ES2327300T3 - Vacuna contra el vih. - Google Patents
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Abstract
Virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) recombinante no citolítico en el que la secuencia señal natural (NSS) de la glicoproteína de la envuelta del virus se modifica mediante la eliminación de aminoácidos cargados positivamente para proporcionar una secuencia señal no citolítica o en el que la NSS se sustituye con o bien una secuencia señal de melitina (MSS) o bien una secuencia señal de IL-3 (ILSS).
Description
Vacuna contra el VIH.
La invención se refiere a una vacuna novedosa
para su uso en el tratamiento del SIDA así como a métodos para la
producción de la misma. Más particularmente, la invención se refiere
a una vacuna que puede producirse en grandes cantidades y que es no
citolítica y no virulenta.
Pese a los recientes avances en la terapia
antiviral, no hay cura permanente para el SIDA o la infección por
VIH. La terapia farmacológica es un área prometedora de
investigación en lo que se refiere a proporcionar una terapia
eficaz, sin embargo debido a los efectos secundarios, el
cumplimiento y el gasto, el progreso no ha sido rápido. Para
agravar estas dificultades está el hecho de que la disponibilidad de
tales fármacos es limitada en países en desarrollo en los que se
estima que se producirá un 90% de las infecciones por VIH hacia el
año 2000.
Debido al éxito que han tenido las vacunas para
las enfermedades infecciosas, siendo el más notable contra la
viruela y la poliomelitis, continúa la búsqueda de una vacuna eficaz
contra el SIDA. Se ha intentado una variedad de enfoques. De hecho,
la mayor parte del desarrollo de la vacuna contra el
VIH-1 se ha concentrado en las vacunas de
subunidades. La dificultad con el enfoque de la vacuna de
subunidades ha sido la capacidad para producir inmunidad óptima. En
la actualidad, no se conoce exactamente qué componentes del/de los
antígeno(s) del VIH y del sistema inmunitario son necesarios
para la protección frente a la infección natural.
Los ensayos iniciales con vacunas han
considerado inmunógenos basados en proteínas de subunidades
recombinantes, tal como la proteína gp120 de la envuelta del
VIH-1. Los resultados de este enfoque han sido
decepcionantes, aunque los regímenes de inmunización que emplean
tanto virus recombinantes vivos como proteínas de subunidades han
provocado, en algunos individuos, tanto CTL CD8+ específicos de la
envuelta como anticuerpos neutralizantes frente a la envuelta del
VIH-1 (Cooney E. L., et al., Proc Natl Acad
Sci USA 1993; 90: 1882-86; McElrath M. J., et
al. J Infect Dis. 169: 41-47 (1994); Graham B.
S., et al. J Infect Dis 166: 244-52 (1992);
y Graham B. S., et al. J Infect Dis 167:
533-37 (1993)).
Los estudios de la glicoproteína de la envuelta
del VIH no han proporcionado un camino plausible hacia el
desarrollo de vacunas. Por ejemplo, con respecto a la gp120 del
VIH-1, se ha encontrado que la secuencia señal de
la glicoproteína gp120 de la envuelta del VIH-1, que
se denomina NSS para la secuencia señal natural del
VIH-1, está asociada con el grado de secreción de la
gp120. En cuanto a esto se ha mostrado que la sustitución de la NSS
con la secuencia señal de o bien melitina o bien
IL-3 da lugar a una producción de alto nivel y una
secreción eficaz de la gp120 (Li, Y., et al. Virology 204:
266-278 (1994); y Li, Y., et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 9606-9611 (1996). Sin embargo, no se
conoce si la secuencia señal de la gp120 del VIH-1
tiene un papel que desempeñar en la patogenicidad del virus.
La vía preferida es el uso de vacunas de virus
inactivado, completo, tal como la vacuna del virus poliomelítico
inactivado, o vacunas de virus vivo atenuado, tal como la vacuna del
virus poliomelítico oral. Desgraciadamente, este enfoque en la
búsqueda de una vacuna contra el virus del SIDA parece ser demasiado
peligroso, dado el potencial de producir problemas tales como el
"incidente Cutter" en el que la inactivación inadecuada de la
vacuna antipoliomelítica dio como resultado una poliomelitis clínica
real. Un enfoque previo ha incorporado el uso de
VIH-1 de tipo natural, sin embargo, fue imposible
producir una cantidad adecuada de virus para virus completo
inactivado porque el rendimiento de las líneas de células T
infectadas con VIH-1 era muy bajo (Coffin et
al. Retroviruses, CSH Press, 1989). Suponiendo que es posible
aumentar el rendimiento, también hay una preocupación acerca de la
responsabilidad potencial de hacer crecer grandes volúmenes de
VIH-1 infeccioso.
Con respecto a las vacunas contra el VIH, se
sabe que la deleción del gen nef del VIH atenúa el virus.
Desrosiers y sus asociados han demostrado que la vacunación de
macacos con VIS con nef delecionado protegía contra la
exposición al VIS de tipo natural (Daniels, M. D. et al.
Science 258:1938 (1992); Desrosiers, R. C., et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:6353 (1989)) y otros han demostrado que el
gen nef es prescindible para la replicación del VIS y el VIH
(Daniels, M. D. et al. Science 258: 1938 (1992); Gibbs, J.
S., et al. AIDS Res. and Human Retroviruses 10:343 (1994);
Igarashi, T., et al. J. Gen. Virol. 78: 985 (1997); Kestler
III, H. W., et al. Cell 65:651 (1991)). Además, la deleción
del gen nef convierte al virus en no patogénico en el
huésped normalmente susceptible (Daniels, M. D. et al.
Science 258:1938 (1992)). Aunque esta deleción no proporciona una
forma del virus que es posible que se produzca en grandes
cantidades. Tampoco se ha mostrado que esta forma del virus sea
segura para la producción de una
vacuna.
vacuna.
En consecuencia, lo que se necesita es una
vacuna que no sea virulenta así como que pueda producirse en grandes
cantidades, y sin las preocupaciones y problemas previos de usar
VIH-1 de tipo natural.
Los presentes inventores han encontrado que la
secuencia señal natural (NSS) de la glicoproteína gp120 de la
envuelta del virus de la inmunodeficiencia humana 1
(VIH-1) es responsable de la apoptosis así como de
la necrosis general de las células infectadas con el virus. Los
inventores también han encontrado que la sustitución de la NSS con
una secuencia señal más eficaz, tal como la secuencia señal de
melitina o IL-3, genera un VIH-1 no
citolítico que puede tener replicación y secreción sumamente
eficaces de gp120. En consecuencia, la presente invención se
refiere a un retrovirus no citolítico que puede realizar replicación
viral sumamente eficaz y que por tanto es útil en la preparación de
una vacuna retroviral. En su aspecto más amplio, la presente
invención proporciona un retrovirus no citolítico en el que la
secuencia señal natural de la glicoproteína de la envuelta del
virus se modifica para que sea no citolítico o se sustituye con una
secuencia señal no citolítica.
