ES2321725T3 - Utilizacion de inhibidores de glucosidasa para un tratamiento de la mucoviscidosis. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un inhibidor de glucosidasa para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la mucoviscidosis, elegido entre los compuestos de fórmula general (II bis) siguiente: en la cual R2 representa un grupo butilo.
Description
Utilización de inhibidores de glucosidasa para
un tratamiento de la mucoviscidosis.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de inhibidores de glucosidasa especificados en la
reivindicación 1 para la preparación de medicamentos para el
tratamiento de la mucoviscidosis.
La mucoviscidosis (CF: Cystic Fibrosis)
es la enfermedad genética recesiva, autosómica, letal más extendida
en las poblaciones europeas y norteamericanas. El gen CF (locus
7q31) codifica la proteína transmembrana llamada CFTR (por
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) (Tsui y
otros, 1985; Riordan y otros, 1989). Las mutaciones del gen CF
causan un transporte anómalo de agua y electrólitos a través de las
membranas celulares de diversos órganos como los pulmones, las
glándulas sudoríparas, el intestino y el páncreas exocrino. Aunque
hay más de 1.000 mutaciones de la proteína CFTR, la mutación más
frecuente (70% de los pacientes) es la deleción de una fenilalanina
en el dominio NBF1 en posición 508 (delF508). La principal causa de
mortalidad de los pacientes CF está vinculada a esta deleción y
causa infecciones o una insuficiencia pulmonar provocadas por un
aumento de la viscosidad de la mucosidad. Esta viscosidad lleva a la
oclusión de las vías respiratorias y favorece las infecciones por
parte de bacterias oportunistas. Además, se constata un agravamiento
a nivel digestivo y en particular pancreático (paciente con
insuficiencia pancreática). La proteína CFTR es una glucoproteína
de 1.480 aminoácidos, que pertenece a la superfamilia de los
transportadores de membrana ABC. CFTR es un canal de cloruro
localizado en la membrana plasmática apical de las células
epiteliales pulmonares en los sujetos sanos. CTFR es responsable
del transporte transepitelial de agua y electrólitos y permite en un
sujeto sano la hidratación de las vías respiratorias pulmonares. En
los pacientes CF, las membranas plasmáticas carecen de esta
proteína debido a un mal direccionamiento de la proteína que queda
retenida en el retículo endoplásmico (RE). La hidratación de las
vías respiratorias pulmonares deja en ese caso de ser funcional. La
deleción delF508 altera el repliegue del dominio NBF1 e impide la
maduración completa de la proteína que por lo tanto se degrada muy
pronto en el curso de su biosíntesis. Por lo tanto, si la proteína
delF508 llega a la membrana funciona como un canal de cloruro. Una
de las claves de un tratamiento de esta enfermedad consiste por lo
tanto en un redireccionamiento de delF508 hacia la membrana de las
células. Una vez en las membranas, puede estimularse la actividad
de transporte de delF508 mediante agonistas fisiológicos endógenos o
exógenos.
El mecanismo de direccionamiento de la proteína
CFTR se efectúa de la manera siguiente. Tras la neosíntesis, la
proteína CFTR reaparece en la luz del RE donde sufre diversas
glucosilaciones gracias a unas glucosiltransferasas. La proteína
reaparece junto con otras 3 glucosas y 1 manosa unidas a N. Dos de
las glucosas son eliminadas por las glucosidasas I y II. La
calnexina o la calreticulina, chaperonas dependientes de calcio,
reconocen la proteína monoglucosilada y se fijan sobre ella
mediante la glucosa unida a N. Estas chaperonas impiden que las
distintas proteínas CFTR presentes en el RE se agreguen entre sí y
permiten la fijación de otras chaperonas tales como ERp57. El
complejo CFTR/calnexina/ERp57 así formado permite el repliegue del
CFTR. A continuación, la glucosidasa II se lleva la glucosa
restante, liberando así el CFTR de las chaperonas. Si el repliegue
es incorrecto, una glucosiltransferasa une una glucosa al CFTR que
podrá de nuevo someterse a uno o más ciclos hasta que esté bien
replegado. Si el repliegue sigue siendo incorrecto, una manosidasa
elimina la manosa unida a N, entonces la proteína será transportada
al citosol, mediante el complejo-canal del
translocón, donde podrá degradarse (Ellgard y Helenius,
2003). Este fenómeno se observa en el 80% del
CFTR-WT y el 99% del delF508-CFTR.
