ES2321508T3

ES2321508T3 - Nuevas celulas endoteliales, anticuerpos dirigidos contra estas celulas y su uso.

Info

Publication number: ES2321508T3
Application number: ES03807892T
Authority: ES
Inventors: Jean Pierre PlouËT; Sandrine Florence Pedron; Martine Michele Maitre-Boube
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2009-06-08
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: DE60325874D1; EP1549741A1; FR2845691A1; US20060263827A1; WO2004033674A1; AU2003300487A1; ATE420948T1; EP1549741B1; FR2845691B1

Abstract

Células endoteliales de fenotipo angiogénico, que presentan las siguientes propiedades: - forman unos tubos cuando se ponen en presencia del factor de crecimiento VEGF en un gel de colágeno, - proliferan bajo la acción del VEGF, - están protegidas de la apoptosis por el VEGF, y - su expresión de VEGF-R2 es 4 veces superior a la de las células correspondientes de fenotipo no angiogénico, y caracterizadas porque son susceptibles de generar unos anticuerpos que presentan una actividad anti-tumoral.

Description

Nuevas células endoteliales, anticuerpos dirigidos contra estas células y su uso.

La presente invención se refiere a nuevas células endoteliales, así como a unos anticuerpos dirigidos contra estas células.

Las células endoteliales cubren el interior de todos los vasos sanguíneos del organismo. Estas células tienen un fenotipo quiescente, no proliferan casi nada (sólo 0,01% de las células endoteliales intervienen en la división celular en un momento dado). El papel fisiológico de las células endoteliales es muy amplio, éstas participan en numerosos fenómenos vitales para el organismo: coagulación sanguínea, mantenimiento de la tensión arterial, selección de células circulantes, síntesis de factores de crecimiento. Cuando un sitio necesita una aportación creciente en oxígeno y en nutrientes, éste reacciona liberando unos factores solubles que convierten el fenotipo de las células endoteliales en un fenotipo activado, y unos factores mitógenos para las células endoteliales de fenotipo activado. Estas células endoteliales adquieren por último un fenotipo angiogénico y son capaces de efectuar el programa de angiogénesis, es decir, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de la red ya existente. Este fenómeno es normal y controlado durante una lesión o en la maduración del cuerpo lúteo del ovario; en cambio, se hace peligroso en unas situaciones patológicas en las que la angiogénesis ya no se controla más, por ejemplo en la retinopatía diabética, la poliartritis y el desarrollo tumoral.

Es necesario que un agente terapéutico ataque sólo a las células endoteliales que participan en la angiogénesis, es decir, a las células de fenotipo angiogénico (Brooks et al., 1994), de ahí la importancia del estudio del fenotipo angiogénico para el desarrollo de nuevas herramientas con el fin de bloquear la angiogénesis. Se han efectuado pocos estudios hasta ahora sobre unas células de fenotipo angiogénico, siendo una dificultad importante la imposibilidad de extraer unas células de este fenotipo y mantenerlas diferenciadas en cultivo in vitro. Las células endoteliales se cultivan habitualmente en presencia de FGF2, y por lo tanto como cualquiera célula cultivada in vitro pierden su fenotipo quiescente y adquieren un fenotipo activado cuando proliferan en una cápsula de cultivo. En cambio, el mantenimiento del fenotipo angiogénico se podría asegurar mediante la adición de FGF2 al medio de cultivo (Boudreau et al., 1997; Battegay et al., 1994). Sin embargo, el papel de FGF2 en patología es controvertido.

En la actualidad, no se dispone de ningún modelo de estudio de células endoteliales que, aunque proliferen, imitan el fenotipo no activado (fenotipo no angiogénico), o bien imitan el fenotipo angiogénico.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar unas células endoteliales que dependen exclusivamente del VEGF.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar un procedimiento de preparación de dichas células cultivadas sobre una capa de gelatina o de colágeno, e incubadas o no en un medio de cultivo cuyo contenido en hormonas y en factores de crecimiento está controlado.

La expresión "células endoteliales de fenotipo no angiogénico" designa unas células incapaces de organizarse en tubos de cultivo en un gel de colágeno en presencia de VEGF.

La expresión "células endoteliales de fenotipo angiogénico" designa unas células capaces de organizarse en tubos de cultivo en un gel de colágeno en presencia de VEGF.

La expresión "sustancias que no afectan sustancialmente las células endoteliales de fenotipo no angiogénico" designa cualquier sustancia natural o sintética que, añadida al medio de cultivo, no modifica la actividad de las células de fenotipo no angiogénico durante por lo menos uno de los 3 ensayos siguientes (descritos en los ejemplos): proliferación, migración, angiogénesis in vitro.

La expresión "sustancias que no afectan sustancialmente las células endoteliales de fenotipo angiogénico" designa cualquier sustancia natural o sintética que, añadida al medio de cultivo, no modifica la actividad de las células de fenotipo angiogénico durante por lo menos uno de los 3 ensayos siguientes (descritos en los ejemplos): proliferación, migración, angiogénesis in vitro.

La presente invención se refiere:

-: a unas células endoteliales de fenotipo angiogénico, que presentan las siguientes propiedades:

-: forman unos tubos cuando se ponen en presencia del factor de crecimiento VEGF, en un gel de colágeno,

-: proliferan bajo la acción del VEGF,

-: están protegidas de la apoptosis por el VEGF,

-: su expresión de VEGFR-2 es 4 veces superior a la de células correspondientes de fenotipo no angiogénico, y

se caracterizan porque son susceptibles de generar unos anticuerpos que presentan una actividad antitumoral.

Según un modo de realización ventajoso de la invención, las células endoteliales de fenotipo angiogénico son sensibles a un tratamiento anti-angiogénico que inhibe la fosforilación del VEGF-R2 (véase la Figura 4).

La expresión "no protegidas de la apoptosis" significa que las células privadas de suero mueren al final de una sucesión de eventos que se traduce en la fragmentación de los núcleos. Este fenómeno se demuestra mediante el recuento de los núcleos celulares fragmentados según la técnica descrita por Gavrieli (Gavrielo et al., 1992).

La apoptosis se puede inducir, por ejemplo, mediante la privación de suero, o mediante cualquier otro medio conocido por el experto en la materia.

La expresión "tratamiento angiogénico" designa la puesta en presencia de las células con una sustancia que inicia un efecto angiogénico, en particular el VEGF.

Se verifica que las células endoteliales de fenotipo angiogénico son sensibles a un tratamiento angiogénico mediante el ensayo de proliferación.

Se verifica que las células endoteliales de fenotipo angiogénico están protegidas de la apoptosis por el VEGF mediante el ensayo de Gavrieli.

La presente invención se refiere a unas células endoteliales tal como se han definido anteriormente, caracterizadas porque son unas células endoteliales de vasos, en particular unas células endoteliales de aorta, de corteza suprarrenal, de piel, de cerebro, de vena o de arteria del cordón umbilical.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de células endoteliales de fenotipo angiogénico tal como se han definido anteriormente, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: incubar unas células endoteliales, en particular extraídas de una aorta en un medio que contiene estradiol y un factor de crecimiento, en particular el VEGF, con el fin de obtener unos clones de células endoteliales de fenotipo angiogénico,

-: extraer un clon con la ayuda de una micropipeta, entre los clones mencionados anteriormente de células endoteliales de fenotipo angiogénico, y cultivar este clon en un medio que contiene estradiol y VEGF hasta obtener la confluencia de las células,

-: seleccionar unas células endoteliales de fenotipo angiogénico mediante la verificación del fenotipo de las células obtenidas en la etapa anterior, con la ayuda de ensayos de proliferación, de migración o de angiogénesis in vitro.

