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ES2328597T3 - Modulacion de nkg2d. - Google Patents

Modulacion de nkg2d. Download PDF

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ES2328597T3
ES2328597T3 ES05761976T ES05761976T ES2328597T3 ES 2328597 T3 ES2328597 T3 ES 2328597T3 ES 05761976 T ES05761976 T ES 05761976T ES 05761976 T ES05761976 T ES 05761976T ES 2328597 T3 ES2328597 T3 ES 2328597T3
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ES
Spain
Prior art keywords
nkg2d
cells
agent
mice
antibody
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES05761976T
Other languages
English (en)
Inventor
Lewis L. Lanier
Koetsu Ogasawara
Jeffrey A. Bluestone
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

Un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos que expresan NKG2D para uso en el tratamiento o prevención de un síndrome asociado a la activación mediada por NKG2D en un sujeto humano, en donde el síndrome se selecciona entre el grupo constituido por una enfermedad autoinmune inflamatoria y rechazo de transplante, y en donde el agente reduce la cantidad de NKG2D sobre la superficie de los leucocitos y en donde el agente comprende un anticuerpo que se une a NKG2D, un fragmento de unión de NKG2D del mismo, o un ARNi codificado por una secuencia de ADN que comprende las SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 1

Description

Modulación de NKG2D.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para uso en el tratamiento y/o prevención de síndromes inflamatorios, en particular mediante alteración de la expansión y función de las células T autorreactivas, y cualesquiera características de la invención adicionales relacionadas con la misma. Además, la presente invención proporciona composiciones para uso en el rechazo de injertos mediada por las células NK.
Antecedentes de la invención
NKG2D es un receptor de activación que se expresa en seres humanos y ratones en células NK y ciertos tipos de células T. NKG2D reconoce la proteína de unión a UL16 (ULBP1), ULBP2, ULBP3, ULBP4, y moléculas relacionadas con la cadena de MHC clase I (M ICA y MICB) en seres humanos, y antígeno 60 de histocompatibilidad secundaria (H60), transcripción inducible temprana de ácido retinoico (RAE1), y transcripción de tipo ULBP de tipo murino 1 (MULT-1) en ratones. Homodímeros NKG2D asociados a la molécula adaptadora DAP10, que contiene el motivo de unión a p85 fosfatidil inositol-3-quinasa de consenso (PI3-K) Tyr-Ile-Asn-Met (YINM, establecido como la SEC ID Nº: 9). NKG2D y DAP 10 interactúan de manera temprana en su ruta biosintética y esta interacción se requiere para el transporte de NKG2D a la superficie de las células.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona composiciones para uso en el tratamiento o prevención de un síndrome asociado a activación mediada por NKG2D.
En un aspecto, los usos se llevan a cabo poniendo en contacto los leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de las células en condiciones adecuadas para tratar o prevenir el síndrome. En algunas realizaciones, el contacto da como resultado una reducción de al menos aproximadamente el 30% en una activación de NKG2D inducida por ligando; en otras realizaciones, la reducción es al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% con relación a un control.
El agente puede, sin limitación, reducir la interacción de NKG2D con DAP10; reducir la cantidad de NKG2D sobre la superficie de las células; incrementar la velocidad a la que NKG2D de superficie se internaliza; reducir la señalización a través del complejo de NKG2D-ligando de NKG2D; y/o reducir la transcripción o traducción de los ácidos nucleicos que codifican NKG2D. En algunas realizaciones, el agente potencia la internalización de los polipéptidos de NKG2D de superficie en condiciones (tales como, por ejemplo, los presentes en los síndromes inflamatorios crónicos) en los que uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, o ULBP4 no pueden disminuir la cantidad de NKG2D de superficie celular hasta el grado que seria necesario (en el caso de un agente terapéutico) proporcionar un beneficio terapéutico. El agente usado de acuerdo con la invención, comprende un anticuerpo que se une a NKG2D, y el fragmento de unión a NKG2D del mismos o un ARNi codificado por una secuencia de ADN que comprende la SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 12. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico.
En la puesta en práctica de la invención, los leucocitos diana pueden ser uno o más de un NKG2D+ CD8 + célula T, un NKG2D+ CD4 + Célula T, un NKG2D+ \gamma\delta Célula T; y un NKG2D + Célula NK; o las células T diana pueden comprender células de macrófagos.
En un aspecto, la invención proporciona el agente para uso en el tratamiento y/o prevención de un síndrome antiinflamatorio asociado a la Activación mediada por NKG2D en un mamífero tal como un paciente humano. Al paciente humano se le puede diagnosticar estar afectado o presentar riesgo sustancial de desarrollar tal síndrome inflamatorio. En un aspecto particular, el uso de la invención se refiere al tratamiento de una afección diagnosticada en un paciente humano.
En aspectos separados, la invención también proporciona el agente para uso en el tratamiento o prevención de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad celíaca, enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, psoriasis, o rechazo de transplante. Los síndromes a los que la presente invención también se pueden aplicar incluyen, sin limitación, diabetes mellitus de tipo I, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, síndrome de Guillain-Barré, uveitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Grave, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, arteritis temporal, síndrome anti-antifosfolipídico, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, dermatitis herpetiforme, pénfigo vulgar, vitiligo, artritis psoriática, osteoartritis, asma resistente a esteroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y ateroesclerosis. En un aspecto particular, el síndrome no es diabetes mellitus de tipo I.
\newpage
En otro aspecto particular, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de NKG2D+ células T o células NK sin empobrecimiento de tales células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide.
En todavía otro aspecto particular, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de NKG2D+ células T o células NK sin empobrecer tales células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple.
En todavía otro aspecto ejemplar, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de NKG2D + células T o células NK sin empobrecimiento de tales células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino.
Un aspecto ejemplar adicional de la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de NKG2D+ células T o células NK sin empobrecimiento de tales células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de psoriasis.
Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de alterar la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin empobrecimiento de tales células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de rechazo de
transplante.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración gráfica de la expresión de RAE-1 sobre células pancreáticas en ratones NOD pre-diabéticos. La Figura 1 (a) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante la RT-PCR cuantitativa en tejido pancreático de ratones NOD y BALB/c de 12-16 semanas de edad. La Figura 1(b) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante la RT-PCR cuantitativa en tejido pancreático de ratones NOD y NOD.scid de 4-6 semanas y 12-16 semanas de edad. La Figura 1(c) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante la RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos de ratones NOD pre-diabéticos. Los datos representativos se muestran y se expresan como veces de inducción de la transcripción de RAE-1. Las veces de inducción se calcularon de acuerdo con la fórmula: Veces de inducción = cantidad de la transcripción de RAE-1 en el órgano de NOD pre-diabético normalizado hasta HPRT dividido por la cantidad de transcripción de RAE-1 en el órgano de NOD joven normalizado para HPRT. La Figura 1(d) muestra la expresión de RAE-1 sobre células pancreáticas CD45-NOD analizada sobre citometría de flujo usando anti-CD45 y anti-RAE-1 mAb. La Figura 1(e) muestra la expresión de RAE-1 sobre células de islotes de CD45 aisladas de páncreas (panel superior) y ganglios linfáticos pancreáticos de drenaje (PLN) (panel inferior) en ratones NOD teñidos con anti-CD45 y anti-RAE-1 mAb.
La Figura 2 (a) es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D sobre células T CD8 + T. Se aislaron leucocitos de bazo, hígado, ganglios linfáticos pancreáticos (PLN) y páncreas de ratones NOD de 10 y 25 semanas de edad y se tiñeron mediante procedimientos convencionales usando anticuerpos monoclonales contra CD8 y NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de células T NKG2D^{+} CD8+ (expresados como el porcentaje total de células CD8^{+}). La Figura 2 (b) es una ilustración gráfica de la expresión de CD44 y Ly-6C sobre células pancreáticas y T PLN NKG2D^{+} CD8 +. Se tiñeron las células con anticuerpos monoclonales contra CD8, NKG2D, y CD44 o Ly6C y se muestran los resultados para las células T CD8 + activadas. La Figura 2 (c es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D y CD44 sobre células pancreáticas T CD8 + PLN NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero-positivo. Se tiñeron las células con NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero y con anticuerpos monoclonales contra CD8 y CD44 o NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de células T CD8+ NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero-positivo (activadas sobre T CD8+).
La Figura 2(d) muestra micrografías de células T CD8^{+} + NKG2D^{+} acumuladas cerca de los islotes. Se tiñeron secciones congeladas secuenciales de páncreas aisladas de ratones NOD pre-diabéticos de 16 semanas de edad con anti-CD8, anti-0068 (marcador de macrófagos), anti-NKG2D y anticuerpos anti-insulina. Izquierda: imagen diferencial de contraste de fase, Centro: CD8 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul); Derecha: C068 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul). Células T CD8^{+} NKG2D^{+} doble-positivas y macrófagos C068+NKG2D+ son amarillos.
La Figura 3(a) es una ilustración gráfica del efecto de tratamiento con anti-NKG2D mAb de sobre la proporción de ratones NOD de 7-25 semanas de edad que desarrollaron diabetes. Círculos oscuros: ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (n = 7) (dos veces a la semana a 200 \mug/ratón IP); círculos claros, ratones NOD tratados con PBS no pirogénico estéril (n = 7). Diabetes se diagnosticó cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. La Figura 3 45 (b) es una ilustración gráfica de los niveles de glucosa en sangre medidos semanalmente a partir de 6 semanas a 40 semanas de edad en los animales representados en la Figura 3a. La Figura 3(c) es una ilustración gráfica de la proporción de ratones NOD que desarrollaron diabetes después del tratamiento con anti-NKG2D mAb en una fase pre-diabética tardía. Se trataron ratones NOD con anti-NKG2D mAb (dos veces a la semana a 200 \mug/ratón IP, círculos oscuros; n = 14) o control Ig (círculos claros; n = 14) de 13 semanas a 25 semanas de edad. A las 25 semanas de edad, siete ratones tratados con anti-NKG2D mAb continuaron recibiendo tratamiento hasta las 30 semanas de edad (triángulos oscuros). La Figura 3 (d) es una ilustración gráfica de los niveles de glucosa en sangre medidos semanalmente de 12 semanas a 36 semanas de edad en los animales representados en La Figura 3c.
La Figura 4(a) es una ilustración gráfica del análisis de leucocitos que infiltran el páncreas y ganglios linfáticos pancreáticos de ratones NOD de 11 semanas de edad tratados con control Ig (clg) o anti-NKG2D mAb (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana comenzando a las 7 semanas de edad) que se habían teñido con anti-CD8, anti-NKG2D, y anti-CD44 y se sometieron a citometría de flujo. Los resultados mostrados están activados sobre células T CD8^{+}. La Figura 4(b) representa fotomicrografías de islotes pancreáticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control de 7 semanas de edad. Se prepararon secciones congeladas de páncreas y se tiñeron de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control. Izquierda: tinción DAPI (núcleos); Derecha: CD8 (rojo), NKG2D (verde) e insulina (azul). La Figura 4(c) representa fotomicrografías de islotes pancreáticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con tratamiento anti-NKG2D mAb (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana) de 7 semanas de edad que se prepararon y se tiñeron como en el panel (b). La Figura 4 (d) es una ilustración gráfica del efecto del tratamiento con anticuerpo anti-NKG2D sobre la acumulación de células T CD8+ autorreactivas NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo en el páncreas. Se aislaron los leucocitos de los páncreas y PLN de ratones NOD de 18 semanas de edad tratados con anti-NKG2D mAb (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana) o control 5 Ig de 13 semanas de edad. Se muestran los porcentajes indicados de células T CD8+ NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo (activadas sobre células T CD8+). La Figura 4(e) es una ilustración gráfica de Linfocitos de bazo y sangre periférica en ratones tratados con control Ig o con anti-NKG2D (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana teñidos con NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero y anti-CD8 mAb. Los porcentajes indicados eran células NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo (activadas sobre la población de células T CD8+). La Figura 4(f) es una ilustración gráfica de células de ganglios linfáticos de páncreas aisladas de ratones NOD de 25 semanas de edad tratados con Ig control (clg) o anti-NKG2D (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana) comenzando a las 13 semanas de edad, como se indica, y cultivadas con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml) y brefeldina A (5 \mug/ml) durante 6 hr. Se detectó la IFN-\gamma intracellular en células T CD8+ mediante tinción inmunofluorescente y citometría de flujo.
La Figura 5 es una ilustración gráfica de mediciones de citometría de flujo de un experimento de transferencia adoptiva de células NOD T en receptores NOD.scid. La Figura 5(a) muestra células T CD8+ NKG2D^{+} en el páncreas, PLN y bazo de ratones NOD.scid transplantados con células NOD T. Antes de la transferencia adoptiva, células T purificadas de un donante NOD diabético se tiñeron con anti-CD8 y anti-NKG2D (a, panel izquierdo inferior). Cinco semanas después de la transferencia, se recogieron las células del páncreas, PLN y bazo se tiñeron con anti-CD8 y anti-NKG2D (a, paneles superiores) o anti-NKG2D y anti-CD44 (a, paneles inferiores). Se muestran los porcentajes de células NKG2D^{+} T CD8+ (activadas sobre células T CD8+). La Figura 5 (b) muestra la acumulación de células autorreactivas NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo T CD8+ en ratones NOD.scid que reciben de manera adoptiva células T transferidas de ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (200 \mug/ratón IP dos veces a la semana) o Ig control, que comienza en el momento de la transferencia y se analizaron 10 semanas después de la transferencia. Se detectaron los porcentajes indicados de células T CD8+ autorreactivas de NRP-V7/H-2Kd tetrámero positivo activadas sobre células vivas. La Figura 5(c) muestra la detección de NKG2D sobre células T de NRP-V7/H-2Kd tetrámero positivo de estos mismos ratones tratados, activadas sobre células T CD8+. La Figura 5 (d) es una ilustración gráfica de la proporción de ratones NOD.scid trasplantados con células T de ratones NOD diabéticos que desarrollaron diabetes. Los ratones NOD.scid de cinco semanas de edad que recibieron células T transferidas de manera adoptiva de ratones NOD diabéticos se trataron con anti-NKG2D mAb (círculos oscuros; n = 6) Ig control (círculos claros; n = 7) de 5 semanas a 14 semanas de edad. Se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal con 200 \mug de anti-NKG2D mAb CX5, dos veces a la semana. Se diagnosticó diabetes cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. La Figura 5 (e) es una ilustración gráfica de la expansión de células autorreactivas NRP-V7/H-2Kd tetrámero positivo T CD8+ después de tratamiento de parada con anti-NKG2D mAb. Cuatro semanas después se cesó el tratamiento de anti- NKG2D mAb en ratones NOD.scid trasplantados con células T de ratones NOD diabéticos, se sacrificaron los animales y se analizaron los páncreas para evaluar la infiltración de células NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo, NKG2D^{+} T CD8+. Para comparación, también se analizaron los ratones tratados con Ig control que desarrollaron diabetes.
La Figura 6 (a) es una ilustración gráfica de la pérdida de expresión de NKG2D sobre células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD antes de la transferencia adoptiva. Se aislaron de los ganglios linfáticos y bazo de ratones 8.3 TcR-transgénicos NOD. Se purificaron después las células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD, mediante aislamiento magnético de células. Antes de la transferencia de células T, células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD se tiñeron con anti-CD8 y NRP-V7/H-2K^{d} tetrámeros o anti-NKG2D y se analizaron mediante citometría de flujo, como se muestra. La Figura 6 (b) es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D sobre células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD en el páncreas dos días después de la transferencia adoptiva de células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD. Dos días después de la transferencia adoptiva de células T de 8.3 TcR-transgénicos NOD, se aislaron los leucocitos del páncreas de ratones que se trataron con Ig control o anti-NKG2D mAb CX5 en el momento de la transferencia de células. Se tiñeron las células con NRP-V7/H-2K^{d} tetrámeros y anti-NKG2D y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestra la expresión de NKG2D sobre las células T transferidas de manera adoptiva (identificada mediante la activación sobre células NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo).
La Figura 6(c) es una ilustración gráfica del efecto de anti-NKG2D mAb CX5 sobre la proliferación de células T CD8^{+} de 8.3 TcR-transgénicos NOD en el páncreas. Células T marcadas con CFSE-45 de 8.3 TcR-transgénicos NOD (1 x10^{7}) se transfirieron en ratones NOD de tipo salvaje de 10 semanas de edad (día 0). Los ratones NOD receptores se trataron con clg o anti-NKG2D mAb CX5 (200 \mug) el día -1, día 1, y día 5. Después de la transferencia, los ratones NOD receptores se sacrificaron y los leucocitos se aislaron y se analizaron del páncreas, ganglio linfático pancreático (PLN), ganglio linfático mesentérico (MLN). Las células mostradas en (c) se activaron sobre Linfocitos viables CD8-positivos. La Figura 6 (d) es una ilustración gráfica de los porcentajes de células marcadas con CSFS en los ratones tratados con Ig control (barras abiertas) y anti-NKG2D mAb (barras cerradas) que habían experimentado una o dos divisiones (es decir, proliferación de células) los días 2, 3 y 4 después de la transferencia, calculado por la siguiente fórmula: % de células de proliferación = (Total de células CFSE^{+} NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero^{+} CD8^{+} menos células CFSE^{+}
NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero^{+} CD8+ que no se dividen) x 100/ Total de células CFSE+ NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero^{+} CD8^{+}.
La Figura 7 representa microfotografías de linfocitos de 8.3 TcR-transgénicos NOD cultivados con 100 nM IGRP (proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa) de péptido durante 3 días y después se desarrollaron en la presencia de 200 U/ml de IL-2 de recombinante humano y 4 ng/ml de IL-7 durante 5 días adicionales células T CD8^{+} activadas de 8.3 TcR-transgénicos se tiñeron sobre hielo con anti-NKG2D mAb CX5 y se tiñeron por contraste de fase con toxina b de cólera para marcar la membrana de superficie celular. Se incubó una alícuota de estas células teñidas durante 30 minutos a 37ºC y se mantuvo otra alícuota sobre hielo. Se analizaron las células mediante el uso de un microscopio de fluorescencia. En la microfotografía, se muestra la expresión de NKG2D como fluorescencia verde y la tinción con fluorescencia roja indica toxina B de cólera (membrana). Hay que hacer notar que NKG2D estaba presente sobre la superficie celular de las células incubadas sobre hielo pero se modulaba y se internalizaba en las células cultivadas a 37ºC.