Una vez en el citosol, se hacen cargo de la proteína distintas
chaperonas tales como Hsp70, Hsp90 o Hdj-2. Estas
chaperonas permiten a la ubiquitina fijarse sobre el CFTR. Marcada
así, el CFTR es reconocido y degradado por el complejo del
proteosoma 26S que es ATP dependiente (Gelman y otros, 2002).
Si la maquinaria de control del retículo considera que el repliegue
del CFRT es correcto, la proteína podrá alcanzar el aparato de
Golgi. Se hará cargo de ella la proteína "cargo"
ERGIC-53 (perteneciente a la familia de las
lectinas) que se une al CFTR mediante la manosa. El paso del ERGIC
se lleva a cabo por medio de la intermediación de vesículas
formadas por el factor GOP I (Ellgard y Helenius, 2003).
Parece que si la proteína está mal replegada, es sensible a la
endoglucosidasa H del aparato de Golgi (Cheng y otros, 1990)
y entonces será retornada al retículo donde se degradará. En
cambio, de la proteína replegada correctamente, resistente a la
endoglucosidasa H, se hará cargo el factor VIP 36 (homólogo al
ERGIC-53) que la llevará a la membrana apical
(Fiedler y Simons, 1995).
Si bien ya se ha observado que un inhibidor de
glucosidasa, la castanospermina, tenía un efecto en la renovación
de la presencia de delF508 en la superficie de células epiteliales
pulmonares (Wei y otros, 1996), en cambio no se ha descrito nunca
que este compuesto sea capaz no sólo de restablecer el
direccionamiento de la membrana de delF508, sino también de
permitir que delF508 actúe como transportador iónico. Por esta
razón, los autores de este artículo no formularon ninguna hipótesis
en cuanto a la utilización posible de este compuesto en el contexto
del tratamiento de la mucoviscidosis.
Los inventores han estudiado precisamente estos
inhibidores de glucosidasa con el fin de determinar si eran capaces
de asegurar al mismo tiempo el direccionamiento correcto y
específico de delF508 sin influir por ello en su actividad de
transportador iónico ni en la viabilidad celular.
El
N-butil-desoxinojirimicina
(NB-DNJ) es un inhibidor de las glucosidasas I y II
del retículo endoplásmico que en primer lugar ha sido elaborado por
el ser humano como molécula antivírica. La inhibición de estas
enzimas modifica el repliegue de una glucoproteína de la cubierta
del virus VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y por
tanto se bloquea el ciclo del virus (Platt y otros, 2001). Se ha
evaluado un tratamiento que utiliza el NB-DNJ en
pacientes que sufren síndrome de inmunodeficiencia adquirida: esta
molécula es bien tolerada y no es citotóxica para los tejidos en
cultivo ni tan siquiera a concentración elevada (2 mM). Además,
estos ensayos clínicos han puesto al descubierto que el
NB-DNJ también tenía un efecto inhibidor sobre las
glucosiltransferasas. Razón ésta por la cual se ha estudiado esta
molécula, también llamada OGT 918, en el tratamiento de la
enfermedad de Gaucher (Dwek y otros, 2000; Cox y
otros, 2000). Esta enfermedad genética se debe a un déficit de
enzima lisosómica, la \beta-glucocerebrosidasa,
que conduce a una acumulación de glucocerebrósidos (sustrato de la
enzima). El NB-DNJ, inhibidor de la
glucosiltransferasa que interviene en la biosíntesis de los
glucocerebrósidos, impide de este modo su síntesis y acumulación
(Dwek y otros, 2000; Cox y otros, 2000). El
NB-DNJ obtuvo en el 2002 la AMM como medicamento en
la enfermedad de Gaucher bajo el nombre de Zavesca®.
