ES2326978T3 - Procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular. - Google Patents

Abstract

Utilización de un antagonista de zvegf3 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de carcinoma hepatocelular en un mamífero, por ejemplo, en la que debe medirse la respuesta tumoral como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en la duración de la progresión, y en la que el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3 que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, estando constituida cada una de dichas cadenas polipeptídicas por una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por: restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº:

Description

Procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular.

Antecedentes de la invención

El carcinoma hepatocelular, o hepatoma, es el tipo más frecuente de cáncer de hígado primario. Es particularmente común (y una causa importante de muerte) en regiones de África y del Sudeste de Asia en las que la hepatitis B crónica es endémica.

La etiología exacta del carcinoma hepatocelular (CHC) es desconocida. Los tumores están compuestos por hepatocitos malignos. Existe una fuerte correlación con la incidencia de la hepatitis B, y la incorporación del ADN vírico en el genoma del hospedador se cree que conduce a la transformación maligna. La infección por hepatitis C crónica está también ligada al CHC, aunque el virus de la hepatitis C (virus de ARN) no se incorpora en el genoma del hospedador. La fibrogénesis (cirrosis) en los pacientes de hepatitis C puede desempeñar una función en la formación del tumor. El CHC es asimismo una complicación principal de la hemocromatosis. Otros factores de riesgo para el CHC incluyen las toxinas medioambientales (por ejemplo, aflatoxinas), alcoholismo, antecedentes familiares y el ser
macho.

Los signos y síntomas de CHC incluyen dolor en el abdomen superior derecho, presencia de masa de tejido o abdomen hinchado, pérdida de peso, pérdida de apetito y sensaciones de saciedad, debilidad o cansancio, náuseas y vómitos, ictericia y fiebre. La \alpha-fetoproteína del suero y la des-g-carboxi-protrombina son marcadores para diagnóstico. Los procedimientos adicionales de diagnóstico incluyen ultrasonidos, exploración por CT, diagnóstico por imagen de resonancia magnética, arteriografía hepática y biopsia.

Los tratamientos actuales para el CHC han conseguido solo un éxito limitado. La cirugía es el más satisfactorio, y puede producir la supervivencia prolongada de los pacientes con tumores pequeños y localizados. El tratamiento del CHC más avanzado incluye la quimioterapia y/ o la terapia de radiación. El trasplante de hígado se ha utilizado también con algún éxito a largo plazo. Sin embargo, el éxito de estos tratamientos depende en gran medida del diagnóstico precoz. Otros tratamientos dados a conocer para el CHC incluyen la ablación por radiofrecuencia (Livraghi et al., Radiology 210:655-61, 1999; Curley et al., Ann. Surg. 230:1-8, 1999); la terapia con láser o microondas; la inyección percutánea de etanol (Livraghi et al. ibid.; Tanaka et al., Cancer 82:78-85, 1998); la criocirugía (Zhou y Tang, Semin. Surg. Oncol. 14:171-174, 1998); la infusión arterial hepática, por ejemplo, con ^{125}I-lipiodol (Lau et al., Lancet 353(9155); 797-801, 1999), 5-fluorodesoxiuridina o diclorometotrexato (Ensminger et al., Cancer Treat. Rep. 65:393-400, 1981); la quimioembolizacion utilizando, por ejemplo, biscloroetilnitrosourea (Dakhil et al., Cancer 50:631-635, 1982) o aceite yodado e hidrocloruro de doxorrubicina (Choi et al., Radiology 182:709-713, 1992); inmunoterapia (Takayama, et al., Lancet 356(9232):802-807, 2000); y una combinación de la terapia con cisplatino con radiación (Epstein et al., Cancer 67:896-900, 1991).

Descripción de la invención

La presente invención proporciona materiales y procedimientos para tratar el carcinoma hepatocelular en un mamífero.

En un aspecto del presente descubrimiento, se proporciona un procedimiento de tratamiento del carcinoma hepatocelular en un mamífero que comprende administrar a un mamífero con carcinoma hepatocelular una composición que comprende un antagonista de zvegf3 en combinación con un vehículo de administración farmacéuticamente aceptable, en el que el antagonista de zvegf3 se selecciona dentro del grupo constituido por anticuerpos anti-zvegf3, polipéptidos de la variante zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo y polinucleótidos inhibidores, en una cantidad suficiente para producir una respuesta tumoral en el mamífero. En una forma de realización, se mide una respuesta tumoral como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en la duración de la evolución. En otra forma de realización, el antagonista de zvegf3 se selecciona dentro del grupo constituido por anticuerpos anti-zvegf3 y polinucleótidos inhibidores. En una forma de realización adicional, el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3. En una forma de realización relacionada, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonado, tal como un anticuerpo monoclonal de IgG. En otras formas de realización de la invención, el antagonista de zvegf3 es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, en el que cada una de las cadenas polipeptídicas está constituida por una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por los restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2 y los restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2. En una forma de realización adicional, el antagonista de zvegf3 se administra por infusión intravenosa.

En un segundo aspecto del descubrimiento, se proporciona un procedimiento de reducción de la proliferación de células cancerosas que comprende administrar a un mamífero con carcinoma hepatocelular una cantidad de una composición que comprende un antagonista de zvegf3 en combinación con un vehículo de administración farmacéuticamente aceptable, en el que el antagonista de zvegf3 se selecciona de entre el grupo constituido por anticuerpos anti-zvegf3, polipéptidos de la variante zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo y polinucleótidos inhibidores, en una cantidad suficiente para reducir la proliferación de células cancerosas en el carcinoma hepatocelular. En una forma de realización, el antagonista de zvegf3 se selecciona de entre el grupo constituido por anticuerpos anti-zvegf3 y polinucleótidos inhibidores. En una forma de realización adicional, el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3. En una forma de realización relacionada, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo monoclonal de IgG. En otras formas de realización de la invención, el antagonista de zvegf3 es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, en la que cada una de las cadenas polipeptídicas está constituida por una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por los restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2, los restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2 y los restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2. En una forma de realización adicional, el antagonista de zvegf3 se administra por infusión intravenosa.

En un tercer aspecto del descubrimiento se proporciona la utilización de un antagonista de zvegf3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma hepatocelular en un mamífero, en la que el antagonista de zvegf3 se selecciona de entre del grupo constituido por anticuerpos anti-zvegf3, polipéptidos de la variante zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo y por nucleótidos inhibidores. En una forma de realización el medicamento se formula para infusión intravenosa.

Estos y otros aspectos de la invención se pondrán de manifiseto haciendo referencia a la descripción detallada siguiente de la invención y a los dibujos adjuntos, en los que:

Las Figs. 1A-1G son un perfil de la capacidad de hidrofilia de Hopp/Woods de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2. El perfil se basa en un intervalo de seis restos móviles. Se ignoraron los restos G, S y T enterrados y los restos H, Y y W expuestos. Estos restos están indicados en la figura por letras de la casilla inferior.

La Fig. 2 es una alineación de la secuencias de aminoácidos humana (SEC. ID. nº: 2) y de ratón (SEC. ID. nº: 4).

El término "antagonista" se utiliza en la presente memoria para indicar un compuesto que reduce una actividad biológica de otro compuesto. En la presente invención, un "antagonista de zvegf3" es un compuesto que reduce la actividad biológica mediada por el receptor (por ejemplo actividad mitógena) de zvegf3 en una célula diana. Los antagonistas pueden ejercer su acción compitiendo con zvegf3 por los puntos de fijación en un receptor de la superficie celular, uniéndose a zvegf3 y previniéndolo de la unión a un receptor de la superficie celular, interfiriendo de otra manera con la función del receptor, reduciendo la producción de zvegf3 o por otros medios.

Las expresiones "cáncer" o "célula cancerosa" se utiliza en la presente memoria para indicar un tejido o célula encontrados en un neoplasma que posee características que le diferencian del tejido normal o de las células del tejido. Dichas características incluyen, pero no se limitan al grado de anaplasia, irregularidad en la forma, independencia del perfil celular, tamaño nuclear, alteraciones en la estructura del núcleo o citoplasma, otras alteraciones fenotípicas, presencia de proteínas celulares indicadoras de un estado canceroso o precanceroso, aumento del número de mitosis y capacidad para metastasizarse. Las palabras que están relacionadas con "cáncer" incluyen, carcinoma, sarcoma, tumor, hepitelioma, adenoma, leucemia, linfoma, pólipos, cirro, transformación, neoplasma y similares.

Un "polinucleótido inhibidor" es una molécula de ADN o ARN que reduce o impide la expresión (transcripción o traducción) de un segundo polinucleótido (diana). Los polinucleótidos inhibidores incluyen polinucleótidos complementarios, ribozimas y secuencias guía externas. La expresión "polinucleótido inhibidor" incluye además moléculas de ADN y ARN que codifican las especies inhibidoras existentes, tales como las moléculas de ADN que codifican ribozimas.

El término "neoplásica" cuando se refiere a células, indica las células que experimentan proliferación nueva y anormal, particularmente en un tejido en el que la proliferación es incontrolada y progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las células neoplásicas pueden ser malignas, es decir invasivas y metastásicas, o benignas.

Los términos "tratar" y "tratamiento" se utilizan extensamente para indicar intervenciones terapéuticas y profilácticas que alteran favorablemente un estado patológico. Los tratamientos incluyen procedimientos que moderan o invierten la evolución de una enfermedad, reducen su gravedad, la previenen o la curan. En el caso de los cánceres, el tratamiento incluye un aumento de la tasa de supervivencia en un periodo de tiempo dado o un aumento del periodo de supervivencia, la reducción en la masa tumoral, la reducción en la metástasis tumoral, la interrupción de la evolución de la enfermedad, la reducción en el tiempo de evolución y similares.

El presente descubrimiento proporciona procedimientos para el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un paciente utilizando antagonistas de Zvegf3. Zvegf3 es una proteína que está relacionada estructuralmente con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y los factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGF). Esta proteína se ha denominado "VEGF-R" (Publicación WO 99/37671 de WIPO) y, más recientemente, "PDGF-C" (documento WO 00/18212; Li et al., Nature Cell Biol. 2:302-309, 2.000; Cao et al., FASEB J. 16: 1575-1583, 2.002). Zvegf3/PDGF-C es una proteína de multidominio con homología significativa con la familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento. Las secuencias de aminoácidos representativas de zvegf3 humano y de ratón se presentan en la SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID. nº: 4, respectivamente. Los ADN que codifican estos polipéptidos se presentan en las SEC. ID. nº: 1 y nº: 3 respectivamente.

La expresión "proteína zvegf3" se utiliza en la presente memoria para indicar proteínas que comprenden el dominio del factor de crecimiento de un polipéptido zvegf3 (por ejemplo, los restos 235-345 de zvegf3 humana (SEC. ID. nº: 2) o zvegf3 ratón (SEC. ID. nº: 4)), en la que la proteína es mitógena para las células que expresan la subunidad del receptor \alpha de PDGF de la superficie celular. Se ha observado que Zvegf3 se une a las isoformas \alpha\alpha y \alpha\beta del receptor de PDGF. Zvegf3 es una proteína homodimérica que se produce en la naturaleza como precursora que está proteolíticamente activada para liberar la proteína madura, un dímero del dominio del factor de crecimiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, "la proteína zvegf3" incluye los precursores que son activables in vivo. Utilizando los métodos conocidos en la técnica, pueden prepararse proteínas zvegf3 en varias formas, incluyendo glucosiladas o no glucosiladas, pegiladas o no pegiladas, con o sin un resto inicial de metionina y como proteínas de fusión como se da a conocer con más detalle a continuación.

La cadena del polipéptido zvegf3 comprende un dominio del factor de crecimiento y un dominio CUB. El dominio del factor de crecimiento se caracteriza por una disposición de los restos de cisteína y las cadenas beta que son características de la estructura "nudo de cisteína" de la familia PDGF el dominio CUB muestra la homología de secuencia para los dominios CUB en las neuropilinas (Takagi et al., Neuron 7:295-307, 1991; Soker et al., Cell 92:735-745, 1998), proteína 1 morfogenética del hueso humano (Wozney et al., Science 242:1528-1534, 1988), proteína del plasma seminal porcino y proteína del fluido seminal ácido bovino (Romero et al., Nat. Struct. Biol. 4:783-788, 1997) y la proteína pseudo-tolloid de X. laevis (Lin et al., Dev. Growth Differ. 39:43-51, 1997).

En la Fig. 2, se presenta una alineación de las secuencias del polipéptido zevgf3 de ratón y humano. El análisis de la secuencia de aminoácidos mostrado en la SEC. ID: nº: 2 indica que los restos 1 a 14 forman un péptido secretor. El domino CUB se extiende desde el resto 46 hasta el resto 163. Una secuencia de pseudopropéptido se extiende desde el resto 164 hasta el resto 234, e incluye dos secuencias de escisión potenciales en su terminal carboxilo, un punto dibásico en los restos 231-232 y un punto diana para furina o una proteasa similar a la furina en los restos 231 a 234. El dominio del factor de crecimiento se extiende desde el resto 235 hasta el resto 345. Los expertos en la materia reconocerán que los límites del dominio son algo imprecisos y puede esperarse que varíen hasta \pm 5 residuos en las posiciones especificadas. Los puntos de escisión proteolítica potenciales se producen en los restos 232 y 234. El tratamiento de zvegf3 recombinante producido en células DHK se ha observado que se produce entre los restos 225 y 226. La escisión del péptido señal se prevé que se produzca después del resto 14 (\pm 3 restos). Este análisis sugiere que la cadena de polipéptido zvegf3 puede fundirse para producir muchas especies monoméricas tal como se muestra en la Tabla 1. La escisión después de Arg-234 cabe que produzca la eliminación de los restos 231-234, con posible conversión de Gly-230 en una amida. La escisión después de Lys-232 cabe esperar que produzca una eliminación interior del resto 231, otra vez con posible conversión de Gly-230 en una amida. Además, puede ser ventajoso incluir hasta siete restos en la zona del interdominio en el terminal carboxilo del dominio CUB. La zona interdominio puede estar truncada en su terminal amino por una cantidad similar. Véase

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TABLA 1 Los dominios correspondientes en ratón y otros zvegf3 no humanos pueden ser determinados por los expertos en materia de alineamientos de secuencias

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Zvegf3 puede prepararse de este modo en varias formas polímeras que comprenden un polipéptido zvegf3 tal como se dio a conocer anteriormente. Estos polipéptidos zvegf3 incluyen zvegf3_{15-345} zvegf3_{46-345} zvegf3_{226-345} y zvegf3_{235-345}. Las variantes y derivados de estos polipéptidos pueden prepararse tal y como se da a conocer en la presente memoria. Pueden producirse también formas intermedias. Por ejemplo, un polipéptido con el dominio del factor de crecimiento puede tener, como resto amino-terminal alguno de los restos 226-240 de la SEC. ID. nº: 2, inclusive.

