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ES2328591T3 - Procedimiento para la purificacion de conjugados de albumina. - Google Patents

Procedimiento para la purificacion de conjugados de albumina. Download PDF

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ES2328591T3
ES2328591T3 ES05735795T ES05735795T ES2328591T3 ES 2328591 T3 ES2328591 T3 ES 2328591T3 ES 05735795 T ES05735795 T ES 05735795T ES 05735795 T ES05735795 T ES 05735795T ES 2328591 T3 ES2328591 T3 ES 2328591T3
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conjugate
albumin
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ES05735795T
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English (en)
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Nathalie Bousquet-Gagnon
Omar Quraishi
Dominique P. Bridon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ConjuChem Biotechnologies Inc
Original Assignee
ConjuChem Biotechnologies Inc
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Abstract

Un procedimiento para la separación de conjugado de albúmina de albúmina no conjugada en una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada, comprendiendo el procedimiento: (a) cargar dicha solución en un soporte sólido hidrófobo equilibrado en tampón acuoso que tiene una alta concentración de sal; (b) aplicar a dicho soporte un gradiente de concentración de sal decreciente; y (c) recoger dicho conjugado de albúmina.

Description

Procedimiento para la purificación de conjugados de albúmina.
Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención
Esta invención se refiere a un procedimiento de purificación para el aislamiento de conjugados de albúmina de una solución que comprende tanto conjugados de albúmina como albúmina no conjugada.
(b) Descripción de la técnica anterior
Los documentos WO 95/10302 y WO 99/24074 describen la formación de conjugados de albúmina en los que la molécula de interés presenta una funcionalidad reactiva acoplada a la misma que está adaptada para unirse covalentemente a albúmina, formando de este modo un conjugado. Estos conjugados se pueden formar in vivo, pero también se pueden formar in vitro. La formación del conjugado in vitro implica la adición de una molécula acoplada a una funcionalidad reactiva a una solución de albúmina. Los productos finales primarios de esta reacción son albúmina no conjugada, el conjugado de albúmina y la molécula no reaccionada acoplada con la funcionalidad reactiva.
Sería muy deseable proporcionar un procedimiento de purificación de conjugado de albúmina de una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para la separación de conjugado de albúmina de albúmina no conjugada en una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada, comprendiendo el procedimiento:
a)
cargar la solución en un soporte sólido hidrófobo equilibrado en tampón acuoso que presente un alto contenido de sal;
b)
aplicación al soporte un gradiente de contenido de sal decreciente; y
c)
recoger el conjugado de albúmina eluido.
En una realización preferida de la presente invención el conjugado de albúmina consiste en una molécula que presenta un aceptor de Michael acoplado covalentemente a la misma que se une a albúmina, y más preferiblemente el enlace está entre el aceptor de Michael y cisteína 34 de albúmina.
En una realización más preferida de la presente invención el aceptor de Michael es un grupo maleimida, y más preferiblemente, el grupo maleimida es ácido maleimida-propiónico (MPA). El aceptor de Michael está acoplado de forma opcional a la molécula mediante un adaptador. El adaptador se selecciona preferiblemente del grupo constituido por motivos hidroxietílicos tales como ácido (2-amino)epoxi-acético (AEA), etilendiamina (EDA), ácido 2-[2-(2-amino)etoxi)]etoxiacético (AEEA), ácido aminoetoxietilaminosuccínico (AEEAS); una o más motivos de cadenas de alquilo (C1-C10) tales como glicina, ácido 3-aminopropiónico (APA), ácido 8-aminooctanoico (AOA), ácido octanoico (OA), ácido 4-aminobenzoico (APhA). Son adaptadores preferidos OA, ADE, AEA, AEEA y AEEAS. Se puede usar también una combinación de dos adaptadores tales como, por ejemplo, AEEA-EDA, AEEA-AEEA, AEEAS-AEEAS y AEA-AEEA.
En una realización preferida de la presente invención la albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina de suero, albúmina recombinante y albúmina de una fuente genómica.
En una realización preferida de la presente invención, la albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina humana, albúmina de rata, albúmina de ratón, albúmina de cerdo, albúmina bovina, albúmina de perro y albúmina de conejo, más preferiblemente albúmina de suero humano.
En una realización preferida la albúmina es modificada con al menos uno seleccionado del grupo constituido por ácidos grasos, iones metálicos, moléculas pequeñas que presentan gran afinidad con la albúmina, y azúcares, tales como, pero sin limitarse a estos, glucosa, lactosa y manosa.
En una realización preferida de la presente invención, la molécula se selecciona del grupo constituido por un péptido, ADN, ARN, molécula orgánica pequeña y una combinación de los mismos. El péptido tiene preferentemente un peso molecular de al menos 57 daltons. Se pretende que el péptido incluya, pero sin limitarse a estos, GLP-1, GLP-2, ANP, K5, dinorfina, GRF, insulina, péptidos natriuréticos, T-20, T-1249, C-34 y PYY. La molécula pequeña se pretende que incluya, pero sin limitarse a estas, vinorelbina, gemcitabina y paclitaxel. En una realización más preferida de la presente invención, cuando la molécula es un ADN, ARN o una molécula orgánica pequeña, está unida covalentemente a la albúmina a través de un enlace covalente sensible a ácido o una secuencia de péptidos susceptible de escisión proteolítica, con lo que se posibilita la separación de la molécula de albúmina y la entrada de la molécula en una célula.
En una realización preferida de la presente invención, el soporte sólido hidrófobo es una columna que contiene una resina hidrófoba tal como, pero sin limitar a estas, octilsefarosa, fenilsefarosa y butilsefarosa y más preferiblemente butilsefarosa.
En otra realización preferida de la presente invención, el soporte sólido hidrófobo que comprende un ligando hidrófobo tal como Cibacron Blue F3G-A, grupos éter o isopropilo junto con un soporte tal como matriz de poliestireno/divinilbenceno.
Las sustancias se separan en base a sus resistencias variables de interacciones hidrófobas con ligandos hidrófobos inmovilizados a una matriz no cargada. Esta técnica se lleva a cabo normalmente con concentraciones moderadamente altas de sales (1 M) en el tampón de partida (adsorción promovida por sal). La elución se consigue mediante una reducción lineal o en etapas en la concentración de sal.
El tipo de ligando, el grado de sustitución, el pH y el tipo y concentración de sal usados durante la fase de adsorción tienen un efecto profundo en el rendimiento global (por ejemplo, selectividad y capacidad) de una matriz de HlC (matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica).
