ES2317665T3 - Proteina quimerica que contiene una secuencia de tipo chaperona intramolecular y su aplicacion a la produccion de insulina. - Google Patents
Proteina quimerica que contiene una secuencia de tipo chaperona intramolecular y su aplicacion a la produccion de insulina. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína quimérica que comprende, desde el extremo-N al extremo-C: a) un primer fragmento peptidilo constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con un dominio de la hormona del crecimiento humano que contiene al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO:2 en los que el porcentaje de identidad se determina sobre una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 de la misma longitud que el primer fragmento peptidilo; b) un resto Arg, o un resto Lys, o un segundo fragmento peptidilo constituido al menos por 2 aminoácidos en cuyo fragmento peptidilo el resto ácido más C-terminal es un resto Arg o Lys; y c) un tercer fragmento peptidilo constituido por un fragmento peptidilo precursor de insulina humana que comprende la cadena A y la cadena B de insulina humana, y en el que la cadena A y la cadena B están separadas mediante un resto peptidilo removible de una longitud entre 2 y 34 restos; y en la que el primer fragmento peptidilo es capaz de aumentar el rendimiento de la conformación bioactiva del precursor de insulina formado poniendo en contacto la proteína recombinante con un agente caotrópico auxiliar en comparación con el rendimiento de la conformación bioactiva del precursor de insulina formado poniendo en contacto la misma proteína recombinante que carece del primer fragmento peptidilo con el agente caotrópico.
Description
Proteína quimérica que contiene una secuencia de
tipo chaperona intramolecular y su aplicación a la producción de
insulina.
La presente invención se refiere a una proteína
quimérica que contiene una secuencia de tipo chaperona
intramolecular (IMC) unida a una proteína diana. En particular, la
invención se refiere a una proteína quimérica que contiene una
secuencia de tipo IMC unida a un precursor de insulina. La presente
invención también se refiere a un procedimiento para obtener una
proteína quimérica que contiene precursor de insulina correctamente
plegado, que comprende, entre otros, poner en contacto una proteína
quimérica incorrectamente plegada que contiene una secuencia de
tipo IMC unida a un precursor de insulina con al menos un agente
caotrópico auxiliar. La presente invención se refiere
adicionalmente a un ensayo para investigar una secuencia de
aminoácidos respecto a su capacidad para mejorar el plegado de un
precursor de insulina usando una proteína quimérica que contiene
una secuencia de tipo IMC unida a un precursor de insulina.
Las chaperonas moleculares se definen como una
clase de proteínas que ayudan a corregir el plegado de otros
polipéptidos pero que no son componentes de la estructura ensamblada
funcional (Shinde and Inouye, TIBS, 1993,
18:442-446). Las chaperonas intramoleculares (IMC)
son parte de los precursores de las proteínas diana que se han de
plegar y en su ausencia las moléculas de proteína diana no tienen
suficiente información para autoplegado apropiado (Inouye, Enzyme,
1991, 45:314-321). Características únicas de las IMC
incluyen: a) la IMC y la proteína diana se unen mediante un enlace
peptidilo formando un polipéptido sencillo; b) se requiere
absolutamente la IMC para la formación de conformación activa de la
proteína diana, pero no se requiere para la función de la proteína
diana; c) tras la terminación del plegado de la proteína, la IMC se
retira bien por autoprocesado o bien por otra endopeptidasa; d) la
IMC no funciona como catalizador, es decir, una molécula de IMC es
capaz de volver a plegar solamente una molécula de la proteína
diana; y e) la IMC es un polipéptido altamente específico "hecho
a medida" que trabaja solamente para las proteínas diana (Inouye,
Enzyme, 1991, 45:314-321).
Recientemente, se ha puesto de manifiesto que
una IMC o un propéptido pueden ayudar a que la proteína diana se
pliegue intermolecularmente, es decir, la IMC o propéptido no se une
a la proteína diana por la vía de un enlace peptidilo, sino que más
bien se añade a la reacción de plegado como un péptido separado
(patente de EE.UU. Nº 5.719.021). Sin embargo, se ha de destacar
que el propéptido usado en la patente de EE.UU. Nº 5.719.021 es el
propéptido natural de la proteína diana o un propéptido de un
polipéptido que tiene la misma función de la proteína diana y el
polipéptido también tiene una secuencia de aminoácidos que es
similar a la proteína diana. Además, la reacción intermolecular que
se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.719.021 tiene que llevarse
a cabo en un medio acuoso iónico tamponado que favorezca la
interacción hidrófoba.