Pueden prepararse proteínas zvegf3 como proteínas de fusión que comprenden las prolongaciones del terminal amino o carboxilo, tales como un resto de metionina con terminal amino, una etiqueta de afinidad o un polipéptido de direccionamiento. Por ejemplo, puede prepararse una proteína zvegf3 como fusión con una etiqueta de afinidad para facilitar la purificación. En lo fundamental, puede utilizarse como etiqueta de afinidad cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de fijación especifico. Las etiquetas de afinidad incluyen, por ejemplo, una zona de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075,1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3; 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988) péptido de fijación de estreptavidina, proteína de fijación de la maltosa (Guan et al., Gene 67:21-30, 1987), proteína de fijación de la celulosa tiorredoxina, ubiquitina, T7 polimerasa u otro epítopo antigénico o dominio de fijación. La fusión de zvegf3 a, por ejemplo, la proteína de fijación a la maltosa o glutación S transferasa puede utilizarse para mejorar el rendimiento en los sistemas de expresión bacteriana. En estos casos la fracción distinta de zvegf3 de la proteína de fusión ordinariamente será eliminada antes de su utilización. La separación del zvegf3 y los fragmentos distintos de zvegf3 de la proteína de fusión se facilitan para proporcionar un punto de escisión específico entre las dos partes. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica. La zvegf3 puede fusionarse también a un péptido de direccionamiento, tal como un anticuerpo (incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de fijación al antígeno de éstos tales como los fragmentos F(ab')_{2} y Fab, anticuerpos monocatenarios y similares) u otro resto peptídico que se une a un tejido diana.

Pueden realizarse variaciones en las secuencias de aminoácidos de zvegf3 mostrados en las SEC. ID. nº: 2 y SEC. ID. nº: 4 para proporcionar polipéptidos mitogénicamente inactivos que se unen al receptor que actúan como antagonistas de zvegf3. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "mitogénicamente inactiva" significa que la proteína no presenta actividad estadísticamente significativa en un ensayo de mitogenesis convencional en comparación con la referencia natural de zvegf3. Dichas variaciones incluyen sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácidos. Aunque no se desea estar ligado por la teoría, se cree que los restos Arg260-Trp271 de zvegf3 humano (SEC. ID. nº: 2) forman un bucle que define la capacidad de la proteína para unirse a los receptores de PDGF. Se predice, por lo tanto, que la fijación a los receptores de PDGF puede estar bloqueada o potenciada por mutaciones en esta zona. Además, se predice que los restos Leu311-His321 de SEC. ID. nº: 2 forman un bucle (bucle 3) que puede estar mutado para bloquear la fijación al receptor. Los péptidos que simulan esta zona de la molécula pueden actuar como antagonistas. Li et al. (Cytokine & Growth Factor Rev. 14:91-98, 2003) dan a conocer que las formas parcialmente procesadas de zvegf3 en las que solamente uno de los dos dominios de CUB está eliminado de la molécula homodímera (denominadas "hemi-dimeros") pueden ser capaces de unir los receptores de PDGF pero bloquear la dimerización del receptor.

Los efectos de los cambios de secuencia de aminoácidos pueden predecirse por modelización informática (utilizando, por ejemplo, el visor Insight II® y las herramientas de modernización de homología; MSI, San Diego, CA) o determinarse por análisis de la estructura cristalina (véase, p.ej., Lapthorn et al., Nature 369:455, 1994), y pueden evaluarse utilizando procedimientos de mutagénesis reconocidos en la técnica en combinación con ensayos de actividad. Los procedimientos representativos de mutagénesis incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al punto y mutagénesis de exploración con alanina (Cunningham and Well, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991). Pueden hacerse y determinarse muchas sustituciones de aminoácidos utilizando procedimientos conocidos, tales como los dados a conocer por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-57, 1988) o Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). Otros procedimientos que pueden utilizarse incluyen la presentación del fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., patente de EE.UU. nº. 5.223.409; Huse, publicación WO 92/06204 de WIPO), mutagénesis dirigida a la zona (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988) y mezclado de ADN como da a conocer Stemmer (Nature 370:389-391, 1994) y Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994). En las moléculas mutantes resultantes se analiza la actividad mitógena u otras propiedades (p.ej., la fijación al receptor) para identificar restos de aminoácidos que son críticos para estas funciones. La mutagénesis puede combinarse con procedimientos de identificación de gran volumen o de gran resolución para detectar la actividad biológica de los polipéptidos zvegf3 en particular la actividad biológica en la modulación de la proliferación celular. Por ejemplo, un análisis de mitogénesis que miden la incorporación de colorante o la incorporación de ^{3}H-timidina puede llevarse a cabo en gran número de muestras. Pueden emplearse análisis competitivos para confirmar la actividad antagonista.

Las proteínas zvegf3, incluyendo los polipéptidos completos, fragmentos y proteínas de fusión, así como las variantes antagonistas, pueden producirse en células hospedadoras modificadas genéticamente según las técnicas convencionales. Células hospedadoras adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y crecen en cultivo, e incluyen bacterias, células micóticas y células eucarióticas superiores cultivadas (incluyendo las células cultivadas de organismos pluricelulares). Las técnicas para la manipulación de moléculas clonadas de ADN y la introducción de ADN exógeno en varias células hospedadoras las da a conocer Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbord, NY, 1989, y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greenm and Wiley and Sons, NY, 1993. Véase el documento WHO 00/34474. En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido zvegf3 está operativamente unida a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo generalmente un activador y terminador de transcripción, en un vector de expresión. El vector contendrá asimismo normalmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la materia reconozcan que en determinados sistemas los marcadores seleccionables pueden proporcionarse en vectores por separado, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse por integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de activadores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño de rutina dentro del nivel de la experiencia ordinaria en la materia. Muchos de dichos elementos están descritos en la bibliografía y están disponibles por los suministradores comerciales. Véase, el documento WO00/34474.

Las proteínas zvegf3 y las variantes pueden también comprender restos de aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la técnica varios procedimientos para incorporar restos de aminoácidos no naturales en proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y traducción de los plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se realiza en un sistema exento de células que comprende un extracto de E coli S30 y enzimas disponibles en el mercado y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzimol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-809, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-10149, 1993). En un segundo procedimiento, se lleva a cabo la traducción en ovocitos de Xenopus por microinyección del ARN mutado y los ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcall et al., J. Biol. Chem. 271:19991-19998, 1996). En un tercer procedimiento, las células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que debe reemplazarse (p.ej., fenilalanina) y en presencia del o de los aminoácido(s) no naturales deseado(s) (p.ej., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural está incorporado en la proteína en lugar de su contrapartida natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470-7476, 1994. Los restos de aminoácidos naturales pueden convertirse en especies no naturales mediante una modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con la mutagénesis dirigida al punto para expandir la serie de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Los polipéptidos con zvegf3, los fragmentos o los variantes de los mismos pueden prepararse por síntesis química según los procedimientos conocidos en la materia, incluyendo la síntesis exclusiva en fase sólida, los procedimientos en fase solida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis clásica en solución. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2^{a} edición), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; y Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis; A Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1989.

Las proteínas con zvegf3 y las variantes de las mismas se purifican por procedimientos de purificación de proteínas convencionales, por lo general mediante una combinación de técnicas cromatográficas. Véase, en general, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes. Protein Purification: Principles and Practice, Sringer-Verlag, Nueva York, 1994. Las proteínas que comprenden una etiqueta de afinidad de polihistidina (por lo general aproximadamente 6 restos de hinstidina) se purifican por cromatografía por afinidad en una resina quelato con níquel. Véase, por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988. Además, el propio dominio del factor de crecimiento se une a la resina de níquel a pH 7,0-8,0 y fosfato Na 25 mM, NaCl, 0,25 M. La proteína ligada puede eluirse con un gradiente de pH descendiente por debajo de pH 5.0 o un gradiente de imidazol. La proteína con dominio de factor de crecimiento zvegf3 recombinante puede purificarse utilizando una combinación de cromatografía en un intercambiador catiónico fuerte seguido de un conjunto de columna en tándem que comprende un intercambiador aniónico fuerte es seguido de una columna con afinidad a metal inmovilizada en serie. Se ha descubierto asimismo que zvegf3 se une a varias matrices con colorante (por ejemplo, BLUE 1, BLUE 2, ORANGE 1, ORANGE 3 y RED3 de Lexton Scientific, Signal Hill, CA) en PBS a pH 6-8, a partir del cual la proteína de fijación puede eluirse en NaCl 1-2 M en tampón de ácido bórico 20 mM a pH 8,8. La proteína eluida de RED3 puede pasarse sobre RED2 (Lexton Scientific) para eliminar los contaminantes restantes. Las proteínas que comprenden una etiqueta glu-glu pueden purificarse por cromatografía de inmunoafinidad según procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Grussenmeyer et al., ibid. Las fusiones de la proteína que se une a la maltosa se purifican en una columna de amilosa según los procedimientos conocidos en la técnica.

Tal como se da a conocer con mayor detalle a continuación, la sobreexpresión de zvegf3 en los hígados de ratones transgénicos condujo a una activación y proliferación notables de las células estrelladas. A las 8 semanas de vida no había acumulación de la matriz extracelular perisinusoidal (ECM) que progresó hasta una deposición de FM perivenular a las 22 semanas y posibles etapas iníciales de la cirrosis caracterizadas por bandeo fibroso y formación del nódulo hepático a las 33 semanas de vida. Se observó que los animales más viejos presentaban hemagioendotelioma, hiperplasia hepatocelular ganglionar y adenoma hepatocelular. Estas alteraciones son coherentes con el desarrollo del carcinoma hepatocelular como resultado de la sobreexpresión a largo plazo de zvegf3.

Asimismo, tal como se da a conocer con más detalle a continuación, la estimulación de las células estrelladas hepáticas de rata con la proteína con dominio del factor de crecimiento de zvegf3 dio como resultado un aumento de aproximadamente 5 veces en la producción de TGF-\beta en comparación de las células de referencia. Se cree que TGF-\beta es un modulador importante de la fibrosis hepática que puede producir la expresión de otros genes profibrósicos. Por consiguiente, los efectos observados en los animales que sobreexpresan zvegf3 pueden ser debidos tanto a efectos directos como indirectos de zvegf3.

Los antagonistas de zvegf3 incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-zvegf3 (incluyendo anticuerpos neutralizantes), polinucleótidos inhibidores (incluyendo los polinucleótidos complementarios, ribozimas y secuencias de guía externas) y otros agentes peptídicos y no peptídicos incluyendo pequeñas moléculas de inhibidores y polipéptidos zvegf3 que se unen al receptor mitogénicamente inactivo.

Los anticuerpos utilizados como antagonistas de zvegf3 incluyen los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína zvegf3 y, uniéndose de este modo, reducen o impiden la fijación de la proteína zvegf3 y, por consiguiente reducen o bloquean la actividad de zvegf3 mediada por el receptor. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos policlonales y fragmentos de fijación del antígeno, tales como los fragmentos proteolíticos F(ab')_{2} y Fab. Los anticuerpos completos o los fragmentos modificados genéticamente, tales como los anticuerpos híbridos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, así como están también incluidos los péptidos y polipéptidos sintéticos de fijación al antígeno. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse injertando CDR no humanos en un marco humano y zonas constantes o incorporando los dominios completos de variable no humana (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie humanoide mediante sustitución de los restos expuestos, en los que el resultado es un anticuerpo "chapeado"). En algún caso, los anticuerpos humanizados pueden conservar restos no humanos dentro de los dominios del marco de la zona variable humana para potenciar las propias características de fijación. Mediante los anticuerpos humanizados, puede aumentarse la vida media biológica y se reduce el potencial de reacciones inmunitarias adversas durante la administración a seres humanos. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse también en ratones que se han alterado genéticamente para producir anticuerpos que tienen una estructura humana. Generalmente se prefieren los anticuerpos de la clase IgG para su utilización en la presente invención.

Los procedimientos para preparar y aislar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Cooligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Hurrell (ed.) Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982. Como sería evidente para un experto en la materia, pueden generarse anticuerpos policlonales inoculando una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones y ratas con un polipéptido zvegf3 o un fragmento del mismo.

Los polipéptidos inmunógenos comprenderán una fracción que lleva el epítopo de un polipéptido zvegf3 (por ejemplo, como se muestra en la SEC. ID. nº: 2) o el receptor. Un "epítopo" es una zona de una proteína a la que puede unirse un anticuerpo. Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002, 1984. Los epítopos pueden ser lineales o de configuración, estando estos últimos compuestos por zonas discontinuas de la proteína que forman un epítopo durante el plegamiento de la proteína. Los epítopos lineales son generalmente de por lo menos 6 restos de aminoácidos de longitud. Los péptidos sintéticos relativamente cortos que simulan parte de una secuencia de proteína son por rutina capaces de producir un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente simulada. Véase Sutcliffe et al., Science 219:660-666, 1983. Los polipéptidos inmunógenos, que llevan el epítopo contienen una secuencia de por lo menos seis, con frecuencia por lo menos nueve, más a menudo de 15 a aproximadamente 30 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido zvegf3 por receptor. Se incluyen los polipéptidos que comprenden un fragmento mayor de una proteína zvegf3 o el receptor, es decir de 30 a 50 restos hasta la secuencia completa. Es preferible que la secuencia de aminoácidos del polipéptido que lleva el epítopo se seleccione para proporcionar solubilidad sustancial en los disolventes acuosos, es decir la secuencia incluye restos relativamente hidrófilos, y los restos hidrófobos se evitan sustancialmente. Véase las Figs. 1A - 1G. Dichas zonas incluyen los restos 43-48, 96-101, 97-102, 260-265 y 330-335 de la SEC. ID. nº: 2. Como se señaló anteriormente, se prefiere generalmente utilizar péptidos algo más largos como inmunogenos, tales como un péptido que comprende los restos 80-104, 195-225, 299-314 y 299-326 de la SEC. ID. nº: 2. Este último péptido puede prepararse con un resto en Cys adicional con terminal N para facilitar el acoplamiento.

La inmunogenicidad de un polipéptido inmunógeno puede aumentarse mediante la utilización de un adyuvante, tal como alúminas (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de un polipéptido con zvegf3 o una porción de las mismas con un polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína que se une a la maltosa. Si la fracción del polipéptido es "haptenoforme", dicha porción puede articularse o unirse ventajosamente a un vehículo macromolecular (tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), o vacuna antitetánica) para la inmunización.

Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos incluyen la exposición in vitro de linfocitos a un polipéptido inmunógeno y la selección de bancos de presentación del anticuerpo en el fago o vectores similares (por ejemplo, mediante la utilización del polipéptido inmovilizado o marcado). Las técnicas para crear e identificar dichos bancos aleatorios para presentación de péptidos son conocidas en la técnica (por ejemplo, Ladner et al., patente US nº 5.223.409; Ladner et al., patente de US nº 4.946.778; Ladner et al., patente US nº 5.403.484 y Ladner et al., patente US nº 5.571.698) y los bancos de presentación del péptido aleatorios y kits para identificar dichos bancos están disponibles en el mercado, por ejemplo en Clontech Laboratorios (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ.). Los bancos de presentación del péptido aleatorios pueden cribarse utilizando las secuencias de zvegf3 dadas a conocer en la presente memoria para identificar proteínas que se unen a zvegf3.

Se determinan anticuerpos que se unen específicamente si se unen a su diana pretendida (por ejemplo, proteína zvegf3 o receptor) con una afinidad por lo menos 10 veces mayor que la afinidad de unión al polipéptido o proteína de referencia (por ejemplo, sin zvegf3 o sin receptor). A este respecto, un "polipéptido sin zvegf3" incluye las moléculas VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, P1GF, PDGF-A y PDGF-B, relacionadas, pero excluye los polipéptidos zvegf3 de especies no humanas. Debido al elevado nivel de identidad de secuencias de aminoácidos esperado entre los ortólogos de zvegf3, los anticuerpos específicos para zvegf3 humano pueden también unirse a zvegf3, de otras especies. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por cualquier experto en la materia, por ejemplo, por análisis Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949). Los procedimientos para identificar y aislar anticuerpos específicos son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Paul (ed.), Fundamental Inmunology, Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. In Inmunol. 43:1-98, 1998; Goding (ed.), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Inmunol. 2:67-101, 1984.

