ES2332354T3

ES2332354T3 - Deteccion de litio en muestras biologicas liquidas y los reactivos para dicho fin.

Info

Publication number: ES2332354T3
Application number: ES01933464T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Dennis Henry Balazs; John William Secombe
Original assignee: Thermo Trace Pty Ltd
Current assignee: Thermo Trace Pty Ltd
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2021-05-25
Also published as: ATE441108T1; EP1283986A1; EP1283986A4; CA2409971C; CA2409971A1; US20030186450A1; EP1283986B1; AUPQ776800A0; US7241623B2; DE60139684D1; WO2001092881A1

Abstract

Un método para detector litio soluble en una muestra biológica líquida que comprende la combinación de: (a) una cantidad de la muestra biológica; (b) 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina; (c) álcali; (d) detergente; (e) agente de quelación; y (f) opcionalmente un solvente adecuado; para producir una muestra de prueba que tiene un pH de al menos 10; detectar un cambio de absorbancia de la muestra de prueba con relación a una muestra estándar deficiente en litio a una longitud de onda entre 475 nm y 485 nm, entre 515 nm y 525 nm o simultáneamente entre 475 nm y 485 nm y entre 515 nm y 525 nm, en donde el cambio de absorbancia indica la presencia de litio soluble en la muestra biológica.

Description

Detección de litio en muestras biológicas líquidas y los reactivos para dicho fin.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con métodos para detectar litio en muestras biológicas líquidas, con métodos para medir cuantitativamente el litio en muestras biológicas líquidas y con los reactivos que pueden ser utilizados en tales métodos.

Antecedentes de la invención

La terapia con litio ha sido adoptada durante muchos años para el tratamiento de pacientes que sufren de trastornos de manía bipolar y de otras enfermedades siquiátricas. El mantenimiento de la concentración de iones de litio en la sangre en el rango de concentración terapéutica entre 0,5 y 1,0 mmol/L en pacientes siquiátricos, generalmente por medio de la administración de iones de litio en la forma de carbonato de litio, se ha encontrado que es particularmente efectiva para controlar el humor en tales pacientes. Sin embargo, surge una dificultad ya que la exposición de los pacientes a niveles elevados de iones de litio (aproximadamente por encima de 1,5 mmol/L) durante un período prolongado contribuye a nefrotoxicidad y toxicidad para la glándula tiroides. Una elevación aguda de niveles fisiológicos de litio representa una emergencia médica debida a nefrotoxicidad. Desde luego no es poco común que los pacientes siquiátricos, o bien no obedezcan su medicación de litio o que accidental o intencionalmente se mediquen más de la cuenta. Por estas razones, y con el propósito de ayudar a los médicos a monitorear la efectividad de la terapia de litio en los pacientes, existe la necesidad de métodos efectivos sencillos pero costosos por medio de los cuales se pueda detectar el litio y/o para cuantificar los niveles de litio en muestras biológicas líquidas.

Históricamente, se han medido los niveles de litio en suero por medio de técnicas de fotometría de emisión de llama. En el uso de la fotometría de emisión de llama para las mediciones de sodio y de potasio, se adopta el litio como estándar interno. Tales técnicas se modifican para las mediciones de litio siendo remplazado el estándar interno de litio por cesio. Infortunadamente, los aparatos para fotometría de emisión llama que utiliza cesio como estándar interno son costosos de adquirir y de mantener y pueden ser molestos de operar.

Más recientemente, las mediciones de concentración de litio en muestras biológicas han sido llevadas a cabo por medio de la utilización de técnicas de electrodo de ión selectivo (ISE), que involucran éteres en corona que tienen un núcleo que acomoda al ion Li^{+}. Aunque las primeras técnicas de ISE eran propensas a interferencia provocadas por sodio y otros iones presentes en la muestra de prueba, los analizadores más recientes de ISE son capaces de una medición más exacta y precisa del litio. Aunque los analizadores de ISE son menos costos y más fáciles de operar y de mantener que el equipo fotómetro de llama, son deseables otras técnicas alternativas y de bajo costo para medición de litio.

Se han identificado recientemente una cantidad de compuestos de porfirina que muestran alta selectividad por iones metálicos, como se reporta por ejemplo en Richards y colaboradores (1) y Tabata y colaboradores (2). Infortunadamente, se han encontrado algunas dificultades en la utilización de los compuestos de porfirina identificados en los trabajos de Richards y colaboradores y Tabata y colaboradores en métodos simples y eficientes para determinar la presencia de y/o la cuantificación de los niveles de litio en muestras líquidas biológicas. En particular, Tabata y colaboradores advierten que la proteína reacciona con la porfirina y reduce la absorbancia, y que como resultado, el suero sometido al método para determinación de litio requieren de la remoción de la proteína por medio del uso de ácido tricloroacético. Después se requiere eliminar al ácido tricloroacético por medio de extracción con éter dietílico. Estas etapas de remoción de la proteína incrementan la complejidad y el costo de las técnicas espectrofotométricas de medición de litio con base en porfirina, evitando efectivamente el uso del método de Tabata y colaboradores en analizadores químicos automatizados.

Haiping Sun, Masaaki Tabata, "Separation and transport of lithium of 10^{-5} M in the presence of sodium chloride higher than 0.1 M by 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15-20-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin", Talanta Vol. 49, No. 3, 1999, páginas 603 - 610, se relaciona con una porfirina soluble en agua (2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15-20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina (H_{2}(obtpps)^{4-}, H_{2}P^{4-}) que fue sintetizada y aplicada a un método de extracción con solvente y un transporte de litio en líquido a través de membrana tan bajo como 10^{-5}.