El disolvente es uno de los parámetros más importantes que influyen en la capacidad y selectividad en HIC (cromatografía de interacción hidrofóbica). Por lo general el proceso de adsorción es más selectivo que el proceso de desorción. Por tanto es importante optimizar el tampón de partida en lo que respecta a pH, tipo de disolvente, tipo de sal y concentración de sal. La adición de diversas sales "de efecto de saturación" ("salting-out") a la muestra promueve las interacciones de ligando-proteína en HIC. Cuando la concentración de sal aumenta, la cantidad de proteína unida aumenta hasta el punto de precipitación de la proteína. Cada tipo de sal difiere en su capacidad para promover interacciones hidrofóbicas. La influencia de diferentes sales en interacción hidrofóbica sigue las series de Hofmeister bien conocidas siguientes:
Series de Hofmeister
Efecto de saturación con sales
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Aniones
PO_{4}^{3-} > SO_{4}^{2-} > CH_{3}COO^{-} > Cl^{-} > Br > NO_{3}^{-} > ClO_{4}^{-} > SCN^{-}
Efecto caotrópico
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Cationes
NH_{4}^{+} < Rb^{+} < K^{+} < Na^{+} < Cs^{+} < Li^{+} < Mg^{2+} < Ba^{2+}
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Aumentando el efecto de saturación con sales se refuerza las interacciones hidrofóbicas, mientras que aumentando el efecto caotrópico se debilitan. Por lo tanto el sulfato de amonio muestra un efecto de saturación con sales más fuerte que el cloruro de sodio. Las sales más habitualmente usadas para HIC son sulfato de amonio ((NH4)_{2}SO_{4}), sulfato de sodio ((Na)_{2}SO_{4})), sulfato de magnesio (MgSO_{4}), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y acetato de amonio (CH_{3}COONH_{4}).
La unión de proteína a adsorbentes de HIC es promovida mediante concentraciones de moderadas a altas de sales "de efecto de saturación", la mayoría de las cuales también tienen una influencia estabilizante sobre la estructura de la proteína debido a su exclusión preferencial de proteínas globulares nativas, es decir, la interacción entre la sal y la superficie de la proteína es termodinámicamente desfavorable. La concentración de sal debería ser suficientemente alta (por ejemplo, de 500 a 1000 mM) para promover las interacciones ligando-proteína aún por debajo de la que provoca la precipitación de la proteína en la muestra. En el caso de albúmina la concentración de sal debería mantenerse por debajo de 3 M (moles por litro). El mecanismo principal de de saturación con sales consiste en el aumento inducido por sal de la tensión superficial de agua (Melander and Horváth, 1977). Por tanto una estructura compacta llega a ser energéticamente más favorable debido a que corresponde a menor área interfacial de la solución de proteína.
De forma interesante se ha encontrado que en las mismas condiciones (es decir, tampón compuesto por SO_{4}^{2-}, PO_{4}^{2-} o CH_{3}COO- con cualquier contraión), estas sales muestran su efecto de saturación con sales esencialmente sobre toda la albúmina conjugada descrita en esta invención de una forma diferente a la albúmina no conjugada (es decir, mercaptoalbúmina y albúmina bloqueada con cisteína), permitiendo así una separación cromatográfica consistente entre albúmina conjugada frente a albúmina no conjugada. Es decir, se ha observado que se requieren menores concentraciones de sal para promover interacciones entre el ligando y la albúmina conjugada que entre el ligando y la albúmina no conjugada. Esta separación cromatográfica es esencialmente independiente de (a) la secuencia de albúmina (por ejemplo, humana, ratón, rata, etc.) (b) la fuente de albúmina (es decir, derivado de plasma o recombinante) (c) el peso molecular de la molécula conjugada, (d) la posición del aceptor de Michael (o grupo maleimida) dentro de la estructura de la molécula, (e) la secuencia de péptidos o estructura química de la molécula, y (f) la estructura tridimensional de la molécula conjugada, por ejemplo, estructura lineal frente a bucle.
En una realización preferida de la presente invención la sal del tampón acuoso tiene un efecto de saturación con sales suficiente. Para proporcionar un efecto de saturación con sales suficiente, la sal es preferiblemente, pero sin limitarse a esta, fosfato, sulfato y acetato. Más preferiblemente, la sal es fosfato o sulfato. La selección del catión del tampón es menos crítica y por tanto se puede seleccionar tal catión, sin limitación, del grupo constituido por NH^{4+}, Rb^{+}, K^{+}, Na^{+}, Cs^{+}, Li^{+}, Mg^{2+} y Ba^{2+}.
El tampón acuoso es preferiblemente fosfato de amonio, sulfato de amonio y fosfato de magnesio y más preferiblemente sulfato de amonio.
En una realización preferida de la presente invención el pH del tampón está preferiblemente entre 3,0 y 9,0; más preferiblemente entre 6,0 y 8,0 e incluso más preferiblemente el pH es 7,0.
En una realización preferida de la presente invención el tampón y el soporte sólido hidrófobo están a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) o a 4ºC o entre ambas.
La tabla 1 muestra un ejemplo del efecto de diferentes sales para la purificación de conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 preformado de una solución de HSA usando resina de butil-sefarosa (se describe la estructura del primer análogo de GLP-1 en el ejemplo 1 siguiente).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
1 
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El término "péptido" se pretende que signifique una secuencia de aminoácido que presente un peso molecular de al menos 57 daltons. La secuencia peptídica puede ser circular (estructura en bucle) tal como ANP, puede contener más de una cadena de aminoácido tal como insulina o puede ser lineal tal como K5, dinorfina A, C-34 y GLP-1.
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Breve descripción de los dibujos
Cada figura muestra la detección por LC/EMS (cromatografía líquida/microscopio electrónico de barrido) del contenido en fracciones eluidas en continuo de la cromatografía llevada a cabo de acuerdo con la presente invención para la separación/purificación de los compuestos descritos en cada ejemplo. Cada fracción se ha desalado y concentrado antes de su detección por LC/EMS como se describe en esta invención a continuación en "procedimiento para la purificación de acuerdo con una realización preferida".
