블록킹을 한 후, JK132(항-인간 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드 마우스 단일 클론 항체, Yasutada Imamura 교수 제공(Animal Cell Technology Laboratory, Department of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Kogakuin University); 이하, 동일한 항체를 이용하였다) 또는 Ab6586 (항-제4형 콜라겐 래빗 다클론(polyclonal) 항체(Abcam plc.); 이하, 동일한 항체를 이용하였다)의 항체 용액에 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-트윈20(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1 (부피)% 트윈20)으로 10분씩 3 번 세척한 후, 상기 막을 2차 항체인 HRP-표지 항-마우스 IgG 항체(GE Healthcare Japan Corp.)의 항체 용액에 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-트윈20으로 10분씩 3 번 세척한 후, 상기 막을 ECL 플러스(GE Healthcare Japan Corp.)에 반응시켜 화학발광시키고 X-레이 필름에 감광하였다.
상기 결과들은 도 1에 나타내었다. 항체 Ab6586 및 JK132는 1 개 또는 이동성이 서로 다른 2 개의 밴드를 갖는 동일한 밴드 패턴들로 실질적으로 검출되었다. 환원되지 않은 시료[환원 처리(-)]로부터, 2 개의 단백질들을 검출하였다: (1) 작은 이동성을 가지며 분자간 이황화 결합(intermolecular disulfide bonds)이 유지되는 SDS-처리 제4형 콜라겐(도 1에서 “삼중-사슬 COL4(triple-chain COL4)”로 표시), 및 (2) 큰 이동성을 가지며 분자간 이황화 결합이 원천적으로 결여된 약 180-kDa 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(도 1에서 “단쇄 COL4(single-chain COL4)”로 표시). 환원된 시료[환원 처리(+)]로부터, 분자간 이황화 결합이 결여된 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(2)와 동일한 이동성을 갖는 1 개의 밴드만을 검출하였다. 환원된 시료[환원 처리(+)]의 밴드는 다음을 포함한다: 분자간 이황화 결합이 유지되는 SDS-처리 제4형 콜라겐(1)의 분자간 이황화 결합 절단으로 인한 단일 사슬; 및 분자간 이황화 결합이 결여된 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(2). 따라서, 이러한 암 세포주들은 분자간 이황화 결합을 갖지 않는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 것으로 확인되었다.
(실시예 2)
누드 랫트(F344/N-rnu/rnu, 7-주령, CLEA Japan, Inc. 제작)에 피하 이식된 인간 폐암 Lu65A(JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)로부터 획득)의 종양 덩어리를 약 3 mm 사각형의 블록으로 잘라서, 투관침을 이용하여 누드 랫트의 등 부위에 피하 이식하였다. 종양의 부피가 약 200 mm3 이상이 되면, 암 조직을 회수하였다. 상기 조직들에 습중량의 4 배 양으로 조직 추출 완충액(pH 7.4, 0.1 M NaCl/PBS, 5 mM EDTA, 단백질 분해효소 억제제 칵테일(F. Hoffmann-La Roche Ltd.), 1 mM PMSF)을 첨가하여 균질화하였다. 그 후, 상기 균질액을 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 원심분리 상층액을 회수하였다. 상기 배양 상층액에 전기영동 시료용 4 X 완충액을 1/4(부피 대비)의 양으로 첨가하였고, 상기 혼합물을 90℃에서 5 분간 가열하여 시료를 준비하였다[환원 처리(+)]. 또한, 2-머캅토에탄올을 첨가하지 않은 전기영동 시료용 4 X 완충액으로 상술한 바와 동일한 방법으로 시료를 준비하였다[환원 처리(-)].
이러한 시료들은 XV PANTERA MP 시스템(D.R.C. Co.,Ltd.)를 이용하여 4.5(질량/부피)% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 수행하고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 트랜스퍼시켰다. 각 시료 당 2 개의 PVDF 막을 준비하여 5(질량/부피)% 탈지유로 블록킹을 한 후, JK132 또는 Ab6586의 항체 용액에 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-트윈20(20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1 (부피)% 트윈20)으로 10분씩 3 번 세척한 후, 상기 막을 2차 항체인 HRP-표지 항-마우스 IgG 항체 또는 항-래빗 IgG 항체(GE Healthcare Japan Corp.)에 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-트윈20으로 10분씩 3 번 세척한 후, 상기 막을 ECL에 반응시켜 화학발광시키고 X-레이 필름에 감광하였다.
상기 결과들은 도 2에 나타내었다. 항체 JK132 및 Ab6586은, 환원되지 않은 시료[환원 처리(-)]로부터, 분자간 이황화 결합을 갖지 않는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드(도 2에서 “단쇄 COL4(single-chain COL4)”로 표시)의 밴드로 검출되었다. 따라서, 상기 인간 폐암 Lu65A의 종양 조직은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 것으로 확인되었다.
JK132 항체는 인간 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드와는 반응하나, 마우스 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드와는 반응하지 않으므로, 상기 인간 폐암 Lu65A의 종양 조직들(누드 랫트에 피하 이식된 인간 종양 조직)은 Lu65A 세포들로부터 유래된 인간 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 것으로 확인되었다.
(실시예 3)
실시예 1의 인간 간암 세포주 HLF 및 인간 신장암 세포주 UO31을 인간 암 세포주들[Lu65A (JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources)로부터 획득), NCI-H460 (National Cancer Institute 제작), NCI-H226 (National Cancer Institute 제작), MDA-MB-157 (ATCC(American Type Culture Collection)로부터 획득), A498 (ATCC로부터 획득), Panc-1 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University로부터 획득), OVCAR3 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University로부터 획득), 및 HT1080 (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 제조)]로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1에서 이용된 것과 동일한 방법으로 각각의 인간 암 세포주에서 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현을 확인하였다.
또한, 실시예 2의 인간 폐암 Lu65A을 HLF(RIKEN CELL BANK로부터 획득)로 변경한것을 제외하고는, 실시예 2에서 이용된 것과 동일한 방법으로 누드 랫트에 피하 이식된 인간 종양 조직의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현을 확인하였다.