M (M= mol dm^{-3}) en presencia de cloruro de sodio superior a 0,1 M. Se extrajo exitosamente porfirina de litio con cinco cargas negativas en cloroformo con ion tetrabutilamonio (But_{4} N^{+}) a un pH de 12,7. Se transportó el litio a una fase acuosa a pH 7 a través de una membrana líquida de cloroformo que contenía [(But_{4}N)_{5}HP]. Se separó el litio en una muestra de suero o de agua de mar y se determinó su concentración espectrofotométricamente por medio del método anterior sin ninguna interferencia de cloruro de sodio. La interferencia de iones metálicos pesados y de transición estaba enmascarada por Mg-EDTA. Una curva de calibración era lineal sobre un rango de 2 x 10^{-6} a 2 x 10^{-5} M con una precisión de 1,51% (RSD).

Tabata M. y colaboradores, "Spectrophotometric determination of lithium ion using a water-soluble octabromoporphyrin in aqueous solution", Talanta Vol. 46, No. 4, 1998, páginas 703 - 709, que se relaciona con porfirina soluble en agua, (2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina; H_{2}Obtpps^{4}) fue sintetizada y desarrollada para la determinación de ion litio en solución acuosa. Los grupos octabromo disminuyeron la basicidad de la porfirina por medio de su efecto de retirada de electrones, y permiten que la porfirina reaccione con el ion litio en solución alcalina para formar el complejo de litio junto con un cambio de absorción máximo: \lambda max/nm (log \varepsilon/mol^{-1} dm^{3} cm^{-1}) de la porfirina de litio son 490,5 nm (5,31) y 734 nm (4,36). El ion litio en un nivel menor a ppm fue determinado espectrofotométricamente en solución acuosa. Se aplicó el método propuesto a la determinación de litio en muestras en suero humano y agua de mar. Se aplicó el método propuesto a la determinación de litio en muestras de suero humano y de agua de mar.

Con la descripción anterior en mente, un objetivo de la presente invención es el de proporcionar un método para detectar y/o medir niveles de litio dentro de muestras líquidas biológicas que supera algunos o todos los problemas anteriormente identificados con las técnicas del estado del arte. También es un objetivo de la invención proporcionar un reactivo que pueda ser utilizado fácilmente en tales técnicas. Otros objetivos de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la misma.

Resumen de la invención

De acuerdo con una modalidad de la presente invención se proporciona un método para detectar iones solubles de litio en una muestra biológica líquida que comprende la combinación de:

(a): una cantidad de la muestra biológica;

(b): 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina o una sal de la misma que no sea de litio;

(c): álcali;

(d): detergente;

(e): opcionalmente un agente de quelación; y

(f): opcionalmente un solvente adecuado;

\quad: para producir una solución de prueba que tiene un pH de al menos 10; detectar un cambio de absorbancia de la solución de prueba con relación a un blanco deficiente en litio a una longitud de onda entre 475 nm y 495 nm, entre 505 nm y 525 nm o simultáneamente entre 475 nm y 495 nm y entre 505 nm y 525 nm, en donde el cambio de absorbancia indica la presencia de iones de litio solubles en la muestra biológica.

En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para medir cuantitativamente iones de litio solubles en una muestra biológica líquida que comprende la combinación de:

(a): un volumen medido de la muestra biológica;

(c): álcali;

(d): detergente;

(e): opcionalmente un agente de quelación; y

(f): opcionalmente un solvente adecuado;

\quad: para producir una solución de prueba de volumen conocido y al menos 10 de pH; medir el cambio de absorbancia de la muestra de prueba con relación a un blanco deficiente en litio a una longitud de onda entre 475 nm y 495 nm, entre 505 nm y 525 nm o simultáneamente entre 475 nm y 495 nm y entre 505 nm y 525 nm, y comparar la medición del cambio de absorbancia contra el cambio de absorbancia para una muestra estándar que tiene una concentración conocida de litio, para determinar así la concentración de ion litio soluble de la muestra biológica líquida.

En una modalidad adicional de la presente invención se proporciona un reactivo para uso en un método para detección de iones de litio solubles en una muestra biológica líquida que comprende:

(i): 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina o una sal de la misma que no sea de litio;

(ii): álcali;

(iii): detergente;

(iv): opcionalmente un agente de quelación; y

(v): opcionalmente un solvente adecuado.

Preferiblemente, la detección o la medición del cambio de absorbancia es llevada a cabo a una longitud de onda de aproximadamente 485 nm, aproximadamente 515 nm o simultáneamente aproximadamente a 485 nm y aproximadamente 515 nm.

En una modalidad preferida de la invención, la muestra biológica líquida es plasma, suero, linfa, orina, saliva, lágrimas, leche o se deriva de cualquiera de estos. En modalidades particularmente preferidas de la invención, la muestra biológica es plasma o suero.

Preferiblemente, la solución de prueba tiene un pH de aproximadamente 13.

En una modalidad preferida de la invención, el álcali es hidróxido de sodio acuoso que está presente en el reactivo en una concentración entre 0,001 M y 0,5 M, particularmente preferiblemente aproximadamente 0,10 M.

Preferiblemente la 2,3,7,8,12,13,17,18 - octabromo -5,10,15,20 - tetrakis (4-sulfonatofenil) porfirina está presente en el reactivo en una concentración entre 5 mg/L y 200 mg/L, particularmente preferiblemente aproximadamente 30 mg/L.

En una modalidad preferida de la invención el detergente es un detergente catiónico aniónico o no iónico, preferiblemente un alquilsulfato, un éter de polioxietileno, un alcanosulfonato o un alquilbencenosulfonato. En una modalidad particularmente preferida de la invención, el detergente es BRIJ 35 que puede ser utilizado por ejemplo en la forma de una solución al 30% dentro los métodos de la invención y puede preferiblemente estar presente dentro del reactivo en una concentración entre 0,001% a 4,0% en volumen del volumen total de reactivo, preferiblemente aproximadamente 0,4%.

