[go: up one dir, main page]

WO2016013115A1 - 希釈生体試料成分の分析方法 - Google Patents

希釈生体試料成分の分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016013115A1
WO2016013115A1 PCT/JP2014/069718 JP2014069718W WO2016013115A1 WO 2016013115 A1 WO2016013115 A1 WO 2016013115A1 JP 2014069718 W JP2014069718 W JP 2014069718W WO 2016013115 A1 WO2016013115 A1 WO 2016013115A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blood
internal standard
plasma
component
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/069718
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
進 大澤
晋哉 杉本
功 米久保
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leisure Inc Japan
Original Assignee
Leisure Inc Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leisure Inc Japan filed Critical Leisure Inc Japan
Priority to PCT/JP2014/069718 priority Critical patent/WO2016013115A1/ja
Priority to US15/328,977 priority patent/US10712354B2/en
Priority to ES17189658T priority patent/ES2804205T3/es
Priority to CN201910145745.XA priority patent/CN109799127B/zh
Priority to EP15824166.1A priority patent/EP3173786B1/en
Priority to CN201580051060.9A priority patent/CN107076728B/zh
Priority to PCT/JP2015/069378 priority patent/WO2016013388A1/ja
Priority to JP2016502831A priority patent/JP6139012B2/ja
Priority to CN201910145469.7A priority patent/CN109799126B/zh
Priority to EP17189656.6A priority patent/EP3309548A1/en
Priority to EP17189658.2A priority patent/EP3282261B1/en
Priority to TW107142776A priority patent/TWI734053B/zh
Priority to TW107142778A priority patent/TWI742321B/zh
Priority to TW105102109A priority patent/TWI713488B/zh
Publication of WO2016013115A1 publication Critical patent/WO2016013115A1/ja
Priority to JP2016016516A priority patent/JP6152179B2/ja
Priority to JP2016016515A priority patent/JP2016102806A/ja
Priority to JP2016116927A priority patent/JP6681794B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to JP2017036826A priority patent/JP2017125858A/ja
Priority to US16/860,656 priority patent/US11808777B2/en
Priority to US16/860,549 priority patent/US11808776B2/en
Priority to US18/373,296 priority patent/US20240027480A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/938—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. beta-galactosidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
    • G01N2496/80—Multi-analyte reference solutions containing cholesterol, glucose and the like