La afinidad de enlace puede determinarse también utilizando un instrumento biodetector disponible en el mercado (BIACORE, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), en el que se inmoviliza la proteína en la superficie de un chip receptor. Véase, Karlsson, J. Inmunol. Methods 145:229-240, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993. Este sistema permite la determinación de las proporciones en y fuera de las cuales puede calcularse la afinidad de fijación y la evaluación de la estequiometría de enlace.

Los anticuerpos se considera que están "aislados" cuando están preparados esencialmente sin otros anticuerpos de diferente especificidad. La utilización de anticuerpos aislados facilita la dirección a la diana de los epítopos específicos o de los fragmentos de zvegf3, tales como el dominio del factor de crecimiento.

Una variedad de ensayos conocidos por los expertos en la materia puede utilizarse para detectar anticuerpos que se unen específicamente a proteínas zvegf3 o receptores. Ensayos a título de ejemplo se describen con detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Ejemplos representativos de dichos análisis incluyen: inmunoelectroforesis a co-corriente, radioinmunoanálisis, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA), transferencia de manchas o análisis de transferencia Western, análisis de inhibición o competencia y análisis en sandwich.

Para aplicaciones terapéuticas se prefiere generalmente utilizar anticuerpos neutralizantes. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo neutralizante" indica un anticuerpo que inhibe por lo menos un 50% menos de la actividad biológica del antígeno afín cuando el anticuerpo se añade en un exceso molar de 1000 veces. Los expertos en la materia reconocerán que a veces es deseable una actividad neutralizante mayor, y pueden emplearse ventajosamente anticuerpos que proporcionan el 50% de inhibición a un exceso molar de 100 veces o 10 veces.

Los antagonistas de zvegf3 incluyen además polinucleótidos complementarios, que pueden utilizarse para inhibir la transcripción del gen zvegf3 y de este modo inhibir la activación celular y/o la proliferación in vivo. Polinucleótidos que son complementarios para un segmento de un polinucleótido que codifica a zvegf3 (por ejemplo, un polinucleótido como se indica en la SEC. ID. nº: 1) se diseñan para unirse al ARNm que codifica a zvegf3 y para inhibir la traducción de dicho ARNm. Los polinucleótidos complementarios pueden dirigirse a tejidos específicos utilizando un método de terapia génica con vectores y/o activadores específicos, tales como los sistemas de administración vírica dados a conocer con más detalle a continuación.

Pueden utilizarse asimismo ribozimas como antagonistas de zvegf3. Las ribozimas son moléculas de ARN que contienen un centro catalítico y una parte de unión al ARN diana. El término incluye enzimas con ARN, ARN con auto-corte y empalme, los ARN de autoescisión y moléculas de ácido nucleico que realizan estas funciones catalíticas. Una ribozima se une selectivamente a una molécula de ARN diana por emparejamiento de bases complementarias, llevando el centro catalítico en proximidad intima con la secuencia diana. La ribozima escinde a continuación el ARN diana y se libera, tras lo cual es capaz de unirse y escindir más moléculas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina "gen ribozima". Las ribozimas pueden diseñarse para expresar la actividad de endonucleasa que se dirige a determinada secuencia diana en una molécula de ARNm (véase, por ejemplo, Draper y Macejak, patente US nº 5.496.698; McSwiggen, patente US nº 5.525.468; Chowrira y McSwiggen, patente US nº 5.631.359; y Robertson y Goldberg, patente US nº 5.225.337). Puede construirse un vector de expresión en el que un elemento regulador está operativamente unido a una secuencia nucleotídica que codifica una ribozima.

En otro enfoque, pueden construirse vectores de expresión en los que un elemento regulador dirige la producción de transcritos de ARN capaces de activar la escisión de las moléculas de ARN que codifican un polipéptido zvegf3 mediada por RNasa P. Según este método, puede construirse una secuencia guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a una especie determinada de ARNm intracelular que es escindido posteriormente por la ribozima celular (véase, por ejemplo, Altman et al., patente de EE.UU. nº 5.168.053; Yuan et al., Science 263:1269, 1994; Pace et al., publicación WIPO nº WO 96/18733; George et al., publicación WIPO nº WO 96/21731; y Werner et al., publicación WIPO nº WO 97/33991). Una secuencia guía externa comprende generalmente una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria de ARNm de zvegf3 y una secuencia nucleotidica 3'-NCCA, en la que N es preferentemente una purina. La secuencia guía externa transcribe la unión a la especie de ARNm objetivo mediante la formación de pares de bases entre el ARNm y las secuencias guía externas complementarias, activando de este modo la escisión del ARNm por la RNasa P en el nucleótido situado en la sección 5' de la zona de bases emparejadas.

Se ha descubierto que el dominio de zvegf3 en el factor del crecimiento es la especie activa (fijación al receptor de PDGF) de la molécula. Para activación se requiere tratamiento proteolítico para eliminar la fracción del terminal N de la molécula. De este modo, pueden utilizarse asimismo inhibidores de esta activación proteolítica como antagonistas de zvegf3.

Para su utilización farmacéutica, se formulan antagonistas de zvegf3 para administración parenteral, particularmente intravenosa o intraperitoneal, según los procedimientos convencionales. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un antagonista de zvegf3 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua, albúmina de suero humano al 5% o similares. Las formulaciones pueden incluir además, uno o más excipientes, conservantes, disolventes, agentes tamponantes, albúmina, para evitar la pérdida de proteínas en las superficies del vial, etc. Los liposomas pueden utilizarse como vehículos según los procedimientos conocidos. Los procedimientos de la formulación son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19ª ed., 1995. Un antagonista de zvegf3 normalmente se formulará y envasará en una forma farmacéutica unitaria. Los anticuerpos por lo general se formularán a concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente o composición terapéutica es la cantidad que produce un efecto estadísticamente significativo, tal como un aumento estadísticamente significativo en la tasa de supervivencia en un periodo de tiempo dado, aumento del tiempo de supervivencia, reducción de la masa tumoral, reducción de la metástasis tumoral, reducción de la evolución de la enfermedad, reducción en tiempo para la evolución y similares. La dosis exacta la determinará el médico según las pautas aceptadas, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la enfermedad que debe tratarse, características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de cualquier experto en la materia. Las formulaciones terapéuticas generalmente se administrarán durante el periodo requerido para conseguir un efecto beneficioso, comúnmente hasta varios meses. La dosificación es diaria o intermitente durante el periodo de tratamiento. La administración intravenosa ordinariamente será por infusión durante un periodo típico de una a varias horas. Pueden emplearse también formulaciones de liberación mantenida. Una gran dosis de carga puede administrase inicialmente, seguida de dosis de mantenimiento periódicas más pequeñas.

Otros factores mitógenos, incluyendo el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento insulinoide (IGF) han estado implicados en el inicio o evolución del carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, puede presentar ventajas el hecho de combinar un inhibidor de zvegf3 con uno o más inhibidores de estos otros factores.

Puede administrarse un antagonista de zvegf3 en combinación con terapias conocidas para el carcinoma hepatocelular, incluyendo la cirugía, la quimioterapia, la extirpación quirúrgica por radio frecuencia, la terapia con láser o microondas, la inyección de etanol percutánea, la criocirugía, la inmunoterapia o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, un antagonista de zvegf3 puede administrarse en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales tales con cisplatino (Epstein et al., Cancer 67:896-900, 1991), hidrocloruro de doxorrubicina (Choi et al, Radiology 182:709-713, 1992), 5-fluorodesoxiuridina (Ensminger et al., Cancer Treat. Rep. 65:393-400, 1981), diclorometotrexato (Ensminger et al., ibid.) o discloroetilnitrosourea (Dakhil et al., Cancer 50:631-635, 1982). La selectividad zonal de la quimioterapia puede mejorarse y la toxicidad generalizada reducirse por quimioembolización (p.ej., Choi et al., ibid.; Dakhil et al., ibid) o infusión arterial hepática (por ejemplo, Ensminger et al., ibid.). La administración de múltiples agentes terapéuticos puede ser simultánea o sucesiva. La quimioembolización, criocirugía, inyección de etanol percutánea y la extirpación por radio frecuencia son de particular interés en el tratamiento de tumores localizados más pequeños (<5 cm) que son irreseccionables debido a la situación o la presencia de otras afecciones medicas.

En determinadas formas de realización de la invención la administración de antagonistas de zvegf3 solos o en combinación con otra terapia producirá una respuesta tumoral. Aunque cada protocolo puede definir las evaluaciones de la respuesta tumoral de manera diferente, pueden encontrarse directrices a título de ejemplo en Clinical Research Associates Manual; Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA; 6 de Octubre de 1998, actualizada en Agosto de 1999 ("CRA Manual"). Según el Manual de CRA (véase el capitulo 7, "Response Accessment"), la respuesta tumoral significa una reducción o eliminación de todas las lesiones o metástasis mensurables. La enfermedad se considera generalmente mensurable si comprende lesiones mensurables en las dos direcciones con márgenes claramente definidos por fotografía médica o rayos X, tomografía axial computerizada (CT), diagnóstico por la imagen de resonancia magnética (MRI) o palpación. Enfermedades evaluables significa que la enfermedad comprende lesiones mensurables en una dimensión, masas con márgenes no definidos claramente, la lesión con ambos diámetros inferiores a 0,5 cm, lesiones en exploración con diámetro más pequeño que la distancia entre los cortes, lesiones palpables con un diámetro inferior a 2 cm u osteopatía. Las enfermedades no evaluables incluyen los derrames de la pleura, ascitis y la enfermedad documentada por pruebas indirectas. Las lesiones previamente radiadas que no han evolucionado se consideran generalmente también no evaluables.

Criterios para el estado objetivo se requieren para protocolos para evaluar la respuesta al tumor solido. Los criterios representativos incluyen los siguientes: (1) respuesta completa (CR) definida como la desaparición completa de todas las enfermedades mensurables y evaluables. Ninguna lesión nueva. Ningún síntoma relacionado con la enfermedad. Ninguna prueba de enfermedad no evaluable; (2) respuesta parcial (PR), definida como disminución superior o igual al 50% de la referencia en la suma de los productos de diámetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables. Ninguna evolución de la enfermedad evaluable. Ninguna lesión nueva. Aplica a pacientes con por lo menos una lesión mensurable; (3) evolución, definida como 50% o un aumento de 10 cm^{2} en la suma de productos de lesiones mensurables sobre la suma más pequeña observada utilizando las mismas técnicas que la referencia, o empeoramiento evidente de cualquier enfermedad evaluable, o la reaparición de cualquier lesión que haya desaparecido, o la aparición de alguna nueva lesión, o insuficiencia para retornar para la evolución debida a la muerte o condición de deterioro (salvo que no esté relacionada con este cáncer); (4) estable o sin respuesta, definida como sin cualificación para CR, PR o evolución. (Véase, Clinical Research Assocites Manual, anteriormente).

Los anticuerpos se administran por vía parenteral, generalmente por infusión intravenosa (incluyendo la infusión arterial hepática) durante el transcurso del tratamiento. La administración puede ser también intraperitoneal. Los anticuerpos se administran generalmente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20 mg/Kg del peso del paciente, normalmente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10 mg/Kg y con frecuencia entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 mg/Kg. A este respecto, es preferible utilizar anticuerpos con una vida media circulante de por lo menos 12 horas, preferentemente por lo menos 4 días, más preferentemente hasta 14-21 días. Los anticuerpos híbridos y humanizados es de esperar que tengan vidas medias circulatorias de hasta cuatro y hasta 14-21 días, respectivamente. En muchos casos, será preferible administrar una dosis de carga mayor seguida de dosis periódicas (por ejemplo, semanalmente) de mantenimiento durante el periodo del tratamiento. Los anticuerpos pueden también administrarse por sistemas de administración de liberación lenta, bombas y otros sistemas de administración conocidos para la infusión continua. Los regímenes de dosificación pueden variarse para proporcionar los niveles de circulación deseados de un anticuerpo específico basándose en su farmacocinética. Por lo tanto, las dosis se calcularán de modo que se mantenga el nivel de circulación deseado del agente terapéutico.

La dosis actual y el régimen de tratamiento los determinará el médico, teniendo en cuenta la naturaleza del cáncer (primario o metastásico). El número y el tamaño de los tumores, otras terapias y las características del paciente. A la vista de la naturaleza del carcinoma hepatocelular que amenaza la vida, pueden emplearse grandes dosis con efectos secundarios significativos.

Los expertos en la materia reconocerán que los mismos principios guían la utilización de otros antagonistas de zvegf3. El régimen de dosificación para un antagonista dado se determinará mediante un número de factores que incluyen la potencia, farmacocinética y la naturaleza fisicoquímica del antagonista. Por ejemplo, pueden administrarse por vía enteral antagonistas de zvegf3 no peptídicos.

Los polinucleótidos terapéuticos, tales como los polinucleótidos complementarios, pueden administrarse a pacientes o a animales de ensayo por medio de sistemas de administración vírica. Los virus a título de ejemplo destinados a este fin incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus de vacuna y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para la administración de ácidos nucleícos heterólogos. Para el estudio, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-189, 1994; y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997. El sistema de adenovirus ofrece varias ventajas. El adenovirus puede (i) acomodar inserciones de ADN relativamente grandes; (ii) desarrollarse hasta un valor elevado; (iii) infectar un extenso intervalo de tipos de células de mamífero; y (iv) utilizarse con muchos activadores diferentes incluyendo los activadores omnipresentes, específicos para el tejido y regulables. Debido a que los adenovirus son estables en el torrente sanguíneo, pueden administrase por inyección intravenosa.

Al eliminar las fracciones del genoma de adenovirus, pueden acomodarse inserciones mayores (hasta de 7 kb) de ADN heterólogo. Estas inserciones pueden incorporarse en el ADN vírico por ligadura directa o por recombinación homologa con el plásmido cotransfectado. Cuando se administran por vía intravenosa a animales sanos, el adenovirus principalmente se dirige al hígado. Si el sistema de administración adenovírico tiene una eliminación del gen E1, el virus no puede replicarse en las células hospedadoras. Sin embargo, el tejido del hospedador (por ejemplo, el hígado) expresará y procesará (y, si está presente una secuencia señal, segrega) la proteína heteróloga.

Un procedimiento alternativo de administración génica comprende la eliminación de las células del cuerpo y la introducción de un vector en las células como plásmido de ADN desnudo. Las células transformadas se vuelven a implantar a continuación en el cuerpo. Los vectores de ADN desnudo se introducen en las células hospedadoras por los procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo la transfección, electroporación; microinyección, transducción, fusión celular, precipitación con DEAE dextrano, y fosfato cálcico utilización de una pistola genérica o utilización de un transportador del vector ADN. Véase, Wu et al., J. Biol. Chem: 263:14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem: 267:963-967, 1992; y Johnson y Tang, Meth. Cell Biol. 43:353-365, 1994.

