ES2321373T3 - Procedimiento para la estabilizacion de proteinas en mezclas complejas durante su almacenamiento en disolventes acuosos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el almacenamiento de una proteína, por el cual se ralentiza la disminución de la concentración eficaz de la proteína en un disolvente acuoso a lo largo del tiempo, caracterizado porque se añade cisteína al disolvente acuoso de modo que la concentración de cisteína en la solución acuosa de proteína se encuentra en el intervalo de 150 a 220 mM, y caracterizado porque como proteína se utiliza insulina, un derivado de insulina y/o un precursor de la misma.
Description
Procedimiento para la estabilización de
proteínas en mezclas complejas durante su almacenamiento en
disolventes acuosos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para el almacenamiento de proteínas en un disolvente
acuoso.
El estado químico de los grupos SH de las
proteínas o de otras estructuras sensibles a la oxidación influye
frecuentemente sobre la identidad, actividad o concentración eficaz
de las proteínas. Identidad significa el respectivo plegamiento de
una proteína. Por actividad se debe entender una actividad
enzimática. La concentración eficaz de una proteína debe ser la
parte de proteína en una solución que, en relación con la función
biológica in vivo, esté correctamente plegada.
A partir de la bibliografía es conocido que las
oxidaciones que modifican la estructura de las proteínas se pueden
reprimir por el empleo de reactivos tiólicos tales como, por
ejemplo, 2-mercaptoetanol o cisteína.
La oxidasa de D-aminoácidos
(DAO) se puede estabilizar mediante tioles. La flavoproteína DAO
cataliza la desaminación estereoespecífica de
D-aminoácidos para dar los correspondientes
\alpha-cetoácidos y amonio (P. Golini et
al., Enzyme and Microbial Technology, 17, 1995,
325-329). Sin embargo, la adición de tioles tales
como, por ejemplo, cisteína, también puede reducir la actividad de
las proteínas. Este efecto también se puede explicar por la
presencia de radicales cisteína. Un ejemplo de ello es la
aminoacilasa. La aminoacilasa es una enzima dímera con un átomo
Zn^{2+} por subunidad. Cada subunidad de la enzima contiene dos
grupos SH de la cisteína y 2 enlaces disulfuro. La modificación
química de los grupos SH y la apertura de los enlaces disulfuro
puede conducir a la inactivación de la enzima. Se pudo poner de
manifiesto que por adición de 2-mercaptoetanol se
reduce la actividad de la aminoacilasa, mientras que por separación
del 2-mercaptoetanol por diálisis o filtración en
gel se puede restablecer casi completamente la actividad enzimática
original (W. Kördel y F. Schneider, Biochem. Biophys. Acta 445,
1976, 446-457).
Para la cisteína y algunos derivados en
determinadas formas de preparación y aplicaciones especiales, se
pudo poner de manifiesto una actividad en cierta medida
antibacteriana, antiviral o antifúngica. Así, se pudo demostrar que
la adición de cisteína es adecuada en cierta medida como protección
frente a la descomposición de alimentos
(US 4937085 A).
(US 4937085 A).
Con ayuda de procedimientos de tecnología
genética se pueden sintetizar proteínas recombinantes tales como
insulina o sus precursores, así como derivados de insulina que
presenten composiciones de aminoácidos discrepantes de la secuencia
génica (por ejemplo humana) de la que derivan, en microorganismos
modificados por tecnología genética como el de la bacteria
Esccherichia coli.
La síntesis recombinante en microorganismos se
lleva a cabo con ayuda de vectores de expresión. Estos vectores de
expresión se componen de un plásmido vector que debería contener una
secuencia control para la replicación del plásmido, así como un gen
de selección (gen resistente a antibióticos, marcador de
metabolismo, entre otros), en el cual se insertó la región
codificante del gen de la proteína que interesa (por ejemplo,
insulina) bajo el control de un promotor activo en el
microorganismo elegido (para E. coli, por ejemplo el
promotor-lac).