La Figura 8 es una ilustración gráfica del efecto de anti-NKG2D mAb sobre células T CD8+ que llevan NKG2D in vivo. Se activaron células T CD8+ de TcR transgénicos específicas de ovoalbúmina OT-1 (OVA) con 100 nM de péptido de OVA durante 3 días y después se cultivaron con 200 U/ml de IL-2 humana recombinante y 4 ng/ml de IL-7 durante 5 días adicionales. Se expresó NKG2D sobre las células T activadas de OT-1 (> 95%), que se marcaron con CFSE y se transfirieron de manera adoptiva (2 x 10^{7} células) en ratones C57B/6. Los ratones que recibieron células T de CD8^{+} NKG2D^{+} OT-1 TcR-transgénicos se trataron con anti-NKG2D mAb o Ig de rata de control a -2, 0, y +2 días (200 \mug por inyección intraperitoneal). La Figura 8 (a): Cuatro días después de la transferencia, se recogieron muestras de sangre, se tiñeron con mAbs contra CD8 y NKG2D de ratón y se analizaron mediante citometría de flujo.
Se indican los porcentajes de células CD8^{+} marcadas con CSFE. La Figura 8(b): El día 21 después de la transferencia adoptiva de células T de OT-1 TcR-transgénicos marcadas con CFSE y tratamiento con Ig control o anti-NKG2D mAb CX5 como se ha indicado en (a), se sacrificaron los ratones y se aislaron y se analizaron los esplenocitos mediante citometría de flujo. La Figura 8 (c): El día 7 después de la transferencia adoptiva de las células T CD8^{+}NKG2D^{+} OT-1 marcadas con CFSE, los ratones se inyectaron con un anti-ratón CD8 mAb de rata de empobrecimiento (2.43 hibridoma, isotipo IgG2b de rata). Tres días después se tiñeron células de sangre periférica con Ig control, anti-CD8 o anti-NKG2D mAb y se analizaron mediante citometría de flujo. El propósito de este experimento era demostrar que el anticuerpo monoclonal CX5 anti-NKG2D no empobrece las células T CD8+ NKG2D+ cuando se administra el anticuerpo in vivo.
La Figura 9 es una ilustración gráfica del efecto de anti-NKG2D mAb sobre la proliferación de células T CD8+ autorreactivas. Células T de 8.3 TcR-20 transgénicos NOD se marcaron con CSFE y se transfirieron en ratones NOD de tipo salvaje, que se trataron con Ig control o anti-NKG2D mAb CX5 como se ha descrito en la Fig. 6. Las células recogidas del páncreas, ganglios linfáticos pancreáticos, ganglios linfáticos mesentéricos y bazo se tiñeron con NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero y anti-CD8 mAb y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran los histogramas de Linfocitos activados sobre células CD8-positivo NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo. Los porcentajes de células de proliferación (más de una división) y no proliferación (activadas sobre células T CFSE^{+} CD8^{+} NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero^{+}) se indican en cada histograma. Las células teñidas con Ig control emparejada a isotipo o controles para tinción de tetrámero demostró la especificidad de unión de los reactivos.
La Figura 10 ilustra la especificidad de la tinción para los ligandos de NKG2D sobre las células de páncreas de NOD. Figura 10 (a): se aislaron y se tiñeron células de páncreas de NOD con anti-CD45 mAb y con Ig control, un anti-pan RAE-1 mAb (clon 186107), anti-RAE-1 ymAb (clon CX1) o proteína de fusión NKG2D-Ig de ratón (dominio extracelular de NKG2D de ratón condensado a IgG1 Fc de tipo humano), seguido de los reactivos de la segunda etapa apropiados para visualización. Se analizaron las células mediante citometría de flujo y CD45-negativo y yoduro de propidio negativo, se evaluaron las células viables. Se tiñeron las células con Ig control emparejada a isotipo (clg) demostró la especificidad de unión a mAb (línea delgada). Figura 10 (b): Anti-RAE1 mAbs bloquearon la tinción de anti-RAE-1 mAbs marcados con biotina, que demuestra la especificidad de unión. Se incubaron previamente células de páncreas con 0,25 \mug de clg, anti-pan RAE-1 mAb purificado 186107 o clon CX1 anti-RAE-1 y mAb (que también reacciona de manera cruzada con RAE-1 \alpha y RAE-1 \beta). Después de 20 min de incubación sobre hielo, estas células se tiñeron después durante 20 min adicionales con 0,25 \mug de Ig control biotinilada, clon 186107 anti-RAE-1 mAb biotinilado, clon CX1 anti-RAE-1\gamma mAb biotinilado y anti-CD45 mAb conjugado a FITC. Para detectar las células mAbs biotiniladas, se lavaron las células y se incubaron con estreptavidina conjugada a PE. Se analizaron las células mediante citometría de flujo y los datos mostrados se activan sobre células CD45-negativo, yoduro de propidio-negativo, viables. De este modo, se detectan los ligandos de NKG2D sobre las células de páncreas de NOD usando tres reactivos independientes: clon 186107 anti-RAE-1 mAb, clon CX1 anti-RAE-1 mAb, y una proteína de fusión NKG2D-Ig. La tinción Anti-RAE-1 mAb es específica porque la tinción de anti-RAE1 biotinilado se bloquea completamente mediante anti-RAE-1 mAbs purificados, pero no una IgG de control de rata.
La Figura 11 (a) muestra la secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 1) de NKG2D murino. La Figura 11 (b) muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de NKG2D murino. La Figura 11 (c) muestra la secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 3) de NKG2D humano. La Figura 11 (d) muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 4) de NKG2D humano.
La Figura 12 es una representación gráfica de de un análisis de citometría de flujo de células de NKL (una línea celular de leucemia NK humana) que se ha incubado con un anticuerpo anti-humano NKG2D de ratón (clon 149810) durante 16 h para estimular la internalización de NKG2D (panel derecho). El panel izquierdo muestra las células que se han incubado con un anticuerpo control durante 16 h. en cada caso, las células se lavaron brevemente en un tampón ácido (pH 3,5) para eliminar cualquier anticuerpo residual unido y después se tiñó con Ig control o anti-NKG2D mAb, seguido de anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado a ficoeritrina. El experimento muestra que el anticuerpo monoclonal anti-humano NKG2D monoclonal indujo la internalización (modulación) de NKG2D, mientras que la incubación con la Ig control no provocó la internalización de NKG2D.
La Figura 13 muestra que la RAE-1 se expresa sobre células B/c BM pero no sobre células B6 BM. Figura 13(a): Se tiñeron células recientemente aisladas de BM con una proteína de fusión NKG2D-humana Ig Fc humana (NKG2D Ig) o Ig control humana Ig (clg). Para detector la unión de NKG2D-Ig, se usó un anticuerpo de IgG anti-humano conjugado a PE (anti-humano Ig PE) como un segundo anticuerpo de etapa. La línea de puntos representa una tinción de clg sobre células BM. La línea gruesa muestra la expresión del ligando NKG2D sobre células BM. Figura 13(b):se tiñeron las células BM con anti-pan RAE-1 mAb biotinilado, anti-H60 mAb biotinilado, anti-MULT1 mAb biotinilado o un clg emparejado a isotipo biotinilado, y después se tiñeron con estreptavidina conjugada a PE. La línea de puntos muestra la tinción de clg ya la línea gruesa muestra la expresión de RAE-1, H60 y MULTI sobre las células BM. Figura 13 (c y d): los receptores de CB6F1 se trataron con anti-NK1.1 mAb el día -2. El día 0, se irradiaron los receptores (11 Gy) y después se reconstituyeron con células B/c o CB6F1 BM (4 x 10^{6}). El día 7, células del bazo del receptor se aislaron y se analizaron como se ha descrito para los paneles a y b. La línea de puntos representa la tinción de clg sobre células BM. La línea gruesa muestra la expresión de ligandos de NKG2D, RAE-1, H60 y MULTI sobre células BM. Los números representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. Figura 13 (e y f): ilustra de manera gráfica ese fenotipo de las células que expresan RAE-1. Se transfirieron las células BM en receptores irradiados tratados previamente con anti-NK1.1 mAb. Se aislaron las células y se tiñeron como se ha descrito para el panel c. La Figura 13(g): ilustra que la proliferación de células expresa RAE-1. Se transfirieron células B/c BM en ratones irradiados CB6F1 que se habían tratado previamente con anti-NK1.1 mAb. Seis días después de la transferencia, BrdU (0,8 mg/ratón) se inyectó en ratones. Dos o 12 horas después, se recogieron células de bazo de receptores y se tiñeron con anti-pan-RAE-1 mAb y anti-BrdU. La Figura 13 (h y 1): 1 lustra que RAE-1 se expresa sobre la progenie de BM tratados con 5-FU. Células BM de ratones B/c tratados con 5-fluorouracilo se transfirieron en ratones CB6F1 irradiados que se trataron previamente con anti-NK1.1 mAb. Ocho días después de la transferencia, se aislaron las células y se analizaron como se ha descrito para los paneles c y e. La Figura 13 (i): muestra la tinción de c-kit y Sca-1 de células activadas positivas de RAE-1. En los paneles e-i, > 98% de las células teñidas con clg estaban en el cuadrante inferior izquierdo (no mostrado). Se muestra el porcentaje de células en cada uno de los dos cuadrantes superiores. Estos
resultados eran reproducibles en al menos dos experimentos independientes (datos representativos no mostrados).
La Figura 14 (a): ilustra que Anti-NKG2D mAb bloquea el rechazo de B/c BM en ratones híbridos CB6F1. Aproximadamente 4x10^{6} de células BM se transfirieron en receptores CB6F1 irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con ^{125}IUdR el día 5, y se recogieron los bazos y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la captación de ^{125}IUdR de los bazos en ratones B/c BM -> CB6F1 y las barras blancas muestran la captación de radiomarca en receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Se trataron los receptores con anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecido o el anti-NK1.1 mAb no empobrecido de las las células NK (200 \mug/ratón el día -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media \pm D. E cpm (5 ratones por grupo). Se realizó el experimento dos veces con resultados comparables. La Figura 14 (b): ilustra de manera gráfica el fenotipo de células donantes de B/c que repoblaron receptores irradiados de CB6F1 tratados con anti-NKG2D mAb o Ig control. Se trataron los ratones como se ha descrito en el panel a, con los esplenocitos recogidos el día 8 después del transplante, se tiñeron glóbulos blancos y se presentaron los datos como se ha descrito en la Figura 13.
La Figura 15 ilustra el rechazo de células BM singénicas que expresan RAE-1. La Figura 15(a) muestra la expresión de RAE-1 \varepsilon sobre células de médula ósea en ratones transgénicos B6 RAE-1 E. Médula ósea recientemente aislada de ratones B6 y B6 RAE-1 \varepsilon transgénicos se tiñeron con clg o anti-pan-RAE-1 mAb. La Figura 15(b) ilustra que las células NK B6 matan células de BM transgénicos RAE-1 \varepsilon singénicas in vitro. Las células de BM recientemente aisladas de ratones B6 de tipo salvaje B6 y RAE-1 \varepsilon transgénicos se usaron como dianas en un ensayo de citotoxicidad in vitro usando células NK de tipo salvaje activadas por IL-2 (Células NK B6 cultivadas durante 7 días en 2000 U/ml de IL-2 recombinante humana del Almacén Pre-Clínico de de la Rama de Fuentes Biológicas del Instituto de Cáncer Institute Nacional) como efectores, en la presencia de clg o anti-NKG2D mAb (clon 191004) usados a 10 \mug/ml. La Figura 15(c) ilustra que los ratones B6 rechazan la médula ósea singénica que expresa RAE-1-\varepsilon. Aproximadamente 4x10^{6} de células RAE-1 \varepsilon de B6 BM transgénicos se transfirieron en receptores B6 irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con ^{125}IUdR el día 5, y se recogieron los bazos y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la captación de ^{125}IUdR de bazos en ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos BM -> B6 y las barras blancas muestran la captación de radiomarca en receptores de tipo salvaje B6 BM -> B6. Se trataron los ratones con el anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecido o el anti-NK1.1 mAb empobrecido de las células (200 \mug/ratón el día -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media \pm D. E cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizó dos veces con resultados comparables. La Figura 15(d) ilustra que los ratones CB6F1 rechazan la médula ósea singénica que expresa RAE-1 \varepsilon. Aproximadamente 4 x10^{6} células de RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1 BM se transfirieron en receptores CB6F1 irradiados. Se inyectaron los ratones con ^{125}IUdR el día 5, y se recogieron los bazos y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la captación de ^{125}IUdR de bazos en ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1 BM -> CB6F1 y las barras blancas muestran la captación de la radiomarca en los receptores CB6F1 BM -> CB6F1 de tipo salvaje. Se trataron los ratones y los datos se muestran en como se ha descrito en el panel c.
La Figura 16(a) ilustra que los ratones DAP 10-1 rechazan de manera ineficaz la médula ósea singénica que expresa RAE-1\varepsilon. Aproximadamente 4 x 10^{6} de células de B6 BM RAE-1 \varepsilon transgénicos se transfirieron en receptores irradiados. Los ratones se inyectaron con ^{125}IUdR el día 5 y se recogieron y se contaron los bazos el día 6. Las barras negras muestran la captación de ^{125}IUdR de bazos en ratones B6 BM -> RAE-1\varepsilon transgénicos B6 de tipo salvaje y las barras blancas muestran la captación de radiomarca en receptores RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 BM -> DAP10-/-B6. Se trataron los ratones con el anti-NKG2D mAb neutralizante no o el anti-NK1.1 mAb empobrecido de células NK (200 \mug/ratón el día -2), como se ha indicado. Los resultados son la media \pm D. E cpm (5 ratones por grupo). La Figura 16(b) ilustra que los ratones DAP12-/- (Bakker et al., Immunity, 13: 345-353, 2000) rechazan la médula ósea singénica que expresa RAE-1 \varepsilon. Aproximadamente 4x10^{6} de células de RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 BM se transfirieron en receptores irradiados. Los ratones se inyectaron con ^{125}IDdR el día 5 y se recogieron y se contaron los bazos el día 6. Las barras negras muestran que la captación de ^{125}IDdR de bazos en ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 BM -> B6 de tipo salvaje y las barras blancas muestran la captación de radiomarca en receptores RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 BM -> DAP12-1-B6. Se trataron los ratones y los resultados se muestran como se describe en el panel a.
La Figura 17 (a) ilustra la modulación de NKG2D sobre células NK en ratones B6 RAE-1 \varepsilon transgénicos. Se tiñeron esplenocitos de ratones de tipo salvaje y B6 RAE-1 \varepsilon transgénicos con anti-pan-RAE-1 mAb (paneles de la izquierda) o anti-NKG2D y anti-NK1.1 mAb (paneles de la derecha). Se analizó la expresión de RAE-1 sobre células de bazo, y se analizó la expresión de NKG2D mediante la activación sobre células NK1.1^{+}. Las líneas delgadas muestran las células teñidas con clg, mientras las líneas gruesas muestran la tinción específica de RAE-1 o NKG2D. Los números representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. La Figura 17(b) muestra de manera gráfica que la citotoxicidad dependiente de NKG2D está alterada en células de RAE-1 \varepsilon transgénicos (Tg) NK. Se prepararon células NK enriquecidas de los bazos de ratones de tipo salvaje o RAE-1E Tg B6 a los que se les inyectó por vía IP polil:C (100 \mug/ratón) un día antes de la recogida. Se realizaron ensayos de destrucción redirigida dependiente de anticuerpo monoclonal contra células diana 721.221 transfectadas en CO32 como se ha descrito (Lanier et al., J Immunol, 141: 3478-3485, 1998) mediante el uso de Ig control (clg), anti-NKG2D, o anti-NK1.1 mAbs. La Figura 17(c): ilustra la modulación de NKG2D sobre células NK de tipo salvaje que se desarrollan en huéspedes RAE-1 \varepsilon transgénicos. Células Ly 5.2 B6 BM (1 x10^{7}/ratón) se transfirieron en ratones (WT) o RAE-1 \varepsilon Tg B6. Tres meses después del transplante, se analizó el nivel de expresión de NKG2D (paneles de la izquierda) y NK1.1 (paneles de la derecha) sobre células NK esplénicas (activadas sobre CO3-, linfocitos NK1.1^{+}). Las líneas delgadas muestran las células teñidas con clg, mientras que las líneas gruesas muestran la tinción específica de RAE-1 o NKG2D. Los números representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. La Figura 17 (d) muestra de manera gráfica la citotoxicidad dependiente de NKG2D de células NK en ratones Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg quiméricos. Se prepararon células NK enriquecidas de los bazos de Ly5.2 B6 BM -> RAE-1 Tg y ratones Ly5.2 B6 BM -> B6 inyectados por vía IP -con polil:C (100 \mug/ratón) un día antes de la recogida. Se realizaron ensayos de citotoxicidad redirigida dependiente de mAb como se ha descrito en el panel b. La Figura 17(e) ilustra que las células NK de tipo salvaje que se desarrollan en ratones RAE-1 Tg demuestran el rechazo de médula ósea dependiente de NKG2D. Las barras de color negro muestran la captación de ^{125}IUdR en bazos de células RAE-1^{+} Tg BM -> ratones quiméricos (Ly5.2 B6 BM-> B6 de tipo salvaje), y las barras blancas muestran la captación de la radiomarca en bazos de células RAE-1^{+}Tg BM -> ratones quiméricos (ratones quiméricos Ly5.2 B6 BM-> RAE-1 Tg). La Figura 17 (f) ilustra que la resistencia híbrida en ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1 está alterada. Se transfirieron aproximadamente 4x10^{6} de células B/c BM en receptores irradiados. Los ratones receptores se inyectaron con ^{125}IUdR el día 5 y se recogieron y se contaron los bazos el día 6. Las barras de color negro muestran la captación de ^{125}IUdR de bazos en ratones B/c BM -> tipo salvaje CB6F1, las barras de color blanco muestran la captación de radiomarca en receptores B/c BM -> RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1, y las barras de color gris muestran los ratones CB6F1 BM ->CB6F1. Se trataron los ratones con el anti-NKG2D mAb no empobrecido, neutralizante o el anti-NK1.1 mAb que empobrece las células NK (200 \mug/ratón el día -2), como se ha indicado. Los resultados se muestran como la media \pm D. E cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizó dos veces con resultados comparables.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente hallazgo de la modulación de NKG2D, un receptor de activación sobre células T CD8+, células NK, y ciertas células T CD4^{+} activadas, es un medio eficaz para la prevención y/o tratamiento de síndromes autoinmunes e inflamatorios. En un aspecto, los presentes inventores han descubierto agentes y procedimientos para estimular la internalización de NKG2D y han identificados tales agentes como modalidades terapéuticas útiles para tratar los síndromes asociados a la activación de NKG2D. Los agentes son particularmente útiles en afecciones (tales como las que se cree que están presentes, por ejemplo, en síndromes inflamatorios crónicos) en las que los ligandos naturales solubles NKG2D no son capaces de estimular la internalización. La invención además abarca cualquier medio para reducir la expresión funcional de NKG2D con el fin de tratar tales síndromes inflamatorios. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención afectan solamente al subconjunto de leucocitos que dependen de su activación principalmente sobre NKG2D.