El documento WO 01/02862 describe el tratamiento
de los problemas para el encauzamiento de proteínas, más
particularmente de la mucoviscidosis, suprimiendo la cooperación de
ERp57 con la calnexina o la calreticulina para la administración de
un inhibidor de glucosilación tal como la desoximanojirimicina (DMJ)
o la desoxinojirimicina (DNJ).
El documento WO 01/02586 describe un
procedimiento para tratar enfermedades genéticas, en particular la
mucoviscidosis, mediante la administración de un antagonista de una
enzima a1,2-manosidasa tal como la
1-desoximanojirimicina (DMJ).
La patente de EE.UU. US 2002/0035072 describe la
utilización de derivados de iminoazúcares, en el tratamiento de
enfermedades lisosómicas y también sugiere utilizar estos derivados
de iminoazúcares en el contexto del tratamiento de patologías
vinculadas a alteraciones en el repliegue de las proteínas, sin
mencionar específicamente la mucoviscidosis.
De la presente invención se deriva el
descubrimiento, por parte de los inventores, del hecho de que el
NB-DNJ y otros inhibidores de la glucosidasa en
general pueden restablecer el direccionamiento de membrana de
delF508 sin alterar los otros canales cloruro y permiten a delF508
funcionar como transportador iónico.
Por la expresión "inhibidor de glucosidasa"
se entiende cualquier inhibidor de las glucosidasas I y/o II,
pudiéndose determinar la inhibición de estas glucosidasas en
particular según el procedimiento descrito en Platt y otros,
1994.
Entre los compuestos inhibidores de glucosidasa
pueden mencionarse aquellos que pueden restablecer el
direccionamiento de membrana de delF508 sin alterar los otros
canales cloruro y que permiten a delF508 funcionar como
transportador iónico, en particular en el contexto de las
experiencias descritas posteriormente y efectuadas sobre células
CF15 epiteliales humanas pulmonares homocigóticas para la deleción
de delF508.
Los compuestos inhibidores de glucosidasa pueden
elegirse entre los compuestos de fórmula general (I) siguiente:
en la
cual:
- R_{1} representa un grupo CH_{3}, o
CH_{2}OH
- R_{2} representa H o un grupo alquilo de 1 a
5 átomos de carbono,
- o R_{1} y R_{2} forman junto con el
carbono en posición (a) y el nitrógeno de la formula (I) que aparece
más abajo un grupo de fórmula:
\newpage
Entre los compuestos de fórmula (I), pueden
mencionarse:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o incluso los compuestos de fórmula
general (II)
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual R_{2} representa H o
un grupo alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono.
\newpage
La presente invención se refiere a la
utilización de un inhibidor de glucosidasa para la preparación de
un medicamento destinado al tratamiento de la mucoviscidosis,
elegido entre los compuestos de fórmula general (II bis)
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual R_{2} representa un
grupo
butilo.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también tiene por objeto la
utilización antes mencionada de inhibidores de glucosidasa según
una de las reivindicaciones 1 a 4, elegidas entre los compuestos de
fórmulas generales (II.1) o (II.2) siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las cuales R_{2} es tal como
se define
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere más particularmente a la
utilización antes mencionada de los compuestos de fórmulas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, los compuestos utilizados en el
contexto de la presente invención son el NB-DNJ y
el NB-DMJ.
Aún más preferiblemente, el compuesto utilizado
en el contexto de la presente invención es el
NB-DNJ.
La invención también tiene por objeto la
utilización antes mencionada de compuestos inhibidores de
glucosidasa definidos anteriormente, para la preparación de un
medicamento administrable por vía oral (jarabe, suspensión, gragea,
comprimidos, polvos o gránulos), rectal (supositorio), nasal
(aerosol mediante inhalación, o gotas), en particular a razón de
aproximadamente de 1 mg a 2 g diarios de compuesto activo en
adultos, o de 1 mg a 1 g diario en niños y lactantes, en una o más
tomas.
