ES2325520A1

ES2325520A1 - Procedimiento y kit para el diagnostico de transtornos de la coagulacion.

Info

Publication number: ES2325520A1
Application number: ES200800680A
Authority: ES
Inventors: Felix Ruiz Rodriguez; Laura Hernandez Ruiz; Ana Saez Benito; Fco. Javier Rodriguez Martorell; Maria D. Jimenez Nuñez
Original assignee: FUNDACION PUERTA DEL MAR; Universidad de Cadiz
Current assignee: FUNDACION PUERTA DEL MAR; Universidad de Cadiz
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2008-03-04
Publication date: 2009-09-07
Anticipated expiration: 2028-03-04
Also published as: WO2009109676A1; ES2325520B2

Abstract

Procedimiento y kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación. Constituye el objeto de la invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante la determinación de las deficiencias de los gránulos densos de las plaquetas. El procedimiento permite la detección del contenido de polifosfato inorgánico en muestras biológicas, particularmente en plaquetas y establecer una correlación entre la cantidad de polifosfato inorgánico determinada en las muestras biológicas, particularmente en las plaquetas, y la tendencia a presentar una deficiencia en los gránulos densos de las plaquetas. Constituye otro objeto de la presente invención un kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante el referido procedimiento.

Description

Procedimiento y kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación.

Objeto de la invención

Constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación, mediante la determinación de las deficiencias en los gránulos densos de las plaquetas. El método: (a) permite la detección del contenido de polifosfato inorgánico en muestras biológicas, particularmente en plaquetas y (b) permite establecer una correlación entre la cantidad de polifosfato inorgánico determinada en las muestras biológicas, particularmente en las plaquetas, y la tendencia a presentar una deficiencia en los gránulos densos de las plaquetas.

Estado de la técnica

Las plaquetas son componentes de la sangre que desempeñan un papel fundamental en los procesos de hemostasis y trombosis. Las plaquetas humanas, así como las de otros mamíferos, poseen un tipo de organelos denominado "gránulos densos" o "gránulos delta". De manera similar a otros organelos secretorios de las plaquetas, como son los lisosomas y los gránulos alfa, los contenidos de gránulos densos son liberados por las plaquetas activadas donde juegan un papel esencial en la coagulación de la sangre. En este sentido, los gránulos densos acumulan moléculas que, al ser secretadas, contribuyen con la activación de plaquetas circulantes adicionales para la formación del coágulo.

En algunos individuos, los gránulos densos de las plaquetas están deficientes lo que resulta en un trastorno de coagulación denominado "enfermedad de los reservorios delta" o "delta-storage pool disease" (abreviado como dSPD). Clínicamente, la dSPD se manifiesta como una tendencia moderada a las hemorragias, aunque en algunos individuos pueden presentarse hemorragias severas. Las manifestaciones típicas incluyen epistaxis, menorragia, hemorragias post-parto y hemorragias posteriores a los procedimientos quirúrgicos (McNicol, A. y Israels, S.J. Thromb Res 1999, 95, 1-18).

La dSPD suele ser debida a un defecto congénito (dSPD congénita) y puede presentarse como una entidad separada, en la cual el defecto en las plaquetas es la única anomalía (White, J.G. Crit Rev Oncol Hematol 1986, 4, 337-77), o como una parte de algunos síndromes hereditarios complejos, como el síndrome de Hermansky-Pudlak y el síndrome de Chediak-Higashi donde se observan variadas patologías adicionales (Rendu, F. y Brohard-Bohn, B. Platelets 2001, 12, 261-73). Aunque la dSPD congénita se diagnostica con poca frecuencia, se ha propuesto que la incidencia real de la enfermedad se desconoce al no realizarse un diagnóstico en individuos con síntomas leves (Nieuwenhuis, H.K. y col. Blood 1987, 70, 620-3).

