MXPA06011553A

MXPA06011553A - Modulacion de nkg2d.

Info

Publication number: MXPA06011553A
Application number: MXPA06011553A
Authority: MX
Inventors: Lewis L Lanier; Koetsu Ogasawara; Jeffrey A Bluestone
Original assignee: Univ California
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2007-01-26
Also published as: KR20070011441A; EP2248529A1; CA2563313A1; JP4667451B2; CA2563313C; KR100919915B1; DK1732588T3; EP2248529B1; JP5693127B2; US20080260727A1; WO2005097160A2; JP2007532549A; ES2328597T3; CN1984672A; CN102988959B; EP2289534B1; AU2005231478C1; ES2645026T3; KR100895749B1; EP1732588B1

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones para tratar y/o prevenir enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias. En particular, la presente invencion proporciona terapeuticos para descomponer la expansion y funcion de celulas T auto-reactivas y/o celulas NK, modulando NKG2D.

Description

MODULACIÓN DE NKG2D Esta solicitud reclama el beneficio de las solicitudes provisionales estadounidenses 60/659,678, presentada el 7 de marzo de 2005, 60/576,242, presentada el 1 de junio de 2004, y 60/559,919, presentada el 5 de abril de 2004. Esta invención fue realizada en parte con apoyo gubernamental bajo las subvenciones CA89189, CA95137, P30 DK26743 y P60 DK63720, del National Institutes Health. Como tal , el gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención. Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para tratar y/o prevenir síndromes inflamatorios, en particular entorpeciendo la expansión y la función de las células T auto reactivas, y cualesquiera características inventivas relacionadas con ellas. Además, la presente invención proporciona métodos y composiciones para prevenir el rechazo de injertos mediado por células NK. Antecedentes de la invención El NKG2D es un receptor activador que se expresa en seres humanos y en ratones en las células NK y en ciertos tipos de células T. El NKG2D reconoce la proteína enlazante UL16 (ULBP1 ), ULBP2, ULBP3, ULBP4, y las moléculas relacionadas con la cadena I de MHC de clase I (M ICA y MICB) en los seres humanos, y el antígeno 60 de histocompatiblídad menor (H60), transcripto inducible tempranamente por ácido retinoico (RAE- 1 ), y transcripto 1 similar a ULBP murino (MULT-1 ) en ratones. Los homo dímeros de NKG2D se asocian con la molécula adaptadora DAP10, la cual contiene el consenso p85 fosfatidil inositol-3-quinasa (PI3-K) que fija el motivo Tyr-lle-Asn-Met (YINM , que se expone como SEQ I D NO: 9). El N KG2D y la DAP 10 interactúan de manera temprana en su ruta biosintética y esta interacción se requiere para transportar el NKG2D a la superficie de la célula. Breve descripción de la invención La presente invención proporciona métodos y composiciones para tratar o prevenir un síndrome asociado con la activación mediada por NKG2D. En un aspecto, los métodos se llevan a cabo poniendo en contacto leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de las células bajo condiciones apropiadas para tratar o prevenir el síndrome. En algunas modalidades, el contacto da como resultado una reducción de al menos aproximadamente 30% en la activación de NKG2D inducida por ligando; en otras modalidades, la reducción es de al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% con relación a un control. El agente puede, sin limitación, reducir la interacción de NKG2D con DAP10; reducir la cantidad de NKG2D en la superficie de las células; aumentar la tasa en la cual se internaliza el NKG2D en la superficie; reducir la señalización a través del complejo ligando NKG2D-NKG2D y/o reducir la transcripción o traducción de ácidos nucleicos que codifican NKG2D. En algunas modalidades, el agente mejora la internalización de poüpéptidos NKG2D en la superficie, bajo condiciones (tales como, por ejemplo, las que están presentes en síndromes inflamatorios crónicos) en las cuales uno o más de M ICA, M ICB, ULBP1 , ULBP2, ULBP3, o ULBP4 no pueden disminuir la cantidad de NKG2D en la superficie celular en la extensión en que sería necesario (en el caso de un agente terapéutico), para proporcionar un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, el agente usado en las composiciones y métodos proporcionados por la invención, contiene un anticuerpo que se une a NKG2D o un fragmento de él que se une a NKG2D. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico. En la práctica de la invención, los leucocitos pueden ser uno o más de de una célula T CD8+ NKG2D + , una célula T CD4+ NKG2D + , una célula NKG2D+?d; y una célula NKG2D+ NK; o las células T objetivo pueden comprender células macrófagas. En un aspecto, los métodos de la invención se pueden usar para tratar y/o prevenir un síndrome inflamatorio asociado con la activación mediada por NKG2D en un mamífero, tal como un paciente humano. El paciente humano puede ser diagnosticado como que tiene o como que está en riesgo sustancial de desarrollar un síndrome inflamatorio de este tipo. En un aspecto particular, el método de la invención está dirigido al tratamiento de una condición diagnosticada en un paciente humano. En aspectos separados, la invención también proporciona métodos para tratar o prevenir artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad celiaca, enfermedades inflamatorias intestinales tales como tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, psoriasis, o rechazo de trasplante. Los síndromes a los cuales también se puede aplicar la presente invención incluye, sin limitación a ellos, diabetes mellitus tipo I , lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barre, uveitis inmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Grave, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, ateritis temporal, síndrome anti-fosfolípido, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, dermatitis herpetiformis, pemphigus vulgaris, vitíligo, artritis psoriásica, osteoartritis, asma resistente a esteroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y ateroesclerosis. En un aspecto particular, el síndrome no es diabetes mellitus tipo I . En otro aspecto, la presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas y estuches que contienen un modulador de NKG2D tal como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-NKG2D. En una serie de modalidades, los estuches contienen un modulador de NKG2D e instrucciones para poner en contacto un leucocito con un modulador de NKG2D bajo condiciones apropiadas para tratar o prevenir un síndrome asociado con la activación mediada por NKG2D de leucocitos. La presente invención también proporciona métodos para identificar un agente modulador de NKG2D, que comprende: poner en contacto un leucocito NKG2D+ con un agente de prueba; y medir la expresión de NKG2D por el leucocito. En algunas modalidades preferidas, medir la expresión de NKG2D incluye uno o más de medir la transcripción, traducción, e internalización de NKG2D. Un subconjunto de estas modalidades, comprende además realizar pruebas clínicas al agente de prueba de acuerdo con los lineamientos de la FDA. Más aún, la presente invención proporciona métodos para identificar un agente modulador de NKG2D, que comprenden: poner en contacto un leucocito NKG2D+ con un agente de prueba, y medir la expresión de NKG2D por el leucocito. En algunas modalidades preferidas, medir la activación de NKG2D inducida por ligando comprende uno o más de medir la fosforilación de DAP10, la actividad de quinasa p85 PI3, la actividad de quinasa Akt, la producción de IFN-y, y la citólisis de una célula objetivo NKG2D + . Un subconjunto de estas modalidades comprende además realizar pruebas clínicas al agente de prueba de acuerdo con los lineamientos de la FDA. En un aspecto adicional , la invención proporciona un método para identificar un agente terapéutico o profiláctico para ei tratamiento o prevención de condiciones inflamatorias y/o enfermedades auto inmunitarias asociadas con la activación de NKG2D. El método comprende detectar agentes potenciales (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo) por la capacidad para unirse específicamente a NKG2D y entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar significativamente estas células en una población de células, modelo apropiado, anfitrión o paciente (por ejemplo, analizando estos anticuerpos usando estrategias experimentales descritas aquí). La detección también, o de manera alternativa, puede comprender detectar la capacidad para inducir internalización de NKG2D en la superficie de células T NKG2D+ o células NK. En otro aspecto en particular, la invención se refiere ai uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide. En todavía otro aspecto en particular, la invención se refiere a el uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple. En todavía otro aspecto de ejemplo, la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal. Un ejemplo adicional de un aspecto de la invención se refiere al uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de psoriasis. Un aspecto adicional de la invención está incorporado en el uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que es específico para NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células para la preparación de un medicamento para el tratamiento de rechazo de trasplante. Breve descripción de los dibujos La figura 1 es una ilustración gráfica de la expresión de RAE-1 en células pancreáticas en ratones NOD pre-diabéticos. La figura 1 (a) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante RT-PCR cuantitativa en el tejido pancreático de ratones NOD y BALB/c ratones de 12 a 16 semanas de edad. La figura 1 (b) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante RT-PCR cuantitativa en el tejido pancreático de ratones NOD y NOD.scid de 4-6 semanas y 12-16 semanas de edad. La figura 1 (°C) muestra ARNm de RAE-1 medido mediante RT-PCR cuantitativa en diferentes tejidos de NOD pre-diabéticos. Los datos representativos se muestran y se expresan como inducción de la transcripción de RAE-1 en veces. Las veces de inducción se calcularon de acuerdo con la fórmula: Veces de inducción = cantidad de transcripto RAE-1 en el órgano de NOD pre-diabético normalizado para HPRT dividido por la cantidad de transcripto RAE-1 en el órgano de NOD joven normalizado para HPRT. La figura 1 (d) muestra la expresión de RAE-1 en células pancreáticas CD45 de NOD analizadas por citometría de flujo usando mAb anti-CD45 y anti-RAE-1 . La figura 1 (e) muestra la expresión de RAE-1 en células CD45- de islote aisladas de páncreas (panel superior) y obtenidas de los nodos linfáticos pancreáticos (PLN) (panel inferior) en ratones NOD teñidos con mAb anti-CD45 y anti-RAE-1 . La figura 2(a) es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D en células T CD8+. Se aislaron leucocitos de bazo, hígado, nodos linfáticos pancreáticos (PLN) y páncreas de ratones NOD de 10 semanas y 25 semanas de edad, y se tiñeron mediante métodos estándar usando anticuerpos monoclonales contra CD8 y NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de células T CD8+ NKG2D+ (expresados como el porcentaje de las células T CD8+ totales). La figura 2 (b) es una ilustración gráfica de la expresión de CD44 y Ly-6C en células T CD8+ NKG2D+ pancreáticas y PLN . Se tiñeron las células con anticuerpos monoclonales contra CD8, NKG2D, y CD44 o Ly6C y los resultados se muestran para las células T CD8+ controladas. La figura 2(°C) es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D y CD44 en células T CD8 + pancreáticas y PLN positivas a tetrámero NRP-V7/H-2Kd . Se tiñeron las células con tetrámero NRP-V7/H-2Kd y con anticuerpos monoclonales contra CD8 y CD44 o NKG2D. Se muestran los porcentajes indicados de células T CD8+ positivas a tetrámero NRP-V7/H-2Kd (reguladas en T CD8+). La figura 2(d) muestra microfotografías de células T CD8+ NKG2D+ acumuladas cerca de los islotes. Se tiñeron secciones congeladas secuenciales de páncreas, aislados de ratones NOD pre-diabéticos de 16 semanas de edad, con anticuerpos anti-CDB, anti-CD68 (marcador macrófago, anti-NKG2D y anti-insulina. Izquierda: imagen diferencial con contraste de fase, Centro: CD8 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul); Derecha: CD68 (rojo), NKG2D (verde), e insulina (azul). Las células T CD8+ NKG2D+ y los macrófagos CD68+ NKG2D+ son amarillos. La figura 3(a) es una ilustración gráfica del efecto del tratamiento con mAb anti-NKG2D a partir de 7-25 semanas de edad sobre la proporción de ratones NOD que desarrollaron diabetes. Círculos oscuros: Ratones NOD tratados con mAb anti-NKG2D (n=7) (bi-semanal con 200 µg/ratón IP); círculos claros: Ratones NOD tratados con PBS estéril no pirógeno (n=7). Se diagnosticó diabetes cuando el nivel de glucosa en la sangre fue mayor de 300 mg/dL en dos mediciones consecutivas. La figura 3(b) es una ilustración gráfica de los niveles de glucosa en la sangre medidos semanalmente desde 6 semanas hasta 40 semanas de edad en los animales representados en la figura 3(a). La figura 3(°C) es una ilustración gráfica de la proporción de ratones NOD que desarrollaron diabetes después del tratamiento con mAb anti-NKG2D en una etapa pre-diabética tardía. Los ratones NOD se trataron con mAb anti-NKG2D (bi-semanalmente con 200 µg/ratón IP, círculos oscuros; n = 14) o con Ig de control (círculos claros; n=14) desde 13 semanas hasta 25 semanas de edad . A las 25 semanas de edad, siete ratones tratados con mAb anti-NKG2D continuaron recibiendo tratamiento hasta las 30 semanas de edad (triángulos oscuros). La figura 3(d) es una ilustración gráfica de los niveles de glucosa en la sangre medidos semanalmente desde 12 semanas hasta 36 semanas de edad en los animales representados en la figura 3c. La figura 4(a) es una ilustración gráfica del análisis de leucocitos infiltrando el páncreas y los nodos linfáticos pancreáticos de ratones NOD de 11 semanas de edad tratados con Ig de control (clg) o con mAb anti-NKG2D (200 µg/ratón IP bi-semanai, comenzando a las 7 semanas de edad) que habían sido teñidos con anti-CDB , anti-NKG2D, y anti-CD44 y sometidos a citometría de flujo. Los resultados mostrados están controlados en las células T CD8+. La figura 4(b) representa microfotografías de islotes pancreáticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig de control desde las 7 semanas de edad. Se prepararon secciones de páncreas congeladas de ratones NOD de 16 semanas de edad y se tiñeron con Ig de control. Izquierda: tinción con DAPI (núcleos); Derecha: CD8 (rojo), NKG2D (verde) e insulina (azul). La figura 4 (°C) muestra microfotografías de islotes pancreáticos de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con mAb anti-NKG2D (200 µg/ratón IP bi-semanal) desde las 7 semanas de edad, que fueron preparados y teñidos como en el panel (b). La figura 4 (d) es una ilustración gráfica del efecto del tratamiento con anticuerpo anti-NKG2D en la acumulación de células T CD8+ auto reactivas, positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en el páncreas. Los leucocitos fueron aislados de páncreas y PLN de ratones NOD de 18 semanas de edad tratados con mAb anti-N KG2D (200 µg/ratón IP bi-semanal) o con Ig de control desde las 13 semanas de edad. Se muestran los porcentajes indicados de células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd (controlados en Células T CD8 + ). La figura 4(e) es una ilustración gráfica de linfocitos de bazo y sangre periférica en ratones tratados con Ig de control o con anti-NKG2D (200 µg/ratón IP bi-semanal teñido con tetrámero NRP-V7/H-2Kd y mAb anti-CD8. Los porcentajes indicados fueron de células positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd (controladas en la población de células T CD8+). La figura 4 (f) es una ilustración gráfica de células de nodo linfático pancreático aisladas de ratones NOD de 25 semanas de edad tratados con Ig de control (clg) o anti-NKG2D (200 µg/ratón IP bi-semanal) comenzando a las 13 semanas de edad, como se indicó, y cultivadas con PMA (20 ng/ml) y ionomicina (500 ng/ml) y brefeldina A (5 µg/ml) durante 6 h. Se detectó I FN-? en las células T CD8+ mediante tinción inmunofluorescente y citometría de flujo. La figura 5 es una ilustración gráfica de mediciones de citometría de flujo de un experimento de transferencia adoptiva de de células T NOD Células T en receptores NOD.scid. La figura 5 (a) muestra células T NKG2D+ CD8+ en el páncreas, PLN y bazo de ratones NOD.scid transplantados con células T NOD. Antes de la transferencia adoptiva, se tiñeron células T purificadas de un donante NOD diabético con anti-CD8 y anti-NKG2D (a, panel superior izquierdo). Cinco semanas después de la transferencia, las células recolectadas del páncreas, PLN y bazo, se tiñeron con anti-CD8 y anti-NKG2D (a, paneles superiores) o anti-NKG2D y anti-CD44 (a, paneles inferiores). Se muestran los porcentajes de células T NKG2D+ CD8+ (controlados en células T CD8+). La figura 5(b) muestra la acumulación de células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en NOD. Los ratones scid que recibieron células T transferidas adoptivamente de ratones diabéticos NOD tratados con mAb anti-NKG2D (200 µg/ratón IP bi-semanal) o Ig de control, comenzaron al momento de la transferencia y se analizaron 10 semanas después de la transferencia. Los porcentajes indicados de células T CD8+ positivas al tetrámero fueron detectadas controlados en células vivas. La figura 5(°C) muestra la detección de células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd de estos mismos ratones tratados, controlada en células T CD8+ . La figura 5 (d) es una ilustración gráfica de la proporción de ratones NOD.scid transplantados con células T de ratones NOD diabéticos que desarrollaron diabetes. Los ratones NOD.scid de cinco semanas de edad que recibieron células T transferidas adoptivamente de ratones NOD diabéticos, se trataron con mAb anti-NKG2D (círculos oscuros; n=6) o Ig de control (círculos claros; n=7) desde 5 semanas hasta 14 semanas de edad. Los ratones fueron inyectados por vía interaperitoneal con 200 µg de mAb anti-NKG2D CX5, dos veces por semana. Se diagnosticó diabetes cuando el nivel de glucosa en la sangre fue mayor que 300 mg/dL en dos mediciones consecutivas. La figura 5(e) es una ilustración gráfica de la expansión de células T CD8+ auto reactivas, positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd después de detener el tratamiento con mAb anti-NKG2D. Cuatro semanas después, se detuvo el tratamiento con mAb anti-NKG2D en los ratones scid.NOD transplantados con células T de ratones diabéticos NOD , se sacrificaron los animales, y se analizaron los páncreas para determinar la infiltración de células T CD8+ NKG2D+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd. También se analizaron los ratones tratados con Ig de control que desarrollaron diabetes, para efectos de comparación . La figura 6 (a) es una ilustración gráfica de la ausencia de expresión de NKG2D en células T NOD transgénicas 8.3 TcR antes de la transferencia adoptiva. Se aislaron linfocitos de los nodos linfáticos y del bazo de ratones N OD transgénicos 8.3 TcR jóvenes. Las célu las T N OD transgénicas 8.3 TcR se purificaron luego , mediante ordenamiento magnético. Antes de la transferencia de células T, se tiñeron células T N OD transgénicas 8.3 TcR con anti-CD8 y tetrámeros NRP-V7/H-2Kd o anti-NKG2D y se analizaron mediante citometría de flujo, como se muestra. La figura 6(b) es una ilustración gráfica de la expresión de NKG2D en células T NOD transgénicas células T NOD transgénicas 8.3 TcR en el páncreas dos d ías después de la transferencia adoptiva de células T NOD transgénicas 8.3 TcR. Dos días después de la transferencia adoptiva de células T NOD transgénicas 8.3 TcR, se aislaron los leucocitos del páncreas de ratones que se trataron con Ig de control o con mAb anti-NKG2D CX5 al momento de la transferencia celular. Se tiñeron las células con tetrámeros N RP-V7/H-2Kd y anti-NKG2D y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestra la expresión de NKG2D en las células T transferidas adoptivamente (identificada mediante control sobre células positivas al tetrámero N RP-V7/H-2Kd). La figura 6(°C) es una ilustración gráfica del efecto de mAb anti-NKG2D CX5 sobre la proliferación de células T NOD CD8+ transgénicas 8.3 TcR en el páncreas. Se transfirieron células T NOD transgénicas 8.3 TcR marcadas con CFSE (1 x107) en ratones NOD de tipo natural (día 0). Los ratones NOD receptores se trataron con clg o con mAb anti-NKG2D CX5 (200 g) el día -1 , el día 1 , y el día 5. Después de la transferencia, se sacrificaron los ratones NOD receptores y se aislaron y analizaron leucocitos del páncreas, nodo linfático pancreático (PLN), y nodo linfático mesentérico (MLN). Las células que se muestran en (°C) fueron controladas en linfocitos positivos a CD8. La figura 6 (d) es una ilustración gráfica de los porcentajes de células marcadas con CSFS- en los ratones tratados con Ig de control (barras sin relleno) y con mAb anti-NKG2D (barras con relleno) que sufrieron una o más divisiones (es decir, células proliferantes) los días 2, 3 y 4 después de la transferencia, calculados mediante la siguiente fórmula: % células proliferantes = total de células CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd menos células CD8+ CFSE+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd) x 100/ Total células CD8+ CFSE+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd. La figura 7 representa microfotografías de linfocitos de NOD transgénicos 8.3 TcR cultivados con 100 nM de péptido IGRP (proteína relacionada con la sub unidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa) durante 3 días y luego cultivados en la presencia de 200 U/mL de IL-2 recombinante humana y 4 ng/ml de IL-7 durante 5 días adicionales. Las células T CD8+ transgénicas 8.3 TcR se tiñeron en hielo con mAb anti-NKG2D CX5 y se contratiñeron con toxina B de cólera para marcar la membrana de la superficie celular. Se incubó una alícuota de estas células teñidas durante 30 minutos a 37 °C y se mantuvo otra alícuota en hielo. Se analizaron las células usando un microscopio fluorescente. En la microfotografía, la expresión de NKG2D se muestra como fluorescencia verde, y la fluorescencia roja indica tinción con toxina B de cólera (membrana). Nótese que N KG2D estaba presente en la superficie celular de las células incubadas en hielo, pero fue modulada e internalizada en las células cultivadas a 37 °C. La figura 8 es una ilustración gráfica del efecto de mAb anti-NKG2D en células T CD8+ portadoras de NKG2D in vivo. Las células T CD8+ transgénicas TcR específicas para ovalbúmina OT-1 (OVA) fueron activadas con 100 nM de péptido OVA durante 3 días y luego cultivadas con 200 U/ml de IL-2 recombinante humana y 4 ng/ml de IL-7 durante 5 días adicionales. Se expresó NKG2D en las células T activadas para OT-1 (>95%), las cuales fueron marcadas con CFSE y transferidas adoptivamente (2x107 células) en ratones C57BL/6. Los ratones que recibieron células T transgénicas CD8+ NKG2D+ OT-1 TcR se trataron con mAb anti-NKG2D o con Ig de rata en los días -2, 0, y +2 (200 g por inyección intraperitoneal). Figura 8(a): Cuatro días después de la transferencia, se recolectaron muestras de sangre, se tiñeron con mAb contra CD8 y NKG2D de ratón y se analizaron mediante citometría de flujo. Se indican los porcentajes de células T CD8+ marcadas con CSFE. Figura 8(b): El día 21 después de la transferencia adoptiva de células T transgénicas OT-1 TcR marcadas con CFSE y tratamiento con Ig de control o mAb anti-NKG2D CX5 como se indicó en (a), se sacrificaron los ratones y se aislaron los esplenocitos y se analizaron mediante citometría de flujo. Figura 8 (°C): El día 7 después de la transferencia adoptiva de las células T transgénicas CD8+ NKG2D+ OT-1 TcR marcadas con CFSE, se inyectó a los ratones con un mAb CD8 anti-ratón de rata atenuado (hibridoma 2.43, isotipo lgG2b de rata). Tres días más tarde, se tiñeron las células de sangre periférica con Ig de control, anti-CD8 o mAb anti-NKG2D y se analizaron mediante citometría de flujo. El propósito de este experimento fue demostrar que el anticuerpo monoclonal CX5 anti-NKG2D no agota las células T CD8+ NKG2D+ cuando el anticuerpo se administra in vivo. La figura 9 es una ilustración gráfica del efecto del mAb anti-NKG2D en la proliferación de células T CD8+ T auto reactivas. Se marcaron células T NOD transgénicas 8.3 TcR con CSFE y se transfirieron a ratones NOD de tipo natural, los cuales se trataron con Ig de control o con mAb CX5 anti-NKG2D tal como se describe en la Fig. 6. Se tiñeron las células recolectadas del páncreas, nodos linfáticos pancreáticos, nodos linfáticos mesentéricos y bazo con tetrámero NRP-V7/H-2Kd y mAb anti-CD8 y se analizaron mediante citometría de flujo. Se muestran ios histogramas de linfocitos controlados en células CD8 positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd . En cada histograma se indican los porcentajes de células proliferantes (más de una división) y no proliferantes (controladas en células T CD8+ CFSE+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd) Las células teñidas con Ig de control coincidentes con el isotipo o controles o controles para tinción del tetrámero demostraron la especificidad de fijación de los reactivos. La figura 10 ilustra la especificidad de la tinción para los ligandos NKG2D en células pancreáticas NOD. Figura 10(a): se aislaron las células pancreáticas y se tiñeron con anti-CD45 mAb y con Ig de control, un mAb anti-panRAE-1 (clon 186107), mAb anti-RAE-1 ? (clon CX1 ) o proteína de fusión NKG2D-lg de ratón (dominio extracelular NKG2D de ratón fusionado a Fe de lgG1 humana), seguida por reactivos apropiados para visualización en el segundo paso. Se analizaron las células mediante citometría de flujo y se evaluaron las células viables negativas a CD45 y negativas a yoduro de propidio. Las células teñidas con Ig de control (clg) coincidentes con el isotipo, demostraron la especificidad de la unión al mAb (línea delgada). Figura 10 (b): mAb anti-RAE-1 puros bloquearon la tinción de mAb anti-RAE-1 marcados con biotina, demostrando la especificidad de unión. Se pre-incubaron células pancreáticas con 0.25 g de clg purificada, clon 186107 de mAb anti-pan RAE-1 o clon CXI de mAb anti-RAE-1 ? (el cual también presenta reacción cruzada con RAE-1 a y RAE-1 ß). Después de 20 min de incubación en hielo, estas células se tiñeron durante 20 min adicionales con 0.25 g de Ig de control biotinilada, clon 186107 de mAb anti-RAE-1 biotinilado, clon CX1 de mAb anti-RAE-1 ? biotinilado y mAb anti-CD45 conjugado con FITC. para detectar los mAb biotinilados, se lavaron las células y se incubaron con estreptavidina conjugada con PE. Se analizaron las células mediante citometría de flujo y los datos mostrados fueron controlados en células viables negativas a CD45, negativas a yoduro de propídio. Así, los ligandos NKG2D se detectan en las células NOD del páncreas usando tres reactivos independientes: clon 186107 de mAb anti-RAE-1 , clon CX1 de mAb anti-RAE-1 , y una proteína de fusión NKG2D-lg de ratón. La tinción de mAb anti-RAE-1 es específica porque la tinción de mAb anti-RAE-1 es bloqueada completamente por el mAb anti-RAE-1 , pero no en una IgG de control de rata. La figura 1 1 (a) muestra la secuencia de ADNc la secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 1 ) de NKG2D murina. La figura 1 1 (b) muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de NKG2D murina. La figura 1 1 (°C) muestra la secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 3) de NKG2D humana . La figura 1 1 (d) muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de NKG2D humana. La figura 12 es una representación gráfica de un análisis de citometría de flujo de células NKL (una línea de células NK de leucemia humana) que habían sido incubadas con un anticuerpo anti-NKG2D humana de ratón (clon 149810) durante 16 h para estimular la internalización de internalización de NKG2D (panel derecho). El panel izquierdo muestra células que han sido incubadas con un anticuerpo de control durante 16 h. En cada caso, las células en resumen fueron lavadas en un regulador de pH ácido (pH 3.5) para eliminar cualquier anticuerpo residual unido, y luego se tiñeron con Ig de control o con mAb anti-NKG2D, seguido por anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina. El experimento muestra que el anticuerpo monoclonal anti-NKG2D humana indujo la internalización (modulación) de NKG2D, mientras que la incubación con la Ig de control no produjo internalización de NKG2D. La figura 13 muestra que RAE-1 se expresa en células B/c BM , pero no en células B6 células BM . Figura 13(a): Se tiñeron células BM recién aisladas con a proteína de fusión Fe de Ig humana - NKG2D de ratón (NKG2D Ig) o Ig humana de control (clg). Para detectar la unión de NKG2D-lg, se usó un anticuerpo anti-lgG humana conjugado con PE (anti-lg humana PE) como anticuerpo de segundo paso. La línea punteada representa la tinción con clg en células BM. La línea gruesa muestra la expresión del ligando NKG2D en células BM. Figura 13(b): se tiñeron las células con mAb anti-panRAE-1 biotinilado, mAb anti-H60 biotinilado, mAb anti-MULT1 biotinilado, o una clg coincidente con el isotipo biotinilada, y luego se tiñeron con estreptavidina conjugada con PE. La línea punteada muestra la tinción con Clg, y la línea gruesa muestra la expresión de RAE-1 , H60 y MULT1 en las células BM. Figura 13 (°C y d): Se trató a receptores CB6F1 con mAb anti-NK1 .1 el día 2. El día 0, se irradiaron los receptores (11 Gy) y luego se reconstituyeron con células BM B/c o CB6F1 (4x106). El día 7, se aislaron células de los bazos del receptor y se analizaron como se describió para los paneles a y b. La línea punteada representa la tinción con clg en las células BM.