Según una realización, la modificación de la
secuencia señal natural de una glicoproteína de la envuelta del
retrovirus da como resultado una replicación más eficaz del virus,
preferiblemente del VIH. Por consiguiente, la presente invención
proporciona un VIH-1 recombinante no citolítico que
puede realizar replicación sumamente eficaz en el que la NSS de la
glicoproteína de la envuelta del virus se modifica suficientemente
para prevenir el daño celular producido por el virus,
preferiblemente mediante la eliminación de aminoácidos cargados
positivamente, incluso más preferiblemente, dando como resultado
tal eliminación o modificación no más de uno (1) y preferiblemente
cero (0) aminoácidos cargados positivamente.
En otra realización, la sustitución de la
secuencia señal natural da como resultado una replicación más eficaz
del VIH. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
VIH-1 recombinante no citolítico que puede realizar
replicación sumamente eficaz en el que la NSS de la glicoproteína de
la envuelta del virus se sustituye con una secuencia señal no
citolítica y más eficaz, que contiene preferiblemente no más de uno
y preferiblemente cero aminoácidos cargados positivamente, más
preferiblemente la secuencia señal de melitina (MSS) o la secuencia
señal de IL-3 (ILSS).
Según otra realización, un retrovirus
esencialmente no citolítico también es no virulento. Por
consiguiente, la presente invención proporciona un retrovirus no
virulento, no citolítico que comprende una adición o deleción de
secuencia de ácido nucleico que convierte al virus en no virulento y
en el que la secuencia señal natural de la glicoproteína de la
envuelta del virus o bien se modifica o bien se sustituye para
proporcionar una secuencia señal no citolítica.
En una realización preferida se proporciona un
retrovirus no virulento, no citolítico, que contiene una deleción
suficiente del gen nef para convertir el virus en no
patogénico, y en el que la NSS de la glicoproteína gp120 de la
envuelta del virus se modifica o se sustituye para proporcionar una
secuencia señal más eficaz.
Según una realización específica de la invención
se proporciona un VIH-1 no virulento, no citolítico
que puede realizar replicación sumamente eficaz, con deleción
suficiente del gen nef para convertir el virus en no
patogénico en un huésped normalmente susceptible y en el que la NSS
de la glicoproteína gp120 de la envuelta del virus se sustituye con
una secuencia señal más eficaz, preferiblemente MSS o ILSS.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una vacuna contra una infección retroviral que comprende
un retrovirus recombinante no citolítico en el que la NSS de la
glicoproteína de la envuelta del virus se modifica para
proporcionar una NSS no citolítica o se sustituye con una NSS no
citolítica. El retrovirus recombinante puede proporcionar
protección frente al retrovirus de tipo natural pese a las
modificaciones genéticas incorporadas en el retrovirus
recombinante, ya que contendrá los epítopos conformacionales
necesarios para generar inmunidad protectora. Preferiblemente, el
retrovirus es el VIH, más preferiblemente todos los clados
diferentes del VIH-1.
La presente invención también incluye un método
de prevención de la apoptosis inducida por infección retroviral que
comprende administrar una cantidad suficiente de antagonista para la
NSS a un animal con necesidad del mismo, preferiblemente un
anticuerpo o molécula antisentido.
La presente invención también incluye un método
de prevención o tratamiento de una infección retroviral que
comprende administrar un retrovirus recombinante no citolítico, en
el que la NSS de la glicoproteína de la envuelta del virus se
modifica para proporcionar una NSS no citolítica o se sustituye con
una NSS no citolítica, a un animal con necesidad del mismo.
La presente invención incluye además un método
de destrucción de células denominadas en el presente documento
células "diana", preferiblemente células cancerosas, que
comprende administrar un virus recombinante, específico para las
células diana, que se ha obtenido mediante ingeniería genética para
contener la NSS del VIH-1, a un animal con
necesidad del mismo.
La presente invención incluye además una célula
transfectada con un retrovirus recombinante de la presente
invención.
Otras características y ventajas de la presente
invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción
detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada
y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas
de la invención se facilitan a modo de ilustración únicamente,
puesto que a los expertos en la técnica les resultarán evidentes
diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance
de la invención a partir de esta descripción detallada.
La invención se describirá ahora con relación a
los dibujos en los que:
La figura 1 son fotografías de examen
microscópico de células de SF2/insecto infectadas con baculovirus
recombinante (AcVPN).
La figura 2 proporciona gráficos que ilustran
los efectos de la secuencia señal de env de
VIH-1 sobre la muerte celular.
La figura 3 muestra resultados de electroforesis
en gel de agarosa que proporcionan un análisis de la fragmentación
del ADN de células SF21 infectadas con AcVPN recombinante que
expresa gp120 con diferentes secuencias señal.
La figura 4 muestra electroforesis en gel de
agarosa que proporciona un análisis de la fragmentación del ADN de
células SF21 infectadas con baculovirus recombinante que expresa la
glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
(VEV-G) con o sin la secuencia señal natural de
env de VIH-1.
La figura 5 es una ilustración de una
construcción de plásmido recombinante de la proteína
VEV-G sin la secuencia señal.
La figura 6 es una ilustración de una
construcción de la gp120 del VIH-1 que contiene la
NSS.
La figura 7 es una ilustración del plásmido pBSK
VEV-G-NSS; este plásmido contiene la
secuencia génica de la proteína VEV-G con la
secuencia señal natural de la proteína de env del
VIH-1.
La figura 8 es una ilustración de una
construcción de plásmido recombinante en la que el sitio
EcoRI-BamHI contiene el fragmento subclonado de
pNL4-3 en el vector pBluescript SK.
La figura 9 es una ilustración de una
construcción de plásmido recombinante que contiene un fragmento de
2245 pb clonado en los sitios PstI+BamHI.
La figura 10 es una ilustración de una
construcción de plásmido recombinante que contiene productos de PCR
digeridos por EcoRI y Pst-I (fragmento de 445
pb).
La figura 11 es una ilustración de un plásmido
recombinante, construcción que contiene un oligonucleótido que
codifica o bien para la secuencia señal de melitina o bien para la
secuencia señal de interleucina-3.
La figura 12 es una ilustración de una
construcción de plásmido recombinante que contiene un fragmento de
421 pb aislado de la secuencia codificante del gen nef en los
sitios Bam HI-XhoI del vector.
Tal como se mencionó anteriormente en el
presente documento, la presente invención se refiere a un retrovirus
no citolítico en el que la secuencia señal natural (NSS) de la
glicoproteína gp120 de la envuelta del VIH-1 se
modifica para que sea esencialmente no citolítico o se sustituye con
una secuencia señal no citolítica. El término "esencialmente no
citolítico" tal como se usa en el presente documento significa
que el retrovirus no mata ni daña significativamente las células
que infecta.