또한, 폐암 환자들로부터 획득된 인간 임상 폐암 조직들(Asterand plc. 제작, Sample IDs: 110443A1, 112523A1, 107811A1, 111540B1, 112294A1, 및 111541A1) 또는 인간 임상 정상 폐 조직들(Asterand plc. 제작, Sample IDs: 98859B2, 112279B1, 및 112301B1)에 각각 습중량의 4 배 양으로 조직 추출 완충액(pH 7.4, 0.1 M NaCl/PBS, 5 mM EDTA, 단백질 분해효소 억제제 칵테일(F. Hoffmann-La Roche Ltd.), 1 mM PMSF)을 첨가하여 균질화하였다. 그 후, 상기 균질액을 12,000 rpm에서 5 분간 원심분리하고, 원심분리 상층액을 회수하였다. 상기 배양 상층액에, 2-머캅토에탄올을 제외하고는 상술한 바와 동일한 전기영동 시료용 4 X 완충액을 1/4(부피 대비)의 양으로 첨가하였고, 상기 혼합물을 90℃에서 5 분간 가열하여 시료를 준비하였다[환원 처리(-)].
폐암 환자들로부터 획득된 인간 임상 폐암 조직들 및 인간 임상 정상 폐 조직들의 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현에서, 내부 기준인 ß-액틴의 양을 평가하기 위하여 항-ß-액틴 항체(Sigma-Aldrich Corp.)를 이용하였다.
인간 임상 조직인 암 조직들 및 정상 폐 조직들은 전문가들에 의해 병리학적으로 진단되었음을 밝힌다.
실시예 1에서 이용된 것과 동일한 방법으로 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현이 확인된 인간 암 세포주(인 비트로) 및 실시예 2에서 이용된 것과 동일한 방법으로 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현이 확인된 인간 종양 조직(인 비보; 누드 랫트에 피하 이식)의 결과들은 실시예 1 및 2와 함께, 표 1에 나타내었다. 또한, 인간 임상 폐암 조직들 및 인간 임상 정상 폐조직들의 결과들은 도 3에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 10 종의 인간 암 세포주 및 누드 랫트에 피하 이식된 2 종의 인간 종양 조직에서 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현을 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 6 례의 인간 임상 폐암 조직 모두에서 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 고발현을 확인하였다. 이와는 대조적으로, 폐암 환자로부터 획득된 인간 임상 정상 폐 조직들에서는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드의 발현이 약하게 관찰되었다.
(인 비트로) (인 비보)
폐암 Lu65A Lu65A
NCl-H460
NCl-H226
유방암 MDA-MB-157
간암 HLF HLF
신장암 UO31
A498
췌장암 Panc-1
난소함 OVCAR3
섬유육종 HT1080
상술한 결과들은, 표 1에서 나타난 바와 같이 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드가 인간 암 세포주들 및 누드 랫트에 피하 이식된 인간 종양 조직들에서 발현된다는 것을 나타냈다. 또한, 도 3의 결과들은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드가 종양 조직들에서 특이적으로 높게 발현된다는 것을 나타냈다.
( 실시예 4)
< 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드의 제작>
- 세포 및 배양
인간 간암 세포주 HLF(RIKEN CELL BANK)을 37℃, 5% CO2 조건하에서 10부피% FBS(Tissue Culture Biologicals Inc.)가 보충된 RPMI1640 배지(Mediatech Inc.)를 이용하여 배양한 후, 유지하였다.
- 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드의 제작-
단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드를, 혈청-제거 RPMI1640 배지(Mediatech Inc.)에서 7 일 간 배양된 인간 간암 HLF 세포로부터 Takahashi, S. 그룹 (Takahashi, S. et al., “Connective Tissue” (1999) vol. 31; pp. 161-168)의 방법을 참조하여 면역 친화성-정제하였다.
요약하자면, 처음에 JK132 항체 4.2 mg을 HiTrap NHS-activated HP 컬럼(GE Healthcare Japan Corp.) 상에 고정화하여 JK132 친화성 컬럼을 제작하였다. 상기 JK132 친화성 컬럼을 0.2 M 글리신-HCl(pH 2.5)으로 세척하였다. 배양 상층액 450 mL을 JK132 친화성 컬럼 1 mL에 적용하였다. PBS(phosphate-buffered saline)로 세척한 후, 0.2 M 글리신-HCl(pH 2.5)으로 회수된 분획물들은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 상기 회수된 용출-분획물을 투석한 후, 동결-건조하여 -80℃에 보관하였다. 폴리아크릴아미드 겔 4.5(질량/부피)%로 전기영동한 후, 정제된 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드를 은 염색(silver staining, Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.)한 결과들은 도 4에 나타내었다. Precision Plus Protein Standard Dual Color(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 분자량(MW) 마커로 이용하였다.
( 실시예 5)
<단일 클론 항체( NK46141 )의 스크리닝>
-면역-
각 암컷 Balb/c 마우스(Japan SLC, Inc.)에, 실시예 5에서 제작된 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(항원)을 복강 내 주사하여 면역화하였다. 초기 면역을 위하여, 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드 100 g 또는 20 g을 완전 프루이드 어쥬반트(complete Freund's adjuvant, Difco Laboratories, Inc. 제조)와 함께 각 마우스에 투여하였다. 연속 주사를 위하여, 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드 20 g 내지 50 g을 RIBI 어쥬반트(Corixa Corp. 제조)와 함께 각 마우스에 투여하였다. 면역화는 2-주 내지 3-주 간격으로 수행하였다. 최종 면역화 7 일 후, 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드 25 g 을 포함한 PBS를 추가(booster)하여 상기 동물의 항체 역가를 강화하였다.