En modalidades preferidas de la invención, el agente de quelación es etilén diamina, piridina, propilén diamina, dietilén triamina, trietilén tetramina, 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), dimetilglioximato, glicinato o acetilacetonato. Preferiblemente el agente de quelación es EDTA y particularmente preferiblemente se utiliza en la forma de EDTA tetrasódico que puede estar presente en una concentración entre 1,0 \muM y 1.000 \muM, preferiblemente aproximadamente 50 \muM.

Preferiblemente el solvente de acuerdo con la invención es agua destilada, etanol, metanol, acetona, dimetilformamida o dimetilsulfóxido. Particularmente preferiblemente el solvente es dimetilsulfóxido o agua.

En una modalidad preferida de la invención el blanco deficiente en litio incluye cada uno de los componentes (b) a (c) y (e) y (f) si están presentes en la solución de prueba, con solvente presente en lugar del componente (a).

De acuerdo con otra modalidad de la invención, la presencia de litio es indicada por un cambio negativo de absorbancia aproximadamente a 515 nm y de acuerdo con una modalidad adicional de la invención, la presencia de litio s indicada por un cambio positivo de absorbancia aproximadamente a 485 nm.

En otra modalidad de la invención, el reactivo puede contener además un fungicida y/o un bactericida. Preferiblemente, el fungicida/bactericida es azida de sodio que puede estar presente en una concentración entre 0,1 g/L y 10 g/L, preferiblemente aproximadamente 1,0 g/L.

Breve descripción de las figuras

La invención es descrita adicionalmente a manera de ejemplo con referencia a las figuras en donde:

La Fig. 1 muestra una gráfica de cambio de absorbancia contra longitud de onda para una muestra de suero (incluido Li^{+} en una concentración de 1 mmol/L) con reactivo, comparada con un blanco de reactivos (con suero reemplazado con agua destilada).

La Fig. 2 muestra una gráfica de cambio de absorbancia contra longitud de onda para una muestra de suero (incluido Li^{+} en una concentración de 4 mmol/L) con reactivo, comparada con un blanco de reactivos (con suero reemplazado con agua destilada).

La Fig. 3 muestra una gráfica de cambio de absorbancia contra longitud de onda para una muestra de suero (deficiente en Li^{+} añadido) con reactivo, comparada con un blanco de reactivos (con suero reemplazado con agua destilada).

La Fig. 4 muestra una gráfica de cambio de absorbancia contra longitud de onda para agua destilada, comparada con un blanco de agua.

La Fig. 5 muestra una gráfica de concentración de litio determinada por medio de los métodos del ejemplos 1 (CRLi) (mmol/L) contra la concentración de litio determinada por medio de fotometría de Llama (mmol/L).

La Fig. 6 muestra una gráfica de concentración de litio determinada por medio de los métodos del ejemplo 1 (CRLi) (mmol/L) contra la concentración de litio determinada por medio de análisis de Electrodo de Ion Selectivo (ISE) (mmol/L).

La Fig. 7 muestra una gráfica de factor de calibración del instrumento contra tiempo de exposición a la atmósfera en un vaso de reactivos abierto (días) para una formulación de porfirina/agua/hidróxido de sodio (formulación estándar) en comparación con una formulación de porfirina/DMSO/carbonato de potasio.

La Fig. 8 muestra una gráfica de absorbancia contra longitud de onda para una formulación de porfirina/agua/
hidróxido de sodio.

La Fig. 9 muestra una gráfica de absorbancia contra longitud de onda para una formulación de porfirina/DMSO/
carbonato de potasio.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de la invención

A todo lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera de otra cosa, la palabra "comprende", y variaciones tales como "que comprende" o "incluye", se entenderá que implican la inclusión de un entero o etapa establecida o grupo de enteros o de etapas pero no la exclusión de ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.

Los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados ya sea para detectar simplemente la presencia de concentraciones detectables de iones solubles de litio en una muestra biológica líquida, o más particularmente para cuantificar concentraciones solubles de ion litio en muestras biológicas líquidas. Puede haber ocasiones en las cuales una simple respuesta positiva o negativa con relación a la presencia de una concentración detectable de litio en una muestra biológica es toda la que se requiere, tal como en el caso en donde es simplemente necesaria para determinar si un paciente siquiátrico está cumpliendo con una prescripción terapéutica de litio. Más regularmente, sin embargo, se adoptarán los métodos de la invención para monitorear en forma exacta los niveles fisiológicos de litio para ayudarle a un médico a determinar el progreso del tratamiento de un paciente en una terapia con litio.

Las muestras biológicas que pueden ser utilizadas de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen líquidos biológicos sustancialmente deficientes de células, tales como por ejemplo plasma sanguíneo o suero, linfa (preferiblemente habiendo removido las células), orina, saliva, lágrimas, leche u otras muestras derivadas de estas. Por ejemplo, los métodos de acuerdo con la invención pueden ser llevados a cabo sobre muestras biológicas líquidas de las anteriores categorías que son fraccionadas para eliminar uno u otra clase de componente, tal como plasma, suero o linfa fraccionados para eliminar materiales proteínicos.

Un ingrediente clave utilizado en los métodos y reactivos de la presente invención es 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina (de ahora en adelante denominada como "cromógeno"), como se describe en la fórmula I a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