La actividad de los antagonistas de zvegf3 puede medirse in vitro utilizando análisis, (incluyendo los análisis basados en células) diseñados para medir la actividad de zvegf3. Los antagonistas reducirán los efectos de zvegf3 en el análisis. El enlace ligando-receptor puede analizrse por varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los análisis de competencia del receptor (Bowen-Pope y Ross, Methods Enzyme. 109:69-100, 1985) y mediante la utilización de receptores solubles, incluyendo los receptores producidos como proteínas de fusión IgG (patente de EE.UU. nº 5.750.375). Los ensayos de fijación al receptor pueden realizarse en estirpes celulares que contienen receptores de la superficie celular conocidos para la evaluación. Pueden estar presentes receptores de forma natural en la célula o pueden ser receptores recombinantes expresados por células modificadas genéticamente. La actividad mitógena puede medirse utilizando análisis conocidos incluyendo los análisis de incorporación de ^{3}H-timidina (dados a conocer, por ejemplo, por Raines y Ross, Methods Enzymol. 109:749-773, 1985; y Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8:5016-5025, 1988), ensayos de incorporación de colorante, (como los dados a conocer, por ejemplo, por Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983 y Raz et al., Acta Trop. 68:139-147, 1997) o recuentos celulares. Los ensayos de mitogénesis miden la incorporación de ^{3}H-timidina en (1) cultivos confluentes al 20% para buscar la capacidad de las proteínas zvegf3 para estimular más las células proliferantes, (2) células en reposo en confluencia mantenidas durante 48 horas para buscar la capacidad de las proteínas zvegf3 para superar la inhibición del crecimiento provocada por contacto. Los ensayos de incorporación del colorante adecuados incluyen la medición de la incorporación del colorante azul Alamar (Raz metal., Ibid.) en la células diana. Véase también Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70:395-405, 1976; Ewton y Florini, Endocrinol. 106:577-583, 1980; y Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:7311-7315, 1989.

Las actividades biológicas de los antagonistas de zvegf3 pueden estudiarse en animales no humanos por administración de compuestos exógenos, por expresión de polinucleótidos complementarios de zvegf3 y por supresión de la expresión zvegf3 endógena por técnicas de modificación genética. Pueden emplearse sistemas de administración vírica (dados a conocer anteriormente). antagonistas de zvegf3 pueden administrarse o expresarse individualmente, en combinación con otros antagonistas de zvegf3, o en combinación con otros compuestos, incluyendo otros antagonistas del factor de crecimiento. Los animales de ensayo se controlan por cambios en dichos parámetros como los signos clínicos, el peso corporal, los recuentos de células sanguíneas, los análisis clínicos, la histopatología, el tamaño y la evolución del tumor y similares.

Los modelos animales que pueden utilizarse en la evaluación de los tratamientos para el carcinoma hepatocelular incluyen los ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Singh y Kuman, Rev. Med. Virol. 13:243-253, 2003), perfusión de dietilnitrosamina en ratas (por ejemplo, Wang et al., World J. Gastroenterol. 9:930-935, 2003; Hemmings y Strickland, Cellular Physiology and Biochemistry 12:345-352, 2002), implantación tumoral: (por ejemplo, Qian et al., World J. Gastroenterol. 9:94-98, 2.003), el modelo de carcinogénesis poliorgánico (Hideaki et al., Japanese Journal of Cancer Research 93:1299-1307, 2.002) y marmotas infectadas con virus crónicos (Tennant, Clin. Liver Dis. 5:43-68, 2.001).

La invención se ilustrara con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

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Ejemplos Ejemplo 1

Se cribó un banco de glándulas salivales humano para un clon completo de zvegf3 por PCR. Este banco era un banco ordenado que representa 9,6 x 10^{5} clones construido en el vector pZP5x. El vector pZP5x es el mismo que pZP9 (depositado en American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA con el número de registro 98668), pero contiene un activador de citomegalovirus en lugar de una metaltioneína entre las secuencias Asp718 y BamHI. El plásmido comprende de este modo un gen de dihidrofolato-reductasa bajo el control del activador precoz SV40 y de la secuencia de poliadenilación de SV40 y una secuencia de clonación para insertar el gen de interés bajo el control del activador CMV y secuencia de poliadenilación génica de la hormona de crecimiento humana (hGH). La placa de operación que contiene 80 grupos de 12.000 colonias cada uno fue identificada por PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos ZC19.045 (SEC. ID. nº: 6) y ZC19.047 (SEC. ID. nº: 7) con una temperatura de hibridación de 60ºC durante 35 ciclos. Existen dos grupos muy positivos 58 (T-8 F1-F12) y 77 (T-7 H1-H12). Los grupos correspondientes en la placa de transferencia fueron identificadas a continuación por PCR utilizando las mismas condiciones. Se obtuvieron dos positivos en el nivel de transferencia. Los positivos eran T-7 H11 y T-8 F10. Se realizaron reacciones con 5' RACE en los grupos de la placa de transferencia, y los fragmentos se secuenciaron para comprobar las secuencias de zvegf3 y determinar si estaba presente un clon completo. Para la PCR se utilizaron los cebadores oligonucleótidos CZ12.700 (SEC. ID. nº: 8) y CZ19.045 (SEC. ID. nº: 6) a una temperatura de hibridación de 61ºC durante 5 ciclos, a continuación 55ºC durante 30 ciclos. El secuenciado demostró que la mezcla T-7 H11 presentaba un desplazamiento de los marcos. La secuencia F10 del grupo de la placa de transferencia 8 parecía ser correcta, de modo que esta mezcla de ADN se utilizó en los filtros de vacío.

La mezcla F10 de la placa de transferencia 8 se colocó en placas y se filtró utilizando membranas de nilón (Hybond-N^{TM}; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). Se tomaron aproximadamente 1.200 colonias por placa en cada uno de los 5 filtros para un total de aproximadamente 6.000 colonias. Los filtros se marcaron con una aguja caliente para orientación, a continuación se desnaturalizaron durante 6 minutos en NaOH 0,5 M y Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Se neutralizaron a continuación los filtros en NaCl 1,5 M y Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. Se fijo el ADN a los filtros utilizando un reticulador UV (Stratalinker® Stratagene, La Jolla, CA) a 1.200 julios. Se prelavaron los filtros a 65ºC: en tampón de prelavado consistente en 0,25 x SSC, SDS al 0,25% y EDTA 1 mM. Se cambió la solución un total de tres veces durante un periodo de 45 minutos para eliminar los desechos celulares. Se prehibridaron los filtros durante aproximadamente 3 horas a 65ºC en 25 ml de solución de hibridación (ExpressHyb^{TM}; Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto CA). Se generó la sonda utilizando un fragmento de aproximadamente 400 pb producido por digestión de un clon que comprende una etiqueta con la secuencia expresada de zvegf3 con EcoRl y BgIII seguido de purificación en gel utilizando una columna rotativa que contiene una membrana de sílica gel (QIAquick^{TM} Gel Extraction Kit; Quiagen, Inc., Valencia CA). Se marcó la sonda por radioactividad con ^{32}P por cebado aleatorio utilizando un kit disponible en el mercado (Rediprime^{TM} II, Amersham Corp., Arlintong Heights, IL) y se purificó utilizando una columna de impulsión. Se utilizó la solución ExpressHyb^{TM} para la solución de hibridación destinada a los filtros. La hibridación tuvo lugar durante la noche a 65ºC. Se enjuagaron las transferencias dos veces en solución 1 a 65ºC (2 x SSC, SDS al 0,1%), a continuación se lavaron 4 veces en la solución 1 a 65ºC. Se expusieron los filtros a la película durante la noche a -80ºC. Existían 14 positivos en los filtros. Se tomaron 85 clones de las áreas positivas y se identificaron por PCR utilizando sondas oligonucleotídicas ZC19.045 (SEC. ID. nº: 6) y ZC19.047 (SEC. ID. nº: 7) y una temperatura de hibridación de 60ºC. Se obtuvieron trece positivos y se rayaron para los clones individuales. Se tomaron veinticuatro colonias y se comprobaron por PCR como se describió anteriormente. Se obtuvieron seis positivos, dos de los cuales se secuenciaron. Ambas secuencias eran iguales y completas. La secuencia se presenta en la SEC.ID. nº: 1.

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Ejemplo 2

Se cribó un panel por PCR para el ADN de zvegf3 de ratón. El panel contenía 8 muestras de ADNc de bancos de cerebro, medula ósea, embrión de 15 días, testículos, glándulas salivales, placenta, embrión de 15 días (Clontech Laboratories) y embrión de 17 días (Clontech Laboratories).

Las mezclas de la PCR contenían los cebadores oligonucletilicos ZC21.222 (SEC. ID. nº: 9) y ZC21.224 (SEC. ID. nº: 10). La reacción se realizó a una temperatura de hibridación de 66ºC con un tiempo de prolongación de 2 minutos durante un total de 35 ciclos utilizando la Ex Taq^{TM} ADN polimerasa (PanVera, Madison, WI) más anticuerpo. Se observó que las muestras de ADN eran positivas para zvegf3 por PCR y se confirmó por secuenciado incluido el ADNc de la mezcla total del banco de embriones de 15 días de ratón, embriones de 15 días de ratón (Clontech Laboratories) y embriones de 17 días (ambos adquiridos en Clontech Laboratories), ADNc de la mezcla total del banco de glándulas salivales de ratón y del ADN de la mezcla total del banco de testículos de ratón. Se secuenciaron los fragmentos de aproximadamente 600 pb de cada uno de los ADNc de la mezcla total del banco de embriones de 15 días de ratón, del ADNc de embriones de 15 días de ratón y de los productos de la PCR con ADNc de embriones de 17 días de ratón. La secuencia del ADNc del embrión de 17 días de ratón y los productos del ADNc de la mezcla total del banco de embriones de 15 días de ratón confirmó que los fragmentos eran de ADN con zvegf3 de ratón.

Se identificó el ADN con zvegf3 completo en el banco de embriones de 15 días de ratón. Este banco era un banco ordenado que representa 9,6 x 10^{5} clones en el vector pCMV\cdotSPORT 2 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La placa de operación, que contiene 80 grupos de 12.000 colonias cada una, fue identificada por PCR utilizando los cebadores oligonucletídicos ZC21.223 (SEC. ID. nº: 11) y ZC21.224 (SEC. ID. nº: 10) con una temperatura de hibridación de 66ºC durante 35 ciclos. Se obtuvieron dieciocho positivos. Se secuenciaron los fragmentos de cuatro grupos (A2, A10, B2 y C4); todos confirmaron que codifican zvegf3. Rondas adicionales de identificación utilizando las mismas condiciones de reacción y las mezclas en las placas de operación y de origen identificaron un grupo positivo (5D).

Se identificaron colonias positivas por hibridación. El grupo 5D de la placa nº 5 de la fuente original se colocó en placas a razón de aproximadamente 250 colonias por placa y se transfirió a membranas de nilón (Hybond-N^{TM}; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL). Se recogieron cinco filtros para un total de \sim 1250 colonias. Se marcaron los filtros con una aguja caliente para orientación, a continuación se desnaturalizaron durante 6 minutos en NaOH 0,5 M y Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Se neutralizaron a continuación los filtros en NaCl 1,5 M y Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. Se fijó el ADN a los filtros utilizando un reticulador UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla, CA) a 1.200 julios. Se generó una sonda por PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos CZ21.223 (SEC. ID. nº: 11) y ZC21.224 (SEC. ID. nº: 10) y una plantilla de ratón de 15 días a una temperatura de hibridación de 66ºC durante 35 ciclos. Se purificó en gel el fragmento de PCR utilizando una columna rotativa que contenía una membrana de gel de sílice (QIAquick^{TM} Gel Extraction Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA). El ADN se marcó por radioactividad con ^{32}Putilizando un kit disponible en el mercado (Sistema de marcado con cebador aleatorio Rediprime^{TM}; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) según las especificaciones del fabricante. Se purificó la sonda utilizando una columna de impulso disponible en el mercado (columna NucTrap®; Stratagene, La Jolla, CA; véase la patente de EE.UU. nº 5.336.412). Se prelavaron los filtros a 65ºC en tampón de prelavado consistente en 0,25X SSC, SDS al 0,25% y EDTA 1 mM. Se cambió la solución un total de tres veces durante un periodo de 45 minutos para eliminar los desechos celulares. Se prehibidaron los filtros durante la noche a 65ºC en 25 ml de una solución de hibridación (ExpressHyb^{TM} Hibridization Solution; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), a continuación se hibridaron durante la noche a 65ºC en la misma solución. Se enjaguaron los filtros dos veces a 65ºC en tampón de prelavado (0,25X SSC, SDS al 0,25%, y EDTA 1 Mm), a continuación se lavaron dos veces en tampón de prelavado a 65ºC. Se expusieron los filtros a la película durante 2 días a -80ºC. Habían 10 positivos en los filtros. Se cogieron 3 clones de las áreas positivas, se rayaron y se identificaron 15 colonias individuales de estos tres positivos por PCR utilizando los cebadores ZC21.223 (SEC. ID. nº: 11) y ZC21.334 (SEC. ID. nº: 12) a una temperatura de hibridación de 66ºC. Se recuperaron dos positivos y se secuenciaron. Se descubrió que ambas secuencias eran iguales y se codificó el zvegf3 de ratón completo (SEC. ID. nº: 4).

La secuencia de aminoácidos está muy conservada entre los zvegf3 de ratón y humano, con una identidad de la secuencia total de aminoácidos del 87%. El péptido segregador, el dominio CUB, el interdominio y el dominio del factor de crecimiento presentan una identidad de aminoácidos del 82%, 92%, 79% y 94%, respectivamente.

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Ejemplo 3

Se construyó un vector de expresión de células de mamífero para el dominio del factor de crecimiento zvegf3 uniendo el fragmento zvegf3 a una secuencia que codifica una secuencia señal segregadora de t-PA optimizada (patente US nº 5.641.655) en el vector pZMP11 linealizado del activador de CMV. El plásmido pZMP11 es un vector de expresión de mamífero que contiene una casete de expresión que tiene el activador precoz inmediato a CMV, un intrón de consenso de la zona variable del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, secuencias Kosak, secuencias de restricción múltiples para la inserción de las secuencias de codificación, un codón de terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humano. El plásmido contiene asimismo un elemento IRES del poliovirus, la secuencia de codificación del dominio extracelular de CD8 truncada en el extremo del terminal C del dominio transmembranario, un origen de replicación de E. coli , una unidad de expresión del marcador seleccionable del mamífero que tiene un activador SV40, potenciador y origen de replicación, un gen DHFR, el terminador SV40 y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y replicación en S. cerevisiae. El vector resultante se denominó pZMP11/zv3GF-otPA.

Se transfectaron las células BHK 570 con pZMP11/zv3GF-otPA por transfección mediada por liposomas utilizando una formulación de liposomas 3:1 (w/w) del lípido policatiónico 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N-N-dimetil-1-propaniminio-trifluoroacetato y el lípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina en agua filtrada por membrana (Lipofectamina^{TM};Life Technologies) y se cultivó según los procedimientos convencionales.

Se ajustó el medio acondicionado con células BHK hasta MES 20 mM a pH 5,5. Una columna de resina de intercambio catiónico (Poros® HS 50; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) (2 cm de diámetro; de volumen de lecho de 50 ml) se equilibró en MES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. El medio ajustado se bombeó en la columna a razón de 20 ml/minuto. Cuando se terminó la carga, se lavó la columna, en primer lugar en MES 20 Mm, NaCl 150 mM, pH 5,5, a continuación con el mismo tampón de composición a pH 6,0. Una vez la referencia volvió a absorbancia cero, la columna se eluyó con un gradiente de 10 volúmenes de columna a MES 20 mM, NaCl 1 M, pH 6,0. El dominio del factor de crecimiento de zvegf3 eluyó a una conductividad de 25 a 50 mS durante el gradiente en desarrollo. La SDS-PAGE reductora puso de manifiesto una banda distinta a 20 kD, que se confirmó como zvegf3 por inmunotransferencia Western. Este material se mezcló y se preparó para cargar a un conjunto con columna tándem que comprende una resina de intercambio aniónico fuerte (Poros® HQ 50; PerSeptive Biosystems) seguido de una columna de afinidad con metal inmovilizado (níquel) en serie. El sistema de columnas se equilibró en tampón MOPS 20 Mm a pH 7,0. La mezcla de zvegf3 se diluyó en línea a 1:10 (v/v) con el tampón de equilibrio MOPS mientras se cargaba. Una vez completada la carga la columna en serie se lavó con tampón MOPS 20 mM, pH 7,0, hasta que se obtuvo la absorbancia de referencia. A continuación se desconectó la columna con níquel del intercambiador aniónico y se lavó con MOPS 20 mM pH 7,0 que contenía NaCl 150 mM. Se eluyó la columna con un gradiente de 1 volumen de columna entre el tampón del último lavado y el mismo tampón que contenía imidazol 20 mM a pH 7,0. Las fracciones que contenían el dominio del factor de crecimiento de zvegf3 se mezclaron y se concentraron utilizando una membrana de corte de 5 kD en preparación para el intercambio de tampón y la purificación en una columna por exclusión de tamaño equilibrada en PBS.

