ES2328141T3

ES2328141T3 - Valvula de nodavirus inactivado.

Info

Publication number: ES2328141T3
Application number: ES04712006T
Authority: ES
Inventors: Nuno Dos Santos; Jacqueline Ireland; Andrew Cartner Barnes; Michael Horne
Original assignee: Novartis Pharma GmbH Austria; Novartis AG
Current assignee: Novartis Pharma GmbH Austria; Novartis AG
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2009-11-10
Anticipated expiration: 2024-02-18
Also published as: US8124100B2; US20060257425A1; AU2004213566A1; CA2512930C; TWI347364B; AU2004213566B2; CL2004000282A1; DK1597359T3; EP1597359A1; HK1085765A1; JP2006517943A; NO20054219L; EP1597359B1; WO2004074467A1; ATE437224T1; PT1597359E; JP4664901B2; MY143785A; CA2512930A1; DE602004022139D1

Abstract

Una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada Mt/01/Sba depositada en la ECACC bajo el Número de Registro 03060401 o una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada la cual reacciona serológicamente con un antisuero generado contra dicha cepa depositada Mt/01/Sba.

Description

Vacuna de nodavirus inactivado.

Ámbito de la invención

La presente invención hace referencia a vacunas para la protección de los peces contra la infección por nodavirus, a los procesos de elaboración de dichas vacunas, y al uso de estas vacunas en la prevención de la Necrosis Nerviosa Viral.

Antecedentes de la invención

Los betanodavirus poseen una única cadena de ARN, son viriones sin envoltura y son los agentes etiológicos de la Necrosis Nerviosa Viral (VNN) o encefalitis de los peces, una enfermedad caracterizada por el desarrollo de una encefalopatía vacuolizante y retinopatía, y la presencia de partículas compatibles con virus en las neuronas de peces infectados. La VNN representa una barrera significativa para las actividades comerciales de acuacultura debido a la frecuencia de la incidencia de la enfermedad, los altos niveles de mortalidad (cercanos al 100%) y su amplia distribución entre las especies de peces cultivados en agua templada y fría.

La desinfección química para la destrucción del nodavirus en cuerpos de agua aislados a base de cloro, iodo o amonio es el método de prevención estándar, pero sería preferible una vacuna debido a la preocupación por los efectos de dichas sustancias químicas en el medio ambiente marino. En la actualidad no hay ninguna vacuna comercialmente disponible para proteger peces contra las infecciones del nodavirus, y en particular contra la VNN. Es un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna que confiera una protección comercialmente significativa contra la infección por nodavirus para peces cultivados.

Resumen de la invención

En un primer aspecto de la invención se proporciona una vacuna contra la VNN que comprende una cepa viral de la necrosis nerviosa viral de peces inactivada Mt/01/Sba, depositada en la ECACC bajo el número de registro 03060401, o una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada la cual reacciona serológicamente con un antisuero extraido a partir de la cepa viral depositada Mt/01/Sba.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona un método para la preparación de una vacuna de nodavirus de peces, que comprende la inactivación del virus antes mencionado mediante la utilización de un compuesto de aziridina.

En un tercer aspecto de la invención se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de la VNN que comprende la administración de una vacuna a un pez que necesite de dicho tratamiento, vacuna que comprende el antes mencionado nodavirus de peces inactivado.

En otro aspecto de la invención se proporciona la utilización del antes mencionado nodavirus inactivado en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la infección por nodavirus o VNN.

En aún otro aspecto de la invención se proporciona una cepa viral de Necrosis Nerviosa Viral Mt/01/Sba depositada en la ECACC el 4 de junio de 2003 bajo el Número de registro 03060401, o una cepa viral con características de identificación similares. Una cepa con características de identificación similares es una que reaccione serológicamente con un antisuero generado en contra de la cepa nodavirus Mt/01/Sba depositada.

Descripción detallada de la invención

Los recientes enfoques para desarrollar una vacuna del nodavirus para peces se han basado en una proteína viral producida de una manera recombinante. Elegimos comparar dos vacunas candidatas, una basada en una proteína recombinante de la cápside de nodavirus adyuvante, y la otra una preparación viral inactivada. Se inactivó el virus mediante el uso de etileneimina binaria, y se administró en una mezcla con adyuvante incompleto de Freund.