Un procedimiento para la obtención de proteínas
recombinantes (por ejemplo insulina; derivados de insulina, entre
otros), bajo la colaboración de microorganismos modificados por
tecnología genética se compone de una serie de etapas de proceso,
que se entrelazan unas con otras y que tienen que estar sintonizadas
entre sí.
Así, por ejemplo, un procedimiento para la
obtención de insulina humana en E. coli puede estar
constituido de las siguientes etapas de proceso.
Fermentación de los microorganismos - separación
de las células - apertura de las células - aislamiento y
almacenamiento intermedio de la proteína de fusión con cisteína -
restablecimiento de la estructura espacial nativa bajo expresión de
los puentes de disulfuro con subsiguiente separación de las
proteínas extrañas que no contienen sustancias válidas - ruptura
enzimática para dar arginilinsulina - purificación básica de la
solución acuosa de proteínas - 1ª purificación cromatográfica -
ruptura enzimática para dar insulina humana - 2ª purificación
cromatográfica - alta purificación mediante HPLC - recristalización
- secado.
El gran número de medidas individuales llevadas
a cabo conduce en toda regla a considerables pérdidas del
rendimiento global, puesto que en cada etapa son ineludibles las
mermas condicionadas por el rendimiento específico de la etapa
elegida.
Por optimación de las etapas intermedias se
puede mejorar el rendimiento global. En estos procedimientos existe
considerable interés en hacer posible un mejor aprovechamiento
económico de los recursos empleados, así como una reducción de la
contaminación del medio ambiente.
En el documento EP 0906918 se describe, por
ejemplo, un procedimiento mejorado para la obtención de un precursor
de insulina o derivados de insulina con puentes de cistina
correctamente enlazados, en presencia de cisteína o hidrocloruro de
cisteína y de un coadyuvante caotrópico.
Derivados de insulina son derivados de insulinas
de origen natural, a saber insulina humana o insulinas de animales.
Estos derivados de insulina se diferencian de las insulinas de
origen natural, por lo demás iguales, por la ausencia y/o
sustitución de al menos uno de los radicales aminoácido que aparece
en la respectiva insulina de origen natural, por otro radical
aminoácido codificable genéticamente y/o por la adición de al menos
un radical aminoácido codificable genéticamente.
En el almacenamiento de proteínas se produce
generalmente una disminución de las concentraciones eficaces.
Por diferentes motivos, entre las diferentes
etapas del proceso puede ser necesario el almacenamiento de las
sustancias resultantes de la producción. Así, puede ocurrir, por
ejemplo, que la capacidad de elaboración de una subsiguiente etapa
técnica de elaboración no sea suficiente como para absorber la
cantidad global de producto de la etapa anterior.
El tiempo necesario para el almacenamiento
intermedio puede ser de duración variable. En función de la
capacidad, necesidad de adaptación de los equipos técnicos,
necesidad de suministro ulterior de productos químicos o
dispositivos o por otros motivos, el almacenamiento intermedio
requerido se puede dilatar hasta varias semanas.
Una vía efectiva para el incremento del
rendimiento se ofrece cuando se consigue que las pérdidas de
proteína eficaz, que surgen en el ineludible almacenamiento
intermedio de los productos de las etapas individuales de proceso
antes continuar con su elaboración, se mantengan en límites lo más
estrechos posible.
Hasta ahora no se había descrito la utilización
de cisteína o sus derivados para contener las pérdidas de
rendimiento de la proteína eficaz durante el almacenamiento
intermedio de las sustancias resultantes de la producción, de
diferente composición y estado, procedentes de etapas individuales
de proceso de los procedimientos de producción industriales, con
inclusión de componentes biológicos, por ejemplo con participación
de catalizadores enzimáticos o microorganismos modificados por
tecnología genética. Tales procedimientos se aplican, por ejemplo en
la preparación de insulina.