\newpage
Los compuestos inhibidores de glucosidasa
definidos anteriormente pueden utilizarse junto con un compuesto
activador del canal CFTR, elegido entre:
- la genisteína de fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- o los derivados de los
benzo[c] quinolizinios de fórmula (II) siguiente: en la
cual:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- R_{1} y R_{2} representan un
átomo de hidrógeno, o forma junto con C_{1} y C_{2} un ciclo
aromático de átomos de
carbono,
- R_{5} representa un átomo de hidrógeno, o un
grupo alquilo lineal o sustituido de 1 a 10 átomos de carbono, en
particular un grupo butilo, o un éster de fórmula COOR' en la cual
R' representa un grupo alquilo lineal o sustituido de 1 a 10 átomos
de carbono, en particular un grupo etilo,
- Y representa un grupo -OH, -SH, -NH_{2}, o
-NHCOCH_{3},
- R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{10}
representan un átomo de hidrógeno, o por lo menos uno de R_{7},
R_{8}, R_{9} o R_{10} representa un átomo de halógeno, en
particular un átomo de cloro, de bromo o de flúor,
- X representa un átomo de halógeno en forma
aniónica, en particular un átomo de bromo Br^{-}, o de cloro
Cl^{-}, o un grupo de átomos en forma aniónica.
\newpage
Los compuestos inhibidores de glucosidasa
definidos anteriormente pueden utilizarse junto con derivados de
los benzo[c] quinolizinios de fórmula (II) elegidos entre los
compuestos siguientes:
También pueden citarse los productos que
comprenden por lo menos un compuesto inhibidor de glucosidasa, en
particular un compuesto de fórmula (I) o (II) tal como se define
anteriormente, y por lo menos un compuesto activador del canal CFTR
tal como se define anteriormente, como productos combinados para una
utilización simultánea, separada o escalonada, en el tratamiento de
la mucoviscidosis.
La invención se ilustrará mejor con ayuda de la
descripción detallada que se desprende de la demostración
experimental del efecto de direccionamiento correcto y específico de
delF508 por parte de MB-DNJ, sin que este último
afecte por ello a su actividad de transportador iónico ni la
viabilidad celular.
Células CHO-WT: Las
células CHO (ovario de hámster chino) son fibroblastos que han sido
transfectados con el gen del CFTR salvaje
(CFTR-WT). Estas células sobreexpresarán por lo
tanto la proteína CFTR.
Medio de cultivo: Medio MEM alfa (GIBCO) + 7% de
suero de ternera fetal + 0,5% de penicilina/estreptomicina + 100
\muM de metotrexato (Ametopterina, Sigma).
Células CF15: Las células CF15 son
células epiteliales humanas de origen nasal que expresan el gen
DF508-CFTR.
Medio de cultivo: Medio DMEM + HAM F12 +
10% de FCS + 0,6% de penicilina/estreptomicina + factores de
crecimiento (insulina 5 \mug/ml, transferrina 5 \mug/ml,
adrenalina 5,5 \muM, adenina 0,18 mM, EGF 10 ng/ml, T3 2 nM,
hidrocortisona 1,1 \muM).
Células Calu-3: Las
células Calu-3 son células epiteliales humanas de
origen pulmonar que expresan el gen del CFTR salvaje.
Medio de cultivo: Medio DMEM/F12 con glutamax +
7% de suero de ternera fetal + 1% de penicilina/estreptomi-
cina M2.
cina M2.