1

Se puede preparar el cromógeno de acuerdo con el método de Tabata y colaboradores (2). Se lo puede utilizar en la forma de una sal, pero naturalmente no en la forma de una sal de litio. Tales sales son también abarcadas por el término "cromógeno". A pH alcalinos aproximadamente superiores a 10, se desprotona el cromógeno y es en esa forma que se permite la formación de un complejo Li^{+}/cromógeno. La formación de un complejo entre el cromógeno y el litio es muy específica debido a la acomodación del ion litio de radio iónico pequeño (73 pm) dentro del núcleo del cromógeno. No se ha observado la formación de complejos entre el cromógeno y los iones mayores de sodio (radio de 113 pm) y de potasio (radio de 151 pm). Como lo indican Tabata y colaboradores (2) el cromógeno experimenta un cambio espectral por la formación de un complejo con Li^{+}, con un pico de absorbancia a 490,5 nm. La detección de este cambio espectral forma la base de los métodos de acuerdo a la presente invención, aunque, como se describirá más adelante, los presentes inventores han determinado que bajo las condiciones específicas esbozadas aquí, se desplaza la longitud de onda del pico de absorbancia de modo que el complejo Li^{+}/cromógeno exhiba un pico máximo de absorbancia aproximadamente entre 475 nm y aproximadamente 495 nm y un pico mínimo de absorbancia aproximadamente entre 505 nm y aproximadamente 525 nm. Específicamente, el pico máximo está aproximadamente en 485 nm (más específicamente aproximadamente en 484,8 nm) y el pico mínimo está aproximadamente en 515 nm (más específicamente aproximadamente en 514,7 nm).

Dado que es necesaria la desprotonación del cromógeno para que tenga lugar la formación del complejo litio/cromógeno, es importante que la solución de prueba que incluye una cantidad de la muestra biológica que va a ser analizada tenga un pH de al menos aproximadamente 10. Esto se puede lograr desde luego por medio de la inclusión de álcali dentro del reactivo del ensayo. Los ejemplos de álcalis particulares que pueden ser utilizados en este sentido incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de sodio y carbonato de potasio, aunque se entiende que se pueden utiliza también otros álcalis. Lo álcalis preferidos que pueden ser utilizados en esta forma son hidróxido de sodio y carbonato de potasio.

Los presentes inventores han determinado que la inclusión de detergente dentro del reactivo de la invención y su utilización dentro de los métodos de la invención no solamente resulta en mediciones con mayor intensidad de absorbancia de las muestras biológicas que incluyen cromógeno y litio, sino que también resultan en un desplazamiento en la longitud de onda a la cual se detecta la absorbancia máxima. Sin desear estar enlazado a una teoría, se ha postulado que estas características se pueden explicar ya que el detergente lucha de alguna manera con los efectos cromogénicos de la proteína dentro de la muestra biológica líquida. Además, y en forma bastante sorprendente, después de la inclusión de detergente dentro de los reactivos de la invención, los presentes inventores han podido detectar un pico mínimo de absorbancia entre 505 nm y 525 nm (más específicamente aproximadamente en 515 nm) que no había sido descrito antes. Esta presencia tanto de un pico de absorción mínimo como máximo le confiere a los métodos presentes tanto versatilidad (ya que se pueden utilizar filtros de longitud de onda de diferentes características) como mayor sensibilidad con relación a los métodos del estado del arte, ya que es posible hacer mediciones con longitudes de onda tanto con los picos de máxima como de mínima absorbancia.

Se pueden utilizar una gran variedad de detergentes de acuerdo con la presente invención, incluyendo por ejemplo detergentes catiónicos, aniónicos o no iónicos. Los ejemplos de clases de detergentes que pueden ser utilizados incluyen detergentes de sulfato de alquilo, éteres de polioxietileno, detergentes de alcanosulfonato y detergentes de alquilbencenosulfonato. Algunos ejemplos específicos de detergentes adecuados son Empigen BB AU, Triton X-100, Triton X-405, lauril sulfato de sodio, y un mezcla de bromuro de alquil trimetil amonio y cloruro de bencetonio. Un detergente particularmente preferido que puede ser adoptado es BRU 35, que está constituido por polioxietilén 23 lauril éter, suministrado comercialmente por Sigma Chemical Co.

Se ha encontrado efectivo incluir un agente de quelación en el reactivo de acuerdo con la invención el cual, nuevamente sin querer estar atado por la teoría, puede ayudar a eliminar o al menos a limitar la interferencia cromogénica que puede surgir debido a cationes divalentes o trivalentes. Algunos ejemplos de agentes de quelación que pueden ser adoptados incluyen etilén diamina, piridina, propilén diamina, dietilén triamina, trietilén tetramina, 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Preferiblemente el agente de quelación adoptado es EDTA y en particular, el EDTA utilizado puede ser EDTA tetrasódico.

Dependiendo de los volúmenes de los componentes utilizados en el método de detección o incorporados dentro de los reactivos de la invención, puede ser apropiado incluir un solvente adecuado. Sorprendentemente se ha encontrado por parte de los presentes inventores que el uso de dimetilsulfóxido (DAISO) como solvente parece mejorar la actividad de, y estabilizar al reactivo porfirina. Sin querer estar atado por la teoría, parece que el uso de DNISO como solvente puede evitar o al menos hacer más lenta la degradación del reactivo como resultado de la exposición al dióxido de carbono atmosférico. Otro solvente preferido es agua destilada o también desionizada. Sin embargo, el término "solvente adecuado" también incluye dentro de su alcance solvente orgánicos miscibles con agua. Los ejemplos de solventes orgánicos miscibles con agua que pueden ser adoptados incluyen metanol, etanol, acetona, dimetilformamida y dimetilsulfóxido. Cabe destacar, sin embargo, que estos solventes se mencionan únicamente a manera de ejemplo y que se pueden utilizar igualmente otros solventes orgánicos miscibles en agua. Por ejemplo, puede ser necesario añadir específicamente un solvente adecuado al reactivo de la invención o cuando se llevan a cabo los métodos de acuerdo con la invención si se requiere un líquido adicional para producir una muestra lo suficientemente grande para análisis espectrofotométrico. Sin embargo, como se pueden añadir a menudo el cromógeno y/o el álcali y/o el detergente y/o el agente de quelación en una forma ya diluida en solvente y en realidad porque la muestra biológica en si misma puede haber sido diluida también con solvente antes de la preparación de la solución del ensayo, puede no ser necesario incluir solvente adicional ya sea durante la preparación de la solución del ensayo o en la preparación del reactivo.