Las sustancias resultantes de la producción que
se han de almacenar de forma intermedia se pueden componer, según
la etapa de proceso, de muchas macromoléculas diferentes de origen
biológico (proteínas, ADN, grasas), constituidas de forma compleja,
microorganismos, sustancias tampón, productos de partida y
otros.
El proceso de producción apunta en toda regla a
la obtención lo más homogénea posible de una sustancia, insulina en
el caso de la producción de insulina. Si las sustancias resultantes
de la producción se tienen que almacenar en el intermedio, en el
caso de la preparación de una proteína, como por ejemplo insulina,
se produce regularmente una pérdida de la concentración eficaz de
esta proteína.
Por almacenamiento de una proteína se debe
entender toda conservación de proteína, independientemente de la
cantidad volumétrica en que se encuentre la proteína, el tiempo que
va a durar la conservación o las condiciones térmicas bajo las
cuales se va a efectuar. El almacenamiento de proteínas se efectúa
normalmente en soluciones acuosas.
Una solución acuosa de una proteína, junto a los
componentes de los medios nutritivos para el cultivo de
microorganismos en forma definida o como medios enteros,
especialmente con fuentes de hidrocarburos o nitrógeno, aminoácidos,
sales inorgánicas y oligoelementos, puede contener también
proporciones de tampones de diferentes tipos de tampones químicos,
así como macromoléculas de origen biológico tales como ADN o grasas,
además de compuestos orgánicos e inorgánicos tales como, por
ejemplo, dodecilsulfato de Na o acetato de K y también proporciones
de disolventes de diferente prioridad tales como metanol o éter de
petróleo.
Lougheed, W.D. et al. (1980)
Diabetologia, 19, 1-9, nº 1 describe la agregación
de la insulina en un sistema artificial de aporte, así como un
procedimiento con el que se almacenó insulina durante 30 días en
presencia de cisteína.
La presente invención se refiere, por tanto, a
un procedimiento para el almacenamiento de una proteína en un
disolvente acuoso, durante el cual se ralentiza la disminución de la
concentración eficaz de la proteína a lo largo del tiempo, y en el
cual se añade cisteína al disolvente acuoso y la concentración de
cisteína en la solución protéica acuosa se encuentra en el
intervalo de 100 a 500 mM.
El procedimiento es adecuado para estabilizar la
ralentización de la disminución con el tiempo de la concentración
eficaz de una proteína durante su almacenamiento en soluciones
acuosas. El procedimiento se puede aplicar, por ejemplo, en la
producción de proteínas por microorganismos. Entre otros, como
microorganismos se ofrecen sobre todo bacterias, en este caso
especialmente Escherichia coli, levaduras tales como, por
ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris,
así como células de insectos. Estos microorganismos se pueden
transformar en la forma de realización preferida con construcciones
de vectores de expresión para la expresión inducida o constitutiva
de dichas proteínas. Los microorganismos se cultivan y, después de
la síntesis de la proteína, se abren. En principio, como método de
apertura entran en consideración todos los procedimientos que son
adecuados para la liberación de la proteína de las bacterias.
Aplicables como procedimientos de apertura son, por ejemplo, los
ultrasonidos, métodos químicos utilizando acetato de K,
dodecilsulfato de Na o lisozima, calentamiento de los
microorganismos o la "French press". Se puede prescindir de la
apertura de los microorganismos si la proteína que se ha de
preparar se segrega directamente al medio. En principio, el
procedimiento se puede aplicar también a proteínas segregadas.