La expresión "clones de células endoteliales de fenotipo angiogénico" designa un conjunto de células que responden a los criterios requeridos.

Después de la etapa de incubación, se extraen todos los clones, se ensayan mediante la angiogénesis in vitro y se seleccionan los que son "angiogénicos", es decir, los que forman unos tubos bajo la acción del VEGF.

La presente invención se refiere asimismo a un anticuerpo monoclonal dirigido contra las células endoteliales de fenotipo angiogénico tal como se han definido anteriormente y que inhibe la angiogénesis, susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento mencionado a continuación.

Mediante la expresión "anticuerpo capaz de inhibir la angiogénesis" se designa un anticuerpo dotado de una actividad anti-angiogénica tal como se ha definido anteriormente.

Según un modo de realización ventajoso de la presente invención, un anticuerpo monoclonal dirigido contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico de la invención presenta las siguientes características:

-: se une a la superficie de las células endoteliales de fenotipo angiogénico, y

-: reconoce un motivo presente exclusivamente en las células endoteliales de fenotipo angiogénico, en particular un receptor membranario.

Se verifica que el anticuerpo monoclonal dirigido contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico de la invención se une a la superficie de las células endoteliales de fenotipo angiogénico mediante el ensayo ELISA sobre células, o citometría, tal como se han definido en los ejemplos.

Se verifica que el anticuerpo monoclonal dirigido contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico de la invención reconoce un motivo presente exclusivamente en las células endoteliales de fenotipo angiogénico, en particular un receptor membranario mediante los mismos ensayos que los indicados anteriormente.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal dirigido contra las células angiogénicas tal como se ha definido anteriormente, y que inhibe la angiogénesis, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de células de fenotipo angiogénico tal como se han definido anteriormente,

-: fusionar unos mielomas de un animal y unos esplenocitos de un animal con el fin de obtener unos hibridomas,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: clonar unos hibridomas seleccionados de entre los obtenidos en la etapa anterior y que segregan unos anticuerpos contra las células de fenotipo angiogénico,

-: verificar las propiedades de inhibición de la angiogénesis de los anticuerpos mencionados anteriormente frente a unas células angiogénicas, en particular con la ayuda del ensayo de proliferación y/o de migración y/o de angiogénesis in vitro.

El animal usado para la etapa de inmunización es en particular el ratón o la rata.

Los mielomas usados para la fusión proceden en particular del ratón o de la rata.

Los esplenocitos usados para la fusión proceden de un animal de la misma especie que de la que proceden los mielomas, a saber, en particular el ratón o la rata.

Los hibridomas que segregan los anticuerpos contra las células de fenotipo angiogénico se seleccionan mediante ELISA o mediante citometría, y la función anti-angiogénica se identifica mediante un ensayo de proliferación y de angiogénesis in vitro.

La presente invención se refiere asimismo a unos anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra unos anticuerpos monoclonales tal como se han definido anteriormente, caracterizados porque son capaces de inhibir las funciones realizadas (inhibición de la angiogénesis) por dichos anticuerpos.

Estos anticuerpos imitan por lo tanto las estructuras de los receptores y se pueden considerar como unos receptores circulantes, y por lo tanto que funcionan como unos anticuerpos anti-ligandos. La ventaja está en la construcción de anticuerpos anti-ligandos sin que se conozca la naturaleza del ligando.

La presente invención se refiere asimismo a unos fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales, tal como se han definido anteriormente, siendo dichos fragmentos capaces de inhibir la angiogénesis.

Los fragmentos Fab se pueden obtener mediante la escisión de la cadena pesada de los anticuerpos, en particular mediante la papaína. Estos se unen por lo tanto a los receptores de la misma manera pero no los dimerizan, ejercen por lo tanto únicamente una actividad de bloqueo del receptor.

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de los anticuerpos anti-idiotípicos tal como se han definido anteriormente, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de anticuerpos monoclonales tal como se han definido anteriormente, a saber, unos anticuerpos anti-células angiogénicas,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: clonar los hibridomas seleccionados de entre los obtenidos en la etapa anterior y que segregan unos anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente usados para la inmunización, estando dichos anticuerpos monoclonales dirigidos contra las células de fenotipo angiogénico, y

-: verificar las propiedades de inhibición de los anticuerpos mencionados anteriormente frente a la función de activación o de inhibición de la angiogénesis de los anticuerpos tal como se han definido anteriormente, en particular con la ayuda del ensayo de proliferación y/o de migración y/o de angiogénesis in vitro.

Los hibridomas que segregan unos anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos monoclonales usados para la inmunización se seleccionan mediante ELISA usando los fragmentos Fab de los anticuerpos que sirvieron de inmunógeno como sustrato de la reacción.

La presente invención se refiere asimismo a unos anticuerpos anti-anti-idiotípicos dirigidos contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico tal como se han definido anteriormente, susceptibles de ser obtenidos según el procedimiento mencionado a continuación, caracterizados porque son capaces de inhibir la angiogénesis. Estando estos anticuerpos dirigidos contra un anticuerpo que imita un receptor, se comportan como unos imitadores del ligando. La ventaja es por lo tanto obtener unos imitadores del ligando, incluso sin conocer su estructura.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de los anticuerpos anti-anti-idiotípicos capaces de inhibir la angiogénesis dirigida contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico tal como se han definido anteriormente, caracterizado porque comprende las siguiente etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de anticuerpos monoclonales tal como se han definido anteriormente, a saber, unos anticuerpos anti-anticuerpos anti-células angiogénicas,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: clonar los hibridomas seleccionados de entre los obtenidos en la etapa anterior y que segregan unos anticuerpos anti-anti-idiotípicos dirigidos contra las células de fenotipo angiogénico, y

-: verificar las propiedades de inhibición o de activación de la angiogénesis de los anticuerpos anti-anti-idiotípicos mencionados anteriormente, en particular con la ayuda del ensayo de proliferación y/o de migración y/o de angiogénesis in vitro.

Los hibridomas que segregan unos anticuerpos anti-anti-idiotípicos dirigidos contra las células de fenotipo angiogénico se seleccionan mediante la medición de su unión a los fragmentos Fab del anticuerpo anti-idiotípico.

La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica, caracterizada porque contiene, a título de sustancia activa un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente, un fragmento Fab tal como se ha definido anteriormente, en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable, siendo dicha composición farmacéutica susceptible de ser administrada en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg/inyección.

La presente invención se refiere asimismo a una composición vacunal, caracterizada porque comprende a título de sustancia activa un anticuerpo monoclonal tal como se ha definido anteriormente, o unos fragmentos Fab tal como se han definido anteriormente, o un anticuerpo anti-anti-idiotípico tal como se ha definido anteriormente, en asociación con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere asimismo al uso de un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente, un fragmento Fab tal como se ha definido anteriormente o un anticuerpo anti-anti-idiotípico tal como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el ámbito de las patologías siguientes: los cánceres, la degeneración muscular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi.

La presente invención se refiere asimismo al uso de un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente, un fragmento Fab tal como se ha definido anteriormente, o un anticuerpo anti-anti-idiotípico tal como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el ámbito de las siguientes patologías: el rechazo de aloinjerto o de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el ámbito de la preparación de injertos entre la extracción y el transplante.