La vacuna basada en la proteína recombinante no logró ofrecer una protección significativa tras la exposición al virus vivo. En cambio, los virus muertos probaron ser altamente eficaces (Porcentaje Relativo de Supervivencia = 91,6%). Este hecho resultó sorprendente: la visión que prevalece en este campo es que las vacunas inactivadas no logran proteger a los peces contra el nodavirus, por lo menos en las lubinas (International Council for the Exploration of the Sea, Mariculture Committee: Report on the Working Group on Pathology and Diseases of Marine Organisms [Consejo Internacional para la Exploración del Mar, Comité de Maricultura: Informe sobre el grupo de trabajo sobre patología y enfermedades de organismos marinos], Copenhague, Dinamarca, 12-16 Marzo 2002).

Según la presente invención, un proceso para la producción de una vacuna contra un nodavirus comienza con la infección de células de cultivo adecuadas con una cepa virulenta del virus en cuestión. El método comprende los pasos de 1) infectar una línea celular susceptible con un nodavirus de peces; 2) permitir que dicho nodavirus crezca en un medio que facilite su crecimiento hasta que se produzca un efecto citopático (ECP); 3) recoger dicho medio que facilita el crecimiento conteniendo dicho nodavirus, las células muertas, los restos de células y las células infectadas para producir un material de recolección; 4) inactivar dicho material de recolección con un agente inactivante adecuado; y 5) mezclar con adyuvante dicho material de recolección inactivado.

Los nodavirus de peces son generalmente cultivados en células de cabeza de serpiente cabrío (SNN-1), o SBL de lubina. La SSN-1 está disponible en la ECACC, Salisbury, Reino Unido. Otra posibilidad es la línea celular del mero de pintas naranjas (Epinephelus coioides) divulgado en EP-A-1006178 (GF-1). Las células pueden comprender una población mixta, o pueden ser clones celulares (tales como la línea celular E-11 descrita en Iwamoto et al. (2000) Dis. Aquat. Organ. 43(2): 81-9). La línea celular puede ser cultivada en botellas de Roux, botellas Roller o en bioreactores como un cultivo en suspensión o en microportadores mediante el uso de cualquier medio o suero que facilite el rápido crecimiento de las células. Las células son preferentemente cultivadas para formar una monocapa confluente y luego inoculadas con el virus, tras lo cual se realiza la incubación en un medio nutriente adecuado para el crecimiento y la replicación del virus hasta la aparición de efectos citopáticos (ECP). El medio de cultivo Leibovitz L-15 (Gibco) es un ejemplo de un medio de cultivo apropiado, como se describe en Frerichs et al. (1996) J. Gen. Virol. 77:2067-2071. Los sueros preferidos para el crecimiento de células son el suero fetal equino, suero fetal bovino o suero de ternero. Cuando los virus han alcanzado su máximo título, el cual se determina de modos diversos mediante infectividad, microscopía electrónica, u otras pruebas convencionales en el arte, el cultivo se clarifica y se filtra, usualmente mediante centrifugación, como por ejemplo la centrifugación en gradiente de densidad de CsCl, para eliminar las células y los restos de células, después de lo cual los fluidos sobrenadantes pueden concentrarse mediante ultrafiltración.

El virus con actividad virulenta que resulta de la purificación se encuentra ya listo para la inactivación. De la forma en que se usa en este documento, el término "virus inactivado" se refiere a un virus previamente virulento que ha sido sometido a un tratamiento para inactivar, matar o modificar de alguna otra forma el virus para eliminar sustancialmente sus propiedades virulentas y retener, al mismo tiempo, su propiedad característica de inmunogenicidad. Según la invención el virus puede ser inactivado mediante la adición de un compuesto de aziridina, el cual puede ser monomérico (Ej. etileneimina) u oligomérico. El compuesto de aziridina preferido es la etileneimina binaria (BEI). Otros ejemplos son la etileneimina trimérica (TEI) y la acetiletileneimina.

Según un método de inactivación, la BEI puede prepararse mediante la disolución, en una concentración de 0,1 M, de bromhidrato 2-bromoetilamina (BEA) en una solución de hidróxido de sodio de aproximadamente 0,2 N, e incubación a 37ºC durante 1 hora.