- 하이브리도마의 제작-
추가 접종 3 일 후, 일반적인 방법에 따라 높은 항체 역가로 면역화된 동물들로부터 비장 세포들을 준비하였다. 폴리에틸렌 글리콜 4000(Sigma-Aldrich Corp.)를 이용하여 상기 비장 세포들을 P3.X63-Ag8.653 마우스 골수종 세포(ATCC, #CRL-1580)와 융합시켰다. 당업계에 공지된 Kohler 및 Milstein의 기술에 따라, 마이크로타이터 플레이트(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제작)를 이용하여 HAT 배지 [RPMI1640(Invitrogen Corp.)에 FBS 10질량%(HyClone; Thermo Fisher Scientific Inc. 제조), 500 M D(+)-글루코오스(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조), 페니실린-스트렙토미신(Invitrogen Corp. 제조) 2질량%, 100 M 하이포크산틴 소디윰(Invitrogen Corp. 제조), 0.1 M 아미노프테린(Invitrogen Corp. 제조), 및 16 M 티미딘(Invitrogen Corp. 제조)를 현탁하여 준비; 하기 실시예들에서, HAT 배지는 본 조성과 동일한 조성을 갖는다]에서 하이브리도마 세포들을 선별하였다.
-항체 역가 측정-
하이브리도마 선별 후, 하기와 같이 ELISA를 이용하여 면역화된 동물의 항체 역가를 측정하였다. 첫 번째로, 마이크로타이터 플레이트(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제작)를 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(항원)으로 코팅하였다. 그 후에, 혈청을 연속적으로 희석한 희석액들을 1(질량/부피)% BSA/TBS(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)-0.05(부피)% 트윈 20으로 블록킹된 웰에 첨가하고 인큐베이션하였다. 마우스 면역글로불린에 대한 퍼록시다아제-콘쥬게이티드 항체를 이용하여 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(항원)이 결합된 항체를 검출하였다.
- ELISA 에 의한 하이브리도마 스크리닝-
단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(항원)(농도: 50 mM 카보네이트 완충액 중 1 g/mL)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제작)에 상온에서 2 시간 동안 고정화하였다. 그 후에, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 플레이트 표면 상의 비 흡착 부위(Free adsorbing portions)를 상온에서 30 분 동안 1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20으로 블록킹하였다. 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 다시 세척하였다. 하이브리도마 배양 상층액을 각 웰에 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 그 후에, 여기에 1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20에 희석된 퍼록시다아제-콘쥬게이티드 항-마우스 IgG 항체(BETHYL Laboratories, Inc., #E90-131) 50 L/웰을 첨가하였다. 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션 한 후, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하고, 기질 용액(시트레이트 완충액(pH 5), 0.05(질량/부피)% o-페닐렌디아민, 0.03부피% H2O2) 100 L/웰을 웰에 첨가하였다. 20 분 내지 30 분 후, 2 N 황산을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 분광 광도계를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기와 같이 획득된 하이브리도마주는 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141 (이하, “#141주(line)”를 의미)로 명명하고, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (receipt date: October 5, 2010)에 국제적으로 기탁하였다.
-단일 클론 항체의 정제-
37℃, 5% CO2 조건하에서 HAT 배지를 이용하여 항체-생산 하이브리도마 #141주를배양해서 배양 상층액을 준비하였다. 또한, 항체-생산 하이브리도마 #141주를 마우스에게 복강 내 투여하고, 7 일 내지 10 일 후 마우스의 복수액을 회수하여 필터로 여과시켜서 불용성 물질을 제거하였다.
항체-생산 하이브리도마 배양 상층액 또는 마우스 복수액을, 일반적인 방법에 따라Protein G-Sepharose 4B(GE Healthcare Japan Corp.)로 팩킹된 컬럼에 적용하여 항체 성분을 흡착하였다. 그 후, 비특이적 흡착 물질을 제거하고, 산성 조건하에서 해리된 단일 클론 항체를 회수하여 정제된 항체로 이용하였다. 완충액 교체를 위하여, 상기 획득된 정제된 항체를 100-배(부피 대비)의 양의 PBS 완충 용액으로 투석하였다. 본 발명자들은 상기 단일 클론 항체를 “NK46141”로 명명하였다.
-단일 클론 항체 NK46141 의 이형판별( isotyping )-
sandwich ELISA를 이용하여 NK46141를 이형판별하였다. 항-마우스 IgG 고트 다클론 항체(Dako Japan Inc. 제작)(고정화 항체, 50 mM 카보네이트 완충액으로 1000-배 희석)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제작)의 6 웰에 각각 50 L/웰의 농도로 분주하고, 상온에서 2 시간 동안 고정화시켰다. 그 후에, 상기 웰을 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 웰 표면 상의 비 흡착 부위(Free adsorbing portions)를 상온에서 30 분 동안 1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20으로 블록킹하였다. 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 다시 세척하였다.
NK46141-생산 하이브리도마의 배양 상층액의 50 L/웰을 여기에 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 웰을 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20으로 1000-배 희석된 검출용 6 종 항체(HRP-표지 항-마우스 IgG1 고트 항체, HRP-표지 항-마우스 IgG2a 고트 항체, HRP-표지 항-마우스 IgG2b 고트 항체, HRP-표지 항-마우스 IgG3 고트 항체, HRP-표지 항-마우스 IgA 고트 항체, 및 HRP-표지 항-마우스 IgGM 고트 항체; BETHYL Laboratories, Inc. 제작) 각 50 L을 각 웰(1 종 당 1 웰)에 첨가하였다. 상온에서 1 시간 인큐베이션 한 후, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하고, 기질 용액(시트레이트 완충액(pH 5), 0.05(질량/부피)% o-페닐렌디아민, 0.03부피% H2O2) 100 L/웰을 웰에 첨가하였다. 20 분 내지 30 분 후, 2 N 황산을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 분광 광도계를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, NK46141의 이형(isotype)은 IgG2b인 것으로 확인되었다.