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a trace biological sample component and a blood cell for diluting a biological sample such as an undetermined trace amount blood with a predetermined buffer, and analyzing the quantification of the plasma sample component and the enzyme activity from the diluted sample mixed solution. Related to the counting measurement.
  • glycerol-3-phosphate or glycerol is used as an internal standard substance as a method for diluting a small amount of blood with a predetermined buffer and analyzing the plasma sample components and enzyme activity from the diluted sample mixture.
  • the method of using is known (for example, refer patent document 1).
  • glycerol-3-phosphate is used as a diluted internal standard substance for plasma, but it is hydrolyzed by alkaline phosphatase, an enzyme present in the living body, to produce glycerol. . Therefore, if the storage time after adding blood is long, an accurate blood dilution rate cannot be obtained. For this reason, the reliability to the measured value of the biological component and enzyme activity in raw plasma falls. In order to solve such a situation, in the conventional method, it was necessary to add EDTA which is an enzyme inhibitor.
  • An internal standard that solves these problems is a substance that can be used as an internal standard charged with a cation such as choline.
  • a cation such as choline.
  • Patent Document 2 since it has an aromatic ring in the molecule, it is highly hydrophobic, and when stored in a plastic container for a long period of time, adsorption occurs, and the dilution factor of blood cannot be accurately determined.
  • compounds such as ethanolamine are effective as substances that do not have an aromatic ring in the molecule and penetrate into blood cells. These substances are hardly present in blood and are stable compounds. Moreover, it can be dissolved in the buffer solution of the internal standard solution and will not be adsorbed to the plastic container by long-term storage.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is simple and accurate to quantify the components of a small and unknown amount of whole blood sample collected and diluted from the body surface of the subject's finger or the like. It is an object of the present invention to provide a dilution rate calculation method that can be used.
  • the present invention is a method for analyzing a biological component in a biological sample such as blood, and includes a dilution buffer to which the biological sample such as blood is added, and the dilution buffer. Analyzing the internal standard substance, calculating the dilution rate, calculating the dilution rate of the biological component of plasma, serum and blood cells, and analyzing the biological component of the plasma, serum or biological sample in the biological sample such as blood It is characterized by that.
  • the internal standard substance in the buffer solution is stable for a long period of time and is a component that does not adsorb to the container containing the buffer solution, and the internal standard substance is the blood or the like. It is a substance that is hardly contained in a biological sample, and is preferably a substance that can be easily and accurately analyzed by a biochemical automatic analyzer or the like.
  • the internal standard substance in the buffer solution is a component that does not penetrate into the blood cells, and is a substance that can accurately reflect the dilution rate of the plasma or the serum. Preferably there is.
  • the internal standard substance in the buffer solution is a component that penetrates into the blood cells, and is a substance that can accurately reflect the dilution rate of the whole blood (plasma and blood cells). preferable.
  • the buffer solution has an osmotic pressure with respect to a blood cell membrane of 250 to 500 mOsm / kg, and has a reagent composition that does not cause hemolysis of the blood cells even when blood is mixed. Is preferred.
  • the buffer solution has a composition that can be stably maintained without denaturing the biological sample component in the blood.
  • the plasma internal standard substance preferably contains maltose.
  • the plasma concentration can be determined from the dilution rate of plasma, the volume of blood cells cannot be determined. If whole blood (plasma and blood cells) can be obtained, anemia can be tested. Therefore, it is preferable that ethanolamine, which is hydrophobic and does not adsorb plastics, be contained as an internal standard substance that penetrates into blood cells. By measuring this internal standard, the dilution rate of the entire blood volume can be determined. The volume ratio (hematocrit value) of blood cells can be obtained from the dilution ratio of blood plasma and the dilution ratio of the entire blood volume.
  • a plastic container is used for both plasma and biological components of biological samples such as trace and unknown whole blood samples collected from the body through fingers and the like, Accurate quantification is possible. Further, the blood cell volume ratio (hematocrit value), which is the degree of blood anemia, can be obtained by calculation from the plasma dilution rate and the whole blood dilution rate. Furthermore, by using an internal standard of whole blood, it is possible to calculate blood cell components (white blood cell count: WBC, red blood cell count: RBC, hemoglobin content: Hgb, hematocrit: Hct).
  • WBC white blood cell count
  • RBC red blood cell count
  • Hgb hemoglobin content
  • Hct hemoglobin content
  • FIG. 2 shows an explanatory diagram in the case of using an internal standard substance that does not permeate the blood cell membrane of blood but permeates only into plasma.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram when the internal standard substance has a property of penetrating into both blood plasma and blood cells.
  • FIG. 1 It is a correlation diagram of the biochemical test of venous blood plasma and hand blood sampling diluted plasma.
  • Venous blood EDTA-2Na-added whole blood and diluted whole blood obtained by diluting this whole blood with blood dilution buffer were used as samples for white blood cells (WBC), red blood cells (RBC), hemoglobin concentration (Hgb), hematocrit value (Hct), It is the correlation figure which calculated platelet count (Plt).
  • the hematocrit value indicating the blood cell volume in the blood obtained from the calculation formula using the plasma dilution rate obtained from the maltose internal standard and the whole blood dilution rate obtained from ethanolamine, and the hematocrit value obtained by measuring the whole blood with a hemocytometer It is a correlation diagram.
  • the present invention has the following features. That is, according to one aspect of the present invention, there is provided a method for quantifying and analyzing enzyme activity of a biological sample containing blood cells of an unknown concentration collected, wherein the component is not or hardly contained in the biological sample.
  • An internal standard that does not pass through the blood cell membrane is prepared and added to the buffer. Analyze the internal standard concentration in the buffer before adding blood, and measure the absorbance and the concentration of the internal standard in the diluted buffer after adding blood. The plasma dilution rate is determined, and the biological components and enzyme activities in the raw plasma are determined.
  • the osmotic pressure of the buffer solution is adjusted so as to be approximately the blood osmotic pressure.
  • the biological sample with the unknown concentration may be a biological sample (saliva, urine, etc.) that does not contain blood cells.
  • the internal standard substance used in this case may be a substance that permeates the blood cell membrane.
  • hydrogen peroxide is generated by adding an oxidase using the internal standard substance or a substance derived from the internal standard substance as a substrate, and peroxidase
  • There is an enzymatic measurement method in which the color development of a quinone dye, NAD (P) H, or tetrazonium salt obtained by oxidative condensation of a Trinder reagent and 4-aminoantipyrine in the presence is measured and quantified as absorbance.
  • the internal standard substance to be put in the buffer solution is a component that does not exist in the living body or is present in a very small amount, and the blood cell membrane It must be non-permeable, stable in buffer solution, and not adsorbed on the container. It is also necessary not to interfere with other biological components.
  • blood 1 is composed of plasma or serum 2 as a liquid component, and blood cell 3 as a solid component, and blood cell 3 further includes a solid component such as a blood cell membrane and a liquid component inside thereof. It is known to have.
  • EDTA-2 sodium an anticoagulant, to blood 1, clotting of blood cell 3 can be prevented.
  • blood cells 3 having a heavy specific gravity are settled to the bottom and plasma is separated into the supernatant.
  • an internal standard substance 5 that does not permeate the blood cell membrane is stored in the buffer 4 in advance in the container (FIG. 2 (a)), and the collected blood 1 is placed in the buffer 4 from the top of the container. And introduced into the upper side of the mixed layer of the internal standard substance 5 (FIG. 2B).
  • the blood 1 is diluted with a predetermined buffer 4
  • components that do not permeate the blood cell membrane originally present in the plasma or serum 2 are distributed in the buffer 4 and plasma or serum 2, and diluted.
  • the blood diluted solution 6 is obtained (FIG. 2 (c)).
  • the internal standard substance 5 includes an internal standard substance 5 such as maltose that penetrates only into the plasma 2. Since maltose is dissolved as an anion in the buffer 4, it is dissolved in the plasma 2 and does not penetrate into the blood cell 3.
  • the internal standard substance added to the buffer solution to determine the dilution rate of plasma components is a chemical substance with a molecular weight of 500 or less and contains sulfate ions (-SO3-), carboxyl ions (-COO-), thiol groups ( -SH), compounds with substituents such as quaternary amine (-NH3 +), disaccharides such as maltose, glutamic acid, leucine, valine, isoleucine, 4-hydroxyxenebenzene, hydroxybutyric acid, creatine, malic acid, Metals (lithium, sodium, potassium, chlor), Trinder reagent with sulfate group in the molecule (N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline), ADPS (N -Ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline), ALPS (N-ethyl-N-sulfopropylaniline),