Existe una variante de dSPD, denominada "dSPD adquirida", que se presenta como consecuencia de algunas condiciones clínicas como enfermedades hepáticas y renales, leucemias mieloides, mielodisplasias o síndromes mieloproliferativos (McNicol, A. y Israels, S.J. Thromb Res 1999, 95, 1-18).

Los gránulos densos de las plaquetas son orgánulos acídicos que acumulan nucleótidos de adenina, serotonina y calcio. El análisis de los contenidos de los gránulos densos de las plaquetas, se incluye entre las pruebas que se realizan para el diagnóstico de la dSPD, y requiere el uso de técnicas como agregometría, citometría de flujo, cromatografía líquida de alta presión, microscopía electrónica y microscopía de fluorescencia (Lorez, H.P. y col. J Lab Clin Med 1977, 89, 200-6 / Lages, B. y Weiss, H.J. Br J Haematol 1988, 68, 53-62 / White, J.G. Semin Thromb Hemost 1998, 24, 163-8 / Ramstrom, AS. y col. Platelets 1999, 10, 153-8 / Maurer-Spurej, E. y col. Am J Clin Pathol 2007, 127, 626-32). La mayoría de estas técnicas requieren equipamientos costosos así como procedimientos largos y laboriosos. Por lo tanto, se hace necesario la generación de nuevos métodos para estudiar la dSPD que puedan ser usados para analizar un gran número de muestras en tiempos reducidos, que sean más económicas y que usen equipamiento común en laboratorios de biomedicina. La presente invención se dirige a estas necesidades entre otras.

Se ha encontrado recientemente que los gránulos densos de la plaquetas acumulan altos niveles de polifosfato inorgánico (polyP) (Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2004, 279, 44250-7). El polyP es un polímero de variado tamaño formado por residuos de fosfato unidos entre sí por enlaces fosfoanhidro de alta energía (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6) (Figura 1). Además de los gránulos densos de las plaquetas, el polyP se acumula en organelos similares que se encuentran en otros tipos celulares. En este sentido, estos organelos que acumulan polyP se conocen como "acidocalcisomas" y han sido descritos en bacterias (Seufferheld, M. y col. J Biol Chem 2003, 278, 29971-8), así como en varios eucariotas unicelulares, como son los parásitos tripanosomatidios y apicomplexa, el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y el "slime mold" Dictyostelium discoideum (Docampo, R. y col. Nat Rev Microbiol 2005, 3, 251-61).

En la industria el polyP ha sido ampliamente usado en variadas aplicaciones que incluyen el procesamiento de alimentos, el uso como aditivo alimentario y la reducción de la dureza del agua, entre otros (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6). En medicina, el polyP se ha utilizado para el tratamiento de enfermedades de las encías (Yamaoka, M. y col. Gerodontology 2008, in press), para estimular la regeneración de los huesos (Hacchou, Y. y col. J Dent Res 2007, 86, 893-7) y la cicatrización de las heridas (Kim, H.R. y col. Patent WO200172313-A), así como para promover la coagulación y disminuir el sangrado (Morrissey, J.H. y col. Patent US2006198837-A1).

El polyP se ha encontrado en todos los seres vivos donde se ha estudiado (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6) y hace poco se ha relacionado con la modulación de la coagulación de la sangre y con la disolución de los coágulos sanguíneos (fibrinólisis) (Smith, S.A. y col. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 903-8). La invención que aquí se presenta, se relaciona con la correlación entre los niveles de polyP en extractos de plaquetas humanas y la presencia o ausencia de dSPD, la cual no había sido demostrada hasta el momento.

Explicación de la invención

Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) determinar en dicha muestra el contenido de un compuesto y compararlo con el contenido de dicho compuesto en muestras de control,

Específicamente, cuando el trastorno de la coagulación a diagnosticar es la enfermedad de los reservorios delta ("delta storage pool disease" en inglés), el compuesto que se determina en la muestra biológica es polifosfato inorgánico.