La línea gruesa muestra la expresión de ligando NKG2D, RAE-1 , H60 y M ULT1 en células BM . Los números representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. Figura 13 (e y f): ilustra gráficamente el fenotipo de las células que expresan RAE-1. Se transfirieron células BM en receptores irradiados tratados previamente con mAb anti-NK1 .1 . Se aislaron las células y se tiñeron tal como se describió para el panel °C. Figura 13 (g): ilustra las células proliferantes que expresan RAE-1 . Se transfirieron células BM B/c en ratones CB6F1 irradiados que fueron tratados previamente con mAb anti-NK1 .1 . Seis días después de la transferencia, se le inyectó a los ratones BrdU (0.8 g/ ratón). Dos h o 12 h después, se recolectaron células de bazo de los receptores y se tiñeron con MaB anti-pan-RAE-1 y anti-BrdU. Figura 13 (h e i): ilustra que RAE-1 se expresa en la progenie de células BM tratadas con 5-FU. Se transfirieron células BM de ratones B/c tratados con 5-fluorouracilo en ratones CB6F1 que fueron tratados previamente con mAb anti-NK1 .1 . Ocho días después de la transferencia, se aislaron las células y se analizaron como se describe para los paneles c y e. Figura 13(¡): muestra tinción de células controladas positivas a RAE-1 con C-kit Sca-1. En los paneles e-i, >98% de células teñidas con clg estuvieron en el cuadrante izquierdo inferior (no se muestra). Se muestra el porcentaje de células en cada uno de los dos cuadrantes superiores. Estos resultados fueron reproducibles en al menos dos experimentos independientes (se muestran los datos representativos). Figura 14(a): ilustra el rechazo de bloques de MAb anti-NKG2D de B/c BM en ratones híbridos CB6F1 . Aproximadamente 4x106 células BM se transfirieron en receptores CB6F1 irradiados. Se inyectó a los ratones receptores con 125l UdR el día 5, y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. las barras negras muestran la absorción de 125I UdR de los bazos en B/c BM-> ratones CB6F1 y las barras blancas muestran la absorción de la etiqueta radiactiva en CB6F1 BM->receptores CB6F1 . Los ratones se trataron con mAb anti-NKG2D no agotadora, neutralizante, o con el mAb anti-NK1 .1 debilitador de células NK (200 µg/ratón el día-2), tal como se indicó. Los resultados se muestran como la media + DS de cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizó dos veces con resultados comparables. Figura 14(b): ilustra el fenotipo de células donantes B/c que repoblaron receptores de receptores CB6F1 tratados con mAb anti-NKG2D o con Ig de control. Los ratones fueron tratados como se describe en el panel a, con esplenocitos recolectados el día 8 después del transplante, se tiñeron las células blancas y los datos se presentan como se describe para la figura 13. La figura 15 ilustra el rechazo de células singénicas BM que expresan RAE-1 . La figura 15 (a) muestra la expresión de RAE-1 e en células de médula ósea en ratones B6 transgénicos RAE-1 e. Se tiñó médula ósea recién aislada de ratones B6 de tipo natural y de ratones B6 transgénicos RAE-1 e, con clg o con mAb anti-pan- RAE-1 . La figura 15 (b) ilustra que las células B6 NK matan las células BM transgénicas con RAE-1 e singénico in vitro. Se usó BM recién aislada de de ratones B6 de tipo natural y de ratones B6 transgénicos RAE-1 e, como objetivos en un análisis de citotoxicidad in vitro estándar usando células NK de tipo natural activadas con IL-2 (las células B6 NK se cultivaron durante 7 días en 2000 U/mL de IL-2 recombinante humana del National Cáncer Institute Biological Resources Branch Pre-clinical Repository) como efectoras, en la presencia de clg o de mAb anti-NKG2D (clon 191004) usado en cantidad de 10 g/mL. La figura 15(°C) ilustra que los ratones B6 rechazan la médula ósea singénica que expresa RAE-1 e. Aproximadamente 4x106 células B6 transgénicas con RAE-1 e se transfirieron en receptores B6 irradiados. Se inyectó a los ratones receptores con 125IUdR el d ía 5, y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la absorción de 125I UdR de bazos en BM transgénica RAE-1 e -> ratones B6 y las barras blancas muestran la absorción de marcador radiactivo en B6 BM de tipo natural-> receptores B6. Los ratones se trataron con el mAb anti-NKG2D no debilitador, neutralizante o con el mAb anti-NK1 .1 debilitador de células NK (200 µg/ratón el día 2), como se indica. Los resultados se muestran como la media + DS de cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizó dos veces con resultados comparables. La figura 1 5 (d) ilustra que los ratones CB6F1 rechazan la médula ósea singénica que expresa RAE-1 e. Aproximadamente 4 x 106 células BM de CB6F1 transgénicas con RAE-1 e fueron transferidas a receptores CB6F1 irradiados. Los ratones se inyectaron con 125IUdR el día 5, y se recolectaron los bazos y se contaron el día 5. Las barras negras muestran la absorción de 125I Ud R de bazos en B M de CB6F1 transgénicos con RAE-1 e-> ratones CB6F1 , y las barras blancas muestran la absorción de marcador radiactivo en BM de CB6F1 -> receptores CB6F1 . Los ratones se trataron y los datos se muestran como se describe en el panel C. La figura 16(a) ilustra que los ratones DAP10-/- ratones rechazan de manera ineficiente la médula ósea singénica que expresa RAE-1 e. Aproximadamente 4x106 células de BM de B6 transgénicos con RAEl e se transfirieron en receptores irradiados. Se inyectó a los ratones con 125IUdR el día 5, y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la absorción de 125IUdR de bazos en BM de B6 transgénicos con RAEl e -> ratones B6 de tipo natural y las barras blancas muestran la absorción de marcador radiactivo en BM de B6 transgénicos con RAE1 e->receptores B6 DAP10-/-. Los ratones se trataron el mAb anti-NKG2D no debilitador, neutralizante, o con el mAb anti-NK1 .1 debilitador de células NK (200 µg/ratón el día 2), como se indicó. Los resultados son la media + DS de cpm (5 ratones por grupo). La figura 16(b) ilustra que los ratones DAP12-/- (Bakker eí al. , Immunity, 13: 345-353, 2000) rechazan la médula ósea singénica que expresa RAEl e. Aproximadamente 4x106 células de BM de B6 transgénicos con RAEl e se transfirieron en receptores irradiados.