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Ejemplo 4

Para preparar animales transgénicos que expresan genes zvegf3 se requiere machos fértiles y adultos (sementales) (B6C3f1, de 2 a 8 meses de vida, (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (estériles) (B6D2f1, de 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), hembras fecundas prepuberales (donantes) (B6C3f1, 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fecundas adultas (receptoras) (B6D2f1, de 2 a 4 meses, (Taconic Farms)).

Se aclimataron los donantes durante 1 semana, a continuación se les inyectó aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina (hCG (Sigma Chemical Co.)) I.P. para provocar superovulación. Los donantes se aparean con sementales después de las inyecciones de hormonas. La ovulación se produce generalmente a las 13 horas de la inyección hCG. Se confirma la copulación por la presencia de un tapón vaginal la mañana siguiente del apareamiento.

Se recogieron óvulos fecundados bajo un microescopio quirúrgico (microscopio Leica MZ12 Stereo, Leica, Wetzlar, Alemania). Se recogieron los oviductos y se liberaron los huevos en portaobjetos para análisis de orina que contenían hialuronidasa (Sigma Chemical Co). Se lavaron los huevos una vez en hialuronidasa y dos veces en medio W640 de Whitten (Tabla 2; todos los reactivos están disponibles en Sigma Chemical Co.) que se había incubado con 5% de CO_{2}, 5% de O_{2} y 90% de N_{2} a 37ºC. Se almacenaron los huevos en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5% hasta la microinyección.

TABLA 2

2

El ADNc con zvegf3 se inserta en el vector de expresión pHB12-8. El vector pHB12-8 procede del p2999B4 (Palmiter et al., Mol. Cell Biol. 13:5266-5275, 1993) por inserción de un intrón de insulina II de rata (aprox. 200 pb) y la zona no traducida de la hormona de crecimiento humano (hGH) y una señal de poliadenilación (aprox. 650 pb) flanqueada por 10 kb de la secuencia de flanqueo 5' de MT-1 y 7 kb de la secuencia de flanqueo 3' de MT- 1. El ADNc se inserta entre la insulina II y las secuencias de hGH.

De 10 a 20 microgramos del ADN plásmido se linealizan, se purifican en gel y se vuelven a poner en suspensión en Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 0,25 mM pH 8,0 a una concentración final de 5 a 10 nanogramos por microlitro para microinyectables.

El ADN plásmido se microinyecta en los óvulos recogidos contenidos en una gota de medio de W640 cubierta una capa aceite mineral caliente equilibrado con CO_{2}. El ADN se coge en una aguja de inyección (se impulsa desde un DI de 0,75 mm, capilar de vidrio de borosilicato de 1 mm de diámetro externo) y se inyecta en cada óvulo. Cada huevo se penetra con la aguja de inyección en uno o ambos pronúcleos haploides.

Se inyectan picolitros de ADN en los pronúcleos, y la aguja de inyección se retira sin entrar en contacto con los nucléolos. El procedimiento se repite hasta que todos los huevos están inyectados. Los huevos microinyectados con éxito se transfieren a una placa de cultivo para tejido orgánico con medio W640 pregasificado para el almacenamiento durante la noche en una incubadora a 37ºC/5% de CO_{2}.

Al día siguiente, embriones de 2 células se transfieren a receptoras pseudoembarazadas. Se identifican los receptores por la presencia de tapones de copulación, después de copulación con estériles vasectomizados. Los receptores se anestesian y se rasura el lado izquierdo dorsal y se transfiere a un microscopio quirúrgico. Se practica una pequeña incisión en la piel y a través de la pared muscular en la mitad del área abdominal perfilada por la caja torácica, el cuarto trasero y la pata trasera, a medio camino entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductores se sacan al exterior en un pequeño paño quirúrgico. La almohadilla de grasa se extiende sobre el paño quirúrgico, y una pequeña pinza hemostática (Roboz, Rockvilles, MD) se acopla a la almohadilla de grasa y se deja colgando sobre el lomo del ratón, impidiendo que los órganos se vuelvan a deslizar. Con una pipeta fina de transferencia que contiene un aceite mineral seguido W640 alternativo y burbujas de aire, de 12 a 17 embriones sanos de 2 células de la inyección del día anterior se transfieren al receptor. La ampolla hinchada se sitúa, y manteniendo el oviducto entre la ampolla y la bolsa, se hace una señal en el oviducto con una aguja de calibre 28 próxima a la bolsa, asegurándose de que no se desgarre la ampolla o la bolsa. La pipeta se transfiere a la señal en el oviducto, y los embriones se hinchan, permitiendo que escape la primera burbuja de aire de la pipeta. La almohadilla de grasa se empuja suavemente dentro del peritoneo y los órganos reproductores se dejan que se deslicen en él. La pared del peritoneo se cierra con una sutura y la piel se cierra con un punto de herida. El ratón se recupera en un calentador de platina a 37ºC durante un mínimo de 4 horas.

Los receptores se devuelven a las jaulas por parejas, y se dejan entre 19 y 21 días de gestación. Después del nacimiento, entre 19 y 21 días después del parto se les deja antes del destetado. Los destetados se sexan y se colocan en jaulas separadas por sexos y se extrae una biopsia de 0,5 cm (utilizada para genotipados) de la cola con tijeras limpias.

El ADN genómico se prepara a partir de los recortes de la cola utilizando un kit disponible en el mercado (DNeasy^{TM}96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se analiza por PCR utilizando cebadores diseñados para la fracción 3' UTR de la hormona de crecimiento humano (hGH) del vector transgénico. La utilización de una zona única para la secuencia humana (identificada en una alineación de las secuencias de ADN 3' UTR de la hormona de crecimiento humana y de ratón) asegura que la reacción de PCR no amplia la secuencia de ratón. Los cebadores ZC17.251 (SEQ ID nº: 13) y ZC17.252 (SEQ ID nº:14) amplían un fragmento de 368 pares de bases de hGH. Además, los cebadores ZC17.156 (SEQ ID nº: 15) y ZC17.157 (SEQ ID nº: 16), que se hibridan con las secuencias del vector y amplían la inserción del ADNc; pueden utilizarse junto con los cebadores de hGH. En estos experimentos, el ADN de los animales positivos para el transgén generarán dos bandas, una banda 368 pares de bases correspondiente al fragmento 3' UTR de hGH y una banda de tamaño variable correspondiente a la inserción del ADNc.

Una vez se confirma que los animales son transgénicos (TG), se vuelven a cruzar en una cepa consanguínea colocando una hembra TG con un macho natural o un macho TG con una o dos hembras naturales. A medida que los cachorros nacen y son destetados, se separan los sexos, y sus colas se recortan para genotipado.

Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo, se realiza una hepatectomia parcial. Se lleva a cabo una preparación quirúrgica del abdomen superior directamente a continuación de la apófisis xifoides. Utilizando la técnica estéril, se practica una pequeña incisión de 1,5 a 2 cm bajo el esternón y se extrae el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Utilizando seda 4-0, se hace una atadura alrededor del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad corporal. Una pinza no traumática se utiliza para mantener la atadura mientras se coloca próximo a la primera atadura un segundo lazo de Dexson absorbible (American Cyanamid, Wayne, N.J.). Se realiza un corte distal en la atadura Dexson, y se colocan aproximadamente 100 mg del tejido de hígado extirpado en una placa petri esterilizada. La sección de hígado extirpado se transfiere a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml, congelado al instante en nitrógeno líquido y almacenado en nieve carbónica. La zona quirúrgica se cierra con sutura y puntos para heridas y la jaula del animal se coloca en una almohadilla de calentamiento a 37ºC durante 24 horas después de la operación. Se comprueba al animal a diario después de la operación y se extraen los puntos para heridas 7 a 10 días después de la intervención quirúrgica.

El análisis del nivel de expresión del ARNm de cada transgén se realiza utilizando un análisis de hibridación con solución de ARN o PCR en tiempo real en el equipo de PCR disponible en el mercado (ABI Prism^{TM} 7700; PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se preparó un vector de adenovirus utilizando un gen potenciador de albúmina específico para el hígado y un activador basal (denominado "activador AEO"). Se construyó el montaje del activador de albúmina (denominado pAEO) insertando un fragmento Not1/EcoRV de 2,2 kb procedente pALBdelta2L (Pinkert et al., Genes Dev. 1:268-276, 1987) y un segmento NruI/Not1 de ADN de 850 pb que comprende el intrón de insulina II de rata, como polienlazador de FseI/PmeI/AscI, y la secuencia poliA de la hormona de crecimiento humano en un vector fagómido disponible en el mercado (pBluescript®KS(+); Stratagene, La Jolla, CA). Para la microinyección, se digiere el plásmido con Not1 para la liberar la casete de expresión.

Se construyó un vector de adenovirus adicional utilizando un activador del gen de queratina especifico para células epiteliales (K14) (Vassar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1563-1567, 1989). El marco de lectura abierto de 1038 pb que codifica zvegf3 humano completo fue ampliado por PCR con el fin de introducir un cordón de iniciación optimizado y las secuencias flanqueantes 5' PmeI y 3' AscI utilizando los elevadores ZC20.180 (SEC ID nº: 17) y ZC20.181 (SEQ. ID. nº: 18). El fragmento resultante PmeI/AscI se subclonó en el polienlazador de pKF0114, vector transgénico limitado de queratinocitos vasales que comprende el activador de queratina 14 (K14) humano (un fragmento de aproximadamente 2,3 Kb del ADN genómico humano [adquirido en Clontech Laboratories, Inc.] basado en la secuencia de Staggers et al., "Sequence of the promoter for the epidermal Keratin gene, K14", nº de registro en el GenBank U11076, 1994), seguido de un intrón heterólogo (un fragmento BstXII PstI de 294 pb procedente de pIRES1hyg (Clontech Laboratories, Inc; véase, Huang y Gorman, Nucleic Acids Res. 18:937-947, 1990), un polienlazador PmeIIAscI y la señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento humana (un fragmento SmalI/EcoRI de 627 pb; véase, Seeburg, DNA 1:239-249, 1982). La inserción del transgén se separó del eje central del plásmido por digestión con NotI y la purificación en gel de agarosa, y se fecundo el ovulo de los emparejamientos de los ratones B6C3F1Tac o los ratones FVB/NTac: endogámicos se microinyectaron y se implantaron en hembras esencialmente pseudopreñadas tal como describe Malik et al., Molec. Cell. Biol. 15:2349-2358, 1995). Se identificaron fundadores transgénicos por PCR en el ADN genómico de la cola utilizando cebadores específicos para la señal poli A de la hormona de crecimiento humano (ZC 17.252, SEC. ID. nº: 14; y ZC17.251, SEC. ID. nº: 13) para ampliar un producto de diagnostico de 368 pb. Se iniciaron estirpes transgénicas cruzando fundadores con ratones C57Bl/6Tac o FVB/NTac.

Se generaron ratones transgénicos esencialmente tal como se dio a conocer anteriormente utilizando los activadores MT-1, K14 y AEO. Se generaron cuatro ratones transgénicos MT-1/zvegf3. En un animal (hembra) se produjeron aproximadamente 800 moléculas de ARNm con zvegf3/célula en el hígado tras la inducción con cinc. Este animal presentaba dilatación del hígado y del bazo. Se observó también proliferación de células sinusoidales hepáticas y de hematopoyesis extramedular. Un ratón transgénico K-14/zvegf3 (hembra) presentaba un nivel bajo de expresión con bajo peso corporal, bajo hematocrito y bajo recuento de plaquetas. Un ratón transgénico AEO/zvegf3 (macho) con un bajo nivel de expresión presentaba proliferación celular sinusoidal en el hígado.

Se realizó un análisis histológico en hígados de ratones transgénicos N1 que sobreexpresan zvegf3 completo del activador AEO y las referencias de la camada no transgénicas a las 8, 16, 22 y 33 semanas de vida. Se observaron cambios similares en animales machos y hembras. Cepas H&E y tricrómicas indicaban un aumento definido del número de células sinusoidales (estrelladas) en el hígado y deposición de la matriz extracelular perisinusoidal (FM) a las 8 semanas de vida. Había un aumento persistente en el número de células estrelladas y en la cantidad y espesor de FM perisinusoidal así como alguna deposición de FM perivenular durante 16 semanas. A las 22 semanas se observaron cambios similares, pero con un aumento en la frecuencia y en la gravedad de la fibrosis perivenular (esteatofibrosis). Se observaron cambios similares a los de las semanas 16 y 22 en la semana 33, sin embargo algunos animales presentaban áreas fibrósas, de bandeo y múltiples, encapsuladas, en las que los hepatocitos parecían dilatados y vacuolados. Estas áreas tendían a estar rodeadas por una capsula de tejido fibroso y los hepatocitos dentro de estas áreas aparecían normales. Estas alteraciones eran coherentes con la cirrosis precoz.

Se observaron cambios similares en ratones N2 de 8 semanas y en machos reproductores sacrificados aproximadamente en un periodo comprendido entre las 32 y las 34 semanas.

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Ejemplo 5

Se sacrificaron cinco ratones transgénicos AEO (generación N7) con zvegf3 humano, se les practicó la necropsia, y se recogieron los tejidos en formalina tamponada al 10%. Muestras adicionales de hígado en fijadores de Carnoy y de zinc tris para inmunohistoquímica. A continuación, se presentan informes individuales del animal para cada uno de los cinco ratones.

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Animal nº 30054 (macho, 53 semanas de vida)

En la necropsia, el hígado apareció difusivamente grande e hinchado con bordes redondeados, y el lóbulo lateral izquierdo tenía un aspecto nodular distinto. Al microscopio, los descubrimientos principales fueron en el hígado e incluían proliferación celular sinusoidal, hiperplasia nodular y adenoma hepatocelular. Además, se vacuolaron los hepatocitos, especialmente alrededor de la vena central, y existían algunos infiltrados celulares mononucleares leves o ligeramente focales e hiperplasia del conducto biliar. Se observaron también infiltrados celulares mononucleares ligeros a moderados en los pulmones, riñones, páncreas y glándulas salivales. Se observó hiperplasia linforreticular en el timo, bazo y medula ósea, siendo esta última de aspecto nodular.

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Animal nº 30237 (macho, 52 semanas de vida)

En la necropsia, los lóbulos mayores del hígado contenían quistes grandes y múltiples nódulos. Además, se observó que el bazo presentaba de 2 a 3 veces su tamaño normal. Al microscopio, el hígado fue el órgano examinado más gravemente afectado, los descubrimientos incluían proliferación celular sinusoidal moderada, hiperplasia nodular/hepatocelular y dilatación vascular grave (difusa). Una sección presentaba un área de trombosis y de necrosis cuaguladora, esta última indicadora de infarto posiblemente causado por la trombosis. El bazo presentaba hiperplasia linforreticular moderada, lo que se correlaciona con la observación grosera de haberse dilatado.