Un reactivo que puede ser utilizado en los métodos de acuerdo con la presente invención se puede preparar antes de llevar a cabo el método y puede contener al cromógeno, al álcali, al detergente y opcionalmente un agente de quelación y/o un solvente adecuado, como se esbozó anteriormente. En una modalidad de la invención, se prepara el reactivo utilizando el cromógeno, hidróxido de sodio acuoso, una solución acuosa al 30% (v/v) de BRiJ 35 y EDTA tetrasódico. El reactivo puede incluir por ejemplo a estos componentes en las siguientes concentra-
ciones:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

El reactivo puede incluir adicionalmente un fungicida y/o un bactericida o para el caso otros componentes tales como estabilizadores, preservantes, antioxidantes, colorantes, pigmentos o similares. Un ejemplo específico de un fungicida/bactericida que puede ser adoptado convenientemente es la azida de sodio. En una modalidad de la invención, se incluye azida de sodio dentro del reactivo en una concentración entre 0,1 g/L y 10 g/L. En una modalidad de la invención, el reactivo para uso en la detección de litio y los métodos para determinación de la concentración de acuerdo con la presente invención será suministrado como un líquido estable de un solo componente. Preferiblemente, será suministrado en un contenedor opaco, listo para ser utilizado.

Es naturalmente importante que las muestras del ensayo no incluyan fuentes externas de litio que pudieran comprometer los resultados del ensayo. Por ejemplo, el plasma de heparina con litio no debe ser utilizado como una muestra biológica dentro de los métodos de ensayo actualmente descritos.

Un reactivo preferido de acuerdo con la presente invención incluye cromógeno en una concentración aproximadamente de 30 mg/L, hidróxido de sodio aproximadamente 0,10 M, HRIJ 35 aproximadamente 0,4% en volumen del volumen total del reactivo, EDTA tetrasódico aproximadamente 50 \muM, en agua destilada. En el caso en donde está presente azida de sodio, se la puede incluir en una concentración aproximadamente de 1,0 g/L. En otra modalidad se pueden remplazar el agua y el hidróxido de sodio con DMSO (por ejemplo una solución del 5% al 50%, preferiblemente aproximadamente al 30% en volumen) y carbonato de potasio (por ejemplo aproximadamente
0,1 M).

El método de detección de acuerdo con la invención es llevado a cabo por medio de la detección del cambio de absorbancia de la muestra del ensayo con relación a un blanco deficiente en litio. El blanco deficiente en litio se puede preparar siguiendo el protocolo para la preparación de la solución del ensayo pero remplazando la cantidad incluida de la muestra biológica con un solvente adecuado. En el caso en donde se pretende que el método determine cuantitativamente la concentración de litio, desde luego es necesario medir en forma exacta el volumen de la muestra biológica dentro de la solución del ensayo y determinar en forma exacta el volumen total de la solución del ensayo. Por comparación del cambio de absorbancia medido para la solución del ensayo contra el cambio de absorbancia para las muestras estándar que tienen concentración conocida de litio, es posible determinar en forma precisa la concentración de litio dentro de la solución del ensayo y por medio del conocimiento de las diluciones de la muestra biológica original, se puede hacer una determinación de la concentración de litio dentro de la muestra biológica original. Por ejemplo, preparando una gráfica del cambio de absorbancia contra la concentración de litio para al menos dos muestras que tienen concentración conocida de litio, es posible leer la concentración de litio para las muestras del ensayo a partir de la gráfica, una vez se ha determinado el cambio de absorbancia. También es posible calcular la concentración de la solución del ensayo simplemente dividiendo el cambio de absorbancia determinado para la solución del ensayo (que contiene la muestra biológica) por el cambio de absorbancia determinado para la muestra de concentración estándar de litio y multiplicando el resultado por la concentración conocida de la muestra estándar de litio. De manera muy importante, se ha encontrado que el cambio de absorbancia es lineal para concentración de litio en el rango fisiológico hasta de 3,0 mmol/L de litio. En el caso en donde se sospecha que la concentración de litio de una muestra biológica puede exceder los 3,0 mmol/L, entonces se deben diluir las muestras biológicas para traer la concentración de la solución dentro del rango analítico del ensayo.

Aunque desde luego también es posible que los métodos de acuerdo con la presente invención se realicen en forma manual, los métodos presentes se pueden automatizar fácilmente utilizando un amplio rango de analizadores de química clínica con tal de que tengan una capacidad de selección de longitud de onda aproximadamente de 485 nm, aproximadamente 515 nm o el par bicromático de longitudes de onda aproximadamente de 485 nm y aproximadamente 515 nm, o al menos dentro de los rangos 475 - 495 nm, 505 - 525 nm y el correspondiente par bicromático. Los ejemplos de sistemas automatizados actuales que tienen la capacidad apropiada son los modelos 917, 747, 737, 717, 705, 902 y 912 de Hitachi; los modelos de Olympus: Reply, AU5000, AU5200, AU800, AU600 y AU400; el modelo de Technicon: DAX y los modelos Cobas Bio y Cobas Integra de Roche.

En otro aspecto de la invención, el reactivo descrito anteriormente puede ser impregnado dentro o adsorbido sobre un material matriz (por ejemplo papel, cartón, vidrio o fibra de vidrio, celulosa, o cualquiera entre un rango de materiales poliméricos) para formar una tira de prueba. Tal tira de prueba puede ser utilizada luego por los médicos o trabajadores de la saluda para analizar de forma inmediata una muestra biológica de un paciente (preferiblemente una obtenida en una forma no invasiva, tal como orina o saliva), como un medio para detectar la presencia de iones de litio y determinar si un paciente está cumpliendo con una prescripción de litio. En tales casos un cambio visible de color de la tira de prueba indicaría la presencia de iones de litio en la muestra biológica analizada. Las tiras de prueba de este tipo están descritas en las patentes estadounidenses Nos. 3.992.158 y 4.292.272. Se puede producir una herramienta analítica similar en la forma de un vial, tubo u otro dispositivo preferiblemente desechable que contenga al reactivo líquido de la invención, al cual se le puede añadir una cantidad de una muestra biológica. Un cambio de color del reactivo será nuevamente indicativa de la presencia de iones de litio n la muestra
biológica.