Se inyectó a los ratones con 125I UdR el d ía 5 y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la absorción de la absorción de 125I UdR de bazos en BM de B6 transgénicos con RAEl D-> ratones B6 de tipo natural y las barras blancas muestran absorción de marcador radiactivo en BM de B6 transgénicos con RAE1 D->DAP 12-/- receptores B6. Los ratones fueron tratados y los resultados se muestran como se describió para el panel a. La figura 17 (a) ilustra la modulación de NKG2D en células NK en ratones B6 transgénicos con RAEl e. Se tiñeron esplenocitos de ratones de tipo natural y B6 transgénicos con RAEl e se tiñeron con mAb anti-pan-RAE-1 (paneles izquierdos) o con mAb antí-NKG2D y anti-NK1 .1 (paneles derechos). Se analizó la expresión de RAE-1 en las células de bazo, y se analizó la expresión de NKG2D controlándola en células NK1 .1 +. Las líneas delgadas muestran células teñidas con clg, mientras que las líneas gruesas muestran tinción específica para RAE-1 o NKG2D. Las cantidades representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. La figura 17 (b) ilustra que la citotoxicidad dependiente de NKG2D es disminuida en las células NK transgénicas (Tg) con RAE-1 e. Se prepararon células NK enriquecidas de los bazos de ratones B6 de tipo natural o Tg con RAE-1 e que fueron inyectados por vía ip con poli l :C (100 g/ratón) un día antes de la recolección. Se realizaron ensayos de eliminación redirigida dependiente de anticuerpo monoclonal contra células objetivo 721 .221 transfectadas con CD32, como se describió en (Lanier eí al., J Immunol, 141 :3478-3485, 1998) usando Ig de control (clg), mAb anti-NKG2D, o anti-NK1 .1 s. Figura 17(c): ilustra la modulación de NKG2D en las células NK de tipo natural desarrollada en anfitriones transgénicos con RAE-1 e. Se transfirieron células BM de B6 Ly 5.2 (1 x107/ratón) se transfirieron en ratones irradiados de tipo natural (WT) o B6 Tg con RAE-1 e. Tres meses después del transplante, se analizó el nivel de expresión de NKG2D (paneles izquierdos) y NK1 .1 (paneles derechos) en las células NK de bazo (controlado en linfocitos CD3-, NK1.1 +). Las líneas delgadas muestran las células teñidas con clg, mientras que las líneas gruesas muestran tinción específica para RAE-1 o NKG2D. Los números representan la fluorescencia media (unidades lineales arbitrarias) de las células teñidas. La figura 17(d) ilustra gráficamente la citotoxicidad dependiente de NKG2D de células NK en BM de B6 Ly5.2->Ratones quiméricos Tg con RAE1 . Se prepararon células NK enriquecidas de los bazos de BM de B6 Ly5.2->RAE-1 Tg y BM de B6 Ly5.2-> ratones B6, inyectados por vía ip con poli l :C (100 µg/ratón) un día antes de la recolección. Se realizaron análisis de citotoxicidad redirigidos dependientes de mAb como se describió en el panel b. La figura 17(e) ilustra que las células NK de tipo natural que se desarrollaron en ratones Tg RAE-1 demuestran rechazo de médula ósea dependiente de NKG2D. Las barras negras muestran la absorción de 25I UdR en bazos de células de BM Tg RAE-1 + -> ratones quiméricos (BM de B6 Ly5.2-> B6 de tipo natural), y las barras blancas muestran absorción de marcador radiactivo en bazos de Células BM Tg RAE-1 +-> ratones quiméricos (BM de B6 Ly5.2->Ratones quiméricos Tg con RAE1 ). La figura 17(f) ilustra que la resistencia h íbrida en ratones CB6F1 transgénicos RAE-1 e es disminuida. Aproximadamente 4x106 células de BM de B/c se transfirieron en receptores irradiados. Se inyectó a los ratones receptores con 125I UdR el día 5, y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. Las barras negras muestran la absorción de 125I UdR de bazos en BM de B/c-> ratones CB6F1 de tipo natural, las barras blancas muestran absorción de marcador radiactivo en BM de B/c -> receptores transgénicos CB6F1 RAE-1 e, y las barras grises muestran BM de CB6F1 ->ratones CB6F1 . Los ratones se trataron con el mAb anti-NKG2D no debilitador, neutralizador, o con el mAb anti-NK1 .1 debilitador de células NK (200 µg/ratón el día 2), como se indicó. Los resultados se muestran como la media + DS de cpm (5 ratones por grupo). El experimento se realizó dos veces con resultados comparables. Descripción detallada de la invención La presente invención está basada, en parte, en el sorprendente hallazgo de que la modulación de NKG2D, un receptor activador en células T CD8+ , Células NK, y ciertas células T CD4+ activadas, es un medio efectivo para prevenir y/o tratar síndromes autoinmunitarios e inflamatorios. En un aspecto, los presentes inventores han descubierto agentes y métodos para estimular la ¡nternalización de NKG2D y han identificado a estos agentes como modalidades terapéuticas útiles para tratar síndromes asociados con la activación de NKG2D. Los agentes y métodos son particularmente útiles bajo condiciones (tales como las que se cree que están presentes, por ejemplo, en síndromes inflamatorios crónicos) en las cuales los ligandos NKG2D solubles naturales no son capaces de estimular la internalización. La invención comprende además cualquier medio para reducir la expresión funcional de NKG2D con el fin de tratar estos síndromes inflamatorios. En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la invención afectan solamente el subconjunto de leucocitos que dependen para su activación primordialmente de NKG2D. La invención comprende métodos y composiciones efectivos para tratar o prevenir un síndrome asociado con la activación de leucocitos mediada por NKG2D. Los métodos se llevan a cabo poniendo en contacto leucocitos que expresan NKG2D con un agente que reduce la activación mediada por NKG2D de las células bajo condiciones apropiadas para prevenir o para tratar el síndrome. El contacto puede llevarse a cabo por cualquier método apropiado, incluyendo administrar el agente o una composición que contiene el agente a un paciente, o anfitrión , incluyendo células activadas por la ruta o rutas NKG2D bajo condiciones que permitan el suministro del agente a las células en el paciente o anfitrión. La activación de NKG2D puede reducirse de acuerdo con la invención mediante uno o más de: (i) debilitar las moléculas de NKG2D preexistentes en la superficie celular de la superficie celular; (ii) interferir con la interacción funcional entre NKG2D y DAP10 o si no, bloquear la función de señalización de NKG2D; y (iii) evitar que las moléculas de NKG2D alcancen la superficie celular, incluyendo interferir con la producción de NKG2D a un nivel transcripcional , traduccional, o post-traduccional. En algunas modalidades, la invención comprende reducir las moléculas de N KG2D en la superficie celular estimulando su internalización sin ocasionar activación significativa concurrente que podría disparar las funciones efectores de los leucocitos portadores de NKG2D. Como se usa aquí, los términos "NKG2D, " "NKG2-D," "D12S2489E,""KLRK1 ," y "miembro 1 de la subfamilia K del receptor similar a lecitina eliminador de células" se refieren a un gen receptor activador de célula eliminadora humana, ADNc (por ejemplo, Homo sapiens - número de acceso a GENBANK NM-007360), y su producto genético, así como también sus contrapartes de mamíferos, incluyendo productos de tipo natural y mutantes. Una región codificadora de NKG2D se expone como SEQ ID NO: 3, y una secuencia de proteína NKG2D se expone como SEQ ID NO: 4. Las contrapartes de mamífero de NKG2D incluyen, sin limitación a ellas, NKG2D de ratón (por ejemplo, Mus musculus - número de acceso a GENBANK NM-033078), NKG2D de rata (por ejemplo, Rattus norvegicus - número de acceso a GENBANK NM-133512), NKG2D de cerdo (por ejemplo, Sus scrofa - número de acceso a GENBANK AF285448), NKG2D de mono (por ejemplo, Macaca mulatta - número de acceso a GENBANK AJ554302), y NKG2D de orangután (por ejemplo, Pongo pygmaeus - número de acceso a GENBANK AF470403). Las modalidades preferidas de la presente invención incluyen agente moduladores de NKG2D, tales como antagonistas de NKG2D y antagonistas parciales. A menos que se indique otra cosa, los métodos de la invención se pueden practicar en el contexto de tratar (por ejemplo, reducir los síntomas asociados con y/o las condiciones subyacentes que son consideradas causantes de una condición ya sea en términos de tiempo, tales como síntomas/condiciones existentes, extensión de tales condiciones/síntomas, gravedad de tales condiciones/síntomas, etc. ) o prevención (por ejemplo, reducir la probabilidad de desarrollar, demorar el inicio de, demorar la gravedad después del inicio, reducir la gravedad en el inicio, etc.) de cualquier tipo de condición inflamatoria relacionada con la actividad de NKG2D, tal como cualquier enfermedad autoinmunitaria inflamatoria asociada con la actividad de NKG2D. Sin embargo, se reconocerá que tales condiciones pueden variar significativamente, de tal forma que los métodos para tratar diversas condiciones también pueden ser considerados aspectos únicos de la invención. I. Agentes moduladores de NKGD2 A menos que se indique otra cosa o que esté claramente implicado en el contexto, en la práctica de la invención se puede usar cualquier agente que reduzca la activación de células mediada por NKG2D. Ejemplos no limitantes de estos agentes incluyen: un ligando NKG2D, o un fragmento de fijación a NKG2D, variante, o derivado de él ; un anticuerpo, o un fragmento, variante, o derivado de él (tal como, por ejemplo, un anticuerpo que se une a NKG2D); un ácido nucleico (o variante o derivado de él), o una molécula pequeña, que inhibe la producción de NKG2D o DAP 10 en una célula; péptidos o moléculas pequeñas que interfieren con la formación o función del complejo NKG2D-DAP10; moléculas pequeñas que alteran la transducción de señal de NKG2D, y combinaciones de cualesquiera de los precedentes. Se puede encontrar ejemplos de ligandos NKG2D por ejemplo, en la patente estadounidense número 6,653,447; Carayannopoulos eí al., J Immunol, 169 (8): 4079-83, 2002; Carayannopoulos eí al. , Eur J Immunol, 32 (3): 597-605, 2002; Sutherland eí a/.,J Immunol, 168 (2): 671 -9, 2002; Sutherland eí al. , Immunol Rev, 181 : 185-92, 2001 ; y Cosmaneí al., Immunity, 14(2): 123-33, 2001 ) La invención comprende agentes que hacen contacto con células que expresan NKG2D desde el exterior, y reducen la activación de células portadoras de NKG2D cuando son expuestos subsiguientemente a células portadoras de ligando NKG2D o de ligandos NKG2D recombinantes. Se puede vigilar cualquier indicador de esta activación , incluyendo, sin limitación, estimulación de fosforilación de DAP 10, estimulación de quinasa p85 PI3, activación de Akt, producción de interferón-gamma (I FN-y) u otras citocinas o quimioquinas dependiente de NKG2D, eliminación de células objetivo portadoras de ligando NKG2D dependiente de NKG2D, y similares. Un medio para evaluar el nivel de activación de NKG2D es midiendo la eliminación de células NK de células objetivo portadoras de ligando NKG2D (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 más adelante). En algunas modalidades de la invención, los agentes moduladores de NKGD2 útiles son aquellos que producen al menos aproximadamente 20% de reducción de la activación de N KG2D inducida por ligando NKG2D en un sistema modelo tal como el que se describe en el Ejemplo 1 ; en otras modalidades, el agente da como resultado al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más reducción de la activación de NKG2D inducida por ligando. Por ejemplo, la activación inducida por ligando NKG2D puede reducirse en al menos aproximadamente 30% en la presencia del agente comparado con un control. El control puede ser, por ejemplo, activación de NKG2D en la ausencia del agente pero bajo condiciones sustancialmente idénticas ya sea en (a) un individuo, (b) una población de organismos sustancialmente similares, usando un valor promedio como control, o (c) ambos. Otro medio para evaluar el nivel de activación de NKG2D es midiendo la producción de IFN-? en la presencia o en la ausencia de un ligando NKG2D tal como M ICA o ULBP. Se puede usar cualquier método para medir la producción de I FN-?, incluyendo, sin limitación, immunoanálisis u otros análisis que miden la proteína I FN-?; bioanálisis que mida la actividad de I FN-?, y similares. En algunas modalidades de la invención, los agentes moduladores de NKG2D son aquellos que producen al menos aproximadamente 20% de reducción en la producción de IFN-? mediada por NKG2D; en otras modalidades, el agente da como resultado al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o mayor reducción en la producción de IFN-? mediada por NKG2D. En una serie de modalidades, los agentes moduladores de NKGD2 de acuerdo con la invención estimulan la internalización celular de NKG2D. La internalización se puede evaluar mediante cualquier medio apropiado, tal como, por ejemplo, mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2 más adelante); microscopía con inmunofluorescencia (incluyendo vigilar la internalización de un anticuerpo mediante microscopía confocal); análisis de unión que detecte NKG2D en la superficie celular, y similares. En algunas modalidades de la invención, los agentes moduladores de NKGD2 útiles son aquellos que ocasionan al menos aproximadamente 10% de reducción en el nivel de NKG2D en la superficie celular o un aumento de 10% en la tasa de desaparición de NKG2D de la superficie celular, comparado con el control cuando se somete a prueba en un sistema modelo tal como el que se describe en el Ejemplo 2; en otras modalidades, el agente da como resultado al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% de reducción del nivel de NKG2D en la superficie celular o al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de aumento en la tasa de desaparición de NKG2D. Preferiblemente, los agentes moduladores de NKGD2 de acuerdo con la invención no dan como resultado una citólisis o debilitamiento significativos de células que expresan NKG2D, incluyendo, por ejemplo, una o más de células T CD8+, células T CD4+, y Células T ?d-TcR+, y células NK CD56/16 + . La capacidad de un agente para eliminar células que expresan NKG2D se puede evaluar usando cualquier medio apropiado, tal como, por ejemplo, mediante detección de células muertas por citometría de flujo o microscopía, usando tinción con anexina V o con yoduro de propidio, incorporación de azul Trypan, análisis con Europio o análisis de liberación de cromo. En algunas modalidades de la invención, los agentes moduladores de NKGD2 útiles son aquellos que muestran un beneficio terapéutico detectable bajo condiciones que conservan la viabilidad de al menos aproximadamente 90% de las células que expresan NKG2D. En otras modalidades, el agente produce menos de aproximadamente 5%, 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, u 80% de reducción en la cantidad de células que expresan NKG2D. La siguiente tabla contiene ejemplos no limitantes de características de agentes moduladores de NKG2D de acuerdo con la invención. Tabla 1. Características de agentes moduladores de NKGD2 La presente invención se refiere a la incapacidad de ligandos naturales solubles de N KG2D (tal como, por ejemplo, M I CA o ULBP) para estimular la internalización de N KG2D en pacientes que sufren de inflamación crónica en una forma similar a la internalización que pod ría ocurrir en individ uos q ue no sufren de inflamación crónica; sin desear estar li mitado por la teoría, se cree que este fenómeno es el resultado al menos en parte, de los altos niveles de citocinas que acompañan los estados inflamatorios crónicos (Este fenómeno puede ser documentado comparando los niveles de N KG2D en las células T en células N K en pacientes que sufren de inflamación crónica y en pacientes saludables; niveles similares de NKG2D en los dos grupos, no obstante el hecho de que la inflamación crónica es acompañada por altos niveles de circulación de ligandos NKG2D, refleja un defecto en la ¡nternalización de NKG2D). La presente invención comprende agentes que estimulan la internalización de NKG2D bajo condiciones en las cuales los ligandos NKG2D solubles naturales podrían no ser efectivos o podrían ser menos efectivos para ello, así como también el uso de estos agentes en los diversos métodos inventivos proporcionados aquí. Se puede usar cualquier sistema modelo apropiado para examinar este efecto, con el fin de demostrar que agentes particulares poseen o muestran tales características, por ejemplo, comparando el efecto sobre la internalización de NKG2D de un ligando natural soluble y un agente modulador de acuerdo con la invención, bajo condiciones en las cuales las células que expresan NKG2D son expuestas a citocinas (incluyendo, sin limitación, interleucina-2, interleucina-15, factor de necrosis tumoral, o combinaciones de los anteriores) bajo condiciones conocidas, para contrarrestar el efecto de los ligandos naturales solubles sobre la internalización. En algunas modalidades, los agentes moduladores de NKGD2 de la invención pueden ocasionar una reducción en los niveles de NKG2D en superficie, esto es, al menos 10% mayor que la reducción en los niveles de NKG2D en superficie ocasionada por un ligando natural soluble NKG2D, cuando se mide la internalización bajo condiciones (tales como, por ejemplo, en la presencia de una o más citocinas) que interfieren con la capacidad del ligando natural soluble para mediar la internalización. En otras modalidades, los agentes moduladores de NKGD2 son al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o >99% más efectivos que un ligando natural soluble NKG2D para mediar la internalización de N KG2D. A. Ligandos NKG2D Un tipo de agente modulador de NKG2D de acuerdo con la invención comprende ligandos NKG2D. Típicamente, estos ligandos muestran alguna modificación con relación a los ligandos NKG2D solubles naturales (tal como, por ejemplo, formas solubles de M ICA, M ICB , y U LBP), lo que los hace efectivos para estimular la internalización de NKG2D bajo condiciones en las cuales los ligandos naturales solubles son inefectivos. Por ejemplo, formas solubles de proteínas MICA y MICB, es decir, que carecen de los dominios transmembrana y citoplásmico, (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense número US2003/0165835, incorporada aquí mediante referencia), o fragmentos de ella que mantienen la actividad fijadora de NKG2D, pueden ser entrecruzados químicamente usando métodos convencionales para formar ligandos NKG2D multiméricos que son capaces de unirse a más de una molécula de NKG2D y de esta manera estimular la internalización . La actividad fijadora de NKG2D se puede evaluar usando cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, unión competitiva, citometría de flujo, y similares. En otra serie de modalidades, se puede producir ligandos multiméricos NKG2D mediante la expresión de polipéptidos que codifican ácidos nucleicos que tienen repeticiones en tándem (separados mediante separadores apropiados) de dominios de unión a NKG2D derivados de MICA, MICB, o ULBP. En otra serie de modalidades, los ligandos pueden incorporar grupos qu ímicos adicionales, tales como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). B. Anticuerpos La presente invención comprende el uso de cualesquiera anticuerpos que se pueden usar para disminuir la activación mediada por NKG2D, tal como, por ejemplo, aquellos que estimulan la internalización de NKG2D sin activación efectiva por medio de rutas de señalización mediadas por NKG2D. Los ejemplos no limitantes de estos anticuerpos incluyen anticuerpos dirigidos contra cualquier epítopo extracelular o intramembrana apropiado de NKG2D; anticuerpos dirigidos contra cualquier epítopo extracelular o intramembrana apropiado de DAP 10; y anticuerpos dirigidos contra un ligando NKG2D soluble o un complejo de ligando NKG2D-NKG2D. También están comprendidos anticuerpos específicos, es decir, anticuerpos en los cuales cada uno de los dos dominios de unión reconoce un epítopo de unión diferente. La secuencia de aminoácidos de NKG2D está descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense número 6,262,244, la secuencia de aminoácidos de DAP 10 se describe en Wu eí al., Science 285:730, 1999, y las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos M ICA y M ICB están descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense número US 2003/0165835, todos incorporados aquí mediante referencia en su totalidad. En general, se sabe que la unidad estructural básica de anticuerpo contiene un tetrámero. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte del terminal amino de cada cadena puede incluir una región variable de aproximadamente 100 a 1 10 o más aminoácidos responsables primordialmente del reconocimiento de antígenos. La parte del terminal carboxi de cada cadena puede definir una región constante responsable primordialmente de la función efectora. Típicamente, las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Adicionalmente, las cadenas pesadas humanas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon , y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes son unidas con una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en general, Fundamental Immunoloqy, Ch . 7 (Paul , ed., 2a. ed. Raven Press, NY, 1989). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada típicamente forman el sitio de unión del anticuerpo. Así, en general, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, los mismos. Normalmente, todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones estructurales (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de cada par, usualmente se llevan en alineación mediante las regiones estructurales, lo que permite la unión a un epítopo específico. En general, desde el terminal N hasta el terminal C, ambas cadenas ligeras y pesadas incluyen los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio, generalmente está de acuerdo con las definiciones de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat eí al. , National Institutes de Health, Bethesda, MD, 5a. ed. , NIH Publ. No. 91 - 3242, 1991 ; Kabat, Adv Prot Chem, 32: 1 -75, 1978; Kabat eí al. , J Biol Chem, 252:6609- 6616, 1977; Chothia eí al. , J Mol Biol, 196:901 -917, 1987; y Chothia eí al., Nature, 342:878-883, 1989. Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo Fab, fragmentos de anticuerpo F(ab)2, fragmentos de anticuerpo Fv (por ejemplo, VH o VL), fragmentos de anticuerpo FV de cadena simple y fragmentos de anticuerpo dsFv. Adicionalmente, las moléculas de anticuerpo de la invención pueden ser en anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. En algunas modalidades, las moléculas de anticuerpo son anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Los anticuerpos monoclonales comprenden anticuerpos obtenidos de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo sitio antigénico. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden ser sintetizados mediante un cultivo de hibridoma, esencialmente no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que está entre una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Los anticuerpos de la presente invención incluyen cualquier región variable de anticuerpo, maduro o no procesado, unido a cualquier región constante de inmunoglobulina. Si una región variable de cadena pesada está unida a una región constante, preferiblemente es una cadena kappa. Si una región variable de cadena pesada está ligada a una región constante, preferiblemente es una región constante humana gamma 1 , gamma 2, gamma 3 o gamma 4, más preferiblemente, gamma 1 , gamma 2 o gamma 4 y de manera aún más preferible gamma 1 o gamma 4.