La BEI formada de esta manera mediante ciclisación se agrega luego a una suspensión de virus, el proceso de inactivación generalmente requiere un período de por lo menos varias horas, preferentemente en una concentración de BEI de entre alrededor de 0,001 a aproximadamente 0,01 M, más preferentemente entre alrededor de 0,003 a aproximadamente 0,005 M, y de manera óptima alrededor de 0,004 M. Durante la inactivación el cultivo se mantiene a temperatura normal/temperatura ambiente. Por ejemplo, un paso de inactivación en 0,004 M de BEI a 25ºC durante 72 horas puede ser apropiado. Sin un ajuste posterior el pH del medio de cultivo tiende a volverse más ácido con el tiempo. Por lo tanto, el pH del medio de cultivo se monitorea opcionalmente en forma continua durante el proceso de inactivación y se mantiene al nivel ligeramente alcalino o ligeramente acídico deseado mediante la adición de álcali adicional, según sea necesario. Después de la inactivación cualquier BEI residual en la recolección puede ser neutralizado mediante la adición de una cantidad en exceso de un reactivo adecuado, como por ejemplo el ácido cítrico o una solución de tiosulfato de sodio.

La etileneimina puede prepararse mediante la adición de sulfato de hidrógeno de 2-aminoetil a una solución en ebullición de hidróxido de sodio, que también se encuantra disponible comercialmente. La polimerización de etileneimina inducida por ácido produce diferentes etileneiminas oligoméricas; es posible aislar oligómeros seleccionados de la mezcla de la reacción mediante la destilación fraccionada. En forma similar a la BEI, la etileneimina y sus formas de oligómeros se mezclan con una suspensión viral y se incuban a fin de realizar la inactivación.

Para obtener mejores resultados el paso de inactivación viral se lleva a cabo a una temperatura en el rango de alrededor de 15 a aproximadamente 35ºC, preferentemente alrededor de 20 a aproximadamente 27ºC, y más preferentemente alrededor de 24-26ºC, opcionalmente a alrededor de 25ºC.

A fin de confirmar la inactivación, la preparación viral inactivada se incuba con células anfitrionas susceptibles de infección durante varios días, por ejemplo como se describe en los Ejemplos, y se observa para el ECP.

Se pueden agregar conservantes tales como el timerosal a los fluidos inactivados, y se puede mezclar el material inactivado con adyuvantes. Después de la mezcla con adyuvantes, se pueden agregar estabilizadores tales como el glicerol/EDTA para mejorar la estabilidad antígena. Se pueden concentrar aún más los fluidos virales mediante el uso de ultrafiltración, la precipitación con polietilenglicol o la adsorción de óxido de polietileno. Estos antígenos concentrados pueden mantenerse a -70ºC o a menores temperaturas durante muchos años, si es necesario, y se pueden convertir en vacunas cuando sea necesario mediante la dilución en un tampón adecuado y la adición opcional de adyuvantes.

En una ejecución preferente se mezcla el sobrenadante viral inactivado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente con un adyuvante.

Los primeros destinatarios de la vacuna de la invención son extremadamente diversos, al ser cualquier especie marina o de agua dulce que sea susceptible a la infección por betanodavirus de peces. Una lista que no intenta ser exhaustiva incluye: lubina (Dicentrarchus labrax L.), pargo (Sparus aurata), verrugato (Umbrina cirrosa), fletán (Hippoglossus hippoglossus), solla roja (Pleuronectes americanus), bacalao del Atlántico (Gadhus morhua), eglefino (Melanogramus aeglefinus), lenguado común (Solea solea), rodaballo (Scophthalmus maximus), jurel (Ej. jurel dentón, Pseudocaranx dentex), mero (Ej.. mero carcelario/ Epinephelus septemfasciatus, mero de pintas rojas/ Epinephelus akaara, mero lutria /Epinephelus tauvina, mero manchado /Epinephelus fuscogutatus, mero jorobado/Cromileptes altivelis, mero malabárico/ Epinephelus malabaricus, mero americano/ Epinephelus moara, y mero con pintas/Plectropomus maculates), perro pintado (Anarhicas minor), perca gigante (Lates calcarifer), pez globo tigre (Takifugu rubripes), falso halibut del Japón (Paralichthys olivaceus), perca loro manchada (Oplegnathus punctatus) y perca loro japonesa (Oplegnathus fasciatus).

Las vacunas preparadas conforme a la invención pueden comprender cualquier nodavirus de peces inactivado, y pueden lograr protección contra cualquier nodavirus de peces. Preferentemente el virus utilizado para preparar la vacuna inactivada de la invención se selecciona de la misma cepa o del mismo genotipo que el virus contra el cual se pretende alcanzar protección (aunque es probable que exista buena protección cruzada entre diferentes genotipos). Los nodavirus de peces se pueden dividir en múltiples genotipos en base a la secuencia parcial de la proteína de la envoltura. Son ejemplos no limitativos de nodavirus de peces: SJNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del jurel dentón), RGNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del mero de pintas rojas), TPNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del pez globo tigre), BFNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del lenguado barfin), FEV (la encefalitis viral de los peces), MGNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del mero malabárico), DGNNV (virus de la necrosis nerviosa viral del mero lanceolado), nodavirus del fletán, encefalitis vírica de la lubina, encefalitis viral del Lates calcarifer, nodavirus de la lubina de Malta, y GGNNV (virus de la necrosis nerviosa viral de mero lutria).