La invención abarca composiciones eficaces para uso en el tratamiento o prevención de un síndrome asociado a la activación mediada por NKG2D de leucocitos. Los usos se llevan a cabo poniendo en contacto los leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activación mediada por NKG2D de las células en condiciones adecuadas para la prevención o tratamiento del síndrome. El contacto se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado, que incluye la administración del agente o una composición que comprende el agente a un paciente, o huésped que comprende las células activadas por la ruta(s) de NKG2D en condiciones que permiten la administración del agente a las células en el paciente o huésped. La activación de NKG2D se puede reducir de acuerdo con la invención mediante uno o más de: (i) empobrecer la superficie celular de las moléculas de NKG2D que existen previamente sobre la superficie; (ii) interferir con la interacción funcional entre NKG2D y DAPIO o de otra manera bloquear la función de señalización de NKG2D; y (iii) evitar que las moléculas NKG2D alcancen la superficie, incluyendo la interferencia con la producción de NKG2D a un nivel de transcripción, de traducción, o después de la traducción. En algunas realizaciones, la invención abarca la reducción de las moléculas de NKG2D de la superficie celular preexistentes mediante la estimulación de su internalización sin que provoque de manera simultánea la activación de que activaría las funciones efectoras de leucocitos que llevan NKG2D.
Los términos "NKG2D", "NKG2-D", "D12S2489E", "KLRK1", y "subfamilia K del receptor de tipo pectina de células destructoras, miembro 1", como se usa en el presente documento se refiere a un gen receptor que activa las células destructoras, ADNc (por ejemplo, Homo sapiens - Nº de acceso del GENBANK NM_007360), y su producto génico, así como sus homólogos de mamíferos, que incluye productos de tipo salvaje y mutantes. Un NKG2D humano que codifica la región se establece como SEC ID Nº: 3, y una secuencia de proteína NKG2D humana se establece como la SEC ID Nº: 4. Los homólogos de mamíferos de NKG2D incluyen but pero no se limitan a NKG2D de ratón (por ejemplo, Mus musculus - Nº de acceso del GENBANK NM_033078), NKG2D de rata (por ejemplo, Rattus norvegicus - Nº de acceso del GENBANK NM_133512), NKG2D de cerdo (por ejemplo, Sus scrofa - Nº de acceso del GENBANK AF285448), monkey NKG2D de mono (por ejemplo, Macaca mulatta - Nº de acceso del GENBANK AJ554302), y NKG2D de orangután (por ejemplo, Pongo pygmaeus - Nº de acceso del GENBANK AF470403). Los agentes que modulan NKG2D de la presente invención comprenden un anticuerpo que se une a NKG2D, un fragmento de unión de NKG2D -del mismo, o un ARNi codificado por una secuencia de ADn que comprende la SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 12.
Salvo que se establezca de otra manera, los usos de acuerdo con la invención se pueden poner en práctica en el contexto de tratamiento (por ejemplo, reducir los síntomas asociados a y/o afecciones subyacentes que se consideran causantes de una afección o bien en términos de tiempo para que tales afecciones/síntomas existan, la extensión de tales afecciones/síntomas, gravedad de tales afecciones/síntomas etc.) o prevención (por ejemplo, reducción de la probabilidad de desarrollo de la aparición subyacente, retraso de la gravedad de la aparición posterior, reducción de la gravedad después de la aparición, etc.) cualquier tipo de afección inflamatoria asociada a la actividad de NKG2D, tal como enfermedad autoinmune inflamatoria asociada a la actividad de NKG2D. Sin embargo, se reconocerá que tales afecciones pueden variar de manera significativa de manera que los procedimientos para tratar diversas condiciones también se pueden considerar como aspectos únicos de la invención.
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I. Agentes de modulación de NKG2D
Cuando se pone en práctica la invención, el agente que reduce la activación de las células mediada por NKG2D comprende un anticuerpo de unión a NKG2D, o un fragmento del mismo, o un ARNi codificado por una secuencia de ADN que comprende la SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 12.
La invención abarca dichos agentes que ponen en contacto las células que expresan NKG2D desde el exterior y reducen la activación de células que llevan NKG2D -cuando se exponen de manera posterior a células que llevan ligando NKG2D o ligandos NKG2D recombinantes. Cualquier indicador de esta activación se puede controlar, que incluyen, sin limitación, estimulación de la fosforilación de DAP10, estimulación de la p85 PI3 quinasa, activación de Akt, producción dependiente de NKG2D -de interferón gamma (1 FN-y) u otras citoquinas o quimioquinas, destrucción dependiente de NKG2D -de las células T diana que llevan ligando de NKG2D, y similares. Un medio de determinar el nivel de activación de NKG2D es mediante la medición de la destrucción de células NK humanas de células diana que llevan ligando de NKG2D (véase, por ejemplo, Ejemplo 1 más adelante). En algunas realizaciones de la invención, los agentes de modulación de NKG2D útiles son los que provocan al menos aproximadamente el 20% de reducción de activación de NKG2D inducida por el ligando de NKG2D en un sistema modelo tal como se describe en el Ejemplo 1; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más reducción en la activación de NKG2D inducida por ligando. Por ejemplo, la activación inducida por el ligando de NKG2D se puede reducir en al menos aproximadamente el 30% en presencia del agente cuando se compara con un control. El control puede ser, por ejemplo, la activación de NKG2D en la ausencia del agente pero en condiciones sustancialmente idénticas en bien (a) un individuo, (b) una población de organismos sustancialmente similares, usando un valor medio como control, o (c) ambos. Otro medio de determinar el nivel de la activación de NKG2D es mediante la producción de IFN-\gamma en la presencia o ausencia de un ligando de NKG2D tal como MICA o ULBP. Se puede usar cualquier procedimiento para la medición de la producción de IFN-\gamma, incluyendo, sin limitación, inmunoensayos u otros ensayos que miden la proteína IFN-\gamma; bioensayos que miden la actividad de IFN-\gamma, y similares. En algunas realizaciones de la invención, los agentes de modulación de NKG2D útiles son los que provocan al menos aproximadamente el 20% de reducción de la producción de IFN-\gamma mediada por NKG2D; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos aproximadamente el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más reducción en la producción de IFN-\gamma mediada por NKG2D.
En una serie de realizaciones, los agentes de modulación de NKG2D de acuerdo con la invención estimulan la internalización celular de NKG2D. La internalización se puede determinar mediante cualquier medio adecuado, tal comos, por ejemplo, mediante citometria de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2 más adelante); microscopía de inmunofluorescencia (incluyendo, el control de la internalización de un anticuerpo mediante microscopía confocal); ensayos de unión que detectan NKG2D de superficie celular, y similares. En algunas realizaciones de la invención, los agentes de modulación de NKG2D útiles son los que provocan al menos aproximadamente el 10% de reducción en el nivel de la superficie celular de NKG2D o un 10% de incremento en la velocidad de desaparición de NKG2D de la superficie celular, cuando se compara con el control cuando se ensaya en un sistema modelo tal como se describe en el Ejemplo 2; en otras realizaciones, el agente da como resultado al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% reducción en el nivel de superficie celular o al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de incremento en la velocidad de desaparición de NKG2D.
Preferiblemente, los agentes que modulan NKG2D de acuerdo con la invención no dan como resultado una histolisis significativa o empobrecimiento de las células que expresan NKG2D, incluyendo, por ejemplo, una o más de células T CD8+, células T CD4+, y células T \gamma\beta-TcR^{+}, y células NK CD56/16^{+}. La capacidad de un agente para destruir las células que expresan NKG2D se puede determinar usando cualquier medio apropiado, tal como, por ejemplo, mediante detección de células muertas por citometría de flujo o microscopía usando tinción por annexina V o yoduro de propidio, incorporación de azul Trypan, ensayo de europio o ensayo de liberación de cromo. En algunas realizaciones de la invención, los agentes de modulación de NKG2D útiles son los que muestran un beneficio terapéutico detectable en condiciones que conservan la viabilidad al menos aproximadamente el 90% de las células que expresan NKG2D. En otras realizaciones, el agente provoca menos de aproximadamente el 5%, 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, u 80% de reducción en el número de células que expresan NKG2D.
La siguiente tabla contiene los ejemplos no limitantes de las características de los agentes de modulación de NKG2D de acuerdo con la invención.
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TABLA 1 Características de los Agentes de modulación de NKG2D
1
2
La presente invención se refiere a la incapacidad de de los ligandos solubles naturales de NKG2D (tal como, por ejemplo, MICA o ULBP) para estimular la internalización de NKG2D en pacientes que padecen de inflamación crónica de una manera similar a la internalización que se pudiera producir en individuos que no padecen inflamación crónica; sin tener en cuenta estrictamente la teoría, se cree que este fenómeno se produce en parte a partir como consecuencias de altos niveles de citoquinas que acompañan estados inflamatorios crónicos. (Este fenómeno se puede documentar mediante la comparación de los niveles de NKG2D en células T o células NK en pacientes que padecen de inflamación crónica y en pacientes sanos; niveles similares de NKG2D en los dos grupos, no obstante el hecho que la inflamación crónica esté acompañada de altos niveles circulantes de ligandos de NKG2D, reflejan un defecto en NKG2D internalización). La presente invención abarca agentes que estimulan la internalización de NKG2D en condiciones en las que los ligandos de NKG2D naturales solubles no serían eficaces o serían menos eficaces de esta manera, así como el uso de tales agentes en los diversos procedimientos de la invención proporcionados en el presente documento. Cualquier sistema de modelo adecuado para examinar este efecto se puede usar para demostrar que los agentes particulares comprenden o muestran tales características, por ejemplo comparando el efecto sobre la internalización de NKG2D de un ligando natural soluble y un agente de modulación de acuerdo con la invención, en condiciones en las que las células que expresan NKG2D se exponen a citoquinas (incluyendo, sin limitación, interleuquina-2, interleuquina-15, factor de necrosis tumoral, o las combinaciones de los anteriores) en condiciones adecuadas para contrarrestar el efecto de los ligandos naturales solubles sobre la internalización. En algunas realizaciones, los agentes de modulación de NKG2D de la invención pueden provocar una reducción en los niveles de NKG2D de superficie que es al menos el 10% mayor que la reducción de los niveles de NKG2D de superficie provocados por un ligando natural soluble de NKG2D, cuando se mide la internalización en condiciones (tal como, por ejemplo, en la presencia de uno o más citoquinas) que interfieren con la capacidad del ligando natural soluble para que medie la internalización. En otras realizaciones, los agentes de modulación de NKG2D son al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% más eficaz que un ligando natural soluble de NKG2D en la mediación de la internalización de NKG2D.
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A. Anticuerpos
La presente invención abarca el uso de cualesquiera anticuerpos que se pueden usar para disminuir la activación mediada por NKG2D, tal como, por ejemplo, los que estimulan la internalización de NKG2D sin activación significativa mediante las rutas de señalización mediadas por NKG2D. Los ejemplos no limitantes de tales anticuerpos incluyen anticuerpos dirigidos contra cualquier epítopo extracelular o intramembrana de NKG2D; anticuerpos dirigidos contra cualquier epítopo extracelular o intramembrana de DAP 10; y anticuerpos dirigidos contra un ligando soluble de NKG2D o un complejo de ligando NKG2D-NKG2D. También se abarcan anticuerpos biespecíficos, es decir anticuerpos en los que cada uno de los dos dominios reconoce un epítopo de unión diferente. La secuencia de aminoácidos de NKG2D se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 6.262.244, se describen la secuencia de aminoácidos de DAP10 en Wu et al., Science 285: 730, 1999, y la secuencia de aminoácidos de polipéptidos MICA y MICB, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0165835.
En general, la unidad de anticuerpo básico estructural se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena puede incluir una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígeno. La parte carboxi-terminal de cada cadena puede definir una región constante principalmente responsable de la función efectora.
De manera típica, las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Además, las cadenas pesadas humanas se clasifican de manera típica como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen con una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente más de 10 aminoácidos. Véase en general, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ed., 2ª ed. Raven Press, NY, 1989).
Las regiones variables de cada par de par de cadena ligera/pesada de manera típica forman el sitio de unión de anticuerpo. De este modo, en general, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión, en general, los mismos. Normalmente, todas las cadenas muestran la misma estructura general de las regiones de marco conservadas relativamente (FR) unidos mediante tres regiones hipervariables, que también se llaman regiones determinantes complementarias o CDRs Las CDRs de las cadenas pesada y ligera de cada par están usualmente en alineación con las regiones de marco conservadas, permitiendo la unión a un epitopo específico. En general, del N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La determinación de aminoácidos para cada dominio está, en general, de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Proteínas de Interés inmunológico, Kabat et al., National Institutes of Health, Bethesda, MO, 5ª ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991; Kabat, Adv Prot Chem, 32: 1-75, 1978; Kabat et al., J Biol Chem, 252: 6609-6616, 1977; Chothia et al., J Mol Biol, 196: 901-917, 1987; y Chothia et al., Nature, 342: 878-883, 1989.
Los anticuerpos de la presente invención pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpos Fab, fragmentos de anticuerpos F(ab)_{2}, fragmentos de anticuerpos Fv (por ejemplo, V_{H} o V_{L}), single chain Fv fragmento de anticuerpos de la cadena sencilla Fv y fragmentos de anticuerpos dsFv. Además, las moléculas de anticuerpo de la invención pueden ser anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo son anticuerpos monoclonales, completamente humanos. Los anticuerpos monoclonales abarcan anticuerpos obtenidos a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para las mutaciones posibles de origen natural que pueden estar presentes en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales altamente específicos, que están dirigidos contra un único sitio antigénico. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se pueden sintetizar mediante un cultivo de hibridoma, esencialmente sin contaminación por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por estar entre una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe considerar como la producción que requiere el anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular.
Los anticuerpos de la presente invención incluyen cualquier región de anticuerpo variable, maduro o no procesado unido a cualquier región de inmunoglobulina constante. Si una región variable de cadena ligera está unida a una región constante, preferiblemente es una cadena kappa. Si una región variable de cadena pesada está unida a una región constante, preferiblemente es una región constante gamma 1, gamma 2, gamma 3 o gamma 4 humana, más preferiblemente, gamma 1, gamma 2 o gamma 4 y 11 más preferiblemente gamma 1 o gamma 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos contra, por ejemplo, NKG2D o DAP10 se generan usando ratones transgénicos que llevan partes de sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, que se pueden mencionar en el presente documento, como ratones "HuMAb", contienen el gen de la inmunoglobulina humana miniloci que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada humana sin disposición (mu y gamma) y la cadena ligera kappa, conjuntamente con las mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena murina mu y kappa endógena. De acuerdo con lo anterior, los ratones muestran una expresión reducida de IgM o kappa de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos de cadena pesada y ligera humanos sometidos a cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos de alta afinidad IgG/kappa monoclonales. La generación de los anticuerpos completamente humanos en ratones HuMAb se conoce comúnmente en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975, o mediante otros procedimientos bien conocidos, desarrollados posteriormente. En el procedimiento de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado se inmuniza para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de manera específica a la proteína usada para la inmunización. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan después con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietien glicol, para formar una célula de hibridoma. Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el desarrollo o supervivencia de las células no fusionadas, parentales de mieloma. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas de manera típica incluirán hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), dichas sustancias evitan el crecimiento de de células deficientes en HGPRT.
El medio de cultivo en el que las células de hibridoma se desarrollan se ensayan para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma se pueden determinar mediante inmunoprecipitaónn o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo o mediante transferencia de Western. Después se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones se pueden succionar mediante procedimientos de dilución limitantes y se desarrollan mediante procedimientos convencionales. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen por ejemplo, medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores de ascites en un animal: Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, el fluido de ascites, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tal como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica anticuerpos monoclonales o fragmento de anticuerpos se aísla fácilmente y se secuencia usando y procedimientos convencionales. Las células de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células T 293 humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.
Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos también se pueden aislar a partir de genotecas de fago de anticuerpos generada usando técnicas bien conocidas, con o sin el uso de recomposición de cadena así como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir genotecas de fago muy grandes. De este modo, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Las variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están abarcadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, 90%, 95%, y lo más preferiblemente el 99% de la secuencia. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácidos conservadores. Los reemplazos conservadores son los que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Si un cambio de aminoácidos da como resultado un péptido funcional se puede determinar fácilmente ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los fragmentos (o análogos) de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, se pueden preparar fácilmente por los expertos en la técnica. Los extremos amino- y carboxi- de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o registradas. Preferiblemente, se usan procedimientos de comparación por ordenador para identificar los motivos de secuencia o predecir los dominios de conformación de proteína que se producen en otras proteínas de estructura conocida y/o función. Se conocen los procedimientos para identificar las secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional. Los motives de secuencia y conformaciones estructurales se pueden usar para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención.
En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos se realizan de manera que: (1) reduzcan la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reduzcan la susceptibilidad a oxidación, (3) alteren la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteren las afinidades de unión, y/o (4) confieran o modifiquen otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos.
En general, los anticuerpos anti-NKG2D útiles de acuerdo con la presente invención muestran una afinidad (Kd) para NKG2D humano que es al menos igual al de los ligandos de NKG2D solubles. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a NKG2D humano con afinidad nanomolar o, incluso más preferiblemente, afinidad picomolar. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a NKG2D humano con un Kd de menos de aproximadamente 100 nM, 50 nM, 20 nM, 20 nM, o 1 nM.