En una realización, la presente invención
proporciona un VIH-1 recombinante no citolítico que
puede realizar replicación sumamente eficaz en el que la NSS de la
glicoproteína de la envuelta del virus se modifica suficientemente
para prevenir el daño celular producido por el virus,
preferiblemente mediante la eliminación de aminoácidos cargados
positivamente, incluso más preferiblemente, dando como resultado tal
eliminación o modificación no más de uno (1) y preferiblemente cero
(0) aminoácidos cargados positivamente. Los aminoácidos cargados
positivamente que se modifican o se sustituyen incluyen lisina y
arginina.
En otra realización, la sustitución de la
secuencia señal natural da como resultado una replicación más eficaz
del VIH. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
VIH-1 recombinante no citolítico que puede realizar
replicación sumamente eficaz en el que la NSS de la glicoproteína de
la envuelta del virus se sustituye con una secuencia señal no
citolítica y más eficaz. En una realización preferida, la
sustitución de la NSS de la glicoproteína de la envuelta del
VIH-1 con la secuencia señal o bien de melitina o
bien de IL-3 disminuye la citotoxicidad del
retrovirus. Como tal, la presente invención incluye dentro de su
alcance la sustitución de la NSS con cualquier secuencia señal que
convierta al retrovirus en no citolítico. Los inventores también
han mostrado que la sustitución de la NSS con las secuencias señal
de melitina o IL-3 da como resultado un mayor nivel
de producción y secreción de la gp120, además de la citotoxicidad
reducida. Los inventores también han mostrado que la sustitución de
la NSS da como resultado la deleción parcial del gen \nupu. Los
estudios han mostrado que el gen \nupu puede delecionarse
completamente sin ningún efecto medible en la capacidad para
replicarse del virus (James et al. AIDS Res. Human Retrovirus
10:343-350,
1994).
1994).
En otra realización, el retrovirus se convierte
en no virulento. En una realización preferida, el virus se
convierte en no virulento mediante la deleción del gen nef.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un retrovirus
no virulento, esencialmente no citolítico que contiene una deleción
suficiente del gen nef para convertir el virus en no
patogénico y en el que la secuencia codificante de la glicoproteína
gp120 de la envuelta del virus se sustituye con una secuencia señal
más eficaz. Tal como se usa en el presente documento, "deleción
suficiente" significa deleción de suficiente cantidad de la
secuencia para prevenir la transcripción y de ese modo la
producción del producto proteico nef.
En una realización adicional, el retrovirus se
convierte en no virulento, no citolítico, y contiene una deleción
suficiente del gen nef y del gen \nupu para convertir el
virus en no patogénico.
El retrovirus recombinante de la presente
invención puede ser cualquier retrovirus incluyendo
VIH-1, VIH-2, VIS,
VLTH-1. Preferiblemente el retrovirus es un virus de
la inmunodeficiencia humana seleccionado de VIH-1 y
VIH-2, más preferiblemente, el retrovirus es el
VIH-1.
Los retrovirus recombinantes de la presente
invención pueden prepararse usando técnicas conocidas en la técnica.
En una realización, el retrovirus puede introducirse en una célula
huésped en condiciones adecuadas para la replicación y la expresión
del retrovirus en el huésped. Por consiguiente, la presente
invención también proporciona una célula transfectada con un
retrovirus recombinante en el que la secuencia señal natural de la
glicoproteína gp120 de la envuelta del virus se modifica para
proporcionar un virus no citotóxico o se sustituye con una
secuencia señal no citolítica. La célula es preferiblemente un
linfocito T, más preferiblemente una célula T que no proviene de
una línea celular transformada.
El retrovirus no citolítico y no virulento de la
presente invención será extremadamente útil para la prevención y el
tratamiento de una infección retroviral ya que el retrovirus puede
producirse en grandes cantidades y de una forma que no es
patogénica para el huésped, preferiblemente el virus de la invención
será útil para el desarrollo de vacunas contra el VIH/SIDA para la
prevención y el tratamiento de infecciones por VIH. Por
consiguiente, la presente invención también proporciona un método de
prevención o tratamiento de una infección retroviral que comprende
administrar una cantidad eficaz de un retrovirus recombinante
inactivado no citolítico no virulento de la presente invención a un
animal con necesidad del mismo. El término "cantidad eficaz"
tal como se usa en el presente documento significa una cantidad
eficaz y a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios
para lograr el resultado deseado. El término "animal" tal como
se usa en el presente documento incluye todos los miembros del
reino animal incluyendo los mamíferos, preferiblemente los seres
humanos.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona un método de prevención o tratamiento de una
infección retroviral que comprende administrar una cantidad eficaz
de un retrovirus recombinante inactivado esencialmente no
citolítico no virulento a un animal con necesidad del mismo, en el
que la secuencia señal natural de la glicoproteína de la envuelta
del virus, preferiblemente gp120, se modifica para proporcionar una
secuencia señal no citolítica, convirtiéndose preferiblemente el
virus en virulento mediante la deleción del gen nef. Según
una realización preferida, la modificación para proporcionar una NSS
no citolítica da como resultado no más de un aminoácido cargado
positivamente en la secuencia NSS, más preferiblemente cero
aminoácidos cargados positivamente. Lo más preferiblemente, el
animal es un ser humano, preferiblemente el retrovirus es el
VIH-1.
En una realización preferida adicional, la
presente invención proporciona un método de prevención o tratamiento
de una infección retroviral que comprende administrar una cantidad
eficaz de un retrovirus recombinante inactivado no citolítico no
virulento a un animal con necesidad del mismo, en el que la
secuencia señal natural de la glicoproteína de la envuelta del
virus, preferiblemente gp120, se sustituye con una secuencia señal
no citolítica, convirtiéndose preferiblemente el virus en no
virulento mediante la deleción del gen nef. Lo más
preferiblemente, el animal es un ser humano, preferiblemente el
retrovirus es el VIH-1.
Según una realización preferida del método en el
que se sustituye la NSS, la secuencia señal no citolítica se
selecciona del grupo que consiste en la secuencia de melitina y en
la secuencia señal de IL-3.
La presente invención incluye además una vacuna
que comprende una cantidad eficaz de un retrovirus no citolítico y
uno no virulento en el que la secuencia señal natural de la
glicoproteína de la envuelta del virus, preferiblemente gp120, se
sustituye con una secuencia señal no citolítica y el virus se
convierte en no virulento mediante la deleción de una parte
suficiente del gen nef. El retrovirus también puede tener una
parte del gen \nupu delecionada como resultado de la sustitución
de la NSS. Preferiblemente, la secuencia señal no citolítica se
selecciona del grupo que consiste en la secuencia de melitina y la
secuencia señal de IL-3.