  • FIG. 3 shows an explanatory diagram of the distribution of the internal standard substance 5 to whole blood (plasma 2 + blood cells 3).
  • the internal standard substance 5 for example, ethanolamine
  • the internal standard substance 5 that permeates the blood cell membrane is stored in the buffer 4 in advance in the container (FIG. 3 (a)), and the collected blood 1 is mixed with the buffer 4 and the internal standard substance 5 from the upper part of the container. It introduce
  • the blood diluted solution 6 is constituted by being uniformly dispersed in the serum 2 (FIG. 3C). That is, since the internal standard substance 5 used in the case shown in FIG. 3 is distributed in both the plasma 2 and the blood cell 3, the dilution factor by the buffer solution 4 can be obtained.
  • Internal standards that penetrate the blood cell membrane include chemical groups with a molecular weight of 500 or less, amino groups (-NH2), alkyl groups (-CH3, -C6H6), ester groups (-COOR), alkoxy groups (-OR), halogens Compounds with hydrophobic substituents such as (-Cl, -Br, -I), including ethanolamine, hexylamine, phenylethylamine, amyramine, histamine, putrescine, hypoxanthine, tryptophan, pregrenolone, ⁇ -sitosterol It is done. Corresponding to these internal standards can be analyzed by enzymatic measurement using oxidase.
  • the buffer solution 4 for diluting the biological component must be miscible with the biological sample in an arbitrary amount, and it is necessary that the component to be measured in the biological sample can be stably stored.
  • the component of buffer 4 is not limited, but HEPES ⁇ 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid ⁇ buffer having buffering capacity, ACES [N- (2-acetamido) -2 -Aminoethanesulfonic acid] buffer, ADA [N- (2-acetamido) iminodiacetic acid] buffer, BES [N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminosulfonic acid] buffer, Bicine [N , N-bis (2-hydroxyethyl) glycine] buffer, Bis-Tris [bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane] buffer, CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid) buffer Solution, CAPSO (N-cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid) buffer, CHES (N-cyclohexy
  • the pH of the buffer is not particularly limited, but is preferably near the original pH of the biological sample from the viewpoint of the stability of the biological sample to be diluted. In the case of blood, plasma, or serum, pH 6 to 8 is preferable.
  • the dilution buffer may contain a chelating agent, antibacterial agent, preservative, coenzyme, saccharide, inhibitor and the like for the purpose of keeping the component to be measured stable.
  • chelating agents include ethylenediaminetetraacetate, citrate, oxalate and the like.
  • antibacterial agents and preservatives include amikacin sulfate, kanamycin sulfate, thiabendazole, sodium azide and the like.
  • coenzymes examples include pyridoxal phosphate, magnesium, zinc and the like.
  • saccharide examples include mannitol, dextrose, oligosaccharide and the like.
  • inhibitors include sodium dodecyl sulfate, mercury, heparin and the like.
  • Stabilizers may be added in combination of a plurality of types depending on the component to be measured.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT aslanine aminotransferase
  • the buffer preferably contains 0.1 to 5.0 mmol / L of ethylenediaminetetraacetic acid salt and 0.01 to 0.20 mmol / L of pyridoxalphosphate, particularly 0.5 to 3.0 mmol / L of ethylenediaminetetraacetic acid and pyridoxalphosphate. It is preferable that 0.02 to 0.10 mmol / L is contained.
  • the internal standard added to the buffer solution is not in the living body or is extremely small, does not interfere with biological components, is stable in the buffer solution, does not adsorb to the storage container, and can be detected with high accuracy.
  • the system must be available. When diluting blood, an osmotic pressure is required so that blood cells do not hemolyze, and an osmotic pressure of 250 to 500 mOsm / kg is preferable.
  • Table 1 shows the composition of a buffer containing, as an example of a buffer, sarcosine, which is one of internal standards that do not permeate the blood cell membrane, and ethanolamine, which is one of the internal standards that permeate the blood cell membrane. ing.
  • HEPES is N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid.
  • Table 2 shows a measurement reagent for sarcosine, which is one of internal standard substances that do not pass through the blood cell membrane.
  • TOOS is N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline sodium dihydrate.
  • the measurement procedure for maltose is shown below.
  • Table 3 shows the measurement reagent for ethanolamine, which is one of the internal standard substances that pass through the blood cell membrane.
  • DAOS is N-ethyl-N (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline sodium salt.
  • the measurement procedure for ethanolamine is shown below.
  • the above R1 and R2 are used for ethanolamine measurement.
  • 1. Mix 11 ⁇ l of the mixed biological sample and 90 ⁇ l of R1, and leave at 37 ° C. for 5 minutes. 2. Measure absorbance at 596/805 nm wavelength. --A3 (absorbance) 3.
  • blood 1 is composed of plasma 2 which is a liquid component, or blood cells 3 which are serum and solid components, and further, blood cells have a solid component such as a blood cell membrane and a liquid component inside thereof. It is known. Blood can be blocked from clotting by adding EDTA-2 sodium, an anticoagulant. When this whole blood is centrifuged, blood cells with heavy specific gravity settle to the bottom, and plasma is separated into the supernatant.
  • buffer solution 4 when blood 1 is diluted with a predetermined buffer solution 4, components that do not permeate the blood cell membrane originally present in plasma 2 or serum are contained in buffer solution 4 and plasma 2 or serum. Will be distributed and diluted.
  • the internal standard substance originally present in the buffer solution should be distributed in the buffer solution and plasma or serum. And diluted.
  • This internal standard indicates an internal standard such as maltose that penetrates only into plasma. Since maltose is dissolved in the buffer as an anion, it dissolves in plasma and does not penetrate into blood cells. That is, the initial concentration (C0) of the internal standard substance 5 that does not pass through the blood cell membrane in the buffer solution 4 changes to the concentration (C1) when blood is added.
  • the blood 1 When the blood 1 is diluted with a predetermined buffer 4, components that permeate the blood cell membrane will be distributed in the buffer and plasma or serum and blood cells and diluted. At this time, if a specified amount of the internal standard substance that permeates the blood cell membrane is dissolved in the buffer solution, the internal standard substance that is originally present in the buffer solution must be distributed in the buffer solution and plasma, or serum and blood cells. And diluted. That is, the initial concentration (C2) of the internal standard substance that permeates the blood cell membrane in the buffer solution changes to the concentration (C3) when blood is added.
  • C2 concentration of the internal standard substance that permeates the blood cell membrane in the buffer solution changes to the concentration (C3) when blood is added.
  • the volume (V0) of the solution containing the internal standard is the specified amount, the internal standard that does not permeate the blood cell membrane From the calculated dilution ratio (r1) of the biological sample component that does not permeate the blood cell membrane, the volume (V1) of the biological sample that does not permeate the blood cell membrane can be calculated.
  • V1 V0 / (r1-1) It can be calculated by
  • the biological sample is diluted with a solution containing the internal standard substance 5 that permeates the blood cell membrane
  • the volume (V0) of the solution containing the internal standard substance is quantitative, the internal standard substance that permeates the blood cell membrane is used. From the calculated blood dilution rate (r2), the blood volume (V1 + V2 + V3) can be calculated.
  • V1 + V2 + V3 V0 / (r2-1) It can be calculated by
  • V1 obtained from V0 and r1
  • V1, V2, and V3 can be calculated from V0, r1, and r2.
  • V1 Dilution rate of plasma or serum
  • V1 + V2 Whole blood dilution rate
  • V1 + V2 + V3 Blood dilution rate ⁇ (V0 + V1 + V2 + V3) / (V1 + V2 + V3) ⁇ Blood cell volume (V2 + V3) Blood cell dilution rate ⁇ (V0 + V2 + V3) / (V2 + V3) ⁇ Blood cell volume (V2) Dilution rate of blood cell liquid ⁇ (V0 + V2) / V2 ⁇
  • Amount of blood cell solids V3 Blood cell solid dilution rate ⁇ (V0 + V3) / V3 ⁇ Hematocrit value (%) ⁇ (V2 + V3) / (V1 + V2 + V3) ⁇ 100 (%) ⁇ or 1- (blood dilution rate-1) / (plasma dilution rate-1) Buffer
  • dilution buffer obtained by adding ethanolamine, an internal standard distributed in blood cells and plasma, to blood dilution buffer. investigated.
  • FIG. 5 shows a correlation diagram for calculating the platelet count (Plt). According to this, good correlation is recognized except for the platelet count.
  • the present invention is simple and accurate for any component in the plasma and biological samples of biological samples such as trace amounts and unknown amounts of whole blood samples collected from the body through the fingers of the subject as described above. It can be quantified.
  • the blood cell volume ratio (hematocrit value), which is the degree of blood anemia, can be obtained.
  • hematocrit value which is the degree of blood anemia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　手指等から採取した微量かつ未知量の全血試料の血漿成分及び血球成分のいずれの成分に対しても簡便かつ正確に定量及び算定することのできる生体試料成分の分析方法を提供する。本発明は、微量の血液中の生体試料成分を分析する方法であって、前記血液を入れる希釈緩衝液と、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、希釈率を算出し、前記血液中の血漿又は血清成分中の生体成分及び全血中の血球算定（血球成分;白血球数:WBC、赤血球数:RBC、ヘモグロビン量:Hgb、ヘマトクリット:Hct）、そして血漿希釈倍数と血球希釈倍数から計算式で血球体積（ヘマトクリット値）を分析することを特徴とする。