La expresión "inhibición de la activación endotelial" se puede determinar mediante un ensayo que mide la presencia en la superficie celular de un marcador de activación (en particular ICAM-1, V-CAM).

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Descripción de las figuras

Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D representan la morfología de dos fenotipos celulares en cultivo, a saber, las células endoteliales de aorta fetal bovina no angiogénicas (F/O) y las células endoteliales de aorta fetal bovina angiogénicas (F/V).

\quad: La Figura 1A corresponde a unas células F/O cultivadas en ausencia de VEGF

\quad: La Figura 1B corresponde a unas células F/O cultivadas en presencia de VEGF

\quad: La Figura 1C corresponde a unas células F/V cultivadas en ausencia de VEGF

\quad: La Figura 1D corresponde a unas células F/V cultivadas en presencia de VEGF

Se observa que el VEGF mantiene unos fenotipos angiogénicos distintos. Sólo las células F/V cambian de morfología bajo la acción del VEGF. Las células F/O son redondas y más grandes que las células F/V. La adición de VEGF no modifica la morfología de las células F/O. Las células F/V cultivadas sin ningún VEGF tienen una morfología próxima a la de las células F/O. En presencia de VEGF aparecen estiradas.

Las Figuras 2A, 2B y 2C representan el análisis de la expresión génica por transferencia de ARN (transferencia northern).

\quad: La Figura 2A corresponde a la comparación por transferencia de ARN de la expresión de VEGF-R2 (receptor 2 del VEGF) en las células F/O y F/V. Se usa como control la actina, cuya expresión no varía en las células F/O y F/V. Esta Figura demuestra que la expresión de VEGF-R2 está fuertemente aumentada en las células F/V con relación a las células F/O.

\quad: La Figura 2B corresponde a la comparación por transferencia de ARN de la expresión del colágeno-1 en las células F/O y F/V. Se usa como control la actina cuya expresión no varía en las células. Esta Figura demuestra que la expresión del colágeno-1 es mayor en las células F/O con relación a aquella en las células F/V.

\quad: La Figura 2C corresponde a la comparación por transferencia de ARN de la expresión de la fibronectina en las células F/O, F/V, BREC/O (células endoteliales no angiogénicas de retina) y BREC/V (células endoteliales angiogénicas de retina) (Hutchings et al., 2002). Se usa como control la actina cuya expresión no varía en las células. Esta Figura demuestra que la expresión de la fibronectina es mayor en las células F/O con relación a aquella en las células F/V. Al igual que para el VEGF-R2, no existe ninguna diferencia significativa de expresión de la fibronectina en las células BREC/V y BREC/O.

En todas estas figuras, la línea "ratio" corresponde a la relación entre la expresión del gen de interés en los dos tipos celulares.

Las Figuras 3A y 3B representan la angiogénesis in vitro sobre Matrigel (Becton Dickinson).

\quad: La Figura 3A representa la ausencia de formación de túbulos por las células F/O. Las células F/O siguen estando en una monocapa uniforme sobre el Matrigel.

\quad: La Figura 3B representa la formación de túbulos por las células F/V. Las células F/V se diferencian sobre Matrigel, se alinean una tras otra para reconstituir unos seudo-capilares.

La Figura 4 representa la sensibilidad de las células a unos agentes anti-angiogénicos particulares, que son: Me-2, FUMA y SU5416.

Las columnas blancas corresponden a las células endoteliales no angigénicas F/O, y las columnas negras corresponden a las células endoteliales angiogénicas F/V.

"ME-2" corresponde al metoxiestradiol; "FUMA" corresponde a la fumagilina; "SU5416" es un inhibidor de la actividad de quinasa del VEGF-R2.

Las células F/O y F/V son idénticamente sensibles a la fumagilina (FUMA) y al metoxiestradiol (ME-2). En cambio, las células F/V son mucho más sensibles que las células F/O al agente anti-angiogénico que interfiere con el VEGF-R2 (SU 5416).

\quad: Las Figuras 5A, 5B y 6 ilustran las funciones mitógenas de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra las células endoteliales angiogénicas. Algunos anticuerpos son anti-angiogénicos, es decir, capaces de inhibir sólo de manera específica la proliferación de las células endoteliales angiogénicas (denominados anticuerpos de tipo 3). Otros anticuerpos tienen una actividad pro-angiogénica frente a unas células endoteliales (denominados anticuerpos de tipo 5).

\quad: Las Figuras 5A y 5B muestran la acción anti-angiogénica de los anticuerpos de tipo 3. La Figura 5A se refiere en particular a la acción de los anticuerpos 3 sobre la proliferación de las células F/V de fenotipo angiogénico. La Figura 5B se refiere a la acción de los anticuerpos de tipo 3 sobre la proliferación de las células no angiogénicas F/O. El ensayo llevado a cabo es un ensayo de proliferación tal como se describe en los ejemplos. Las células se cultivan en DMEM suplementado con 5% de suero de ternera neonata al cual no se añade ningún factor angiogénico (condición 0), o se añaden 2 ng/ml de VEGF (condición VEGF), o 2 ng/ml de FGF-2 (condición FGF-2). El anticuerpo se añade al mismo tiempo que los factores angiogénicos, a unas concentraciones variables (0, 1, 3 ó 7 \mug/ml).

Las columnas blancas corresponden a la proliferación de las células sin ningún anticuerpo. Las columnas punteadas corresponden a la proliferación de las células en presencia de 1 \mug/ml de anticuerpo. Las columnas rayadas corresponden a la proliferación de las células en presencia de 3 \mug/ml de anticuerpos. Las columnas negras corresponden a la proliferación de las células en presencia de 7 \mug/ml de anticuerpos.

Se observa que los anticuerpos de tipo 3 inhiben de manera dependiente de la dosis la proliferación de las células F/V sin afectar a la de las células F/O.

Se observa que los anticuerpos de tipo 3 inhiben el efecto mitógeno del VEGF y del FGF-2 frente a unas células endoteliales angiogénicas.

\quad: La figura 6 muestra la acción pro-angiogénica de los anticuerpos de tipo 5. El ensayo llevado a cabo es un ensayo de proliferación tal como se describe en los ejemplos. Las células se cultivan en DMEM suplementado con 5% de suero de ternera neonata. El anticuerpo se añade al mismo tiempo que los factores angiogénicos, a unas concentraciones variables (0, 50 ó 100 \mug/ml).

Las columnas blancas corresponden a la proliferación relativa de las células F/O en presencia de concentraciones variables de anticuerpos de tipo 5. Las columnas negras corresponden a la proliferación relativa de las células F/V en presencia de concentraciones variables de anticuerpos de tipo 5.

Se observa que los anticuerpos de tipo 5 estimulan la proliferación de las células F/O. En cambio, no tienen ningún efecto sobre la proliferación de las células F/V.

La Figura 7 representa la función de los anticuerpos de tipo 3 en tumorogénesis.

La curva con los rombos negros corresponde a los ratones no tratados, y la curva con los cuadrados negros corresponde a los anticuerpos de tipo 3.

Esta Figura representa el volumen tumoral medio (6 ratones por grupo) en mm^{3} en función del tiempo (en días).

Se observa que los anticuerpos de tipo 3 son capaces de inhibir de manera significativa el desarrollo de melanomas B16F10 en el ratón C57BL/6.