En algunas realizaciones, los anticuerpos útiles incluyen los que reducen la interacción entre NKG2D humano y uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, y ULBP4. Tales anticuerpos de bloqueo se pueden identificar usando ensayos de competición convencionales.
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B. Moduladores de ácidos nucleicos
La presente invención abarca modulación de la expresión en la superficie celular de NKG2D a un nivel de transcripción, de traducción, o después de la traducción.
Los moduladores de NKG2D abarcan moléculas de ARN capaces de inhibir la producción de NKG2D cuando se introduce en una célula que expresa NKG2D (denominado ARN), incluyendo ARN de doble cadena de horquilla corta (shRNA). Las secuencias de ARN para modular la expresión de NKG2D incluyen las codificadas por las secuencias 5'-GGATGGGACT AGTACACATT CC-3' (SEC ID Nº: 10); 5'-TGGCAGTGGG AAGATGGCTC C-3' (SEC ID Nº: 11); y 5'-CAGAAGGGAG ACTGT-GCACT CTATGCCTC-3' (SEC ID Nº: 12).
La producción de las construcciones de ARNi se pueden llevar a cabo mediante procedimientos de síntesis química o mediante técnicas de ácido nucleico recombinantes. La ARN polimerasa endógena de la célula tratada puede mediar la transcripción in vivo, o la ARN polimerasa se puede usar para la transcripción in vitro. Las construcciones de ARNi pueden incluir modificaciones para cualquier estructura central de fosfato-azúcar o el nucleósido, por ejemplo, para reducir la susceptibilidad a las nucleasas celulares, mejorar la biodisponibilidad, mejorar las características de formulación, y/o cambiar otras propiedades farmacocinéticas. Por ejemplo, los enlaces fosfodiéster de ARN natural se pueden modificar para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o un heteroátomo de azufre. Se pueden ajustar modificaciones en la estructura de ARN para que permitan la inhibición genética específica mientras evitan una respuesta general al ARNds. Del mismo modo, las bases se pueden modificar para que bloqueen la actividad de la adenosina desaminasa. La construcción de ARNi se puede producir de manera enzimática o mediante la síntesis orgánica parcial/total, se puede introducir cualquier ribonucleótido modificado mediante síntesis enzimática u orgánica in vitro.
Se pueden adaptar procedimientos de modificación de moléculas de ARN para la modificación de las construcciones de ARNi (véase, por ejemplo, Heidenreich et al., Nucleic Acids Res, 25: 776-780, 1977; Wilson et al., J Mol Recog, 7: 89-98, 1994; Chen et al., Nucleic Acids Res, 23: 2661-2668, 1995; y Hirschbein et al., Antisense Nucleic Acid Orug Oev, 7: 55-61, 1997). Por ejemplo, la estructura central de una construcción de ARNi se puede modificar con fosforotioatos, fosforamidato, fosfoditioatos, metilfosfonato-fosfodiésteres quiméricos, ácidos nucleicos de péptidos, 5-propinil-pirimidina que contiene oligómeros o modificaciones de azúcar (por ejemplo, ribonucleósidos 2'-sustituidos, configuración a).
La estructura de doble cadena se puede formar a partir de una cadena de ARN auto complementaria o a partir de dos cadenas de ARN complementarias. La formación de ARN dúplex se puede iniciar o bien dentro o fuera de ka célula. El ARN se puede introducir en una cantidad que permite la administración de al menos una copia por célula. Las dosis más altas (por ejemplo, al menos 5, 10, 100,500 ó 1000 copias por célula) de material de doble cadena puede producir una inhibición más eficaz, mientras que las dosis menores también pueden ser útiles para las aplicaciones específicas. La inhibición es específica de la secuencia ya que las secuencias de nucleótidos que corresponden a la región dúplex del ARN se dirigen a la inhibición genética.
En ciertas realizaciones, las construcciones de ARNi sujeto son "ARN de interferencia pequeños" o "ARNsi". Estos ácidos nucleicos son de aproximadamente 19-30 nucleótidos de longitud, tal como, por ejemplo, aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud, que corresponden en longitud a los fragmentos generados por "el conteo" de la nucleasa de los ARN de doble cadena más largos. Los ARNsi se entiende que reclutan los complejos de nucleasa y guían los complejos de ARNm mediante alteración de las secuencias específicas. Como resultado, el ARNm diana se degrada mediante las nucleasas en el complejo de proteína. En una realización particular, las moléculas de los nucleótidos 21-23 de ARNsi comprenden un grupo 3' hidroxilo.
El ARNsi para uso en la presente invención se puede obtener usando numerosas técnicas usadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARNsi se puede sintetizar de manera química o producir de manera recombinante usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar e hibridar oligómeros de ARN codificante y no codificante cortos para formar estructuras de ARN de doble cadena con salientes de 2-nucleótido en cada nucleótido (Capten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98: 9742-9747, 2001; y Elbashir et al., EMBO J, 20: 6877-88, 2001). Estas estructuras de ARNsi de doble cadena se pueden introducir después directamente a las células, o bien mediante captación pasiva o mediante un sistema de administración de elección. En ciertas realizaciones, las construcciones de ARNsi se pueden generar mediante el procesamiento de los ARN de doble cadena más largos, por ejemplo, en la presencia de la enzima dicer. En una realización, se usa el sistema de Drosophila in vitro. En esta realización, los ARNds se combinan con un extracto soluble derivado de embriones de Drosophila, produciendo por lo tanto una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNds se procesa para moléculas de ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de moléculas de ARNsi se pueden purificar usando técnicas convencionales. Por ejemplo, se puede usar electroforesis de gel para purificar los ARNsi. De manera alternativa, se pueden usar procedimientos no desnaturalizantes, tales como cromatografía en columna no desnaturalizante, para purificar ARNsi. Además, se puede usar cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño), centrifugación de gradiente de glicerol, purificación de afinidad con anticuerpo para purificar los ARNsi.
En algunas realizaciones, se usa un plásmido para administrar el ARN de doble cadena derivado, por ejemplo, en forma de un producto de transcripción. En tales realizaciones, se diseña el plásmido para que incluya una "secuencia de codificación" para cada una de las hebras codificantes y no codificantes de la construcción de ARNi. Las secuencias codificantes pueden ser la misma secuencia, por ejemplo, flanquedas por promotores invertidos, o pueden ser dos secuencias separadas cada una en control de transcripción de promotores separados. Después que la secuencia de codificación se ha transcrito, el de ARN complementario se transcribe en pares de bases para formar el ARN de doble cadena. La solicitud PCT W001/77350 describe un vector ejemplar para la transcripción bidireccional de un transgen para producir tanto las transcripciones de ARN codificantes como no codificantes del mismo transgen en una célula eucariótica.
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II. Procedimientos de tratamiento
La presente invención proporciona los agentes anteriores para uso en los procedimientos para prevenir y/o tratar enfermedades inflamatorias incluyendo diversos trastornos autoinmunes inflamatorios y síndromes asociados a la activación de NKG2D. Tales síndromes, incluyen, pero no se limitan a, situaciones clínicas en las que la inducción de ligandos de NKG2D relacionados con estrés (por ejemplo, MICA, MICB, y ULBP3) da como resultado una activación y/o expansión excesiva de células T y/o células NK autorreactivas que se pueden reflejar en niveles crecientes de citoquinas tal como IL-2, TNF-a, y IL-15.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto particular, la invención proporciona los agentes anteriores para uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir artritis reumatoide (RA). El procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente que tiene RA o que se ha identificado/diagnosticado por tener un riesgo sustancial de desarrollar RA, de manera que se trata o se previene la RA. En un aspecto particular, el procedimiento de tratamiento/prevención de RA de la invención se practica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal "contra" (Es decir, que es "específica para" o que "específicamente se une a" o que "preferiblemente se une a") NKG2D. En un aspecto, el agente (por ejemplo, un anti-NKG2D mAb o fragmento de mAb) es un agente que se demuestra que es eficaz en la mejora de RA en un modelo aceptable de RA, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.414.218 y la publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20030005469 (los principios y modelos relacionados de describen en, por ejemplo, Wooley, P. H., Animal Models of Artritis, eds. J. H. Klippel y P. A. Oieppe, Mosby Publishers (Londres), 1998; Erning et al., Artritis Res, 4 Suppl 3:S133-40, 2002; Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1 (1): 135-47, 2002; Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2): 240-4, 1999; Ourie et al., Clin Inmunol Immunopathol, 73 (1): 11-8, 1994; y Muller-Ladner et al., Orugs Today (Barc), 35(4-5): 379-88, 1999). En un aspecto adicional, el agente es un anticuerpo que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos de expresión de NKG2D y/o alteración de la expansión de células NKG2D+ T o células NK (por ejemplo, alteración de la expansión y/o función de las células T CD8+) (por el contrario, por ejemplo, al menos algunos de los anticuerpos descritos en la publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20040115198), sin empobrecimiento de manera significativa tales células (por ejemplo, provocando una reducción de aproximadamente el 10% o menos de tales células cuando se compara con un control adecuado). En un aspecto, el procedimiento da como resultado una modulación de uno o más biomarcadores de una manera consistente con el tratamiento o prevención (según sea aplicable) de RA (por ejemplo, IL-6 de suero, TNF R, IL-2R, CD4 suprimido, CD8 suprimido, y/o proteína C reactiva). En otro aspecto, la práctica del procedimiento da como resultado una reducción detectable de inflamación sinovial en las articulaciones periféricas del paciente/huésped. En un aspecto, el procedimiento da como resultado la prevención del deterioro radiográfico y mejora de la función física en el paciente o huésped como se muestra mediante, por ejemplo, una reducción en la progresión radiográfico en el paciente o huésped, reducción de la inflamación y articulaciones sensibles (como se determina mediante criterio analítico aceptable), y/o mejora de la calidad de vida de manera significativa (por ejemplo, como se determina mediante una reducción en las puntuaciones de incapacidad en el Cuestionario De Evaluación de salud de RA).
En otro aspecto ejemplar particular, la invención proporcional los agentes anteriores para uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir esclerosis múltiple (MS). El procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligandos en un paciente humano o huésped mamífero que tiene MS o que se ha identificado/diagnosticado por tener un riesgo sustancial de desarrollar MS, de manera que MS se trata o se previene en el paciente o huésped. En un aspecto particular, el procedimiento de tratamiento/prevención de MS se pone en práctica mediante el uso de un anticuerpo monocional o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D (un anticuerpo "anti-NKG2D"). En un aspecto más particular el agente es un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de detectar de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos de expresión de NKG2D - y/o alterar la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin empobrecer de manera significativa tales células.
En todavía otro aspecto ejemplar, la invención proporciona los agentes anteriores para uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), tal como enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. El procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o huésped mamífero que tiene IBD o que se ha identificado/diagnosticado por tener un riesgo sustancial de desarrollar IBD, de manera que IBD se trata o se previene en el paciente o huésped. En un aspecto particular, el procedimiento de tratamiento/prevención de IBD de la invención se pone en práctica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D. En un aspecto más particular, el agente es un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos que expresan NKG2D y/o alteración de la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin empobrecimiento de manera significativa de tales células.
En otra faceta, la invención proporciona los agentes anteriores para uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir psoriasis. El procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o huésped mamífero que tiene psoriasis o que se ha identificado/diagnosticado por tener riesgo sustancial de desarrollar psoriasis, de manera que la psoriasis se trata o se previene en el paciente o huésped. De manera típica, el procedimiento se lleva a cabo mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D al paciente. En un aspecto más particular, el agente es un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de leucocitos que expresan NKG2D y/o alteración de la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin empobrecimiento de manera significativa de tales células.
En todavía otra faceta, la invención proporciona los agentes anteriores para uso en procedimientos de reducción de la probabilidad de rechazo de transplante (o reducción de la gravedad o tiempo de aparición de una afección relacionada con el rechazo de transplante). El procedimiento comprende la administración (por ejemplo, administración directamente o administración mediante una composición que comprende un ácido nucleico codificante, etc.) una cantidad eficaz de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o huésped mamífero que es, aproximadamente o va a ser, recientemente el receptor de un transplante de tejido/órgano, de manera que la probabilidad de rechazo se reduzca de manera detectable (por ejemplo, cuando se compara con un control). En un aspecto particular, el procedimiento se pone en práctica mediante la administración de un anti-NKG2D mAb o fragmento de anti-NKG2D mAb. En un aspecto más particular, el agente es un anti-NKG2D mAb o fragmento que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos de expresión de NKG2D y/o alteración de la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin empobrecimiento de manera significativa de tales células.
En otro aspecto, un agente usado de acuerdo con la invención, tal como un anti-NKG2D mAb o fragmento r anti-NKG2D mAb, se administra a un paciente o huésped que padece de un riesgo sustancial de desarrollar diabetes mellitus de tipo I en una cantidad y en condiciones suficientes para tratar o prevenir la afección en el paciente o huésped.
El procedimiento de la invención se aplica de manera similar a una diversidad de otras enfermedades autoinmunes y afecciones inflamatorias asociadas a NKG2D, incluyendo lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, síndrome Guillain-Barré, uveitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Grave, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, arteritis temporal, síndrome antifosfolipídica, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, dermatitis herpetiforme, pénfigo vulgar, vitiligo, artritis psoriática, osteoartritis, asma resistente a esteroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y aterosclerosis. En algunas realizaciones preferidas, el transplante es un transplante de médula ósea (BM) o de tronco de sangre periférica (PBSM). En algunas realizaciones, el transplante de BMT o PBSCT se administra como tratamiento de leucemia o linfoma, mientras en otras realizaciones, el transplante se administra como tratamiento para otros tipos de cánceres tales como neuroblastoma o mieloma múltiple.
En la puesta en práctica de la presente invención, un modulador de NKG2D se puede administrar a un paciente como una sola dosis que comprende una cantidad eficaz de dosis única para prevenir o tratar un síndrome inflamatorio o autoinmune, o en una serie de dosis por fases, que conjuntamente comprenden una cantidad eficaz de para prevenir o tratar el síndrome. Una cantidad eficaz de un modulador de NKG2D se refiere a la cantidad de modulador que, cuando se administra en una única dosis o el agregado de dosis múltiples, o como parte de cualquier otro tipo de régimen de tratamiento definido, produce a una mejora estadística cuantificable en resultado, como se evidencia mediante al menos un parámetro clínico asociado al síndrome. Una cantidad eficaz de un modulador de NKG2D puede ralentizar la progresión de una enfermedad cuando se compara con los pacientes que no reciben el modulador de NKG2D.
Se entenderá que la cantidad eficaz del modulador de NKG2D, así como el régimen de dosificación global, puede variar de acuerdo con la enfermedad y el estado clínico del paciente, que, a su vez se puede reflejar en uno o más parámetros clínicos tales como las puntuaciones de enfermedad clínicamente aceptadas. Por ejemplo, para artritis reumatoide, la gravedad de la enfermedad y/o resultado de tratamiento, se puede evaluar controlando el número de articulaciones inflamadas; dolor; mobilidad; y/o la puntuación de enfermedad oficial ACR 20/50 ó 70. Para la diabetes Tipo 1, gravedad de enfermedad y/o resultado de tratamiento se puede evaluar mediante la medición de los niveles de glucosa en sangre o sus variaciones, niveles de Hbl C, y similares. Para la esclerosis múltiple, se puede determinar la inflamación de cerebro mediante el escaneo del cerebro. Para el rechazo de transplante hematopoyético, se puede evaluar la gravedad de la enfermedad (fallo de trasplante) y/o resultado de tratamiento mediante la evidencia de neutropenia prolongada, trombocitopenia, y dependencia de la transfusión de glóbulos rojos en pacientes que se han sometido a acondicionamiento mieloablativo, y mediante incapacidad para observar el quimerismo en pacientes que se han sometido a acondicionamiento no mieloablativo. En general, los efectos detectables en el resultado del tratamiento que usan los procedimientos y composiciones de la presente invención incluyen una disminución en la necesidad de otros tratamientos (incluyendo, por ejemplo, una disminución en la cantidad de y/o duración de otros fármacos o tratamientos), una disminución en el número y/o duración de estancias en hospital, una disminución de la pérdida de días de trabajo debido a enfermedad, y similares. Se entenderá además que la cantidad eficaz se puede determinar por los expertos en la técnica mediante experimentación de rutina, mediante la construcción de una matriz de valores y ensayando los puntos diferentes en la matriz.
La presente invención abarca la administración combinada de uno o más agentes adicionales en conexión con un modulador de NKG2D. Se entenderá que, en las realizaciones que comprenden la administración de combinaciones de un modulador de NKG2D con otros agentes, la dosificación del modulador de NKG2D puede por sí mismo comprender una cantidad eficaz y el(los) aumentar agente(s) adicional(es) pueden además aumentar el beneficio terapéutico al paciente. De manera alternativa, la combinación del modulador de NKG2D y el segundo agente puede comprender conjuntamente una cantidad eficaz para prevenir o tratar el síndrome. También se entenderá que se pueden definir cantidades eficaces en el contexto de regímenes de tratamiento particular, incluyendo, por ejemplo, programación y número de administraciones, modos de administraciones, formulaciones, etc.
En algunas realizaciones en las que el síndrome asociado a NKG2D es diabetes Tipo 1, el agente adicional abarca uno o más de un agente que promueve el crecimiento de células beta pancreáticas o potencia el trasplante de células beta, tal como, por ejemplo factores de crecimiento de células beta o de supervivencia o anticuerpos inmunomoduladores. En algunas realizaciones en las que el síndrome asociado a NKG2D es artritis reumatoide, el agente adicional es uno o más de metotrexato; un anticuerpo anti-TNF-\alpha; una proteína de fusión TNF-\alpha receptor-Ig un anticuerpo anti-IL-15, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAIO), y un fármaco antirreumático que modifica la enfermedad (OMARO). Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente biológico tal como un agente anti-TNF (por ejemplo, ENBREL®), infliximab (REMICAOE®) y adalimumab (HUMIRA®) o rituximab (RITUXAN®). En algunas realizaciones en las que el síndrome asociado a NKG2D es rechazo de transplante hematopoyético, el(los) factor(es) de crecimiento hematopoyético(s) (por ejemplo, eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, IL-3, EL-11, trombopoyetina, etc.) o antimicrobiano(s) (por ejemplo, antibiótico, antiviral, antifúngico) se puede administrar como una terapia adjunta. En algunas realizaciones en las que el síndrome asociado a NKG2D es psoriasis, el agente adicional es uno o más de de tar y sus derivados, fototerapia, corticoesteroides, Ciclosporina A, análogos de la vitamina D, metotrexato, inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) así como agentes biológicos tales como agentes anti-TNF-alfa y RITUXAN®. En algunas realizaciones en las que el síndrome asociado a NKG2D -es una enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) tal como, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, el agente adicional es uno o más de aminosalicilatos, corticosteroides, inmunomoduladores, antibióticos, o agentes biológicos tales como REMICADE® y HUMIRA®.