Se describirá adicionalmente ahora la presenta invención y a manera de ejemplo únicamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Protocolo Analítico

1): Diluir un volumen de muestra biológica líquida en forma precisa por medio de la adición de 10 volúmenes de agua desionizada o destilada.

2): Mezclar completamente la muestra biológica diluida.

3): Tomar un volumen de la muestra diluida y añadir 100 volúmenes de reactivo y mezclar para producir la solución del ensayo. El reactivo incluye cromógeno (20 \muM) en hidróxido de sodio acuoso (pH 13,0), detergente BRIJ 35 (0,4% en volumen del volumen total del reactivo) y agente de quelación EDTA tetrasódico (50 \muM).

4a): Después de cinco minutos a temperatura ambiente o de dos minutos a 37ºC leer la absorbancia de la solución del ensayo a 515 nm contra un blanco deficiente en litio (donde se remplaza el líquido biológico por agua destilada) en un espectrofotómetro (los inventores utilizaron un espectrofotómetro GBC Cintra 10e). Registrar el cambio de absorbancia (\DeltaA) (absorbancia de la solución del ensayo menos la absorbancia del blanco), que será negativo.

4b): Alternativamente, llevar a cabo la etapa 4 con el espectrofotómetro programado en 485 nm. El cambio de absorbancia (\DeltaA) registrado será positivo.

5): El ensayo puede ser calibrado por comparación con los resultados obtenidos siguiendo las etapas 1 a 4 con un estándar de concentración conocida de litio en lugar de la muestra biológica líquida. La solución de concentración conocida de litio puede ser o bien un material con base en suero (matriz emparejada) o puede ser una solución acuosa primaria. Idealmente la concentración de litio dentro del estándar se aproximará a 1,00 mM. La precisión de la calibración es independiente de los efectos de la matriz.

6): El cálculo de la concentración se puede llevar a cabo de acuerdo con la siguiente fórmula

\hskip1.5cm

200

en donde w = longitud de onda a la cual se lleva a cabo las mediciones de absorbancia.

\vskip1.000000\baselineskip

Las gráficas de cambio de absorbancia para muestras de suero que incluyen, y son deficientes, en litio son mostradas en las Figs. 1 a 4. Las Figs. 1 y 2 muestran gráficas de cambio de absorbancia contra longitud de onda para muestras preparadas de acuerdo con el protocolo esbozado anteriormente (donde la muestra biológica era suero, con concentraciones de ion litio de 1 mmol/L y 4 mmol/L, respectivamente). En estas gráficas se utilizó un blanco de reactivos en donde se había remplazado el suero por agua destilada.

Las Figs. 3 y 4 muestran gráficas de cambio de absorbancia contra longitud de onda para muestras preparadas de acuerdo con el protocolo esbozado anteriormente (donde la muestra biológica es suero deficiente en iones añadidos de litio) y para agua destilada con reactivos, respectivamente. En estas gráficas se utilizaron un blanco de reactivos con suero remplazado con agua destilada (Fig. 3) y un blanco de agua (Fig. 4). Se observa que en la Fig. 3 los picos máximo y mínimo están con un cambio de absorbancia mucho menor que para las Figs. 1 y 2. La presencia de picos máximo y mínimo dentro de la Fig. 3 demuestra la baja concentración de iones de litio (aproximadamente 0,005 mmol/L) presente naturalmente dentro del plasma de un paciente que no está en una terapia con
litio.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Determinación de la Concentración de una Muestra de Suero Inoculada con Concentraciones Conocidas de Cloruro de Litio

Se inoculó cloruro de litio en concentraciones de 0.50, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 y 3.5 mmol/L en muestras separadas de suero humano. Se determinó la concentración de Li^{+} dentro de estas muestras de suero de acuerdo con el protocolo esbozado en el Ejemplo 1. A continuación se muestran los resultados en la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

2

Los presentes inventores han determinado que el método de la invención es extremadamente sensible para la medición de concentraciones de litio en suero. El coeficiente de absorción molar del complejo litio/cromógeno es aproximadamente de 9 x 10^{4}. El límite mínimo de detección para litio en suero/plasma se ha determinado que es aproximadamente de 0,04 mmol/L.

Se ha determinado que el ensayo es lineal aproximadamente con 3,0 mmol/L de Li^{+}. Las muestras que tienen una concentración mayor que esta deben ser diluidas adicionalmente para hacer entrar la concentración de la solución del ensayo dentro del rango analítico del ensayo.

Se ha observado que el ensayo no es afectado por concentraciones fisiológicas o patofisiológicas de álcali, metales alcalinotérreos o de transición encontrados en sangre humana. Debido a la combinación de una alta dilución de la muestra del ensayo y la alta sensibilidad del cromógeno, los efectos de la matriz de la muestra tales como lipemia, ictericia y hemólisis tienen efectos insignificantes sobre los resultados del ensayo en las concentraciones encontradas en especímenes del paciente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Comparación de los Resultados del Ensayo con las Mediciones por Espectrofotometría de Emisión de Llama y Electrodo de Ion Selectivo de la Concentración de Litio

Se midieron las concentraciones de litio en las muestras de suero 1 a 19 con diferentes concentraciones de Li^{+} utilizando espectrofotometría de emisión de llama ("llama") (utilizando un aparato Instrumentation Laboratory Modelo 943) análisis por electrodo de ion selectivo ("ISE") (utilizando un Analizador de Electrolitos AVL 9180) y por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención como se esboza en el Ejemplo 1 ("CRILi"). En la Tabla 2 a continuación se presentan los resultados, donde todas las mediciones de Li^{+} están en una concentración de
mmol/L.