Ejemplos de IMC incluyen los propéptidos de
subtilisina, proteasa \alpha-lítica,
carboxipeptidasa Y y ubiquitina (Shinde and Inouye, TIBS, 1993,
18:442-446). Ciertas características de una
secuencia de subtilisina de IMC incluyen: a) la IMC contiene un
porcentaje más alto de restos aminoácido cargados que el de la
proteína diana; b) la distribución de estos restos cargados dentro
de la IMC es extremadamente irregular, es decir, la mitad
N-terminal contiene más restos cargados
positivamente que restos cargados negativamente y la mitad
C-terminal contiene más restos cargados
negativamente que restos cargados positivamente; c) los restos Ser y
Thr dentro de la IMC también están distribuidos irregularmente; d)
la IMC tiene un contenido de restos aromáticos reactivamente alto;
y e) la IMC contiene una secuencia hidrófoba de 9 restos (Inouye,
Enzyme, 1991, 45:314-321). Un sesgo similar hacia
restos cargados se observa también en proteasa
\alpha-lítica y carboxipeptidasa Y (Inouye,
Enzyme, 1991, 45:314-321).
La secuencia de aminoácidos de la hormona del
crecimiento humano madura (hGH) se describe en Ikehara y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1984, 81:5956-5960.
No hay sugerencia en la técnica de que hGH madura o alguna porción
de la misma pueda funcionar como IMC o propéptido. En realidad, la
hGH madura o alguna porción de la misma no se puede considerar un
propéptido en absoluto porque, por definición, cualquier secuencia
pre, pro, o prepro se retira de una secuencia madura.
La insulina es un péptido bien definido con
secuencia de aminoácidos y características estructurales conocidas
(Watson y col., Recombinant DNA-A Short Course;
Scientific American Books, W. H. Freeman Co., Nueva York, 1983,
págs. 231-235; Norman and Litwack, En Hormones,
Academic Press, Nueva York, 1987, págs. 264-317).
Esta hormona está constituida por dos cadenas separadas de péptidos
que son la cadena A (21 aminoácidos) y la cadena B (30 aminoácidos)
unidas mediante puentes disulfuro según se indica en la Figura 1B.
Proinsulina es el precursor biológico de insulina y es una cadena
sencilla de péptido que se forma cuando las cadenas A y B se
conectan mediante el péptido C (Figura 1A).
\vskip1.000000\baselineskip
La insulina humana fue la primera proteína
animal hecha en bacterias en una secuencia idéntica a la del péptido
pancreático humano (Watson y col., Recombinant
DNA-A Short Course; Scientific American Books, W. H.
Feeman Co., Nueva York, 1983, págs. 231-235). La
primera expresión con éxito de insulina humana en laboratorio se
anunció en 1978 y la insulina humana se aprobó como fármaco
terapéutico en 1982 (Johnson, Science, 1983,
219:632-637).
Según este método, cada cadena de insulina se
produce como proteína de fusión de
\beta-galactosidasa (\beta-gal)
en fermentaciones separadas usando E. Coli transformada con
plásmidos que contienen una secuencia de ADN que codifica la cadena
A o B de insulina humana, respectivamente. Los productos son
intracelulares y aparecían en cuerpos de inclusión citoplásmicos
prominentes (Williams y col., Science, 1982,
215(5):687-689). Las proteínas recombinantes
producidas en E. Coli representan habitualmente
10-40% de la proteína total (Burgess, Protein
Engineering; Oxender, D. L., Fox, C. F., Eds.; Alan R. Liss, Inc.;
Nueva York, 1987; págs. 71-82).