La figura 1 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 1;
La figura 2 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GRF (SEC ID nº 2) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 2;
La figura 3 ilustra la purificación del HSA no conjugado mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 3;
La figura 4 ilustra la purificación del conjugado rHSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 4;
La figura 5 ilustra la purificación de HSA mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 5;
La figura 6 ilustra la purificación del conjugado HSA: análogo de K5 (SEC ID nº 3) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 6;
La figura 7 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer derivado de insulina que presenta modificación en la cadena A (SEC ID nº 4) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 7;
La figura 8 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo derivado de insulina que presenta modificación en la cadena A (SEC ID nº 5) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 8;
La figura 9 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de C34 (SEC ID nº 6) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 9;
La figura 10 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de C34 (SEC ID nº 7) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 10;
La figura 11 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de C34 (SEC ID nº 8) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 11;
La figura 12 ilustra la purificación de L-cisteína mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 12;
La figura 13 ilustra la purificación de L-cisteína:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 13;
La figura 14 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 9) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 14;
La figura 15 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 10) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 15;
La figura 16 ilustra la purificación del conjugado HSA:cuarto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 11) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 16;
La figura 17 ilustra la purificación del conjugado HSA:quinto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 17;
La figura 18 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 13) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 18;
La figura 19 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de exendina-4 (SEC ID nº 14) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 19;
La figura 20 ilustra la purificación de HSA:MPA mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 20;
La figura 21 ilustra la purificación de HSA mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 21;
La figura 22 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de C34 (SEC ID nº 3) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 22;
La figura 23 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de dinorfina A (SEC ID nº 15) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 23;
La figura 24 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de ANP (SEC ID nº 16) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 24;
La figura 25 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de dinorfina A (SEC ID nº 17) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 25;
La figura 26 ilustra la purificación del conjugado HSA:inhibidor de ACE (SEC ID nº 18) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 26;
La figura 27 ilustra la purificación del conjugado HSA:sexto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 19) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 27;
La figura 28 ilustra la purificación del conjugado HSA:séptimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 20) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 28;
La figura 29 ilustra la purificación del conjugado HSA:octavo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 21) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 29;
La figura 30 ilustra la purificación del conjugado HSA:noveno análogo de GLP-1 (SEC ID nº 22) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 30;
La figura 31 ilustra la purificación del conjugado HSA:décimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 23) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 31;
La figura 32 ilustra la purificación del conjugado HSA:undécimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 24) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 32;
La figura 33 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 25) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 33;
La figura 34 ilustra la purificación del conjugado HSA:duodécimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 26) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 34;
La figura 35 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 4) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 35;
La figura 36 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 27) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 36;
La figura 37 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo derivado de insulina que presenta modificación en la cadena A (SEC ID nº 5) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 37;
La figura 38 ilustra la purificación del conjugado HSA:cuarto derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 28) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 38;
La figura 39 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GRF (SEC ID nº 2) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 39;
La figura 40 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de GRF (SEC ID nº 29) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 40;
La figura 41 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de GRF (SEC ID nº 30) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 41;
La figura 42 ilustra la purificación del conjugado HSA:cuarto análogo de GRF (SEC ID nº 31) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 42;
\global\parskip1.000000\baselineskip
La figura 43 ilustra la purificación del conjugado HSA:decimotercer análogo de GLP-1 CJC 1365 (SEC ID nº 32) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 43;
La figura 44 ilustra la purificación del conjugado lactosa HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 44;
La figura 45 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de T20 (SEC ID nº 33) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 45;
La figura 46 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de T1249 (SEC ID nº 34) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 46;
La figura 47 ilustra la purificación del compuesto HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 47;
La figura 48 ilustra la purificación del compuesto HSA:primer análogo de C-34 (SEC ID nº 6) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 48;
La figura 49 ilustra la purificación del compuesto HSA:segundo análogo de GFR (SEC ID nº 29) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 49;
La figura 50 ilustra la purificación del conjugado HSA:conjugado de análogo de vinorelbina (SEC ID nº 35) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 50;
La figura 51 ilustra la purificación de L-cisteína mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 51;
La figura 52 ilustra la purificación de conjugado L-cisteína:análogo de vinorelbina (SEC ID nº 35) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 52;
La figura 53 ilustra la purificación del conjugado RSA:tercer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 25) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 53;
La figura 54 ilustra la purificación del conjugado HSA:cuarto análogo de C-34 (SEC ID nº 36) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 54;
La figura 55 ilustra la purificación del conjugado HSA:quinto análogo de C-34 (SEC ID nº 37) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 55;
La figura 56 ilustra la purificación del conjugado HSA:sexto análogo de C-34 (SEC ID nº 38) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 56;
La figura 57 ilustra la purificación del conjugado HSA:séptimo análogo de C-34 (SEC ID nº 39) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 57;
La figura 58 ilustra la purificación del conjugado HSA:octavo análogo de C-34 (SEC ID nº 40) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 58;
La figura 59 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de PYY (SEC ID nº 41) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 59;
La figura 60 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de PYY (SEC ID nº 42) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 60;
La figura 61 ilustra la purificación del conjugado HSA:quinto derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 43) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 61;
La figura 62 ilustra la purificación del conjugado HSA:sexto derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 44) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 62;
La figura 63 ilustra la purificación del conjugado HSA:séptimo derivado de insulina que presenta modificación en la cadena B (SEC ID nº 45) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 63;
La figura 64 ilustra la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de PYY (SEC ID nº 46) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 64;
La figura 65 ilustra la purificación del conjugado HSA:cuarto análogo de PYY (SEC ID nº 47) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 65;
La figura 66 ilustra la purificación del conjugado HSA:quinto análogo de PYY (SEC ID nº 48) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 66;
La figura 67 ilustra la purificación del conjugado HSA:sexto análogo de PYY (SEC ID nº 49) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 67;
La figura 68 ilustra la purificación del conjugado HSA:segundo análogo de ANP (SEC ID nº 50) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 68;
Las figuras 69A-B ilustran la purificación del conjugado HSA:tercer análogo de ANP CJC1681 (SEC ID nº 51) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 69;
La figura 70 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 70;
La figura 71 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 71;
La figura 72 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 72;
La figura 73 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 73;
La figura 74 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 74;
La figura 75 ilustra la purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 52) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 75; y
La figura 76 ilustra la purificación del conjugado RSA:primer análogo de GLP-2 (SEC ID nº 52) mediante una realización preferida del procedimiento de la presente invención como se describe en el ejemplo 76.
Descripción detallada de una realización preferida de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para la purificación de conjugados de albúmina de una solución que comprende conjugados de albúmina y albúmina no conjugada.
Procedimientos Preparación de albúmina de suero humano (no conjugado) (HSA) para control y conjugados de albúmina preformados
Se solubilizó cada compuesto con el aceptor de Michael en agua nanopura (o en DMSO si el compuesto era difícil de solubilizar) a una concentración de 10 mM, luego se diluyó hasta 1 mM en una solución de HSA (25%, 250 mg/ml, Cortex-Biochem, San Leandro, CA). Se incubaron luego las muestras a 37ºC durante 30 minutos. Antes de su purificación se diluyó cada solución de conjugado hasta 5%, 50 mg/ml de HSA en tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7) constituido por octanoato de sodio 5 mM. Se puede añadir la concentración inicial de sal usada en el gradiente de solución al tampón para dilución de la solución mixta. Preferiblemente la concentración inicial de sal es de aproximadamente 750 a aproximadamente 1700 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}^{-}.
Procedimiento para la purificación de acuerdo con una realización preferida
Usando un purificador ÄKTA (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), se cargó cada conjugado con un caudal de 2,5 ml/min en una columna de 50 ml de resina de flujo rápido de butilsefarosa 4 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) equilibrada en tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7) compuesta por octanoato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}
SO_{4} 750 mM a 1,7 M. En estas condiciones los conjugados de HSA que presentan una adición de peso molecular de más de 2 kDa respecto a HSA no conjugado se adsorbían en la resina hidrófoba mientras que esencialmente todo el HSA no conjugado eluyó dentro del volumen hueco de la columna. Para adiciones de peso molecular inferiores a 2 kDa se puede usar un contenido en sal inicial mayor seguido de un gradiente en etapas decreciente de sal. Cada conjugado se purificó adicionalmente a partir de cualquier compuesto no conjugado libre mediante aplicación de un gradiente decreciente continuo o no continuo de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4} de 750 a 0 mM) sobre 4 volúmenes de columna. En una realización preferida, cada conjugado purificado se desaló luego y se concentró mediante diafiltración, por ejemplo usando dispositivos de filtro (30 kDa) Amicon® de ultracentrífuga (Millipore Corporation, Bedford, MA). Finalmente, para almacenamiento prolongado, cada solución de conjugado se sumerge preferiblemente en nitrógeno líquido, y se liofiliza usando un sistema de liofilización Labconco (FreeZone®4.5) y se conserva a -20ºC.