- 면역침강 분석-
면역침강 분석을 위하여, 정제된 단일 클론 항체(NK46141) 0.5 g을, 실시예 1에서 이용된 것과 동일한 방식으로 배양된, 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드를 발현하는 인간 간암 세포주 HLF(single-chain type IV collagen α1 polypeptide-expressing human liver cancer cell line HLF)의 배양 상층액 500 L과 함께 4℃에서 30 분 동안 윤전(rotation)하여 인큐베이션하였다. 양성 대조군은, NK46141 대신 JK132을 이용한 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 수행하였다. 이형 대조군은, NK46141 대신 이형 대조군 마우스 IgG2b(Functional Grade, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL) 제조, M077-3M2))를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 수행하였다. 마찬가지로, 음성 대조군은, 면역침강용 제1차 항체를 포함하지 않은 PBS를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
다음으로, Dynabeads M-280 쉽 항-마우스 IgG 제2차 항체(Dynabeads-콘쥬게이티드 고트 항-마우스 IgG, VERITAS Corp. 제조, #DB11201) 10 L을 여기에 첨가하여 4℃에서 1 시간 동안 윤전하여 인큐베이션하였다. 또한, 음성 대조군으로 인간 간암 세포주 HLF의 상층 배양액에 Dynabeads M-280 쉽 항-마우스 IgG 제2차 항체를 첨가하여 상술한 바와 동일한 방법으로 인큐베이션하였다.
상기 반응 혼합물을 자석에 2 분간 세워두고, 상기 상층액을 제거하였다. 상기 Dynabeads를 세척 완충액(0.05(부피)% 트윈 20 및 2 mM EDTA를 포함한 PBS) 500 L으로 세 번 세척하였다. 상기 Dynabeads에, 2-머캅토에탄올이 없는 전기 영동 시료용 1X 완충액 50 L을 첨가하고, 상기 혼합물을 90℃에서 5 분간 가열하여 시료를 준비하였다. 상기 시료로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하고, PVDF 막으로 트랜스퍼하였다. 상기 PVDF 막을 Ab6586으로 인큐베이션하고, 실시예 1에서 이용된 것과 동일한 방법으로 분석하였다.
상기 결과들은 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 용어 "Sup."은 면역침강 전의 인간 간암 세포주 HLF의 배양 상층액을 의미하며, 몇 개의 밴드들이 Ab6586으로 검출되었다. 상기 도표에서 보여주는 바와 같이, NK46141 또는 JK132와 함께 처리한 시료의 면역침강에 의해서 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드만이 선별적으로 회수되었다. 이러한 면역침강 방법은, NK46141이 제4형 콜라겐은 인식하지 않고 선택적으로 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 인식한다는 것을 나타냈다.
이러한 방식으로, 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드를 선택적으로 인식하는 단일 클론 항체 NK46141을 획득하였다.
( 실시예6 )
<단일 클론 항체 NK46141 의 결합 친화성>
Djavadi-Ohaniance L. 그룹[Djavadi-Ohaniance L., et al., (1996) In Antibody Engineering (Eds.: McCafferty J., et al.), Chapter 4, pp. 77-97., IRL Press, Oxford.]의 방법을 참조로 한 ELISA를 이용하여, 정제된 단일 클론 항체 NK46141의 해리 상수를 확인하였다.
요약하자면, 미리 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(항원)를 고정화시킨 Immunoplate(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제조)를 제작하였다. 한편, 일정 농도(0.10 g/mL)를 갖는 JK132 및 NK46141를 각각 다양한 농도의 항원과 함께, 평형에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 용액을 ELISA 웰에 첨가하여 프리 항체(free antibody)의 양을 결정하였다. 상기 항원-항체 반응은 질량 작용의 법칙을 따르기 때문에, 측정된 값을 하기의 공식 1에 적용하였다. 하기의 공식 2의 X 및 Y를 결정하고, 그래프를 그려서 기울기(1/Kd)로부터 해리 상수를 확인하였다.
(공식 1)
x / [총 항체 농도]× 1 / [프리 항원(Free antigen)] = (1 - x / [총 항체 농도])× 1 / Kd
상기 X = x / [총 항체 농도] 및 Y = x / ([총 항체 농도] × [프리 항원]
(공식 2)
Y = (1 - X) × 1 / Kd
상기 결과들은 표 2에 나타내었다.
JK132 NK46141
해리 상수 (M) 15.3×10-8 3.4×10-8
JK132 및 NK46141는 각각 15.3×10-8 M 및 3.4×10-8 M의 해리 상수를 가지며, 이는 NK46141이 JK132보다 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드에 대하여 더 높은 친화성을 갖는다는 것을 가리킨다.
( 실시예 7)
<단일 클론 항체 NK46141 에 의하여 인식되는 에피토프 부위( epitope site )의 분석>
항원(단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드)과의 재활성을 sandwich ELISA로 평가하였다. 실시예 5에서 정제된 단일 클론 항체 NK46141(고정화되는 항체, 50 mM 카보네이트 완충액 중 5 g/mL)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc; Thermo Fisher Scientific Inc. 제작)에 상온에서 2 시간 동안 고정화시켰다. 그 후에, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 플레이트 표면 상의 비 흡착 부위(Free adsorbing portions)를 상온에서 30 분 동안 1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20으로 블록킹하였다. 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 다시 세척하였다. 상기 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드(1(질량/부피)% BSA/TBS-0.05(부피)% 트윈 20 중 1 g/mL)을 항원으로 상기 웰에 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하였다. 이어서, Peroxidase Labeling Kit-SH(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제작)를 이용하여 검출하는 HRP-표지 항체로 제작된 단일 클론 항체의 50 L/웰을 여기에 첨가하였다. 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션 한 후, 상기 플레이트를 TBS/0.05(부피)% 트윈 20으로 세척하고, 기질 용액(시트레이트 완충액(pH 5), 0.05(질량/부피)% o-페닐렌디아민, 0.03부피% H2O2) 100 L/웰을 웰에 첨가하였다. 20 분 내지 30 분 후, 2 N 황산을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 분광 광도계를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 결과들은 표 3에 나타내었다.
HRP-표지 JK132 HRP-표지 NK46141
고정화된 JK132 0.273 3.354
고정화된 NK46141 3.284 0.209
상기 실험 결과, HRP-표지 JK132 항체 및 HRP-표지 단일 클론 항체 NK46141에 대하여, 고정화된 항체인 JK132로 획득된 흡광도 값은 각각 0.273 및 3.354이었다. 이와 대조적으로, HRP-표지 JK132 항체 및 HRP-표지 단일 클론 항체 NK46141에 대하여, 고정화된 항체인 NK46141로 획득된 흡광도 값은 각각 3.284 및 0.209이었으며, 이는 JK132 및 NK46141가 단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드에 결합하는 데 있어 서로 경쟁적이지 않다는 것을 나타낸다. 이것은 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프가 JK132에 의하여 인식되는 에피토프와 상이한 부위에 위치한다는 것을 보여주며, 이는 JK132 및 NK46141가 상이한 에피토프를 인식한다는 것을 의미한다.