Una vez retiradas de los cuerpos de inclusión,
el desdoblamiento químico mediante CNBr en el resto Met entre la
\beta-galactosidasa y las cadenas A o B, seguido
de purificación, dio los péptidos A y B separados. Se combinan
luego los péptidos y se inducen a plegarse en una relación de 2:1 de
cadena A-B (formas sulfonadas-S) en
presencia de cantidades limitadas de mercaptano a fin de obtener una
hormona activa (Chance y col., En Peptides:
Synthesis-Structure-Function, Rich
D. M. Gross, E., Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, II 1981,
págs. 721-728; Frank and Chance, En Quo
Vadis? Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering,
Joyesuk y col., Eds., Sanoff Group,
Toulouse-Labege, Francia, 1985, págs.
137-148). Después de 24 h, el rendimiento es
aproximadamente 60% referido a la cantidad de cadena B usada (Chance
y col. En Insulins, Growth Hormone and Recombinant DNA Technology,
Raven Press, Nueva York, 1981, págs. 71-85; Johnson,
Fluid Phase Equilib., 1986, 29:109-123). Goeddel y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1979,
76(1):106-110, obtuvieron resultados
similares con 20% de la proteína celular total expresada como
proteína de fusión tanto de cadena A como B. El plegado posterior
de cadenas sulfonadas-S da 50-80% de
plegado correcto.
El gran tamaño de la proteína de fusión de
\beta-gal limita los rendimientos porque la
proteína de fusión de \beta-gal (\sim1000
aminoácidos) y la cadena A o B de insulina (21 ó 30 aminoácidos,
respectivamente) llegan a despegarse del ribosoma de las células
(terminación prematura de la cadena durante la traducción) y por lo
tanto produce péptidos de insulina incompletos (Burnett,
Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, Ed., Academic
Press, Nueva York, 1983, págs. 259-277; Hall,
Invisible Frontiers-The Race To Synthesize a Human
Gene, Atlantic Monthly Press, Nueva York, 1987). Una mejora clave
para esta aproximación es el uso del operón del triptófano
(Trp) en lugar de operón del Iac (sistema de
\beta-gal) para obtener una proteína de fusión
más pequeña. El operón del Trp está constituido por una serie
de cinco genes bacterianos que sintetizan secuencialmente las
enzimas responsables del anabolismo de triptófano. Una de estas
enzimas, Trp E, tiene solamente 190 aminoácidos en
comparación con los 1000 aminoácidos de
\beta-gal. El gen Trp E seguido de genes
para las cadenas A o B de insulina tiene la ventaja añadida de
potenciar la producción de proteína de fusión de
5-10% a 20-30% de la proteína total
(Hall, Invisible Frontiers-The Race To Synthesize a
Human Gene, Atlantic Monthly Press, Nueva York, 1987) dado que el
promotor de Trp es un promotor fuerte en E. Coli.
Esto conduce a una expresión al menos 10 veces mayor de polipéptido
cuando se compara con el sistema Iac (es decir
\beta-gal) (Burnett, Experimental Manipulation of
Gene Expression, Inouye, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983,
págs. 259-277). El operón del Trp se activa
cuando la fermentación de E. Coli se queda sin triptófano
(Hall, Invisible Frontiers-The Race To Synthesize a
Human Gene, Atlantic Monthly Press, Nueva York, 1987:
Etienne-Decent, En Genetic Biochemistry: From Gene
to Protein, Ellis Horwood Limited, Chichester, Reino Unido, 1988,
págs. 125-127). Esta característica es beneficiosa
durante la fermentación dado que la masa celular se puede maximizar
al principio. Luego, cuando sea apropiado, se puede activar el
sistema de producción de insulina de la célula permitiendo que el
medio de fermentación llegue a agotarse de Trp.
Después de que se termina la fermentación, las
células se recuperan y se desintegran. Se separa luego el detritus
celular de los cuerpos de inclusión, y se disuelven los cuerpos de
inclusión en un disolvente, si bien no se conocen específicos
(Wheelwright, Protein Purification, Oxford University Press; Nueva
York, 1991, pág. 217). Los cuerpos de inclusión en algunas
ocasiones se disuelven en HCl de gaunidina 6 M y ditiotreitol 0,1
mM (Burgess, Protein Engineering, Oxender and Fox, Eds., Alan R.