\newpage
Según una realización, la modificación de la
secuencia señal natural de una glicoproteína de la envuelta del
retrovirus da como resultado una replicación más eficaz del virus,
preferiblemente VIH. Por consiguiente, la presente invención
proporciona un VIH-1 recombinante no citolítico que
puede realizar replicación sumamente eficaz en el que la NSS de la
glicoproteína de la envuelta del virus se modifica suficientemente
para prevenir el daño celular producido por el virus,
preferiblemente mediante la eliminación de aminoácidos cargados
positivamente, incluso más preferiblemente, dando como resultado
tal eliminación o modificación no más de un (1) aminoácido cargado
positivamente, más preferiblemente no más de cero (0) aminoácidos
cargados positivamente.
En otra realización, la sustitución de la
secuencia señal no citolítica da como resultado una replicación más
eficaz del VIH. Por consiguiente, la presente invención proporciona
una vacuna compuesta por un VIH-1 recombinante no
citolítico que puede realizar replicación sumamente eficaz en el que
la NSS de la glicoproteína de la envuelta del virus se sustituye
con una secuencia señal no citolítica y más eficaz, que contiene
preferiblemente no más de un aminoácido positivo, preferiblemente
la secuencia señal de melitina (MSS) o la secuencia señal de
IL-3 (ILSS).
Según otra realización, un retrovirus
esencialmente no citolítico también es no virulento, preferiblemente
a través de la deleción del gen nef. Por consiguiente, la
presente invención proporciona una vacuna que comprende un
retrovirus no virulento, esencialmente no citolítico que comprende
una adición o deleción de secuencia de ácido nucleico que convierte
al virus en no virulento y en la que la secuencia señal natural de
la glicoproteína de la envuelta del virus o bien se modifica o bien
se sustituye para proporcionar una secuencia señal esencialmente no
citolítica.
Alternativamente, la vacuna puede comprender una
cantidad eficaz de un retrovirus no virulento y no citolítico en el
que la secuencia señal natural de la glicoproteína gp120 de la
envuelta del virus se modifica para reducir el número de
aminoácidos positivos hasta no más de un aminoácido cargado
positivamente, preferiblemente no más de cero aminoácidos cargados
positivamente y el virus se convierte en no virulento mediante la
deleción de una parte suficiente del gen nef.
Por consiguiente, la presente invención también
incluye un método de prevención o tratamiento de una infección
retroviral que comprende administrar una vacuna de la presente
invención a un animal con necesidad del mismo. Tal como se usa en
el presente documento, "vacuna" incluye todas las vacunas
profilácticas y terapéuticas. Según una realización, la vacuna
contiene un retrovirus recombinante no virulento y no citolítico, en
el que la NSS de la glicoproteína de la envuelta del virus se
modifica para proporcionar una NSS no citolítica o se sustituye con
una NSS no citolítica y el virus se convierte en no virulento
mediante la deleción de una parte suficiente del gen
nef.
Las composiciones de vacuna de la invención son
adecuadas para su administración a sujetos de una forma
biológicamente compatible in vivo. La expresión "forma
biológicamente compatible adecuada para la administración in
vivo" tal como se usa en el presente documento significa una
forma de la sustancia que va a administrarse en la que cualquier
efecto tóxico queda compensado por los efectos terapéuticos. Las
sustancias pueden administrarse a cualquier animal, preferiblemente
a seres humanos.
Las vacunas de la presente invención pueden
contener adicionalmente diluyentes, adyuvantes y/o vehículos
adecuados. Preferiblemente, las vacunas contienen un adyuvante que
puede potenciar la inmunogenicidad de la vacuna in vivo. El
adyuvante puede seleccionarse de muchos adyuvantes conocidos en la
técnica incluyendo la parte de lípido A de la endotoxina de las
bacterias Gram negativas, dimicolato de trehalosa de micobacterias,
el fosfolípido lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio
(DDA), ciertos polímeros de bloque lineales de
polioxipropileno-polioxietileno
(POP-POE), hidróxido de aluminio y liposomas. Las
vacunas también pueden incluir citocinas que se sabe que potencian
la respuesta inmunitaria incluyendo CM-CSF,
IL-2, IL-12, TNF e IFN\gamma.
La dosis de la vacuna puede variar según
factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso
del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una
respuesta deseada en el individuo. Puede ajustarse el régimen de
dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por
ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o
la dosis puede reducirse proporcionalmente tal como indiquen las
exigencias de la situación terapéutica. La dosis de la vacuna
también puede variarse para proporcionar una respuesta a la dosis
preventiva óptima dependiendo de las circunstancias.
Las vacunas pueden administrarse de cualquier
manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea,
intravenosa, intramuscular, etc.), administración oral, inhalación,
administración transdérmica (tal como pomada o crema tópica, etc.)
o aplicaciones de supositorio.
La presente invención también incluye un método
de prevención de que la NSS de un retrovirus ejerza sus efectos
apoptóticos sobre una célula, apoptosis inducida por una infección
retroviral. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
método de prevención o inhibición de la apoptosis que comprende
administrar una cantidad suficiente de antagonista para la NSS a un
animal con necesidad del mismo. El antagonista puede ser cualquier
sustancia que pueda inhibir el gen de la NSS o su producto proteico
al que se hace referencia en el presente documento como "proteína
de NSS", preferiblemente el antagonista es un anticuerpo o una
molécula antisentido.
\newpage
En una realización, el antagonista es una
sustancia que inhibe la proteína de NSS tal como un anticuerpo
específico para la proteína de NSS. Los anticuerpos frente a la
proteína de NSS pueden prepararse usando técnicas conocidas en la
técnica tales como las descritas por Kohler y Milstein, Nature 256,
495 (1975) y en las patentes estadounidenses números RE 32.011,
4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993 (véanse también Monoclonal
Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,
Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.), 1980, y
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Dentro del contexto de la
presente invención, se entiende que los anticuerpos incluyen
anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de
anticuerpo (por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}) y parejas de
unión producidas de manera recombinante. En consecuencia, la
presente invención proporciona un método de inhibición de los
efectos de la NSS de un retrovirus que comprende administrar una
cantidad eficaz de un anticuerpo que inhibe la proteína de NSS.
Además de los anticuerpos, también pueden usarse
otros antagonistas o ligandos que se unen a la proteína de NSS y
que inhiben su función. Pueden identificarse ligandos de la proteína
de NSS sometiendo a ensayo una muestra para péptidos que se une a
la proteína de NSS. Puede usarse cualquier sistema o método de
ensayo que detecte interacciones proteína-proteína,
incluyendo co-inmunoprecipitación, reticulación y
co-purificación a través de gradientes o columnas
cromatográficas. Pueden someterse a prueba muestras biológicas y
bibliotecas comercialmente disponibles para péptidos de unión a la
proteína de NSS. Por ejemplo, puede usarse proteína de NSS marcada
o proteína de NSS soluble para sondar bibliotecas de presentación en
fagos. Además, pueden usarse anticuerpos que se unen a la proteína
de NSS para aislar otros péptidos con afinidad de unión a la
proteína de NSS. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos marcados
para sondar bibliotecas de presentación en fagos o muestras
biológicas. Además, puede usarse una secuencia de ácido nucleico que
codifica para una proteína de NSS para sondar muestras biológicas o
bibliotecas para ácidos nucleicos que codifican para ligandos o
proteínas de unión a la proteína de NSS.