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III. Formulaciones farmacéuticas y Modos de Administración
La presente invención abarca formulaciones farmacéuticas que comprenden los moduladores de NKG2D anteriores, que también pueden comprender uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para uso en el tratamiento o prevención de un síndrome como en la reivindicación 1. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualesquiera y todos los disolventes y, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes que retrasan la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles con un modulador de NKG2D o composición o combinación relacionada usada de acuerdo con la invención. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de los mismos. En muchos casos, puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o cloruro de sodio en tal composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables también cantidades menores de substancias auxiliares tal como agentes humectantes o agentes emulsionantes, conservantes o tampones, que de manera deseable potencian la vida útil o eficacia del modulador del modulador de NKG2D, composición, o combinación relacionada. De manera adecuada para los vehículos y otros componentes de composiciones farmacéuticas se determina basándose en la falta de un impacto negativo significativo en las propiedades biológicas deseadas del modulador de NKG2D, composición, o combinación relacionada.
Las composiciones de modulador de NKG2D, composiciones, o combinaciones relacionadas usadas de acuerdo con la invención pueden estar en una diversidad de formas adecuadas. Tales formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, emulsiones, microemulsiones, comprimidos, pastillas, polvos, liposomas, dendrímeros y otras nanopartículas (véase, por ejemplo, Baek et al., Methods Enzymol, 362: 240-9, 2003; y Nigavekar et al., Pharm Res, 21: 476-83,2004), micropartículas, y supositorios. La forma óptima depende del modo propuesto de administración, la naturaleza de la composición o combinación, y y la aplicación terapéutica. Las formulaciones también pueden incluir, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbocera (polietiilen glicoles de diversos pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbocera. Puede ser apropiada cualquiera de las mezclas anteriores en los tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no esté inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también, por ejemplo, Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci
Technol, 52: 238-311, 1998, y las citas en el documento para información adicional relacionada con los excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Una composición para uso farmacéutico también puede incluir diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-80), estabilizantes (por ejemplo, azúcares o aminoácidos sin proteínas), conservantes, fijadores de tejido, solubilizantes, y/u otros materiales adecuados para la inclusión en una composición farmacéutica. Los ejemplos de componentes adecuados también se describen en, por ejemplo, Berge et al., J Pharm Sci, 6661: 1-19, 1977; Wang y Hanson, J Parenteral Sci Tech, 42:S4-S6, 1988, Patente de Estados Unidos números. 6.165.779 y 6.225. 289; y otros documentos citados en los documentos. Tal composición farmacéutica también puede incluir conservantes, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Urquhart et al., Lancet, 16: 40 367, 1980; Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2ª ed., vol. 3, 1998; Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS, 7ª ed., 2000; Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31 st ed.; Remington's PHARMACEUTICAL SCI ENCES, 16th-20th editions; THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman y Gilman, eds., 9th ed., 1996; Wilson y Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL y PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado y Remers, eds., 10ª ed., 1998; y las Patentes de Estados Unidos Números. 5.708.025 y 5.994.106. Los principios de formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables también se describen en, por ejemplo, Platt, Clin Lab Med, 7: 289-99, 1987; Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988; EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998, y "Drug Dosage", J Kans Med Soc, 70(1): 30-32, 1969. Los vehículos farmacéuticamente aceptables particularmente adecuados para la administración de vectores se describen en, por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional WO 50 98/32859. En un aspecto ejemplar, el compuesto activo o combinación se prepara con un vehículo que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Están patentados muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones o se conocen de manera general por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, SUSTAINED AND CONTROL-LED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, 1978.
En otro aspecto, las composiciones usadas en la invención propuestas para la administración oral, por ejemplo, se pueden formular con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden estar contenidas en cápsulas de gelatina duras o blandas, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y usarse en la forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto usado en la invención mediante la administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar de manera conjunta el compuesto con, un material para evitar su inactivación.
Las composiciones de modulador de NKG2D, composiciones relacionadas, y composiciones de combinación se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada, tal como una vía oral, mucosal, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutáneoa, intramuscular, parenteral, intertumoral, intratumoral, o tópica. También se puede administrar de manera continua mediante una minibomba u otro dispositivo adecuado. El anticuerpo u otro modulador de NKG2D en general se administrará mientras la afección patológica esté presente, siempre que el anticuerpo provoque que el empeoramiento de la afección se detenga o se mejore. El anticuerpo u otro modulador de NKG2Dwill en general se administrará como parte de una composición farmacéuticamente aceptable como se describe en otra parte en el presente documento. El anticuerpo se puede administrar mediante cualquier vía adecuada, pero de manera típica se administra por vía parenteral en formulaciones de dosificación unitaria que contienen vehículos farmacéuticamente aceptables, adyuvantes, y similares (estabilizantes, agentes disgregantes, anti-oxidantes, etc.). El término "parenteral" como se usa en el presente documento incluye, técnicas subcutáneas, intravenosas, intraarteriales, intramusculares, intrasternales, intratendinosas, intraspinales, intracraneales, intratorácicas, de infusión y administración intraperitoneal. Lo más comúnmente, un anticuerpo se administró por vía intravenosa o subcutánea. Las vías de inyección también incluyen inyección en el músculo (intramuscular, IM); inyección bajo la piel (subcutánea, SC); inyección en una vena (intravenosa, IV); inyección en la cavidad abdominal (intraperitoneal, IP); y otra administración en/a través de la piel (intradérmica, ID, usualmente mediante inyecciones múltiples).
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar de manera adicional ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención y no se consideran limitantes de su alcance.
Ejemplo 1 Ensayo para la activación de NKG2D
Células NK humanas activadas con IL-2 se cultivaron conjuntamente con un cultivo de células diana apropiado marcado con ^{51}Cr, tal como células Ba/F3 de ratón que se habían transfectado con ADNc que codifica MICA humano en condiciones in en las que el polipéptido de MICA se expresa; y; como células control, las mismas células diana que no se han transfectado. La liberación de ^{51}Cr se controla para indicar la lisis de células. La lisis de células que expresan MICA mediante las células NK activadas a niveles por encima de controles indica la activación específica de NKG2D.
Para seleccionar los moduladores de NKG2Ds, las células NK activadas se incuban con agentes candidatos antes de la exposición a las células diana marcadas con ^{51}Cr. Los compuestos que disminuyen de manera significativa la destrucción de las células diana que llevan el ligando de NKG2D se identifican y se evalúan posteriormente.
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Ejemplo 2 Ensayo para la internalización de NKG2D
Se cultivan células que expresan NKG2D humano a 37ºC durante una o más horas en la presencia de un anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina. Como control, las células NKG2D+ células se cultivan con el anti-NKG2D marcado con biotina a 4ºC en la presencia del 0,05% de azida de sodio para evitar la internalización. Se lavan las células para retirar el exceso de anticuerpo, y después se tiñen con estreptavidina marcada con tinte fluorescente para detectar el anticuerpo NKG2D conjugado con biotina, después se evalúa la internalización mediante microscopía fluorescente o citometria de flujo. Una disminución en la cantidad de NKG2D en la superficie celular con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 37ºC comparado con las células incubadas con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 4ºC es un indicador de la internalización. Esto además se puede verificar mediante la fijación y permeabilización de las células y tinción con un anticuerpo de segunda etapa marcado con tinte fluorescente y permeabilización de las células y tinción con un anticuerpo de segunda etapa marcado con tiente fluorescente que detectará el anticuerpo primario anti- NKG2D. Si se internaliza, el anticuerpo de segunda etapa detectará el anticuerpo anti-NKG2D primario en el interior de las células cultivadas a 37ºC, como se visualiza mediante microscopía fluorescente.
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Ejemplo 3 El bloqueo de NKG2D evita la Diabetes Autoinmune en ratones
Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto de bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la diabetes de Tipo I en un sistema de modelo animal, el ratón NOD (Ogasawara et al., Immunity, 20: 757-767, 2004).
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Ratones, Reactivos, Citoquinas y Anticuerpos
Se compraron ratones NOD de Taconic (Germantown, NY). Se compraron ratones NOD.scid de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Se han descritos ratones 8.3 TcR-transgénicos NOD (Verdaguer et al, J Exp Med, 186: 5 1663-1676, 1997). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones sin patógenos en la instalación de animales UCSF y se realizaron los experimentos de acuerdo con las guías del Comité UCSF de Investigación animal. Se diagnosticó diabetes cuando el nivel de glucosa en sangre era mayor que 300 mg/dl en dos mediciones consecutivas. Se midieron los niveles de glucosa en sangre usando un control de glucosa en sangre (Walgreen's, Oeerfield, IL).
Se generaron clones Anti-ratón NKG2D mAb, CX5 y CX6 (isotipo IgG1 de rata), como se describe en (Ogasawara 10 et al, Immunity, 18: 41-51, 2003) y se obtuvo el clon anti-ratón NKG2D mAb 191004 (isotipo IgG2a de rata) de R&D Systems (Minneapolis, MN). Todos los anti-NKG2D mAbs reconocen el dominio extracelular de NKG2D y bloquean de manera eficaz la unión de NKG2D a sus ligandos. Para la inyección in vivo, se utilizó un anticuerpo CX5 purificado que no contenía endotoxina detectable (0,3 pg/inyección). Se compraron ratas control IgG de Sigma (St. Louis, MO). Anti-ratón pan RAE-1 mAb (clon 186107, isotipo de rata IgG2b) se une a RAE-1 \alpha, \beta, \delta, \gamma, y \varepsilon. Se produjeron tetrámeros NRP-V7/H-2K^{d} y TUM/H-2K^{d} (control) como se describe en (Amrani et al, Nature, 406: 739-742, 2000) o a partir de la instalación de del tetrámero NIH (Atlanta, GA). El tetrámero TUMI H-2K^{d} no se unió a las células NRP-V71 H-2K^{d} tetrámero positivas. Se compraron otros anticuerpos de BD PharMingen o eBioscience (San Diego, CA).
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Preparación de células de islotes de Páncreas
Se aislaron islotes de ratón como sigue. En resumen, se inyectaron 0,3 mg/ml de colagenasa P (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en el conducto pancreático. Se retiraron los páncreas distendidos y se incubaron a 37ºC durante 13-17 min. Se purificaron los islotes mediante centrifugación en gradientes de Eurocollin-Ficoll que comprendía cuatro densidades diferentes (1,108, 1,096, 1,069, y 1,037). Después de la centrifugación, se recogieron y se lavaron los fragmentos de tejido a 1,069/1,096. Después de esto, para obtener las células individuales, se disociaron las células de islotes mediante solución de disociación de células no enzimática (Sigma, St. Louis, MO).
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Inmunofluorescencia, Citometria de flujo y Microscopía
Para la detección de NKG2D, se tiñeron las células (-1 x10^{6}) con 0,25 \mug de anti-NKG2D mAb biotinilado o marcado con PE (clon 191004). Se tiñeron conjuntamente las células con anti-CD8 conjugado a FITC, anti-CD8 conjugado a APC, antiCD44 conjugado a FITC, o anti-Ly-6C conjugado a FITC. Para detectar RAE-1, se tiñeron las células con un anti-pan RAE-1 mAb biotinilado que reconoce las cinco proteínas RAE-1 conocidas (Lodoen et al, JExp Med, 197: 1245-1253, 2003) o anti-RAE-1 mAb (clon CX1) (Ogasawara et al., supra, 2003). Se usó estreptavidina conjugada a PE o estreptavidina conjugada a APC para detectar mAbs biotinilados. Se incubaron las células con mAbs durante 20 min y se lavaron con PBS que contenía NaN_{3} al 0,01%. Se analizaron las células usando un FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) o un citómetro Personal Guava® con software Guava ViaCount^{TM} y Guava Express^{TM} (Hayward, CA). Se activaron las poblaciones de linfocitos viables basándose en los perfiles de dispersión anteriores y laterales y mediante la pérdida de tinción de yoduro de propidio. Para la inmunohistoquímica, se congelaron de manera rápida los órganos en medio, OCT y se prepararon las secciones y se tiñeron y mediante técnicas convencionales. Se adquirieron las imágenes usando un microscopio Deltavision (Applied Precision, Issaquah, WH) y se llevó a cabo la desconvolución por ordenador usando el software softWoRx (Applied
Precision).
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RT-PCR Cuantitativa
Se llevó a cabo (tiempo real) PCR usando un instrumento ABI 7700 (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se compraron sondas en Applied Biosystems. Se describieron anteriormente sondas y cebadores específicos de RAE-1 (Ogasawara et al., supra, 2003). Los cebadores universales usados para detectar todas las transcripciones de RAE-1 conocidas eran: 5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3' no codificante (SEC ID Nº: 6); 5'-catcattagc tgatctccag ctca-3' no codificante (SEO ID NO: 7), y la sonda era 5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3' (SEC ID Nº: 8). Se trató el ARN total con ADNasa I, y después se sintetizó ADNc de primera cadena usando cebadores de hexámeros al azar. Las condiciones de ciclación para PCR de tiempo real fueron: 50ºC durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, y 60ºC durante 2 min. Se analizaron los datos mediante el uso del Software de Análisis de Detector de Secuencias v1.7 (Applied Biosystems). Se realizó el análisis estadístico usando un ensayo t de dos muestras.
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Estudios de Transferencia adoptiva-Células T NOD transferidas en ratones NOD.scid
Se aislaron células T de bazos y ganglios linfáticos de ratones NOD diabéticos de 16 semanas de edad mediante aislamiento magnético de células usando MACS (Miltenyi Biotec Inc., alemania). Se enriquecieron células T (pureza > 98%) mediante selección negativa con empobrecimiento de células CO19^{+}, CO24^{+}, y MHC clase II+. Aproximadamente 7,5 x10^{6} de células T se transfirieron en ratones NOD.scid de 4-5 semanas de edad mediante la inyección en la vena de la cola. Se examinaron semanalmente los niveles de glucosa en sangre en los ratones transferidos de manera adoptiva.
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Estudios de Transferencia adoptiva de células T de 8.3 TcR-transgénicos en ratones NOD
Se realizó la transferencia de células T como se ha descrito previamente (Serra et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99: 15566-15571, 2002). En resumen, se aislaron Linfocitos de 8.3 TcR-transgénicos a partir de ganglios linfáticos y bazos. Se enriquecieron las células T (pureza > 95%) mediante la selección negativa mediante aislamiento magnético usando un MACS. Aproximadamente 1 x 10^{7} de células T marcadas con CFSE (5 \muM) se transfirieron en ratones NOD de 10 semanas de edad mediante inyección en la vena de la cola el día O. Se inyectó Anti-NKG2D 10 mAb (CX5) o clg (200 \mug/inyección) en los ratones NOD receptores los días -1, +1 y +5.
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Expresión de RAE-1 en el páncreas de ratones NOD pre-diabéticos
Para investigar si las interacciones entre NKG2D y RAE-1 están implicados en el desarrollo de diabetes autoinmune, se desarrolló en un ensayo de RT-PCR cuantitativo para detectar las transcripciones de genes RAE-1 conocidos. Se detectaron las transcripciones de RAE1 en los páncreas de ratones NOD pre-diabéticos de fase tardía (12-16 semanas de edad), pero no en los páncreas de ratones BALB/c de edad coincidente (Fig. 1a). Aunque las transcripciones de RAE-1 comparativamente menos pronunciadas también se detectaron en los páncreas de ratones NOD de 4-6 semanas de edad. RAE-1 también se detectó en los páncreas de ratones adultos NOD.scid (que carecían de células B y T) (Fig. 1b). Conjuntamente, estos resultados indicaron que la expresión de RAE es independiente de una respuesta autoinmune en curso. Para examinar si RAE-1 se regula hacia arriba de manera selectiva en el páncreas con la edad, se compararon los niveles de transcripciones de RAE-1 en un órgano particular de ratones NOD jóvenes con aquellos en el mismo órgano en ratones NOD prediabéticos de fase tardía. Mediante este criterio, se incrementó RAE-1 relativamente más en el páncreas de los ratones prediabéticos con la edad, comparados con el hígado, bazo, riñón y timo (Fig. 1c).
Para determinar si las proteínas de RAE-1 se expresan en la superficie celular, se aislaron células pancreáticas a partir de ratones NOD prediabéticos y no diabéticos BALB/c. Las células aisladas mediante digestión enzimática del páncreas se tiñeron con anti-RAE-1 y anti-CD45 mAb (que distingue la infiltración de células CD45^{+} hematopoyéticas de las células de los islotes pancreáticos CD45 no hematopoyéticas). Las células de linaje CD45 hematopoyéticas positivo se detectaron infiltrando el páncreas de NOD prediabéticos, pero no el páncreas de BALB/c no diabéticos (Fig. 1d). Se detectaron las proteínas de RAE-1 predominantemente cobre las células pancreáticas no hematopoyéticas CD45 negativo en ratones NOD, pero no se encontró en las células pancreáticas en ratones BALB/c. Usando técnicas de separación de gradiente de densidad, se aislaron los islotes a partir de páncreas de NOD y también se recogieron de ganglios linfáticos (PLN) de estos ratones. Se tiñeron suspensiones de células individuales de los islotes aislados y se tiñeron las PLN con anti-RAE-1 y anti-CD45 mAb y se analizaron mediante citometría de flujo. RAE-1 estaba presente a niveles inferiores en la mayoría de las células de los islotes de CD45-, pero no en las células CD45^{+} hematopoyéticas en el páncreas o PLN (Fig. 1d, e). Estos resultados indicaban que las transcripciones y proteínas de RAE-1 estaban presentes en el páncreas de ratones NOD pre-diabéticos, pero no enratones BALB/c 35 no diabéticos, e indicaban que la expresión de RAE-1 puede preceder a la aparición de la enfermedad y contribuir a la progresión de la enfermedad en ratones NOD.