Para la presente invención se aportan ejemplos en los cuales la muestra biológica se toma de humanos, pero además de los humanos, otros mamíferos como por ejemplo, perros, gatos, cerdos, ganado vacuno, y ratones, son también susceptibles de desarrollar dSPD (Meyers, K.M. y col. Am J Physiol 1979, 237, R239-48 / Meyers, K.M. y col. Am J Hematol 1981, 11, 241-53 / Novak, E.K. y col. Blood 1984, 63, 536-44 / Daniels, T.M. y col. Blood 1986, 67, 1043-7 / Callan, M.B. y col. Thromb Haemost 1995, 74, 949-53). Por lo tanto, el procedimiento de la invención es también útil para estudiar la enfermedad en general en mamíferos o para validar modelos animales de dSPD.

La muestra biológica incluye sangre y específicamente plaquetas. Cuando la muestra incluye plaquetas, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) aislamiento de las plaquetas de los otros componentes de la muestra biológica y determinación del número de plaquetas aisladas

c) ataque ácido sobre las plaquetas aisladas en la etapa anterior, para solubilizar el polifosfato inorgánico

d) separación del polifosfato inorgánico del resto de componentes de las plaquetas

e) determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores.

La etapa de aislamiento de las plaquetas se lleva a cabo mediante un proceso de centrifugación simple, o bien mediante filtración en gel o bien mediante centrifugación en gradiente de densidad y la determinación del número de plaquetas se realiza mediante un analizador hematológico, o bien mediante un hemacitómetro de Neubauer y un microscopio.

La etapa de ataque ácido sobre las plaquetas se efectúa mediante resuspensión de las plaquetas, previamente lavadas con un tampón isotónico, en un ácido fuerte como ácido perclórico o ácido tricloroacético y la separación del polifosfato solubilizado se lleva a cabo mediante centrifugación. La determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores se efectúa, tras neutralización con solución alcalina, directamente mediante colorimetría o fluorimetría, preferentemente colorimetría.

Alternativamente, la determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado incluye tras la neutralización con solución alcalina:

a) un ataque enzimático para procesar el polifosfato, liberándose los productos resultantes de dicha reacción enzimática.

b) determinación cuantitativa de alguno de los productos resultantes de la reacción enzimática mediante colorimetría o por luminiscencia, preferentemente mediante colorimetría.

Constituye otro objeto de la presente invención un kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante el referido procedimiento. Dicho kit incluye:

- medios para aislar las plaquetas de la sangre y producir extractos acídicos de las mismas.

- medios para la detección y cuantificación del polifosfato.

- muestras de control de polifosfato y/o plaquetas para comparar con los valores obtenidos.

Adicionalmente, el kit puede incluir enzimas para el procesamiento específico de polifosfato en productos detectables mediante colorimetría o por luminiscencia.

En realizaciones preferentes del kit, los medios para producir extractos acídicos de las plaquetas son ácidos que se seleccionan entre ácido perclórico o ácido tricloroacético, los medios para la detección y cuantificación del polifosfato son reactivos para ensayos colorímétricos, de fluorescencia o de luminiscencia, preferentemente reactivos colorimétricos que se seleccionan entre colorantes básicos como el azul de toulidina o fluoróforos como Fura-2 o DAPI.

En el caso de kits que incluyan enzimas, éstas se seleccionan entre las exopolifosafatasas, la polifosfato kinasas, o la polifosfato glucokinasas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra un esquema de una molécula de polyP. Cada molécula de polyP contiene al menos tres residuos de fosfato. El símbolo designado como "n" representa un número entero superior a 1 y puede ser hasta varios cientos.

Figura 2: muestra un histograma de la medida de polyP en las plaquetas, según la metodología explicada en el Ejemplo 1. Las muestras fueron obtenidas de individuos sanos (Normal) y de pacientes con dSPD (dSPD).