En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos contra, por ejemplo, NKG2D o DAP10 se generan usando ratones transgénicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, a los cuales se puede hacer referencia aquí como ratones "HuMAb" contienen mini loci con el gen de inmunoglobulina humana, que codifican secuencias de inmunoglobulina humana no reacomodadas de cadena pesada (mu y gamma) y de cadena ligera kappa, junto con mutaciones apuntadas que inactivan los loci de cadena murina mu y kappa. De acuerdo con esto, los ratones muestran expresión reducida de IgM o kappa de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG/kappa de alta afinidad. La generación de anticuerpos totalmente humanos en ratones HuMAb es conocida comúnmente en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse usando el método de hibridoma descrito primero por Kohler eí al., Nature, 256:495, 1975, o mediante otros métodos bien conocidos, desarrollados posteriormente. En el método de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal anfitrión apropiado para hacer que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma . Las células hibridoma así preparadas, son colocadas en placas y se cultivan en un medio de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental sobrevivientes o no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforíbosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células T deficientes en HGPRT. El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se cultivan, se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. La especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridoma puede determinarse mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RÍA) o análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo o mediante detección Western . Después se identifican las células hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden ser sub clonados limitando los procedimientos de dilución y cultivándolos mediante métodos estándar. Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, D-MEM o medio RPMI-1640. Además, las células hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados e manera apropiada del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de i nmunoglobulina, tales como , por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita , electroforesis en gel , diálisis, o cromatografía de afinidad . El ADN que codifica anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo se aisla se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales. Las células hibridoma sirven como fuente de esta ADN . Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión , los cuales son transfectados entonces en células anfitrionas tales como células de E. coli, células COS de simio, células 293T humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra forma no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo también pueden ser aislados de bibliotecas de fagos anticuerpo generadas usando técnicas bien conocidas, con o sin el uso de saltos de cadena , as í como también infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir librerías de fagos muy grandes. Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales con hibridoma de anticuerpos monoclonales. En la presente invención están comprendidas variaciones menores en la secuencia de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, y mucho más preferiblemente 99% de la secuencia. En particular, están contemplados reemplazos de aminoácidos conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Se puede determinar si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional, analizando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los fragmentos (o análogos) de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, pueden ser preparados fácilmente por un conocedor de la materia. Los términos amino- y carboxi- preferidos de fragmentos o análogos, aparecen cerca de dominios limítrofes o funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o de uso privado. Preferiblemente, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína que se predice que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Los métodos para identificar secuencias de proteína que se doblan en una estructura tridimensional conocida, son conocidos. Se puede usar motivos de secuencia y conformaciones estructurales para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención . En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos se realizan de forma que: (1 ) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) a.lteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de estos análogos. En general, los anticuerpos anti-NKG2D útiles de acuerdo con la presente invención muestran una afinidad (Kd) por NKG2D humano que es al menos igual a la de los ligandos NKG2D solubles. En algunas modalidades, los anticuerpos se unen a NKG2D humana con afinidad nanomolar, o de manera aún más preferible, con afinidad picomolar. En algunas modalidades, los anticuerpos se unen a NKG2D humano con una Kd de menos de aproximadamente 100 nM, 50 nM , 20 nM, 20 nM , o 1 nM. En algunas modalidades, los anticuerpos útiles incluyen aquellos que reducen la interacción entre NKG2D humano y una o más de MICA, MICB, ULBP1 , ULBP2, ULBP3, y ULBP4. Estos anticuerpos bloqueadores se pueden identificar usando ensayos de competencia convencionales. C. Moduladores de ácido nucleico La presente invención comprende la modulación de la expresión de NKG2D en la superficie celular en un nivel transcripcional, traduccional, o post-traduccional. En algunas modalidades, los moduladores están basados en ácido nucleico, incluyendo, sin limitación, ADN , ARN , ARN/ADN quimérico, ácido nucleico de proteína y otros derivados de ácido nucleico. En algunas modalidades, los moduladores de NKG2D comprenden moléculas de ARN capaces de inhibir la producción de NKG2D cuando se introducen en una célula que expresa NKG2D (denominadas iARN), incluyendo ARN bicatenario en horquilla (shARN). Los ejemplos no limitantes de secuencias de iARN útiles para modular la expresión de NKG2D incluyen las que están codificadas por las secuencias 5'-GGATGGGACT AGTACACATT CC-3' (SEQ ID NO: 10); 5'- TGGCAGTGGG AAGATGGCTC °C-3' (SEQ ID NO: 1 1 ); y d'-CAGAAGGGAG ACTGTGCACT CTATGCCTC-3" (SEQ ID NO:12). Se entenderá que cualquier secuencia capaz de reducir la expresión de NKG2D en la superficie celular se puede usar en la práctica de la presente invención. Se puede llevar a cabo la producción de construcciones de iARN usando métodos de síntesis química o técnicas con ácido nucleico recombinante. El ARN polimerasa endógeno de la célula tratada puede mediar la transcripción in vivo, o el ARN polimerasa clonada puede usarse para la transcripción in vitro. La construcción de ¡ARN puede incluir modificaciones ya sea a la estructura principal fosfato-azúcar o al nucleósido, por ejemplo, para reducir la susceptibilidad a nucleasas celulares, mejorar la biodisponibilidad, mejorar las características de formulación y/o cambiar otras propiedades fármacocinéticas. Por ejemplo, los enlaces fosfodiéster de ARN natural pueden modificarse para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o Un heteroátomo de azufre. Las modificaciones en la estructura de ARN pueden ser ajustadas para permitir la inhibición genética mientras que evita una respuesta general al dsARN. De manera similar, se puede modificar las bases para bloquear la actividad de la adenosina desaminasa. La construcción de iARN se puede producir enzimáticamente o mediante síntesis orgánica parcial/total, se puede introducir cualquier ribonucleótido modificado mediante síntesis enzimática u orgánica in vitro. Los métodos para modificar químicamente moléculas de ARN pueden adaptarse para modificar construcciones de iARN (véase, por ejemplo, Heidenreich eí al. , Nucleic Acids Res, 25:776-780, 1977; Wilson eí al., J Mol Recog, 7:89-98, 1994; Chen eí al. , Nucleic Acids Res, 23:2661 -2668, 1995; y Hirschbein eí al. , Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 7:55-61 , 1997). Por ejemplo, la estructura principal de una construcción de RNAi puede ser modificada con fosforotioatos, fosforamidato, fosfoditioatos, metilfosfonato-fosfodiésteres quiméricos, ácidos nucleicos peptídicos, 5-propinil-pirimidina que contiene oligómeros o modificaciones de azúcar (por ejemplo, ribonucleósidos 2'-sustituidos, configuración a). La estructura bicatenaria puede formarse a partir de una sola cadena ARN auto complementario o de dos cadenas de ARN complementarias. La formación dúplex de ARN puede iniciarse ya sea dentro o fuera de la célula. El ARN puede introducirse en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Dosis mayores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) de material bicatenario pueden producir inhibición más efectiva , mientras que dosis más bajas también pueden ser útiles para aplicaciones específicas. La inhibición es específica para la secuencia en que las secuencias de nucleótidos que corresponden a la región dúplex del ARN son apuntadas para la inhibición genética. En ciertas modalidades, las construcciones de ¡ARN en cuestión son "ARN con interferencia pequeña " o "ARNsi" Estos ácidos nucleicos tienen aproximadamente 19-30 nucleótidos de longitud, tal como, por ejemplo, aproximadamente 21 - 23 nucleótidos de longitud, correspondiente en longitud a los fragmentos generados por el "rebanado" con nucleasa de ARN bicatenarios más grandes. Se entiende que los ARNsi reclutan complejos nucleasa y guían los complejos hacia el ARNm objetivo apareándose a secuencias específicas. Como resultado, el ARNm objetivo es degradado por las nucleasas en el complejo de proteínas. En una modalidad particular, las moléculas de ARNsi de 21 -23 nucleótidos contienen un grupo 3'-hidroxilo. El ARNsi para su uso en la presente invención puede obtenerse usando una cantidad de técnicas que son familiares para los conocedores de la materia. Por ejemplo, el ARNsi puede ser sintetizado químicamente o producido recombinantemente usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligómeros de ARN directo o inverso y fijarlos para formar estructuras de ARN con 2-nucleótidos colgantes en cada extremo (Caplen eí al. , Proc Nati Acad Sci USA, 98: 9742-9747, 2001 ; y Elbashir eí al., EMBO J, 20: 6877-88, 2001 ). Estas estructuras de ARNsi bicatenarias pueden ser introducidas luego directamente en las células, ya sea mediante absorción pasiva o mediante un sistema de suministro de elección.

En ciertas modalidades, las construcciones de ARNsi pueden ser generadas mediante el procesamiento de ARN bicatenarios más grandes, por ejemplo, en la presencia del rebanador enzimático. En una modalidad, se usa el sistema de Drosophila in vitro. En esta modalidad, se combina ARNds con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo así una combinación . La combinación se mantiene bajo condiciones en las cuales el ARNds es procesado para producir moléculas de ARN de aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos. Las moléculas de ARNsi pueden ser purificadas usando técnicas convencionales. Por ejemplo, se puede usar electroforesis en gel para purificar ARNsi. Alternativamente, se puede usar métodos no desnaturalizantes, tales como cromatografía de columna no desnaturalizante, para purificar el ARNsi. Además, se puede usar cromatografía (por 'ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño), centrifugación con gradiente de glicerol, purificación de afinidad con anticuerpo, para purificar ARNsi. En algunas modalidades, se usa un plásmido para suministrar el ARN bicatenario, por ejemplo, como un producto transcripcional.

En estas modalidades, el plásmido se diseña para incluir una "secuencia codificadora" para cada una de las hebras directa e inversa de la construcción de iARN. Las secuencias codificadoras pueden ser la misma secuencia, por ejemplo, flanqueada por promotores invertidos, o pueden ser dos secuencias separadas, cada una bajo control transcripcional de promotores separados. Después de que se transcribe la secuencia codificadora, estos transcriptos complementarios de ARN forman pares base para formar el ARN bicatenario. La solicitud del TCP número W001 /77350 describe un ejemplo de vector para transcripción bidireccional de un transgen para producir transcriptos de ARN tanto directos como inversos del mismo transgen en una célula eucariótica. II. Métodos de Tratamiento La presente invención proporciona métodos para prevenir y/o tratar enfermedades inflamatorias, incluyendo diversos trastornos y síndromes autoinmunitarios asociados con la activación de NKG2D. Estos síndromes, incluyen, sin limitación a ellos, situaciones clínicas en las cuales la inducción de ligandos NKG2D relacionados con tensión (por ejemplo, M ICA, MICB , y ULBPs) da como resultado una activación y/o expansión excesiva de células T y/o células NK auto reactivas, lo cual puede reflejarse en niveles aumentados de citocinas tales como IL-2, FNT-a, e IL-15. De acuerdo con esto, en un aspecto particular, la invención proporciona a método para tratar y/o prevenir la artritis reumatoide (RA). El método comprende suministrar una cantidad efectiva de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente que tiene RA o que se ha identificado/diagnosticado como en riesgo sustancial de desarrollar RA, de tal forma que se trate o prevenga la RA. En un aspecto particular, el método de tratamiento/prevención de RA de la invención, se practica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal "contra" (es decir, que es "específico para" o que "se une específicamente a" o que "se une preferencialmente a") NKG2D. En un aspecto, el agente (por ejemplo, un mAb anti-NKG2D o fragmento de mAb) es un agente que está demostrado que es efectivo para producir mejoría en la RA en un modelo aceptable de RA, tal como se describe en la patente estadounidense número 6,414,218 y en la publicación de patente estadounidense número 20030005469 (los principios y modelos relacionados se describen, por ejemplo, en Wooley, P. H., Animal Models of Arthritis. eds. J. H . Klippel y P. A. Díeppe, Mosby Publishers (London), 1998; Eming eí al. , Arthritis Res, 4 Supl 3: S133-40, 2002; Holmdahl eí al., Ageing Res Rev, 1 (1 ): 135-47, Anthony eí al. , Clin Exp Rheumatol, 17 (2): 240-4, 1999; Durie eí al. , Clin Immunol Immunopathol, 73(1 ): 1 1 -8, 1994; y Muller-Ladner eí al. , Drugs Today (Barc), 35 (4-5):379-88, 1999). En un aspecto adicional, el agente es un anticuerpo que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de leucocitos con expresión de NKG2D y/o entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o de células NK (por ejemplo, entorpeciendo la expansión y/o la función de células T CD8+ auto reactivas) (en contraste, por ejemplo, con al menos algunos de los anticuerpos descritos en la publicación de patente estadounidense número 200401 5198), sin debilitar significativamente estas células (por ejemplo, ocasionando una reducción de aproximadamente 10% o menos de estas células cuando se compara con un control apropiado). En un aspecto, el método da como resultado la modulación de uno o más biomarcadores de una forma consistente con el tratamiento o prevención (según sea aplicable) de RA (por ejemplo, IL-6 en suero, FNT R, IL-2R, pérdida de CD4, pérdida de CD8, y/o proteína C reactiva). En otro aspecto, la práctica del método da como resultado una reducción detectable de inflamación sinovial en las articulaciones periféricas del paciente/anfitrión. En un aspecto, el método da como resultado evitar el deterioro radiográfico y mejorar la función física en el paciente o anfitrión, según se muestra mediante, por ejemplo, una reducción en el avance radiográfico en el paciente o anfitrión, reducción de articulaciones inflamadas y sensibles (según se determina mediante criterios analíticos) y/o una calidad de vida mejorada significativamente (por ejemplo, según se determina mediante una reducción de las puntuaciones de discapacidad en el cuestionario RA Health Assessment). En otro ejemplo de aspecto particular, la invención proporciona un método para tratar y/o prevenir la esclerosis múltiple (MS). El método comprende suministrar una cantidad efectiva de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando en un paciente humano o anfitrión mamífero que tiene MS o que se ha identificado/diagnosticado como en riesgo sustancial de desarrollar MS, de tal forma que el MS se trata o previene en el paciente o anfitrión . En un aspecto particular, el método de tratamiento/prevención de MS de la invención, se practica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D (un "anticuerpo anti-NKG2D"). En un aspecto más particular, el agente es un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de los leucocitos con expresión de NKG2D y/o de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o de células NK, sin debilitar significativamente estas células. En todavía otro ejemplo de aspecto, la invención proporciona un método para tratar y/o prevenir la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), tal como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. El método comprende suministrar una cantidad efectiva de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o anfitrión mamífero que tiene IBD o que se ha identificado/diagnosticado como en riesgo sustancial de desarrollar IBD, de tal forma que la IBD se trata o previene en el paciente o anfitrión. En un aspecto particular, el método de tratamiento/prevención de IBD se practica mediante el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D. En un aspecto más particular, el agente es un anticuerpo monoclonal anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando en leucocitos que expresan NKG2D y/o de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o de células NK, sin debilitar significativamente estas células. En otra faceta, la invención proporciona un método para tratar y/o prevenir la psoriasis. El método comprende suministrar una cantidad efectiva de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o anfitrión mamífero que tiene psoriasis o que se ha identificado/diagnosticado como en riesgo sustancial de desarrollar psoriasis, de tal forma que la psoriasis se trata o se previene en el paciente o anfitrión . Típicamente, el método se lleva a cabo mediante suministro de una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal contra NKG2D al paciente. En un aspecto más particular, el agente es un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando en leucocitos que expresan NKG2D y/o entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin debilitar significativamente estas células. En todavía otra faceta, la invención proporciona métodos para reducir la probabilidad de rechazo de trasplante (o para reducir la gravedad o el tiempo para el inicio de una condición relacionada con rechazo de trasplante). El método comprende suministrar (por ejemplo, administrar directamente o administrar por la vía de una composición que contiene, un ácido nucleico codificador, etc. ) una cantidad efectiva de un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando a un paciente humano o anfitrión mamífero que está cerca de ser, es, o fue recientemente el receptor de un trasplante, de tal forma que la probabilidad de rechazo es reducida de manera detectable (por ejemplo, en comparación con un control). En un aspecto particular, el método se practica mediante el suministro de un mAb anti-NKG2D o de un fragmento de mAb anti-NKG2D. En un aspecto más particular, el agente es un mAb anti-NKG2D o un fragmento que es capaz de reducir de manera detectable la activación de NKG2D inducida por ligando de leucocitos con expresión de NKG2D y/o de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin debilitar significativamente estas células. En otro aspecto, un agente de acuerdo con la invención, tal como un mAb anti-NKG2D o un fragmento de mAb anti-NKG2D, se suministra a un paciente o anfitrión mamífero que tiene diabetes mellitus de tipo I o que está en riesgo sustancial de desarrollarla, en una cantidad y bajo condiciones suficientes para tratar o prevenir la condición en el paciente o anfitrión. El método de la invención se puede aplicar de manera similar a una variedad de otras enfermedades y condiciones inflamatorias autoinmunitarias asociadas con NKG2D, incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia perniciosa, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Grave, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, ateritis temporal, síndrome anti-fosfolípido, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Behcet, escleroderma, polimiosítis, dermatomiositis, espondilitis anquilosante, síndrome de Sjogren, dermatitis herpetiformis, pemphigus vulgaris, vitíligo, artritis psoriásica, osteoartritis, asma resistente a esteroides, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y ateroesclerosis. En algunas modalidades preferidas, el trasplante es un trasplante de médula ósea (BM) o un trasplante de célula madre de sangre periférica (PBSM). En algunas modalidades, el trasplante de BMT o PBSCT se administra como tratamiento de leucemia o linfoma, mientras que en otras modalidades, el trasplante se administra como tratamiento para otros tipos de cánceres, tales como neuroblastoma o mieloma múltiple. En la práctica de la presente invención, un modulador de NKG2D se puede administrar a un paciente como una sola dosis que contiene una cantidad efectiva en una sola dosis para prevenir o tratar un síndrome inflamatorio o autoinmunitario, o en una serie de dosis en etapas, que juntas contienen una cantidad efectiva para prevenir o tratar el síndrome. Una cantidad efectiva de un modulador de NKG2D se refiere a la cantidad del modulador que, cuando se administra en una sola dosis o en el agregado de dosis múltiples, o como parte de cualquier otro tipo de régimen de tratamiento definido, produce una mejora estadística medible en los resultados, evidenciada por al menos un parámetro clínico asociado con el síndrome. Una cantidad efectiva de un modulador de NKG2D puede hacer más lento el progreso de una enfermedad cuando se compara con pacientes que no reciben el modulador de NKG2D. Se entenderá que la cantidad efectiva del modulador de NKG2D, así como también el régimen de dosis general, puede variar de acuerdo con la enfermedad y con el estado clínico del paciente, lo cual , a su vez, puede ser reflejado en uno o más parámetros clínicos, tales como puntuaciones de la enfermedad aceptadas clínicamente. Por ejemplo, para la artritis reumatoide, la gravedad de la enfermedad y/o el resultado del tratamiento, puede evaluarse vigilando la cantidad de articulaciones inflamadas, dolor, movilidad, y/o la puntuación oficial de la enfermedad ACR 20/50 o 70. Para la diabetes de tipo I , la gravedad de la enfermedad y/o el resultado del tratamiento pueden evaluarse midiendo los resultados de los niveles de glucosa en sangre o sus variaciones, los niveles de Hb1 C, y similares. Para la esclerosis múltiple, la inflamación cerebral puede evaluarse mediante formación de imágenes del cerebro. Para el rechazo de trasplante hematopoyético, la gravedad de la enfermedad (falla en el injerto) y/o el resultado del tratamiento, pueden ser evaluados por la evidencia de neutropenia, trombocitopenia, y dependencia de la transfusión de glóbulos rojos prolongadas, en pacientes que han experimentado condicionamiento mieloablativo, y cuando no se observa quimerismo en pacientes que han experimentado condicionamiento no mieloablativo. En general, los efectos detectables en el resultado del tratamiento usando los métodos y composiciones de la presente invención incluyen una disminución en la necesidad de otros tratamientos (incluyendo, por ejemplo, una disminución en la cantidad y/o duración de otros fármacos o tratamientos), una disminución en la cantidad y/o duración de estadías en hospital , una disminución en días perdidos debido a enfermedad , y similares. Se entenderá además que la cantidad efectiva puede ser determinada por los conocedores de la materia mediante experimentación de rutina, construyendo una matriz de valores y sometiendo a prueba diferentes puntos en la matriz. La presente invención comprende la administración combinada de uno o más agentes adicionales en conjunto con un modulador de NKG2D. Se entenderá que, en modalidades que comprenden la administración de combinaciones de un modulador de NKG2D con otros agentes, la dosis del modulador de NKG2D puede contener en sí misma una cantidad efectiva, y agente(s) adicional(es) pueden aumentar más el beneficio para el paciente. Alternativamente, la combinación del modulador de NKG2D y el segundo agente pueden contener juntos una cantidad efectiva para prevenir o para tratar el síndrome. También se entenderá que se puede definir cantidades efectivas en el contexto de regímenes de tratamiento particulares, incluyendo, por ejemplo, programación y cantidad de administraciones, modos de administración, formulaciones, etc.