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Células T CD8+ que infiltran el páncreas de NOD expresan NKG2D
Ya que el desarrollo de diabetes en ratones NOD requiere tanto células CD4^{+} como T CD8+, se analizó la expresión de NKG2D sobre las células T aisladas de los tejidos inmunes periféricos y sobre los leucocitos de infiltración en los páncreas de ratones NOD. Como se muestra en la in Fig. 2a, se detectó NKG2D en un subconjunto de células T CD8+ que infiltran el páncreas in ratones NOD de 10 y 25 semanas de edad. Los porcentajes de células T CD8^{+} NKG2D^{+} que infiltran el páncreas con progresión de la enfermedad (Fig. 2a). Se detectó una fracción más pequeña de células T CD8^{+} NKG2D^{+} en las PLN y bazo (Fig. 2a, b). Además, células T CD8^{+} NKG2D^{+} en el páncreas y PLN se encontró que expresan altos niveles de CD44, pero no de Ly6C (Fig. 2b). También se observó una población de leucocitos CD8 NKG2D+ leucocitos (que no expresaban CD3) en los leucocitos que infiltran el páncreas de NOD (Fig. 2a) y muchas de estas células expresaban de manera conjunta antígenos de células NK cell y mieloides. Como se ha indicado para las razas de ratones no diabéticos normales (Jamieson et al., Immunity, 17: 19-29,2002), no se detectó NKG2D en células T CD4+ o en células B220^{+} B células en el páncreas o en los tejidos linfoides periféricos de o bien ratones NOD de 10 semanas o 25 semanas de edad.
Los estudios recientes revelaron que una proporción sustancial de células T autorreactivas CD8^{+} en ratones NOD reconocen un péptido de la proteína relacionada con la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa (IGRP) que se presenta por H-2K^{d}. Un péptido de mimotopo, NRP-V7 (KYNKANVFL, establecido como la SEQ ID Nº: 5), funciona como un super-agonista en los ratones NOD que expresan 8.3 TcR. Células T NRP-V7-reactivas CD8^{+} se acumulan en el páncreas de ratones NOD y juegan un papel crítico en la diabetogénesis. Se tiñeron de manera conjunta células T CD8^{+} y PLN en el páncreas con NRP-V7/H-2K^{d} tetrámeros y anti-NKG2D: Casi todas las células T NRPV7/H-2Kd tetrámero positivo CD8+ que infiltran el páncreas expresaron NKG2D y CD44^{anto} (Fig. 2c). De manera similar, las células T NKG2D^{+} CD8^{+} en el páncreas eran CD44^{alto}, pero Ly-6C' (Fig. 2b), un fenotipo consistente con las células T CD8^{+} efectoras (Cerwenka et al., J Inmunol, 161: 97-105, 1998). De manera notable, pocas células T CD8^{+} NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo se detectaron en las PLN (Fig. 2c). La inmunohistoquimica demostró que las células T CD8^{+} NKG2D^{+} se acumulan en los islotes de ratones pre-diabéticos NOD, cerca de las células beta que producen insulina (Fig. 2d). Además de las células T CD8^{+}, un subconjunto de las células C068 positivo (macrófagos) en el páncreas también expresó NKG2D (Fig. 2d).
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Tratamiento con anti-NKG2D mAb neutralizante in vivo evita la diabetes autoinmune
La expresión de NKG2D sobre las células T CD8^{+} y ligandos de NKG2D sobre los islotes prediabéticos indicaron un papel para estas moléculas a en la diabetogénesis. Se ensayó esta hipótesis, mediante tratamiento de ratones NOD prediabéticos con un anti-NKG2D mAb neutralizante. El CX5 anti-ratón NKG2D mAb bloquea la unión de NKG2D a sus ligandos, e incubación de células que llevan NKG2D con CX5 da como resultado la modulación e internalización del receptor. De manera importante, el tratamiento de ratones in vivo con CX5 no empobrecieron las células NKG2D^{+} NK o células T CD8^{+}. Se trataron ratones NOD con anti-NKG2D mAb de 7-25 semanas de edad. Los ratones tratados con diluyente solamente desarrollaron diabetes comenzando a las 15 semanas de edad y todos (n = 7) tenían enfermedad a las 28 semanas (Fig. 3a, b). Por el contrario, ninguno de los ratones NOD tratados con anti-NKG2D (n = 7) desarrolló diabetes a las 30 semanas de edad, aunque el tratamiento con anticuerpo se detuvo 5 semanas antes (Fig. 3a, b).
Como un análisis más riguroso, se ensayó el tratamiento de anti-NKG2D mAb para la prevención de la aparición de la enfermedad en ratones pre-diabéticos de 13 semanas de edad con insulitas establecida. Los ratones de control proporcionados con IgG desarrollaron diabetes comenzando a las 15 semanas de edad. Por el contrario, no se produjo diabetes en cualquiera de los ratones NOD durante las 12 semanas de tratamiento de anti-NKG2D (Fig. 3c, d). De manera notable, la mayoría de los ratones tratados con anti-NKG2D estaban sin enfermedad durante 7 semanas después de la detención de la terapia (Fig. 3c, d). De este modo, el bloqueo de NKG2D evitó la progresión de diabetes no solamente en los ratones jóvenes con insulitis, pero también en ratones en una prediabes tardía con la aparición inminente de la destrucción de islotes. Los efectos secundarios de del tratamiento de anti-NKG2D mAb no se observaron o bien mediante un examen bruto o análisis histológico. De este modo, el tratamiento de anti-NKG2D mAb es una terapia eficaz para prevenir la diabetes, al menos mientras se administre un anticuerpo de manera continua.
Para examinar el mecanismo de la terapia mediada por anti-NKG2D mAb, se analizaron los leucocitos aislados del páncreas y PLN de Ig de control y ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb. Células T CD8^{+} que expresan conjuntamente NKG2D y los niveles altos de CD44 estaban presentes en el páncreas de ratones tratados con Ig de control. Como se esperaba, la expresión de NKG2D se redujo de manera significativa en las células T CD8^{+}, pero la expresión de CD44 era idéntica en el páncreas de ratones tratados con anti-NKG2D mAb comparado con la de los ratones tratados con Ig control (Fig. 4a). Por el contrario, Células T CD8^{+} que expresan NKG2D eran relativamente infrecuentes en las PLN de ratones tratados tanto como control como anti-NKG2D mAb, indicativo de la localización preferencial de las células T CD8^{+} NKG2D^{+} en el páncreas (consistente con los resultados presentados en la in Fig 2 para los ratones no tratados). El análisis inmunohistoquímico de las secciones congeladas de páncreas de ratones tratados con Ig control indicó células T CD8^{+} que expresan NKG2D en el páncreas de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig control (Fig. 4b). Por el contrario, estaban presentes muchas menos células T CD8^{+} en el páncreas sano de los ratones de 16 semanas de edad que se habían tratado durante nueve semanas con antiNKG2D (Fig. 4c).
Los leucocitos aislados del páncreas y PLN de ratones NOD tratados con Ig control o anti-NKG2D mAb también se analizaron para determinar la presencia de células T CD8^{+} autorreactivas específicas de antígeno. De manera notable, la infiltración de células T CD8^{+} autorreactivas NRPV7/H-2Kd tetrámero positivo en el páncreas se disminuyó de manera notable (-75%) en los ratones tratados con antiNKG2D mAb (Fig. 4d). La frecuencia de células T CD8^{+} NRP-V7/H-2Kd tetrámero positivo también disminuyó en PLN, bazo y sangre periférica de ratones tratados con anti-NKG2D mAb, comparado con los ratones tratados con Ig control (Fig 4d, e). No se detectó NKG2D sobre las células T CD8^{+} en ratones tratados con anti-NKG2D mAb. Debido a que CX5 es un anti-NKG2D mAb no empobrecedor (Véase, La Figura 8), la terapia se contempla para que trabaje mediante modulación del receptor (Véase, La Figura 7) y/o inhibición de unión de ligando. También se examinó la producción de IFN-\gamma por las células T CD8^{+} aisladas a partir de PLN de ratones tratados in vivo con Ig control o antiNKG2D mAb. Tras la estimulación con PMA y yonomicina in vitro, las células T CD8^{+} IFN-\gamma se detectaron en ratones NOD tratados con clg, mientras que se observaron menos células T IFN^{+} \gamma CD8^{+} en ratones sometidos a terapia de anti-NKG2D mAb (Fig. 4f). No obstante, un entendimiento del(de los) mecanismo(s) no es necesario con el fin de realizar y usar la presente invención.
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El bloqueo de NKG2D evita la diabetes en ratones NOD.scid que reciben células Transferidas de manera adoptiva de ratones NOD diabéticos
Para dirigir si el bloqueo de NKG2D afecta a las células T CD8^{+} efectoras, las células T aisladas de ratones de 16 semanas de edad se transfirieron de manera adoptiva en receptores NOD.scid (que carecían de células T y y no desarrollaban diabetes). En el momento de la transferencia, solamente un pequeño porcentaje de las células T CD8^{+} expresaban NKG2D (Fig. 5a). Sin embargo, 5 semanas después de la transferencia se detectaron un número sustancial de células T CD8^{+} NKG2D^{+} en el páncreas, PLN, y bazo en los ratones receptores (Fig. 5a), que sugiere la expansión de células T NKG2D^{+} preexistentes o adquisición de NKG2D sobre las células T CD8^{+} transferidas.
Aproximadamente el 15% de las células T CD8^{+} que infiltran el páncreas en ratones receptores tratados con clg eran NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo, mientras que se encontró de manera significativa que eran menos en los ratones tratados con anti-NKG2D mAb (Fig. 5b, c). NKG2D estaba presente en la mayoría de las células T CD8^{+} NRP-V7/H-2K^{d} tetrámero positivo autorreactivas en los ratones NOD tratados con Ig control, pero no se detectó en los ratones que recibieron terapia anti-NKG2D (Fig 5c). Aunque la diabetes desarrollada en todos los ratones NOD.scid control que recibían células T de ratones NOD diabéticos, ninguno de los ratones tratados con anti-NKG2D desarrolló diabetes mientras que se sometía a terapia (Fig 5d).
Para determinar si el tratamiento de anti-NKG2D bloqueaba la expansión de células T CD8^{+} patógenas en los ratones receptores NOD.scid, se detuvo el tratamiento de anti-NKG2D mAb después de 8 semanas, cuando habían sucumbido a la enfermedad todos los ratones tratados con Ig control. Cuatro semanas después de la detención de la terapia de anti-NKG2D, la diabetes desarrollada en la mayoría de los ratones NOD.scid que habían recibido células T de donantes NOD diabéticos (Fig. 5d). Además, en ese momento existía evidencia de expansión de células T CD8^{+} NRPV7/H-2K^{d} tetrámero positivo NKG2D^{+} en los ratones NOD.scid (Fig. 5e). Estos resultados indicaron que el tratamiento de antiNKG2D mAb inhibía la expansión y/o acumulación de células T CD8^{+} NKG2D^{+} en el páncreas. La rápida progresión a diabetes en poco tiempo después de la detención de la terapia indicó que las células T efectoras estaban controladas, en lugar de empobrecidas, durante el período de tratamiento de anticuerpo.
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La terapia de Anti-NKG2D mAb evita la expansión de células T CD8+ autorreactivas en el páncreas
El hallazgo de pocas células T CD8^{+} NRP-V7/H-2Kd tetrámero positivo en el páncreas de ratones tratados con anti-NKG2D era consistente con la posibilidad de que la terapia de mAb bloqueaba la expansión de las células T autorreactivas. Para probar directamente esta hipótesis, células T de 8.3 TcR-transgénicos se marcaron con CSFE, transferidas de manera adoptiva a receptores NOD de 10 semanas de edad y se trataron o bien con Ig control o anti-NKG2D mAb (Fig. 6). Antes de la transferencia, células T CD8^{+} donantes de ganglios linfáticos y bazos de ratones NOD 8.3 TcR-transgénicos eran más de > 90% NRP-V7/H2Kd tetrámero positivo pero no expresaban NKG2D (Fig. 6a). Dos días más tarde, las células células T CD8^{+} marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgénicos NOD que infiltran el páncreas de ratones tratados con Ig control expresaron NKG2D (Fig. 6b) y sin embargo ya estaban proliferando, sin dilución de CSFE se observó en las células células T transferidas presentes en los ganglios linfáticos pancreáticos o mesentéricos (Fig. 6c). Los días 4 y 8 después de la transferencia, las células T marcadas con CESE de 8.3 TcR-transgénicos en el páncreas y ganglios linfáticos pancreáticos, pero no en los ganglios linfáticos mesentéricos, de ratones tratados con Ig control mostraron la proliferación extensiva (Fig. 6c). En un contraste sorprendente, no se detectó NKG2D sobre la superficie celular de las células T CD8+ transferidas marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgénicos en el páncreas de ratones NOD tratados con anti-NKG2D mAb (Fig. 6b). Además, la expansión de estas células en el páncreas se inhibió sustancialmente comparado con los ratones tratados con Ig control (Fig. 6c). De manera interesante, el tratamiento con antiNKG2D mAb tenía un efecto mucho más profundo en la proliferación de células T marcadas con CSFE de 8.3 TcR-transgénicos que infiltran el páncreas comparado con las células en los ganglios linfáticos. La expansión de las células T endógenas no marcadas con CSFE en el páncreas detectada con NRP-V7/H2Kd tetrámero también se administró mediante tratamiento con anti-NKG2D mAb, comparado con los ratones tratados con Ig control. La cuantificación de la proliferación de las células T transferidas de manera adoptiva de 8.3 TcR-transgénicos que infiltran el páncreas en ratones NOD tratados con Ig control y anti-NKG2D mAb indicaron un efecto profundo de la terapia de anti-NKG2D sobre la expansión de las células T CD8+ autorreactivas específicas de antígeno (Fig. 6d).
Los datos indican que RAE-1 está presente en los islotes de páncreas prediabéticos de los ratones NOD y que las células T CD8^{+} autorreactivas que infiltran el páncreas expresan NKG2D. El tratamiento con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NKG2D no empobrecedor durante la fase prediabética evitaba completamente la enfermedad mediante la alteración de la expansión y función de las 35 células T CD8^{+} autorreactivas. Estos hallazgos demuestran que NKG2D es esencial para la progresión de la enfermedad y y proporciona una nueva diana terapéutica para la diabetes de tipo I autoinmune. Estos datos directamente implican al receptor de NKG2D en el desarrollo funcional de las funciones efectoras de las células T CD8^{+} patógenas e indican que el anti-NKG2D mAb funciona de manera terapéutica para bloquear las señales mediadas por receptor en la ausencia de I empobrecimiento de las células flanqueantes.
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Ejemplo 4 Modulación de la Expresión de la superficie celular de NKG2D mediante ARNsh
Se realizó el siguiente experimento para examinar el efecto del ARN inhibidor en la expresión de NKG2D. El ADN que codifica NKG2D en un vector que contiene un elemento IRES-eGFP se transfectó de manera estable en células CHO. Se transfectaron después las células que expresan NKG2D transferidas de manera estable (usando Lipofectamina y procedimientos convencionales) con un ADNc que codifica CD8 de ratón (mCD8) y con un plásmido (el vector pCR2.1TOPO de InVitroGen) que contenía un ADNc de 22 pares de bases (bp) (5'-ggatgggact agtacacatt cc-3' como se establece en la SEC ID Nº: 10) homólogo a un segmento de NKG2D humano (denominado shDNA03). Como un control específico para demostrar la especificidad, células CHO que expresan NKG2D también se transfirieron de manera doble con mCD8 y con un ADNc de 22 pares de bases similar a NKG2D humano pero con 3 nucleótidos mutados (5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3' como se establece en la SEC ID Nº: 13). Las células en los paneles de la izquierda se transfectaron solamente con el plásmido que contiene el ADNc de CD8 de ratón (mCD8). Las células transfectadas se tiñeron con anticuerpos monoclonales contra CD8 de ratón y contra NKG2D humano y se analizaron mediante citometría de flujo. Se obtuvieron transferencias de puntos bivariadas mostrando la fluorescencia que representa (i) CD8 de ratón contra NKG2D humano y (ii) eGFP (fluorescencia verde intrínseca que se produce a partir de la expresión del vector NKG2D-IRES-eGFPhumano) contra NKG2D humano.
Los resultados indicaron, primero, que las células T que expresaban CD8 de ratón sobre la superficie celular se puede detectar fácilmente revelando que se transfirieron con los plásmidos introducidos en las células CHO. Además, la expresión de NKG2D humano sobre las células que expresan el CD8 de ratón no estaba afectada por la co-transfección con el plásmido CD8 de ratón solo o con el plásmido contienen la construcción de NKG2D. Por el contrario, la co-transfección con la secuencia de NKG2D homóloga sustancialmente evitó la expresión de NKG2D.
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Ejemplo 5 Modulación de NKG2D de superficie celular mediante el uso de un anticuerpo Monoclonal Anti-NKG2D
Se realizaron los siguientes experimentos para la evaluación de la capacidad de un anticuerpo monoclonal dirigido contra NKG2D para modular la expresión en la superficie celular de NKG2D.
Se tiñó una línea celular de NK humana (NKL) durante 30 min sobre hielo con una IgG control conjugada a biotina (clg bio) o con NKG2D mAb anti-humano de ratón conjugado a biotina (clon 149810 de R&D Systems), se lavó y se incubó una alícuota, y se incubó una alícuota durante toda una noche a 37ºC. Las células se tiñeron con estreptavidina conjugada a aloficocianina -o bien antes del cultivo (0 h) o después de cultivo (16 h), y y se analizaron posteriormente mediante citometria de flujo. La intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) de células teñidas con anti-NKG2D antes del cultivo era 186 comparado con 61 después del cultivo, lo que indica una disminución del 67% en la expresión de NKG2D sobre la superficie celular de las células NK tratadas con anti-NKG2D mAb durante 16 horas.
Se cultivaron células NKL durante 16 h a 37ºC con o bien IgG o con IgG anti-humano NKG2D de ratón (clon 149810 de R y D Systems). Al final de la incubación, se lavaron las células y se trataron con medio ácido a pH 3,5 durante 15 min para retirar el anticuerpo de superficie. Las células se tiñeron después con anticuerpo anti-NKG2D seguido de anticuerpo secundario de IgG anti-ratón de cabra marcado con PE para detectar NKG2D. La Figura 12 muestra que este anticuerpo anti-NKG2D es eficaz en la estimulación de la internalización de NKG2D de superficie sobre estas células humanas.