\quad: Las Figuras 8A a 8H representan unos análisis por citometría de flujo para unas células F/V (FBAE V) (Figuras 8A a 8D) y para unas células F/O (FBAE O) (Figuras 8E a 8H), incubadas con diferentes anticuerpos. Las Figuras 8A y 8E corresponden al control negativo; las Figuras 8B y 8F corresponden al anticuerpo A definido a continuación; las Figuras 8C y 8B corresponden al anticuerpo B definido a continuación; las Figuras 8D y 8H corresponden al anticuerpo C definido a continuación.

Las Figuras 9A a 9H representan unos análisis por citometría de flujo para unas células RPE V (Figuras 9A a 9D) y para unas células RPE O (Figuras 9E a 9H), incubadas con diferentes anticuerpos. Las Figuras 9A y 9E corresponden al control negativo; las Figuras 9B y 9F corresponden al anticuerpo A definido a continuación; las Figuras 9C y 9G corresponden al anticuerpo B definido a continuación; las Figuras 9D y 9H corresponden al anticuerpo C definido a continuación.

Las Figuras 10A, 10B y 10C corresponden a unos resultados de inmunohistoquímica de secciones de glioblastomas. La Figura 10A corresponde a un glioblastoma incubado con un anticuerpo que reconoce las células musculares lisas de los vasos ("SM actina"). La Figura 10B corresponde a un glioblastoma incubado con un anticuerpo comercial que reconoce las células endoteliales (Anticuerpo anti-CD 31) (DAKO). La Figura 10C corresponde a un glioblastoma incubado con un anticuerpo que reconoce el anticuerpo C definido a continuación.

La Figura 11 corresponde a una transferencia de ARN, usando las sondas que corresponden al fragmento 74/1268 de la secuencia AF063658 (Genbank) para el VEGF-R2, al fragmento 4155/4624 de la secuencia AB008683 (Genbank) para el colágeno-1 y al fragmento 380/847 de la secuencia M10905 (Genbank) para la fibronectina, a la secuencia AK024691 de la netrina 4, la secuencia AK025662 para Sck, la secuencia K85799 para Tus-4/EPV20/.

Material y métodos 1. Establecimiento de los clones de diferentes fenotipos

Las células endoteliales de aorta fetal de ternera (FBAE o F) se extraen mecánicamente a partir de la luz aórtica con la ayuda de un raspador, y se incuban sobre unas cápsulas de cultivo previamente recubiertas de gelatina o de colágeno I (10 \mug/ml) preparado según el párrafo "angiogénesis in vitro" (0,2% en PBS, durante 24 h a 4ºC) en un medio DMEM que contiene 10% de suero de ternera neonata (SVNN). Las cápsulas se suplementan con estradiol (10-9 M) y con 1 ng/ml de VEGF (F/V) o se cultivan sin estrógeno ni VEGF (F/O). El medio se cambia después de 4 días. Entre 6 y 10 días, se aíslan los clones de cada uno de los cultivos. Para eso, los clones visualizados con microscopio como unos focos de 100 a 1000 células se aspiran con la ayuda de una micropipeta y se transfieren a unos pocillos de 2 cm^{2}. Cada uno de los clones se cultiva en el medio correspondiente (estradiol + VEGF para las células F/V; sin estradiol ni VEGF para las células F/O), y después cuando se obtiene la confluencia (aproximadamente 6 días para las F/V, 15 días para las F/O) se tripsinan las monocapas y se vuelven a inocular en unas cápsulas de 5 cm de diámetro. Cuando se obtiene la confluencia, se tripsinan entonces las células, se congela una fracción alícuota, y después se inicia la validación del clon (determinación de la respuesta al VEGF en uno de los siguientes ensayos: migración, proliferación, angiogénesis).

Factores usados

Se produce el VEGF (isoforma de 165 aminoácidos) mediante la infección de las células de insecto SF9 por un baculovirus recombinante que contiene el ADNc correspondiente (Plouët et al., 1997).

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2. Técnica de estudio in vitro: validación de los clones Migración

La técnica ha sido descrita anteriormente por Jonca et al. (1997).

Proliferación

Se inoculan unas placas de 12 pocillos a baja densidad (5.000 a 10.000 células/pocillo), en un medio DMEM con 8% de suero. Después de 24 horas, la proliferación de las células se estimula mediante la adición de un intervalo de factor de crecimiento, de medicamentos anti-angiogénicos (metoxiestradiol, fumagilina, SU5416 dirigido contra el VEGF-R2 - Plouët et al., 2001) o de anticuerpos de la presente invención. Las células se vuelven a estimular después de 48 horas, y al final de un total de cinco días de cultivo las células se tripsinan y se recuentan con un contador Coulter.

Angiogénesis in vitro

Se han despellejado y disecado cuatro colas de rata para recuperar los haces blancos que están constituidos en gran parte de colágeno de tipo I. El colágeno se extrae de estas fibras en 50 ml de ácido acético 0,5 M frío y se agita durante una noche. Después, el líquido se centrifuga a 5.000 g durante 40 minutos, y se recupera el sobrenadante. Se vuelve a extraer una vez con 20 ml de ácido acético, los sobrenadantes se mezclan y después se dializan contra 1 l de ácido acético 0,2M. La concentración de colágeno se ajusta a 3 mg/ml mediante pesada.

La preparación de los geles para la angiogénesis in vitro se lleva a cabo sobre hielo para conservar la disolución de colágeno en forma líquida. Se mezcla 1 ml de colágeno (5 mg/ml) con 0,5 ml de DMEM 10X (que contiene una concentración 10X de antibióticos y de glutamina), 0,9 ml de H_{2}O estéril y 0,1 ml de bicarbonato de sodio 1M. Cuando el pH está ajustado a 7,4, se añade un volumen igual de matrigel (Becton Dickinson).

Se vierte el gel en unos pocillos de cultivo (2 mm de grosor) y se incuba a 37ºC para solidificarlo. Se añaden las células después de 15 minutos (100.000 células/cm^{2}) sobre la superficie del gel. Después de 2 horas, se añaden los diferentes factores solubles y las células se observan y se fotografían después de 24 horas.

Transferencia de ARN (transferencia northern)

Las células F/O o F/V se cultivan en medio DMEM que contiene 10% de SVNN hasta la semi-confluencia. Después, las células se tripsinan y se centrifugan. Se extraen los ARN con la ayuda de una disolución de TRIZOL (Invitrogen). Se separan 2 \mug de ARN poli A+ mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (p/vol) en condiciones desnaturalizantes, se transfieren sobre membrana de nylon (Hybond N Amersham) y se fijan bajo UV (0,5 J/cm^{2}) según la técnica descrita por Sambrook et al., 1989. La hibridación se realiza a 42ºC en el siguiente medio de reacción: 50% de formamida, 5X Denhardt's y 0,5% de SDS (p/vol), que contiene 0,2% de ADN de esperma de arenque y 1 ng/ml de sonda radioactiva (actividad específica comprendida entre 10^{8} y 10^{9} cpm/\mug) marcada con 32P con la ayuda del kit Megaprime^{TM} DNA labelling systems (Amersham). Se realizan los lavados a 45ºC en SSPE 0,2X que contiene 0,1% de SDS.

Las sondas usadas corresponden al fragmento 74/1268 de la secuencia AF063658 (Genbank) para el VEGF-R2, al fragmento 4155/4624 de la secuencia AB008683 (Genbank) para el colágeno-1 y al fragmento 380/847 de la secuencia M10905 (Genbank) para la fibronectina, a la secuencia AK024691 de la netrina 4, la secuencia AK 025662 para Sck, la secuencia X85799 para Tus-4/EPV20/.