El inmunomarcado permite visualizar la
localización celular de la proteína CFTR gracias a un anticuerpo
(Ac) primario anti-CFTR más un anticuerpo secundario
anti-anticuerpo primario marcado en el fluoróforo
Cy3. Las células son sembradas anticipadamente sobre lamelas en un
medio de cultivo apropiado. Se efectúan tres lavados con TBS (NaCl:
157 mM, Tris base: 20 \muM, pH 7,4) de 5 minutos cada uno. A
continuación se fijan las células con la ayuda de TBS
paraformaldheído (3%) durante 20 minutos. Tras 3 lavados con TBS (5
minutos) se incuban las células con TBS-tritón 0,1%
(10 minutos) que permite la formación de orificios en la membrana
celular, a continuación se efectúan de nuevo 3 lavados con TBS antes
de ponerlas con TBS-BSA 0,5%-saponina 0,05% durante
una hora. En seguida se incuban las células con el anticuerpo
primario anti C-terminal CFTR (2 \mug/ml) durante
1 hora. Se realizan 3 lavados con
TBS-BSA-saponina de 5 minutos cada
uno antes de incubar con el anticuerpo secundario
GAM-cy3 (1/400) durante 1 hora. Tras 2 lavados con
TBS de 5 minutos, se marcan los nudos mediante incubación con
Topro3 (1/1.000) durante 5 minutos. Por último, pueden montarse las
lamelas sobre la lámina tras 3 últimos lavados con TBS de 5
minutos. Las láminas se observan en el microscopio confocal
(Bio-Rad) gracias a una excitación con el láser de
longitudes de onda apropiadas. A fin de diferenciar el marcado
entre Cy3 y Topro3 se ha cambiado el color de la fluorescencia de
Topro3 por azul (color de los nudos).
Las medidas de transporte de iones cloruro en
las células se han realizado con ayuda de la técnica de los eflujos
de yoduro radioactivo (Becq y otros, 1999; Dormer y otros, 2001). El
trazador (^{125}I) se incorpora en el medio intracelular. Además,
la cantidad de radiotrazador que sale de la célula se cuenta tras
la adición de distintos agentes farmacológicos. El yoduro se utiliza
como trazador de transporte de iones cloruro. Se ha observado que
los dos radiotrazadores ^{125}I y ^{36}Cl podían considerarse
como equivalentes por la medida de la actividad de un canal de
cloruro (Venglarick y otros, 1990). Además el ^{125}I
tiene la ventaja que tiene una vida corta en comparación con la del
^{35}Cl (semividas respectivas: 30 días y 300.000 años). Las
células se cultivan sobre placas de 24 pocillos en un medio
adecuado. Se efectúan 2 lavados con medio de eflujo (NaCl: 136,6
mM, KCl: 5,4 mM, KH_{2}PO_{4}: 0,3 mM, NaH_{2}PO_{4}: 0,3
mM, NaHCO_{3}: 4,2 mM, CaCl_{2}: 1,3 mM, MgCl_{2}: 0,5 mM,
MgSO_{4}: 0,4 mM, HEPES: 10 mM, D-glucosa: 5,6 mM)
con el fin de eliminar las células muertas que se desprenden de la
radioactividad de manera anárquica. Además, se ponen las células a
incubar con 500 \mul de carga (1 \muCi/ml de ^{125}I) durante
30 minutos en el caso de las CHO-WT o 1 hora en el
caso de las CF15 y Calu-3. El yoduro se equilibra
entre una y otra parte de la membrana celular. El robot
(Multiprobe, Packard) realiza las etapas siguientes: El medio de
carga se aclara con medio de eflujo para eliminar la radioactividad
extracelular. Cada minuto se recoge el sobrenadante en tubos de
hemólisis y se sustituye el medio de cultivo con un volumen
equivalente (500 \mul). En las recogidas de los 3 primeros
minutos no se lleva a cabo la adición de fármaco, permiten obtener
una línea de base estable, que caracteriza la salida pasiva de
iones I. Las 7 recogidas siguientes se obtienen en presencia de la
molécula que hay que probar. Al final del experimento, se lisan las
células mediante adición de 500 \mul de NaOH (0,1 N)/0,1% SDS (30
minutos), de este modo puede determinarse la radioactividad que hay
dentro de la célula. La radioactividad presente en los tubos de