결합 친화도 및 인식되는 에피토프 부위에 있어서 단일 클론 항체 NK46141와 JK132 간에 차이가 있음을 나타내는 상기 분석 결과들은, NK46141 및 JK132가 상이한 활성을 갖는 항체들임을 보여준다.
( 실시예 8)
<누드 마우스에 이식된 인간 폐암 세포주에서의 항암 효과>
인간 폐암 세포주 Lu65A(JCRB로부터 획득)를 37℃, 5% CO2 조건하에서 10부피% FBS(Tissue Culture Biologicals Inc.)가 보충된 RPMI1640 배지(Mediatech Inc.)를 이용하여 배양한 후, 유지하였다. 2 × 106 세포/0.2 mL의 농도의 Lu65A 세포 현탁액을 주사기로 각 누드 마우스(Balb/cAJcl-nu/nu, 9-주령, CLEA Japan, Inc. 제작)의 등쪽 부위에 피하 이식하였다.
종양 이식 1 일 전, 암 이식 3 일, 7 일, 10 일 및 14 일 후(총 5 번), 꼬리 혈관에 단일 클론 항체 NK46141을 투여하였다. 이용 시 NK46141을 식염수(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에 희석하였다. 대조군은 식염수를 이용하였다.
Lu65A 이식 7 일, 10 일, 14 일, 17일 및 21 일 후, 종양 부피를 측정하였다. 상기 종양 부피는, 종양의 긴 축(L mm) 및 짧은 축(W mm)을 측정하여 공식(L × W2) / 2 에 따라 계산하였다.
상기 결과들은 도 6에 나타내었다. 인간 폐암 세포 Lu65A를 피하 이식한 마우스 모델의 NK46141(30 mg/kg)-투여군은, NK46141을 투여하지 않은 대조군보다 종양 부피가 유의성 있게(p value < 0.05, t-test) 작았으며, 이는 NK46141이 종양 조직의 성장을 억제한다는 것을 나타낸다.
( 실시예 9)
< NK46141 의 CDR 서열의 확인>
RNeasy(Qiagen N.V. 제작)를 이용하여 하이브리도마 #141 주로부터 총 RNA를 획득하였다. 획득된 총 RNA로부터, NK46141의 H 사슬 및 L 사슬 가변 부위를 코딩하는 cDNA를 증폭하고, 5’-RACE PCR로 클로닝하였다. NK46141 H 사슬 및 L 사슬 가변 부위의 유전자 서열(SEQ ID NOs: 1 및 2) 및 아미노산 서열(SEQ ID NOs: 3 및 4)을 DNA 시퀀싱 및 N-말단 아미노산 서열 분석에 의하여 확인하였다.
공지된 항체들의 CDR 아미노산 서열과 NK46141의 아미노산 서열을 비교하여 NK46141 CDR을 확인하였다. 특히, NK46141에 높은 상동성을 갖는 공지된 항체의 유전자에 대하여 IMGT Repertoire 데이터 베이스 (http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/), IMGT 데이터 베이스 (IMGT/LIGM-DB database (http://www.imgt.org/IMGTlect/) 및 Kabat 데이터 베이스(http://www.kabatdatabase.com)를 검색하였다. 상기 획득된 항체 유전자에 대한 CDR 아미노산 서열 정보로부터 NK46141의 CDR을 확인하였다.
상기 2 종의 IMGT 데이터 베이스에 기반한 분석 결과, H 사슬은 CDR1 서열 GFTFTDYY (SEQ ID NO: 5), CDR2 서열 ISEGGSYT (SEQ ID NO: 6) 및 CDR3 서열 ASPYYGDGGFAY (SEQ ID NO: 7)을 갖는 것으로 확인되었으나, L 사슬은 CDR1 서열 QSIVHSDGNTY (SEQ ID NO: 8), CDR2 서열 KVS (SEQ ID NO: 9) 및 CDR3 서열 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 10)을 갖는 것으로 확인되었다.
상기 Kabat 데이터 베이스에 기반한 분석 결과, H 사슬은 CDR1 서열 DYYMY (SEQ ID NO: 11), CDR2 서열 TISEGGSYTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 12) 및 CDR3 서열PYYGDGGFAY (SEQ ID NO: 13)을 갖는 것으로 확인되었으나, L 사슬은 CDR1 서열 RSSQSIVHSDGNTYLE (SEQ ID NO: 14), CDR2 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 15) 및 CDR3 서열 FQGSHVPPT (SEQ ID NO: 16)을 갖는 것으로 확인되었다.
( 실시예 10)
< NK46141 에 의하여 인식되는 에피토프 서열의 확인>
NK46141에 의하여 인식되는 에피토프 부위의 범위를 좁히기 위하여, 다양한 변이체(variant) 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드를 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
-야생형 제4형 콜라겐 α1 유전자의 클로닝 -
RNeasy(Qiagen N.V. 제작)를 이용하여 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드를 생산하는 인간 간암 세포주 HLF로부터 총 RNA를 획득하였다. 획득된 총 RNA로부터, 역전사 효소(Superscript III, manufactured by Invitrogen Corp. 제작)를 이용하여 HLF 세포-유래 cDNA를 제작하였다. 주형인 HLF 세포-유래 cDNA 및 프라이머(SEQ ID NOs: 17 및 18)를 이용하여 야생형 제4형 콜라겐 α1 유전자(COL4A1, NCBI Gene ID: 1282)를 PCR로 증폭하고, 클로닝하였다. 클로닝된 야생형 COL4A1은, DNA 시퀀싱에 의하여 어떠한 변이(variation)도 없는 것으로 확인되었다.