Las mezclas complejas de proteínas que se forman
cuando se abren los microorganismos, o cuando segregan proteína
directamente al medio, se encuentran habitualmente en solución
acuosa. Como proteínas se utilizan insulina, un derivado de
insulina y/o un precursor de la misma. En la solución acuosa las
proteínas pueden estar disueltas o se presentan en forma
suspendida. La conservación de estas soluciones de proteína se
efectúa preferentemente entre 0ºC - 50ºC o entre 5ºC - 30ºC o a
5ºC. Para ralentizar la desactivación se añade cisteína a esta
mezcla de proteínas. La concentración de cisteína en la mezcla de
proteínas es 150 - 220 mM. Preferentemente, se añaden 170 mM. Las
proteínas en soluciones moleculares complejas se pueden almacenar de
esta manera hasta varias semanas con sólo una escasa disminución de
la concentración eficaz de la proteína. El procedimiento es
aplicable para la síntesis de proteínas heterólogas, especialmente
en microorganismos después de su apertura con subsiguiente
purificación y eventual renaturalización, preferentemente para la
preparación de insulina y sus precursores.
Como proteínas para el almacenamiento en un
procedimiento de la invención se utilizan preferentemente insulina o
derivados de insulina.
La presente invención se refiere, además, a un
procedimiento para la preparación de una proteína heteróloga, el
cual comprende la expresión de la proteína heteróloga o de su
precursor en un microorganismo transformado, proteína heteróloga
que se almacena después mediante un procedimiento conforme a la
presente invención. Eventualmente, esta proteína heteróloga o un
precursor de la misma se renaturaliza a continuación, se purifica de
secuencias líder o se procesa de cualquier otra manera y,
finalmente, después de la purificación y del aislamiento, se
obtiene el producto deseado. Como proteínas heterólogas se
consideran preferentemente insulina o derivados de insulina, así
como precursores de insulina.
Durante la implementación de los procedimientos
para la preparación de insulina se descubrió que por la adición de
cisteína a la proteína de fusión el producto permanece estable al
almacenamiento durante meses. Por el contrario, el producto no
tratado previamente pierde ya al cabo de pocos días, de forma
irreversible, una parte de su actividad.
En los ejemplos siguientes se utilizan las
moléculas precursoras de la insulina humana, así como un derivado
de insulina. La estructura y secuencia de aminoácidos se han
publicado en el documento EP 906 918 con los protocolos de las
secuencias. El precursor de la insulina humana tiene la secuencia de
la insulina humana de origen natural. El precursor del derivado de
insulina contiene en la posición 21 de la cadena A una glicina en
lugar de una arginina y en el extremo C-terminal de
la cadena B, en las posiciones 31 y 32, dos moléculas de
arginina.
Las proteínas de fusión de las insulinas se
pueden preparar por fermentación de células de E. coli
modificadas genéticamente conforme a los documentos EP 489 780 y EP
0 906 918. En estos casos, se obtiene una suspensión de proteínas
que contiene aproximadamente 20 a 25% de materia seca y 40 a 50% de
insulina plegable.
Para la finalidad de estabilizar la proteína
mediante cisteína, a aproximadamente 2.500 kg de esta suspensión
protéica (correspondiente a una carga de fermentación) se incorporan
75 kg de cisteína-hidrocloruro*H_{2}O, en el
espacio de 20 minutos y bajo fuerte agitación. El valor del pH
desciende en este caso de 7,0 a 2,5. En el intervalo de pH
alrededor de 5 la suspensión se vuelve muy pastosa, para volver a
ser bien agitable a partir de pH 4. Bajo estas condiciones de
ensayo se establece en la suspensión protéica una concentración de
hidrocloruro de cisteína 170 mM. La suspensión proteica se sigue
agitando durante 60 minutos, a continuación de lo cual puede
permanecer sin más agitación hasta su elaboración.
Para la confirmación experimental del efecto
conservante de la cisteína se llevaron a cabo los siguientes ensayos
de laboratorio:
La proteína de fusión de la insulina humana y la
proteína de fusión del derivado de insulina, preparadas conforme al
documento EP 906 918 se almacenaron con y sin cisteína a 5ºC y a la
temperatura ambiente hasta por 2 meses. Durante el ensayo se
tomaron partes alícuotas de las tandas. La proteína de fusión se
llevó por plegamiento reductor a la forma pre-pro
de la insulina humana y, respectivamente a la forma
pre-pro del derivado de insulina (documento EP 906
918). Las tandas que se almacenaron sin hidrocloruro de
cisteína-monohidrato se les añadieron la cantidad
de cisteína necesaria para el plegamiento, aproximadamente 1 hora
antes del comienzo del plegamiento. En las demás tandas, que
contenían la cisteína en forma de conservante, esto ya no era
necesario.