hemólisis se cuenta en ciclos por minuto (cpm) gracias a un contador
gamma (Cobra II, Packard). Los resultados en cpm se expresan en
forma de velocidad de salida de yoduro radioactivo (R) a partir de
la fórmula siguiente: R(min^{-1}) =
[ln(^{125}It_{1})-ln(^{125}It_{2})]/(t_{1}-t_{2})
con ^{125}I t_{1}: cpm en el tiempo t_{1}; ^{125}I t_{2}:
cpm en el tiempo t_{2}. Este flujo de yoduro se representa bajo
la forma de una curva. Con el objetivo de cuantificar la salida de
yoduro debida a la administración de la molécula sometida a prueba,
se calcula el flujo relativo siguiente que permite librarse del
flujo de base Velocidad relativa (min^{-1}) = Rpic - Rbasal. Por
último, estos resultados son normalizados para poder comparar el
efecto de distintos fármacos entre sí. Los resultados se presentan
bajo la forma de media +/-SEM. La prueba estadística de Student
sirve para comparar el efecto de los fármacos respecto de los
controles (los valores correspondientes a P <0,01 se consideran
estadísticamente significativos).
La prueba de toxicidad al MTT es una prueba
colorimétrica que se basa en la capacidad de las deshidrogenasas
mitocondriales para metabolizar el MTT (sal de tetrazolio amarillo)
a formazán (púrpura). Entonces, puede determinarse la absorbancia,
proporcional a la concentración de colorante convertido, mediante
espectrofotometría. Se ponen las células a incubar en placas de 96
pocillos en presencia del agente a probar durante 2 horas. Se
realizan 3 controles: 100% de células vivas: células sin agente; 0%
células vivas: células dejadas al aire libre; en blanco: medio sin
célula. Se aclaran las células con medio RPMI sin rojo de fenol para
que el color del medio no interfiera en las medidas de la
absorbancia. Además, se incuban durante 4 horas con 100 \mul de
solución de RPMI suplementada con MTT (0,5 mg/ml). Entonces se
elimina el medio, la adición de 100 \mul de DMSO permite
solubilizar el colorante convertido (formazán). La absorbancia se
mide mediante espectrofotometría a 570 nm (púrpura); 630 nm (ruido
de fondo). Con el objetivo de liberarse del ruido de fondo, se
efectúa el cálculo siguiente: DO_{real} = DO_{570 \
nm}-DO_{630 \ nm}. Además, los resultados son
normalizados con respecto a los controles (100% y 0% de células
vivas) y se presentan bajo la forma de media +/-SEM.
El estudio del direccionamiento de la proteína
delF508-CFTR se realiza en el laboratorio combinando
estrategias de farmacología, de imaginería celular, de pruebas
bioquímicas y electrofisiológicas sobre células CF15 epiteliales
humanas pulmonares homocigóticas para la deleción delF508. Hay
distintas moléculas capaces de interferir con determinados factores
implicados en el direccionamiento del CFTR. Es el caso del
N-butil-desoxinojirimicina
(NB-DNJ) que es inhibidor de las glucosidasas I y II
y que ha sido probado.
Para cada experiencia, la adición de un cóctel
(forskoline 10 \muM, genisteína 30 \muM) permite la activación
del CFTR cuando se encuentra en la membrana. Así, si se ha
restablecido el direccionamiento de delF508 podrá observarse un
eflujo de yoduro. Los resultados, presentados bajo la forma de un
histograma, se han normalizado con respecto a un tratamiento de
referencia (tratamiento de las células con MBP-91
250 \muM durante 2 horas) para el cual se considera que se tiene
un 100% de actividad CFTR. A continuación se muestra que el
tratamiento por parte de un inhibidor de glucosidasa,
N-butildesoxinojirimicina (NB-DNJ)
(estructura que se presenta a continuación) de células CF15 durante
dos horas a 37ºC restablece un direccionamiento de la proteína
delF508 y le permite funcionar como transportador iónico (figura
1).