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Ejemplo 6 El bloqueo de NKG2D evita el rechazo de Injerto de Médula Ósea Parental en ratones F1
Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de resistencia (rechazo de injertos de médula ósea parental por los receptores F1) en un sistema de modelo animal, ratones (C57BU6 x BALB/c) F1 (CB6F1).
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Ratones
Se compraron ratones C57BU6, BALB/c, y CB6F1 de aproximadamente 6 semanas de edad en el National Cancer Institute Animal Program (Frederick, MD). Se generaron ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos y se retrocruzaron en el antecedente C57BU 6 (Ehrlich et al., observaciones no publicadas). Ratones DAP12-/- en el antecedente C57BU6 (retrocruzados 9 generaciones) se describieron anteriormente (Bakker et al., Immunity, 13: 345-353,2000), y se generaron DAP10-/- a partir de células del tronco embrionario C57BU6 (Phillips et al., observaciones no publicadas). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las guías del Comité UCSF sobre la Investigación de Animales.
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Reactivos, Citoquinas y Anticuerpos
Se generó Anti-ratón NKG2D mAb, clon CX5 (isotipo IgG1 de rata mediante la inmunización de ratas con proteína NKG2D de ratón purificada, como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., Immunity, 18: 41-51, 2003). Se produjo Anti-ratón NKG2D, clon 191004 (isotipo IgG2a de rata), a partir de un hibridoma que se produce de la fusión de un mieloma de ratón con células B a partir de una rata inmunizada con el dominio de ratón NKG2D extracelular (R y D Systems, Minneapolis, MN). Todos los anti-NKG2D mAbs reconocen el dominio extracelular NKG2D bloquean de manera eficaz y la unión de NKG2D a sus ligandos. Para la inyección in vivo, se usaron anti-NKG2D mAb CX5 y anti-NK1.1 mAb PK136 purificados que no contenían endotoxina detectable (< 0,3 \mug/inyección). El anti-NKG2D mAb CX5 es un anticuerpo bloqueante que no empobrece las células NK o células T que llevan NKG2D -cuando se inyectan in vivo (Ogasawara et al., Immunity, 20, 757-7567, 2004; Lodoen et al., J Exp Med, 197: 1245-1253, 2003); y Lodoen et al., J Exp Med, 200: 1075-108, 2004). Se compró IgG control de rata en Sigma (S1. Louis, MO). Se generaron Anti-ratón pan-RAE-1 mAb (clon 186107, isotipo IgG2b de rata), anti-ratón H60 mAb (clon 205310) y anti-ratón MULTI mAb (clon 237104) como se ha descrito (Lodoen et al., supra, 2003; y Lodoen et al., supra, 2004). Se compraron otros anticuerpos en BD PharMingen o eBiosocience (San Diego, CA).
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Transplante de médula ósea
Se transplantó médula ósea murina como se ha descrito anteriormente (George et al., J Inmunol, 163: 1859-1867, 1999). En resumen, se realizaron tratamientos de mAb (200 \mug/ratón) 2 días antes de la transferencia de la médula ósea, y se trataron los receptores con poli I:C (Sigma, 200 \mug/ratón) para activar el rechazo de injerto mediado por células NK un día antes de la inyección de células de médula ósea (Murphy et al., J Exp Med, 166: 1499-1509, 1987). El día 0 se irradiaron los ratones mediante exposición a dosis letales (11 Gy) de irradiación ^{137}CS gamma, y después 4 x 10^{6} de células BM se inyectaron por vía intravenosa. Cinco días después de la transferencia los ratones se les proporcionó 26 \mug de 5-fluoro-2'-deoxyuridina (Sigma, St. Louis, MO) por vía intravenosa para suprimir la síntesis de timidina endógena (George et al., supra, 1999). Treinta minutos más tarde, a los ratones se les proporcionó 3 \muCi de 5-[^{125}I]yodo-5 2'-deoxiuridina (Amersham Life Science, Arlington Heights IL) por vía intravenosa. El día 6, se retiraron los bazos de los ratones receptores y se contaron con un contador gamma.
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Generación de ratones BM quiméricos
En resumen, 1x10^{7} de células Ly5.2 B6 BM se transfirieron por vía intravenosa en células NK empobrecidas y ratones receptores irradiados (dosis absorbida de radiación = 11 Gy), como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., Nature, 391: 701-703, 1998). Durante la reconstitución, se mantuvieron los ratones en antibióticos.
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Preparación de células NK
Las células NK se enriquecieron como se ha descrito previamente (Ogasawara et al., J Inmunol, 169: 3676-3685, 2002). En resumen, se incubaron células de bazo con anti-ratón CD4 mAb (clon GK1.5) y anti-ratón CD8 mAb (clon 53-6.7), y después se mezclaron estas células con perlas magnéticas recubiertas con anti-ratón Ig y anti-rata Ig de cabra (Advanced Magnetic, Inc, Cambridge, MA). CD4, CD8, y se retiraron las células Ig (slg)-positivo de superficie mediante aislamiento de células magnético.
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Análisis de citometría de flujo
Se usó una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de ratón NKG2D condensado a IgG1 Fc humano (mNKG2D-Ig) para detectar ligandos de NKG2D (Cerwenka et al., Immunity, 12: 721-727,2000). Se usó un fragmento de IgG Fc\gamma anti-humana de cabra (Jackson Inmuno Research, West Grove, PA) como un reactivo de segunda etapa. Las células (1 x 10^{6}) se tiñeron con 0,5 \mug de mNKG2D-Ig y con 0,25 \mug de otros mAbs. Para determinar qué ligandos de NKG2D se expresaban, se tiñeron células con un anti-pan RAE-1 mAb biotinilado, que reconoce las cinco proteínas RAE-1 conocidas (es decir, RAE-1 \alpha, \beta, \gamma, \delta y \varepsilon), anti-H60 mAb biotinilado o anti-MULT1 mAb, estreptavidina conjugada a PE o estreptavidina conjugada a APC se usó para detectar mAbs biotinilados. Para la detección de NKG2D, células (-1x10^{6}) se tiñeron con 0,25 \mug de anti-NKG2D mAb biotinilado o marcado con PE (clon 191004). Se tiñeron conjuntamente las células con anti-CD43, anti-Ly6C/G, antiC011 c, anti-B220, anti-CO3, anti-TER119, anti-NK1.1 y anti-CD49d (OX5) mAbs. Se incubaron las células con mAbs durante 20 min y se lavaron con PBS que contiene NaN_{3} al 0,01%. Se analizaron las células mediante el uso de un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA). Se activaron poblaciones de linfocitos viables basándose en los perfiles de dispersión directos y laterales y mediante la falta de yoduro de propidio.
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Ensayo Citotóxico
Se realizaron ensayos de citotoxicidad redirigidos mediados por anticuerpo monoclonal como se ha descrito previamente (Lanier et al., J Inmunol, 141: 3478-3485, 1988). Se marcaron las células T diana con 50 \muCi de Na_{2} (^{51}Cr) O_{4} durante 2 h a 37ºC en medio RPMI-1640 que contiene un 10% de FCS, se lavó tres veces con medio, y se usó en ensayos de citotoxicidad. Se mezclaron células diana marcadas con ^{51}Cr (5 x 10^{3}) y células efectoras en pocillos con fondo en forma de U de una placa de microtitulación de 96 pocillos en las relaciones efector/diana (EIT) indicadas, por triplicado. Después de un período de incubación de 4 h, se recogieron los sobrenadantes sin células y se midió la radiactividad en un contador Micro-beta (Wallac, Turku, Finlandia). La liberación espontánea era menor que el 15% de la liberación máxima. Se calculó el porcentaje de liberación de ^{51}Cr específica de acuerdo con la siguiente fórmula: % de lisis específica = liberación (experimental - espontánea) x 100 / (máxima - espontánea).
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Expresión de ligandos NKG2D en células de ratón BM
Los genes que codifican ligandos de NKG2D son polimórficos; ratones BALB/c (B/c) tienen genes RAE-1\alpha, \beta y \gamma, mientras que los ratones C57BU6 (B6) poseen los genes RAE-1\alpha y \varepsilon (Cerwenka y Lanier, Tissue Antigens, 61: 335-343, 2003). De manera similar, ratones B/c pero no B6 expresan H60 (Malarkannan et al., J Inmunol, 161: 3501-3509, 1998). Se analizaron las células BM aislados de ratones B/c, B6 y (BALB/c x C57BU6) F1 (CB6F1) para determinar si los ligandos de NKG2D se expresan en células BM. Se tiñeron las células con una proteína de fusión de ratón NKG2D-IgG Fc y se analizó mediante citometría de flujo. Se detectaron bajos niveles de ligandos de NKG2D sobre la superficie de células recientemente aisladas B/c BM, pero no de células B6 BM (Fig. 13a). Con el fin de determinar qué ligandos de NKG2D se expresaban, se tiñeron las células BM con anticuerpos monoclonales anti-pan RAE-1, anti-H60 y antiMULT1 (mAbs). Se expresaron RAE-1 y H60 a bajos niveles en células B/c BM recientemente aisladas, mientras que no se detectó MULTI (Fig 13b). Por ele contrario, RAE-1 no se detectó en esplenocitos recientemente aislados de ratones B/c, B6 o CB6F1 ratones.
Estudios anteriores han probado que las células NK en receptoers F1 son capaces de rechazar injertos de médula ósea parental (Kiessling et al., Eur J Inmunol, 7: 655-663, 1977; Lotzova et al., Transplantation, 35: 490-494, 1983; Murphy et al., J Exp Med, 165, 1212-1217, 1987; y Murphy et al., Eur J Inmunol, 20: 1729-1734, 1990). Los inventores contemplaban que las células B/c BM que repueblan el bazo en un receptor CB6F1 irradiado expresa los ligandos NKG2D. De este modo durante el desarrollo de la presente invención, los ratones receptores CB6F1 se trataron previamente con anti-NK1.1 mAb para empobrecer las células NK residentes y por lo tanto evitan el rechazo de las células B/c BM trasplantadas. Como un control, un grupo de ratones CB6F1 irradiados se reconstituyeron con células CB6F1 BM singénicas. Siete días después del injerto, las células hematopoyéticas que repueblan los bazos de los ratones CB6F1 se aislaron y se analizaron para evaluar la expresión de ligandos de NKG2D. Como se muestra en la Fig. 13c, se detectaron los ligandos de NKG2D sobre las células hematopoyéticas aisladas de los bazos de ratones B/c BM -> CB6F1, pero no sobre las células aisladas de los bazos de ratones CB6F1 BM -> CB6F1. Las células B/c hematopoyéticas que reconstituyen los bazos de los receptores CB6F1 irradiados predominantemente expresaban RAE-1, y no H60 o MULTI (Fig. 13d).
Con el fin de identificar la población de células hematopoyéticas que expresan RAE-1, las células aisladas de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1 y B/c BM -> CB6F1 se tiñeron con mAbs con marcadores de linaje hematopyéticos. El día 7 después del transplante, se detectó RAE-1 sobre la mayoría de las células aisladas de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Por el contrario, no se detectó RAE-1 sobre una proporción sustancial de células de los bazos de receptores CB6F1 BM -> CB6F1. Esencialmente todas las células RAE-1-positivas aisladas de los receptores B/c BM -> CB6F1 expresaban CD43 (Fig. 13e). RAE-1 también estaban presentes sobre la mayoría de las células que expresan Gr-1 asociado a proteína de granulocitos (Ly-6C/G) y el marcador CD11 b asociado a células mieloides (Mac-1). Solamente una fracción menor de células positivas B220 (marcador asociado a células B) y células positivas Ter119 (un marcador asociado a eritrocitos) expresaban RAE-1, y no se detectó RAE-1 en las células T CD3+ (Fig. 13e). Se contempló que las células B y células T detectadas en los bazos eran células residuales resistentes a radiación de origen de huésped, debido a que es diferente de las células T o células B se habrían desarrollado a partir de las células de médula ósea del donante es menor que una semana después del transplante. Se detectó RAE-1 sobre un pequeño subconjunto de células que expresan c-kit y Sca-1, aunque la mayoría de las células RAE-1 -positivas no tenían estos marcadores (Fig. 13f). El estado de proliferación de las células que expresan RAE-1 en los receptores B/c BM -> CB6F1 se evaluó mediante la inyección de BrdU en estos ratones a las 2 hr y 12 hr antes de la recogida de las células de bazo el día 7 después de transplante. Como se muestra en la Fig. 13g, se detectó fácilmente RAE-1 en una fracción grande (pero no toda) de las células progenitoras proliferantes en los bazos de los receptores de transplante.
En los experimentos iniciales, ratones CB6F1 se transplantaron con médula ósea aislada de donantes B/c. Con el fin de dirigir si RAE-1 se expresa en la progenie de células de tronco hematopoyéticas (HSC), se trataron ratones B/c donantes con 5-fluorouracilo (5-FU) antes de la recogida de la médula ósea para enriquecer para HSC, y después se transplantó médula ósea de donantes tratados con 5-FU en receptores CB6F1 que se habían tratado previamente con anti-NK1.1 mAb para empobrecer las células NK de huésped. Las células de médula ósea recogidas de los donantes tratados con 5-FU no expresaron RAE-1. Cuando las células en los bazos de receptores B/c 5-FU BM -> CB6F1 se analizaron el día 8 después de transplante, esencialmente todas las células RAE-1-positivo expresaban bajos niveles de Ly-6C/G, CD11 b y CD43, pero no CD3, Ter119, o B220. Una pequeña población de células RAE-1 positivo expresaban bajos niveles de c-kit y Sca-1, aunque una mayoría de las células RAE-1 positivo que carecen de estos marcadores (Fig. 13i). Estos resultados indicaron que la mayoría de las células B/c progenitoras proliferantes en los receptores CB6F1 empobrecidos con células NK expresan RAE-1.
Después del desarrollo de la presente invención, se ha reseñado la expresión de los ligandos de NKG2D sobre las células de médula ósea humanas proliferantes (Nowbakht et al., Blood, publicado de manera electrónica el 18 de enero de 2005). De este modo, los inventores contemplan que los experimentos descritos en el presente documento en ratones, son también relevantes para los humanos (y otros mamíferos).
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NKG2D está implicado en la resistencia híbrida
Durante el desarrollo de la presente invención, el hallazgo que RAE-1 se expresó en las células progenitoras proliferantes en los bazos de ratones CB6F1 reconstituidos con médula ósea de B/c sugirió a los inventores que NKG2D está implicado en la resistencia híbrida. Esto se confirmó mediante la transferencia de células B/c BM en ratones CB6F1 irradiado tratados previamente con un anticuerpo control (clg), un anti-NKG2D mAb (CX5) neutralizante, no empobrecedor (Ogasawara et al., Immunity, 20: 757-767, 2004), o el anti-NK1.1 mAb (PK136) empobrecedor de las células NK. Hematopoyeticas. La reconstitución de las células hematopoyéticas de ratones receptores se evaluó mediante inyección de ^{125}IUdR doce horas antes de la recogida de bazos el día 7. Los ratones tratados con clg rechazaron las células de B/c BM células, y consistente con las reseñas anteriores (Lotzova et al., Transplantation, 35: 490-494, 1983), el empobrecimiento de las células NK en ratones CB6F1 evitaban de manera eficaz el rechazo de las células de médula ósea de B/c, que daban como resultado un incremento sustancial en la incorporación de la radiomarca en los bazos (Fig. 14a). El anti-NKG2D mAb no empobrecedor, neutralizante también incrementaba de manera notable la incorporación de ^{125}IUdR, comparable con los efectos de células NK empobrecedoras.
La capacidad de tratamiento de anti-NKG2D mAb para evitar el rechazo de de las células de médula ósea de B/c se confirmó mediante el examen de las células que repoblan los bazos el día 8 después de transplante. Como se muestra en la Fig. 14b, se detectaron las células RAE-1 positivas predominantemente expresaban de manera conjunta CD43, Ly-6C/G, y CD11 b en los bazos de ratones CB6F1 tratados con antiNKG2D mAb. Por el contrario, se recuperaron muchas menos células de los ratones tratados con clg y muy pocas de estas células expresaron RAE-1. Estos datos indicaron que el rechazo de las células RAE-1-positivo de B/c BM en ratones CB6F1 se evita de manera eficaz mediante o bien el empobrecimiento de las células NK o mediante el bloqueo del receptor de NKG2D.
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Las células NK eliminan las células de BM singénicas que expresan altos niveles de RAE-1
La capacidad de tratamiento de anti-NKG2D mAb para bloquear el rechazo de injerto de médula ósea parental en receptores F1 provocaban la pregunta de si el reconocimiento de H-2 parental por las células NK de F1 se requiere para el rechazo de dependiente de NKG2D o si las células NK también pueden rechazar las células de médula ósea singénicas siempre que RAE-1 se exprese a niveles suficientemente altos. De células de médula ósea CB6F1 que repueblan los receptores CB6F1 singénicos irradiados (Fig. 13c, e) y células B6 de médula ósea que repueblan los receptores B6 irradiados singénicos expresaban solamente niveles muy bajos de RAE-1 comparado con las células de médula ósea de B/c de repoblación (Fig. 13d, e). Por lo tanto, con el fin de evaluar si existe o no la expresión de RAE-1 sobre células de médula ósea de B6 o CB6F1 provocarían el rechazo de injertos de médula ósea singénicos, se generaron ratones transgénicos que expresan RAE-1 \varepsilon dirigidos mediante un promotor de \beta-actin humano, que da como resultado la expresión de RAE-1 \varepsilon en todos los tejidos. Como se muestra en la Fig. 15a el nivel de expresión de RAE-1 \varepsilon en las células de médula ósea aisladas recientemente de ratones transgénicos B6 RAE-1 \varepsilon, es similar a los niveles de RAE-1 presentes en las células de médula ósea de B/c (Fig. 13d, e).