TABLA 2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Las gráficas de medición de litio por CRLi contra las mediciones de litio por medio del fotómetro de llama y la medición de litio por CRLi contra la medición de litio por medio del electrodo de ion selectivo se muestran en las Figs. 5 y 6, respectivamente. Las correlaciones son las siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

Correlación

\quad: CRLi = 0,98 Li (Fotómetro de llama) + 0,06

r = 0,999: n =17

\quad: CRLi = 0,91 (ISE) + 0,07

r = 0,998: n = 17

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Análisis Automatizado

Se diluyeron las muestras de Suero 1 y 2 de Control de Calidad Liquicheck de Biorad utilizando pipetas automáticas manuales (Finnpipettes); 1 parte de suero Q C por 10 partes de agua desionizada.

Se colocaron luego alícuotas de la muestra diluida en 10 copas para muestras Cobas de Biorad QC 1 y 10 copas de Biorad QC 2.

Estas fueron luego analizadas en dos "corridas", produciendo 20 resultados de ensayo para cada material.

Los calibradores eran diluciones 1/11 del Estándar de Litio, concentraciones de 0.50, 1.00 y 3.00 mmol/L.

\newpage

Utilizando una Cobas Bio Centrifugal Analycer (Roche) se obtuvo la siguiente imprecisión en la corrida:

4

Se puede observar con base en esto que el método de ensayo de la presente invención es adecuado para automatización.

Debe entenderse que la presente invención ha sido descrita únicamente a manera de ejemplo y que las modificaciones y/o alteraciones de la misma, que serían evidentes para una persona capacitada en el arte con base en la descripción dad aquí, se considera que también caen dentro del alcance y el espíritu de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Comparación de los efectos del solvente sobre la estabilidad del reactivo

Se pretende determinar si el uso de una combinación de un álcali resistente al dióxido de carbono (tal como carbonato de potasio) y el solvente DMSO, podrían mejorar y estabilizar la formulación del reactivo.

El protocolo experimental es el siguiente:

1): Los reactivos fueron elaborados con una formulación normal (agua/NaOH (0,1 M)) y 40 mg/l de porfirina y formulación de ensayo (DMSO al 30%/carbonato de potasio (0,1 M)) y 34 mg/l de porfirina. (observación: como resultado de una mejor absorbancia en presencia de DMSO, se requirieron únicamente 34 mg/l de porfirina para producir una absorbancia equivalente de 40 mg/l de porfirina en una versión de agua/NaOH). Ambas soluciones tuvieron una absorbancia de pico de 2,5A +/- 0,05.

2): Se mantuvieron las dos soluciones de reactivos en la oscuridad a temperatura ambiente en contenedores abiertos para reactivos y se las expuso así al dióxido de carbono atmosférico. La experiencia previa ha mostrado que las soluciones fuertemente alcalinas absorben rápidamente dióxido de carbono de la atmósfera resultando así en una caída en el pH de la solución. En la medida en que cae el pH del reactivo se incrementa el factor de calibración (el factor de calibración es el inverso del cambio de la absorbancia por mmol de litio. Produce una medida de la sensibilidad del reactivo, de tal manera que el incremento el factor de calibración refleja la disminución de la sensibilidad del reactivo). Eventualmente, por debajo de un cierto pH el reactivo no recupera más en forma precisa los resultados de litio de las muestras. Los resultados son mostrados en la Fig. 7 donde los puntos con forma de diamante son para la formulación de DMSO y los puntos cuadrados son para la formulación normal.

3): Se utilizaron ambas soluciones para analizar una serie de soluciones acuosas de litio y muestras de suero humano que contenían litio.

4): Se analizaron las muestras por medio de ambos reactivos en los días uno a seis (observación: después del día 4 la formulación de agua/NaOH produjo resultados erróneos en las soluciones acuosas y en las muestras del paciente).

5): Resultados: Al sexto día la formulación de DMSO/carbonato de potasio todavía entrego resultados analíticos satisfactorios. La versión de agua/NaOH fue inadecuada para uso más allá del día 4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Cromogenicidad mejorada con solvente DMSO

Las Figs. 8 y 9 muestran lecturas de absorbancia contra longitud de onda para una formulación normal (Fig. 8) y una formulación de DMSO (Fig. 9). La formulación normal incluía agua como solvente e hidróxido de sodio 0,1 M, mientras que la formulación de DMSO incluía 30% de DMSO con carbonato de potasio 0,1 M. Ambas formulaciones incluían 40 mg/L de porfirina. Como puede observarse a partir de una comparación de la absorbancia máxima de las Figs. 8 y 9, la absorbancia a 508 nm es aproximadamente 2,95 para la formulación de DMSO comparada con aproximadamente 2,5 para la formulación normal. Esto demuestra claramente la cromogenicidad mejorada de la formulación de DMSO, que creen los presentes inventores que es un efecto separado para la estabilidad mejorada mostrada en el ejemplo 5 anterior.

Referencias

1. Richards y colaboradores; "Observation of a Stable Water-Soluble Lithium Porphyrin"; Inorg. Chem. 1996, 35; páginas 1940 - 1944.