Las cepas de nodavirus están disponibles en repositorios institucionales y laboratorios en todo el mundo, incluyendo el Community Reference Laboratory for Fish Diseases en el Danish Veterinary Institute en Aarhus. Son ejemplos la cepa MT9410 del GNNV, la cepa SJNag93 del SJNNV, la cepa SGWak97 del RGNNV, la cepa SGMie95 del RGNNV, la cepa TPKag93 del TPNNV, la cepa JFIWa98 del BFNNV, aislados virales de la necrosis nerviosa viral del fletán AHNor96 y AH99NorA, aislado de nodavirus de Umbrina cirrosa Uc-1, aislado de nodavirus de fletán AH95NorA, y aislado viral de necrosis nerviosa viral del falso halibut del Japón JF-HI93. En la presente invención se prefiere el uso de la cepa de aislado de nodavirus de Malta Mt/01/Sba. Esta cepa se depositó bajo el Budapest Treaty en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) en Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, RU, el 4 de junio de 2003 y le fue asignado el Número de Registro 03060401. El Institute of Aquaculture en la University of Stirling es la fuente de esta cepa. Las cepas de nodavirus con características de identificación similares preferidas para ser utilizadas en la invención se pueden identificar mediante reacción cruzada específica con antisuero o anticuerpos policlonales o monoclonales purificados generados contra la cepa Mt/01/Sba.

La vacuna de la presente invención ofrece protección contra la infección por nodavirus y enfermedades relacionadas hasta un cierto grado que es comercialmente significativo y valioso para la industria del cultivo de peces. Dado a que las infecciones por nodavirus generalmente matan a prácticamente el 100% de todos los peces infectados en el ambiente, cualquier tratamiento que resulte en un incremento del porcentaje relativo de supervivencia (RPS) es un avance con respecto a los métodos de tratamiento convencionales. En términos comerciales, una protección significativa usualmente significa un RPS para peces vacunados de por lo menos aproximadamente 30%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 40%, más preferentemente de por lo menos 50%, más preferentemente de por lo menos 60%, por ejemplo de por lo menos 70%. La vacuna de la invención puede ser utilizada en forma profiláctica, o puede ser administrada como un tratamiento para peces infectados con nodavirus para eliminar la infección y/o mejorar las tasas de recuperación.

En algunos casos la población de peces de una determinada especie o de una cierta edad pueden no desarrollar ninguno de los síntomas de la enfermedad cuando son expuestos al nodavirus. Sin embargo, pueden actuar como portadores del virus, y persiste el riesgo de que puedan transmitir el virus a peces que son vulnerables. También es un aspecto de la presente invención la vacunación de peces reproductores no infectados contra el nodavirus mediante la utilización del virus inactivado divulgado en la presente, para evitar con ello que se transformen en portadores.

En una ejecución particular, la invención provee la utilización de un nodavirus de peces inactivado en la elaboración de una vacuna para la prevención o tratamiento de la VNN en el bacalao del Atlántico, mediante la vacunación de peces salmónidos co-cultivados (tales como el salmón plateado (Oncorhynchus kisutch), el salmón real (Oncorhynchus tshawytscha), el salmón japonés (Oncorhynchus masou), el salmón rosado (Oncorhynchus gorbuscha), la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), y el salmón del Atlántico (Salmo salar)). También se provee un método para prevenir la VNN en el bacalao del Atlántico, que comprende la administración de una vacuna que comprende, a su vez, de un nodavirus de peces inactivado a peces salmónidos co-cultivados.

En una ejecución la vacuna de la invención se administra a larvas y/o juveniles de una especie de peces, tales como a juveniles de lubina. Alternativamente, la vacuna puede ser administrada en peces adultos o maduros.

Las vías de administración típicas de la vacuna son mediante una inyección en la cavidad peritoneal (para los peces más grandes), una inyección intramuscular, en forma oral en el alimento, o mediante la inmersión en agua marina o dulce. Se recomienda que los peces posean un peso corporal de 5 gramos o más para la administración de la vacuna de la invención mediante una inyección. Un volumen de inyección adecuado es de alrededor de 10 a aproximadamente 200 \mul, preferentemente de alrededor de 50 a aproximadamente 100 \mul. Para la inmersión o la administración oral, se prefiere un peso corporal de por lo menos 1 gramo.