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3. Producción de anticuerpos monoclonales específicos del fenotipo FBAE V Inmunización sustractiva de los ratones por las células FBAE

Cinco ratones Balbc de 6 semanas de edad se inmunizan mediante la inyección de 200 \mul que contiene 2 X 10^{6} células F/O. Veinte y cuatro y cuarenta y ocho horas después, los ratones reciben 200 mg/kg de peso corporal de ciclofosfamida con el fin de destruir los linfocitos activos y hacer así que los ratones sean tolerantes al endotelio de fenotipo no angiogénico. Quince días después, los ratones reciben una inyección de 2 X 10^{6} células F/V. La operación se repite al día 30 y al día 45. Las inyecciones se llevaron a cabo por vía intraperitoneal. La evaluación de la respuesta de cada ratón a la inmunización se lleva a cabo mediante citometría de flujo a partir de una muestra de suero.

Fusión

La técnica usada para la realización de los hibridomas deriva de la que han llevado a cabo Kohler y Milstein (1975).

La víspera de la fusión, es decir a D47, cinco ratones Balbc no-inmunizados se sacrifican para la obtención de los macrófagos que sirven de células alimentadoras a los hibridomas. Los macrófagos se recuperan mediante la inyección de 8 ml de medio de cultivo ISCOVE en el peritoneo de los ratones. El medio se aspira y se devuelve 2 veces en la cavidad peritoneal y después se recupera y se centrifuga. Después de la centrifugación, los macrófagos se recogen en un medio ISCOVE que contiene 20% de suero de ternera fetal (Biochrom, lote 5612). Después, estas células se distribuyen en 20 placas de 96 pocillos en una cantidad de 100 \mul por pocillo (aproximadamente 3 X 10^{4} células/pocillo).

Al día siguiente, es decir a D48, se sacrifican los ratones que presentan los títulos más elevados de anticuerpos dirigidos contra las células F/V. Se extraen sus bazos y se dilaceran en un medio ISCOVE para liberar los esplenocitos. Se aparta el tejido conjuntivo, y los esplenocitos se centrifugan y se recuentan. En paralelo, se cultivo la línea de mieloma de ratón Ag8X63 durante 10 días en un medio ISCOVE (Invitrogen) con 20% de suero Myoclone (Invitrogen). Estas células se lavan y se recuentan.

Los dos tipos celulares, esplenocitos y mielomas, se mezclan con el fin de obtener una relación de 1 célula de mieloma Ag8X63 (Kearney et al., 1979) por 6 esplenocitos. La fusión se lleva a cabo mediante adición de 20 veces 50 \mul de polietilenglicol (PEG) a intervalos de 30 segundos. Se añaden entonces gota a gota a la suspensión celular cuatro ml de medio ISCOVE precalentado a 37ºC, y después de un periodo de incubación de 4 minutos a 37ºC se añaden 4 ml. La suspensión se centrifuga, y después el residuo celular se recoge en 100 ml de medio ISCOVE complementado con 20% de suero de ternera fetal y del medio selectivo HAT 1X (50X: Hipoxantina 5 mM, Aminopterina 20 \muM y Timidina 0,8 mM) que permite la eliminación de los esplenocitos y de las células de mieloma. La suspensión se distribuye entonces en una cantidad de 100 \mul por pocillo sobre los macrófagos (aproximadamente 100.000 células).

Después de 5 días, se añaden 100 \mul de medio HAT, y entre 8 y 14 días el medio acondicionado de cada hibridoma se recoge para medir los anticuerpos dirigidos contra las células endoteliales de diferentes fenotipos mediante ELISA.

Se clonan entonces los hibridomas seleccionados por su capacidad para segregar unos anticuerpos dirigidos contra las células F/O o F/V (primera clonación), es decir, que las células se inoculan en condición de dilución límite (5 células/ml) en un volumen de 0,1 ml por pocillo. El medio (ISCOVE suplementado con suero y con HAT) se cambia después de 10 días. Tras 15 días, algunos pocillos contienen unos focos de células que se han multiplicado a partir de la célula inoculada al principio, por lo tanto todas estas células son idénticas y proceden del mismo clon. Cuando la superficie ocupada por las células representa por lo menos la mitad de la superficie total del pocillo, se extrae el medio y se analiza como anteriormente. En esta etapa, se pueden seleccionar los clones productores de anticuerpos y conocer su especificidad para las células F/O o F/V (segunda clonación).

Cuando los clones se identificaron, se afirmó su naturaleza monoclonal mediante la operación habitual que consiste en inocular una placa de 96 pocillos con unas células que proceden del mismo clon diluidas en unas condiciones límites tal como anteriormente. Los clones segregantes deben por lo tanto segregar todos un anticuerpo de misma la especificidad frente a unas células F/V con relación a las células F/O (cribado mediante ELISA) para que este anticuerpo sea declarado monoclonal.

Se efectúa entonces una tercera clonación para asegurarse de que los clones son realmente monoclonales en unas condiciones idénticas a las indicadas anteriormente.

Método de cribado de los clones

El cribado del suero extraído y de los sobrenadantes de los hibridomas se lleva a cabo mediante ELISA y citometría de flujo.

ELISA

Se inoculan 15.000 células F/O o F/V por pocillo en unas placas de 96 pocillos (100 \mul/pocillo) en un medio DMEM que contiene 10% de suero de ternera neonata. Después de 36h, las células sub-confluentes se aclaran 3 veces en una disolución de PBS que contiene 0,005% de Tween 20. Los sitios potenciales de unión no específicos de los anticuerpos son saturados mediante la incubación en una disolución de glicina 1M, pH 8,1 (2 h a temperatura ambiente) seguido de 3 lavados (PBS/Tween 0,05%) y de una incubación de una noche a 4ºC en una disolución de IgG irrelevante a 10 \mug/ml en PBS. La disolución de bloqueo se elimina, y después se añaden los anticuerpos a ensayar. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, las células se lavan 3 veces en PBS/Tween 0,05% para eliminar los anticuerpos no fijados. Los complejos células-anticuerpos se incuban durante 1 hora en presencia de un anticuerpo secundario anti-ratón acoplado con la peroxidasa (Amersham NA 931) diluido al 1/4.000 en PBS que contiene 0,05% de Tween y 0,5% de BSA. Tras 3 lavados (PBS/Tween 0,05%), se añade el sustrato de la peroxidasa (OPD Sigma) en una cantidad de 100 \mul/pocillo. Después de 10 a 30 minutos de incubación protegida de la luz, la reacción colorimétrica se detiene mediante adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4}M. La intensidad de la señal se mide mediante espectrofotometría a 490 nm.

Citometría

El sobrenadante (o el suero) a ensayar se incuba con unas células F/O, F/V, RPE/O o unas células RPE/V durante 45 minutos. Después, las células se lavan 3 veces en PBS-BSA 0,02%. Un segundo anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado con el isotiocianato de fluoresceína se añade a las células (F-877, Sigma Immuno Chemicals). La intensidad de fluorescencia de las células se mide mediante citometría de flujo y se compara entre las células F/O y F/V. La intensidad de fluorescencia se mide en un citómetro de flujo ELITE.

Isotipaje

La caracterización isotópica de cada clon se mide con la ayuda de un ensayo rápido de isotipaje de los anticuerpos murinos MABTEST (Adiatec).