Description

希釈生体試料成分の分析方法
　本発明は、未定量の微量血液などの生体試料を所定の緩衝液で希釈し、希釈された試料混合溶液から、血漿試料成分の定量及び酵素活性を分析する微量生体試料成分の分析方法と血球の計数測定に関する。
　従来、微量の血液を所定の緩衝液で希釈し、希釈された試料混合溶液から、血漿試料成分の定量及び酵素活性を分析する方法としては、内部標準物質としてグリセロール-3-リン酸やグリセロールを使用する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
　また血球成分の計数測定にはその希釈内部標準物質としてチラミンを使用する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）
特開２００６－３２２８２９号公報 特開２０１１-１１２４５１号公報
　しかしながら、上記した従来の希釈率算出法では、血漿の希釈内部標準物質としてはグリセロール-3-リン酸が利用されているが、生体に存在する酵素であるアルカリホスファターゼにより水解され、グリセロールを生成する。従って、血液を添加した後の保存時間が長くなると正確な血液希釈率が得られなくなる。このため、原血漿中の生体成分や酵素活性の測定値への信頼性が低下する。このような状況を解消するため従来の方法では酵素の阻害剤であるEDTAを添加する必要があった。しかしながら、この阻害剤の添加では完全に酵素を阻害できないため、生成物阻害剤としてリン酸を更に添加する必要があり、これら２つの物質の添加によりアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやアラニンアミノトランスフェラーゼの活性が低下することとなる。その結果、これらの酵素の活性化剤であるピリドキサルリン酸を過剰に添加することから他の生体成分測定への影響も生じることとなる。
　これらの問題点を解決する内部標準としては、コリンなどの陽イオンに荷電した内部標準として利用できる物質であるが、プラスチック容器に吸着が認められ、長期間の保存には適さないという課題がある。〔特許文献２〕として申請されているが、分子内に芳香環を持つために疎水性が高く、プラスチックの容器に長期保存すると吸着を起こし、血液の希釈倍数を正確に求めることが出来ないという問題がある。分子内に芳香環を持たず、血球内に浸透する物質としてエタノールアミンなどの化合物が有効であることを見いだした。これらの物質は血液中にほとんど存在せず、しかも安定な化合物である。また、内部標準液の緩衝液に溶けることが可能で、長期保存によりプラスチック容器に吸着することがない。
　本発明は、上記した課題を解決すべくなされたものであり、対象者の手指等の体表面から採取され、希釈された少量かつ未知量の全血試料の成分に対し、簡便かつ正確に定量することのできる希釈率算出法を提供することを目的とする。
　上記した目的を達成するため、本発明は、血液などの生体試料中の生体成分を分析する方法であって、前記血液などの生体試料を添加する希釈緩衝液と、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、希釈率を算出し、血漿、血清や血球の生体成分の希釈率を算出し、前記血液などの生体試料中の血漿、血清又は生体試料中の生体成分を分析することを特徴とする。
　本発明の血漿試料生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は長期間安定であり、前記緩衝液を入れる容器に吸着しない成分であり、前記内部標準物質は前記血液などの生体試料中にほとんど含まれていない物質であり、生化学自動分析装置などで容易且つ精度よく分析可能な物質であるのが好ましい。
　また、本発明の血漿試料生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は前記血球内に浸透しない成分であり、前記血漿や前記血清の希釈率を正確に反映可能な物質であるのが好ましい。同様に血球数の算定方法において、前記緩衝液中の内部標準物質は前記血球内に浸透する成分であり、前記全血（血漿と血球）の希釈率を正確に反映可能な物質であるのが好ましい。
　さらに、本発明の生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液は血球膜に対する浸透圧が250～500mOsm/kgで、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有しているのが好ましい。
　さらにまた、本発明の生体試料成分の分析方法において、前記緩衝液は前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できる組成を有しているのが好ましい。
　さらに、本発明の生体試料成分の分析方法において、血漿内部標準物質はマルトースを含んでいるのが好ましい。
　血漿の希釈率からは血漿濃度を求めることが可能であるが、血球の体積を求めることはできない。血液の全血（血漿と血球）を求めることができれば貧血の検査が可能になる。
　そこで血球内に浸透する内部標準物質として疎水性でプラスチックの吸着がないエタノールアミンを含んでいるのが好ましい。この内部標準を測定することで血液量全体の希釈率を求めることができる。
　血液の血漿の希釈率と血液量全体の希釈率から血球の容積比率（ヘマトクリット値）を求めることが可能となる。
　本発明によれば、手指等を介して体内から採取した微量かつ未知量の全血試料などの生体試料の血漿及び生体試料中のいずれの成分に対してもプラスチック容器を使用して、簡便かつ正確に定量することができる。また血漿希釈率と全血希釈率から計算により血液の貧血の程度である血球容積比率（ヘマトクリット値）を求めることができる。さらに全血の内部標準を用いることで、血球成分（白血球数:WBC、赤血球数:RBC、ヘモグロビン量:Hgb、ヘマトクリット:Hct）の算定が可能となる。
本発明の生体試料成分の分析方法において使用する血液の組成を示す模式図である。 本発明の生体試料成分の分析方法において血液を所定の緩衝液で希釈した状態を示す模式図である。この場合、図２においては血液の血球膜を透過することはなく血漿中にのみ浸透する内部標準物質を使用した場合の説明図を示す。 本発明の生体試料成分の分析方法において血液を所定の緩衝液で希釈した状態を示す模式図である。図３は、内部標準物質が血液の血漿及び血球内部の両方に浸透する性質を有する場合の説明図である。 静脈血血漿と手指採血希釈血漿の生化学検査の相関図である。 静脈採血のEDTA-2Na添加全血とこの全血を血液希釈緩衝液で希釈した希釈全血をそれぞれ試料として白血球（WBC）、赤血球(RBC)、ヘモグロビン濃度(Hgb)、ヘマトクリット値(Hct)、血小板数（Plt）を算定した相関図である。 マルトース内部標準から求めた血漿希釈率とエタノールアミンから求めた全血希釈率を用いて計算式から求めた血液中の血球体積を示すヘマトクリット値と全血を血球計数機で求めたヘマトクリット値との相関図である。
　本発明は以下の特徴を有する。すなわち、本発明の１つの特徴によれば、採取した未知濃度の血球を含む生体試料の成分を定量及び酵素活性分析する方法であって、生体試料に全く含まれない若しくはほとんど含まれない成分であって、血球膜を通過しない内部標準物質を用意し、これを緩衝液中に添加する。血液を添加する前の緩衝液中の内部標準物質濃度を分析し、その吸光度と血液添加後の希釈された緩衝液中の内部標準物質の濃度を測定することで、その吸光度の比率から血液中の血漿希釈率を求め、原血漿中の生体成分や酵素活性を求める。この場合、前記緩衝液の浸透圧がほぼ血液浸透圧となるように調製されるのが好ましい。
　上記未知濃度の生体試料は、血球を含まない生体試料（唾液、尿など）であっても構わない。この場合に用いる内部標準物質は、血球膜を透過する物質であっても構わない。
　緩衝液中の内部標準物質の濃度を測定する代表的な方法としては、その内部標準物質又は内部標準物質から誘導された物質を基質とする酸化酵素を加えることによって過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼ存在下でトリンダー試薬と4-アミノアンチピリンが酸化縮合して得られるキノン色素やNAD(P)H、テトラゾニウム塩の発色を吸光度として測定、定量する酵素的測定法方法がある。
　他にも内部標準物質の定量方法として、内部標準物質自身の吸光度を直接測定する方法、内部標準物質に対する抗体及び標識抗体を用いて吸光度若しくは化学発光によって測定する方法、クロマトグラフィーなどがあり、用いる内部標準物質に応じた定量方法をとり得る事が出来る。
　血液を緩衝液で希釈したときの、血漿成分の正確な希釈率を求めるためには、緩衝液に入れる内部標準物質は生体内に存在しないか、極微量に存在する成分であり、血球膜を透過しないこと、緩衝液中で安定なこと、容器に吸着しないことが必要である。また、他の生体成分に干渉しないことが必要である。
　図１に示すように、血液１は、液体成分である血漿又は血清２、と固体成分である血球３によって構成されており、更に血球３は血球膜などの固体成分とその内側に液体成分を有することが知られている。血液１には抗凝固剤であるEDTA-２ナトリウムを加えることにより血球３の凝固を阻止できる。この全血を遠心すると比重の重い血球３が最下段に沈降し、上清に血漿が分離される。
　また、図２に示すように、予め容器に緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５を収容しておき（図２（ａ））、採取した血液１を容器の上部から緩衝液４と内部標準物質５の混合層の上側に導入する（図２（ｂ））。そして血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿又は血清２に存在する血球膜を透過しない成分は、緩衝液４及び血漿又は血清２中に分布することになり、希釈されて血液希釈溶液６となる（図２（ｃ））。
　この際、緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質５は、緩衝液４及び血漿又は血清２中に分布することになり、希釈される。この内部標準物質５としては血漿２中にのみ浸透するマルトースなどの内部標準物質５を含む。マルトースは陰イオンとして緩衝液４に溶解しているため、血漿２中に溶存して、血球３内には浸透しない。
　血漿成分の希釈率を求めるために緩衝液に添加される内部標準物質としては、分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン（-SO3-）、カルボキシルイオン（-COO-）、チオール基（-SH）、第4級アミン（-NH3+）などの置換基を持つ化合物で、マルトースなどの２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、金属類（リチウム、ナトリウム、カリウム、クロール）、硫酸基を分子内に持つトリンダー試薬である(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる。
　図３に内部標準物質５が全血（血漿２+血球３）への分布の説明図を示す。図３に示す場合の内部標準物質５（たとえば、エタノールアミン）は血漿２と血球３内の両者に浸透する。予め容器に緩衝液４に血球膜を透過する内部標準物質５を収容しておき（図３（ａ））、採取した血液１を容器の上部から緩衝液４と内部標準物質５の混合層の上側に導入する（図３（ｂ））。そして、血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿又は血清２に存在する血球膜を透過する内部標準物質は、血球３及び血漿又は血清２中の両方に存在するが、血漿又は血清２中に均一に分散して血液希釈溶液６を構成する（図３（ｃ））。すなわち、図３に示す場合に使用する内部標準物質５は血漿２と血球３内の両者に分布するので緩衝液４による希釈倍数を求めることができる。
　血球膜を透過する内部標準物質としては、分子量500以下の化学物質でアミノ基（-NH2）、アルキル基（-CH3、-C6H6）、エステル基（-COOR）、アルコシキ基（-OR）、ハロゲン（-Cl, -Br, -I）などの疎水性置換基を持つ化合物で、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールなどが挙げられる。これらの内部標準に対応するは酸化酵素を用いた酵素的測定法で分析することができる。
　これらの内部標準物質は血球内と血漿内に分布するため、全血（血漿＋血球）の希釈倍数を求めることに利用できる。
　生体成分を希釈する緩衝液４は、生体試料と任意の分量で混和可能であり、生体試料中の被測定成分を安定に保存できることが必要である。緩衝液４の成分は限定されないが、緩衝能を有するHEPES｛2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸｝緩衝液、ACES［N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸］緩衝液、ADA［N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸］緩衝液、BES［N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノスルホン酸］緩衝液、Bicine［N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン］緩衝液、Bis-Tris［ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン］緩衝液、CAPS（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、CAPSO（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸）緩衝液、CHES（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）緩衝液、DIPSO｛3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝液、EPPS｛3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸｝緩衝液、HEPPSO｛2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸一水和物｝緩衝液、MES（2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物）緩衝液、MOPS（3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、MOPSO（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、PIPES［ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)］緩衝液、POPSO［ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)二水和物］緩衝液、TAPS［N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸］緩衝液、TAPSO［2-ヒドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノスルホン酸］緩衝液、TES［N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸］緩衝液、Tricine｛N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン｝緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液生理食塩水などが挙げられ、その濃度は特に限定されないが、0.1～1000mmolｌ/Lが好ましく、特に10～500mmol/Lが好ましい。緩衝液のpHは特に限定されないが、希釈する生体試料の安定性の面から生体試料の元来のpH付近が望ましく、血液、血漿又は血清の場合、pH6～8が好ましい。