Ejemplos de análisis por LC/EMS
Tras la purificación, se inyecta preferiblemente 1 \mul de cada muestra de conjugado en el sistema LC/EMS. El conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) fue confirmado por detección de una especie de mayor abundancia con una masa total de 70160 Da, lo que corresponde a la masa de mercaptoalbúmina (66448 Da) donde cisteína 34 está en la forma tiol libre, más la masa de una única molécula del primer análogo de GLP-1 (3719,9 Da). La estructura del primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1) se describe en el ejemplo 1 siguiente. Esto se ilustra en la tabla 2.
TABLA 2
3
El conjugado HSA:primer análogo de GRF (SEC ID nº 2) fue confirmado por detección de una especie de mayor abundancia con una masa total de 70086 Da, lo que corresponde a la masa de mercaptoalbúmina (66448 Da) donde cisteína 34 está en la forma tiol libre, más la masa de una única molécula del primer análogo de GRF (3648,2 Da). La estructura del primer análogo de GRF (SEC ID nº 2) se describe en el ejemplo 2 siguiente. Esto se ilustra en la tabla 3.
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TABLA 3
5
Los siguientes ejemplos ilustran varios compuestos que presentan un grupo maleimida como aceptor de Michael que se han conjugado con albúmina y purificado de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.
Los siguientes ejemplos tienen la finalidad de ilustrar la presente invención y no limitar su alcance.
En los siguientes ejemplos los números de gradiente se refieren a los siguientes detalles de gradiente, mientras que CV significa un volumen de columna de 50 ml.
Gradiente nº 1: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 750 - 0 mM lineal, sobre 4 CV, caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 2: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,75 M - 1,2 M gradiente en etapas sobre 0,5 CV, seguido de (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,2 M - 875 mM sobre 5 CV y finalmente (NH_{4})_{2}SO_{4} de 875 mM - O mM sobre 0,5 CV caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 3: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 900 - 0 mM lineal sobre 4 CV, caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 4: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,5 M a 1,1 M gradiente en etapas sobre 0,5 CV, seguido de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,1 M - 375 mM sobre 6 CV, y finalmente (NH_{4})_{2}SO_{4} 375 mM - O mM sobre 0,5 CV, caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 5: (NH_{4})_{2}SO_{4} lineal de 750 - 0 M sobre 2 CV, caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 6: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,75 M - O M gradiente en etapas sobre 6 CV, caudal de 2,5 ml/min
Gradiente nº 7: (NH_{4})_{2}SO_{4} de 750 - O mM lineal sobre 6 CV, caudal de 2,5 ml/min.
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Ejemplo 1 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8}Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
6
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 1 la fracción de conjugado purificada eluye durante el gradiente de concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} decreciente como fracción B (F8-F9), mientras que la albúmina no conjugada eluye en el volumen hueco de la columna (fracción A). La fracción de conjugado se concentró con filtro de 30 kDa Ultrafree^{TM} y se analizó usando LC-EMS.
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Ejemplo 2 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GRF (SEC ID nº 2)
El primer análogo de GRF es GRF (1-29) dAla^{2}Gln^{8}Ala^{15}Leu^{27}Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
7
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GRF 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 2 la fracción de conjugado purificada eluye en fracción B (F6-F7), mientras que la albúmina no conjugada eluye en el volumen hueco de la columna (fracción A). La fracción de conjugado se concentró con filtro de 30 kDa Ultrafree^{TM} y se analizó usando LC-EMS.
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Ejemplo 3 Purificación de HSA no conjugado 1 ml
La purificación de 1 ml de 250 mg/ml de HSA no conjugado al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) diluido en 9 ml de tampón (pH 7,0), constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. Esencialmente todas las moléculas de albúmina eluyen en el volumen hueco y no se observan especies de proteínas a 280 nm durante el gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4}. La figura 3 ilustra la curva de separación obtenida.
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Ejemplo 4 Purificación del conjugado rHSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8}Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y se muestra su secuencia en el ejemplo 1.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 5 ml de rHSA al 5% (HSA recombinante de calidad para cultivo de nuevo siglo) con primer análogo de GLP-1 200 \muM diluido en 5 ml de un tampón constituido por fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 4 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción B (F7-F8-F9).
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Ejemplo 5 Purificación de HSA 10 ml
La purificación de 10 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) diluido en 40 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. Esencialmente todas las moléculas de albúmina eluyen en el volumen hueco y no se observan especies de proteína a 280 nm durante el gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4}. La figura 5 ilustra la curva de separación obtenida.
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Ejemplo 6 Purificación del conjugado HSA:análogo de K5 (SEC ID nº 3)
El análogo de K5 es Ac-K5 Lys^{8} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
8
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 4 ml de 250 4 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con análogo de K5 1 mM diluido en 16 ml de un tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 6 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción A con albúmina y en la fracción B (F6-F7-F8).
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Ejemplo 7 Purificación de conjugado HSA:primer derivado de insulina (SEC ID nº 4)
El primer derivado de insulina es insulina humana con MPA en la posición B1 de cadena B (SEC ID nº 4) y cadena A nativa (SEC ID nº 35). La fórmula I siguiente representa el primer derivado de insulina descrito en el presente ejemplo y todos los otros derivados de insulina descritos en otros ejemplos. La fórmula I proporciona información relativa al puente disulfuro intra en la cadena A y los dos puentes disulfuro entre la cadena A y la cadena B para todos los derivados de insulina.
9
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer derivado de insulina 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 7 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción B (F6-F7-F8).
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Ejemplo 8 Purificación de conjugado HSA:segundo derivado de insulina (SEC ID nº 5)
El segundo derivado de insulina es insulina humana con MPA en la posición A1 de la cadena A (SEC ID nº 5) y cadena B nativa (SEC ID nº 53) y está representada en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo derivado de insulina 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 8 la fracción de conjugado purificada aparece en la fracción B (F6-F7-F8).