Tumorogénesis

Se inyectan 200.000 células de melanoma B16 a unos ratones C57. Ocho días después, cuando los tumores crean unos nódulos palpables, se inyectan los anticuerpos 2 veces por semana por vía intraperitoneal a la dosis de 50 \mug diluida en 200 \mul de PBS. El volumen del tumor se mide 2 veces por semana con un calibrador y se expresa mediante la fórmula V= 1/2 x L X l^{2} (designando L y l la dimensión más grande y la más pequeña respectivamente).

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4. Producción de anticuerpos anti-idiotípicos

Se inyectan por vía sub-cutánea a unos ratones 10 \mug de un anticuerpo monoclonal dirigido contra las células endoteliales no angiogénicas, obteniéndose dicho anticuerpo monoclonal según el procedimiento descrito en el párrafo anterior, en asociación con 100 \mul de adyuvante de Freund (Sigma), siendo el anticuerpo purificado según unos métodos habituales mediante precipitación con sulfato de amonio y después por cromatografía de intercambio de iones.

La inyección se repite 15, 30 y 45 días después.

Cincuenta y cinco días después de la primera inyección se inyectan a unos ratones 10 \mug del mismo anticuerpo por vía intraperitoneal. Cincuenta y ocho días después, los ratones se sacrifican, y sus bazos son extraídos y dilacerados en un medio ISCOVE para liberar los esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan con unas células de mieloma de ratón, en particular unas células AG8X 63 (Kearney et al., 1979) y se incuban en una cantidad de 100.000 células/pocillo.

La fusión se lleva a cabo mediante adición de 20 veces 50 \mul de polietilenglicol (PEG) a intervalos de 30 segundos. Se añaden entonces gota a gota a la suspensión celular 4 ml de medio ISCOVE precalentado a 37ºC, y después de un periodo de incubación de 4 minutos a 37ºC se añaden 4 ml. La suspensión se centrifuga, y después el residuo celular se recoge en 100 ml de medio ISCOVE complementado con 20% de suero de ternera fetal y HAT 1X (50X: hipoxantina 5 mM, aminopterina 20 \muM y timidina 0,8 mM) y se distribuye en una cantidad de 100 \mul por pocillo sobre los macrófagos.

Después de 5 días se añaden 100 \mul de medio HAT, y entre 8 a 14 días el medio acondicionado de cada hibridoma se extrae para medir los anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos que hayan servido de agentes inmunógenos, es decir, dirigidos contra unas células endoteliales.

Los hibridomas seleccionados por su capacidad para segregar unos anticuerpos dirigidos contra unos anticuerpos monoclonales dirigidos ellos mismos contra unas células F/O o F/V se clonan entonces (primera clonación), es decir, las células se inoculan en condición de dilución límite (5 células/ml) en un volumen de 0,1 ml por pocillo. El medio de cultivo HAT se cambia después de 10 días. Después de 15 días, algunos pocillos contienen unos focos de células que se han multiplicado a partir de la célula inoculada al principio, por lo tanto todas estas células son idénticas y proceden del mismo clon. Cuando la superficie ocupada por las células representa por lo menos la mitad de la superficie total del pocillo, el medio se extrae y se analiza como anteriormente mediante ELISA. En esta etapa se pueden seleccionar los clones productores de anticuerpos y conocer su especificidad para los anticuerpos monoclonales dirigidos contra las células F/O o F/V (segunda clonación).

Cuando los clones se identificaron, se afirmó su naturaleza monoclonal mediante la operación habitual que consiste en inocular una placa de 96 pocillos con unas células que proceden del mismo clon diluidas en condiciones límites tal como anteriormente. Los clones segregantes deben por lo tanto segregar todos un anticuerpo de la misma especificidad para que este anticuerpo sea declarado monoclonal.

Se efectúa entonces una tercera clonación para asegurarse que los clones son realmente monoclonales en las condiciones idénticas a las definidas anteriormente.

Los anticuerpos anti-idiotípicos se criban mediante una serie de ensayos, en particular mediante un ensayo ELISA anti-idiotípico: los anticuerpos dirigidos contra las células endoteliales de la invención se colocan en un tampón de carbonato 50 mM pH 9 a una dilución de 10 \mug/ml. Después, la superficie de los pocillos se incuba con suero de albumina al 0,5%. Los sobrenadantes de hibridomas se incuban a continuación en las cápsulas y se revela su presencia mediante los anticuerpos anti-inmunoglobulinas de ratón conjugados con peroxidasa.

Se verifica asimismo que los anticuerpos anti-idiotípicos inhiben la función de los anticuerpos monoclonales contra los cuales están dirigidos frente a unas células endoteliales, que inhiben en particular la proliferación de las células F/V incubadas con ng/ml y 20 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-células endoteliales angiogénicas o no.

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5. Producción de anticuerpos anti-anti-idiotípicos

Se inyectan por vía subcutánea a unos ratones 10 \mug de un anticuerpo anti-idiotípico, tal como se obtiene según el procedimiento descrito en el párrafo anterior, en asociación con 100 \mul de adyuvante de Freund.

La inyección se repite 15, 30 y 45 días después.

Cincuenta y cinco días después de la primera inyección, se inyectan a unos ratones 10 mg de anticuerpos anti-idiotípicos por vía intraperitoneal. Cincuenta y ocho días después se sacrifican los ratones y sus bazos son extraídos y dilacerados en un medio ISCOVE para liberar los esplenocitos. Los esplenocitos son fusionados con unas células de mieloma de ratón, en particular unas células AG8X 63, y se incuban en una cantidad de 100.000 células/pocillo.

La fusión se lleva a cabo mediante la adición de 20 veces 50 \mul de polietilenglicol (PEG) a intervalos de 30 segundos. Se añaden entonces gota a gota a la suspensión celular cuatro ml de medio ISCOVE precalentado a 37ºC, y después de un periodo de incubación de 4 minutos a 37ºC se añaden 4 ml. La suspensión se centrifuga, y después el residuo celular se recoge en 100 ml de medio ISCOVE complementado con 20% de suero de ternera fetal y HAT 1 X (50X: hipoxantina 5 mM, aminopterina 20 \muM y timidina 0,8 mM) y se distribuye en una cantidad de 100 \mul por pocillo sobre los macrófagos.

Después de 5 días, se añaden 100 \mul de medio HAT, y entre 8 y 14 días el medio acondicionado de cada hibridoma se extrae para medir los anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos anti-idiotípicos.

Los hibridomas seleccionados por su capacidad para segregar unos anticuerpos dirigidos contra unos anticuerpos anti-idiotípicos se clonan entonces (primera clonación), es decir, las células se inoculan en condición de dilución límite (5 células/ml) en un volumen de 0,1 ml por pocillo. El medio de cultivo ISCOVE que contiene 20% de suero y HAT se cambia tras 10 días. Después de 15 días, algunos de los pocillos contienen unos focos de células que se han multiplicado a partir de la célula inoculada al principio, por lo tanto todas estas células son idénticas y proceden del mismo clon. Cuando la superficie ocupada por las células representa por lo menos la mitad de la superficie total del pocillo, el medio se extrae y se analiza como anteriormente mediante ELISA. En esta etapa se pueden seleccionar los clones productores de anticuerpos y conocer su especificidad para los anticuerpos anti-idiotípicos (segunda
clonación).

Cuando los clones se identificaron, se confirmó su naturaleza monoclonal mediante la operación habitual que consiste en inocular una placa de 96 pocillos con unas células que proceden del mismo clon diluidas en condiciones límites tal como anteriormente. Los clones segregantes deben por lo tanto segregar todos un anticuerpo de la misma especificidad para que este anticuerpo sea declarado monoclonal.