En algunas modalidades en las cuales el síndrome asociado con NKG2D es diabetes de tipo 1 , el agente adicional comprende uno o más de un agente que promueve el crecimiento de células beta pancreáticas o que mejora el trasplante de células beta, tal como, por ejemplo, crecimiento de células beta o factores de supervivencia o anticuerpos inmunomoduladores. En algunas modalidades en las cuales el síndrome asociado con NKG2D es artritis reumatoide, el agente adicional es uno o más de metotrexato; un anticuerpo anti-FNTa; una proteína de fusión receptor de FNTa-lg, un anticuerpo anti-IL-15, un fármaco anti inflamatorio no esferoide (NSAID), y un fármaco anti reumático modificador de la enfermedad (DMARD). Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente biológico, tal como un anti-TNF agente anti-FNT (por ejemplo, ENBREL®), infliximab (REM ICADE®) y adalimumab (HUM IRA®) o rituximab (RITUXAN®). En algunas modalidades en las cuales el síndrome asociado con NGK2D es rechazo de trasplante hematopoyétíco, se puede administrar factor(es) de crecimiento hematopoyético (por ejemplo, eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-1 1 , trombopoyetina, etc.) o antimicrobiano(s) (por ejemplo, antibiótico, antiviral, antifúngico) como una terapia adjunta. En algunas modalidades en las cuales el síndrome asociado con NKG2D es psoriasis, el agente adicional es uno o más de alquitrán y sus derivados, fototerapia, corticoesteroides, ciclosporina A, análogos de vitamina D, metotrexato, inhibidores de proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK), así como también agentes biológicos tales como agentes anti-FNTa y R1TUXAN®. En algunas modalidades en las cuales el síndrome asociado con NKG2D es una enfermedad inflamatoria intestinal (I BD) tal como, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, el agente adicional es uno o más de aminosalicilatos, corticoesteroides, inmunomoduladores, antibióticos, o agentes biológicos tales como REM I CADE® y HUMIRA®. III. Formulaciones farmacéuticas y modos de administración La presente invención comprende formulaciones farmacéuticas que contienen moduladores de NKG2D , los cuales también pueden contener uno o más portadores aceptables para uso farmacéutico. Los portadores aceptables para uso farmacéutico incluyen cualquiera y todos los solventes apropiados, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifúngicos, agentes isotónicos y demoradores de absorción y similares, que son compatibles fisiológicamente con un modulador de NKG2D o composición relacionada o combinación proporcionada por la invención. Los ejemplos de portadores aceptables para uso farmacéutico incluyen uno o más de agua, salina, salina regulada fosfatada, dextrosa , glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de ellas. En muchos casos, puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o cloruro de sodio en esta composición. Sustancias aceptable para uso farmacéutico también en cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsificantes, conservadores o reguladores de pH , los cuales deseablemente pueden aumentar la vida en el estante o la efectividad del modulador de NKG2D , composición relacionada, o combinación . La apropiabilidad de portadores y otros componentes de composiciones farmacéuticas se determina basándose en la ausencia de impacto negativo significativo sobre las propiedades biológicas deseadas del modulador de NKG2D , composición relacionada, o combinación. Las composiciones de modulador de NKG2, composiciones relacionadas, y combinaciones de acuerdo con la invención pueden tener una variedad de formas apropiadas. Estas formas incluyen, por ejemplo, formas de dosis líquida, semi-sólida y sólida, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, emulsiones, microemulsiones, tabletas, pildoras, polvps, liposomas, dendrímeros y otras nanopartículas (véase, por ejemplo, Baek eí al. , Methods Enzymol, 362: 240-9, 2003; y Nigavekar eí al. , Pharm Res, 21 : 476-83, 2004), micropartículas, y supositorios. La forma óptima depende del modo de administración deseado, de la naturaleza de la composición o combinación , y de la aplicación terapéutica. Las formulaciones también pueden incluir, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos (catiónicos o amónicos) que contienen vesículas, conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semi sólidos y mezclas semi sólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación , y la formulación sea compatible fisiológicamente y tolerable con la ruta de administración. Véase también, por ejemplo, Powell eí al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Techno , 52: 238-31 1 , 1998, y las citas que se mencionan allí para información adicional relacionada con excipientes y portadores bien conocidos para los químicos farmacéuticos. Las composiciones de modulador de NKG2D también incluyen composiciones que contienen cualquier combinación apropiada de un péptido modulador de NKG2D y una sal de él apropiada. Se puede usar cualquier sal apropiada, tal como sal de metal alcalino terreo en cualquier forma apropiada (por ejemplo, una sal reguladora de pH), para la estabilización de los moduladores de NKG2D (preferiblemente, la cantidad de sal es tal que se evita la oxidación y/o precipitación del modulador de NKG2D). Las sales apropiadas típicamente incluyen cloruro de sodio, succinato de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y cloruro de calcio. También se proporcionan composiciones que contienen una base y moduladores de NKG2D. En otros aspectos, la invención proporciona una composición moduladora de NKG2D que carece de una cantidad tonificante de cualquier sal. Una composición para uso farmacéutico también incluye diluyentes, rellenadores, sales, reguladores de pH , detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-80), estabilizadores (por ejemplo, azúcares o aminoácidos libres de proteína), conservadores, fijadores de tejido, solubilizantes y/u otros materiales apropiados para su inclusión en una composición farmacéutica. Ejemplos de componentes apropiados también se describen, por ejemplo, en Berge eí al. , J Pharm Sci, 6661 :1 -19, 1977; Wang y Hanson, J Parenteral Sci Tech, 42: S4-S6, 1988, patentes estadounidenses números 6,165,779 y 6,225,289; y en otros documentos citados aquí. Una composición farmacéutica como esta también incluye conservadores, antioxidantes, u otros aditivos familiares para los conocedores de la materia. Los portadores adicionales aceptables para uso farmacéutico son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Urquhart eí al., Lancet, 16: 367, 1980; Lieberman eí al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2a. ed. , vol. 3, 1998; Ansel eí al. , PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS, 7a. ed. , 2000; Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31 a. ed.; Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, Ediciones 16a. - 20a.; THE PHARMACOLOG ICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman y Gilman, eds., 9a. ed., 1996; Wilson y Gisvslds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado y Remers, eds., 10a. ed., 1998; y las patentes estadounidenses números 5,708,025 y 5,994,106. Los principios para formular composiciones aceptables para uso farmacéutico también se describen, por ejemplo, en Platt, Clin. Lab Med, 7: 289-99, 1987; Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE DE DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988; EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998, y "Drug Dosage" J Kans Med Soc, 70(1):30-32, 1969. Otros portadores aceptables para uso farmacéutico particularmente apropiados para la administración de vectores se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 98/32859. En un ejemplo de aspecto, el compuesto activo o combinación se prepara con un portador que protegerá el compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se puede usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de vinilo y etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones son patentados o son generalmente familiares para los conocedores de la materia. Véase, por ejemplo, SUSTAINED AND CONTROLLED RELÉASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc. , NY, 1978. En otro aspecto, las composiciones de la invención dirigidas a su administración oral, por ejemplo, se pueden formular con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea), también puede ser colocado dentro de una cápsula de gelatina dura o de cubierta suave , contenido en tabletas, o incorporado directamente en la dieta del sujeto. Para su administración terapéutica oral , los compuestos pueden ser incorporados con excipientes, y usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, tabletas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención por otra vía distinta a administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con un material para prevenir su inactivación, o coadministrarlo con él. Otro aspecto de la presente invención proporciona un estuche que contiene un modulador de NKG2D, composición relacionada, o combinación, portador aceptable para uso farmacéutico, y opcionamente, otros componentes en la composición farmacéutica. Un estuche puede incluir, además del modulador de NKG2D, agentes para diagnóstico o terapéuticos. Un estuche también incluye instrucciones para el uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una serie de modalidades, el estuche incluye un modulador de NKG2D, compuesto relacionado, o composición de combinación en una forma altamente estable (tal como en forma liofilizada) en combinación con portadores aceptables para uso farmacéutico) que pueden estar mezclados con la composición altamente estable para formar una composición inyectable.

Las composiciones de modulador de NKG2D, composiciones relacionadas, y composiciones de combinación, pueden ser administradas por cualquier vía apropiada, tal como una vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea , intramuscular, parenteral, intertumor, intratumor, o tópica. También se pueden administrar continuamente por medio de una mini bomba u otro dispositivo apropiado. El anticuerpo u otro modulador de NKG2D generalmente será administrado por tanto tiempo como la condición de enfermedad esté presente, siempre que el anticuerpo ocasione que la condición detenga su empeoramiento o que mejore. El anticuerpo u otro modulador de NKG2D generalmente se administrará como parte de una composición aceptable para uso farmacéutico tal como se describe aquí. El anticuerpo se puede administrar por cualquier ruta apropiada, pero típicamente se administra parenteralmente en formulaciones con dosis unitarias que contienen portadores convencionales aceptables para uso farmacéutico, adyuvantes, y similares (estabilizadores, agentes desintegrantes, anti-oxidantes, etc. ). Como se usa aquí, el término "parenteral" incluye suministro por vía subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, ¡ntraesternal, intratendinosa, intraespinal, intracraneal, intratoráxica, técnicas de infusión y suministro ¡nteraperitoneal. Mucho más comúnmente, un anticuerpo será administrado por vía intravenosa o por vía subcutánea. Las vías de inyección también incluyen inyección en el músculo (intramuscular, IM); inyección bajo la piel (subcutánea, SC); inyección en una vena (intravenosa, IV); inyección en la cavidad abdominal (¡ntraperitoneal, IP); y otro suministro en o a través de la piel (intradérmico, ID, usualmente con múltiples inyecciones). La invención proporciona además un método para promover la venta y/o el uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes, o si no de los descritos aquí, que comprende distribuir información (por ejemplo, mediante materiales impresos que son entregados a mano, enviados por correo, etc. , mediante carteles de propaganda, mediante programas y anuncios de televisión, mediante programas y anuncios de radio, mediante anuncios en sitios de Internet, mediante correo electrónico, mediante telemercadeo, mediante mercadeo puerta a puerta o persona a persona, mediante conferencias para obtener fondos y/o de anfitriones, paneles, foros, etc., empleando y/o contratando los servicios del personal de ventas y/o enlaces médicos/científicos, proporcionando fondos y/o alojando investigación y publicaciones científicas relacionadas con estos usos, etc.) con relación al uso del compuesto en la prevención o tratamiento de cualquier condición o combinación de condiciones mencionadas en cualquiera de los aspectos precedentes, o descritas aquí para cualquier persona o entidad de interés potencial (por ejemplo, cadenas farmacéuticas, administradores de fórmulas, compañías de seguros, HMO, hospitales y cadenas e hospitales, otras compañías para el cuidado de la salud, administradores de prestaciones farmacéuticas, pacientes potenciales, pacientes en remisión, médicos de atención primaria, enfermeras, doctores farmaceutas y/o líderes de opinión clave). Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención, y no deben ser interpretados como limitantes de su alcance. Ejemplo 1 Análisis de la activación de NKG2D Se co-cultivan células NK humanas activadas por IL-2 con un cultivo celular objetivo marcado con 51Cr, tal como células Ba/F3 de ratón que habían sido transfectadas con ADNc que codifica MICA humano bajo condiciones en las cuales se expresa el polipéptido MICA, y como células de control, las mismas células objetivo que no han sido transfectadas. Se vigila la liberación de 51Cr para indicar la lisis celular. La lisis de las células que expresan MICA mediante las células NK activadas en niveles por encima de los de los controles, indica la activación específica para la activación específica para NKG2D. Para detectar moduladores de NKG2D, las células NK activadas se incuban con agentes candidatos antes de la exposición a las células objetivo marcadas con 51 Cr. Los compuestos que disminuyen significativamente la eliminación de las células objetivo portadoras de ligando NKG2D son identificadas y evaluadas adicionalmente. Ejemplo 2 Análisis de internalización de NKG2D Las células que expresan NKG2D humana se cultivan a 37 °C durante una o más horas en la presencia de un anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina. Como control , las células NKG2D+ se cultivan con el anti-NKG2D marcado con biotina a 4 °C en la presencia de azida de sodio al 0.05% para prevenir la internalización. Las células se lavan para eliminar el exceso de anticuerpo, y luego se tiñen con una estreptavidina fluorescente marcada con tinte para detectar el anticuerpo NKG2D conjugado con biotina. Luego se evalúa la internalización mediante microscopía fluorescente o citometría de flujo. Una disminución en la cantidad de NKG2D en la superficie celular después del cultivo con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 37 °C en comparación con las células incubadas con el anticuerpo anti-NKG2D marcado con biotina a 4 °C es un indicador de internaiización. Esto se puede verificar además mediante fijación y permeabilización de las células y tinción con un anticuerpo de segundo paso marcado con tinte fluorescente que detectará el anticuerpo anti-NKG2D primario. Si está internalizado, el anticuerpo de segundo paso detectará el anticuerpo anti-NKG2D primario dentro de las células cultivadas a 37 °C, según se visualiza mediante microscopía fluorescente. Ejemplo 3 El blogueo de NKG2D previene la diabetes autoinmuitaria en ratones Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para someter a prueba el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de diabetes de tipo I en un sistema modelo animal, el ratón NOD. (Ogasawara eí al. , Immunity, 20: 757-767, 2004). Ratones, Reactivos, Citocinas y Anticuerpos Se adquirieron ratones NOD en Taconic (Germantown , NY). NOD. Se adquirieron ratones Scid en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, M E). Los ratones NOD transgénicos 8.3 TcR han sido descritos (Verdaguer eí a/. ,J Exp Med, 186: 1663-1676, 1997). Todos los ratones fueron mantenidos bajo condiciones específicas libres de patógenos en la instalación para animales de la UCSF, y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los líneamientos del Comité de Investigación en Animales de la UCSF. Se diagnosticó diabetes cuando el nivel de glucosa en sangre fue mayor que 300 mg/dL en dos mediciones consecutivas. Se midieron los niveles de glucosa en sangre usando un medidor de glucosa en sangre (Walgreen's, Deerfield, IL). Se generaron clones CX5 y CX6 (isotipo lgG 1 de rata) de mAb NKG2D anti-ratón, tal como se describió (Ogasawara eí al. , Immunity, 18:41 -51 , 2003) y se obtuvo el clon 191004 de mAb de NKG2D anti-ratón (isotipo lgG2a de rata) de R&D Systems (Minneapolis, MN). Todos los mAb anti-NKG2D reconocen el dominio extracelular de NKG2D y bloquean eficientemente la unión de NKG2D a sus ligandos. Para la inyección in vivo, se utilizó un anticuerpo CX5 purificado que no contenía endotoxina detectable (<0.3 pg/inyección). La IgG control de rata se adquirió en Sigma (St. Louis, MO). El mAb pan RAE-1 anti-ratón (clon 186107, isotipo lgG2b de rata) se une aRAE-1 a,ß ,?, d y e. Los tetrámeros NRP-V7/H-2Kd y TUMM-2Kd (control) se produjeron como se describió (Amrani eí al., Nature, 406: 739-742, 2000) o en la instalación para tetrámeros de N I H (Atlanta, GA). El tetrámero TUM/ H-2Kd no se unió a las células positivas al tetrámero N RP-V7/H-2Kd. Se adquirieron otros anticuerpos en BD PharMingen o en eBioscience (San Diego, CA). Preparación de células de islotes del páncreas Se aislaron los islotes de ratón como sigue. En resumen, se inyectó 0.3 mg/ml de colagenasa P (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) en el ducto pancreático. Se extrajeron los páncreas distendidos y se incubaron a 37 °C durante 13-17 min. Los islotes se purificaron mediante centrifugación en gradientes Eurocollin-Ficoll que contenían cuatro densidades diferentes (1 .108, 1 .096, 1 .069, y 1.037). Después de la centrifugación, se recolectaron los fragmentos de tejido en 1 .069/1.096 y se lavaron. Después de eso, para obtener células solas, se disociaron las células de los islotes mediante solución de disociación celular no enzimática (Sigma, St. Louis, MO). Inmunofluorescencia, Citometría de flujo y Microscopía Para la detección de NKG2D, se tiñeron células (~1 x106) con 0.25 g de mAb anti-NKG2D (clon 191004) biotinilado o marcado con PE. Las células fueron co-teñidas con anti-CD8 conjugado con F1TC, anti-CD8 conjugado con APC, anti-CD44 conjugado con FITC, o anti-Ly-6C conjugado con FITC. Para detectar RAE-1 , se tiñeron las células con un mAb anti-panRAE-1 biotinilado que reconoce todas las cinco proteínas RAE-1 conocidas (Lodoen eí al. , J Exp Med, 197: 1245-1253, 2003) o mAb anti-RAE-1 (clon CX1 ) (Ogasawara eí al. , supra, 2003). Se usó estreptavidina conjugada con PE o estreptavidina conjugada con APC para detectar mAb biotinilados. Las células se incubaron con mAb durante 20 min y se lavaron con PBS que contenía NaN3 al 0.01 %. Las células fueron analizadas usando un FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) o citómetro personal para computadora personal Guava® con el software GuavaViaCount™ y GuavaExpress™ (Hayward, CA). Las poblaciones de linfocitos viables fueron controladas basándose en perfiles dispersión directa y lateral, y mediante la ausencia de tinción con yoduro de propidio. Para la inmunoquímica, los órganos fueron congelados instantáneamente en medio OCT, y se prepararon secciones y se tiñeron mediante técnicas convencionales. Las imágenes se adquirieron usando un microscopio Deltavisión (Applied Precisión, Issaquah , WH) y la desconvolución computacional se llevó a cabo usando el software softWoRx (Applied Precisión). RT-PCR cuantitativa Se llevó a cabo PCR cuantitativa (tiempo real) usando un instrumento ABI 7700 (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se adquirieron sondas en Applied Biosystems. Las sondas y sensibilizadoers específicos para RAE-1 se describieron previamente (Ogasawara eí al. , supra, 2003). Los sensibilizadores universales usados para detectar todos los transcriptos de RAE-1 conocidos fueron: directo, 5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3' (S EQ ID NO: 6); inverso, 5'- catcattagc tgatctccag ctca-3" (SEQ ID NO:7), y la sonda fue 5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3' (SEQ ID NO:8). Se trató el ARN total con DNasa I , y luego se sintetizó la primera cadena de ADNc usando sensibilizadores hexámeros aleatorios. Las condiciones de ciclización para la PCR en tiempo real fueron : 50 °C durante 10 min, seguida por 50 ciclos a 95 °C durante 30 seg, y 60 °C durante 2 min. Se analizaron los datos usando el software de análisis Sequence Detector v1 .7 (Applied Biosystems). Se llevó a cabo el análisis estadístico usando una prueba T con dos muestras. Estudios de transferencia adoptiva - células T de NOD transferidas en ratones NOD.scid Se aislaron células T de bazos y nodos linfáticos de ratones NOD de 16 semanas de edad mediante clasificación magnética usando MACS (Miltenyi Biotec Inc., Alemania). Las células T (pureza >98%) fueron enriquecidas por selección negativa con debilitamiento de células CD 19+, CD24+, y MHC clase l|+. Aproximadamente 7.5 x106 células T se transfirieron en ratones NOD.scid de 4-5 semanas de edad mediante inyección en la vena de la cola. Los niveles de glucosa en sangre en los ratones transferidos adoptivamente se examinaron semanalmente.

Estudios de transferencia adoptiva - células T transgénicas 8.3 TcR en ratones NOD Se realizó transferencia adoptiva de células T célula como se describió previamente (Serra eí al. , Proc Nati Acad Sci USA, 99: 15566-15571 , 2002). En resumen , se aislaron linfocitos transgénicos 8.3 TcR de los nodos linfáticos y los bazos. Las células T (pureza >95 %) fueron enriquecidas mediante selección negativa mediante clasificación magnética usando un MACS. Aproximadamente 1 x 107 Células T marcadas con CFSE (5 M) se transfirieron en ratones NOD de 10 semanas de edad mediante inyección en la vena de la cola el día 0. Se inyectó MAb anti-NKG2D (CX5) o clg (200 g/inyección) en los ratones NOD receptores los días -1 , +1 y +5. Expresión de RAE-1 en el páncreas de ratones NOD pre-diabéticos Para investigar si las interacciones entre NKG2D y RAE-1 están involucradas en el desarrollo de diabetes autoinmunitaria, se desarrolló un análisis RT-PCR cuantitativo para detectar transcriptos de todos los genes RAE-1 conocidos. Se detectaron abundantes transcriptos de RAE-1 en los páncreas de ratones NOD pre-diabéticos en etapa tardía (12-16 semanas de edad), pero no en los páncreas de ratones BALB/c con edades coincidentes (Fig. 1 a). Si bien comparativamente se detectan de forma menos pronunciada, los transcriptos de RAE-1 también se detectaron en los páncreas de ratones NOD de 4-6 semanas de edad. También se detectó RAE-1 en los páncreas de ratones NOD.scíd adultos (que carecen de células B y T) (Fig. 1 b). Juntos, estos resultados indicaron que la expresión de RAE es independiente del inicio de una respuesta autoinmunitaria. Para examinar si RAE-1 se regula hacia arriba selectivamente en el páncreas con la edad, los niveles de transcriptos RAE-1 en un órgano particular de ratones NOD jóvenes, fueron comparados con los del mismo órgano en ratones NOD pre-diabéticos en etapa tardía. Mediante este criterio, RAE-1 aumentó relativamente más en el páncreas de los ratones pre-diabéticos con la edad, en comparación con el hígado, bazo, riñon y timo (Fig. 1 c).