-야생형 COL4A1 발현 벡터의 제작-
야생형 COL4A1을 pENTR1A(Invitrogen Corp.)으로 서브클로닝하였다. LR 클로나제(Clonase, Invitrogen Corp.)를 이용하여 야생형 COL4A1 발현 벡터를 제작하였다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작-
단쇄 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드의 29-488 잔기의 아미노산을 결여시킨 변이체 COL4A1 재조합 단백질을 획득하기 위하여, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1을 다음과 같은 방법으로 제작하였다:
단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 488 잔기까지의 아미노산 결실 부위(amino acid deletion site)에 해당하는 염기를 결실시키기 위하여, 주형인 야생형 COL4A1 발현 벡터 및 프라이머(SEQ ID NOs: 19 및 20)를 이용하여 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이어서, 야생형 COL4A1 발현 벡터 제작에서 야생형 COL4A1을 PCR 산물로 변경한 것을 제외하고는, 야생형 COL4A1 발현 벡터의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 1을 제작하였다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 2의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 이용된 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 21 및 22인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 2를 제작하였다.
상기 변이체 COL4A1 발현 벡터 2는 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 989 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 3의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 이용된 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 23 및 24인 프라이머로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 3을 제작하였다.
상기 변이체 COL4A1 발현 벡터 3은 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 1,066 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
상기 제작된 야생형 COL4A1 발현 벡터 및 변이체 COL4A1 발현 벡터 1-3 각각은 COL4A1-유래 시그널 서열을 포함하므로, 포유류 세포들에 의하여 일시적으로 과발현된 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드는 배양 상층액으로 분비된다.
따라서, 상기 제작된 야생형 COL4A1 발현 벡터 및 변이체 COL4A1 발현 벡터 1-3 각각을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포(Invitrogen Corp. 제작)에 도입하여 일시적으로 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드를 발현시켰다. 이하, 야생형 COL4A1 발현 벡터를 이용하여 발현되는, 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 전체-길이 아미노산 서열을 갖는 야생형 재조합 단백질은 “FL”로 부르며; 변이체 COL4A1 발현 벡터 1을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “Δ29-488”로 부르고; 변이체 COL4A1 발현 벡터 2를 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “Δ29-989”로 부르며; 그리고 변이체 COL4A1 발현 벡터 3을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은“Δ29-1,066”로 부른다.
상기 제작된 야생형 COL4A1 발현 벡터 및 변이체 COL4A1 발현 벡터 1-3 뿐만 아니라 그것으로부터 발현된 FL, Δ29-488, Δ29-989 및 Δ29-1,066을 하기 표 4 및 도 7a에 요약하였다.
도 7a는 야생형 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드(FL) 및 상기 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드(Δ29-488, Δ29-989 및 Δ29-1,066)를 도식적으로 나타낸 도표이다.
발현 벡터 명 주형 정방향 프라이머 역방향 프라이머 재조합 단백질 아미노산 결실 부위
야생형 COL4A1 발현 벡터 HLFcDNA SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 FL -
변이체 COL4A1 발현 벡터 1 FL SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 Δ29-488 잔기 29-488
변이체 COL4A1 발현 벡터 2 FL SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 Δ29-989 잔기 29-989
변이체 COL4A1 발현 벡터 3 FL SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 Δ29-1066 잔기 29-1066
상기 분비된 야생형 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 또는 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 각각을 포함하는 배양 상층액을 회수하고, 프로브로 NK46141을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 NK46141에 대한 에피토프 범위를 좁혔다. 이 점에서, 상술한 바와 동일한 방법으로 COL4A1 유전자-제거 벡터만을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포에 도입하여, 상기 결과물인 배양 상층액을 음성 대조군(Mock)으로 이용하였다. 또한, NK46141과는 상이한 에피토프를 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 항체 JK132를, 유전자 발현 확인을 위한 대조군으로 이용하였다. 상기 결과들은 도 7b에 나타내었다.
그 결과, Δ29-1,066에 대한 어떠한 밴드도 검출되지 않았으며, 이는 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프가 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 아미노산 서열의 990-1,066 잔기에 위치한다는 것을 보여준다. JK132에 의하여 인식되는 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드의 에피토프는 아미노산 서열의 1,165-1,179 잔기에 위치하는 것으로 알려져 있다.
NK46141에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 추가적으로 좁히기 위하여, 다음과 같이 변이체 COL4A1 발현 벡터 4-6를 제작하였다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 4의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 주형으로 이용한 야생형 COL4A1 발현 벡터를 변이체 COL4A1 발현 벡터 2로 변경하고, 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 25 및 26인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 4를 제작하였다. 그 후에, C-말단(C-terminus)에서 태깅되는 myc 에피토프를 코딩하는 서열을, 일반적인 방법에 따라 변이체 COL4A1 발현 벡터 4에 추가하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 4는 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 989 잔기까지 및 1,067 잔기에서 1,669 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 5의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 4의 제작에서 이용된 프라이머 서열 SEQ ID NO. 25 및 26을 SEQ ID NO. 27 및 28인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 4의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 5를 제작하였다. 그 후에, C-말단(C-terminus)에서 태깅되는 myc 에피토프를 코딩하는 서열을, 일반적인 방법에 따라 변이체 COL4A1 발현 벡터 5에 추가하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 5는 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 989 잔기까지 및 1,020 잔기에서 1,669 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 6의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 4의 제작에서 주형으로 이용된 변이체 COL4A1 발현 벡터 2를 변이체 COL4A1 발현 벡터 4로 변경하고, 프라이머 서열 SEQ ID NO. 25 및 26을 SEQ ID NO. 29 및 30인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 4의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 6을 제작하였다. 그 후에, C-말단(C-terminus)에서 태깅되는 myc 에피토프를 코딩하는 서열을, 일반적인 방법에 따라 변이체 COL4A1 발현 벡터 6에 추가하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 6은 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 29 잔기에서 1,019 잔기까지 및 1,067 잔기에서 1,669 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
상기 제작된 변이체 COL4A1 발현 벡터 4-6 각각을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포(Invitrogen Corp. 제작)에 도입하여 일시적으로 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드를 배양 상층액에서 발현시켰다. 이하, 변이체 COL4A1 발현 벡터 4를 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “990-1,066myc”로 부르며; 변이체 COL4A1 발현 벡터 5를 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “990-1,019myc”로 부르고; 그리고 변이체 COL4A1 발현 벡터 6을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은“1,020-1,066myc”로 부른다.