　希釈緩衝液には被測定成分を安定に保つことを目的にキレート剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類、阻害剤などを含んでもよい。
　キレート剤の一例としては、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。抗菌剤や防腐剤の一例としては、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。補酵素の一例としては、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などが挙げられる。糖類の一例としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などが挙げられる。阻害剤の一例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンなどが挙げられる。
　安定化剤は、被測定成分に応じて複数の種類を組み合わせて添加しても構わない。血液、血漿又は血清を緩衝液で希釈し、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）を被測定成分とする場合、緩衝液中にエチレンジアミン四酢酸塩及びピリドキサルリン酸が含まれていることが好ましい。この場合の緩衝液にはエチレンジアミン四酢酸塩は0.1～5.0mmol/L、ピリドキサルリン酸は0.01～0.20mmol/Lが含まれていることが望ましく、特にエチレンジアミン四酢酸0.5～3.0mmol/L、ピリドキサルリン酸0.02～0.10mmol/Lが含まれていることが好ましい。
　緩衝液に加える内部標準物質は、生体内に無いか極微量であること、生体成分に干渉を与えないこと、緩衝液内で安定であること、保存容器に吸着しないこと、精度よく測定できる検出系が利用できることなどが求められる。また、血液を希釈する場合には、血球が溶血しないような浸透圧が必要であり、250～500mOsm/kgの浸透圧が好ましい。
　表１には緩衝液の一例として、血球膜を透過しない内部標準物質の１つであるサルコシン及び血球膜を透過する内部標準物質の１つであるエタノールアミンを含有する緩衝液の組成が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ここで、HEPESはN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸である。
　表２には、血球膜を通過しない内部標準物質の１つであるサルコシンの測定試薬が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ここで、TOOSはN-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリンナトリウム二水和物である。
　以下に、マルトースの測定手順を示す。
　マルトース測定にあたっては、上記R1およびR2を使用する。
１．7.0μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
２．545/658nm波長で吸光度を測定する。――A1（吸光度）
３．30μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
４．545/658nm波長で吸光度を測定する。――A2（吸光度）
　吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A2-A1として得られる。
　表３には、血球膜を通過する内部標準物質の1つであるエタノールアミンの測定試薬が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ここで、DAOSはN-エチル-Ｎ（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリンナトリウム塩である。
　以下に、エタノールアミンの測定手順を示す。
　エタノールアミン測定にあたって、上記R1およびR2を使用する。
１．11μlの混合生体試料と90μlのR1を混合し、37℃で5分間放置する。
２．596/805nm波長で吸光度を測定する。――A3（吸光度）
３．45μlのR2を混合し、37℃で5分間放置する。
４．546/884nm波長で吸光度を測定する。――A4（吸光度）
　吸光度は測定値の差として表すことができる。従って、一般に吸光度はΔA=A4-A3として得られる。
　吸光度と濃度の関係はLambert-Beerの法則によりA=ε×c×lであることが知られている。ここで、A（吸光度）、ε（モル吸光係数）、c（溶質のモル濃度）、l（光路長）である。吸光度（A）と溶質のモル濃度（c）は比例関係にあり、既知濃度の溶質が溶けた溶液を測定し得られた検量線を用いることによって、一般に未知試料中の溶質の濃度が算出される。
　図１に示すように、血液１は、液体成分である血漿２又は、血清と固体成分である血球３によって構成されており、更に血球は血球膜などの固体成分とその内側に液体成分を有することが知られている。血液は抗凝固剤であるEDTA-２ナトリウムを加えることで血球の凝固を阻止できる。この全血を遠心すると比重の重い血球が最下段に沈降し、上清に血漿が分離される。
　また、図２に示すように、血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、本来、血漿２又は血清に存在する血球膜を透過しない成分は、緩衝液４及び血漿２又は、血清中に分布することになり、希釈される。
　この際、緩衝液４に血球膜を透過しない内部標準物質５が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質は、緩衝液及び血漿又は、血清中に分布することになり、希釈される。この内部標準は血漿中にのみ浸透するマルトースなどの内部標準を示す。マルトースは陰イオンとして緩衝液に溶解しているため、血漿中に溶存して、血球内には浸透しない。
　つまり、緩衝液４中の血球膜を透過しない内部標準物質５の初期濃度（C0）は、血液が添加されることによって濃度（C1）へ変化する。このC0及びC1によって、血漿又は、血清の希釈率（r1）=C0/（C0-C1）が算出される。ここで、本来血漿又は、血清に存在する血球膜を透過しない成分の希釈率は、血漿２又は、血清の希釈率と等しいので、r1=（V0+V1）/V1=C0/（C0-C1）によって算出される。
　血液１を所定の緩衝液４で希釈した場合、血球膜を透過する成分は、緩衝液及び血漿又は血清及び血球中に分布することになり、希釈される。この際、緩衝液に血球膜を透過する内部標準物質が規定量溶解している場合、本来緩衝液中に存在するこの内部標準物質は、緩衝液及び血漿又は、血清及び血球中に分布することになり、希釈される。つまり、緩衝液中の血球膜を透過する内部標準物質の初期濃度（C2）は、血液が添加されることによって濃度（C3）へ変化する。このC2及びC3によって、血液全体の希釈率（r2）=（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）=C2/（C2-C3）が算出される。ここで、本来血漿又は、血清及び血球液体に存在する血球膜を透過する成分の希釈率は、血液全体の希釈率と等しいので、r2=（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）=C2/（C2-C3）によって算出される。
　これらは、以下の表４に示すいずれの場合でも利用可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　さらに、血球膜を透過しない内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、内部標準物質が含まれる溶液の容量（V0）が規定量であれば、血球膜を透過しない内部標準物質から算出される血球膜を透過しない生体試料成分の希釈率（r1）より、血球膜を透過しない生体試料の容量（V1）が算出できる。
　すなわち、
V1=V0/（r1-1）
で算出できる。
　また、血球膜を透過する内部標準物質５が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、内部標準物質が含まれる溶液の容量（V0）が定量であれば、血球膜を透過する内部標準物質から算出される血液の希釈率（r2）より、血液の容量（V1+V2+V3）が算出できる。
　すなわち、
V1+V2+V3 =V0/（r2-1）
で算出できる。
　血球膜を透過しない内部標準物質と血球膜を透過する内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、V0とr1から求められるV1と、V0とr2から求められるV1+V2+V3の両式より、
V2+V3 =（V1+V2+V3）- V1 = V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)が算出できる。
　また、血球は65%の液体と35%の固体から成ることが知られている。
V2/（V2+V3）= 0.65より
V2 = 0.65×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
V3 = 0.35×V2/0.65
V3 = 0.35×{V0 / (r2 - 1) - V0 / (r1 - 1)}
　従って、血球膜を透過しない内部標準物質を含む溶液、血球膜を透過する内部標準物質を含む溶液又は、血球膜を透過しない内部標準物質と血球膜を透過する内部標準物質が含まれる溶液で生体試料を希釈する際、V0、r1、r2によってV1、V2、V3が算出可能である。
　さらに、V0、r1、r2、V1、V2、V3を組み合わせることによって、
血漿又は、血清の量（V1）
血漿又は、血清の希釈率（r1）
血漿又は、血清及び血球液体の量（V1+V2）
血液全体の希釈率（r2）
血液量（V1+V2+V3）
血液の希釈率{（V0+V1+V2+V3）/（V1+V2+V3）}
血球量（V2+V3）
血球の希釈率{（V0+V2+V3）/（V2+V3）}
血球液体の量（V2）
血球液体の希釈率{（V0+V2）/V2}
血球固体の量（V3）
血球固体の希釈率{（V0+V3）/V3}
ヘマトクリット値（％）{（V2+V3）/（V1+V2+V3）×100(%)}または1-（血液希釈率-1）/（血漿希釈率-1）
緩衝液の量（V0）
緩衝液の血漿又は、血清に対する希釈率{（V0+V1）/V0}
緩衝液の血漿又は、血清及び血球液体に対する希釈率{（V0+V1+V2）/V0}
緩衝液の血液に対する希釈率{（V0+V1+V2+V3）/V0}
緩衝液の血球液体に対する希釈率{（V0+V2）/V0}
緩衝液の血球固体に対する希釈率{（V0+V3）/V0}
緩衝液の血球に対する希釈率{（V0+V2+V3）/V0}
　などが算出可能である。V0、r1、r2、V1、V2、V3を単独または組み合わせることによって算出できるものは、上記の例に限定されるものではない。
　以下、本発明の実施例について説明する。
　マルトースを内部標準物質として希釈緩衝液に添加した血液希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200 μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。希釈なしの全血を遠心して得られた血漿の測定値と希釈した血漿の測定値に内部標準で希釈倍数を乗じて求めた希釈血漿測定値について相関を調べた結果、図１に示すように酵素活性（トランスアミナーゼ;ALT,γ-グルタミルトランスフェラーゼ;GGT）、脂質検査（中性脂肪；TG、LDL-コレステロール、グルコース、ヘモグロビンA1c）の検査で良好な相関性が得られた。
　血球および血漿に分布する内部標準であるエタノールアミンを血液希釈緩衝液に添加した希釈緩衝液にEDTA-2Na添加した全血試料を60μLと血液希釈緩衝液を200μL加え、50例の静脈血液試料について検討した。
　静脈採血のEDTA-2Na添加全血とこの全血を血液希釈緩衝液で希釈した希釈全血をそれぞれ試料として白血球（WBC）、赤血球(RBC)、ヘモグロビン濃度(Hgb)、ヘマトクリット値(Hct)、血小板数（Plt）を算定した相関図を図５に示す。これによれば血小板数を除き、良好な相関性が認められる。
　マルトース内部標準から求めた血漿希釈率とエタノールアミンから求めた全血希釈率を用いて計算式から求めた血液中の血球体積を示すヘマトクリット値と全血を血球計数機で求めた値との相関を調べた。その結果を図６に示す。良好な相関性で実用性がある。
　本発明は、上記したように対象者の手指等を介して体内から採取した微量かつ未知量の全血試料などの生体試料の血漿及び生体試料中のいずれの成分に対しても簡便かつ正確に定量することができる。また血液の貧血の程度である血球容積比率（ヘマトクリット値）を求めることができる。これにより、対象者自身でも行うことができる、血液等の微量採取にもかかわらず、かつ採取から長時間経過後においても対象者の血液等の採取された生体試料の分析を正確に行うことができる。したがって、対象者の健康診断に有効に利用することができ、産業上の利用性が高い。
　１：血液
　２：血漿（血清）
　３：血球
　４：緩衝液
　５：内部標準物
　６：血液希釈溶液