En otra realización, el antagonista de NSS es un
oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de la proteína
de NSS. En los métodos de la presente invención pueden usarse
oligonucleótidos antisentido que son complementarios a una
secuencia de ácido nucleico de un gen de la proteína de NSS para
inhibir la proteína de NSS.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un método de inhibición de los efectos de la NSS de un
retrovirus que comprende administrar una cantidad eficaz de un
oligonucleótido antisentido que es complementario a una secuencia
de ácido nucleico de un gen de la proteína de NSS a un animal con
necesidad del mismo. Preferiblemente, el retrovirus es el
VIH-1.
El término oligonucleótido antisentido tal como
se usa en el presente documento significa una secuencia de
nucleótidos que es complementaria a su diana.
El término "oligonucleótido" se refiere a
un oligómero o polímero de monómeros de nucleósido o nucleótido que
consisten en bases, azúcares y uniones entre azúcares (estructura
principal) que se producen de manera natural. El término también
incluye oligómeros modificados o sustituidos que comprenden
monómeros que no se producen de manera natural o partes de los
mismos, que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos
modificados o sustituidos pueden preferirse con respecto a las
formas que se producen de manera natural debido a propiedades tales
como captación celular potenciada, o estabilidad aumentada en
presencia de nucleasas. El término también incluye oligonucleótidos
quiméricos que contienen dos o más regiones químicamente distintas.
Por ejemplo, los oligonucleótidos quiméricos pueden contener al
menos una región de nucleótidos modificados que confieren
propiedades beneficiosas (por ejemplo, resistencia a nucleasas
aumentada, captación aumentada en las células), o dos o más
oligonucleótidos de la invención pueden unirse para formar un
oligonucleótido quimérico.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente
invención pueden ser ácidos ribonucleico o desoxirribonucleico y
pueden contener bases que se producen de manera natural incluyendo
adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Los
oligonucleótidos también pueden contener bases modificadas tales
como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina,
6-metilo, 2-propilo y otras
alquiladeninas, 5-halouracilo,
5-halocitosina, 6-azauracilo,
6-azacitosina y 6-azatimina,
pseudouracilo, 4-tiouracilo,
8-haloadenina, 8-aminoadenina,
8-tioladenina, 8-tiolalquiladeninas,
8-hidroxiladenina y otras adeninas
8-sustituidas, 8-haloguaninas,
8-aminoguanina, 8-tiolguanina,
8-tiolalquilguaninas,
8-hidroxilguanina y otras guaninas
8-sustituidas, otros aza- y desazauracilos,
timidinas, citosinas, adeninas o guaninas,
5-trifluorometiluracilo y
5-trifluorocitosina.
Otros oligonucleótidos antisentido de la
invención pueden contener heteroátomos de oxígeno, fósforo
modificado en la estructura principal de fosfato, uniones entre
azúcares de cicloalquilo o alquilo de cadena corta o uniones entre
azúcares heterocíclicas o heteroatómicas de cadena corta. Por
ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden contener
fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos y fosforoditioatos.
En una realización de la invención hay uniones de enlaces de
fosforotioato entre de la cuarta a la sexta bases del extremo 3'
terminal. En otra realización, los enlaces de fosforotioato unen
todos los nucleótidos.
Los oligonucleótidos antisentido de la invención
también pueden comprender análogos de nucleótidos que pueden
adaptarse mejor como reactivos terapéuticos o experimentales. Un
ejemplo de un análogo de oligonucleótido es un ácido nucleico
peptídico (PNA) en el que la estructura principal de desoxirribosa
(o ribosa) - fosfato en el ADN (o el ARN) se sustituye con una
estructura principal de poliamida que es similar a la encontrada en
péptidos (P. E. Nielsen, et al Science 1991, 254, 1497). Se
ha mostrado que los análogos de PNA son resistentes a la
degradación mediante enzimas y que tienen vidas prolongadas in
vivo e in vitro. Los PNA también se unen más fuertemente
a una secuencia de ADN complementaria debido a la falta de repulsión
de cargas entre la hebra de PNA y la hebra de ADN. Otros
oligonucleótidos pueden contener nucleótidos que contienen
estructuras principales poliméricas, estructuras principales
cíclicas o estructuras principales acíclicas. Por ejemplo, los
nucleótidos pueden tener estructuras principales de morfolino
(patente estadounidense número 5.034.506). Los oligonucleótidos
también pueden contener grupos tales como grupos indicadores, un
grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un
oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades
farmacodinámicas de un oligonucleótido antisentido. Los
oligonucleótidos antisentido también pueden tener miméticos de
azúcares.
Las moléculas de ácido nucleico antisentido
pueden construirse usando reacciones de ligamiento enzimáticas y de
síntesis química usando procedimientos conocidos en la técnica. Las
moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención o un
fragmento de las mismas, pueden sintetizarse químicamente usando
nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos
modificados de diversas formas diseñados para aumentar la
estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la
estabilidad física del dúplex formado con ARNm o el gen nativo, por
ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con
acridina. Las secuencias antisentido pueden producirse
biológicamente usando un vector de expresión introducido en las
células en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus
atenuado en el que las secuencias antisentido se producen bajo el
control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad
puede determinarse por el tipo celular en el que se introduce el
vector.
Además, la presente invención también contempla
un método para someter a ensayo una sustancia que inhibe la
actividad de la NSS de un retrovirus que comprende hacer reaccionar
un retrovirus que contiene una NSS con una sustancia de prueba, en
condiciones que permiten la inhibición de la NSS, someter a ensayo
la capacidad del retrovirus para inducir la apoptosis, y compararla
con la capacidad para inducir apoptosis obtenida en ausencia de la
sustancia de prueba, para determinar el efecto de la sustancia sobre
la NSS del retrovirus.
La presente invención incluye además un método
para matar o destruir células diana, preferiblemente células
cancerosas, que comprende administrar a la célula o células una
cantidad eficaz de un virus recombinante, preferiblemente VEV o
cualquier otro virus de ARN portador, específico para las células
diana, que contiene preferiblemente la NSS del
VIH-1. Preferiblemente, las células están en un
animal que lo necesita, lo más preferiblemente en un ser humano.