Descripción detallada y modo de realización de la invención

Se ha identificado una correlación entre un bajo contenido de polyP en las plaquetas y la presencia de dSPD. Por lo tanto, cuando los contenidos de polyP en una muestra de plaquetas de un individuo son significativamente menores que un standard, obtenido a partir de individuos sanos, esto es un indicativo de que el individuo podría estar sufriendo de dSPD.

Utilizando la metodología descrita más detalladamente en el Ejemplo 1, se ha determinado una correlación entre niveles bajos de polyP en las plaquetas y la dSPD. Brevemente, el método se inició con la recogida de sangre de pacientes que han sido previamente diagnosticados con dSPD. Asímismo, para obtener los valores estándar de polyP en las plaquetas se obtuvieron muestras de sangre de numerosos individuos sanos. Los donantes sanos confirmaron que no sufrían trastornos en la coagulación y que una semana antes de la donación de sangre no habían tomado medicaciones que pudieran afectar a las plaquetas.

Para evitar la activación de las plaquetas durante la extracción de sangre y durante el manejo inicial de las muestras, se utilizaron tubos que contenían citrato, aunque otros anticoagulantes podrían también ser utilizados durante esta etapa.

Seguidamente, las plaquetas se aislaron de la muestra de sangre por centrifugación simple y el número de plaquetas fue determinado con un analizador hematológico (contador de plaquetas). El aislamiento de las plaquetas puede ser también realizado mediante otros métodos como por ejemplo, la filtración en gel (Lages, B. y col. J Lab Clin Med 1975, 85, 811-25) o la centrifugación en gradientes de densidad (Bagamery, K. y col. Clin Lab Haematol 2005, 27, 75-7). Así mismo, el número total de plaquetas en la muestra puede ser determinado por otros métodos, por ejemplo mediante el uso de un hemacitómetro o "cámara neubauer" y un microscopio (Dacie, J.V. y Lewis, S.M. Practical Haematology 1995).

A continuación, el precipitado de plaquetas aisladas, y lavadas con un tampón isotónico, se resuspendió en un ácido fuerte (como por ejemplo ácido perclórico) para producir extractos acídicos en los cuales las moléculas de mediano tamaño de polyP son solubles, pero las proteínas y lípidos de las plaquetas forman una mezcla insoluble que es separada por centrifugación. Luego, los extractos acídicos, que contenían el polyP, fueron neutralizados con una solución alcalina, para proceder a la determinación de los contenidos de polyP como se describe a continuación.

Varios métodos pueden ser utilizados para la detección de polyP, que incluyen, pero no están limitados a, reacciones metacromáticas con colorantes básicos como azul de toulidina (Lorenz, B. y Schroder, H.C. Prog Mol Subcell Biol 1999, 23, 217-39) , la detección de los cambios de fluorescencia de fluoróforos como Fura-2 o DAPI en presencia de polyP (Lorenz, B. y col. Anal Biochem 1997, 246, 176-84 / Aschar-Sobbi, R. y col. J Fluoresc 2008, in press), o la determinación colorimétrica de los productos resultantes después de la incubación de los extractos con enzimas específicas que procesan el polyP. Como ejemplos de las enzimas utilizadas en este útimo tipo de detección están la exopolifosafatasa (Wurst, H. y Kornberg, A. J Biol Chem 1994, 269, 10996-1001 / Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2001, 276, 26114-21), la polifosfato kinasa (Robinson, N.A. y col. J Biol Chem 1987, 262, 5216-22 / Ault-Riche, D. y col. J Bacteriol 1998, 180, 1841-7), o la polifosfato glucokinasa (Clark, J.E. y col. J Bacteriol 1986, 168, 1212-9). Los productos de las reacciones enzimáticas son marcados con cromóforos y son detectados y cuantificados con la ayuda de un espectrofotómetro o colorímetro o un luminómetro. En el ejemplo 1, el polyP ha sido cuantificado por el uso de la forma recombinante y purificada de la exopolifosfatasa inorgánica de levadura (Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2001, 276, 26114-21). Así mismo, el fosfato producido por la reacción enzimática ha sido evaluado colorimétricamente por el uso de azul de molibdeno y verde de malaquita (Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2001, 276, 26114-21).