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Animal nº 30031 (hembra, 53 semanas de vida)

Las primeras observaciones en la necropsia ya incluían un hígado dilatado con bordes redondeados que contenía múltiples nódulos por todas partes. Los lóbulos laterales derecho e izquierdo destacaban especialmente y los bazos sanguíneos en el lóbulo lateral derecho destacaban. El lóbulo medio pequeño era de color marrón y el bazo apareció ligeramente dilatado. Al microscopio, una sección del hígado contenía un área de adenoma hepatocelular, y existían múltiples áreas con hiperplasia hepatocelular nodular. El hígado también presentaba proliferación celular sinusoidal moderada, dilatación sinusoidal y dilatación vascular focal. Los descubrimientos en otros tejidos incluían hiperplasia de endometrio quística del útero; infiltrado celular mononuclear en el pulmón (peribronquial), riñones, páncreas y glándulas salivales; hiperplasia linforreticular en el timo, bazo y ganglios linfáticos. Los riñones presentaban una glomerulopatía leve que se caracterizaba como aumento de material hialino en el conducto glomerular y/o aumento del mesangio. Existían también áreas focales de regeneración tubular y túbulos dilatados con material acuoso con proteínas.

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Animal nº 30032 (hembra, 53 semanas de vida)

En la necropsia, el hígado aparecía pálido y contenía múltiples nódulos por todas partes. Al microscopio, el hígado presentaba múltiples áreas de tamaño variable de hiperplasia nodular (hepatocelular) que se correlacionan con la observación a simple vista. El hígado también presentaba proliferación celular sinusoidal moderada e infiltrado mononuclear, y dilatación sinusoidal y vacuolar leve o ligera, algunas con pruebas de fibrosis perivenular. Los riñones presentaban una glomerulopatía moderada que se caracterizaba por el aumento de material hialino en el conducto glomelular y/o mesangio aumentado. Existían también aéreas focales de regeneración tubular y túbulos dilatados con material proteínico. Los descubrimientos en otros tejidos incluían la hiperplasia quística en el endometrio del útero; infiltrado celular mononuclear en el pulmón (peribronquial), riñones, páncreas y glándulas salivales; e hiperplasia linforreticular en el bazo y ganglios linfáticos.

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Animal nº 30033 (hembra, 53 semanas de vida)

En la necropsia se observó que el hígado estaba dilatado con vasos sanguíneos destacados, múltiples nódulos de tamaño variable y formación de quiste focal. El lóbulo lateral derecho presentaba una masa papilar acoplada a su superficie por un tallo estrecho y se observaba que el lóbulo caudal estaba hinchado y de color oscuro. Al microscopio, el hígado tenía múltiples áreas de hiperplasia nodular (hepatocelular) y proliferación moderada de células sinusoidales con un área focal de fibrosis perivenular. Otros descubrimientos en este animal incluían infiltrado celular mononuclear en el hígado, pulmones (peribronquial), riñones, páncreas y glándulas salivales e hiperplasia linforreticular en el timo, bazo y ganglios linfáticos. Los riñones presentaban glomerulopatía leve o ligera similar a la descrita anteriormente pero carecía de algunos alteraciones tubulares obvias.

En resumen, los cinco animales presentaban alteraciones similares en los tejidos examinados al microscopio. Los descubrimientos más destacados fueron el hígado, que eran fenotípicos de este montaje. Existía un aumento moderado en el número o hiperplasia de células sinusoidales, que, aunque no identificadas positivamente, se cree que eran células estrelladas hepáticas (HSC). La inmunohistoquímica y cepas especiales pusieron de manifiesto que, aunque estas células no presentan ninguna prueba de actina alfa del musculo liso (indicador de activación de HSC), había un aumento significativo en la cantidad de colágeno intrasinusoidal, esto último observado por tinción con rojo Sirius. Existían algunas pruebas de fibrosis perivenular en una pareja de animales. Puede haberse iniciado el aumento de deposición de colágeno y/o contribuir a la hiperplasia hepatocelular y a la formación de nódulos, lo que a su vez dio como resultado la formación del tumor representada por los adenomas hepatocelulares observados en algunos hígados. Todos los descubrimientos en los tejidos restantes examinados de estos animales, tal como los infiltrados celulares mononucleares en varios órganos, la hiperplasia linforreticular en los tejidos linfoides y las alteraciones renales, eran reflejo de la disminución general de la salud de cada animal y no se cree que este directamente relacionados con el transgén. Algunos descubrimientos son frecuentes en la mayoría de las cepas de ratón a esta edad.

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Ejemplo 6

Dos ratones macho transgénicos, generación N4, se sacrificaron a las 52 semanas de vida y se les practicó la necropsia, y se realizó un examen fisiológico. Al microscopio, el hígado fue el órgano diana primario, con multitud de alteraciones que incluían la telangiectasia, dilatación vascular, proliferación celular sinusoidal, hiperplasia, hepatocítica nodular y fibrosis sinusoidal. Al menos en uno de cada dos animales, el hígado presentaba también áreas de hemorragia, infarto, hiperplasia del conducto biliar, formación de quistes e infiltrados celulares linfoides. Las observaciones al microscopio en los tejidos restantes examinados se consideraron descubrimientos fortuitos corrientes en ratones de un año de vida.

La fibrosis hepática progresiva en estos dos animales dio como resultado la destrucción de la arquitectura del sistema vascular produciendo hipertensión grave demostrada por los bazos dilatados y la telangiectasia en los sinusoides. Debido a la extensa pérdida del parénquima hepático normal en las áreas de telangiectasia, la gravedad de la proliferación celular sinusoidal fue difícil de evaluar, aunque existían áreas con obvio número creciente de estas células en ausencia de pérdida de hepatocitos.

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Ejemplo 7

Un solo ratón macho transgénico AEO/zvegf3, generación N4, se sacrificó a las 57 semanas de vida y se le practicó la necropsia y se realizó una observación fisiológica de rutina. En la necropsia, se observó que el hígado era deforme, oscuro y nodular. Al microscopio, el hígado presentaba áreas de hiperplasia celular perisinusoidal (estrellada) difusa y moderada así como dilatación sinusoidal moderada, alteración mixomatosa, fibrosis perivascular e hiperplasia hepatocelular nodular. Asimismo, estaban presentes en una o más de las secciones un quiste, un adenoma hepatocelular y un área focal de necrosis. Este último descubrimiento se cree que representa un área de infarto que estaba posiblemente asociada a la fibrosis y áreas de alteración mixomatosa. Todas estas alteraciones se consideraron típicas de la fibrosis hepática progresiva y crónica y eran similares a las observadas en otros ratones transgénicos de este montaje y edad. Todas las observaciones microscópicas restantes en este animal se consideraron descubrimientos fortuitos y no relacionados con el transgén.

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Ejemplo 8

Se sacrificaron cuatro ratones transgénicos (N4) AEO/zvegf3 a aproximadamente las 62 semanas de vida y se les practicó la necropsia, se recogieron los tejidos y se conservaron en PNF (formalina neutra tamponada) al 10%. En la necropsia, se observó que el hígado de cada uno de estos ratones estaba dilatado y con aspecto fibroso. Todos los tejidos se cortaron y se procesaron, se prepararon secciones y las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina para un examen microscópico de rutina. Además, se tiñeron secciones de hígado con tricromo de Masson y Rojo Sirius, y se realizó la inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la actina \alpha del musculo liso, desmina y colágeno de
tipo I.

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Animal nº 24811-macho

Los descubrimientos microscópicos más destacados fueron en el hígado, siendo primero la hiperplasia/proliferación celular sinusoidal difusa grave con áreas multifocales de acumulación en la matriz pseudomixomatosa, esta última caracterizada como acumulación de material ácido de tipo mucopolisacárido rodeando las células con forma de husillo que eran de aspecto similar a las células sinusoidales (posiblemente estrelladas) proliferantes adyacentes. Hubo una aparente dilatación de los vasos sanguíneos, especialmente las venas centrales, así como las aéreas multifocales de dilatación sinusoidal y telangectasia. Las últimas alteraciones estaban, con frecuencia, acompañadas por un aumento de las cifras del número de células pseudoendoteliales hinchadas, que recubren las paredes de estas áreas dilatadas. Algunas áreas en las secciones tenían un aumento obvio de fibrosis e indicio de formación de nódulo hepático, este último observado más fácilmente con las secciones teñidas con tricromo y rojo sirio. La inmunohistoquímica (IHC) demostró un aumento de la tinción con actina alfa de los músculos lisos (actina SM), asociado principalmente a las áreas de dilatación sinusoidal y a la proliferación de células pseudoendoteliales, y fue muy indicadora de posible angiogénesis. Existía también un aumento correlacionado en la tinción para desmina. La tinción con colágeno de tipo I, estaba correlacionada íntimamente con la fibrosis; el colágeno era el más abundante en la fibrosis asociada a la posible formación del nódulo hepático. En otros tejidos, los descubrimientos destacados incluían la hiperplasia linfoide perivascular en el pulmón, un quiste cortical en un riñón, infiltrado linfoide multifocal y glomerulopatía difusa en ambos riñones. La glomerulopatía estaba caracterizada por un aumento en el tamaño global de los glomérulos así como por un aumento de celularidad. Algunos de los glomérulos, afectados contenían gotitas eosinófilas de tamaño variable que se creía que representan proteínas. (Estos descubrimientos en el pulmón y en el riñón no son infrecuentes en ratones viejos y posiblemente puede que sean consecuencia de la patología del hígado). Los ganglios linfáticos mesentéricos se sustituyeron completamente por un neoplasma que estaba compuesto de células con forma de husillo impregnadas en una matriz con aspecto fibroso. Este tumor se diagnosticó como sarcoma de células de husillo y se consideró un descubrimiento accidental y no relacionado con el transgén. Todas las alteraciones microscópicas observadas en los tejidos restantes se consideraron también descubrimientos fortuitos.

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Animal nº 24957-macho

Los descubrimientos microscópicos en este animal fueron similares a los observados en el animal nº 24811 y de nuevo, los descubrimientos más destacados fueron en el hígado. Sin embargo, la diferencia principal fue la presencia de neoplasmas algo mayores en dos o más lóbulos del hígado que estaban caracterizados por estar compuestos por numerosas células pseudoendoteliales gruesas que estaban recubiertas o tendían a apilarse en sinusoides dilatados y áreas destacadas de telangiectacia. Este tumor fue diagnosticado como hemangioendotioloma. Existían también áreas focales de necrosis, posiblemente infarto, asociadas al neoplasma. Excepto en ausencia de áreas mixomatosas, el hígado restante presentaba alteraciones similares a las descritas anteriormente, es decir, hiperplasia celular sinusoidal, hiperplasia hepatocelular nodular, infiltrado linfoide, dilatación vascular y fibrosis. En las secciones teñidas con IHC, la actina SM y la desmina eran las más destacadas en el neoplasma y posiblemente eran reflejo de angiogénesis. El colágeno de tipo I no se destacó en el tumor sino que se destacó más en las áreas de fibrosis y de hiperplasia nodular. Otras alteraciones destacadas en el riñón y pulmón fueron similares tanto en la distribución como en la gravedad de los descritos anteriormente para el animal nº 24811. Todas las alteraciones microscópicas observadas en los tejidos restantes se consideraron también descubrimientos fortuitos y no relacionados con el trasgén.

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Animal nº 26015-macho

Los descubrimientos microscópicos en el hígado de este animal fueron muy similares a los observados en los animales nº 24811 y nº 24957 a excepción de una gran masa en un lóbulo. Este neoplasma se caracterizó como una masa finamente encapsulada compuesta de cordones de grandes hepatocitos vacuolados separados por sinusoides dilatados con aéreas focales de micosis debidas al infarto. Este neoplasma era característico de un adenoma hepatocelular. Existían cantidades mínimas de actina SM, desmina y colágenos de tipo I en el tumor, pero aumento de las cantidades de tres de estos estaban presentes en las demás secciones del hígado, este último fue el más destacado en las áreas con aumento de hiperplasia celular sinusoidal y fibrosis. Las alteraciones microscópicas en el riñón y en los pulmones fueron también similares a las observadas en los dos animales anteriores. Todas las demás alteraciones microscópicas observadas en los tejidos restantes se consideraron descubrimientos fortuitos y no relacionados directamente con el transgén.

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Animal nº 24819-hembra

Los descubrimientos microscópicos en los tejidos examinados procedentes de este animal fueron muy similares a los observados en los tres ratones machos descritos anteriormente. El hígado presentaba hiperplasia sinusoidal difusa grave, fibrosis e hiperplasia hepatocelular nodular así como una dilatación vascular sinusoidal, hiperplasia del conducto biliar y áreas focales de acumulación de la matriz pseudomixomatosa. Se produjo un aumento en la cantidad de fibrosis en todas las secciones de hígado examinadas, que era más destacada en torno a las aéreas de formación del nódulo hepatocítico. El aumento de la tinción para la desmina y el colágeno de tipo I fue también destacado en estas áreas y estaba íntimamente asociado a la fibrosis. Había algunas áreas focales de aumento de la tinción para actina SM, pero estas estaban asociadas principalmente a las áreas de dilatación sinusoidal y de telangiectasia, y posiblemente representaban angiogénisis. Las alteraciones microscópicas observadas en el riñón y pulmón eran también similares a las descritas anteriormente. Sin embargo, el pulmón en este animal también presentaba una pleuritis crónica moderada caracterizada principalmente como fibrosis de la pleura. Esta última observación así como las alteraciones observadas en los tejidos restantes examinados se consideraron descubrimientos fortuitos y no relacionados con el transgén.

Las alteraciones microscópicas observadas en los hígados de estos cuatro ratones transgénicos pueden representar la etapa final de una fibrosis crónica progresiva. El nódulo hepatocítico y la formación del tumor son similares a las que se atribuye a la fibrosis hepática y a la cirrosis en el hombre. Además, es evidente el impacto de la fibrosis resultante y de la acumulación celular sinusoidal en el sistema vascular a partir de la dilatación vascular sinusoidal así como el desarrollo de neoplasmas vasculares y de alteraciones preneoplásicas asociadas. Significativamente, los resultados de la tinción con IHC para una actina \alpha del musculo liso, que parecían estar asociados principalmente a alteraciones angiógenas y no a las células sinusoidales o a las áreas fibrosas, sugeriría que las células implicadas en la matriz y la producción de colágeno pueden haberse diferenciado en células más especializadas que han perdido su actina y por consiguiente ya no pueden denominarse miofibrobastos.

Como se da a conocer en los ejemplos 5 a 8, doce ratones transgénicos con zvegf3 humana AEO entre 52 y 62 semanas de vida se sacrificaron y se practicó la necropsia. En la necropsia, se recogieron los tejidos seleccionados y se procesaron para evaluación microscópica dando especial atención a la patología del hígado. En la necropsia se observó que el hígado de cada uno de estos animales estaba dilatado de forma variable, hinchado, deforme, anormalmente oscuro o de color claro, fibroso, nodular y/o que contenía quistes. Al microscopio, los variables pero consistentes descubrimientos destacados en el hígado eran fenotípicos de este montaje transgénico. Aunque no están presentes en todos los animales, se observaron uno o más de las siguientes alteraciones hepáticas: aumento del número de hiperplasia de células perisinusoidales (estrelladas), dilatación sinusoidal y vascular, telangiectasia, formación de quistes, fibrosis perivenular e intrasinusoidal, hiperplasia hepatocelular nodular y adenoma hepatocelular. Ocasionalmente asociada a la fibrosis y a las células perisinusoidales proliferantes existía una alteración mixomatosa caracterizada por la presencia de células en forma de husillo impregnadas en una matriz mucilaginosa. Un animal presentaba un tumor hepático compuesto de gruesas células pseudoendoteliales asociadas a áreas de dilatación vascular y sinusoidal. Este tumor se caracterizó como hemangioendotelioma y su formación estaba posiblemente relacionada con la fibrosis y las alteraciones vasculares asociadas. Algunas de las áreas de hiperplasia nodular y de formación de adenoma presentaban frecuentemente áreas de necrosis que se atribuyeron al infarto.