Las células que están infectadas o son cancerosas expresan
marcadores específicos celulares para los que puede incorporarse un
sitio de reconocimiento complementario en un vector adecuado en el
que se ha incorporado la NSS del VIH-1. Este enfoque
se ha realizado con virus de la estomatitis vesicular (VEV) que se
ha diseñado mediante ingeniería para incorporar los genes para CD4 y
CXCR4 dirigiendo así el VEV modificado para infectar células
infectadas con VIH-1 (Schnell, M.J. et al.
Cell 90: 849-857 (1997)). En consecuencia, la
presente invención proporciona un método para destruir células
diana, tales como células cancerosas, que comprende administrar un
virus recombinante que contiene la NSS y un sitio de reconocimiento
específico para las células diana, a un animal que lo necesita. En
una realización, la NSS del VIH-1 se incorpora en
un vector de tipo VEV modificado que se ha dirigido a un tipo de
célula cancerosa específica basándose en un antígeno de superficie
de célula cancerosa particular proporcionando así al VEV la
capacidad para inducir apoptosis en las células cancerosas
seleccionadas
como diana.
como diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos no limitativos son
ilustrativos de la presente invención:
La construcción de baculovirus recombinantes que
expresan gp120-NSS, gp120-MSS y
gp120-\DeltaS de VIH-1 se ha
descrito previamente por Li et al. (Virology 204:
266-278, 1994).
La construcción de baculovirus recombinantes que
expresan la glicoproteína (G) de VEV_{Ind} se describió
previamente por Bailey et al. (Virology 169:
323-331, 1989).
Construcción de baculovirus recombinantes que
expresan proteína G de VEV_{Ind} con la secuencia señal de
env del VIH-1
(VEV-G-NSS):
\newpage
Para sustituir la secuencia señal de la proteína
VEV-G, los presentes inventores construyeron en
primer lugar VEV-G-\DeltaS
mediante PCR con dos cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el plásmido pwK1 (que contiene el gen G
de longitud completa de VEV_{Ind}, y proporcionado amablemente
por el Dr. Robert R. Wagner, Universidad de Virginia, EE.UU.) como
molde, y se amplificó con el kit Gene amp mediante 30 ciclos de PCR
en un termociclador Cetus de Perkin-Elmer (los
ciclos fueron 94ºC, 1 min; 45ºC, 2 min; 72ºC, 3 min) a partir 20 ng
de pwK1 como molde y 1,0 \muM de cada cebador.
Todos los cebadores tenían sitios de BamHI en su
extremo 5' terminal de manera que el fragmento de ADN de
VEV-G-\DeltaS amplificado podía
insertarse en el sitio de BamHI del plásmido, pBluescript SK VECTOR
(Stratagene). El clon en el que el extremo 5' terminal de
VEV-G-\DeltaS hacia el promotor de
T7 se seleccionó y se digirió con enzimas de restricción SphI más
XhoI. El vector se muestra en la figura 5.
Se amplificó la secuencia señal del
VIH-1 del gen env a partir de
pBluescript-gp120-NSS mediante PCR
con los siguientes dos cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
Esto se ilustra en la figura 6. Se digirió el
fragmento de ADN amplificado que contenía la secuencia señal del
VIH-1 con enzimas de restricción XhoI más SphI, y se
insertó en el vector digerido con XhoI y SphI, pBluescript
VEV-G-\Deltas. El plásmido
resultante se denomina pBSK
VEV-G-NSS, y el constructo se
confirmó adicionalmente mediante secuenciación de ADN. Esto se
ilustra en la figura 7.
Se insertó el fragmento de BamHI de
VEV-G-NSS en el sitio de BamHI de un
baculovirus pAcYM1 (Li et al. Virology 204:
266-278, 1994), y se generó baculovirus recombinante
que expresaba VEV-G-NSS mediante un
método de transfección convencional (Li et al. Virology 204:
266-278, 1994).
Se infectaron células SF21 con AcVPN
recombinante a una m.o.i. de 5 UFP/célula y se incubaron a 27ºC
durante 48 h. Se examinaron las células infectadas mediante
microscopio de contraste de fase. Los resultados se muestran en la
figura 1. (A) células infectadas con AcVPN de tipo natural; (B)
células infectadas con vAcgp120-NS (rgp120 con la
secuencia señal natural del VIH-1 que muestra lisis
celular); (C) células infectadas con
vAcgp120-\DeltaS; (rgp120 sin la secuencia señal
que muestra células intactas); (D) células infectadas con
vAcgp120-MS (rgp120 con la secuencia señal de
melitina que muestra células intactas); (E) células infectadas con
vAcVEV-G (proteína G de VEV que muestra células
intactas); (F) células infectadas con
vAcVEV-G-NS (proteína G de VEV con
la secuencia señal natural de env del VIH-1
que muestra lisis celular).
Los resultados anteriores demuestran que la
secuencia señal de env del VIH-1 destruye
células rápidamente.
Se infectaron células SF21 con AcVPN
recombinante a una m.o.i. de 5 UFP/célula durante 1 h, y se retiró
el inóculo y se incubó con el medio completo TNM-FH
que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%. A las 24, 48 y 72 h
tras la infección, se tiñeron las células con azul trípano (GIBCO,
BRL) durante 5 min y se contaron las células con el microscopio y
se determinó el porcentaje de células muertas usando la siguiente
fórmula:
\frac{Células
\ muertas \ (teñidas)}{Células \ viables \ (sin \ teñir) + Células \
muertas} \ x \ 100 = % \ de \ celúlas \
muertas
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el LDRA según las instrucciones del
fabricante (kit de detección de citotoxicidad Boehringer
Mannheim).
Mannheim).
Se infectaron células SF21 con AcVPN
recombinante a una m.o.i. de 5 UFP/célula durante 1 h y se retiró el
inóculo y se incubó con medio completo a 27ºC, se recogió medio de
cultivo a intervalos regulares de 12 h y se centrifugó a 12.000 rpm
durante 1 min. Se diluyó el sobrenadante del cultivo 10 veces y se
incubaron 100 \mul del sobrenadante con 100 \mul de mezcla de
reacción (kit de detección de la citotoxicidad) durante 30 min a
temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de las muestras a 490
nm mediante cuantificación del tinte de formazán formado usando un
lector de microplacas (ELISA) (Bio-Rad 550).
Los resultados de los ensayos de azul trípano y
de liberación de lactato deshidrogenasa se ilustran en la figura 2A
y 2B, respectivamente. Figura 2A; porcentaje de células
permeabilizadas mediante azul trípano (células muertas) tras
expresar rgp120 o proteínas VEV-G con diferentes
secuencia señal. Figura 2B; ensayo de liberación de lactato
deshidrogenasa (LDH) (kit de detección de citotoxicidad de
Boehringer Mannheim). Las cantidades de LDH liberada a partir de
células SF21 infectadas con virus recombinantes que expresan rgp120
o VEV-G con diferentes secuencias señal se midieron
mediante cuantificación del tinte de formazán formado en placas de
ELISA leídas a 490 nm.