En ausencia de tratamiento de las células, la
proteína delF508 no es de la membrana y se carece de eflujo de
yoduro estimulado por el cóctel (forskolina 10 \muM, genisteína 30
\muM). Se ha determinado la CI_{50} (concentración de la
molécula que proporciona un 50% de la eficacia máxima) del
NB-DNJ a 123 micromolar (figura 2). Mediante
imaginería celular se ha localizado la proteína delF508 en los
compartimentos de la membrana plasmática tras tratamiento por parte
del NB-DNJ.
Con el objetivo de mostrar que el efecto del
NB-DNJ es específico del direccionamiento del
delF508 y que no altera los otros canales cloruro, se ha probado el
NB-DNJ como posible activador de las células
Calu-3. Los resultados presentados en la figura 3
se han obtenido en eflujo de yoduro sobre células
Calu-3. Los controles son la forskolina (5 \muM,
n=8) y el MPB-91 (250 \muM, n=8). El
NB-DNJ (n=8) no es un activador del CFTR salvaje ni
de otros transportes aniónicos de estas células ya que no hay
diferencia significativa entre el efecto con o sin
NB-DNJ (basal).
Con el objetivo de mostrar que el efecto del
NB-DNJ es específico del direccionamiento del
delF508 se ha probado el NB-DNJ como modulador del
direccionamiento del CFTR salvaje sobre células
Calu-3. Los resultados presentados en la figura 4
se han obtenido en eflujo de yoduro sobre células
Calu-3 tratadas durante 2 horas con
NB-DNJ (500 \muM). En la figura 4, el basal
corresponde a células no tratadas y sin estimulación por parte de
MPB-91. No se ha estimulado ningún eflujo de yoduro.
El segundo control corresponde a células sin tratamiento pero
estimuladas con 250 \muM de MPB-91. En este caso
se ha activado CFTR y se ha determinado un eflujo de yoduro. El
tercer control corresponde a células tratadas con
MPB-91 durante 2 horas a 37ºC y a continuación
estimuladas con 250 \muM de MBP-91. La actividad
CFTR en estas condiciones experimentales no difiere
significativamente con respecto a las otras dos situaciones
experimentales. Por último, cuando las células
Calu-3 son tratadas durante 2 horas a 37ºC con 500
\muM de NB-DNJ y estimuladas con 250 \muM de
MBP-91 el nivel de actividad de CFTR no se ve
afectado. Estos resultados demuestran que el NB-DNJ
no influye en el direccionamiento del CFTR salvaje o de otros
canales cloruro, ni altera la actividad de CFTR en las células
epiteliales humanas pulmonares no CF.
Con el objetivo de probar la citotoxicidad del
NB-DNJ, se han incubado células
CHO-WT durante 2 horas con diferentes
concentraciones de inhibidores antes de someter la prueba de
viabilidad celular al MTT. La figura 5 presenta un resumen de los
resultados. Los resultados muestran que las células son viables a
todas las concentraciones de NB-DNJ. Esta molécula
no presenta por lo tanto citotoxicidad celular.
Se han comparado los efectos de distintos
compuestos de la familia del
N-butil-desoxinojirimicina
(NB-DNJ o nB-DNJ). Los productos se
presentan en la figura 6. Para cada experiencia, la adición de un
cóctel (forskoline 10 \muM, genisteína 30 \muM) permite la
activación del CFTR cuando éste se encuentra en la membrana. Los
resultados presentados en la figura 7 muestran que el tratamiento de
las células CF15 con 100 \muM de DNJ, NB-DNJ o
DMJ durante dos horas a 37ºC restablece un direccionamiento de la
proteína delF508 y le permite funcionar como transportador iónico
(figura 7). Al contrario, los compuestos DGJ,
nB-DGJ, DFJ y nB-DFJ no tienen
ningún efecto significativo sobre el direccionamiento de del F508
(figura 7). Para cada compuesto (DNJ, DMJ y nB-DMJ)
se ha determinado la CI_{50} (concentración de la molécula que
proporciona un 50% de la eficacia máxima) a >250 \muM, 134
\muM y 113 \muM respectivamente. DFJ, DMJ, DNJ, DGJ,
nB-DFJ y nB-DGJ no entran en el
cuadro de la protección reivindicada.