상기 제작된 변이체 COL4A1 발현 벡터 4-6 뿐만 아니라 그것으로부터 발현된 990-1,066myc, 990-1,019myc 및 1,020-1,066myc을 하기 표 5 및 도 9에 요약하였다.
도 9는 상기 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드(990-1,066myc, 990-1,019myc 및 1,020-1,066myc)를 도식적으로 나타낸 도표이다.
발현 벡터 명 주형 정방향 프라이머 역방향 프라이머 재조합 단백질 아미노산 결실 부위
변이체 COL4A1 발현 벡터 4 변이체 COL4A1 발현 벡터 2 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 990-1066
myc		 잔기 29-989
잔기 1067-1669
변이체 COL4A1 발현 벡터 5 변이체 COL4A1 발현 벡터 2 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 990-1019
myc		 잔기 29-989
잔기 1020-1669
변이체 COL4A1 발현 벡터 6 변이체 COL4A1 발현 벡터 4 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 1020-1066
myc		 잔기 29-1019
잔기 1067-1669
상기 분비된 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 각각을 포함하는 배양 상층액을 회수하고, 프로브로 NK46141을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 NK46141에 대한 에피토프 범위를 좁혔다. 이 점에서, 상술한 바와 동일한 방법으로 COL4A1 유전자-제거 벡터만을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포에 도입하여, 상기 결과물인 배양 상층액을 음성 대조군(Mock)으로 이용하였다. 또한, 항-myc 항체(Sigma-Aldrich Corp.)를, 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 발현 확인을 위한 양성 대조군으로 이용하였다. 상기 결과들은 도 8b에 나타내었다.
그 결과, 990-1,019myc에 대한 어떠한 밴드도 검출되지 않았으며, 이는 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프가 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 아미노산 서열의 990-1,019 잔기에 위치한다는 것을 보여준다.
NK46141에 의하여 인식되는 에피토프 범위를 추가적으로 좁히기 위하여, 다음과 같이 변이체 COL4A1 발현 벡터 7-9를 제작하였다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 7의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 이용한 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 31 및 32인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 7을 제작하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 7은 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 1,020 잔기에서 1,066 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 8의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 이용한 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 33 및 34인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 8을 제작하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 8은 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 1,020 잔기에서 1,049 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
- 변이체 COL4A1 발현 벡터 9의 제작-
변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에서 이용한 프라이머 서열 SEQ ID NO. 19 및 20을 SEQ ID NO. 35 및 36인 프라이머 서열로 변경한 것을 제외하고는, 변이체 COL4A1 발현 벡터 1의 제작에 이용된 것과 동일한 방법으로 변이체 COL4A1 발현 벡터 9를 제작하였다.
변이체 COL4A1 발현 벡터 9는 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 1,050 잔기에서 1,066 잔기까지의 아미노산 결실 부위에 해당하는 염기를 결실시킨 발현 벡터이다.
상기 제작된 변이체 COL4A1 발현 벡터 7-9 각각을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포(Invitrogen Corp. 제작)에 도입하여 일시적으로 야생형 또는 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드를 배양 상층액에서 발현시켰다. 이하, 변이체 COL4A1 발현 벡터 7을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “Δ1,020-1,066”로 부르며; 변이체 COL4A1 발현 벡터 8을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은 “Δ1,020-1,049”로 부르고; 그리고 변이체 COL4A1 발현 벡터 6을 이용하여 발현되는 변이체 재조합 단백질은“Δ1,050-1,066”로 부른다.
상기 제작된 변이체 COL4A1 발현 벡터 7-9 뿐만 아니라 그것으로부터 발현된 Δ1,020-1,066, Δ1,020-1,049 및 Δ1,050-1,066 을 야생형 COL4A1 발현 벡터와 함께 하기 표 6 및 도 9a에 요약하였다.
도 9a는 상기 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드(990-1,066myc, 990-1,019myc 및 1,020-1,066myc)를 도식적으로 나타낸 도표이다.
발현 벡터 명 주형 정방향 프라이머 역방향 프라이머 재조합 단백질 아미노산 결실 부위
야생형 COL4A1 발현 벡터 HLFcDNA SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 FL -
변이체 COL4A1 발현 벡터 7 FL SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 Δ1020-1066 잔기 1020-1066
변이체 COL4A1 발현 벡터 8 FL SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 Δ1020-1049 잔기 1020-1049
변이체 COL4A1 발현 벡터 9 FL SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 Δ1050-1066 잔기 1050-1066
상기 분비된 3 종의 변이체 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 각각을 포함하는 배양 상층액을 회수하고, 프로브로 NK46141을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 NK46141에 대한 에피토프 범위를 좁혔다. 이 점에서, 상술한 바와 동일한 방법으로 COL4A1 유전자-제거 벡터만을 인간 배아 신장 세포-유래 293FT 세포에 도입하여, 상기 결과물인 배양 상층액을 음성 대조군(Mock)으로 이용하였다. 또한, NK46141과는 상이한 에피토프를 인식하는 항-단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드 항체 JK132를, 유전자 발현 확인을 위한 대조군으로 이용하였다. 상기 결과들은 도 9b에 나타내었다.
그 결과, Δ1,020-1,066 또는 Δ1,050-1,066에 대한 어떠한 밴드도 검출되지 않았으며, 이는 NK46141에 의하여 인식되는 에피토프가 단쇄 제4형 콜라겐 펩타이드의 아미노산 서열의 1,050-1,066 잔기에 위치한다는 것을 보여준다.
실시예 10의 야생형 COL4A1 발현 벡터 및 변이체 COL4A1 발현 벡터 1-9의 제작에 이용된 프라이머 서열들은 하기와 같이 요약하였다.
Figure pct00001
NK46141에 의하여 인식되는 에피토프를 추가적으로 확인하기 위하여, 하기와 같은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 37-42를 화학적으로 합성하고, NK46141을 프로브로 하여 도트 블롯(dot blot)에 이용하였다. 도 10에서, #1은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 37을 나타내고; #2는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 38을 나타내며; #3은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 39을 나타내고; #4는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 40을 나타내며; #5는 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 41을 나타내고; 그리고 #6은 펩타이드 서열 SEQ ID NO. 42을 나타낸다.