Finalmente, se evaluaron los niveles de polyP obtenidos a partir de las muestras de plaquetas y se compararon los valores obtenidos entre los pacientes con dSPD y los individuos sanos. Se estudió una muestra de 130 individuos sanos, y dentro de esta muestra, no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de polyP dependiendo del sexo y ni la edad. En contraste, el polyP de las plaquetas fue significativamente menor en el grupo de pacientes con dSPD, al compararlo con el grupo de individuos sanos. Por lo tanto, se observa que si los niveles de polyP de las plaquetas en un individuo es menor de un tercio de los valores medios de un grupo de individuos sanos, podría darse el caso de presentar una dSPD.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la metodología utilizada para identificar a el polyP como marcador de dSPD.

Los experimentos fueron realizados utilizando plaquetas frescas de 130 individuos voluntarios y de cinco pacientes con dSPD. Los donantes del grupo control confirmaron, que según su conocimiento, no tenían trastornos en la coagulación. Así mismo, todos los individuos del estudio confirmaron que no habían tomado alguna medicación que afectase a las plaquetas en la semana antes de la donación de sangre. El diagnóstico de dSPD en los cinco pacientes utilizados se confirmó mediante el análisis de la incorporación de mepacrina por citometría de flujo y por el estudio de la secreción de ATD utilizando luminescencia.

Las muestras de sangre fueron obtenidas en tubos con citrato de sodio al 3.2%. El conteo de las plaquetas de las muestras se realizó utilizando un analizador de hematología Sysmex XE 2100 (Briggs, C. y col. Clin Lab Haematol 2000, 22, 345-50). Las muestras se centrifugaron dos veces a 200 x g por 10 min, para eliminar los glóbulos rojos y leucocitos. Los sobrenadantes resultantes fueron centrifugados a 1,000 x g por 15 min, y los precipitados resultantes se lavaron una vez con el siguiente tampón: 25 mM HEPES, 0,25M sacarosa, 12 mM acido citrico trisódico, pH=6,5. Los precipitados fueron luego extraídos con 0,15 ml de ácido perclórico (HClO4) 0.5 M. Después de una incubación en hielo de 30 min, los extractos acídicos fueron centrifugados a 13,000 x g por 7 min. Los sobrenadantes resultantes se neutralizaron por la adición de una solución de 1M KOH, 100 mM TrisHCl, lo que produce la formación de KClO4 y la precipitación del mismo. El KClO4 precipitado fue separado por centrifugación a 13,000 x g por 5 min, y el sobrenadante resultante fue utilizado para la determinación de polyP.

Los niveles de polyP fueron determinados en los extractos neutralizados por la medición del fosfato inorgánico (Pi) resultante después del tratamiento con un exceso de la enzima purificada exopolifosfatasa recombinante de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Enzima ScrPPX1). La Enzima ScrPPX1 fue obtenida por la expresión de un plásmido (cesión de la Universidad de Stanford) con el gen (rPPX1) con colas de histidina de la exopolifosfatasa recombinante de S. cerevisiae (Wurst, H. y col. J Bacteriol 1995, 177, 898-906), en la cepa de bacteria E. coli strain CA38 pTrcPPX1 (Crooke, E. y col. J Biol Chem 1994, 269, 6290-5). El aislamiento de la Enzima ScrPPX1 fue realizado como se describe en Ruiz y col. (Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2001, 276, 26114-21). La determinación de polyP de los extractos neutralizados, se realizó como se describe a continuación: En un volumen final de de 75 \mul ajustado a concentraciones finales de 60 mM Tris-HCl, pH 7.5, y 15 mM MgCl2, se mezclan alícuotas de los extractos junto con 0.5 a 2 \mug de Enzima ScrPPX1 purificada. Las incubaciones se realizan por al menos 20 min a 37ºC y la produción de Pi resultante fue monitorizada colorimétricamente por el método de detección de fosfato descrito por Lanzetta y col., que utiliza molibdato de amonio y verde de malaquita (Lanzetta, P.A. y col. Anal Biochem 1979, 100, 95-7).