La dosis efectiva de vacuna puede variar según el tamaño y la especie del ejemplar, y según el modo de administración. La dosis óptima puede determinarse a través de ensayo y error un veterinario o un especialista en acuacultura. Un rango de dosis adecuada de virus es de entre alrededor de 10^{2} a 10^{9} de TCID_{50} (dosis de infección del tejido de cultivo que afecta el 50% de los cultivos inoculados) por unidad de dosis, preferentemente alrededor de 10^{4} a 10^{8} de TCID_{50} por unidad de dosis, más preferentemente alrededor de 10^{6} a 10^{7} de TCID_{50} por unidad de dosis, más preferentemente aún alrededor de 10^{7} de TCID_{50} por unidad de dosis. Preferentemente se administra a los peces que van a ser tratados una unidad de dosis única. Los peces más pequeños pueden beneficiarse de una dosis de alrededor de 10^{4} a 10^{7} de TCID_{50}/ml con una administración en remojo (inmersión), por ejemplo con un tiempo de contacto de alrededor de 60 segundos.

Usualmente, las vacunas se preparan como soluciones líquidas, emulsiones o suspensiones para inyección o administración en el agua. Por ejemplo, puede prepararse una emulsión líquida o un concentrado emulsificable para agregarlos en un tanque de agua o tina en donde se mantiene a los peces. También es posible preparar formas sólidas (por Ej. polvo) adecuadas para la disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos, o para mezclarlos con alimento sólido, antes de la administración. La vacuna puede ser un cultivo liofilizado en una forma lista para ser usada para su reconstitución con un diluyente estéril. Por ejemplo, las células liofilizadas pueden ser reconstituidas en salina al 0,9% (opcionalmente provista como parte del contenido del paquete de la vacuna). Una formulación preferida de vacuna inyectable es una emulsión. Las formas líquidas o reconstituidas de la vacuna pueden diluirse en un volumen pequeño de agua (Ej.. 1 a 100 volúmenes) antes de su adición a un criadero, tanque o tina. Las composiciones farmacéuticas de la vacuna de la invención pueden administrarse en una forma de liberación inmediata o de liberación extendida.

Los portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables con los cuales el virus inactivado puede mezclarse incluyen los excipientes convencionales, y pueden ser, por ejemplo, solventes acuosos tales como el agua, una solución salina o PBS (Solución Salina Amortiguada por Fosfatos), aceite, dextrosa, glicerol, agentes humectantes o emulsionantes, agentes volumétricos, estabilizadores, antioxidantes, recubrimientos, aglutinantes, rellenos, desintegrantes, diluyentes, lubricantes, agentes amortiguadores de pH, y otros similares. Se pueden mezclar con el sobrenadante viral inactivado los adyuvantes tales como el muramil dipéptido, avridina, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, aceites, emulsiones aceitosas, saponinas, sulfato de dextran, glucanos, citoquinas, co-polímeros de bloque, oligonucleótidos inmunoestimuladores y otros conocidos en el arte. Un adyuvante preferente es el Adyuvante Incompleto de Freund (FIA). La cantidad de adyuvante agregada depende de la naturaleza del adyuvante mismo. El FIA puede ser ventajosamente emulsionado con sobrenadante viral inactivado en una proporción de alrededor de 1:1 por
volumen.

En algunos casos puede ser conveniente combinar la vacuna de la invención con otro antígeno en una vacuna de combinación, o en un kit que incluya ambos componentes por separado, la administración secuencial o simultanea, para el tratamiento o prevención de la VNN o una gran cantidad de enfermedades a las cuales los peces son susceptibles.. Otros antígenos con los cuales se puede combinar el nodavirus inactivado incluyen los antígenos a partir de: Iridovirus, VHSV, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Aeromonas spp., Vibrio spp., Edwardsiella spp., Lactococcus spp., Streptococcus spp., Flexibacter spp. y Nocardia spp.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Preparación de la vacuna viral inactivada

Las células SSN-1 se cultivan en un medio L15 (Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS) a 28ºC. Para subcultivar estas células, se lavaron dos veces las monocapas confluentes (con una antigüedad de 4 a 7 días) mediante la utilización de PBS Dulbeccos (Invitrogen) y se recolectaron mediante la utilización de tripsina-EDTA (Invitrogen). Un frasco de células es rutinariamente divido para producir otros 3 frascos (relación de separación 1:3).