그 결과, NK46141에 의하여 인식되는 에피토프는, 제4형 콜라겐 α1 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 1,056-1,064 잔기에 위치한 아미노산 서열“GIGIPGLRG”(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 펩타이드인 것으로 나타났다(도 10의 #5).
Figure pct00002

본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였으며, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능하고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다는 것은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 잘 인식된다.
산업상 이용가능성
상술한 바와 같이, 종양 조직에서 특이적으로 발현되는 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 타겟팅하는 본 발명의 항체는, 정상 조직, 정상 기관 또는 정상 세포에는 작용하지 않는 약제 또는 진단 약제 또는 종양의 치료 또는 진단용 키트로 유용하다.
국립산업기술종합연구소특허생물기탁센터 FERMBP11300 20101005
SEQUENCE LISTING <110> NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTI SINGLE-STRAND TYPE-IV COLLAGEN POLYPEPTIDE ANTIBODY, AND PHARMACEUTICAL, OR AGENT FOR DIAGNOSING, PREVENTING OR TREATING TUMOURS, CONTAINING SAME <130> N-ST015-11P <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 1 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gactattaca tgtattgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc atcagtgaag gtggtagtta cacctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaaaaa caacctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagtccctat 300 tatggggacg gggggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 360 aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctgggt gtggagatac aactggttcc 420 tccgtgactc tgggatgcct ggtcaagggc tacttccc 458 <210> 2 <211> 475 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 2 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctacaga aaccaggcca gtctccaagg ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360 tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420 ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtg 475 <210> 3 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Glu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 145 150 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 4 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 145 150 155 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 5 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 6 Ile Ser Glu Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 7 Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Gly Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 8 Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 9 Lys Val Ser 1 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 10 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 11 Asp Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 12 Thr Ile Ser Glu Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 13 Pro Tyr Tyr Gly Asp Gly Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 14 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 15 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 16 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 gtcgacgcca ccatggggcc ccggctcagc gtctggctgc tg 42 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 gcggccgctt atgttcttct catacagact tggcagcg 38 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 19 ggtttcccag ggcagccagg ggccaagggc gacaga 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 20 cttcgcagcg gcccggctgt gctcctcgtg gagcag 36 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 21 ggacctaaag gtgatccagg tataagtgga 30 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 22 cttcgcagcg gcccggctgt gctcctcgtg gagcag 36 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 ggagatcaag ggatagcggg tttcccagga agccct 36 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 24 cttcgcagcg gcccggctgt gctcctcgtg gagcag 36 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 25 gtcgacgcca ccatggggcc ccggctcagc gtctggctgc tg 42 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 26 gcggccgcga cttttcacct cgcagccctg ggatgcctat 40 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 27 gtcgacgcca ccatggggcc ccggctcagc gtctggctgc tg 42 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 28 tggcaagccc attccaccaa cagatccttt 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 29 ggaacacctg gagagaaagg tgtgcctggc 30 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 30 cttcgcagcg gcccggctgt gctcctcgtg gagcag 36 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 31 ggagatcaag ggatagcggg tttcccagga 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 32 tggcaagccc attccaccaa cagatccttt 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 33 gggcaggcag gcccacctgg cataggcatc 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 34 tggcaagccc attccaccaa cagatccttt 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer <400> 35 ggagatcaag ggatagcggg tttcccagga 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer <400> 36 tttctctcct tttgcacctt tgtctccagg 30 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 37 Gly Ile Gly Ile Pro Gly Leu Arg Gly Glu Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 38 Ile Gly Ile Pro Gly Leu Arg Gly Glu Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 39 Gly Ile Pro Gly Leu Arg Gly Glu Lys 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 40 Gly Ile Gly Ile Pro Gly Leu Arg Gly Glu 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 41 Gly Ile Gly Ile Pro Gly Leu Arg Gly 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 42 Gly Ile Gly Ile Pro Gly Leu Arg 1 5

Claims (20)

  1. 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고, 항-NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)의 하이브리도마 주에 의하여 생산되는 단일 클론 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  4. 상기 제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  5. 상기 제 1 항의 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하는 단일 클론 항체.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체에 포함되는 상기 H 사슬은 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 L 사슬은 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체에 포함되는 H 사슬은 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하며; 그리고 L 사슬은 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 인간화(humanized)된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  10. 상기 제 1 항의 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region), 및 인간 항체를 포함하며, 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 상기 인간 항체에 그래프팅 된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  11. 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체.
  12. 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬을 포함하는 단일 클론 항체.
  13. GIGIPGLRG(SEQ ID NO: 41)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 단일 클론 항체.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 클론 항체는 인간화(humanized)된 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체.
  15. 항 NK-항원 단일 클론 항체 #141(기탁 번호: FERM BP-11300)인 하이브리도마 주.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 단일 클론 항체를 포함하는 약제.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 단일 클론 항체를 포함하는 종양 진단, 예방 또는 치료용 약제.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 종양은 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드를 발현하는 암 세포들을 포함하는 종양인 것을 특징으로 하는 종양 진단, 예방 또는 치료용 약제.
  19. 상기 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 내지 제 6 항, 제 8 항 내지 제 11 항, 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항의 단일 클론 항체의 일부 구조(partial structure)로서, 상기 일부 구조는 상기 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하며, 그리고 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 서열목록 제 5 서열 내지 제 7 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열; 및 서열목록 제 8 서열 내지 제 10 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체의 일부 구조.
  20. 상기 제 1 항, 제 3 항 내지 제 5 항, 제 7 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 단일 클론 항체의 일부 구조(partial structure)로서, 상기 일부 구조는 상기 단일 클론 항체의 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)을 포함하며, 그리고 상기 최소 1 종의 CDR(complementarity determining region)은 서열목록 제 11 서열 내지 제 13 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열; 및 서열목록 제 14 서열 내지 제 16 서열의 아미노산 서열로부터 선택되는 최소 1 종의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체의 일부 구조.
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