Las alteraciones macroscópicas y las macroscópicas correspondientes observadas en los hígados de estos ratones transgénicos más viejos eran típicas en la etapa final de una fibrosis progresiva y crónica. El aumento progresivo en la deposición de colágeno y la fibrosis posterior observada es similar a la fibrosis hepática y a la cirrosis en el hombre, y se cree normalmente que contribuye a la hiperplasia hepatocelular nodular y a la formación de tumor, incluyendo una evolución de hiperplasia a adenoma a carcinoma.

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Ejemplo 9

Para la construcción de vectores adenovíricos, la zona codificadora de la proteína de zvegf3 humano se amplió por PCR utilizando cebadores que añadían secuencias de restricción Pmel y AscI en los terminales 5' y 3' respectivamente, se utilizaron cebadores ZC20.180 (SEC. ID. nº: 17) y ZC20.181 (SEC. ID. nº: 18) de PCR con una plantilla de ADNc completa con zvegf3 en una reacción de PCR de la manera siguiente: incubación a 72ºC durante 7 min.; seguido de remojado a 4ºC. El producto de reacción se cargó en un gel de agarosa al 1,2% de temperatura de fusión baja en tampón TAE (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001 M). El producto zvegf3 de la PCR se extrajó del gel y se purificó utilizando un kit disponible en el mercado que comprende una columna rotativa con membrana de gel de sílice (kit de purificación por PCR QIAquick^{TM} y kit para limpieza con gel; Qiagen, Inc.) como para instrucciones del kit. El producto zvegf3 se digirió a continuación con PmeI y AscI, se extrajo con fenol/cloroformo, se precipitó con EtOH y rehidrató en 20 ml de TE (Tris/EDTA, pH 8). El fragmento de zvegf3 de 1038 pb se ligó a continuación en las secuencias Pmel-AscI del vector transgénico TG12-8 (conocido también como pHB12-8; véase el Ejemplo 4) y se transformó en células competitivas DH10B^{TM} E. coli por electroporación. Los clones que contienen zvegf3 se identificaron por minipreparación del ADN plásmido seguido de digestión con PmeI y AscI. Se secuenció un clon positivo para asegurar que no existían eliminaciones u otras anomalías en el montaje. Se confirmó la secuencia de ADN con zvegf3.

Se preparó ADN utilizando un kit disponible en el mercado (Maxi Kit, Qiagen, Inc.) y se liberó el ADNc con zvegf3 de 1038 pb del vector pTG12-8 utilizando las enzimas PmeI y AscI. Se aisló el ADNc en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% y se extrajo del gel. La oblea de gel se fundió a 70ºC y el ADN se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol tamponado con Tris y se precipitó con EtOH. Se volvió a poner en suspensión ADN en 10 \mul de H_{2}O.

Se clonó el ADNc con zvegf3 en las secuencias EcoRV-AscI de un cAdTrack-CMV modificado (He, T-C. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998). Este montaje contiene el gen marcador de la proteína verde fluorescente (GFP). La expresión de GFP que conduce al activador CMV se sustituyó con el activador SV40 y la señal de poliadenilación SV40 se sustituyó con la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano. Además se sustituyó el polienlazador natural con las secuencias FseI, EcoRV, y AscI. Esta forma modificada de pAdTracK-CMV se denominó pZyTrack. Se efectúo la ligadura utilizando un ligadura de ADN disponible en el mercado y el kit de identificación (Fast-Link^{TM} Kit; Epicentre Technologies, Madison, WI). Se identificaron los clones que contienen zvegf3 por digestión de ADN de minipreparación con Fsel y AscI. Con el fin de alinear el plásmido, aproximadamente 5 \mug del plásmido pZyTracK zvegf3 resultante se dirigió con Pmel. Aproximadamente 1 \mug del plásmido linealizado se cotransformó con 200 mg de pAdEasy superenrollado (He et al., Ibid) en la células BJ5183 de E. Coli (He et al., ibid). La cotransformación se realizó utilizando equipo de electroporación disponible en el mercado (Gene Pulser®; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a 2,5 kV, 200 ohmios y 25 \muFa. La mezcla de cotransformación completa se colocó en 4 placas LB que contenían 25 \mug/ml de kanamicina. Se recogieron las colonias más pequeñas y se expandieron Lb/kanamicina y se identificó el ADN adenovírico recombinante por procedimientos de minipreparación de ADN convencional. La digestión del ADN adenovírico recombinante con Fsel y AscI confirmó la presencia de la inserción zvegf3. El ADN de minipreparación de adenovirus recombinante se transformó de células competitivas DH10B^{TM} de E., Coli y se preparó ADN utilizando un kit de purificación de ADN disponible en el mercado (adquirido en Qiagen, Inc.) según las instrucciones del kit.

Aproximadamente 5 \mug de ADN de adenovirus recombinante se digirieron con la enzima Pacl (New England Biolabs) durante 3 horas a 37ºC en un volumen de reacción de 100 \mul que contenía 20 a 30 U de PacI. El ADN digerido se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Se volvió a poner en suspensión el sedimento de ADN en 10 \mul de agua destilada. Un matraz T25 de células QBI-293A (Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canadá), inoculadas el día anterior y cultivadas a 60-70% de confluencia, se transfectaron con el ADN digerido con PacI. El ADN digerido con PacI se diluyó hasta un volumen total de 50 \mul con HBS esterilizado (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM). En un tubo aparte 20 \mul de 1 mg/ml de sales N-[1-(2,3-dioleiloxi)propiI]-N,N,N-trimetiI-amonio (DOTAP) (Boehringer Mannheim. Indianapolis, IN) se diluyó hasta un volumen total 100 \mul con HBS. El ADN se añadió al DOTAP, se mezcló suavemente pipeteando arriba y abajo, y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se separó el medio de las células 293A y se lavó con 5 ml de medio alfa esencial mínimo exento de suero (MEM) que contenía piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales en MEM 0,1 mM y tampón HEPES 25 mM (reactivos adquiridos en Life Technologies, Gaithersburg. MD). Se añadieron 5 ml de MEM exento de suero y la células se mantuvieron a 37ºC. La mezcla ADN/lípido se añadió gota a gota a los matraces de las células, se mezcló suavemente y se incubó a 37ºC durante 4 horas. El medio que contiene la mezcla ADN/lípido se aspiró a continuación y se sustituyó con 5 ml de MEM completo que contenía suero bobino fetal al 5%. En las células transfectadas se controlaron la expresión de GFP y la formación de focos (placas víricas).

Siete días después de la transfección de las células 293 A con el ADN adenovírico recombinante las expresaron a GFP y comenzaron a formar focos. Se recogió el lisado vírico en bruto utilizando un rascador de células para recoger todas las células 293 A. Se transfirió el lisado a un tubo cónico de 50 ml. Para liberar la mayor parte de las partículas de virus de las células, se efectuaron tres ciclos de congelación/descongelación en un baño con hielo/etanol y un baño de agua a 37ºC.

El lisado en bruto se amplió (ampliación primaria (1ª)) para obtener una solución madre de trabajo del lisado de rAdV con zvegf3. Diez placas de 10 cm de células 293A (80-90%) casi confluentes se crearon 20 horas antes, a continuación se añadieron 200 \mul de lisado rAdV en bruto a cada placa 10 cm, y las placas se controlaron durante 48 a 72 horas buscando el efecto citopático (CPE) bajo el microscopio de luz blanca y la expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente. Cuando todas las células mostraban el CPE se recogió este primer lisado de solución madre y se realizaron ciclos de congelación/descongelación tal como se describió anteriormente.

La segunda (2ª) ampliación de rAdV con zvegf3 se obtuvo de la manera siguiente: Se prepararon veinte placas de cultivo de tejido de 15 cm de células 293 A de modo que las células eran 80 y 90% confluentes. Todo el medio MEM al 5% menos 20 ml se retiró y cada placa se inoculó con 300 a 500 \mul del primer lisado d rAdV ampliado. Después de 48 horas se lisaron las células de la producción de virus, se recogió el lisado en botellas de centrifuga de polipropileno de 250 ml y se purificó el rAdV.

Se añadió detergente NP-40 a una concentración final de 0,5% de las botellas de lisado en bruto con objeto de lisar todas le células. Se colocaron las botellas en una plataforma rotativa durante 10 minutos agitando tan rápido como era posible sin que cayeran las botellas. El residuo se sedimentó por centrifugación a 20.000 X G durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a botellas de centrifugadora de policarbonato de 250 ml y se añadió un volumen de 0,5 de solución PEG8000 al 20%/NaCl 2,5 M. Se agitaron las botellas durante la noche en hielo. Se centrifugaron las botellas a 20.000 X G durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante en una solución de blanqueador. Utilizando un rascador de células esterilizado, el precipitado blanco de virus/PEG de dos botellas se volvió a poner en suspensión en 2,5 ml de PBS. La solución de virus resultante se colocó en tubos de microcentrifuga de 2 ml y se centrifugó a 14.000 X G en la microcentrifugadora durante 10 minutos para separar cualquier residuo adicional de células. El sobrenadante de los tubos de microcentrifugadora de 2 ml se transfirió a un tubo de cierre a presión de polipropileno de 15 ml y se ajustó a una densidad de 1,34 g/ml con CsCl. Se estimó el volumen de solución de virus y se añadieron 0,55 g/ml de CsCl. Se disolvió CsCl y 1 ml de esta solución pesaba 1,34 g. Se transfirió la solución a tubos de centrifugadora de pared gruesa de policarbonato de 3,2 ml y se centrifugó a 348.000 X G durante 3 a 4 horas a 25ºC. El virus formó una banda blanca. Utilizando puntas de pipeta de boca ancha, se recogió la banda de virus.

El virus recuperado del gradiente tenía una gran cantidad de CsCl, que tenía que eliminarse antes de utilizar el virus en las células. Se utilizaron columnas de intercambio iónico disponibles en el mercado (columnas PD-10 rellenas previamente con Sephadex® G-25M; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) para desalar la preparación del virus. Se equilibró la columna con 20 ml de PBS. Se cargó el virus y se dejó desarrollar en la columna. Se añadieron 5 ml de PBS a la columna, y se recogieron fracciones de 10 a 8 gotas. La densidad óptica de una dilución 1:50 de cada fracción se determinó a 260 nm en un espectrofotómetro. Un pico de absorbancia transparente estaba presente entre las fracciones 7-12. Se agruparon las fracciones del pico, y se determinó la densidad óptica (D.O) de una dilución 1:25. La D.O. se convirtió a la concentración de virus utilizando la formula: (OD a 260 nm)(25)(1,1x10^{12})= viriones/ml. La D.O. de una dilución 1:25 del rADV con zvegf3 fue 0,145 dando una concentración de virus de 4x10^{12} viriones/ml.

Para almacenar el virus, se añadió glicerol más virus purificado hasta una concentración final de 15%, se mezcló suavemente pero con eficacia y se almacenó en alícuotas a -80ºC.

Se siguió un protocolo desarrollado por Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal. Canadá) para medir la capacidad de infección del virus recombinante. En resumen, se sembraron dos placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 1x10^{4} células 293A por pocillo en MEM que contenía suero bovino fetal al 2% para cada virus recombinante que ha de ensayarse. Tras 24 horas se realizaron diluciones de 10 veces de cada virus desde 1x10^{-2} hasta1x10^{-14} en MEM que contenía suero bovino fetal al 2%. Se colocaron 100 \mul de cada dilución en cada uno de los 20 pocillos. Después de 5 días a 37ºC, se leyó el CPE positivo o negativo en los pocillos y se calculó un valor para las unidades formadoras de placa (pfu)/ml.

La formulación de TCID_{50} utilizada fue como para Quantum Biotechnologies, Inc., anteriormente. Se determino el valor (T) de una placa en la que el virus se diluyó desde 10^{-2} a 10^{-14}, y se leyó 5 días después de la infección. Se determinó a cada dilución una relación (R) de pocillos positivos al CPE para el número total de pocillos. Para calcular el valor de la muestra de virus no diluida: el factor, F' = 1+d(S-0,5); en la que "S" es la suma de las relaciones (R); y "d" es el log 10 de la dilución en serie, por ejemplo, "d" es igual a 1 para una dilución en serie de diez veces. El valor de la muestra no diluida es T=10^{(1+F)}=TCID_{50}/ml. Para convertir TCID_{50}/ml en pfu/ml, se sustrajeron 0,7 del exponente en el calculo del valor (T).

El adenovirus zvegf3 tenía un valor de 1,8 x 10^{10} pfu/ml.

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Ejemplo 10

Se prepararon anticuerpos anti-péptido policlonales inmunizando dos conejos blancos New Zealand hembra con los péptidos huzvegf3-1 (restos 80-104 de la SEQ I.D. nº: 2) huzvegf3-2 (restos 299-314 de la SEQ I.D. nº:2), huzvegf3-3 (restos 299-326 de la SEQ I.D. nº: 2 con un resto cys N-terminal) o huzvegf3-4 (restos 195-225 de la SEQ I.D. nº: 2 con un resto cys C-terminal). Se sintetizaron los péptidos utilizando un sintetizador de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos huzvegf3-1, huzvegf3-3 y huzvegf3-4 se conjugaron a continuación con hemocianina de lapa californiana (KLH) activada con la proteína vehículo maleimida mediante los restos de cisteína (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). El péptido huzvegf3-2 se conjugó con la proteína portadora KLH utilizando gluteraldehído. Se puso a cada conejo una inyección intraperitoneal (IP) de 200 \mug de péptido conjugado en adyuvante completo de Freund (Pierce Chemical Co.) seguido de inyecciones IP de refuerzo de 100 \mug de péptido conjugado adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. Enre siete y diez días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, se extrajo sangre a los animales y se recogió el suero. Se suministró un refuerzo a los conejos y se les extrajo sangre cada tres semanas.

Los anticuerpos específicos para péptido huzvegf3 se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo utilizando una columna de péptido 4B CNBr-Sepharose® que se preparó utilizando 10 mg de los péptidos respectivos por gramo de CNBr-Sepharose®; seguido en diálisis PBS durante la noche: los anticuerpos huzvegf3 específicos para el péptido se caracterizaron mediante una comprobación de valor de ELISA utilizando 1 \mug/ml del péptido apropiado como objetivo del anticuerpo. Los anticuerpos específicos para el péptido huzvegf3-1 tenían un limite inferior de detección (LLD) de 500 pg/ml por ELISA en anticuerpo objetivo apropiado y se reconoció la proteína recombinante completa (MBP-fusión) por ELISA. Los anticuerpos específicos para el péptido huzvegf3-2 tenían una LLD de 1 ng/ml por ELISA. Los anticuerpos específicos para el péptido huzvegf3-3 tenían una LLD de 50 pg/ml por ELISA y la proteína recombinante se reconoció por análisis de inmunotransferencia Western. Los anticuerpos específicos para el péptido huzvegf3-4 tenían una LLD de 50 pg/ml por ELISA y la proteína recombinante reconocida por análisis de inmunotransferencia Western.