Para propagar el virus para este estudio, se subcultivó un frasco confluente de 75 cm^{2} de células de SSN-1 para producir un frasco de 175 cm^{2} y un frasco de 25 cm^{2}. Se incuban a 28ºC hasta que las células son 70-80% confluentes (usualmente 1 día). El medio acondicionado es luego asépticamente extraido y retenido y se agregan 5 ml de Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS; Invitrogen) más 3 ml de nodavirus de la lubina de Malta pequeña (Mt/01/Sba) al frasco de 175 cm^{2}. El frasco de 25 cm^{2} se utilizó como prueba (control negativo) y se le agregó tan sólo 1 ml de medio acondicionado y 1 ml de HBSS + 2% de FBS. Los frascos se incubaron a 25ºC durante 30 minutos y luego se resuplementaron de la siguiente forma:

frasco de 175 cm^{2} - 8 ml como medio acondicionado más 8 ml L15 de medio L15 sólamente (sin FBS).

frasco de 25 cm^{2} - 2 ml como medio acondicionado más 2 ml L15 de medio sólamente (sin FBS).

\newpage

La composición final del medio es por lo tanto L15 + ca. FBS al 5%. La concentración de suero reducida retarda el crecimiento de las células para optimizar la replicación viral. Se incubaron las células a 25ºC y se monitorearon diariamente para el desarrollo de un efecto citopático (ECP). Cuando un ECP completo es evidente, se recolecta el sobrenadante de cultivo de células y se centrifuga a 1000 g durante 15 minutos a 4ºC para sedimentar los restos de células. Luego se trata este sobrenadante clarificado, que contiene el virus, con etileneimina binaria (BEI).

\vskip1.000000\baselineskip

Inactivación viral

(1): Ciclización de bromhidrato de 2-bromoetilamina en etileneimina binaria. Se agregó 2,1 g de bromhidrato de 2-bromoetilamina a 100 ml de 0,175 N NaOH para crear una solución de 0,1 M de etileneamina binaria (BEA). Se colocó la solución en un baño de agua a 37ºC durante 1-2 horas para crear etileneimina binaria (BEI).

(2): Inactivación del antígeno viral. Se agregaron 4 ml de 0,1 M de BEI a 96 ml de antígeno viral vivo, se mezcló bien y se incubó la muestra sobre una plataforma oscilante a 25ºC durante 72 horas (concentración final de BEI = 4 mM). También se prepara un control positivo en este paso que contiene virus "vivo" + HBSS solo y un control negativo que consiste en HBSS + BEI.

(3): Neutralización de BEI. Luego de 72 horas, se agrega 40 \mul de tiosulfato de sodio frío 2 M por 1 ml de antígeno de virus inactivado, y se lleva a cabo posteriormente la prueba de inactivación.

\vskip1.000000\baselineskip

Prueba de inactivación

Para probar que el virus ha sido inactivado con éxito y para determinar el TCID_{50} (dosis de infección del tejido de cultivo que afecta el 50% de los cultivos inoculados) del virus "vivo" (es decir, muestra de control positiva la cual no ha sido tratada con BEI), se lleva a cabo una titulación por retroceso sobre las células de SSN-1 en una placa de 96 de pocillos mediante la utilización de las siguientes muestras:

(a): Prueba = HBSS solamente

(b): Prueba = HBSS + tiosulfato de sodio

(c): Prueba = HBSS + BEI + tiosulfato de sodio

(d): Virus = virus vivo + HBSS solamente

(e): Virus = virus vivo + tiosulfato de sodio

(f): Virus inactivado = virus + BEI + tiosulfato de sodio

(g): Virus inactivado = virus + BEI + tiosulfato de sodio

(h): Virus inactivado = virus + BEI + tiosulfato de sodio

\vskip1.000000\baselineskip

Las muestras (a)-(c) actúan como controles negativos y demuestran el efecto que estos químicos podrían tener sobre las células. Las muestras (d) y (e) son los controles positivos y permiten que se calcule el TCID_{50} mediante la utilización del método Spearman-Kärber. La muestra (e) también muestra si el tiosulfato de sodio solo posee un efecto sobre el virus. Las muestras (f)-(h) son réplicas del virus inactivado y permiten controlar que el virus ha dejado de ser viable.

Se incubó la placa de 96 de pocillos a 25ºC y se monitoreó diariamente. Se tomó una lectura final luego de 7-10 días de incubación y se calculó el TCID_{50}.