Para determinar si las proteínas RAE-1 se expresaron en la superficie celular, se aislaron células pancreáticas de ratones NOD pre-diabéticos y BALB/c no diabéticos. Las células aisladas por digestión enzimática del páncreas se tiñeron con mAb anti-RAE-1 y anti-CD45 (los cuales distinguen las células hematopoyéticas CD45+ infiltradas de las células de islote pancreático no hematopoyéticas). Se detectaron las células con linaje hematopoyético positivas a CD45 infiltrando el páncreas de NOD pre-diabéticos, pero no el páncreas de BALB/c no diabéticos (Fig . 1 d). Las proteínas RAE-1 se detectaron predominantemente en las células pancreáticas no hematopoyéticas negativas a CD45 en ratones NOD, pero no se encontraron en las células pancreáticas en los ratones BALB/c. Usando técnicas de separación por gradiente de densidad, se aislaron los islotes de páncreas de NOD y también se recolectaron de los nodos linfáticos pancreáticos (PLN) de estos ratones. Las suspensiones de células solas de los islotes aislados y PLN se tiñeron con mAb anti-RAE-1 y anti-CD45 y se analizaron mediante citometría de flujo. RAE-1 estuvo presente en niveles bajos en la mayoría de las células de islote CD45, pero no en las células hematopoyéticas CD45+ en el páncreas o PLN (Fig. 1 d, e). Estos resultados indicaron que los transcriptos y proteínas RAE-1 estaban presentes en el páncreas de ratones NOD pre-diabéticos, pero no en ratones BALB/c no diabéticos, e indicaron que la expresión de RAE-1 puede preceder al inicio de la enfermedad y contribuir al progreso de la enfermedad en ratones NOD . Las células T D8+ infiltradas en el páncreas de NOD expresan NKG2D Dado que el desarrollo de diabetes en ratones NOD requiere tanto células T CD4+ como CD8+, la expresión de NKG2D fue analizada en células T aisladas de los tejidos periféricos inmunitarios y en los leucocitos infiltrados en los páncreas de ratones NOD. Como se muestra en la figura a, se detectó NKG2D en un subconjunto de las células T CD8+ infiltradas en el páncreas en ratones NOD de 10 y de 5 semanas de edad. Los porcentajes de células T CD8+ NKG2D+ infiltradas en el páncreas aumentaron con el progreso de la enfermedad (Fig. 2a). Una fracción más pequeña de células T CD8+ NKG2D+ se detectó en PLN y bazo (Fig. 2a, b). Adicionalmente, se encontró que las células T CD8+ NKG2D+ en el páncreas y PLN expresan altos niveles de CD44, pero no de Ly-6C (Fig. 2b). Una población de leucocitos CD8- NKG2D+ leucocitos (los cuales no expresaron CD3) también se observó en los leucocitos que infiltraron el páncreas de NOD (Fig. 2a) y muchas de estas células co-expresaron células NK y antígenos de célula mieloides. Tal como se reportó para las cepas de ratones no diabéticos normales (Jamieson eí al. , Immunity, 17: 19-29, 2002), el NKG2D no se detectó en las células T CD4+ o en las células B 220+ en el páncreas o en los tejidos periféricos linfoides de los ratones NOD de 10 semanas o de 25 semanas de edad. Estudios recientes revelaron que una proporción sustancial de células T auto reactivas CD8+ en ratones NOD reconoce un péptido de la proteína relacionada con la subunidad catalítica glucosa-6-fosfatasa (IGRP) que es presentado por H-2Kd. Un péptido mimótopo, NRP-V7 (KYNKANVFL, que se expone como SEQ ID NO: 5), funciona como un super-agonista en ratones NOD que expresan 8.3 TcR. Las células T CD8+ reactivas a ÍRP-V7- se acumulan en el páncreas de ratones NOD y juegan un papel crítico en la diabetogénesis. Las células T CD8+ en el páncreas y PLN fueron co-teñidas con tetrámeros NRP-V7/H-2Kd y anti-NKG2D. Casi todas las células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd infiltradas en el páncreas expresaron NKG2D y CD44alt0 (Fig. 2c). De manera similar, las células T CD8+ NKG2D+ en el páncreas fueron CD44alt0, pero Ly-6C (Fig. 2b), un fenotipo consistente con células T CD8+ efectoras (Cerwenka eí al. , J Immunol, 161 :97-105, 1998). De manera notable, se detectaron pocas células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en el PLN (Fig. 2c).

La inmunohistoquímica reveló que las células T CD8+ NKG2D+ se acumularon en los islotes de ratones NOD pre-diabéticos, cerca de las células beta productoras de insulina (Fig. 2d). Además de las células T CD8+ , un subconjunto de las células positivas a CD68 (macrófagos) en el páncreas también expresó NKG2D (Fig. d). El tratamiento con mAb anti-NKG2D neutralizante in vivo previene la diabetes auto inmunitaria La expresión de NKG2D en las células T CD8+ infiltradas y ligandos NKG2D en los islotes pre-diabéticos, indicaron un papel para estas moléculas en la diabetogénesis. Esta hipótesis se sometió a prueba tratando los ratones NOD pre-diabéticos con un mAb anti-NKG2D neutralizante. El mAb CX5 de NKG2D anti-ratón bloquea la unión de NKG2D a sus ligandos, y la incubación de células portadoras de NKG2D con CX5 dio como resultado la modulación y la internalización del receptor. De manera importante, el tratamiento de ratones in vivo con CX5 no disminuyó las células NK o las células T CD8+ NKG2D + . Los ratones NOD se trataron con mAb anti-NKG2D desde 7 - 25 semanas de edad . Los ratones tratados con diluyente solamente, desarrollaron diabetes que comenzó a las 15 semanas de edad y todos (n=7) tuvieron la enfermedad a las 28 semanas (Fig. 3a, b). En contraste, ninguno de los ratones NOD tratados con anti-NKG2D (n=7) desarrollaron diabetes a las 30 semanas de edad, a pesar de que el tratamiento con anticuerpos fue detenido 5 semanas más temprano (Fig. 3a, b).

Como un análisis más restringido, el tratamiento con mAb anti-NKG2D fue sometido a prueba para determinar la prevención del inicio en ratones pre-diabéticos de 1 3 semanas de edad con insulitis establecida . Los ratones a los que se les proporcionó IgG de control desarrollaron diabetes comenzando a las 1 5 semanas de edad . En contraste , no apareció diabetes en ninguno de los ratones NOD d urante las 1 2 semanas de tratamiento con anti-N KG2D (Fig . 3c, d). De manera notable, la mayoría de los ratones tratados con anti-NKG2D permaneció libre de la enfermedad a las 7 semanas después de detener la terapia (Fig . 3c, d ). Así, el bloqueo de NKG2D evitó el progreso de la diabetes no solamente en ratones jóvenes con insulitis, sino también en ratones en una etapa pre-diabética con el inicio inminente de la destrucción de islotes. No se observaron efectos colaterales del tratamiento con mAb anti-NKG2D mediante examen superficial o mediante análisis histológico. ASÍ, el tratamiento con mAb anti-NKG2D es una terapia eficiente para prevenir la diabetes , al menos siempre que el anticuerpo se administre continuamente. Para examinar el mecanismo de la terapia mediada por mAb anti-NKG2D , se analizaron los leucocitos aislados del páncreas y PLN de ratones NOD tratados con Ig de control y con mAb anti-NKG2D . Las células T CD8+ que co-expresan NKG2D y altos niveles de CD44 estaban presentes en el páncreas de los ratones tratados con Ig de control . Tal como se esperaba, la expresión de NKG2D se redujo significativamente en las células T CD8+, pero la expresión de CD44 fue idéntica en el páncreas de ratones tratados con mAb anti-NKG2D comparada con la de ratones tratados con Ig de control (Fig. 4a). En contraste, las células T CD8+ que expresan NKG2D fueron relativamente infrecuentes en el PLN tanto de los ratones de control como de los tratados con mAb anti-NKG2D, lo que indica localización preferencial de las células T CD8+ NKG2D + en el páncreas (consistente con los resultados presentados en la Fig. 2 para los ratones NOD no tratados). El análisis inmunohistoquímico de secciones de páncreas congeladas de ratones tratados con ig de control indicó abundantes células T CD8+ que expresan NKG2D en el páncreas de ratones NOD de 16 semanas de edad tratados con Ig de control (Fig. 4b). En contraste, mucho menos células T CD8+ estaban presentes en el páncreas saludable de los ratones de 16 semanas de edad que habían sido tratados durante nueve semanas con anti-NKG2D (Fig. 4c). Los leucocitos aislados del páncreas y PLN de Ratones NOD tratados con Ig de control o con mAb anti-NKG2D también fueron analizados para determinar la presencia de células T CD8+ auto reactivas específicas para antígeno. De manera contundente, la infiltración de células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en el páncreas disminuyó drásticamente (-75%) en los ratones tratados con mAb anti-NKG2D (Fig. 4d). La frecuencia de células T CD8+ positivas al tetrámero N RP-V7/H-2Kd también disminuyó en el PLN, bazo y sangre periférica de los ratones tratados con mAb anti- NKG2D, en comparación con los ratones tratados con Ig de control (Fig. 4d, e). No se detectó NKG2D en las células T CD8+ en los ratones tratados con mAb anti-NKG2D. Debido a que CX5 es un mAb anti-NKG2D no debilitador (Véase la figura 8), se contempla que la terapia funciona por modulación del receptor (Véase la figura 7) y/O inhibición de la unión del ligando. La producción de IFN-? por las células T CD8+ aisladas del PLN de los ratones tratados in vivo con Ig de control o con mAb anti-NKG2D también fue examinada. Al ser estimulados con PMA y ionomicina in vitro, se detectaron células T CD8+ IFN-?+ en ratones NOD tratados con clg, mientras que se observaron menos células T CD8+ IFN-?+ en ratones sometidos a terapia con mAb anti-NKG2D (Fig . 4f). No obstante, no es necesario un entendimiento del mecanismo o mecanismos con el fin de elaborar y usar la presente invención. El blogueo de NKG2D previene la diabetes en ratones NOP.scid que reciben células T transferidas adoptivamente de ratones NOD diabéticos para averiguar si el bloqueo de NKG2D afecta las células T CD8+ efectoras, se transfirieron adoptivamente células T aisladas de ratones NOD diabéticos de 16 semanas de edad en receptores NOD .scid (los cuales carecen de células T y no desarrollan diabetes). Al momento de la transferencia, solamente las células T CD8+ expresaron NKG2D (Fig. 5a). Sin embargo, 5 semanas después de la transferencia se detectó una cantidad sustancial de células T CD8+ NKG2D+ en el páncreas, PLN , y bazo en los ratones receptores (Fig. 5a), lo que sugiere la expansión de células T NKG2D+ pre-existentes, o la adquisición de NKG2D en las células T CD8+ transferidas. Aproximadamente 15% de las células T CD8+ que infiltraron el páncreas en los ratones receptores tratados con clg fueron positivos al tetrámero N RP-V7/H-2Kd, mientras que se encontraron significativamente menos en los ratones tratados con mAb anti-NKG2D (Fig. 5b, c). El NKG2D estaba presente en la mayoría de las células T CD8+ auto reactivas positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en los ratones NOD tratados con Ig de control, pero no se detectó en los ratones que recibieron terapia con mAb anti-NKG2D (Fig. 5c). Si bien la diabetes se desarrolló en todos los ratones NOD.scid tratados con Ig de control que recibieron células T de ratones NOD diabéticos, ninguno de los ratones tratados con mAb anti-NKG2D desarrolló diabetes mientras recibía la terapia (Fig. 5d). Para determinar si el tratamiento con anti-NKG2D bloqueaba la expansión de células T CD8+ en los ratones receptores NOD.scid, se detuvo el tratamiento con mAb anti-NKG2D después de 8 semanas, cuando todos los ratones tratados con Ig de control habían sucumbido a la enfermedad. Cuatro semanas después de suspender la terapia con anti-NKG2D, se desarrolló diabetes en la mayoría de los NOD.scid que habían recibido células T de donantes NOD diabéticos (Fig. 5d). Adicionalmente, en este momento hubo evidencia de la expansión de las células T CD8+ NKG2D+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en los ratones NOD .scid (Fig. 5e). Estos resultados indicaron que el tratamiento con mAb anti-NKG2D inhibió la expansión y/o la acumulación de células T CD8+ NKG2D+ en el páncreas. El rápido progreso de la diabetes corto tiempo después de suspender la terapia indicó que las células T efectoras estaban controladas, en lugar de debilitadas, durante el periodo de tratamiento con el anticuerpo. La terapia con mAb anti-NKG2D previene la expansión de células T auto reactivas CD8+ en el páncreas El hallazgo de menos células T CD8+ positivas al tetrámero NRP-V7/H-2Kd en el páncreas de ratones tratados con anti-NKG2D fue consistente con la posibilidad de que la terapia con mAb bloqueara la expansión de las células T auto reactivas. Para probar directamente esta hipótesis, se marcaron células T transgénicas 8.3 TcR con CSFE, se transfirieron adoptivamente en receptores NOD de 10 semanas de edad y se trataron ya sea con Ig de control o con mAb anti-NKG2D (Fig. 6). Antes de la transferencia, las células T CD8+ de los nodos linfáticos y los bazos de ratones NOD transgénicos 8.3 TcR fueron >90 % positivas al tetrámero NRP-V7/H2Kd pero no expresaron NKG2D (Fig. 6a). Dos días después, las células T de NOD transgénicos 8.3 TcR marcadas con CSFE se infiltraron en el páncreas de ratones tratados con Ig de control que expresaron NKG2D (Fig. 6b) y ya estaban proliferando; sin embargo, no se observó ninguna dilución de CSFE en las células T transferidas presentes en los nodos linfáticos pancreáticos o mesentéricos (Fig. 6c). Los días 4 y 8 después de la transferencia, las células T transgénicas 8.3 TcR marcadas con CFSE en el páncreas y nodos linfáticos pancreáticos, pero no en los nodos linfáticos mesentéricos, de ratones tratados con Ig de control mostraron proliferación excesiva (Fig . 6c). En un contraste contundente, no se detectó N KG2D en la superficie celular de las célu las T CD8+ transgénicas 8.3 TcR marcadas con CSFE en el páncreas de ratones NOD tratados con mAb anti-NKG2D (Fig . 6b). Adicionalmente, la expansión de estas células en el páncreas fue inhibida sustancialmente en comparación con los ratones tratados con Ig de control (Fig . 6c). De manera interesante, el tratamiento con mAb anti-NKG2D tuvo un efecto mucho más profundo en la proliferación de células T CD8+ transgénicas 8.3 TcR marcadas con CSFE infiltradas en el páncreas en comparación con las células en los nodos linfáticos. La expansión de las células T endógenas no marcadas con CSFE en el páncreas detectada con el tetrámero NRP-V7/H2Kd también fue disminuida con el tratamiento con mAb anti-NKG2D , en comparación con los ratones tratados con Ig de control . La cuantificación de la proliferación de las células T transgénicas 8.3 TcR transferidas adoptivamente infiltradas en el páncreas en los ratones tratados con Ig de control y en los ratones NOD tratados con mAb anti-NKG2D indicó un efecto profundo de la terapia con anti-NKG2D sobre la expansión de las células T CD8+ auto reactivas específicas para el antígeno (Fig. 6d). Los datos indican que RAE-1 está presente en los islotes pancreáticos de ratones NOD pre-diabéticos, y que las células T CD8+ auto reactivas que infiltran el páncreas expresan NKG2D. El tratamiento con un anticuerpo monoclonal (mAb) no debilitador anti-NKG2D durante la etapa pre-diabética, evitó completamente la enfermedad entorpeciendo la expansión y la función de las células T CD8+ auto reactivas. Estos hallazgos demuestran que el NKG2D es esencial para el avance de la enfermedad y proporciona un nuevo objetivo terapéutico para la diabetes autoinmunitaria de tipo I . Estos datos implican directamente al receptor de NKG2D en el desarrollo funcional de las funciones efectoras de las células efectoras T CD8+ e indican que el mAb anti-NKG2D funciona terapéuticamente para bloquear las señales mediadas por el receptor en la ausencia de debilitamiento franco de la célula. Ejemplo 4 Modulación de la expresión de NKG2D en la superficie celular por ARNsh El siguiente experimento se llevó a cabo para examinar el efecto del ARN inhibidor sobre la expresión de NKG2D. Se transfectó establemente ADN que codifica NKG2D humana en un vector que conten ía un elemento I RES-eGFP en células CHO. Las células transfectadas establemente que expresaron NKG2D fueron transfectadas luego (usando Lipofectamina y métodos estándar) con un ADNc que codifica CD8 de ratón (mCD8) y con un plásmido (el vector pCR2.1 -TOPO de InVitroGen) que contenía un ADNc con 22 pares de bases (bp) (5'-ggatgggact agtacacatt cc-3', que se expone como SEQ ID NO: 10) homólogo para un segmento de NKG2D humano (denominado ADNsh03). Como control para demostrar la especificidad, también se transfectaron doblemente células CHO que expresaban NKG2D con mCD8 y con un ADNc con 22 bp similar a NKG2D humano, pero con 3 nucleótidos mutados (5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3' , que se expone como SEQ ID NO: 13). Las células en los paneles izquierdos fueron transfectadas solamente con el plásmido que contenía el ADNc CD8 de ratón (mCD8). Se tiñeron las células transfectadas con anticuerpos monoclonales contra CD8 de ratón y contra NKG2D humano y se analizaron mediante citometría de flujo. Se obtuvieron puntos para graficar que muestran la fluorescencia, que representan (i) CD8 de ratón contra NKG2D humano y (ii) eGFP (fluorescencia verde intrínseca resultante de la expresión del vector NKG2D humano-IRES-eGFP) contra NKG2D humano. Los resultados indicaron, primero, que las células que expresaron CD8 de ratón en la superficie celular pudieron ser detectadas fácilmente, revelando que fueron transfectados con los plásmidos introducidos en las células CHO. Adicionalmente, la expresión de NKG2D humana en las células de ratón que expresan CD8 no fue afectada por la co-transfección con el plásmido CD8 de ratón solo o con el plásmido que contiene la construcción mutante NKG2D. En contraste, la co-transfección con la secuencia homologa de NKG2D evitó sustancialmente la expresión de NKG2D. Ejemplo 5 Modu lación de NKG2D en la superficie celular mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-NKG2D Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para evaluar la capacidad de un anticuerpo monoclonal dirigido contra NKG2D para modular la expresión de NKG2D en la superficie celular. Se tiñó una línea celular NK humana (NKL) durante 30 min en hielo con una IgG de control conjugada con biotina (clg bio) o con mAb anti-NKG2D humano de ratón conjugado con biotina (R&D Systems, clon 149810), se lavó, y se incubó una alícuota durante la noche a 37 °C. Se tiñeron las células con estreptavidina conjugada con haloficocianina ya sea antes del cultivo (0 h) o después del cultivo (16 h), y se analizaron a continuación mediante citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media (unidades arbitrarias) de las células teñidas con anti-NKG2D antes del cultivo fue de 186 en comparación con 61 después del cultivo, lo que indica un 67% de disminución en la expresión de NKG2D en la superficie celular de las células NK tratadas con mAb anti-NKG2D durante 16 horas. Se cultivaron células NKL durante 16 h a 37 °C con IgG de control o con IgG anti-NKG2D humano de ratón (R&D Systems, clon 149810). Al final de la incubación , las células se lavaron y se trataron con medio ácido a un pH de 3.5 durante 15 min para eliminar el anticuerpo de la superficie. Las células fueron teñidas luego con anticuerpo anti-NKG2D seguido por anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra marcada con PE para detectar el NKG2D en la superficie. La figura 12 muestra que este anticuerpo anti-NKG2D es efectivo para estimular la internalización de NKG2D en la superficie en estas células humanas. Ejemplo 6 El blogueo de NKG2D evita el rechazo de injertos de médula ósea parental en ratones F1. Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para someter a prueba el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de resistencia híbrida (rechazo de injertos de médula ósea parental por receptores F1 ) en un sistema modelo animal, ratones F1 (CB6F1 ) (C57BL/6 x BALB/c) Ratones Se adquirieron ratones C57BL/6, BALB/c, y CB6F1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad en el National Cáncer Institute Animal Program (Frederick, MD). Se generaron ratones transgénicos RAE-1 e y se retrocruzaron sobre el antecedente C57BL/6 (Ehrlich eí al. , observaciones no publicadas). Los ratones DAP12-/- en el antecedente C57BL/6 (9 generaciones retrocruzadas) se describieron previamente (Bakker et al. , Immunity, 13:345-353, 2000), y se generaron DAP10-/- a partir de células madre embriónicas de C57BL/6 (Phillips eí al. , observaciones no publicadas). Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos del UCSF Committee on Animal Research. Reactivos. Citocinas y Anticuerpos Se generó MAb de NKG2D anti-ratón, clon CX5 (isotipo lgG1 de rata), inmunizando ratas con proteína NKG2D de ratón, como se describió previamente (Ogasawara eí al. , Immunity, 18:41 -51 , 2003). Se produjo el NKG2D anti-ratón , clon 191004 (isotipo lgG2a de rata), a partir de un hibridoma resultante de la fusión de un mieloma de ratón con células B de una rata inmunizada con dominio extracelular NKG2D recombinante de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los mAb anti-NKG2D reconocen el dominio extracelular NKG2D y bloquean eficientemente la unión de NKG2D a sus ligandos. Para inyección in vivo se usaron mAb Cx5 anti-NKG2D mAb CX5 y mAb anti-NK1 .1 PK136 que no contenían endotoxina detectable (<0.3 pg/inyección). El mAb CX5 anti-NKG2D es un anticuerpo bloqueador que no agota las células NK o las células T portadoras de NKG2D cuando se inyecta in vivo (Ogasawara eí al. , Immunity, 20, 757-7567, 2004; Lodoen eí al., J Exp Med, 197: 1245-1253, 2003); y Lodoen eí al. ,J Exp Med, 200: 1075-108, 2004). La IgG de rata de control se adquirió en Sigma (St. Louis, MO). Antiratón pan-RAE-1 mAb (clon 186107, isotipo lgG2b de rata), se generaron mAb H60 anti-ratón (clon 205310) y mAb M ULT1 anti-ratón (clon 237104) como se describió (Lodoen eí al. , supra, 2003; y Lodoen eí al. , supra, 2004). Otros anticuerpos se adquirieron en BD PharMingen o en Biosocience (San Diego, CA). Trasplante de médula ósea Se trasplantó médula ósea murina como se describió previamente (George eí al. , J Immunol, 163: 1859-1867, 1999). En resumen, se llevaron a cabo tratamientos con mAb (200 g/ratón) 2 días antes de la transferencia de médula ósea, y los receptores se trataron con poli l:C (Sigma, 200 µg/ratón) para reforzar el rechazo de injerto mediado por célula NK un día antes de la inyección de células de médula ósea (Murphy eí al., J Exp Med, 166: 1499-1509, 1987). El día 0, se irradió a los ratones mediante exposición a dosis letales (11Gy) de irradiación gamma con 137Cs, y luego se inyectaron 4 x 106 células de BM por vía intravenosa. Cinco días después de la transferencia, se le suministró a los ratones 26 µg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (Sigma, St. Louis, MO) por vía intravenosa para suprimir la síntesis de timidina endógena (George eí al., supra, 1999). Treinta minutos después, se le suministró a los ratones 3 µ Ci de 5-[ 25l]yodo-2'-desoxiuridina (Amersham Life Science, Arlington Heights IL) por vía intravenosa. El día 6, se extrajeron los bazos de los ratones receptores y se contaron con un contador gamma. Generación de BM de ratones quiméricos En resumen, se transfectaron 1x107 células Ly5.2 B6 c por vía intravenosa en ratones receptores con células NK debilitadas e irradiados (dosis de radiación absorbida = 11 Gy), como se describió previamente (Ogasawara eí al., Nature, 391: 701-703, 1998). Durante la reconstitución, los ratones fueron mantenidos con antibióticos. Preparación de Células NK Se enriquecieron células NK como se describió previamente (Ogasawara eí al. , J Immunol, 169: 3676-3685, 2002). En resumen, se incubaron células de bazo con mAb CD4 anti-ratón (clon GK1 .5) y mAb CD8 anti-ratón (clon 53-6.7), y después de ello, estas células se mezclaron con perlas magnéticas recubiertas con Ig anti-ratón de cabra y con Ig anti-rata de cabra (Advanced Magnetic, Inc, Cambridge, MA). Se eliminaron las células CD4, CD8, y positivas a Ig (slg) en la superficie mediante clasificación magnética de las células. Análisis de citometría de flujo Se usó una proteína de fusión que contenía el dominio extracelular NKG2D de ratón fusionado con lgG1 Fe (mNKG2D-lg) humana, para detectar ligandos NKG2D (Cerwenka eí ai., Immunity, 12:721 -727, 2000). Un fragmento de Fc? anti-lgG humana de cabra conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch , West Grove, PA) se usó como un reactivo de segundo paso. Las células (1 x 106) se tiñeron con 0.5 g de mNKG2D-lg y con 0.25 g de otros mAb. Para determinar cuáles ligandos NKG2D fueron expresados, se tiñeron las células con un mAb anti-panRAE-1 biotinilado, el cual reconoce todas las cinco proteínas RAE-1 conocidas (es decir, RAE-1 a, ß, ?, d y e), mAb anti-H60 o mAb anti-MULT1 biotinilado. Se usó estreptavidina conjugada con PE o estreptavidina conjugada con APC para detectar mAb biotinilados. Para la detección de NKG2D, se tiñeron células (-1 x 106) con 0.25 g de mAb anti-NKG2D biotinilada o marcada con PE (clon 191004). Las células fueron co-teñidas con mAb anti-CD43, anti-Ly6C/G, anti-CD 1 1 c, anti-B220, anti-CD3, anti-TER1 19, anti-NK1 .1 y anti-CD49d (DX5). Se incubaron las células con los mAb durante 20 min y se lavaron con PBS que contenía NaN3 al 0.01 %. SE analizaron las células usando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson , San José, CA). Se controlaron las poblaciones de linfocitos viables basándose en los perfiles de dispersión directa y lateral y en la ausencia de tinción con yoduro de propidio. Análisis citotóxico Se realizaron análisis de citotoxicidad redirigidos mediados por anticuerpo monoclonal como se describió previamente (Lanier eí al. , J Immunol, 141 :3478-3485, 1988). Se marcaron las células objetivo con 50 µCi de Na2(51Cr)O4 durante 2 h a 37 °C en medio RPMI-1640 que contenía 10% de FCS, se lavaron tres veces con el medio, y se usaron en análisis de citotoxicidad. Se mezclaron las células objetivo marcadas con 51Cr (5 x 103) y se mezclaron las células efectoras en receptáculos con fondo en U de una placa para microtitulación de 96 receptáculos en las proporcionas indicadas de efector/objetivo (E/T), por triplicado. Después de un periodo de incubación de 4 h, se recolectaron los supernadantes libres de células y se midió la radiactividad en un contador Micro-beta (Wallac, Turku, Finland). La liberación espontánea fue menor que 15% de la liberación máxima. El porcentaje liberación específica para 51 Cr se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: % de lisis específica = liberación(experimental - espontánea) x 100 / liberación(máxima - espontánea).