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Ejemplo 9 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de C34 (SEC ID nº 6)
El primer análogo de C34 es MPA-AEEA-C34-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
10
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de C34 1 mM diluido en 20 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 9 la fracción de conjugado purificada aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 10 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de C34 (SEC ID nº 7)
El segundo análogo de C34 es C34 (1-34) Lys^{35} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente estructura:
11
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo análogo de C34 1 mM diluido en 20 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 10 la fracción de conjugado purificada aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 11 Purificación de conjugado HSA:tercer análogo de C34 (SEC ID nº 8)
El tercer análogo de C34 es C34 (1-34) Lys^{13} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente estructura:
12
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con tercer análogo de C34 1 mM diluido en 20 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 11 la fracción de conjugado purificada aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 12 Purificación de I-cisteína
La purificación de 121 mg de I-cisteína en 2 ml de un tampón constituido por fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. La figura 12 ilustra la curva de separación obtenida, donde L-cisteína eluye en el volumen hueco de la columna (F3).
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Ejemplo 13 Purificación de conjugado L-cisteína:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se mostró anteriormente en el ejemplo 1.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 121 mg de L-cisteína con 36,36 mg de primer análogo de GLP-1 diluido en 2 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}
SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. La figura 13 ilustra la curva de separación obtenida, donde L-cisteína en exceso eluye en F3 (volumen hueco de la columna) y el conjugado L-cisteína:primer análogo de GLP-1 eluye en (NH_{4})_{2}SO_{4} 0 mM.
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Ejemplo 14 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 9)
El segundo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
120
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 10 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. En la figura 14 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 15 Purificación de conjugado HSA:tercer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 10)
El tercer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
13
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con tercer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 10 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. En la figura 15 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 16 Purificación de conjugado HSA:cuarto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 11)
El cuarto análogo de GLP-1 es GLP- (7-36) Lys^{26} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA) y presenta la siguiente secuencia:
130
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con cuarto análogo de GLP-1 1 mM diluido en 10 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 16 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 17 Purificación de conjugado HSA:quinto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 12)
El quinto análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{34} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA) y presenta la siguiente secuencia:
131
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con quinto análogo de GLP-1 1 mM diluido en 10 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 17 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 18 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 13)
El primer análogo de exendina-4 es exendina-4-(1-39) Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
132
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de exendina-4 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 18 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 19 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de exendina-4 (SEC ID nº 14)
El segundo análogo de exendina-4 es exendina-4-(9-39) Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
14
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% de Cortex con segundo análogo de exendina-4 1 mM diluido en 21,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 19 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 20 Purificación de HSA:MPA
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con MPA 2 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 20 la fracción de mercaptoalbúmina está en la fracción A (F5) y la albúmina bloqueada está en la fracción B (F7-F8). Se concentró la fracción conjugada con filtro de 30 kDa de Amicon^{TM}.
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Ejemplo 21 Purificación de HSA
La purificación de 1 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. Cuando se usa el gradiente nº 2, a diferencia de los gradientes nº 1 y nº 5, tanto la albúmina conjugada como la albúmina no conjugada se adsorbe sobre la resina hidrófoba durante la carga de la muestra. La figura 21 ilustra la curva de separación obtenida cuando F4 y F5 se enriquecen en mercaptoalbúmina y F6, F7 y F8 se enriquecen en albúmina bloqueada.
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Ejemplo 22 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de C34 (SEC ID nº 3)
El segundo análogo de C34 es C34 (1-34) Lys^{35} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su estructura se muestra en el ejemplo 10.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo análogo de C34 1 mM diluido en 9 ml de un tampón constituido por fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 22 la mercaptoalbúmina aparece en la fracción A (F5) y albúmina bloqueada y el conjugado purificado está en la fracción B (F7-F8).
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Ejemplo 23 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de dinorfina A (SEC ID nº 15)
El primer análogo de dinorfina A es DynA (1-13) (MPA)-NH_{2} y tiene la siguiente secuencia: YGGFLRRIRPKLK(MPA)-CONH_{2}.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de dinorfina A 1 mM diluido en 9 ml de un tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 23 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción A (F11-F12).
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Ejemplo 24 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de ANP (SEC ID nº 16)
El primer análogo de ANP es MPA-AEEA-ANP (99-126)-CONH2 y presenta la siguiente estructura:
15
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de ANP 1 mM diluido en 9 ml de un tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 24 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción A (F14).
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Ejemplo 25 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de dinorfina A (SEC ID nº 17)
El segundo análogo de dinorfina A es DynA (7-13) Lys^{13} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y tiene la siguiente secuencia:
16
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo análogo de dinorfina A 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 25 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción A (F9).
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Ejemplo 26 Purificación de conjugado HSA:inhibidor de ACE (SEC ID nº 18)
El inhibidor de ACE usado en este ejemplo es acetil-Phe-His-ciclohexilestatillie-Lys (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
17
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con inhibidor de ACE 1 mM diluido en 9 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 2 descrito anteriormente. En la figura 26 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción A (F14).
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Ejemplo 27 Purificación de conjugado HSA:sexto análogo de GLP-1 (SEC ID nº 19)
El sexto análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{23} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
18
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con sexto análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 27 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 28 Purificación de conjugado HSA:séptimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 20)
El séptimo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{18} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
19
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con séptimo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 28 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 29 Purificación de conjugado HSA:octavo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 21)
El octavo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{26} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
20
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con octavo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 29 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 30 Purificación de conjugado HSA:noveno análogo de GLP-1 (SEC ID nº 22)
El noveno análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-37) Lys^{27} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
21
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con noveno análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 30 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 31 Purificación de conjugado HSA:décimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 23)
El décimo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-37) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
210
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con décimo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 31 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 32 Purificación de conjugado HSA:undécimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 24)
El undécimo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
22
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con undécimo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 32 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción
F2.
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Ejemplo 33 Purificación de conjugado HSA:tercer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 25)
El tercer análogo de exendina-4 es exendina-4-(1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
220
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con tercer análogo de exendina-4 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 33 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 34 Purificación de conjugado HSA:duodécimo análogo de GLP-1 (SEC ID nº 26)
El duodécimo análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) Lys^{34} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
221
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA 250 mg/ml al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con duodécimo análogo de GLP-1 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 34 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción
F2.
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Ejemplo 35 Purificación de conjugado HSA:primer derivado de insulina (SEC ID nº 4)
El primer derivado de insulina es insulina humana con MPA en la posición B1 de cadena B (SEC ID nº 4) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y su estructura se detalla en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer derivado de insulina 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 35 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 36 Purificación de conjugado HSA:tercer derivado de insulina (SEC ID nº 27)
El tercer derivado de insulina es insulina humana con OA-MPA en la posición B1 de cadena B (SEC ID nº 27) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 4 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con tercer derivado de insulina 1 mM diluido en 21 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 36 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción
F2.
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Ejemplo 37 Purificación de conjugado HSA:segundo derivado de insulina (SEC ID nº 5)
El segundo derivado de insulina es insulina humana con MPA en la posición A1 de cadena A (SEC ID nº 5) y cadena B nativa (SEC ID nº 53) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo derivado de insulina 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 37 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 38 Purificación de conjugado HSA:cuarto derivado de insulina (SEC ID nº 28)
El cuarto derivado de insulina es insulina humana con MPA en la posición B29 de cadena B (SEC ID nº 28) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con cuarto derivado de insulina 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 38 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción
F2.