Claims (8)

  1. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透しない性質を有しており、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬、リチウム、ナトリウム、カリウム、クロールからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
  2. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が血球内に浸透する性質を有しており、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質である内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
  3. 　試料血液を入れるための希釈緩衝液を用い、該希釈緩衝液中に含まれる内部標準物質を分析し、血液又は血漿又は血清の希釈率を算出し、前記試料血液中の血球算定数や血漿の生体成分または前記試料血液中の血漿又は血清成分中の生体成分を分析する生体試料成分の分析方法において、
    　前記希釈緩衝液は、
    　血球内に浸透しない性質を有する前記内部標準物質であって、マルトースを含む２単糖類、グルタミン酸、ロイシン、バリン、イソロイシン、4-ハイドロキシンベンゼン、ハイドロキシ酪酸、クレアチン、リンゴ酸、トリンダー試薬からなる群から選ばれる物質と、
    　血球内に浸透する性質を有する前記内部標準物質であって、エタノールアミン、ヘキシルアミン、フェニールエチルアミン、アミールアミン、ヒスタミン、プトレシン、ヒポキサンチン、トリプトファン、プレグレノロン、β-シトステロールからなる群から選ばれる物質とを含む生体試料成分の分析方法。
  4. 　前記希釈緩衝液に含まれる内部標準物質が分子量500以下の化学物質で分子内に硫酸イオン（-SO3-）、カルボキシルイオン（-COO-）、チオール基（-SH）、第4級アミン（-NH3+）、リチウム、ナトリウム、カリウム、クロールからなる群から選ばれる置換基を持つ化合物から選ばれる内部標準物質を用いた請求項１に記載の生体試料成分の分析方法。
  5. 　前記トリンダー試薬がADOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、ADPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン)、ALPS(N-エチル-N-スルホプロピルアニリン)、DAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、HDAOS(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン)、MAOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメチルアニリン)、TOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン)、TOPS(N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン)から成る群から選ばれる化合物である請求項１に記載の化合物から選ばれる内部標準物質を用いた生体試料成分の分析方法。
  6. 　前記希釈緩衝液は、血液が混合されても前記血球の溶血が生じない試薬組成を有している請求項１から５のいずれか１つの請求項に記載の生体試料成分の分析方法。
  7. 　前記希釈緩衝液が前記血液中の生体試料成分を変性させることなく、安定に維持できるように、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などのキレート剤、アミカシン硫酸塩、カナマイシン硫酸塩、チアベンダゾール、アジ化ナトリウムなどの抗菌剤や防腐剤、ピリドキサルリン酸、マグネシウム、亜鉛などの補酵素、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖などの糖類、ドデシル硫酸ナトリウム、水銀、ヘパリンからなる群から選択される阻害剤を被測定成分に応じて単独若しくは複数組み合わされた組成の添加物を含む請求項１から６のいずれか１つの請求項に記載の生体試料成分の分析方法。
  8. 　前記内部標準物質の希釈率から血液の血球容積率（ヘマトクリット値）を算出することを特徴とする請求項３に記載の生体試料成分の分析方法。
PCT/JP2014/069718 2014-07-25 2014-07-25 希釈生体試料成分の分析方法 Ceased WO2016013115A1 (ja)

Priority Applications (21)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/069718 WO2016013115A1 (ja) 2014-07-25 2014-07-25 希釈生体試料成分の分析方法
US15/328,977 US10712354B2 (en) 2014-07-25 2015-07-06 Method of analyzing diluted biological sample component
ES17189658T ES2804205T3 (es) 2014-07-25 2015-07-06 Método de análisis para componente de muestra biológica diluida
CN201910145745.XA CN109799127B (zh) 2014-07-25 2015-07-06 稀释生物样品成分的分析方法
EP15824166.1A EP3173786B1 (en) 2014-07-25 2015-07-06 Method of analyzing diluted biological sample component
CN201580051060.9A CN107076728B (zh) 2014-07-25 2015-07-06 稀释生物样品成分的分析方法
PCT/JP2015/069378 WO2016013388A1 (ja) 2014-07-25 2015-07-06 希釈生体試料成分の分析方法
JP2016502831A JP6139012B2 (ja) 2014-07-25 2015-07-06 希釈生体試料成分の分析方法
CN201910145469.7A CN109799126B (zh) 2014-07-25 2015-07-06 稀释生物样品成分的分析方法
EP17189656.6A EP3309548A1 (en) 2014-07-25 2015-07-06 Analysis method for diluted biological sample component
EP17189658.2A EP3282261B1 (en) 2014-07-25 2015-07-06 Analysis method for diluted biological sample component
TW107142776A TWI734053B (zh) 2014-07-25 2016-01-22 經稀釋之活體樣品成分之分析方法
TW107142778A TWI742321B (zh) 2014-07-25 2016-01-22 經稀釋之活體樣品成分之分析方法
TW105102109A TWI713488B (zh) 2014-07-25 2016-01-22 經稀釋之活體樣品成分之分析方法
JP2016016516A JP6152179B2 (ja) 2014-07-25 2016-01-29 希釈生体試料成分の分析方法（外部標準法）
JP2016016515A JP2016102806A (ja) 2014-07-25 2016-01-29 希釈生体試料成分の分析方法（内部標準法）
JP2016116927A JP6681794B2 (ja) 2014-07-25 2016-06-13 希釈生体試料成分の分析方法（内部標準法）
JP2017036826A JP2017125858A (ja) 2014-07-25 2017-02-28 希釈生体試料成分の分析方法（外部標準法）
US16/860,656 US11808777B2 (en) 2014-07-25 2020-04-28 Method of analyzing diluted biological sample component
US16/860,549 US11808776B2 (en) 2014-07-25 2020-04-28 Method of analyzing diluted biological sample component
US18/373,296 US20240027480A1 (en) 2014-07-25 2023-09-27 Method of analyzing diluted biological sample component