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Ejemplo 11

Se extrajo antisuero policlonal, denominado "E2243" en un conejo por inmunización con el polipéptido zvegf3 humano completo fusionado a la proteína de fijación a la maltosa (MBP) de E. Coli y se purificó por afinidad utilizando la proteína de fusión. Se examinó la especificidad del antisuero en formato de inmunotrasferencia Western en el que se redujeron las muestras de varias proteínas zvegf3 y se realizó la electroforesis en un gel de poliacrilamida. Las proteínas utilizadas fueron: dominio del factor de crecimiento de zvegf3 humano recombinante, zvegf3 humana recombinante completa y zvegf3 humana recombinante completa fusionada a MBP, cada una a concentraciones 13,9, 41,7 y 125 ng/banda; y medio acondicionado de las células HaCat que expresan a zvegf3 humana completa. Las proteínas electroforizadas se transfirieron a continuación a una membrana de nitrocelulosa, se enjuagaron y se bloquearon por incubación durante la noche en tampón que contenía leche en polvo sin grasa al 2,5%. El anticuerpo primario (antisuero E2243) se diluyó a 300 ng/ml y se añadió a la inmunotransferencia de nitrocelulosa, que se incubó a continuación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La transferencia se enjuagó a continuación, se añadió anticuerpo secundario (IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante) y la transferencia se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Se enjuagó a continuación la inmunotransferencia, se desarrolló con sustratos disponibles en el mercado y se expuso a una película durante 10 segundos. La inmunotransferencia Western demostró que el antisuero E2243 reconocía todas las muestras de zvegf3 completa (fusionada y sin fusionar) y la zvegf3 en medio acondicionado, pero no reconoció ninguna de las muestras del dominio del factor de crecimiento de zvegf3.

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Ejemplo 12

Se generaron hibridomas de ratón que producen anticuerpos monoclonales (MAb) específicos para la proteína con dominio del factor de crecimiento (GFD) con zvegf3 humana recombinante utilizando GFD con zvegf3 humana recombinante, purificada y sin etiqueta producida en las células BHK (huzvegf3-GFD-BHK). Se inyectó IP a cada uno de los diez ratones BALB/c el día uno 20 \mug de huzvegf3-GFD-BHK, se mezcló 1:1 (v/v) en adyuvante completo de Freund. Se inyectó IP posteriormente a cada ratón 10 \mug de huzvegf3-GFD-BHK se mezcló 1:1 (v/v) en adyuvante incompleto de Freund los días 15, 29, 41, 57, 71, 89 y 115. El día 118, se fusionaron los esplenocitos y linfocitos de los ganglios linfáticos dilatados de dos ratones con el valor mayor del anticuerpo anti-huzvegf3 (determinado en un ELISA de captura de huzvegf3-GFD biotinilado; véase a continuación) se fusionaron en una proporción 2,76:1 con la estirpe celular de mieloma de ratón X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-1550, 1979) esencialmente como fue dado a conocer por Lane (J. Immunol. Methods 81:223-228, 1985). La mezcla de fusión se colocó en 24 placas de 96 pocillos con una densidad media de 1,2 x 10^{5} células totales/pocillo en el medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Live Technologies Inc. Gaithersburg, MD) que contenía 10% de suero fetal de clon I (HyClone Laboratories, Inc. Logan, UT), 10% de complemento de clonación de hibridoma (BM Condimed® H1; Roche Diagnostics Corp., Indianapolis IN), L-glutamina 2 mM (Life Technologies Inc.), 100 U/ml de penicilina G sódica (Life Technologies Inc.) y 100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina (Life Technologies Inc.). Se alimentaron los pocillos los días 4 y 7 por aspiración y sustitución de aproximadamente tres cuartos de los contenidos del medio en cada pocillo. Esta fusión se denominó HH1.

Se detectaron los mAb anti-huzvegf3 de clase IgG los días 9/10 después de la fusión utilizando una ELISA de captura de huzvegf3-GFD biotinilado. Se recubrieron los pocillos de las placas (Immunol® II; Dinex Technologies, Chantilly, VA) con 1 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra (adquirido en Kirkegaard & Perry Laboratories Gaithersburg, MD) en tampón de carbonato/bicarbonato 0,05 M (Sigma, St Louis, MO), 50 \mul/pocillo. Se incubaron las placas a 4ºC durante la noche, a continuación se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,05% de monolaurato de polioxietilensorbitán (Tween 20) (PBST) para eliminar el anticuerpo no ligado. Se bloquearon los pocillos con PBST que contenía albúmina de suero bovino (Sigma) al 1% (p/v) (Tampón PTB), 200 \mul/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente (T.A.), a continuación se lavaron como anteriormente. Los sobrenadantes del cultivo de las placas de fusión se colocaron en placas de réplica en placas recubiertas con anticuerpo, 100 \mul/pocillo y se incubaron a T.A.. durante 1 hora. Se biotiniló la proteína zvegf3-GFD humana con sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), según las instrucciones del fabricante durante 45 minutos a T.A. Se interrumpió la reacción con glicina 2 M. La proteína biotinilada se diluyó hasta 1 \mug/ml en tampón PTB. Se lavaron las placas cuatro veces con PBST, zvegf3-GFD biotimilada se añadió a razón de 100 \mul/pocillo y las placas se incubaron a T.A. durante 1 hora. Se lavaron las placas a continuación cuatro veces con PBST, y se diluyó estreptavidina conjugada con HRP (Pierce Chemical Company) se diluyó hasta 0,5 \mug/ml en tampón TPB y se añadió a las placas a razón de 100 \mul/pocillo. Se incubaron las placas a T.A. durante 1 hora, a continuación se lavaron cinco veces con PBST. Se diluyó 1:100 el sustrato TMB (EIA chromagen, nº de Cat. R6R; Genetic Systems Corp.) en tampón de sustrato (Genetic. Systems Corp.) y se añadieron a las placas a razón de 100 \mul/pocillo. Se incubaron las placas 10 a 15 minutos a T.A. en la oscuridad. Se interrumpió el desarrollo de color por adición de 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 N. Se leyó la densidad óptica en un lector de placas ELISA (Molecular Devices Sunnyvale, CA) a longitudes de onda de 450 mm (L1) y 650 mm (L2). Se determinó la medición final de D.O. mediante la fórmula L1-L2.

78 pocillos patrón contenían un anticuerpo que fue capaz de capturar huzvegf3-GFD biotinilado. Estos pocillos patrón se expandieron para crioconservación del híbrido y generación de sobrenadante adicional. El análisis por ELISA de los sobrenadantes del pocillo patrón expandido demostró que 27 de los 78 pocillos patrón originales conservaban el anticuerpo específico para huzvegf3-GFD, poseyendo 20 de 27 reactividad significativa con el antígeno.

Se clonaron seis de los pocillos patrón designados limitando la dilución a una densidad inferior a una célula por pocillo. Se evaluó la monoclonalidad por examen al microscopio de los pocillos para un solo foco de crecimiento celular. Se ensayó el anticuerpo específico en los clones por el mismo ensayo utilizado en la criba patrón. Cinco a seis de los clones más fuertes se expandieron brevemente. Los sobrenadantes de estos clones se diluyeron en serie a continuación y se analizaron por ELISA para identificar los tres clones que producen el mejor anticuerpo. En la verificación, el mejor clon de cada pocillo patrón se volvió a clonar posteriormente y se ensayó como se describió anteriormente.

Seis de los clones de la segunda ronda con valoración mayor se adaptaron al crecimiento en medio de fusión/clona-
ción menos la adición de suplemento de clonación de hibridoma. Cada uno de los clones se adaptó posteriormente al crecimiento en una formulación del medio de producción que consiste esencialmente en medio de Eagle modificado por Dulbecco + 2,5% de suero de clon 1 fetal y varios complementos. Se diluyeron de nuevo en serie los sobrenadantes y se analizaron por ELISA en huzvegf3-GFD para identificar los clones valorados más alto y los siguientes valorados más altos (denominados clones primarios y secundarios, respectivamente): el MAb producido por cada serie de clones se evaluó a continuación para la sub clase IgG utilizando el kit de subtipado de hibridoma de ratón (Cat. nº 1183117; Roche Diagnostics Corp.). Los clones HH1-24, -40, -57 y 76 se observó que todos producían un anticuerpo IgG_{1}. Los clones HH1-58 y -78 produjeron un anticuerpo IgG_{2b}. Todos los anticuerpos poseían una cadena ligera \kappa.

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Ejemplo 13

Se emprendió un estudio para determinar si zvegf3 administrado adenovíricamente estimulaba la proliferación celular determinada por incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) en los tejidos.

Se dividieron los ratones (macho C57B1, 7 semanas de vida) en tres grupos. El día 0 se administró por vía parental adenovirus con zvegf3 al primer (n=11) y segundo (n=12) grupos respectivamente por la vena de la cola recibiendo cada ratón una dosis de \sim1 x 10^{11} partículas en un volumen de \sim 0,1 ml. El tercer grupo (n=8) no recibió tratamiento. Se administraron a cada ratón dos dosis intraperitoneales de 3 mg de solución de BrdU preparada recientemente a aproximadamente 24 y 12 horas del sacrificio. Los días 2, 4, 6, 8 y 10, dos ratones de cada grupo de tratamiento y uno o dos ratones no tratados se sacrificaron, y se recogieron los tejidos y la sangre. Se analizaron las muestras para recuento de sangre completa (CBC) y análisis químico del suero y se prepararon obleas para análisis de sangre diferencial manual y de las células madre de la médula. Se sometieron un fémur, un pulmón, un corazón, un timo, un hígado, un riñón, un bazo, un páncreas, un duodeno, y ganglios linfáticos mesentéricos a histología convencional y evaluación por incorporación de BrdU. La íntima del duodeno sirvió como tejido de referencia para la incorporación de BrdU.

Además, dos ratones que recibieron aproximadamente la mitad de la dosis de partículas de adenovirus con zvegf3 y un ratón que recibió la dosis completa de adenovirus paterno se sacrificaron y se analizaron tal como se describió anteriormente el día 16.

Una pieza de hígado de cada ratón se rasuró para el ensayo con ARNm de la proteína de adenovirus para examinar el transcurso de tiempo de la expresión de las preparaciones de adenovirus.

Al comienzo del día 6, la mayoría de los animales tratados con adenovirus presentaban hígados y bazos visiblemente dilatados en comparación con los ratones no tratados. Los hígados de los ratones tratados con adenovirus con zvegf3 tendían a parecer más pálidos que los animales tratados con el virus paterno. Se observó proliferación de células sinusoidales en el hígado. La inspección visual sugirió que estas células eran células estrelladas y/o fibroblastos. El color del bazo fue el mismo en ambos grupos. La mayoría de los animales que recibieron el adenovirus con zvegf3 presentaba las diáfasis de fémur más pálidas, con la médula de color más claro.

Las CBC de la sangre periférica presentaban una diferencia posible en los recuentos de plaquetas, pero no en los recuentos de RBC o WBC entre los animales tratados con virus zvegf3 y paterno. En comparación con los grupos sin tratar y tratados con virus paterno, en grupo con zvegf3 presentaba recuentos de plaquetas menores los días 2,4, 6 y 8 pero no el día 10. El volumen de plaquetas medio (tamaño medio de las plaquetas individuales) en el grupo con zvegf3 tendía también a ser mayor, coherente con el aumento relativo en la población mayor de plaquetas inmaduras.

El marcado con BrdU presentaba un aumento de la proliferación celular en el riñón, principalmente en la médula y en una medida inferior en la corteza celebrar. Las células proliferantes parecían ser células intersticiales, que pueden haber incluido fibroblastos y/o células del mesangio.

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Ejemplo 14

En la proteína con dominio del factor de crecimiento con zvegf3 humano producidas en células BHK se determinó la capacidad para estimular la producción de TGF-\beta en células estrelladas. Se colocaron en grupos de cultivo tisular en placas de 48 pocillos células estrelladas hepáticas de rata (conseguidas del Dr. Nelson Fausto, Universidad de Washington) (Costar®: Corning: Corning. NY) en medio de crecimiento DMEM (Life Technologies, Inc.) enriquecido con piruvato y suero al 10% (HyClone Laboratories, Inc.). En la confluencia, el medio se cambió por medio exento de suero sustituyendo BSA al 0,1% (Fracción V; Sigma. St. Louis, MO) por suero. 48 horas después, se cambió el medio, se sustituyó por el mismo medio exento de suero, y se añadió la proteína GFD con zvegf3 a 100 ng/ml en los pocillos. 48 horas después, se recogió el medio acondicionado y se centrifugó para deshacerse de las células exentas de células flotantes o de los desechos. Las concentraciones de TGF- \beta1 se determinaron en estos medios utilizando el kit ELISA disponible en el mercado (R&D Systems, St. Paul, MN). La estimulación de las células estrelladas con 100 ng/ml de GFD con zvegf3 produjo un aumento de 5 veces aproximadamente en la producción de TGF-\beta en comparación con una referencia de BSA.

<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DEL CARCINOMA HEPATOCELULAR

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<130> 03-14PC

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<150> 60/490,047

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<151> 2003-07-25

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<160> 18

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<170> FastSEQ for Windows Version 3.0

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<210> 1

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<211> 1760

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (154)...(1191)

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<400> 1

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3

4

5

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<210> 2

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<211> 345

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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6

\newpage

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<210> 3

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<211> 3571

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1049)...(2086)

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<400> 3

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8

9

10

11

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<210> 4

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<211> 345

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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12

13

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<210> 5

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<211> 370

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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14

15

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<210> 6

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleótido

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<400> 6

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agcaggtcca gtggcaaagc

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleótido

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<400> 7

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cgtttgatga aagatttggg c

\hfill

21

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<210> 8

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleótido

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<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggtctat ataagcagag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagccctcg ccccagtcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatacaggaaagccttgcc caaaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaactaccct gcgattctct gctgc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaaatgga gcttggctga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctggacgtc ctcctgctgg tatag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtatggagc caggggcaag ttggg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtggcaac ttccagggcc aggagag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttttgctag cctcaaccct gactatc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido ZC20,180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgcggttt aaacgccacc atgagcctct tcggg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleótido ZC20,181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtatcggcg cgccctatcc tcctgtgctc cc

\hfill

32

Claims (6)

1. Utilización de un antagonista de zvegf3 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de carcinoma hepatocelular en un mamífero, por ejemplo, en la que debe medirse la respuesta tumoral como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en la duración de la progresión, y en la que el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3 que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, estando constituida cada una de dichas cadenas polipeptídicas por una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por:

restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y

restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Utilización de un antagonista de zvegf3 en la preparación de un medicamento destinado a reducir la proliferación de células cancerosas en un mamífero con carcinoma hepatocelular, en la que el antagonista es un anticuerpo anti-zvegf3 que se une específicamente a una proteína dimérica que tiene dos cadenas polipeptídicas, en la que cada una de dichas cadenas polipeptídicas comprende una secuencia de restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por:

restos 230 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 231 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 232 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 233 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 234 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 235 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 236 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 237 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 238 a 345 de la SEC. ID. nº: 2;

restos 239 a 345 de la SEC. ID. nº: 2; y

restos 240 a 345 de la SEC. ID. nº: 2.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el anticuerpo anti-zvegf3 es un anticuerpo monoclonal.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgG.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el medicamento está destinado a la administración del antagonista de zvegf3 por infusión intravenosa.

6. Antagonista de zvegf3 según la reivindicación 1, destinado a su utilización en el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un mamífero o en la reducción de la proliferación de células cancerosas en un mamífero con carcinoma hepatocelular, opcionalmente en el que el anticuerpo se define con más detalle por las características según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.