En conclusión rgp120 y VEV-G con
la secuencia señal natural de env del VIH-1
destruyen células mucho más rápido. Las células sobreviven mucho
más tiempo sin la secuencia señal natural de env del
VIH-1 o con la secuencia señal de melitina. La
secuencia señal natural de env del VIH-1 es
responsable de una rápida muerte celular.
Se infectaron células SF21 (3 x 10^{6}) con
AcVPN recombinante a una m.o.i. de 5 UFP/célula durante 1 h. Se
retiró el inóculo y se incubó con medio completo a 27ºC durante 48
h. Se sedimentaron las células a 2500 rpm durante 10 min y se
extrajeron con TSE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, SDS al 1%, al que
se añadió proteinasa K hasta una concentración final de 70
\mug/ml). Entonces, se incubaron las muestras durante 2 h a 37ºC,
y al final de la incubación se añadió NaCl hasta una concentración
final de 1 M y entonces se incubaron las muestras a 4ºC durante la
noche. Se extrajo el ADN con fenol:cloroformo (1:1) y con
cloroformo. Finalmente, se añadió etanol (100%) para precipitar el
ADN (15 min a 80ºC) y se sedimentó el precipitado de ADN mediante
microcentrifugación a 12.000 rpm durante 15 min. Se lavó el
sedimento de ADN una vez con etanol al 70%. Volvió a suspenderse en
TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) con ARNasa A (50 \mug/ml), se
sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,2% y se tiñó con
bromuro de etidio. (N. Chejanovsky y E. Gershburg, Virology 209:
519-525, 1995). Los resultados se ilustran en la
figura 3. Se extrajo ADN celular total (A) o ADN de bajo peso
molecular (B) a las 48 h tras la infección y se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en presencia de bromuro de
etidio. Carriles M, marcador de ADN; carriles WT, células infectadas
con AcVPN de tipo natural; carriles células infectadas con
\DeltaS (rgp120 sin la secuencia señal); carril NSS, células
infectadas con vAcgp120-NS (rgp120 con la secuencia
señal natural de env del VIH-1); carriles
MSS, células infectadas con vAcgp120-MS (rgp120 con
la secuencia señal de melitina). Los resultados anteriores
demuestran que la secuencia señal natural de env del
VIH-1 induce la apoptosis.
Se infectaron células SF21 con
vAcVEV-G (VEV-G) o
vAcVEV-G-NSS
(VEV-G-NSS) a una m.o.i. de 5
UFP/
célula y se incubaron a 27ºC durante 48 horas. A las 48 h tras la infección, se sedimentaron las células SF21 (3 x 10^{6}) a 2500 rpm durante 5 min y se sometieron a lisis en disolución que contenía Tris HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM y Triton X-100 al 0,5%, y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 25 min en una microcentrifugadora Eppendorf para sedimentar ADN cromosómico. Se digirió el sobrenadante con 0,1 mg de ARNasa por ml a 37ºC durante 1 h y después durante 2 h con 1 mg de proteinasa K por ml a 50ºC en presencia de SDS al 1%, se extrajo con fenol y cloroformo, se precipitó con etanol frío. Volvió a suspenderse el precipitado en TE y se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 11,5% que contenía 5 \mug de bromuro de etidio por ml. Se visualizó el ADN mediante transiluminación UV. (Rosario Leopardi y Bernard Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9583-9587, 1996).
célula y se incubaron a 27ºC durante 48 horas. A las 48 h tras la infección, se sedimentaron las células SF21 (3 x 10^{6}) a 2500 rpm durante 5 min y se sometieron a lisis en disolución que contenía Tris HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM y Triton X-100 al 0,5%, y se centrifugaron a 12.000 rpm durante 25 min en una microcentrifugadora Eppendorf para sedimentar ADN cromosómico. Se digirió el sobrenadante con 0,1 mg de ARNasa por ml a 37ºC durante 1 h y después durante 2 h con 1 mg de proteinasa K por ml a 50ºC en presencia de SDS al 1%, se extrajo con fenol y cloroformo, se precipitó con etanol frío. Volvió a suspenderse el precipitado en TE y se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 11,5% que contenía 5 \mug de bromuro de etidio por ml. Se visualizó el ADN mediante transiluminación UV. (Rosario Leopardi y Bernard Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9583-9587, 1996).
Los resultados se muestran en la figura 3, panel
B y figura 4, panel B.
Un clon de ADN proviral de VIH-1
infeccioso, pNL4-3 (proporcionado por el Dr. Malcolm
Martin mediante el programa de reactivo de referencia e
investigación del SIDA ("AIDS Research and Reference
Reagent"), Division of AIDS, NIAID, NIH, Adachi et
al, J. Virol. 59: 284-291, 1986), contiene dos
sitios de enzima de restricción únicos; EcoRI (posición 5744) y
BamHI (posición 8466). La región codificante del gen env
comienza a partir de la posición 6221 y termina en la posición
8785. Para sustituir la secuencia señal natural de env del
VIH-1 con melitina, IL-3 o cualquier
otra secuencia señal de proteína secretora, se aísla el fragmento
EcoRI-BamHI de pNL4-3 a partir de
gel de agarosa y se subclona dentro del sitio de EcoRI - BamHI de
vector pBluescript SK tal como se ilustra en la figura 8. A partir
de este producto, se designan cuatro cebadores tal como sigue:
Se usan pBSK-env como molde más
los cebadores n.º 1 y n.º 2 y se realiza una PCR para amplificar la
parte izquierda de la región de env, fragmento de 477 pb. De
manera similar, se emplean los cebadores n.º 3 y n.º 4 para
amplificar la parte derecha de env, 2245 pb. Se digirió el
producto de PCR de EcoRI - PstI (fragmento de 477 pb) con EcoRI +
PstI mientras que el producto de PCR de PstI-BamHI
(fragmento de 2245 pb) se cortó con PstI + BamHI. Entonces, se
clonó el fragmento de 2245 pb digerido con
PstI-BamHI dentro de los sitios de PstI + BamHI del
vector pBSK tal como se muestra en la figura 9.
Después de esto, se digirió
pBSK-2245 con EcoRI + PstI y se ligó con los
productos de PCR digeridos con EcoRI + PstI (fragmento de 445 pb)
dando como resultado el plásmido pBSK-env-\DeltaS, tal como
se muestra en la figura
10.
10.
Se digirió el plásmido pBSK-env-\DeltaS
con PstI + NcoI y después se ligó con el oligonucleótido sintético
que codifica para MSS, la secuencia señal de IL-3 o
cualquier otra secuencia señal deseada. Este oligonucleótido
sintético contiene un sitio de PstI en el extremo 5' y un sitio de
NcoI en el extremo 3'. Antes de la ligación dentro del vector, en
primer lugar se digirieron estos oligonucleótidos bicatenarios con
PstI + NcoI.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótido sintético que codifica para la
secuencia señal de interleucina 3 (sólo se muestra el sentido
positivo):
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido recombinante resultante se muestra
en la figura 11.