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/069718 WO2016013115A1 (ja) 2014-07-25 2014-07-25 希釈生体試料成分の分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016013115A1 true WO2016013115A1 (ja) 2016-01-28

Family

ID=55162667

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/069718 Ceased WO2016013115A1 (ja) 2014-07-25 2014-07-25 希釈生体試料成分の分析方法
PCT/JP2015/069378 Ceased WO2016013388A1 (ja) 2014-07-25 2015-07-06 希釈生体試料成分の分析方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/069378 Ceased WO2016013388A1 (ja) 2014-07-25 2015-07-06 希釈生体試料成分の分析方法

Country Status (7)

Country Link
US (4) US10712354B2 (ja)
EP (3) EP3282261B1 (ja)
JP (5) JP6139012B2 (ja)
CN (3) CN109799126B (ja)
ES (1) ES2804205T3 (ja)
TW (3) TWI742321B (ja)
WO (2) WO2016013115A1 (ja)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016013115A1 (ja) 2014-07-25 2016-01-28 株式会社 リージャー 希釈生体試料成分の分析方法
JP6495768B2 (ja) * 2015-07-06 2019-04-03 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789108B2 (ja) * 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789109B2 (ja) 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789106B2 (ja) 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液分析方法及び血液検査キット
JP6789107B2 (ja) * 2016-12-28 2020-11-25 富士フイルム株式会社 血液検査キット及び血液分析方法
CA3125914A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 1866402 Ontario Limited Blood separation and analysis device and methods
CN110488004A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的25-羟基维生素d试剂盒及其制备方法和应用
CN110488003A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的甲状旁腺激素试剂盒及其制备方法和应用
CN110488008A (zh) * 2019-09-26 2019-11-22 北京华科泰生物技术股份有限公司 一种用于检测末梢血的25-羟基维生素d3试剂盒及其制备方法和应用
CN111239120A (zh) * 2020-02-26 2020-06-05 绍兴市人民医院 一种血液钙离子检测试纸
CN113466148A (zh) * 2021-06-18 2021-10-01 铜陵有色金属集团股份有限公司 铜电解液中有效明胶的测试方法
CN115825173A (zh) * 2021-09-18 2023-03-21 艾康生物技术(杭州)有限公司 一种质控液及其应用
CN115078737B (zh) * 2022-06-30 2023-04-28 山东帝俊生物技术有限公司 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用
TWI872888B (zh) * 2022-12-30 2025-02-11 財團法人工業技術研究院 用於穩定血液中游離核酸及/或外泌體核酸的組成物、含其之試劑與套組以及其用途
CN116223813A (zh) * 2023-02-23 2023-06-06 深圳市雷诺华科技实业有限公司 一种电化学发光层析法测定心肌肌钙蛋白i的试剂盒及其测定方法
WO2024204342A1 (ja) * 2023-03-31 2024-10-03 株式会社Provigate 体液試料を輸送又は保存するための溶液及び方法
CN116625772A (zh) * 2023-05-25 2023-08-22 安徽九陆生物科技有限公司 一种微量血液过滤的方法及应用
CN119846191A (zh) * 2024-12-31 2025-04-18 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 全血样本中待测物的免疫学检测方法
CN120741382B (zh) * 2025-09-01 2025-11-28 山东子峰生物技术有限公司 一种hct检测试剂盒及检测hct的方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006322829A (ja) * 2005-05-19 2006-11-30 Leisure Inc 未定量の生体試料の定量分析方法
JP2011112451A (ja) * 2009-11-25 2011-06-09 Physical Screening Inc 生体試料成分の分析方法