Se inocularon también simultáneamente las muestras antes mencionadas en frascos de 25 cm^{2} de células de SSN-1 en un medio de L15 y de FBS al 5% y se incubaron a 25ºC. Luego de 7 días de incubación estos cultivos de células se pasaron a células de SSN-1 de 1 día de vida (monocapas preformadas). Se llevaron a cabo dos pasajes preformados sucesivos adicionales mediante la utilización del sobrenadante del día 7 del frasco pasado previamente como inoculante. Se monitorearon todos los frascos por un total de 21 días para controlar OPE. Todos los frascos que contienen virus tratado de BEI permanecen negativos al OPE (todos los otros controles son como se esperaban); por lo tanto, se puede asumir que el virus ha sido exitosamente inactivado.

El virus inactivado se emulsionó a 1:1 en Adyuvante Incompleto de Freund (FIA), a una concentración de 108 de TCID_{50}/ml.

\vskip1.000000\baselineskip

Antígeno recombinante

El antígeno recombinante se preparó mediante la clonación de la secuencia de códigos completa de la proteína de la cápside a partir de una cepa de nodavirus de fletán V9954 en el vector pET-30EK/LIV (Novagen). Siguiendo la inducción del cultivo de células anfitrionas con IPTG, se recolectó la proteínas cápside recombinante como un producto insoluble (cuerpos de inclusión). La proteína recombinante se solubilizó posteriormente, luego se volvió a replegar mediante la ejecución de varias rondas de diálisis. El antígeno recombinante final se emulsionó a 1:1 en Adyuvante Incompleto de Freund (FIA), a una concentración final de proteína de 0,675 mg/ml.

Las vacunas emulsionadas y los controles se realizaron mediante goteo (de alrededor de 1 gota sec-1) de FIA en tubos estériles Falcon de 15 ml que contenían la vacuna o el control respectivo, mientras se agitaban con un vortex.

\vskip1.000000\baselineskip

Vacunación

Las lubinas (Dicentrarchus labrax) de un peso medio de 18 g se mantienen en tanques de aproximadamente 40 L cada uno, con 60 o 65 peces por tanque. Los tanques se abastecen mediante un sistema de agua salada (al 35\textperthousand) a 23\pm1ºC tratada con ozono (cuando es necesario) y UV de recirculación, y alimentados con alimento comercial para lubina (SORGAL S.A., Ovar, Portugal).

Posteriormente de una aclimatización de 7 días en el nuevo sistema de contención y tras ser privados de alimento por 24 horas, se anestesió a los peces y se los inmunizó con uno de los siguientes tratamientos en grupos duplicados mediante una inyección intraperitoneal (100 \mul/pez): antígeno recombinado 1:1 en FIA; virus inactivado de BEI 1:1 en FIA, PBS 1:1 en FIA (control); HBSS (Solución Salina Balanceada de Hank/Gibco BRL) 1:1 en FIA (control).

\vskip1.000000\baselineskip

Provocación por exposición

Los peces son expuestos en el día 24 (552 grados día), luego de ser privados de alimento por un período de 24 horas. Se obtuvo inoculante de nodavirus virulento de un aislado de nodavirus de Malta (MT/01/Sba) originado a partir de lubinas juveniles cultivadas. Se inocularon simultáneamente cultivos de tejido de recolección original en células de SSN-1 mediante el uso de un medio L-15 suplementado con FBS al 5% y se incubó a 25ºC. Cuando el OPE estuvo completo, se clarificaron los cultivos de tejido mediante centrifugación a 1500 g durante 15 minutos y se reinoculó el sobrenadante conteniendo el virus (inoculación preformada) en líneas de SSN-1 a fin de alcanzar una alta concentración del virus. Luego del OPE completo, se centrifugaron los cultivos de tejido (a 1500 g durante 15 minutos) y se almacenaron a - 70ºC hasta su utilización. Se agregaron luego las células SSN-1 y se incubaron con el virus a 25ºC. La TCID_{50} (dosis de infección del tejido de cultivo que afecta el 50% de los cultivos inoculados) se calculó según el método de Spearman-Kärber (1931).