\newpage
Ejemplo 39 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GRF (SEC ID nº 2)
El primer análogo de GRF es GRF (1-29) dAla^{2} Gln^{8} Ala^{15} Leu^{27} Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y se muestra su secuencia en el ejemplo 2.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3,7 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GRF 1 mM diluido en 22 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 39 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 40 Purificación del conjugado HSA:segundo análogo de GRF (SEC ID nº 29)
El segundo análogo de GRF es GRF (1-29) Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
23
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con segundo análogo de GRF 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 900 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 40 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 41 Purificación del conjugado HSA:tercer análogo de GRF (SEC ID nº 30)
El tercer análogo de GRF es GRF (1-29) dAla^{2} Gln^{8} dArg^{11} Ala^{15} Leu ^{27} Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
24
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con tercer análogo de GRF 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 41 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 42 Purificación del conjugado HSA:cuarto análogo de GRF (SEC ID nº 31)
El cuarto análogo de GRF es GRF (1-29) dAla^{2} Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
25
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con cuarto análogo de GRF 1 mM diluido en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 900 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 42 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 43 Purificación de conjugado HSA:decimotercer análogo de GLP-1 CJC 1365 (SEC ID nº 32)
El decimotercer análogo de GLP-1 es GLP-1 (9-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
250
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3,5 ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) y decimotercer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 21,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 43 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 44 Purificación de conjugado HSA lactosa:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 4 ml de albúmina lactosaaminada al 25% (HSA pre-incubada con lactosa en exceso a 37ºC, pH 7,0) con primer análogo de GLP-1 200 \muM en 4 ml de un tampón constituido por fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM (pH 7,0), se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 44 la fracción de conjugado lactosaaminada aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 45 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de T-20 (SEC ID nº 33)
El primer análogo de T-20 es Ac-T20 (1-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
26
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA al 25% con primer análogo de T20 1 mM en 10 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 45 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 46 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de T-1249 (SEC ID nº 34)
El primer análogo de T1249 es Ac-T1249 (1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
27
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% y primer análogo de T1249 1 mM en 10,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 46 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F4.
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Ejemplo 47 Purificación de un conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra en el ejemplo 1.
La purificación de 114,45 mg del conjugado preformado del primer análogo de GLP-1 en 12,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. La figura 47 ilustra la curva de separación obtenida con el conjugado encontrado en la fracción F2.
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Ejemplo 48 Purificación de un HSA:primer análogo de C34 (SEC ID nº 6)
El primer análogo de C34 es MPA-AEEA-C34-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 9.
La purificación de 114,45 mg del conjugado preformado del primer análogo de C34 en 12,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. La figura 48 ilustra la curva de separación obtenida con el conjugado encontrado en la fracción F2.
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Ejemplo 49 Purificación de un HSA:segundo análogo de GRF (SEC ID nº 29)
El segundo análogo de GRF es GRF (1-29)Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 40.
La purificación de 125,53 mg del conjugado preformado del segundo análogo de GRF en 12,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, pH 7,0, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 5 descrito anteriormente. La figura 49 ilustra la curva de separación obtenida con el conjugado encontrado en la fracción F2.
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Ejemplo 50 Purificación de conjugado HSA:análogo de vinorelbina
El análogo de vinorelbina es una molécula de vinorelbina con AEEA-MPA acoplado a la misma como se ilustra en la siguiente estructura:
28
La purificación de un conjugado preparado de 2,5 ml HSA al 25% y análogo de vinorelbina 1 mM en 22,5 ml de un tampón preparado con tampón de fosfato de sodio 20 mM, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, pH 7,0 se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando gradiente nº 4 descrito anteriormente. En la figura 50 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2. La fracción de conjugado se concentró con filtro de 30 kDa Amicon^{TM}.
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Ejemplo 51 Purificación de L-cisteína
La purificación de 2,5 ml de L-cisteína 40 mM en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1500 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 4 descrito anteriormente. La figura 51 ilustra la curva de separación obtenida con L-cisteína eluyendo dentro del volumen hueco de la columna (fracción F3).
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Ejemplo 52 Purificación de conjugado L-cisteína:análogo de vinorelbina (SEC ID nº 35)
El análogo de vinorelbina es una molécula de vinorelbina con AEEA-MPA acoplado a la misma como se ilustra en la estructura mostrada en el ejemplo 50.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de L-cisteína 40 mM con análogo de vinorelbina 1 mM en 22,5 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando gradiente nº 4 descrito anteriormente. La figura 52 ilustra la curva de separación obtenida con el conjugado de L-cisteína que eluye en las fracciones F8, F9 y F10.
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Ejemplo 53 Purificación de conjugado RSA:tercer análogo de exendina-4 (SEC ID nº 25)
El tercer análogo de exendina-4 es exendina-4-(1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra en el ejemplo 33.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 11 ml de RSA al 5% (albúmina de suero de rata) con tercer análogo de exendina-4 200 \muM en 11 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 53 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 54 Purificación de conjugado HSA:cuarto análogo de C34 (SEC ID nº 36)
El cuarto análogo de C34 es C34 (1-34) Lys^{13} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
29
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con cuarto análogo de C34 1 mM en 13 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. La figura 54 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 55 Purificación de conjugado HSA:quinto análogo de C34 (SEC ID nº 37)
El quinto análogo de C34 es C34 (1-34) Lys^{35} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
30
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con quinto análogo de C34 1 mM en 13 ml de un tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 55 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 56 Purificación de conjugado HSA:sexto análogo de C34 (SEC ID nº 38)
El sexto análogo de C34 es MPA-C34 (1-34)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
31
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con sexto análogo de C34 1 mM en 13 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 56 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 57 Purificación de conjugado HSA:séptimo análogo de C34 (SEC ID nº 39)
El séptimo análogo de C34 es Ac-C34 (1-34) Glu^{2} Lys^{6} Lys^{7} Glu^{9} Glu^{10} Lys^{13} Lys^{14} Glu^{16} Glu^{17} Lys^{20} Lys^{21} Glu^{23} Glu^{24} Lys^{27} Glu^{31} Lys^{34} Lys^{35} Lys^{36} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
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32
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con séptimo análogo de C34 1 mM en 13 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 57 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 58 Purificación de conjugado HSA:octavo análogo de C34 (SEC ID nº 40)
El octavo análogo de C34 es MPA-AEEA-C34 (1-34) Glu^{2} Lys^{6} Lys^{7} Glu^{9} Glu^{10} Lys^{13} Lys^{14} Glu^{16} Glu^{17} Lys^{20} Lys^{21} Glu^{23} Glu^{24} Lys^{27} Glu^{31} Lys^{34} Lys^{35} CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
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33
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con octavo análogo de C34 1 mM en 13 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 58 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 59 Purificación de conjugado HSA:primer análogo de PYY (SEC ID nº 41)