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3137759A (en) * 1959-09-01 1964-06-16 Technicon Instr Spectral-flame burner apparatus and spectral-flame burners therefor
US4378430A (en) * 1979-09-11 1983-03-29 Modrovich Ivan Endre Method of forming stabilized urease solutions
JPS5920150A (ja) 1982-07-24 1984-02-01 株式会社東芝 血球カウンタ
JPH0233360B2 (ja) * 1982-09-17 1990-07-26 Sekisui Chemical Co Ltd Tanjusannoteiryoho
DE3587685T2 (de) * 1984-07-05 1994-07-14 Jerald C Nelson Dialysierzelle.
JPS61110058A (ja) * 1984-11-02 1986-05-28 Fuji Photo Film Co Ltd アルカリ性ホスフアタ−ゼ活性測定用一体型多層分析要素
US5252333A (en) * 1987-04-27 1993-10-12 Scotia Holdings Plc Lithium salt-containing pharmaceutical compositions
JPH03140844A (ja) 1989-10-26 1991-06-14 Shimadzu Corp 微小試料による多項目分析方法
JPH06148193A (ja) 1992-11-02 1994-05-27 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk 抗リン脂質抗体結合用担体及び該担体を用いた免疫学的測定法
JP3206999B2 (ja) * 1992-12-18 2001-09-10 オリンパス光学工業株式会社 サンプル希釈誤差の検出方法およびそれを用いるサンプル希釈誤差の検出装置
JPH10104226A (ja) 1996-09-30 1998-04-24 Masaki Kobayashi 血液検体採集カード
CN1178701C (zh) * 1997-02-04 2004-12-08 法诺斯技术公司 检测异常上皮细胞脱落的方法
US5998224A (en) * 1997-05-16 1999-12-07 Abbott Laboratories Magnetically assisted binding assays utilizing a magnetically responsive reagent
IL124099A (en) * 1998-04-15 2001-03-19 Univ Ben Gurion Method for diagnosing bipolar disorder and predicting the response of bipolar disorder patients to lithium therapy
KR100608276B1 (ko) * 1998-08-24 2006-08-02 무라마쯔 다카시 동맥경화 및 ｐｔｃａ술후의 혈관 재협착에 대한예방·치료제
JP4194158B2 (ja) 1998-12-25 2008-12-10 株式会社三菱化学ヤトロン 尿素窒素測定方法および尿素窒素測定用試薬
US7011977B2 (en) * 1999-01-30 2006-03-14 Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc. Quantification of carnitine levels in dialysis patients
US6936473B2 (en) 2000-01-05 2005-08-30 Leisure, Inc. Method of preparing a biological sample for quantification
US7202395B2 (en) * 2000-01-19 2007-04-10 The University Of York Assessment method
JP3643011B2 (ja) * 2000-05-18 2005-04-27 アークレイ株式会社 定量分析法
AUPQ776800A0 (en) * 2000-05-26 2000-06-22 Seba Diagnostics Pty. Ltd. Detection method and reagents
DE60116794T2 (de) 2000-09-25 2006-08-31 Picoliter, Inc., Sunnyvale Schallausstoss von fluiden aus mehreren behältern
EP1270041A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-02 Universite De Geneve Device for non-invasively determining the relative levels of two substances present in a biological system
TWI247615B (en) * 2003-09-22 2006-01-21 Leisure Inc Apparatus for separating biological sample and separating method of the same
CN100456028C (zh) * 2003-11-28 2009-01-28 宝山钢铁股份有限公司 测量铁矿石总铁含量用的氧化钴内标试剂的制造方法
CN1786187A (zh) * 2004-12-10 2006-06-14 苏州艾杰生物科技有限公司 酶法测定钾离子含量的方法及钾离子诊断试剂盒
CN1786186A (zh) * 2004-12-10 2006-06-14 苏州艾杰生物科技有限公司 酶法测定钠离子含量的方法及钠离子诊断试剂盒
CN1693881A (zh) * 2005-02-06 2005-11-09 浙江亚克药业有限公司 偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶的方法和试剂盒
US7541190B2 (en) * 2005-02-07 2009-06-02 Beckman Coulter, Inc. Method of measurement of cellular hemoglobin
GB2430437A (en) * 2005-09-27 2007-03-28 3M Innovative Properties Co Method of making a fluoropolymer
DK1911358T3 (da) * 2006-10-13 2009-10-26 Gervais Danone Sa Ny sammensætning til forbedring af hudkvalitet og fremgangmåde til fremstilling deraf
CN101169427A (zh) * 2006-10-24 2008-04-30 苏州艾杰生物科技有限公司 钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法
CN101173930A (zh) * 2006-10-30 2008-05-07 苏州艾杰生物科技有限公司 钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法
CN101173929A (zh) * 2006-10-30 2008-05-07 苏州艾杰生物科技有限公司 钠诊断/测定试剂盒及钠的浓度测定方法
CN101210930A (zh) * 2006-12-27 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种测定血清中镁含量的方法
US7955867B2 (en) * 2007-01-31 2011-06-07 Millipore Corporation High throughput cell-based assays, methods of use and kits
JP4940430B2 (ja) * 2007-02-19 2012-05-30 国立大学法人 千葉大学 グルタミン酸の定量方法及びグルタミン酸定量装置。
CN101464299A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
CN101464355A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 苏州艾杰生物科技有限公司 钠(离子)诊断/测定试剂盒及钠(离子)浓度测定方法
WO2009116546A1 (ja) 2008-03-18 2009-09-24 国立大学法人 岡山大学 興奮性化学伝達調節剤およびそのスクリーニング法
JP2012501681A (ja) 2008-09-12 2012-01-26 ジェンボールト コーポレイション 生体分子の貯蔵および安定化のためのマトリックスおよび媒体
CN101475988A (zh) * 2009-02-03 2009-07-08 戴立忠 一种实时荧光定量pcr实验内标的设计方法
ES2578479T3 (es) * 2009-04-28 2016-07-27 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Método de medición que usa sustancia de patrón interno
CN101813675B (zh) * 2010-04-13 2012-11-14 上海市公安局刑事侦查总队 检测全血、尿中吗啡类生物碱的lc-ms/ms分析方法
CN102234333A (zh) * 2010-05-08 2011-11-09 国家海洋环境监测中心 滴滴涕代谢物dda的多抗血清制备及快速检测方法建立
US20120277999A1 (en) * 2010-10-29 2012-11-01 Pbd Biodiagnostics, Llc Methods, kits and arrays for screening for, predicting and identifying donors for hematopoietic cell transplantation, and predicting risk of hematopoietic cell transplant (hct) to induce graft vs. host disease (gvhd)
US9638706B2 (en) 2011-07-21 2017-05-02 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Standard solution for use in analysis of amino acid in plasma
US20140234988A1 (en) * 2011-08-18 2014-08-21 Medizinische Universitaet Graz Methods for Diagnosing and Treating Medical Conditions Associated With Oxidative Stress
CN102424852B (zh) * 2011-12-27 2014-04-02 戴立忠 实时荧光定量pcr检测方法
US20130186450A1 (en) * 2012-01-23 2013-07-25 Seldon Energy Partners, LLC Solar Power System
JP5100903B1 (ja) * 2012-04-06 2012-12-19 Ａｋｊグローバルテクノロジー株式会社 リチウム試薬組成物、それを用いたリチウムイオン測定方法及び測定装置
CN102621267B (zh) * 2012-04-09 2014-08-06 江苏省中医院 一种测定血浆或尿液中d-山梨醇浓度的方法
CN102706815B (zh) * 2012-05-25 2014-07-02 中国航空工业集团公司北京航空材料研究院 一种测定纯Hf中痕量元素钠的方法
CN102735664B (zh) * 2012-06-18 2014-12-10 中国科学院化学研究所 钾离子浓度检测方法
CN102866148B (zh) 2012-06-18 2015-07-08 中国科学院化学研究所 钾离子浓度检测方法
JP5920150B2 (ja) 2012-09-28 2016-05-18 ブラザー工業株式会社 画像形成装置
JP5222432B1 (ja) 2012-11-07 2013-06-26 Ａｋｊグローバルテクノロジー株式会社 リチウム測定方法
US9169509B2 (en) * 2013-01-15 2015-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Topoisomerase 2b as a predictor of susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity
CN103323308B (zh) 2013-05-23 2016-01-06 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种处理微量全血的试剂及其应用
WO2016013115A1 (ja) * 2014-07-25 2016-01-28 株式会社 リージャー 希釈生体試料成分の分析方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006322829A (ja) * 2005-05-19 2006-11-30 Leisure Inc 未定量の生体試料の定量分析方法
JP2011112451A (ja) * 2009-11-25 2011-06-09 Physical Screening Inc 生体試料成分の分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISATO MOMII ET AL.: "Shushi Saiketsu ni yoru Kishaku Shiryochu no Seitai Seibun Sokutei ni Okeru Naibu Hyojun Busshitsu no Sokuteiho Kaihatsu", SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI, vol. 35, no. 1, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 84 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL., THE JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY, vol. 62, no. 3, 25 March 2014 (2014-03-25), pages 235 - 240 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL.: "Futatsu no Naibu Hyojun Kishakuho o Mochiita Seikagaku Komoku to Hematocrit no Sokutei", SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI, vol. 35, no. 1, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 85 *
SHIN'YA SUGIMOTO ET AL.: "Shushi Saiketsu ni yoru Naibu Hyojun Tenka Kishaku Kessho o Mochiita Seikagaku Kensa to Hematocrit-chi no Sokutei", vol. 40, no. issue 1, 31 July 2011 (2011-07-31), pages 222 *
SUSUMU OSAWA ET AL.: "Biryo Shushi Saiketsu Kensaho no Ketsueki Kishaku ni Mochiiru Kanshoeki Naibu Hyojun Busshitsu no Kento", RINSHO KAGAKU, vol. 42, no. issue 1, 31 July 2013 (2013-07-31), pages 190 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3282261A1 (en) 2018-02-14
WO2016013388A1 (ja) 2016-01-28
TW201908733A (zh) 2019-03-01
TWI734053B (zh) 2021-07-21
EP3282261B1 (en) 2020-04-22
US20200319215A1 (en) 2020-10-08
JP2017125858A (ja) 2017-07-20
JPWO2016013388A1 (ja) 2017-04-27
EP3173786A1 (en) 2017-05-31
JP6152179B2 (ja) 2017-06-21
TW201702597A (zh) 2017-01-16
US11808777B2 (en) 2023-11-07
US10712354B2 (en) 2020-07-14
CN109799127B (zh) 2022-05-31
US20200319216A1 (en) 2020-10-08
TW201908732A (zh) 2019-03-01
JP6139012B2 (ja) 2017-05-31
US20170205433A1 (en) 2017-07-20
ES2804205T3 (es) 2021-02-04
CN109799126B (zh) 2022-03-01
CN107076728A (zh) 2017-08-18
TWI713488B (zh) 2020-12-21
CN107076728B (zh) 2020-07-31
JP6681794B2 (ja) 2020-04-15
CN109799127A (zh) 2019-05-24
JP2016191709A (ja) 2016-11-10
EP3173786B1 (en) 2019-10-23
JP2016102806A (ja) 2016-06-02
JP2016118565A (ja) 2016-06-30
CN109799126A (zh) 2019-05-24
US11808776B2 (en) 2023-11-07
US20240027480A1 (en) 2024-01-25
EP3173786A4 (en) 2017-12-27
TWI742321B (zh) 2021-10-11
EP3309548A1 (en) 2018-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016013115A1 (ja) 希釈生体試料成分の分析方法
KR102211991B1 (ko) 혈액 샘플 분석 방법
CN104076158A (zh) 一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒
JP2011112451A (ja) 生体試料成分の分析方法
JP7484998B2 (ja) 測定感度を改善した生体成分測定キット及び生体成分測定方法
WO2015189960A1 (ja) 血液試料採取器具
US20150147798A1 (en) Method for stabilizing ascorbic acid oxidase
JP7314931B2 (ja) 生体成分測定試薬キットの感度低下抑制方法
JP6461005B2 (ja) 血清又は血漿中の低密度リポ蛋白の凍結乾燥による変性抑制剤及び変性抑制方法
JP7206631B2 (ja) ４－ヒドロキシアンチピリンの定量方法、並びに生体成分測定キットの製造方法及び生体成分測定キット
WO2017006409A1 (ja) 希釈血漿を検査試料として用いる測定法への正確さの伝達方法
JPWO2013161675A1 (ja) 血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14898266

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14898266

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1