Expresión de ligandos NKG2D en células BM de ratón Los genes que codifican ligandos NKG2D son polimórficos; los ratones BALB/c (B/c) tienen genes RAE-1 a,ß y ?, mientras que los ratones C57BL/6 (B6) poseen genes RAE-1 d y e (Cerwenka y Lanier, Tissue Antigens, 61 :335-343, 2003). De manera similar, los ratones B/c pero no los ratones B6 expresan H60 (Malarkannan eí al. , J Immunol, 161 :3501 -3509, 1998). Se analizaron células de BM aisladas de ratones B/c, B6 y (BALB/c x C57BL/6) F1 (CB6F1 ) para determinar si los ligandos NKG2D son expresados en las células de BM . Se tiñeron las células con una proteína de fusión NKG2D-lgG Fe de ratón y se analizaron mediante citometría de flujo. Se detectaron niveles bajos de ligandos NKG2D en la superficie de células de BM de B/c recién aisladas, pero no en las células de BM de B6 (Fig. 13a). Con el fin de determinar cuáles ligandos NKG2D eran expresados, se tiñeron las células de BM con anticuerpos monoclonales (mAb) anti-pan RAE-1 , anti-H60 y anti-MULT1 . Se expresó RAE-1 y H60 en niveles bajos en células de BM B/c recién aisladas, mientras que no se detectó MULT1 (Fig. 13b). En contraste, no se detectó RAE-1 en esplenocitos de ratones B/c, B6 o CB6F1 . Estudios anteriores han establecido que las células NK en receptores F1 son capaces de rechazar injertos de médula ósea parental (Kiessling eí al. , Eur J immunol, 7: 655-663, 1977; Lotzova eí al. , Transplantation, 35:490-494, 1983; Murphy eí al., J Exp Med, 165, 1212-1217, 1987; y Murphy eí al. , Eur J Immunol, 20:1729- 1734, 1990). Los inventores contemplaron que las células BM de B/c que repueblan el bazo en un receptor CB6F1 irradiado expresan ligandos NKG2D. Así, durante el desarrollo de la presente invención , los ratones receptores CB6F1 fueron tratados previamente con un mAb anti-NK1 .1 para debilitar las células NK residentes y evitar así el rechazo de las células de BM de B/c trasplantadas. Como control, se reconstituyeron ratones CB6F1 irradiados con células de BM de CB6F1 singénicas. Siete días después del injerto, las células hematopoyéticas que repoblaron los bazos de los ratones CB6F1 fueron aisladas y analizadas para determinar la expresión de ligandos NKG2D. Como se muestra en la figura 13c, se detectaron ligandos NKG2D en las células hematopoyéticas aisladas de los bazos de BM de B/c->ratones CB6F1 , pero no en las células aisladas de los bazos de BM de CB6F1 -> ratones CB6F1 . Las células hematopoyéticas de B/c que reconstituyeron los bazos de los receptores CB6F1 irradiados expresaron predominantemente RAE- 1 , y no H60 o MULT1 (Fig. 13d). Con el fin de identificar la población de células hematopoyéticas que expresaron RAE-1 , se tiñeron células aisladas de BM de CB6F1 ->BM de CB6F1 y B/c -> de los bazos de receptores CB6F1 con mAb contra marcadores de linaje hematopoyético. El día 7 después del transplante, se detectó RAE-1 en la mayoría de las células aisladas de los bazos de BM de CB6F1 ->receptores CB6F1 . En contraste, no se detectó RAE-1 en una proporción sustancial en las células de los bazos de BM de CB6F1 BM-> receptores CB6F1 . Esencialmente, todas las células positivas a RAE-1 aisladas de la BM de B/c->receptores CB6F1 expresaron CD43 (Fig. 13e). También estaba presente RAE-1 en la mayoría de las células que expresaron la proteína Gr-1 (Ly-6C/G) asociada con granulocito y el marcador CD 1 1 b (Mac-1 ) asociado con célula mieloide. Solamente una fracción menor de células positivas a B220 (marcador asociado a las células B) y a Ter1 19 (un marcador asociado a eritrocito) expresaron RAE-1 , y no se detectó RAE-1 en las células T células T CD3+ (Fig . 13e). Está contemplado que las células B y las células T detectadas en los bazos fueron células residuales resistentes a la radiactividad del anfitrión de origen, debido a que es poco probable que las células T o células B pudieran haberse desarrollado a partir de las células de médula ósea del donante en menos de una semana después del transplante. Se detectó RAE-1 en un pequeño subconjunto de células que expresaron c-kit y Sca-1 , si bien la mayoría de las células positivas a RAE-1 no tuvieron estos marcadores (Fig. 13f). El estado de proliferación de las células que expresan RAE-1 en la BM de B/c ->receptores CB6F1 se evaluó inyectando BrdU a estos ratones a 2 h y 12 h antes de la recolección de las células de bazo el día 7 después del transplante. Como se muestra en la figura 13g, se detectó fácilmente RAE-1 en una fracción grande (pero no en toda) de las células progenituras proliferantes en los bazos de los receptores del trasplante.

En los experimentos iniciales, se trasplantó méd ula ósea completa a ratones CB6F1 , aislada de donantes B/c. Con el fin de averiguar si el RAE-1 se expresa en la progenie de células madre hematopoyéticas (H SC), se trató a ratones B/c con 5-fluorou racilo (5-FU) antes de recolectar la médula ósea para enriquecer las HSC, y luego se trasplantó la médula ósea de donantes tratados con 5-FU en receptores CB6F1 que fueron tratados previamente con mAb anti-N K1 .1 para debilitar las células N K residentes en el anfitrión . Las células de médula ósea recolectadas de los donantes tratados con 5-FU no expresaron RAE-1 . Cuando las células en los bazos de BM de B/c con 5-FU -> receptores CB6F1 fueron analizadas el día 8 después del transplante, esencialmente todas las células positivas a RAE-1 expresaron Ly-6C/G , CD 1 1 b y CD43, pero no CD3, Ter1 1 9, o B220. Una pequeña población de células positivas a RAE-1 expresó bajos niveles de c-kit y Sca-1 , a pesar de que una mayoría de células positivas a RAE-1 carecía de estos marcadores (Fig. 13i). Estos resultados indicaron que la mayoría de las células de B/c progenitores en los receptores CB6F1 con células NK debilitadas expresan RAE-1 . Desde el desarrollo de la presente invención , ha sido reportada la expresión de los ligandos NKG2D en células de médula ósea humanas proliferantes (Nowbakht eí al. , Blood, publicado electrónicamente el 1 8 de enero de 2005). Por ello, los inventores contemplan que los experimentos descritos aquí en ratones también son relevantes para los seres humanos .