El primer análogo de PYY es PYY (3-36) Lys^{4} (\varepsilon-OA-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente estructura:
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34
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1,5 ml de HSA al 25% con primer análogo de PYY 1 mM en 6 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 59 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 60 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de PYY (SEC ID nº 42)
El segundo análogo de PYY es MPA-OA-PYY (3-36)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
35
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1,5 ml de HSA al 25% con segundo análogo de PYY 1 mM en 6 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 60 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 61 Purificación de conjugado HSA:quinto derivado de insulina (SEC ID nº 43)
El quinto derivado de insulina es insulina humana con AEEAS-AEEAS-MPA en la posición B29 de cadena B (SEC ID nº 43) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con quinto derivado de insulina 1 mM en 15 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 61 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 62 Purificación de conjugado HSA:sexto derivado de insulina (SEC ID nº 44)
El sexto derivado de insulina es insulina humana con AEEAS-AEEAS-MPA en la posición B1 de cadena B (SEC ID nº 44) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2,5 ml de HSA al 25% con sexto derivado de insulina 1 mM en 15 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 62 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 63 Purificación de conjugado HSA:séptimo derivado de insulina (SEC ID nº 45)
El séptimo derivado de insulina es insulina humana con OA-MPA en la posición B29 de cadena B (SEC ID nº 45) y cadena A nativa (SEC ID nº 35) y se representa en la fórmula I mostrada anteriormente en el ejemplo 7.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de HSA al 25% con séptimo derivado de insulina 1 mM en 15 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 63 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 64 Purificación de conjugado HSA:tercer análogo de PYY (SEC ID nº 46)
El tercer análogo de PYY es MPA-PYY (3-36)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
36
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de HSA al 25% con tercer análogo de PYY 1 mM en 18 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 64 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 65 Purificación de conjugado HSA:cuarto análogo de PYY (SEC ID nº 47)
El cuarto análogo de PYY es PYY (3-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
37
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 3 ml de HSA al 25% con cuarto análogo de PYY 1 mM en 18 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 65 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 66 Purificación de conjugado HSA:quinto análogo de PYY (SEC ID nº 48)
El quinto análogo de PYY es MPA-PYY (22-36)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia: (MPA)-ASL-RHYLN
LVTRQRY-CONH_{2}
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 6 ml de HSA al 25% con quinto análogo de PYY 1 mM en 36 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 900 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 66 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 67 Purificación de conjugado HSA:sexto análogo de PYY (SEC ID nº 49)
El sexto análogo de PYY es acetil-PYY (22-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia: Ac-ASLRHYLNLVTRQRYK(MPA)-CONH_{2}
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 6 ml de HSA al 25% con sexto análogo de PYY 1 mM en 36 ml de tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 900 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 67 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 68 Purificación de conjugado HSA:segundo análogo de ANP (SEC ID nº 50)
El segundo análogo de ANP es MPA-ANP (99-126)-CONH_{2} y presenta la siguiente estructura:
38
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de HSA al 25% con segundo análogo de ANP 1 mM en 14 ml de un tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En la figura 68 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 69 Purificación de conjugado HSA:tercer análogo de ANP (SEC ID nº 51)
El tercer análogo de ANP es ANP (99-126) que ha reaccionado con MAL-dPEG_{4}^{TM} (Quanta Biodesign, Powell, OH, EEUU) acoplado con Ser^{99}. El análogo de ANP resultante es MPA-EEEEP-ANP (99-126) donde EEEEP es ácido etoxi etoxi etoxi etoxi propiónico; y su secuencia es la siguiente:
39
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de HSA al 25% con CJC 1681 1 mM en 14 ml de un tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0), caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 900 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 3 descrito anteriormente. En las figuras 69A y 69B la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 70 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,75 M, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 6 descrito anteriormente. En la figura 70 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción B.
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Ejemplo 71 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y sulfato de magnesio 1,75 M, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 6 descrito anteriormente. En la figura 71 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 72 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
Ejemplo con sulfato de amonio 750 mM. La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 72 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 73 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
Ejemplo con fosfato de amonio 1,75 M. La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y fosfato de amonio 1,75 M, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 6 descrito anteriormente. En la figura 73 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción B.
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Ejemplo 74 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-1 (SEC ID nº 1)
El primer análogo de GLP-1 es GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra anteriormente en el ejemplo 1.
Ejemplo con fosfato de amonio 750 mM. La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 1 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-1 1 mM diluido en 9 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y fosfato de amonio 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 74 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 75 Purificación del conjugado HSA:primer análogo de GLP-2 (SEC ID nº 52)
El primer análogo de GLP-2 es GLP-2 (1-33) Gly^{2} Lys^{34} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y presenta la siguiente secuencia:
40
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 2 ml de 250 mg/ml de HSA al 25% (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) con primer análogo de GLP-2 1 mM diluido en 14 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 75 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.
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Ejemplo 76 Purificación de conjugado RSA:primer análogo de GLP-2 (SEC ID nº 52)
El primer análogo de GLP-2 es GLP-2 (1-33) Gly^{2} Lys^{34} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} y su secuencia se muestra en el ejemplo 75.
La purificación de un conjugado preparado haciendo reaccionar 9 ml de 250 mg/ml de RSA al 25% (albúmina de suero de rata) con primer análogo de GLP-2 1 mM diluido en 14 ml de tampón constituido por tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,0, caprilato de sodio 5 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 750 mM, se llevó a cabo en una columna de butilsefarosa usando el gradiente nº 1 descrito anteriormente. En la figura 76 la fracción de conjugado purificado aparece en la fracción F2.

Claims (32)

1. Un procedimiento para la separación de conjugado de albúmina de albúmina no conjugada en una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada, comprendiendo el procedimiento:
(a)
cargar dicha solución en un soporte sólido hidrófobo equilibrado en tampón acuoso que tiene una alta concentración de sal;
(b)
aplicar a dicho soporte un gradiente de concentración de sal decreciente; y
(c)
recoger dicho conjugado de albúmina.
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2. Un procedimiento para la producción de un conjugado de albúmina que comprende:
(a)
preparación de una solución que comprende conjugado de albúmina y albúmina no conjugada; y
(b)
separación del conjugado de albúmina de la albúmina no conjugada en dicha solución llevando a cabo el procedimiento de la reivindicación 1.
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3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho conjugado de albúmina comprende una molécula que presenta un aceptor de Michael unido covalentemente a albúmina.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho enlace está entre dicho aceptor de Michael y cisteína 34 de dicha albúmina.
5. El procedimiento de la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho aceptor de Michael es un grupo maleimida.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho grupo maleimida es ácido maleimida-propiónico (MPA).