La transformación en la forma
pre-pro de la insulina humana y, respectivamente, a
la forma pre-pro del derivado de insulina se
determinó mediante HPLC.
0,5 g de proteína se disuelven en 40 ml de una
solución 6 M de hidrocloruro de guanidina, Tris 50 mM, pH 8,
tetracetato de etilendiamina (EDTA) 5 mM, 1% de
2-mercaptoetanol, ditiotreitol 10 mM, a 95ºC durante
2 minutos y, después, se centrifuga a 14.000 g durante 20 minutos.
Del sobrenadante transparente se aplican 0,02 ml a una columna para
cromatografía líquida de alta presión.
Columna: ®Nucleogel RP 300 - 5/46 (Macherey
& Nagel, Aachen, Alemania)
Gradiente: tampón A: 0,1% de ácido
trifluoroacético (TFA)
Tampón B: 0,09% de TFA en acetonitrilo
Temperatura: 55ºC
Tiempo global de elución: 40 min.
\vskip1.000000\baselineskip
El gradiente se caracteriza por la siguiente
cantidad de tampón B tras los correspondientes tiempos de
elución:
10 min. 25%, 12 min. 60%, 13 min. 90%,
15 min. 100%
Caudal: 1 ml/min.
Detección: 215 nm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por adición de cisteína o hidrocloruro de
cisteína se hacen posibles tiempos de almacenamiento de hasta 2
meses sin significativas pérdidas de actividad.
Claims (17)
1. Procedimiento para el almacenamiento de una
proteína, por el cual se ralentiza la disminución de la
concentración eficaz de la proteína en un disolvente acuoso a lo
largo del tiempo, caracterizado porque se añade cisteína al
disolvente acuoso de modo que la concentración de cisteína en la
solución acuosa de proteína se encuentra en el intervalo de 150 a
220 mM, y caracterizado porque como proteína se utiliza
insulina, un derivado de insulina y/o un precursor de la misma.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la proteína es una proteína heteróloga
preparada en un microorganismo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque como microorganismo se utiliza una
bacteria.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque como bacteria se utiliza Escherichia
coli.
5. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque como microorganismo se utiliza una
levadura.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque como levadura se utiliza
Saccharomyces cerevisiae.
7. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque como levadura se utiliza Pichia
pastoris.
8. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque como microorganismo se utilizan células
de insectos.
9. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque el
microorganismo prepara la proteína mediante una construcción de un
vector de expresión.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteína se
presenta en forma disuelta.
11. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteína se
presenta en suspensión.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
concentración de cisteína en la solución acuosa de proteína es 170
mM.
13. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el
almacenamiento de la proteína tiene lugar a 0ºC hasta 50ºC.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque el almacenamiento de la proteína tiene
lugar a 5ºC hasta 30ºC.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque el almacenamiento de la proteína tiene
lugar a 5ºC.
16. Procedimiento para la preparación de una
proteína heteróloga, el cual abarca la expresión de la proteína
heteróloga o su precursor en un microorganismo transformado,
eventualmente la apertura del microorganismo o el aislamiento de la
proteína heteróloga o de su precursor a partir del medio de cultivo,
subsiguiente almacenamiento mediante un procedimiento conforme a
una o varias de las reivindicaciones 1 a 15 y, eventualmente, la
subsiguiente renaturalización de la proteína heteróloga o de su
precursor, eventualmente separación de las secuencias líder y de
las demás secuencias que sólo aparecen en la etapa previa de la
proteína heteróloga y, finalmente, purificación y aislamiento de la
proteína heteróloga.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la proteína heteróloga es una insulina
de origen animal o insulina humana.
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