2. Tabata y colaboradores; "Trace Analysis of Lithium with a Water-Soluble Porphyrin"; Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry 32 (1998); páginas 267 - 281.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 3992158 A [0041]: \bullet US 4292272 A [0041]

Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bullet Haiping Sun; Masaaki Tabata. Separation and transport of lithium of 10-5 M in the presence of sodium chloride higher than 0.1 M by 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15-20-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin. Talanta, 1999, vol. 49 (3), 603 - 610 [0006]

\bulletTabata M. y colaboradores, Spectrophotometric determination of lithium ion using a water-soluble octabromoporphyrin in aqueous solution. Talanta, 1998, vol. 46 (4), 703 - 709 [0008]

\bulletRichards y colaboradores, Observation of a Stable Water-Soluble Lithium Porphyrin. Inorg. Chem., 1996, vol. 35, 1940 - 1944 [0063]

\bulletTabata y colaboradores, Trace Analysis of Lithium with a Water-Soluble Porphyrin. Journal of Inclusion Phenomena and Molecular Recognition in Chemistry, 1998, vol. 32, 267 - 281 [0063]

Claims

```
\global\parskip0.960000\baselineskip
```
1. Un método para detector litio soluble en una muestra biológica líquida que comprende la combinación de:

(a)

una cantidad de la muestra biológica;

(b)

2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina;

(c)

álcali;

(d)

detergente;

(e)

agente de quelación; y

(f)

opcionalmente un solvente adecuado;

\quad

para producir una muestra de prueba que tiene un pH de al menos 10; detectar un cambio de absorbancia de la muestra de prueba con relación a una muestra estándar deficiente en litio a una longitud de onda entre 475 nm y 485 nm, entre 515 nm y 525 nm o simultáneamente entre 475 nm y 485 nm y entre 515 nm y 525 nm, en donde el cambio de absorbancia indica la presencia de litio soluble en la muestra biológica.
2. Un método para medir cuantitativamente litio soluble en una muestra biológica líquida que comprende la combinación de:

(a)

un volumen medido de la muestra biológica;

(b)

2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina;

(c)

álcali;

(d)

detergente;

(e)

agente de quelación; y

(f)

opcionalmente un solvente adecuado;

\quad

para producir una muestra de prueba de volumen conocido y de al menos pH 10; medir el cambio de absorbancia de la muestra de prueba con relación a una muestra estándar deficiente en litio a una longitud de onda entre 475 nm y 485 nm, entre 515 nm y 525 nm o simultáneamente entre 475 nm y 485 nm y entre 515 nm y 525 nm, y comparar la medición del cambio de absorbancia contra la gráfica de cambio de absorbancia para muestras que tienen una concentración conocida de litio, para determinar así la concentración de litio soluble de la muestra biológica líquida.
3. El método de acuerdo a la reivindicación 1 o a la reivindicación 2 en donde el cambio de absorbancia se detecta aproximadamente a 480 nm, aproximadamente a 520 nm o simultáneamente a 480 nm y aproximadamente 520 nm.
4. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde la muestra biológica líquida es plasma, suero, linfa, proteína, orina, saliva, lágrimas, leche o en donde la muestra biológica líquida se deriva de uno de los anteriores.
5. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el pH de la muestra de prueba es aproximadamente 13.
6. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el álcali es hidróxido de sodio o carbonato de potasio.
7. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el detergente es un detergente catiónico, aniónico o no iónico.
8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el detergente es un sulfato de alquilo, un éter de polioxietileno, un alcanosulfonato o un alquilbencenosulfonato.
9. El método de acuerdo a la reivindicación 8 en donde el detergente es polioxietileno 23 lauril éter.
10. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el agente de quelación es etilén diamina, piridina, propilén diamina, dietilén triamina, trietilén tetramina, 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), dimetilglioximato, glicinato o acetilacetonato.
11. El método de acuerdo a la reivindicación 10 en donde el agente de quelación es EDTA.
```
\newpage
```
```
\global\parskip1.000000\baselineskip
```
12. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el solvente es agua destilada, etanol, metanol, acetona, dimetilformamida o dimetilsulfóxido.
13. El método de acuerdo a cualquier reivindicación precedente en donde el estándar deficiente en litio incluye cada uno de los componentes (b) hasta (e) y (f) si están presentes en la muestra de prueba, con un solvente adecuado presente en lugar del componente (a).
14. El método de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el litio está indicado por medio de un cambio negativo de absorbancia aproximadamente a 520 nm.
15. El método de acuerdo a la reivindicación 1 en donde el litio está indicado por medio de un cambio positivo de absorbancia aproximadamente a 480 nm.
16. Un reactivo para uso en un método para detección de litio en una muestra biológica líquida que comprende:

(i)

2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina;

(ii)

álcali;

(iii)

detergente;

(iv)

agente de quelación; y

(v)

opcionalmente un solvente adecuado.
17. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 16 en donde el componente (i) está presente en una concentración entre 5 mg/L y 200 mg/L.
18. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 16 o a la reivindicación 17 n donde el álcali es hidróxido de sodio o carbonato de potasio.
19. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 18 en donde el álcali está presente en una concentración entre 0,001 M y 0,5 M.
20. El reactivo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 en donde en detergente es polioxietileno 23 lauril éter (aproximadamente solución al 30% (v/v)).
21. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 20 en donde el polioxietileno 23 lauril éter está presente en una concentración aproximadamente entre 0,001% hasta aproximadamente 4,0% en volumen del volumen total del reactivo.
22. Un reactivo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 en donde el agente de quelación es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
23. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 22 en donde el EDTA es EDTA tetrasódico presente en una concentración entre 1,0 \muM hasta 1000 \muM.
24. El reactivo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 que comprende además un fungicida y/o un bactericida.
25. Un reactivo de acuerdo a la reivindicación 24 en donde el fungicida/bactericida es azida de sodio.
26. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 25 en donde la azida de sodio está presenta en una concentración entre 0,1 g/L y 10 g/L.
27. El reactivo de acuerdo a la reivindicación 16 que comprende:

(i)

aproximadamente 31 mg/L de 2,3,7,8,12,13,17,18-octabromo-5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatofenil) porfirina;

(ii)

aproximadamente 0,10 M de hidróxido de sodio;

(iii)

aproximadamente 0,4% en volumen del volumen total del reactivo de polioxietileno 23 lauril éter;

(iv)

aproximadamente 50 \muM de EDTA tetrasódico.
28. Un reactivo de acuerdo a la reivindicación 27 que comprende además aproximadamente 1,0 g/L de azida de sodio.