Aplicabilidad industrial

Como el procedimiento objeto de la presente invención es apropiado para examinar un gran número de muestras en tiempos cortos, podría ser utilizado, por ejemplo, para determinar la incidencia real de la dSPD congénita en la población general. Así mismo, por este procedimiento pueden ser examinados de manera rutinaria a los pacientes que están en riesgo de desarrollar dSPD adquirida, como son los pacientes con enfermedades hepáticas y renales, leucemias mieloides, mielodisplasias o síndromes proliferativos.

El procedimiento de la invención sirve de base para el desarrollo de kits para la evaluación y ensayo de los niveles de polyP, tanto en plaquetas aisladas como en otros tipos celulares. Por ejemplo, los kits podrían incluir enzimas y/o los ensayos colorimétricos que permitan la cuantificación del polyP en las plaquetas. Se espera que los kits apropiados incluyan, pero no estén limitados a, medios para aislar las plaquetas de la sangre y producir extractos acidicos de las plaquetas, medios para detectar y/o cuantificar polyP, y también muestras control de polyP y/o plaquetas para comparar con los valores obtenidos.

Claims

1. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica del individuo a diagnosticar

caracterizado porque cuando el trastorno de la coagulación a diagnosticar es la enfermedad de los reservorios delta, el compuesto que se determina en la muestra biológica es polifosfato inorgánico.

2. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo del que se obtiene la muestra biológica es un mamífero.

3. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 2, caracterizado porque el mamífero del que se obtiene la muestra biológica es un humano.

4. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la muestra biológica incluye sangre.

5. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra biológica incluye plaquetas.

6. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 5, caracterizado porque cuando la muestra incluye plaquetas, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una muestra biológica del individuo a diagnosticar

c) ataque ácido sobre las plaquetas aisladas en la etapa anterior, para solubilizar el polifosfato inorgánico.

7. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de aislamiento de las plaquetas se lleva a cabo mediante un proceso de centrifugación simple, o bien mediante filtración en gel o bien mediante centrifugación en gradiente de densidad.

8. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la determinación del número de plaquetas se realiza mediante un analizador hematológico, o bien mediante un hemacitómetro de Neubauer y un microscopio.

9. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque el ataque ácido sobre las plaquetas se efectúa mediante resuspensión de las plaquetas, previamente lavadas con un tampón isotónico, en un ácido fuerte como ácido perclórico o ácido tricloroacético.

10. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la separación del polifosfato solubilizado se lleva a cabo mediante centrifugación.

11. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores se efectúa, tras neutralización con solución alcalina, directamente mediante colorimetría o fluorimetría, preferentemente colorimetría.

12. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato y solubilizado y separado en las etapas anteriores incluye tras la neutralización con solución alcalina

a) un ataque enzimático para procesar el polifosfato, para liberar los productos resultantes de dicha reacción enzimática.

13. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante un procedimiento según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque incluye:

- medios para la detección y cuantificación del polifosfato.

14. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 13, caracterizado porque incluye adicionalmente enzimas para el procesamiento específico de polifosfato en productos detectables mediante colorimetría o por luminiscencia.

15. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque los medios para producir extractos acídicos de las plaquetas son ácidos que se seleccionan entre ácido perclórico o ácido tricloroacético.

16. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque los medios para la detección y cuantificación del polifosfato son reactivos para ensayos colorimétricos, de fluorescencia o de luminiscencia, preferentemente reactivos colorimétricos que se seleccionan entre colorantes básicos como el azul de toulidina o fluoróforos como Fura-2 o DAPI.

17. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 14-16, caracterizado porque las enzimas se seleccionan entre las exopolifosafatasas, la polifosfato kinasas, o la polifosfato glucokinasas.