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha molécula se selecciona del grupo constituido por un péptido, un ADN, un ARN y una combinación de los mismos, al cual está covalentemente unido dicho aceptor de Michael, opcionalmente mediante un adaptador.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que dicha molécula es un péptido que tiene un peso molecular de al menos 57 daltons.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho péptido se selecciona del grupo constituido por péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), péptido natriurético atrial (ANP), kringle 5 (K5), dinorfina, exendina-4, factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF), insulina, péptidos natriuréticos, enfuvirtida (T-20), T-1249, C-34, péptido EF C-35 soluble (SC-35), péptido YY (PYY), y análogos de los mismos.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha molécula se selecciona del grupo constituido por vinorelbina, gemcitabina y paclitaxel.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que dicha molécula está unida covalentemente a dicha albúmina a través de un enlace covalente sensible a ácido o una secuencia de péptido susceptible de escisión proteolítica, con lo que se posibilita la separación de dicha molécula y albúmina y la entrada de la molécula en una célula.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho soporte sólido hidrófobo es una columna que contiene una resina hidrófoba.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha resina hidrófoba se selecciona del grupo constituido por octilsefarosa, fenilsefarosa y butilsefarosa.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha resina hidrófoba es butilsefarosa.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha sal tiene un efecto de saturación con sales suficiente para promover las interacciones ligando-proteína.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha sal se selecciona del grupo constituido por fosfato de amonio, sulfato de amonio y fosfato de magnesio.
17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha sal es fosfato de amonio o sulfato de amonio.
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18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha sal es sulfato de amonio.
19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho gradiente de concentración de sal decreciente tiene una concentración de sal de partida inferior a 3000 mM.
20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho gradiente de concentración de sal decreciente tiene una concentración de sal de partida entre 500 y 1000 mM.
21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 y 11, en el que dicha molécula es un péptido al que está unido covalentemente dicho aceptor de Michael, opcionalmente mediante un adaptador.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho péptido es un análogo de péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), péptido similar al glucagón tipo 2 (GLP-2), péptido natriurético atrial (ANP), kringle 5 (K5), dinorfina, exendina-4, factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF), insulina, péptidos natriuréticos, enfuvirtida (T-20), T-1249, C-34, péptido EK C-35 soluble (SC-35), o péptido YY (PYY).
23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, 11 y 21, en el que dicha molécula se selecciona del grupo constituido por GLP-1 (7-36) dA1a^{8} Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 1), GRF (1-29) dAla^{2} Gln^{8} Ala^{15} Leu^{27} Lys^{30} (\varepsilon-MPA) CONH_{2} (SEC ID nº 2), Ac-K5 Lys^{8} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} (SEC ID nº 3), insulina B1-MPA (SEC ID nº 4), insulina A1-MPA (SEC ID nº 5), MPA-AEEA-C34-CONH_{2} (SEC ID nº 6), C34 (1-34) Lys^{35} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 7), C34 (1-34) Lys^{13} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 8), GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} (SEC ID nº 9), GLP-1 (7-36) dAla^{8} Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} (SEC ID nº 10), GLP-1 (7-36) Lys^{26} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA) (SEC ID nº 11), GLP-1 (7-36) Lys^{34} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA) (SEC ID nº 12), exendina-4-(1-39) Lys^{40} (\varepsilon-MPA)-NH_{2} (SEC ID nº 13), exendina-4-(9-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 14), Dyn A (1-13) (MPA)-NH_{2} (SEC ID nº 15), MPA-AEEA-ANP (99-126)-CONH_{2} (SEC ID nº 16), Dyn A (7-13) Lys^{13} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 17), acetil-Phe-His-ciclohexilestatil-lle-Lys (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 18), GLP-1 (7-36) Lys^{23} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 19), GLP-1 (7-36) Lys^{18} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 20), GLP-1 (7-36) Lys^{26} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 21), GLP-1 (7-36) Lys^{27} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 22), GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 23), GLP-1 (7-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 24), exendina-4-(1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 25), GLP-1 (7-36) Lys^{34} (\varepsilon-AEBA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 26), insulina B1-OA-MPA (SEC ID nº 27), insulina B29-MPA (SEC ID nº 28), GRF (1-29) Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 29), GRF (1-29) dAla^{2} Gln^{8} dArg^{11} Ala^{15} Leu^{27} Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 30), GRF (1-29) dAla^{2} Lys^{30} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 31), GLP-1 (9-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 32), Ac-T20 (1-36) Lys^{37} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 33), Ac-T1249 (1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 34), 3',4'-didehidro-4'-desoxi-C'-norvincaleucoblastina-AEEA-MPA, C34 (1-34) Lys^{13} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 36), C34 (1-34) Lys^{35} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 37), MPA-C34 (1-34)-CONH_{2} (SEC ID nº 38), Ac-C34 (1-34) Glu^{2} Lys^{6} Lys^{7} Glu^{9} Glu^{10} Lys^{13} Lys^{14} Glu^{16} Glu^{17} Lys^{20} Lys^{21} Glu^{23} Glu^{24} Lys^{27} Glu^{31} Lys^{34} Lys^{35} Lys^{36} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 39), MPA-AEEA-C34 (1-34) Glu^{2} Lys^{6} Lys^{7} Glu^{9} Glu^{10} Lys^{13} Lys^{14} Glu^{16} Glu^{17} Lys^{20} Lys^{21} Glu^{23} Glu^{24} Lys^{27} Glu^{31} Lys^{34} Lys^{35} CONH_{2} (SEC ID nº 40), PYY (3-36) Lys^{4} (\varepsilon-OA-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 41), MPA-OA-PYY (3-36)-CONH_{2} (SEC ID nº 42), insulina B29-AEES2-MPA (SEC ID nº 43), insulina B1-AEES2-MPA (SEC ID nº 44), insulina B29-OA-MPA (SEC ID nº 45), SPA-PYX (3-36)-CONH_{2} (SEC ID nº 46), PYY (3-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 47), MPA-PYY (22-36)-CONH_{2} (SEC ID nº 48) acetil-PYY (22-36) Lys^{37} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 49), MPA-ANP (99-126)-CONH_{2} (SEC ID nº 50), MPA-EEEEP-ANP (99-126) (SEC ID nº 51) y GLP-2 (1-33) Gly^{2} Lys^{34} (\varepsilon-MPA)-CONH_{2} (SEC ID nº 52).
24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicho péptido es insulina B1.
25. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicho péptido es exendina-4 (1-39) Lys^{40}.
26. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha molécula es exendina-4 (1-39) Lys^{40} (\varepsilon-AEEA-MPA)-CONH_{2}.
27. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha molécula es insulina B1-OA-MPA.
28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicha albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina del suero y albúmina recombinante.
29. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicha albúmina se selecciona del grupo constituido por albúmina humana, albúmina de rata, albúmina de ratón, albúmina de cerdo, albúmina bovina, albúmina de perro y albúmina de conejo.
30. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicha albúmina es albúmina de suero humana.
31. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicha albúmina está modificada con al menos una seleccionada del grupo constituido por un ácido graso, un ión metálico y un azúcar.
32. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que dicha albúmina está modificada con un azúcar seleccionado del grupo constituido por glucosa, lactosa y manosa.
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