Tras la secuenciación para verificar la correcta
modificación, se digirió el plásmido con EcoRI + BamHI para aislar
el fragmento de EcoRI - BamHI, que volvió a clonarse en los sitios
de EcoRI-BamHI del vector de ADN proviral de
pNL4-3. El plásmido resultante se denomina
pVIH-1-MSS (o
pVIH-1-IL3SS).
Además, durante la construcción anterior, la NSS
se sustituye no sólo con MSS o secuencia señal de
IL-3, sino que también se crea una deleción parcial
del gen vpu. El gen vpu codifica para 82 aa y su
extremo 3' se solapa con la secuencia señal de gen env del
VIH-1, aproximadamente 28 aa. Sin embargo, está en
un marco de lectura diferente (-1 marco de lectura). Estudios han
mostrado que la deleción de los genes vpu o nef no
alteró la replicación del virus en CMSP de chimpancé, CMSP humanas
ni en la línea híbrida de células B/T CEMx174 (James et al,
AIDS Res. Human Retrovirus 10:343-350, 1994). Por
tanto, durante la amplificación de PCR del fragmento de 455 pb de
la parte izquierda de env con los cebadores n.º 1 y n.º 2,
se añadieron dos codones de terminación justo delante del codón de
iniciación de los genes env lo que da como resultado la
deleción de 28 aa de vpu (véase el cebador
n.º 2).
n.º 2).
La secuencia codificante del gen nef
comienza a partir de la posición 8787 y termina en la posición 9407
en el clon de ADN proviral pNL4-3. También hay dos
sitios de enzimas de restricción únicos; el sitio de BamHI en la
posición 8466 en el gen env y el sitio de XhoI en la posición
8887 en el gen nef. Para realizar la deleción del gen
nef, se digirió el plásmido
VIH-1-MSS (o IL-3SS)
con BamHI y XhoI. Se aislaron los 421 pb resultantes de fragmento
de BamHI-XhoI y se subclonaron en los sitios de
BamHI-XhoI de vector pBSK tal como se muestra en la
figura 12. Se diseñaron dos cebadores:
El gen nef codifica para 260 aa según el
presente diseño. Se insertaron dos codones de terminación en el
sitio de XhoI lo que da como resultado que el gen nef sólo
codifica para 33 aa. Tras la amplificación de PCR y digestión con
BamHI + XhoI, se clonaron estos 421 pb de fragmento de ADN de PCR de
nuevo dentro de BamHI-XhoI del vector
pVIH-1-MSS (o
IL-3SS). El plásmido recombinante resultante
contiene la sustitución de NSS y deleción parcial de vpu y
nef, que se usa para la prueba de vacuna.
Aunque la presente invención se ha descrito con
referencia a lo que se considera actualmente que son los ejemplos
preferidos, debe entenderse que la invención no se limita a los
ejemplos dados a conocer. Por el contrario, se pretende que la
invención cubra diversas modificaciones y disposiciones equivalentes
incluidas dentro del espíritu y el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (21)
1. Virus de la inmunodeficiencia humana 1
(VIH-1) recombinante no citolítico en el que la
secuencia señal natural (NSS) de la glicoproteína de la envuelta
del virus se modifica mediante la eliminación de aminoácidos
cargados positivamente para proporcionar una secuencia señal no
citolítica o en el que la NSS se sustituye con o bien una secuencia
señal de melitina (MSS) o bien una secuencia señal de
IL-3 (ILSS).
2. Retrovirus recombinante no citolítico según
la reivindicación 1, en el que la secuencia señal no citolítica
modificada se modifica para contener no más de un aminoácido cargado
positivamente.
3. Retrovirus recombinante no citolítico según o
bien la reivindicación 1 o bien la 2, en el que la secuencia señal
no citolítica modificada se modifica para contener cero aminoácidos
cargados positivamente.
4. Retrovirus según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el retrovirus se convierte en no
virulento mediante la deleción del gen nef.
5. Vacuna que incorpora el retrovirus según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Uso de un VIH-1 recombinante
no citolítico, en el que la NSS de la glicoproteína de la envuelta
del virus se sustituye con o bien una secuencia señal de melitina
(MSS) o bien una secuencia señal de IL-3 (ILSS) para
la fabricación de una preparación de vacuna para la prevención o el
tratamiento de una infección retroviral.
7. Uso de un VIH-1 recombinante
no citolítico, en el que la NSS de la glicoproteína de la envuelta
del virus se modifica mediante la eliminación de aminoácidos
cargados positivamente para proporcionar una NSS no citolítica para
la fabricación de una preparación de vacuna para la prevención o el
tratamiento de una infección retroviral.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que la
modificación para proporcionar una NSS no citolítica da como
resultado no más de un aminoácido cargado positivamente en la
secuencia NSS.
9. Uso según o bien la reivindicación 7 o bien
la 8, en el que la modificación para proporcionar una NSS no
citolítica da como resultado cero aminoácidos cargados
positivamente.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que el virus se convierte en no
virulento mediante la deleción del gen nef.
11. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que la preparación de vacuna es para
el tratamiento de la infección por VIH.
12. Vacuna que comprende un
VIH-1 recombinante no citolítico, en la que la NSS
de la glicoproteína de la envuelta del virus se sustituye con o
bien una secuencia señal de melitina (MSS) o bien una secuencia
señal de IL-3 (ILSS).
13. Vacuna que comprende un
VIH-1 recombinante no citolítico, en la que la NSS
de la glicoproteína de la envuelta del retrovirus se modifica
mediante la eliminación de aminoácidos cargados positivamente para
proporcionar una NSS no citolítica.
14. Vacuna según la reivindicación 13, en la que
la secuencia señal natural se modifica para reducir el número de
aminoácidos cargados positivamente hasta no más de un aminoácido
cargado positivamente.
15. Vacuna según la reivindicación 14, en la que
el número de aminoácidos cargados positivamente es cero.
16. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, en la que el retrovirus se convierte en no
virulento mediante la deleción del gen nef.
17. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, que comprende además un adyuvante.
18. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17 para el tratamiento de la infección por
VIH.
19. Uso de un VEV recombinante que contiene la
NSS de una glicoproteína de la envuelta del VIH-1 y
un sitio de reconocimiento específico para una célula cancerosa
diana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del
cáncer.
20. Uso de un oligonucleótido antisentido que es
complementario a una secuencia de ácido nucleico para una NSS del
gen de la glicoproteína de la envuelta para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una infección retroviral.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que la
infección retroviral es infección por VIH.
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