El NKG2D está involucrado en la resistencia híbrida Durante el desarrollo de la presente invención, el hallazgo de que RAE-1 se expresaba en las células progenitoras proliferantes en los bazos de ratones CB6F1 reconstituidos con médula ósea B/c sugirió a los inventores que el NKG2D está involucrado en la resistencia híbrida. Esto fue confirmado mediante transferencia de células BM B/c en ratones CB6F1 irradiados, tratados previamente con un anticuerpo de control (clg), un mAb anti-NKG2D neutralizante, no debilitador (CX5) (Ogasawara eí al. , Immunity, 20: 757-767, 2004), o con el mAb anti-NK1.1 debilitador de células NK (PK136). La reconstitución de células hematopoyéticas de los ratones receptores se evaluó inyectando 25IUdR doce horas antes de recolectar los bazos el día 7. Los ratones tratados con clg rechazaron las células BM de B/c, y esto es consistente con los informes anteriores (Lotzova eí al. , Transplantation, 35:490-494, 1983), el debilitamiento de células NK en ratones CB6F1 evitó eficientemente el rechazo de las células B/c de médula ósea, lo que dio como resultado un aumento sustancial en la incorporación de los marcadores radiactivos en los bazos (Fig. 14a). El mAb anti-NKG2D no debilitador, neutralizante, también aumentó drásticamente la incorporación de 125I UdR, en forma comparable a los efectos del debilitamiento de células NK. La capacidad del tratamiento con mAb anti-NKG2D para prevenir el rechazo de células B/c de médula ósea se confirmó examinando las células que repoblaron los bazos el día 8 después del trasplante. Como se muestra en la figura 14b, las células positivas a RAE-1 que co-expresaron predominantemente CD43, Ly-6C/G, y CD1 1 b se detectaron en los bazos de ratones CB6F1 tratados con mAb anti NKG2D. En contraste, se recuperaron mucho menos células de los ratones tratados con Clg y muy pocas de estas células expresaron RAE-1 . Estos datos indicaron que el rechazo de células BM B/c en ratones CB6F1 positivas a RAE-1 es prevenido eficientemente ya sea mediante el debilitamiento de células NK o bloqueando el receptor de NKG2D. Las células NK eliminan células singénicas BM que expresan altos niveles de RAE-1 La capacidad del tratamiento con mAb anti-NKG2D para bloquear el rechazo de injerto de médula ósea parental en receptores F1 hizo surgir la pregunta de si el reconocimiento de H-2 parental por las células NK de F1 se requiere para el rechazo dependiente de NKG2D o si las células NK también pueden rechazar células singénicas de médula ósea siempre que RAE-1 se exprese en niveles suficientemente altos. Las células de médula ósea de CB6F1 repoblaron los receptores CB6F1 irradiados (Fig. 13c, e) y las células de médula de B6 que repoblaron los receptores B6 irradiados solamente expresaron niveles muy bajos de RAE-1 en comparación con las células de médula ósea que repoblaron B/c (Fig. 13d,e). En consecuencia, con el fin de evaluar si la expresión de RAE-1 en células de médula ósea de B6 o de CB6F1 podría ocasionar rechazo de injertos de médula ósea singénica, se generaron ratones transgénicos que expresan RAE-1 e activados por un promotor de ß-actina humana, dando como resultado la expresión de RAE-1 e en todos los tejidos. Como se muestra en la figura 15a, el nivel de expresión de RAE-1 e en células recién aisladas de médula ósea de ratones transgénicos B6 RAE-1 e, es similar a los niveles de RAE- 1 presentes en las células B/c de médula ósea repobladoras (Fig .13d ,e). Se sometieron a prueba células de médula ósea recién aisladas de los ratones B6 transgénicos con RAE-1 e como objetivos para células NK no transgénicas, con activación singénica I L-2 en un análisis de citotoxícidad in vitro estándar. Como se muestra en la figura 15b, las células NK activadas eliminaron las células de médula ósea de B6 RAE-1 e transgénicos recién aisladas, pero no las células de médula ósea de B6 no transgénicos negativas a RAE-1. Se bloqueo la citotoxicidad mediante un mAb anti-NKG2D, lo que demuestra que la eliminación es dependiente de NKG2D. De acuerdo con los resultados in vitro, los ratones B6 no transgénicos irradiados rechazaron las células de médula ósea de donantes B6 RAE-1 e transgénicos. De manera importante, se evitó el rechazo en ratones tratados con el mAb anti-NKG2D neutralizante, pero no en ratones tratados con una Ig de control (Fig. 15c). Se obtuvieron resultados similares cuando los ratones B/c RAE-1 e transgénicos fueron cruzados con ratones B/c ratones y se injertó médula ósea de CB6F RAE-1 e transgénicos en receptores CB6F1 no transgénicos. Las células de médula ósea de CB6F1 RAE-1 e transgénicos, a diferencia de las células de médula ósea de CB6F1 no transgénicos (Fig.13c, e), expresaron altos niveles de RAE-1 e y fueron rechazador por los receptores de CB6F1 no transgénicos (Fig . 15d). Se evitó el rechazo mediante la administración del mAb anti-NKG2D neutralizante, no debilitador o mediante el debilitamiento de células NK con mAb anti-NK1 .1 . Colectivamente, estos hallazgos demuestran que las células NK de B6 y de CB6F1 pueden rechazar células de médula ósea H-2 idénticas, siempre que las células de médula ósea expresen RAE-1. DAP10 y DAP12 en rechazo de BM mediado por NKG2D En los ratones, el empalme alternativo de ARN de transcriptos de NKG2D genera dos isoformas de proteína denominadas NKG2D-S y NKG2D-L. La NKG2D-L se expresa predominantemente en células NK en reposo, y se asocia con la proteína adaptadora DAP10, mientras que la NKG2D-S es inducida por la activación de células NK y se asocia ya sea con DAP10 o con DAP12 (Diefenbach eí al. , Nat Immunol, 3:1 142-1 149, 2002). Se trasplantaron células de médula ósea de ratones B6 transgénicos con RAEl e en receptores C57BL/6 DAP10-/-, y DAP12-/-, de tipo natural , irradiados, con el fin de determinar si DAP10 o DAP12 o ambos adaptadores están involucrados en el rechazo mediado por NKG2D. Se inyectó a los ratones con 125I UdR el día 5 y los bazos se recolectaron y se contaron el día 6. En comparación con los ratones B6 de tipo natural, los ratones B6 DAP10-/- demostraron una deficiencia significativa en el rechazo de trasplante de médula ósea de B6 con RAEl e transgénicos (Fig. 16a). En contraste, los receptores B6 con DAP12-/- rechazaron la médula ósea de B6 con RAEl e transgénicos más eficientemente que los ratones B6 DAP 10-/-, a pesar de que lo hicieron ligeramente menos bien que con los ratones B6 de tipo natural (Fig. 16b). Todos los ratones B6 DAP10-/- y DAP12-/- de tipo natural , fallaron en el rechazo del injerto de médula ósea de B6 con RAEl e transgénicos cuando se trataron con el mAb anti-NK1 .1 debilitador o con el mAb anti-NKG2D neutralizante, no debilitador. Estos resultados indican un papel predominante de DAP10, y un papel menor de DAP12, en el rechazo de médula ósea dependiente de NKG2D. No obstante, no es necesario un entendimiento del mecanismo para hacer y usar la invención. Resistencia híbrida por defecto en ratones con RAEl e La activación de células NK de ratones NOD induce la expresión de RAE-1 , lo cual tiene como resultado la modulación de NKG2D dependiente del ligando en las células NK (Ogasawara eí al. , Immunity, 18,41 -51 ,2003). El análisis de la expresión de NKG2D en la superficie de las células NK de los ratones B6 con RAEl e transgénicos reveló una expresión de NKG2D reducida cuando se compara con la de las células NK de ratones de tipo natural (Fig. 17a). Si bien la cantidad de de NKG2D en los ratones B6 con RAEl e transgénicos fue disminuida sustancialmente, la cantidad de células NK en los bazos y la expresión de NK1 .1 , Ly-49D, Ly-49A, Ly-49C/I, Ly-49F/I/C/H, y Ly-49G2 en las células NK fue similar a la de las células NK de tipo natural. Para examinar si la función de NKG2D función es impedida en las células NK transgénicas con RAEl e, se llevó a cabo un análisis de citotoxicidad redirigido al anticuerpo usando clg , mAb anti-NKG2D y mAb anti-NK1 .1 s. Si bien la actividad citotóxica dependiente de NK1 .1 de las células N K transgénicas con RAE-1 e fue idéntica a la de las células NK de B6, la citotoxicidad dependiente de NKG2D fue impedida en las células NK transgénicas con RAEl e (Fig. 17b). El transgen RAEl e es activado por un promotor ß-actina en estos ratones transgénicos, y por lo tanto, las células NK de estos animales co-expresan tanto el ligando como el receptor. Con el fin de determinar si las células NK de tipo natural (no transgénicas) son inactivadas in vivo por la exposición constante a los ligandos NKG2D, se generaron quimeras de médula ósea transplantando médula ósea de B6 congénica Ly5.2 en receptores transgénicos B6 (Ly5.1 ) con RAEl e irradiados letalmente. Tres meses después del transplante, la cantidad de células N K en los bazos y la expresión de NK1 .1 (Fig. 17c), Ly-49D, Ly-49A, Ly-49 C/l , Ly-49F/I/C/H y Ly-49G2 en BM Ly5.2->ratones transgénicos con RAEl e fue similar a la de BM Ly5.2-> ratones B6 de tipo natural. En contraste, la expresión de NKG2D en las células NK disminuyó fuertemente en BM Ly-5.2->ratones transgénicos con RAEl e (Fig. 17c). De manera consistente con los niveles disminuidos de NKG2D en las células NK, la actividad citotóxica dependiente de NKG2D fue disminuida en BM Ly-5.2 - > ratones transgénicos con RAEl e , según se determinó mediante un análisis de citotoxicidad redirigido al anticuerpo in vitro (Fig. 17d). Los inventores también investigaron si las células de BM de ratones transgénicos con RAEl e fueron rechazadas en BM Ly-5.2 B6 -> receptores transgénicos con RAEl e. Tal como se esperaba, las células NK en los Ly5.2 B6 de tipo natural -> ratones B6 de tipo natural rechazaron las células de BM transgénicas con RAEl e eficientemente (Fig. 17e). En contraste, las células NK que se desarrollaron en BM Ly-5.2 B6-> ratones transgénicos con RAEl e fallaron en rechazar las células BM transgénicas con RAEl e (Fig. 17). Estos hallazgos indicaron que la modulación de NKG2D de las células NK es ocasionada por la interacción con células receptoras que expresan RAE-1 in vivo, resistentes a la irradiación, y esto da como resultado una disminución de la función de NKG2D in vivo. No obstante, no es necesario un entendimiento del mecanismo para hacer y usar la invención. Para investigar si la resistencia híbrida a F1 es afectada por los niveles disminuidos de NKG2D en las células NK en los ratones transgénicos con RAEl e , se cruzaron ratones transgénicos con ratones B/c, y los ratones transgénicos CBF1 con RAEl e fueron sometidos a prueba para determinar su capacidad de rechazar células de BM de B/c parentales. A diferencia de los ratones CB6F1 de tipo natural , los ratones CB6F1 transgénicos con RAEl e fallaron en rechazar las células de BM de B/c (Fig. 17f). Más aún, el tratamiento con mAb anti-NK1.1 o con mAb anti-NKG2D mAb no afectó la incorporación de 125I UdR de las células de BM en los receptores CB6F1 transgénicos con RAEl e. Sin embargo, el debilitamiento de las células NK o el bloqueo de NKG2D permitió el injerto de células de médula ósea de B/c en receptores CB6F1 de tipo natural. Por ello, como se demostró aquí, el NKG2D está implicado como un componente importante en la resistencia híbrida a F1. Ejemplo 7 Bloqueo de NKG2D para la prevención y tratamiento de artritis reumatoide Esto se puede someter a prueba en un modelo animal de artritis crónica, en donde se puede demostrar que el NKG2D está presente en el sitio de inflamación. Un ejemplo de este tipo de modelo es el de artritis crónica inducida por colágeno (Malfait eí al. , Arthritis and Rheumatism 44: 1215-1224,2001 ). Recientemente, se encontró que las células T CD4+ CD28- en la sangre periférica y en los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide expresan NKG2D, mientras que se encontró que los sinoviocitos inflamados expresan de manera aberrante los ligandos M IC de NKG2D (Groh eí al. , Proc Nati Acad Sci USA, 100: 9452-9457, 2003). Por ello, los inventores contemplan que las composiciones y métodos para bloquear NKG2D descritos aquí, también son apropiados para la prevención y tratamiento de la artritis reumatoide. Los siguientes experimentos se realizan para someter a prueba el efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la artritis reumatoide (RA) en un sistema modelo animal, el ratón DBA/I . En resumen, se induce artritis por colágeno (CÍA) de tipo II en ratones machos DBA/1 de 6 a 7 semanas de edad mediante inyección intradérmica en la base de la cola de 100 µg de colágeno I I bovino complementado con 2.0 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37RA emulsificado en adyuvante de Freund completo, según se describe (Seo eí al. , Nat Med, 10:1088-1094, 2004). Se le asigna una calificación a la inflamación en las articulaciones desde 1 hasta 4, con una puntuación máxima de 16 por ratón. La gravedad clínica de la artritis se califica como sigue: 0, normal; 1 , inflamación ligera y/o eritema; 2, inflamación edematosa sustancial; 3, inflamación edematosa sustancial mas ligera rigidez en la articulación; o 4, laxitud (Véase, por ejemplo, Williams eí al. , Proc Nati Acad Sci USA, 89:9784-9788, 1992). Cada pata se califica, permitiendo una puntuación clínica máxima de 16 para cada animal.

La inflamación de las patas traseras se mide con un par de calibres.

Se inyecta a los ratones 200 µg de un mAb anti-NKG2D o un mAb coincidente con un isotipo de control IP, los días 0, 2, 4, 6 y 8 o los días 0, 3, 7 y 10 después de la inmunización. Los inventores contemplan que el tratamiento con IgG de control da como resultado el desarrollo de artritis grave comenzando aproximadamente 28 días después de la inmunización (por ejemplo, gravedad mayor de 10; incidencia mayor de 80%, y espesor de la pata mayor de 3.5 mm). En contraste, se espera que el tratamiento con mAb anti-NKG2D dé como resultado la supresión de la enfermedad, la cual se manifiesta como una disminución en la gravedad de la artritis y en la incidencia, así como también un espesor de pata reducido y una histopatología de la articulación reducida con relación a los animales de control tratados con mAb (por ejemplo, gravedad menor que 10, preferiblemente menor que 5 y más preferiblemente menor que 2; incidencia menor que 80%, preferiblemente menor que 50%, y más preferiblemente menor que 20%; y espesor de la pata menor que 3.5 mm, preferiblemente menor que 3.0 mm, y más preferiblemente menor que 2.5 mm). Para tratar la CÍA establecida, ratones son inyectados los días 28, 30, 32, 34 y 36 o los días 28, 31 , 35 y 38 después de la inmunización. Los ratones son divididos luego en dos grupos con iguales puntuaciones medias de artritis el día 28 después de la inmunización, y se tratan con mAb de control, o con mAb anti-NKG2D los días 28, 30, 32, 34 y 36 después de la inmunización. Está contemplado que la artritis se revierta solamente en el grupo tratado con mAb anti-NKG2D (por ejemplo, reducción en la gravedad de la enfermedad, incidencia, espesor de la pata e histopatología de la articulación). Más aún, los inventores contemplan que el tratamiento con mAb anti-NKG2D dará como resultado una disminución en la cantidad de células que expresan NKG2D presentes en las articulaciones de los sujetos artríticos, así como también una reducción en los niveles de citocinas inflamatorias (por ejemplo, FNT-a, IL-15, etc.) en el fluido sinovial.

Ejemplo 8 Blog ueo de NKG2D para la prevención y tratamiento de la enfermedad celiaca El MIC se expresa fuertemente en la superficie epitelial de los intestinos en pacientes con enfermedad celiaca (CD), el cual a su vez co-activa los linfocitos T intra-epiteliales (I EL) por medio de NKG2D , lo que conduce a la citólisis de células epiteliales objetivo (Meresse eí al. , immunity, 21 : 357-366, 2004; y Hue eí al. , Immunity, 21 : 367-377, 2004). Los inventores contemplan que las composiciones y métodos para bloquear NKG2D descritos aquí, son también apropiados para la prevención y tratamiento de la enfermedad celiaca. El efecto del bloqueo de NKG2D en el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) se someterá a prueba en un modelo animal apropiado, tal como, por ejemplo, uno de los siguientes dos modelos de colitis de ratón: inducida por TNB (Chin eí al., Digestive Diseases and Sciences 39:513-525, 1994) o modelo transferido por célula T (Powrie eí al. , Int Immunol 5: 1461 y sig. , 1993) en ratones scid. Todas las referencias, incluyendo publicaciones, solicitudes de patente y patentes, citadas aquí, están incorporadas aquí mediante referencia en la misma extensión que si cada referencia fuera indicada individual y específicamente para ser incorporada como referencia, y se hubiera expuesto en su totalidad aquí (en la extensión máxima permitida por la ley). Todos los títulos y sub-títulos se usan aquí solamente por conveniencia y no deben ser interpretados como limitantes de la invención en forma alguna. Cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas sus variaciones posibles está comprendida por la invención, a menos que se indique aquí otra cosa o se contradiga claramente por el contexto. El uso de los términos "un" , "una", "uno" y "el", "la", "lo" , "los" , y referentes similares en el contexto de descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones), debe ser interpretado como que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí otra cosa o que claramente se contradiga por el contexto. La mención de rangos o valores aquí solamente tiene la intención de servir como un método breve para referirse individualmente a cada valor separado que caiga dentro del rango, a menos que se indique aquí otra cosa, y cada valor separado está incorporado en la especificación como si fuera declarado aquí individualmente. A menos que se declare otra cosa, todos los valores exactos proporcionados aquí son representativos de valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los ejemplos de valores proporcionados con respecto a un factor o medición particular puede considerarse que también proporciona una medición aproximada, modificada por "aproximadamente", en donde sea apropiado). Todos los métodos descritos aquí se pueden llevar a cabo en cualquier orden apropiado, a menos que se indique aquí otra cosa, o que se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o del lenguaje de los ejemplos (por ejemplo, "tal como") proporcionado aquí, solamente tiene la intención de iluminar mejor la invención y no de poner una limitación en el alcance de la invención , a menos que se reivindique otra cosa. Ningún lenguaje en la especificación debe ser interpretado como indicador de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención . La cita e incorporación de documentos de patente se hace aquí solamente por conveniencia, y no refleja ninguna visión de la validez, patentabilidad y/o aplicación de estos documentos de patente. Una descripción aquí de un aspecto o modalidad de la invención usando términos tales como "comprende", "tiene", incluye", o "contiene", un elemento particular, tiene la intención de proporcionar apoyo para un aspecto o modalidad de la invención que "consiste en" "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento particular, a menos que se declare otra cosa o que se contradiga claramente por el contexto. Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia en cuestión enumeradas en las reivindicaciones anexas, tal como están permitidas mediante la ley aplicable.

Claims

REIVI N DICACIONES

1 . Un método para tratar o prevenir un síndrome asociado con la activación mediada por NKG2D , el método comprende poner en contacto leucocitos que expresan N KG2D con un agente que reduce la activación de N KG2 D inducida por ligando de las células bajo condiciones apropiadas para tratar o prevenir el síndrome.

2. El método de la reivindicación 1 , caracterizado además porq ue dicho contacto da como resultado una reducción de al menos 30% en la activación de NKG2D inducida por ligando.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado además porque dicho agente reduce la interacción de NKG2D con DAP1 0.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado además porque dicho agente reduce la cantidad de NKG2D en la superficie de las células.

5. El método de la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha reducción en la cantidad de NKG2D en la superficie cel ular ocurre bajo condiciones en las cuales uno o más de de M I CA, M I CB , U LB P 1 , ULB P2, ULBP3, o U LB P4 no puede disminuir la cantidad de N KG2D en la superficie cel ular.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado además porque dicho agente aumenta la tasa a la cual el NKG2D en la superficie celular es internalizado.

7. El método de la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho aumento en la tasa de internalización de NKG2D ocurre bajo condiciones en las cuales uno o más de MICA, MICB, ULBP 1, ULBP2, ULBP3, o ULBP4 no puede aumentar la tasa de internalización de NKG2D.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado además porque dicho contacto reduce la señalización a través del complejo de ligandos NKG2D-NKG2D.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado además porque los leucocitos se seleccionan del grupo que consiste en células T CD8+ NKG2D + , células T CD4+ NKG2D + , células T NKG2D+?d, células NK NKG2D + , y macrófagos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado además porque dicho contacto da como resultado menos de aproximadamente 10% de reducción en la cantidad de leucocitos que expresan NKG2D con relación a un control.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado además porque dicho agente contiene un anticuerpo que se une a NKG2D o un fragmento de él que se une a NKG2D.

12. Ei método de la reivindicación 11, caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

13. El método de la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho anticuerpo monocional es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado además porque dicho agente contiene un ácido nucleico que reduce la transcripción o traducción de ácidos nucleicos que codifican NKG2D.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome es diabetes mellitus de tipo I .

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome es rechazo de trasplante.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome no es diabetes mellitus de tipo I.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome es artritis reumatoide.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome es enfermedad cellaca.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, caracterizado además porque dicho síndrome es esclerosis múltiple.

21 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 20, caracterizado además porque la expresión del ligando NKG2D es elevada en las células de un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 21 , caracterizado además porque dichas condiciones dan como resultado una reducción en los linfocitos que infiltran un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 22, caracterizado además porque dichas condiciones dan como resultado una reducción en los niveles de interferón gamma en un órgano o tejido afectado por dicho síndrome.

24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 23, caracterizado además porque dicho agente reduce la proliferación de dichos leucocitos.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 24, caracterizado además porque el método comprende tratar un paciente humano al cual se le ha diagnosticado que tiene el síndrome.

26. Un método para el tratamiento o prevención de un síndrome asociado con activación mediada por NKG2D en un paciente humano, que comprende administrar a un paciente humano un agente que reduce la activación de NKG2D inducida por ligando de leucocitos que expresan NKG2D en una cantidad efectiva y bajo condiciones apropiadas para tratar o prevenir el síndrome.

27. Un estuche que contiene un modulador de NKG2D e instrucciones para poner en contacto un leucocito con un modulador de NKG2D bajo condiciones apropiadas para tratar o prevenir un síndrome asociado con la activación de leucocitos mediada por NKG2D.

28. Un método para identificar un agente modulador de NKG2D, que comprende: i) poner en contacto un leucocito NKG2D+ con un agente de prueba; y ii) medir la expresión de NKG2D por dicho leucocito.

29. El método de la reivindicación 28, caracterizado además porque medir la expresión de NKG2D comprende uno o más de medir la transcripción, la traducción, y la internalización de NG2K.

30. Un método para identificar un agente modulador de NKG2D, que comprende: i) poner en contacto un leucocito NKG2D+ con un agente de prueba; y ii) medir la activación de NKG2D inducida por ligando de dicho leucocito.

31. El método de la reivindicación 30, caracterizado además porque medir la activación de NKG2D inducida por ligando comprende uno o más de medir la fosforilación de DAP10, la actividad de quinasa p85 PI3, la actividad de quinasa Akt, la producción de IFN-?, y la citólisis de una célula objetivo NKG2D+.

32. Uso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria asociada con activación mediada por NKG2D.

33. El uso de la reivindicación 32, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aumenta la tasa a la cual el N KG2D en la superficie celular es internalizado.

34. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32 y 33, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.

35. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32 hasta 34, caracterizado además porque la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.

36. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32 hasta 34, caracterizado además porque la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.

37. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 32 hasta 34, caracterizado además porque la enfermedad autoinmunitaria no es diabetes mellitus de tipo I .

38. Uso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a NKG2D y es capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar estas células, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de rechazo de trasplante.

39. Un método para identificar un agente terapéutico o profiláctico para condiciones inflamatorias asociadas con activación mediada por NKG2D, que comprende identificar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo por su capacidad para unirse específicamente a N KG2D y entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK, sin debilitar significativamente estas células.

40. El método de la reivindicación 39, caracterizado además porque los anticuerpos o frag mentos de anticuerpo son detectados además por su capacidad para inducir internalizacíón de N KG2D en la superficie de cél ulas T o células NK N KG2D+.

41 . El método de la reivindicación 39 o 40, caracterizado además porque los anticuerpos son anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados.

42. Un método para identificar un agente terapéutico o profiláctico para condiciones inflamatorias asociadas con activación mediada por NKG2D, q ue comprende detectar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo por su capacidad para unirse a NKG2D e inducir la internalización de NKG2D en la superficie celular, sin debilitar significativamente estas células.

43. Un método para entorpecer la expansión de células NKG2D+ en un anfitrión mamífero que sufre, o que está en riesgo sustancial de desarrollar una condición inflamatoria asociada con la actividad de NKG2D , que comprende suministrar a u n anfitrión mam ífero un anticuerpo específico para N KG2D y capaz de entorpecer la expansión de células T NKG2D+ o células NK sin debilitar significativamente estas células , bajo condiciones y en una cantidad efectiva para entorpecer la expansión de las células NKG2D+ en el anfitrión mam ífero.

44. Un método para estimular la internalización celular de NKG2D en células que expresan NKG2D en un anfitrión que sufre o que está en riesgo sustancial de desarrollar una condición inflamatoria y/o enfermedad autoinmunitaria asociada con la actividad de NKG2D, que comprende suministrar al anfitrión un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se fija específicamente a NKG2D y es capaz de estimular la internalización celular de NKG2D sin activación efectiva por la(s) ruta(s) de señalización mediada por NKG2D, bajo condiciones y en una cantidad efectiva para estimular la internalización celular de NKG2D en células que expresan NKG2D.