Se ensayaron células de médula ósea aisladas recientemente de ratones B6 RAE-1 \varepsilon transgénicos como dianas para las células NK no transgénicas singénicas activadas por IL-2 NK en un ensayo de citotoxicidad in vitro convencional. Como se muestra en la Fig. 15b, las células NK activadas destruían las células médula ósea recientemente aisladas RAE-1 \varepsilon transgénicas B6, pero no las células de médula ósea RAE-1 negativo no transgénicas B6. Se bloqueó la citotoxicidad mediante un anti-NKG2D mAb, demostrando que la destrucción es dependiente de NKG2D. De acuerdo con los resultados in vitro, los ratones B6 no transgénicos irradiados rechazaron las células de médula ósea de donantes B6 transgénicos de RAE-1 \varepsilon transgénicos. De manera importante, se evitó el rechazo en ratones tratados con el anti-NKG2D mAb neutralizante, pero no en los ratones tratados con una Ig control (Fig. 15c). Se obtuvieron resultados similares cuando se cruzaron ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 con ratones B/c y la médula ósea de RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1 se injertó en receptores no transgénicos CB6F1. Las células de médula ósea de RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1, se diferenciaban de las células de médula ósea de CB6F1 no transgénicos (Fig. 13c, e), expresaron altos niveles de de RAE1 E y se rechazaron por los receptores singénicos no transgénicos CB6F1 (Fig. 15d). Se evitó el rechazo mediante la administración de anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecedor o mediante el empobrecimiento de las células NK con anti-N K1.1 mAb. De manera colectiva, estos hallazgos demuestran que las células NK de B6 y CB6F1 pueden rechazar las células de médula ósea H-2 idénticas, siempre que las células de médula ósea expresen RAE-1.
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DAP10 y DAP12 en rechazo de BM mediada por NKG2D
En ratones, el ayuste de ARN alternativo de transcripciones de NKG2D genera dos isoformas de proteínas llamadas NKG2D-S y NKG2D-L. NKG2D-L se expresa predominantemente en las células NK de reposo y se asocia con la proteína adaptadora DAP 10 mientras que NKG2D-S se induce mediante la activación de las células NK y se asocia o bien con DAP 10 o DAP12 (Diefenbach et al., Nat Inmunol, 3: 1142-1149, 2002). células de médula ósea de ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 se transplantaron en receptores irradiados de tipo salvaje, DAP1 0-1-, y DAP12-1-C57BU6, con el fin de determinar si DAP10 o DAP 12 o ambos adaptadores estaban implicados en el rechazo mediado por NKG2D. Los ratones se inyectaron con ^{125}IUdR el día 5 y se recogieron los bazos y se contaron el día 6. Comparado con los ratones B6 de tipo salvaje, los ratones DAP10-/B6 demostraron una deficiencia significativa en el rechazo de injerto de médula ósea de RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 (Fig. 16a). Por el contrario, los receptores DAP12-1-B6 rechazaron la médula ósea de RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 de manera más eficaz que los ratones DAP10-/-B6, aunque ligeramente menos que los ratones B6 de tipo salvaje (Fig. 16b). Los ratones de tipo salvaje, DAP10-/- y DAP12-/-B6 todos confeccionados para rechazar el inyecto de médula ósea de RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 cuando se trata con anti-NK1.1 mAb de empobrecimiento con el anti-NKG2D mAb neutralizante no empobrecedor. Estos resultados indican un papel predominante de DAP1 O, y un papel menor de DAP12, en el rechazo de médula ósea dependiente de NKG2D. No obstante, no es necesaria una comprensión del mecanismo con el fin de realizar y usar la invención.
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Resistencia híbrida detective en ratones transgénicos en RAE-1 \varepsilon
La activación de las células NK de ratones NOD induce la expresión de RAE-1, que da como resultado la modulación dependiente de ligando de NKG2D en las células NK (Ogasawara et al., Immunity, 18, 41-51, 2003). El análisis de la expresión de NKG2D sobre la superficie de las células NK de los ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 reveló una expresión reducida de NKG2D cuando se compara con las células NK de ratones de tipo salvaje (Fig. 17a). Aunque la cantidad de NKG2D en los RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 se disminuyeron de manera sustancial, el número de células NK en los bazos y la expresión de NK1.1, Ly-49D, Ly-49A, Ly-49C/I, Ly-49F/I/C/H, 50 y Ly-49G2 en las células NK eran similares a las NK células de tipo salvaje. Para examinar si la función de NKG2D está alterada en las células NK de RAE-1 \varepsilon transgénicos, se realizó un ensayo de citotoxicidad redirigida de anticuerpos usando clg, anti-NKG2D mAb y anti-NK1.1 mAbs. Aunque la actividad dependiente de NK1.1 de células Nk de RAE-1 \varepsilon transgénicos era idéntica a las células NK de B6 de tipo salvaje, se alteró la citotoxicidad dependiente de NKG2D en células NK de RAE-1 \varepsilon transgénicos (Fig. 17b).
El transgen RAE-1 \varepsilon se dirige mediante un promotor de acción \beta es estos ratones transgénicos, y por lo tanto, las células NK de estos animales expresan de manera conjunta tanto el ligando como el receptor. Con el fin de determinar si las células NK de tipo salvaje (non-transgénicos) están inactivadas in vivo mediante la exposición constante a ligandos NKG2D, se generaron quimeras de médula ósea mediante trasplante de médula ósea de B6 congénicos Ly5.2 de tipo salvaje en receptores RAE-1 \varepsilon B6 (Ly5.1) irradiados de manera letal. Tres meses después del trasplante el número de células, NK en los bazos y la expresión de NK1.1 (Fig. 17c), Ly-49D, Ly-49A, Ly-49 C/I, Ly-49F/I/C/H y Ly-49G2 en ratones transgénicos Ly5.2 BM ->RAE-1 \varepsilon eran similares a a los que había en ratones B6 Ly5.2 BM -> de tipo salvaje.
Por el contrario, la expresión de NKG2D en las células NK disminuyó drásticamente en ratones Ly-5.2 BM -> RAE-1E transgénicos (Fig. 17c). Consistente con los niveles disminuidos de NKG2D sobre las células NK, Se alteró la actividad citotóxica dependiente de NKG2D -en ratones Ly-5.2 BM -> RAE-1 \varepsilon transgénicos, como se determina mediante un ensayo de citotoxicidad in vitro redirigido de anticuerpos (Fig. 17d). Los inventores también investigaron si células de RAE-1 \varepsilon transgénicos B6 BM se rechazaban en receptores Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1 EB6 transgénicos. Como se esperaba, células NK en los ratones Ly5.2 B6 de tipo salvaje -> B6 de tipo salvaje rechazaron las células de RAE-1 \varepsilon transgénicos BM de manera eficaz (Fig. 17e). Por el contrario, las células NK que se desarrollaban en ratones Ly-5.2 B6 BM -> RAE-1 \varepsilon transgénicos no rechazaban las células de RAE-1 \varepsilon transgénicos BM (Fig. 17). Estos hallazgos indicaban que la modulación de NKG2D de células NK está provocada por la interacción con el receptor RAE-1 resistente a la radiación que expresa las células in vivo, y que esto da como resultado la alteración de la función de NKG2D in vivo. Sin embargo, un entendimiento del mecanismo no es necesario con el fin de hacer uso la invención.
Para investigar si la resistencia de híbridos F1 está afectada por los niveles disminuidos de NKG2D en células NK en los ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos B6, los ratones transgénicos se cruzaron con ratones B/c, y los ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos CBF1 se ensayaron para evaluar su capacidad de rechazar las células B/c BM parentales. A diferencia de los ratones CB6F1 de tipo salvaje, los ratones RAE-1 \varepsilon transgénicos CB6F1 no rechazaban las células B/c BM (Fig. 17f). además, el tratamiento con anti-NK1.1 mAb o anti-NKG2D mAb no afectaron la incorporación de ^{125}IUdR de células B/c BM en los receptores RAE-1E transgénicos CB6F1. Sin embargo, las células NK empobrecedoras o que bloquean NKG2D permitieron el injerto de las células de médula ósea de B/c en receptores CB6F1 de tipo salvaje. De este modo como se demuestra en el presente documento, NKG2D está implicado como un componente importante en la resistencia de híbridos F1.
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Ejemplo 7 Bloqueo de NKG2D para la Prevención y Tratamiento de Artritis reumatoide
Esto se puede ensayar en un modelo animal crónico de artritis donde NKG2D se puede demostrar que está presente en el sitio de la inflamación. Un ejemplo de tal modelo es la artritis inducida por colágeno crónica (Malfait et al., Artritis y Rheumatism 44: 1215-1224, 2001).
Recientemente, células T CD4+ CD28- en la sangre periférica y tejidos sinoviales de pacientes de artritis reumatoide humanos se encontró que expresan NKG2D, mientras que los sinoviocitos inflamados se encontró que expresan de manera aberrante los ligandos MIC de NKG2D (Groh et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100: 9452-9457, 2003). De este modo, los inventores contemplan que las composiciones y procedimientos para bloquear NKG2D descritos en el presente documento son también adecuados para la prevención y tratamiento de artritis reumatoide. Se realizaron los siguientes experimentos para ensayar el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de artritis reumatoide (RA) en un sistema de modelo animal, el ratón DBA/1.
En resumen, la artritis inducida por el colágeno de tipo II (CII) (CIA) se induce en ratones DBA/1 de 6-7 semanas de edad mediante inyección intradérmica en la base de la cola 100 \mug de colágeno II bovino suplementado con 2,0 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37RA emulsionado en adyuvante de Freund completo, como se ha descrito (Seo et al., Nat Med, 10: 1088-1094, 2004). La inflamación de las articulaciones se puntuó de 1 a 4,con una puntuación máxima de 16 por ratón. la gravedad clínica de artritis se clasifica como sigue: 0, normal; 1, inflamación ligera y/o eritema; 2, inflamación eritematosa sustancial; 3, inflamación eritematosa sustancial más ligera rigidez de las articulaciones; o 4, laxitud (Véase, por ejemplo, Williams et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89: 9784-9788, 1992). Cada miembro se clasifica, permitiendo una puntuación clínica máxima de 16 para cada animal. La inflamación de las patas traseras se mide con un par de calibres.
Se inyectan ratones con 200 \mug de un anti-NKG2D mAb o un mAb IP emparejado a isotipo control, los días 0, 2, 4, 6 y 8 o los días 0, 3, 7 y 10 después de la inmunización. Los inventores contemplan que el tratamiento con IgG control da como resultado el desarrollo de artritis grave que comienza aproximadamente 28 d después de la inmunización (por ejemplo, gravedad mayor que 10; la incidencia mayor que el 80%, y el grosor de la pata mayor que 3,5 mm). Por el contrario, el tratamiento con anti-NKG2D mAb se espera que dé como resultado la supresión de la enfermedad, que se manifiesta como una disminución de la gravedad e incidencia de artritis, así como una reducción del grosor de la pata e histopatología de la articulación reducida con relación a los animales tratados con mAb control (por ejemplo, la gravedad menor que 10, preferiblemente menor que 5 y lo más preferiblemente menor que 2; la incidencia menor que el 80%, preferiblemente menor que el 50%, y lo más preferiblemente menor que el 20%; y grosor de la pata menor que 3,5 mm, preferiblemente menor que 3.0 mm, y lo más preferiblemente menor que 2,5 mm).
Para tratar CIA establecida, se inyectan ratones los días 28, 30, 32, 34 y 36 o los días 28, 31, 35 y 38 después de la inmunización. Los ratones se dividen después en dos grupos con puntuaciones medias de artritis iguales el día 28 después de la inmunización, y se trataron con mAb control, o anti-NKG2D mAb los días 28, 30, 32, 34 y 36 después de la inmunización. Se contempla que la artritis se invierte solamente en el grupo tratado con anti-NKG2D mAb (por ejemplo, de reducción en la gravedad de la enfermedad, incidencia, grosor de la para e histopatología de la articulación). Además, los inventores contemplan que el tratamiento con anti-NKG2D mAb dará como resultado una reducción de los números de células que expresan NKG2D presentes en las articulaciones de sujetos artríticos, así como una reducción INEN los niveles de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a, IL-15, etc.) en el fluido sinovial.
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Ejemplo 8 Bloqueo de NKG2D para la Prevención y Tratamiento de Enfermedad celíaca
MIC se expresa de manera intense en la superficie del epitelio del intestino que en los pacientes de Enfermedad celiaca (CD), que a su vez activan de manera conjunta los linfocitos T intraepiteliales (IEL) mediante NKG2D, que conduce a la citolisis de dianas de células epiteliales (Meresse et al, Immunity, 21: 357-366, 2004; y Hue et al, Immunity, 21: 367-377, 2004). Los inventores contemplan que las composiciones y procedimientos para bloquear NKG2D descritos en el presente documento son también adecuados para la prevención y tratamiento de enfermedad celíaca. El efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) se ensayará en un modelo de animal pequeño adecuado, tal como, por ejemplo, cualquiera de los dos siguientes modelos de ratón de colitis: TNB inducido (Chin et al, Digestive Diseases and Sciences 39: 513-525, 1994) o modelo de células T transferidas (Powrie et al., Int Inmunol 5: 1461 etseq., 1993) en ratones SCID.

Claims (53)

1. Un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos que expresan NKG2D para uso en el tratamiento o prevención de un síndrome asociado a la activación mediada por NKG2D en un sujeto humano, en donde el síndrome se selecciona entre el grupo constituido por una enfermedad autoinmune inflamatoria y rechazo de transplante, y en donde el agente reduce la cantidad de NKG2D sobre la superficie de los leucocitos y en donde el agente comprende un anticuerpo que se une a NKG2D, un fragmento de unión de NKG2D del mismo, o un ARNi codificado por una secuencia de ADN que comprende las SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11 o SEC ID Nº: 12.
2. El agente de la reivindicación 1, en donde la reducción de la activación de NKG2D inducida por ligando comprende poner en contacto leucocitos que expresan NKG2D con el agente.
3. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicho agente reduce al menos el 30% de la activación de NKG2D inducida por ligando.
4. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho agente reduce la interacción de NKG2D con DAP10.
5. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho agente incrementa la velocidad a la que NKG2D de superficie celular se internaliza.
6. El agente de la reivindicación 1, en donde dicha reducción en la cantidad de NKG2D de la superficie celular se produce en condiciones en las que uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 o ULBP4 no pueden disminuir la cantidad de NKG2D de la superficie celular.
7. El agente de la reivindicación 5, en donde dicho incremento en la velocidad de la internalización de NKG2D se produce en condiciones en las que uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 o ULBP4 no pueden incrementar la velocidad de la internalización de NKG2D.
8. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho contacto reduce la señalización a través del complejo NKG2D-ligando de NKG2D.
9. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los leucocitos se seleccionan entre el grupo constituido por células T NKG2D+ CD8+, células T NKG2D+ CD4+, células T NKG2D+ gamma-delta, células NK NKG2D+, y macrófagos.
10. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho agente reduce menos de aproximadamente el 10% del número de leucocitos que expresan NKG2D con relación a un control.
11. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho agente comprende un anticuerpo que se une a NKG2D o un fragmento de unión a NKG2D del mismo.
12. El agente de la reivindicación 11, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
13. El agente de la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico.
14. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho agente comprende un ácido nucleico que reduce la transcripción o traducción de ácidos nucleicos que codifican NKG2D.
15. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la expresión del ligando de NKG2D se eleva en células de un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
16. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho agente reduce los linfocitos que infiltran un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
17. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicho agente reduce los niveles de interferón-gamma en un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
18. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho agente reduce la proliferación de dichos leucocitos.
19. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde al sujeto humano se le ha diagnosticado el síndrome.
20. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es artritis reumatoide.
21. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es diabetes mellitus de tipo I.
22. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es esclerosis múltiple.
23. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es enfermedad celíaca.
24. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del intestino.
25. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es lupus eritematoso sistémico.
26. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el rechazo de transplante es rechazo de transplante de médula ósea.
27. El agente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria se selecciona entre el grupo constituido por tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Sjogren, enfermedad de Behcet, granulomatosis de Wegener, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, polimiositis, y dermatomiositis.
28. El uso de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de leucocitos que expresan NKG2D para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un síndrome asociado a la activación mediada por NKG2D en un sujeto humano, en donde el síndrome se selecciona entre el grupo constituido por una enfermedad autoinmune inflamatoria y rechazo de transplante, y en donde el agente reduce la cantidad de NKG2D en la superficie de los leucocitos, y en donde el agente comprende un anticuerpo que se une a NKG2D o un fragmento de unión a NKG2D del mismo.
29. El uso de la reivindicación 28, en donde la reducción de la activación de NKG2D inducida por ligando comprende poner en contacto leucocitos que expresan NKG2D con el agente.
30. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, en donde dicho agente reduce al menos el 30% de la activación de NKG2D inducida por ligando.
31. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde dicho agente reduce la interacción de NKG2D con DAP10.
32. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde dicho agente incrementa la velocidad a la que NKG2D de superficie celular se internaliza.
33. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha reducción en la cantidad de NKG2D de superficie celular se produce en condiciones en las que uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 o ULBP4 no pueden disminuir la cantidad de NKG2D de superficie celular.
34. El uso de la reivindicación 32, en donde dicho incremento en la velocidad de la internalización de NKG2D se produce en condiciones en las que uno o más de MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 o ULBP4 no pueden incrementar la velocidad de internalización de NKG2D.
35. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en donde dicho contacto reduce la señalización a través del complejo NKG2D-ligando de NKG2D.
36. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, en donde los leucocitos se seleccionan entre el grupo constituido por células T NKG2D+ CD8+, células T NKG2D+ CD4+, células T NKG2D+ gamma-delta, células NK NKG2D+ y macrófagos.
37. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, en donde dicho agente reduce menos de aproximadamente el 10% en la cantidad de leucocitos que expresan NKG2D con relación a un control.
38. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37, en donde dicho agente comprende un anticuerpo que se une a NKG2D o un fragmento de unión a NKG2D del mismo.
39. El uso de la reivindicación 38, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
40. El uso de la reivindicación 39, en donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico.
\newpage
41. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 40, en donde la expresión del ligando de NKG2D se eleva en las células de un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
42. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 41, en donde dicho agente reduce los linfocitos que infiltran un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
43. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42, en donde dicho agente reduce los niveles de interferón-gamma en un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.
44. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 43, en donde dicho agente reduce la proliferación de dichos leucocitos.
45. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 44, en donde al sujeto humano se le ha diagnosticado el síndrome.
46. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es artritis reumatoide.
47. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es diabetes mellitus de tipo I.
48. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es esclerosis múltiple.
49. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es enfermedad celíaca.
50. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del intestino.
51. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria es lupus eritematoso sistémico.
52. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde el rechazo de transplante es rechazo de transplante de médula ósea.
53. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en donde la enfermedad autoinmune inflamatoria se selecciona entre el grupo constituido por tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Sjogren, enfermedad de Behcet, granulomatosis de Wegener, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, polimiositis, y dermatomiositis.
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