Despues del descongelamiento, se diluyó el inoculante de provocación en HBSS (Gibco) suplementado con FBS al 2% para obtener una dosis de provocación de 107 de TCID_{50} por pez. Durante la anestesia, se inoculó cada pez por vía IP con 100 \mul de inoculante. Se incrementó la temperatura del tanque de agua a 26ºC 3 días después de la provocación para recrear un brote viral natural. Se tomaron muestras del tejido del cerebro de peces muertos para confirmar la presencia del virus.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados

Las mortalidades específicas comienzan en todos los grupos el día 6 después de la provocación, llegan a un pico a los días 7-8 días y disminuyen hacia el día 14 después de la provocación. Se termina el ensayo 31 días después de la provocación. Se someten los datos obtenidos a la prueba Z para comparar dos proporciones mediante la utilización de un nivel de significatividad de P<0,05.

Se obtuvo una protección significativa con los grupos vacunados con virus de BEI inactivado, en comparación con los grupos de control respectivos, mientras que el grupo vacunado con la proteína recombinada de la cápside se encuentra desprotegido.

TABLA 1 Porcentaje de supervivencia y porcentaje relativo de supervivencia de los grupos vacunados

1

A fin de controlar los posibles efectos protectivos de los retrovirus que se encuentran presente en la línea celular del SSN-1 se llevó a cabo un segundo ensayo de una forma idéntica a la del primer ensayo, que compara el nodavirus BEI inactivado con un control de PBS como en el ensayo 1 y con un control adicional que consiste en un retrovirus BEI inactivado emulsionado 1:1 en FIA. La tabla 2 muestra los resultados de este segundo ensayo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Repetición de Ensayo con control de retrovirus inactivado

2

Aunque el RPS para la vacuna de nodavirus de BEI inactivada es inferior (77%) en el ensayo 2 que al compararlo con la HBSS en el primer ensayo (91,95%) la provocación es más fuerte (el control de PBS en el ensayo 1 obtuvo una mortalidad del 45,5%, comparado con el 59,26% del ensayo 2).

Estos experimentos de provocación muestran que, en contra de toda expectativa, un nodavirus de peces inactivado utilizando un compuesto aziridina (BEI) puede ser notablemente efectivo en prevenir las mortalidades asociadas con la infección por nodavirus en las lubinas. Los mecanismos específicos de inactivación de virus mediante la utilización de agentes diferentes aún no se comprenden en profundidad, y en particular los efectos de inactivación mediante la utilización de compuestos aziridina en la inmunogenicidad de los nodavirus no pudieron haber sido previstos, dado a la escasez de conocimiento en este campo. Los hallazgos de los ejemplos son particularmente sorprendentes en vista de la incapacidad reportada del nodavirus inactivado para proteger los peces contra la VNN.

Claims

1. Una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada Mt/01/Sba depositada en la ECACC bajo el Número de Registro 03060401 o una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada la cual reacciona serológicamente con un antisuero generado contra dicha cepa depositada Mt/01/Sba.

2. Una composición de vacuna para la prevención o tratamiento de la infección por nodavirus en peces, que comprende un nodavirus de peces inactivado según la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición de vacuna según la reivindicación 2 donde dicho nodavirus es un agente etiológico de necrosis nerviosa viral (VNN) o encefalopatía viral y retinopatía en peces.

4. Una composición de vacuna según la reivindicación 2 ó 3 donde dicho nodavirus ha sido inactivado mediante la utilización de un compuesto aziridina.

5. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 que comprende un adyuvante.

6. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 donde dicho adyuvante es un Adyuvante Incompleto de Freund.

7. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 la cual comprende alrededor de 105 a aproximadamente 108 de TCID_{50} de nodavirus inactivado por unidad de dosis.

8. Una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a 7 en donde dicho compuesto aziridina es etileneimina binaria (BEI).

9. La utilización de una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada Mt/01/Sba depositada con ECACC bajo el Número de Registro 03060401 o la utilización de una cepa viral de necrosis nerviosa viral de peces inactivada la cual reacciona serológicamente con un antisuero generado contra la cepa Mt/01/Sba depositada con ECACC bajo el Número de Registro 03060401 para la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de la infección por nodavirus en los peces.

10. La utilización según la reivindicación 9, donde dicho nodavirus ha sido inactivado mediante la utilización de un compuesto aziridina.

11. La utilización según la reivindicación 9 ó 10 donde dicho nodavirus es un agente etiológico de necrosis nerviosa viral (VNN) o encefalopatía viral y retinopatía en peces.

12. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 11 donde dicho pez es la lubina (Dicentrarchus labrax).

13. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 donde dicho pez es bacalao (Gadbus morhua), y el medicamento es para la vacunación de peces salmónidos co-cultivados.

14. La utilización según cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 13 donde dicho pez es un potencial portador de las infecciones por nodavirus.