Se efectúa entonces una tercera clonación para asegurarse de que los clones son realmente monoclonales idénticos a los descritos anteriormente.

Los anticuerpos anti-anti-idiotípicos se criban mediante una serie de ensayos, en particular mediante un ensayo ELISA anti-idiotípico: los anticuerpos anti-idiotípicos tales como se obtienen anteriormente se colocan en un tampón de carbonato 50 mM pH 9 a una dilución de 10 \mug/ml. Después, la superficie de los pocillos se incuba con seroalbumina al 0,5%. Los sobrenadantes de hibridomas se incuban a continuación en las cápsulas y se revela su presencia mediante los anticuerpos anti-inmunoglobulinas de ratón conjugados con peroxidasa.

Se verifica asimismo que los anticuerpos anti-anti-idiotípicos se unen a las células endoteliales angiogénicas o no angiogénicas, según los mismos ensayos que los descritos en el párrafo 3.

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6. Inmnohistoquímica de cortes de glioblastoma

El glioblastoma es un tumor maligno del cerebro cuya característica principal es que está extremadamente vascularizado. Cortes clasificados de trozos de glioblastomas retirados durante operaciones quirúrgicas se incubaron con unos anticuerpos que reconocen las células del músculo lisas de los vasos (SM actina) (Figura 10A) o las células endoteliales (anti-CD 31) (Figura 10B) o el anticuerpo C definido anteriormente (Figura 10C).

Se desparafinan unos cortes de 3 \mum de grosor de glioblastomas.

Después, los sitios antigénicos se exponen de la siguiente manera: se efectúan 2 pasadas de 5 minutos de dichos cortes en el microondas (potencia máxima) en Tp citrato 10 mM pH 6,0 (citrato trisódico C_{6}H_{5}Na_{3}O_{7}, 2H_{2}O PM 294,10) y se deja enfriar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se dejan reposar en PBS 1X.

El tampón de citrato 10 mM se obtiene como según lo siguiente: se mezclan 5,9 g de citrato trisódico y agua (c.s. 2l) y después el pH se ajusta a 6 con ácido cítrico en polvo.

Los sitios no específicos se bloquean añadiendo a los cortes mencionados anteriormente un suero bloqueante prediluido (suero de caballo al 2,5%) durante 20 minutos. A continuación, el exceso de suero se elimina mediante aclarado en PBS durante 5 minutos.

Los cortes se incuban durante 30 minutos con diferentes anticuerpos (diluidos en PBS que contiene 0,1% de BSA) a temperatura ambiente, en cámara húmeda, y se aclaran con PBS durante 5 minutos.

Se lleva a cabo una incubación suplementaria con el anticuerpo secundario biotinilado universal prediluido durante 30 minutos (KIT VECTASTAIN Elite UNIVERSAL RTU).

El conjunto así obtenido se incuba con el complejo Elite ABC avidina-biotina-peroxidasa durante 30 minutos, y después se efectúa un aclarado con PBS durante 5 minutos.

La incubación se lleva a cabo con el agente reactivo AEC listo para usar (Dako K3464) durante 10 minutos, seguido del aclarado con agua destilada.

Después, se efectúa un contra-tinción con hematoxilina de Mayer durante 2 minutos y se aclara con agua amoniacal (2,5/1.000) y después con agua destilada.

El portaobjeto se incuba después con un líquido de montaje acuoso (Dako Paramount S3025) y se deposita un vidrio cubreobjetos.

Resultados I. Determinación de los fenotipos de las células F/O y F/V Morfología

El fenotipo de las cepas F/O y F/V se mantiene mediante la adicción de VEGF en el medio de cultivo a largo plazo. Cuando se retira el VEGF (caso de ausencia de VEGF), la morfología de cada una de las cepas es diferente: monocapa regular pavimentosa en confluencia para F/V, las F/O son unas células más grandes y redondeadas.

Cuatro horas después de la adición del VEGF, sólo las células F/V sufren un cambio de morfología: las células se alargan, creciendo el espacio intercelular (véanse las Figuras 1C y 1D). En cambio, las células F/O no cambian de forma (Figuras 1A y 1B).

Expresión de los genes

La expresión de VEGFR-2 y del colágeno I en las células F/O y F/V se estudió mediante transferencia Northern. Parece que la expresión de VEGFR-2 está aumentada de 4 veces en las células F/V con relación a F/O. En cambio, la expresión de VEGFR-2 es idéntica en BREC/O y BREC/V (Hutchings et al., 2002).

Además, se comparó la expresión de otros genes en las parejas O y V de las células endoteliales retinianas bovinas (BREC) y de células endoteliales fetales bovinas (F) (véase la Figura 2C).

Por ejemplo, la fibronectina parece más expresada por las células F/O que por las células F/V (relación 3, 5) mientras que su expresión es similar en las células BREC/O y BREC/V.

Por ejemplo, las secuencias AK024691, AK 025662 y X85799 están respectivamente 4, 12 y 2,5 veces más expresadas en las células F/V que en las células F/O.

Angiogénesis in vitro en respuesta al VEGF

Las células F/O o F/V inoculadas sobre un gel de colágeno-matrigel se incuban con 50 ng/ml de VEGF, y se examina su morfología 24 horas después. Las células F/V estimuladas por el VEGF se organizan en haces que comprenden una fila de 3-4 células, y después en estructuras tubulares tal como lo muestra la Figura 3B. En cambio, las células F/O siguen dispuestas en agrupamientos, sean estimuladas o no por el VEGF (Figura 3A).

Respuesta a los tratamientos anti-angiogénicos

Las células F/V son sensibles a la acción mitógena del VEGF (ED 50 = 0,3 ng/ml) mientras que las células F/O no proliferan bajo la acción del VEGF.

Las células F/O y F/V se inoculan a baja densidad (5.000) tal como se indica, y se inoculan tres fármacos separadamente, de los cuales 2 son de mecanismo desconocido (metoxiestradiol-ME-2 y fumagilina - FUMA), y 1 que interfiere con el VEGF-R2 (SU 5416) que inhibe la actividad de quinasa. Parece que las células F/O y F/V son igualmente sensibles a la fumagilina y al metoxiestradiol (Figura 4), mientras que las células F/V son más sensibles al SU 5416. Parece que la IC50 de estos 2 compuestos se multiplica por 20 y 50 respectivamente para las células F/O.

Así pues el uso de estas células permite llevar a cabo un cribado de medicamentos anti-angiogénicos que no afectan a las células endoteliales de los vasos sanos, no angiogénicos.

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II. Producción de anticuerpos monoclonales específicos del fenotipo angiogénico Reconocimiento específico de las células F/V

Se efectuaron 4 fusiones y se obtuvieron 426 hibridomas. Después de un cribado mediante ELISA, se subclonaron 15 clones y se analizaron 1.026 clones, de los cuales 6 se seleccionaron mediante ELISA, correspondiendo a unos anticuerpos monoclonales que se unen a F/O o F/V. La verificación de la especificidad de estos anticuerpos monoclonales se efectuó mediante citometría de flujo.

Parece que algunos anticuerpos se unen selectivamente a las células F/V o a las células F/O (véase la tabla a continuación y la figura 8 que representa el análisis de la especificidad de los anticuerpos por citometría de flujo).

La tabla a continuación indica los porcentajes de células reconocidas por los diferentes tipos de anticuerpos.