Las pruebas de eflujo han revelado que el
NB-DNJ que provoca una acumulación del delF508 en el
retículo endoplásmico permite una relocalización de esta proteína
en la membrana y representa por lo tanto un medio farmacológico
importante de redireccionamiento del delF508 en una célula epitelial
humana pulmonar. El NB-DNJ permite el
direccionamiento de la membrana específico de delF508 sin influir en
la actividad de transportador iónico de esta proteína, y no tiene
ningún efecto sobre los otros canales cloruro, ni sobre la
viabilidad celular.
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Las células CF15 han sido pretratadas durante 2
horas con el NB-DNJ (500 \muM). Se considera que
el efecto del MBP-91 (250 \muM) representa el 100%
en esta prueba. La actividad del CFTR se determina como eflujo de
yoduro (n=8 para cada situación) tras estimulación con fsk 10 \muM
+ gst 30 \muM. Ns: diferencia no significativa.^{***}:
diferencia significativa P <0,001.
Las células CF15 han sido pretratadas durante 2
horas con el NB-DNJ a distintas concentraciones. La
actividad del CFTR se determina como eflujo de yoduro (n=4 para cada
concentración) tras estimulación con fsk 10 \muM + gst 30
\muM.
La actividad del CFTR se determina como eflujo
de yoduro (n=8 para cada situación) tras estimulación con
forskolina (fsk) 5 \muM, MBP-91 250 \muM,
NB-DNJ 500 \muM. Obsérvese que la fsk y el
compuesto MBP-91 activan un eflujo de yoduro en
esta célula, pero que el NB-DNJ no tiene ningún
efecto. Ns: diferencia no significativa.^{***}: diferencia
significativa P <0,001.
Las células Calu-3 se preincuban
durante 2 horas a 37ºC con 500 \muM NB-DNJ, con
MPB-91 250 \muM. Células no tratadas: no treat.
El basal indica que las células no han sido tratadas ni estimuladas.
La actividad del CFTR se determina como eflujo de yoduro (n=8 para
cada situación) tras estimulación con MBP-91 250
\muM. Obsérvese que un tratamiento con NB-DNJ no
tiene ningún efecto ya que el nivel de estimulación de los eflujos
es el mismo para las tres situaciones. Ns: diferencia no
significativa.
Obsérvese que a 5 y 50 \muM no puede
determinarse ninguna citotoxicidad. Se observa una leve toxicidad a
500 \muM. 2 horas de tratamiento de las células. Ns: diferencia no
significativa.^{***}: diferencia significativa P <0,001.
DFJ, DMJ, DNJ, DGJ, nB-DFJ y
nB-DGJ no entran en el cuadro de la protección
reivindicada.
DNJ, DMJ, nB-DGJ, DGJ,
nB-DFJ y DFJ no entran en el cuadro de la protección
reivindicada.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (4)
1. Utilización de un inhibidor de glucosidasa
para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de
la mucoviscidosis, elegido entre los compuestos de fórmula general
(II bis) siguiente:
en la cual R_{2} representa un
grupo
butilo.
2. Utilización según la reivindicación 1 de un
compuesto de fórmulas siguientes:
3. Utilización según una de las reivindicaciones
1 o 2 del compuesto NB-DNJ.
4. Utilización de compuestos definidos en una de
las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento
administrable por vía oral (jarabe, suspensión, gragea, comprimidos,
polvos o gránulos), rectal (supositorio), nasal (aerosol mediante
inhalación, o gotas), en particular a razón de alrededor de 1 mg a 2
g diarios de compuesto activo en adultos, o de 1 mg a 1 g diario en
niños y lactantes, en una o más tomas.
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