1

Se pueden distinguir 3 tipos de anticuerpos:

: Marcaje F/O > F/V: tipo A

: Marcaje F/V > F/O: tipo B

: Marcaje F/O ausente: tipo C

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El anticuerpo A marca preferentemente las células F/O (Figura 8F) y RPE O (Figura 9F).

El anticuerpo B marca preferentemente las células F/V (Figura 8C), y no reconoce las RPE O y RPE V.

El anticuerpo C marca exclusivamente las células F/V (Figura 8D) y no las células F/O (Figura 8H), y no reconoce las RPE O y RPE V.

Proliferación

El estudio de la función mitógena de los anticuerpos permite clasificarlos en 2 categorías: los anticuerpos de tipo 3 inhiben la proliferación de las células F/V sin afectar a la de las células F/O (Figuras 5A y 5B), y los anticuerpos de tipo 5 estimulan la proliferación de las células F/O sin afectar a la de las células F/V (Figura 6).

Tumorogénesis

La figura 7 muestra que la inyección de los anticuerpos de tipo B reduce el volumen del tumor en cada tiempo de observación. La siguiente tabla muestra las medias y las desviaciones estándares de los volúmenes de los tumores observados a 20 días. Se deduce que el anticuerpo de tipo A no tiene ningún efecto sobre la tumorogénesis, lo que está de acuerdo con los resultados de citometría de flujo que demuestran que este anticuerpo no se une a las células angiogénicas.

En cambio, los anticuerpos de tipo B y C que reconocen las células de fenotipo angiogénico por citometría de flujo inhiben el crecimiento tumoral.

2

III. Inmunohistoquímica de cortes de glioblastoma

Las figuras 10A, 10B y 10C muestran

-: un marcaje con el anticuerpo anti-actina ("smooth muscle cell actin"): marcaje de todas las células perivasculares musculares lisas;

-: un marcaje con el anticuerpo anti-CD 31: marcaje de todas las células endoteliales; y

-: un marcaje con el anticuerpo C: marcaje de cualquier célula endotelial tumoral.

Por otro lado, nunca se detectó un marcaje con el anticuerpo C en unos cortes de tejido sano (cerebro, pulmón, corazón, riñón, hígado).

En conclusión, el anticuerpo mencionado anteriormente es por lo tanto específico de las células del fenotipo angiogénico y no reconoce las células de fenotipo no angiogénico.

Referencias

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Claims

1. Células endoteliales de fenotipo angiogénico, que presentan las siguientes propiedades:

-: forman unos tubos cuando se ponen en presencia del factor de crecimiento VEGF en un gel de colágeno,

-: proliferan bajo la acción del VEGF,

-: están protegidas de la apoptosis por el VEGF, y

-: su expresión de VEGF-R2 es 4 veces superior a la de las células correspondientes de fenotipo no angiogénico, y

caracterizadas porque son susceptibles de generar unos anticuerpos que presentan una actividad anti-tumoral.

2. Células endoteliales según la reivindicación 1, caracterizadas porque son unas células endoteliales de vasos, en particular unas células endoteliales de aorta, de corteza suprarrenal, de piel, de cerebro, de vena o de arteria del cordón umbilical.

3. Procedimiento de preparación de células endoteliales de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: incubar unas células endoteliales, en particular extraídas de una aorta en un medio que contiene estradiol y VEGF, con el fin de obtener unos clones de células endoteliales de fenotipo angiogénico,

-: extraer un clon con la ayuda de una micropipeta, entre los clones mencionados anteriormente, de células endoteliales de fenotipo angiogénico, y cultivar este clon en un medio que contiene estradiol y VEGF hasta obtener la confluencia de las células,

-: seleccionar unas células endoteliales de fenotipo angiogénico, mediante verificación del fenotipo de las células obtenidas en la etapa anterior, con la ayuda de ensayos de proliferación, de migración o de angiogénesis in vitro.

4. Procedimiento de preparación de un anticuerpo monoclonal dirigido contra las células endoteliales de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1, y que inhibe la angiogénesis, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de células de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: clonar los hibridomas seleccionados de entre los obtenidos en la etapa anterior y que segregan unos anticuerpos contra las células de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1,

5. Anticuerpo monoclonal dirigido contra las células endoteliales de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1, y que inhibe la angiogénesis, susceptible de ser obtenido según el procedimiento de la reivindicación 4.

6. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5, que presenta las siguientes características:

7. Anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra unos anticuerpos monoclonales según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizados porque son capaces de inhibir las funciones ejercidas (inhibición de la angiogénesis) por dichos anticuerpos.

8. Fragmentos Fab de los anticuerpos monoclonales según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, siendo dichos fragmentos capaces de inhibir la angiogénesis.

9. Procedimiento de preparación de los anticuerpos anti-idiotípicos según la reivindicación 7, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de anticuerpos monoclonales según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: clonar los hibridomas seleccionados de entre los obtenidos en la etapa anterior y que segregan unos anticuerpos dirigidos contra los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente, usados para la inmunización, siendo dichos anticuerpos monoclonales dirigidos contra las células de fenotipo angiogénico, y

-: verificar las propiedades de inhibición de los anticuerpos mencionados anteriormente frente a la función de inhibición de la angiogénesis de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en particular con la ayuda del ensayo de proliferación y/o de migración y/o de angiogénesis in vitro.

10. Procedimiento de preparación de los anticuerpos anti-anti-idiotípicos capaces de inhibir la angiogénesis dirigidos contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-: inmunizar un animal mediante la inyección de anticuerpos anti-idiotípicos según la reivindicación 7,

-: cultivar los hibridomas así obtenidos,

-: verificar las propiedades de inhibición de la angiogénesis de los anticuerpos anti-anti-idiotípicos mencionados anteriormente, en particular con la ayuda del ensayo de proliferación y/o de migración y/o de angiogénesis in vitro.

11. Anticuerpos anti-anti-idiotípicos dirigidos contra unas células endoteliales de fenotipo angiogénico según la reivindicación 1, susceptibles de ser obtenidos según el procedimiento de la reivindicación 10, caracterizados porque son capaces de inhibir la angiogénesis.

12. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene, a título de sustancia activa, un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo según una de las reivindicaciones 5 ó 6, un fragmento Fab según la reivindicación 8, en asociación con un vector farmacéuticamente aceptable, siendo dicha composición farmacéutica susceptible de ser administrada en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg/inyección.

13. Composición vacunal, caracterizada porque comprende, a título de sustancia activa, un anticuerpo monoclonal según una de las reivindicaciones 5 ó 6, o unos fragmentos Fab según la reivindicación 8, o un anticuerpo anti-anti-idiotípico según la reivindicación 11, en asociación con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

14. Uso de un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo según una de las reivindicaciones 5 ó 6, un fragmento Fab según la reivindicación 8, o un anticuerpo anti-anti-idiotípico según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la proliferación endotelial, en particular en el ámbito de las siguientes patologías: los cánceres, la degeneración muscular relacionada con la edad, las retinopatías diabéticas, la poliartritis reumatoide, los angiomas, los angiosarcomas, en particular la enfermedad de Castelman y el sarcoma de Kaposi.

15. Uso de un inhibidor de la angiogénesis, seleccionado de entre un anticuerpo según una de las reivindicaciones 5 ó 6, un fragmento Fab según la reivindicación 8, o un anticuerpo anti-anti-idiotípico según la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que necesitan la inhibición de la activación endotelial, en particular en el ámbito de las siguientes patologías: el rechazo de aloinjerto y de xenoinjerto, las acrocianosis, las esclerodermias, o en el ámbito de la preparación de injertos entre la extracción y el transplante.