Liss, Inc., Nueva York, 1987, págs. 71-82). A
continuación, la
Trp-LE-Met-cadena A
y la
Trp-LE-Met-cadena B
experimentan un desdoblamiento con CNBr para liberar las cadenas de
insulina A y B. Modificaciones adicionales de las cadenas A y B
incluyen sulfitolisis oxidativa, purificación y combinación para
producir insulina bruta. Esta insulina bruta se somete a intercambio
iónico, exclusión por tamaño, y cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa (HPLC RP) para producir la insulina
humana recombinante purificada (Frank and Chance, Munch Med. Wschr,
1983, 125 (Suppl. 1):514-520).
También se puede elaborar insulina humana con
microorganismos recombinantes que producen proinsulina íntegra en
lugar de las cadenas A o B separadamente (Kroeff y col., J.
Chomatogr, 1989, 481:45-61). Inicialmente, ARNm es
copiado en ADNc, y un codón de metionina se sintetiza químicamente y
se une al extremo 5' del ADNc de proinsulina. El ADNc se inserta a
un gen bacteriano en un vector de plásmido que se introduce y a
continuación se hace crecer en E. Coli. Se puede liberar
proinsulina del fragmento (\beta-gal) de enzima
bacteriana (o alternativamente de la Trp-LE/Met
Proinsulina (Trp Proinsulina) destruyendo el conector de metionina).
La cadena de proinsulina se somete a un proceso de plegado para
formar los puentes disulfuro intramoleculares correctos, y el
péptido C se puede desdoblar luego con enzimas para producir
insulina humana (Frank and Chance, Munch Med. Wschr., 1983,
125(Suppl. 1):514-520). En comparación, el
método de las dos cadenas anteriormente descrito es más
complejo.
Dorschug y col. construyeron proteínas de fusión
que codifican plásmidos recombinantes que contenían una
mini-proinsulina
(B-Arg-A), expresaron las proteínas
de fusión en E. Coli (cuerpo de inclusión) y levadura
(segregada), prepararon mini-proinsulina
correctamente plegada por la vía de desdoblamiento con BrCN y
sulfitolisis oxidativa, y convirtieron la
mini-proinsulina correctamente plegada en insulina
humana mediante tratamiento con tripsina y carboxipeptidasa B (EP
0.347.781 B1; IL 9.562.511 B y AU 611.303 B2).
Tottrup and Carlsen, Biotechnol. Bioeng, 1990,
35:339-348 usaron el sistema de levadura en una
fermentación optimizada alimentada por lotes, y se reseñó que los
rendimientos de proteína de fusión de superóxido
dismutasa-proinsulina humana
(SOD-PI) fueron de 1500 mg/L. El material de partida
para la producción de insulina humana recombinante sería
SOD-PI; no se han reseñado rendimientos del producto
final.
Recientemente, Castellanos-Serra
y col., FEBS Letters, 1996, 378:171-176 expresaron
en E. Coli una proteína de fusión de proinsulina que llevaba
un péptido N-terminal de
interleucina-2 modificada (restos aminoácido
1-22) unido al extremo-N de
proinsulina mediante un resto lisina. Se aisló la proinsulina
quimérica de los cuerpos de inclusión, se re-plegó
por la vía de sulfitolisis oxidativa, y luego se convirtió en la
insulina de proteínas de fusión correctamente mediante reacción
prolongada con tripsina y carboxipeptidasa B. La fusión
IL2-proinsulina se puede plegar correctamente sin
retirar en primer lugar el fragmento IL2, eliminando así el bromuro
de cianógeno y las etapas de purificación asociadas. Sin embargo, la
etapa de sulfitolisis oxidativa y las etapas de purificación
asociadas no se pueden evitar mediante el uso de proteína de fusión
IL2-proinsulina.
Villa-Komaroff y col., Proc.
Natl. Acad, Sci. EE.UU., 1978,
75(8):3727-3731 fueron los primeros en
describir un sistema de secreción para proinsulina humana en E.
Coli. Thim y col., construyeron proteínas de fusión que
codificaban plásmidos recombinantes que contenían una levadura
modificada que se acoplaba con una secuencia conductora de factor
\alpha1 y un precursor de insulina (Thim y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 1986, 83:6766-6770). La secuencia
conductora sirve para dirigir la proteína de fusión hacia la red
secretora de la célula de levadura y para exponer la proteína de
fusión al sistema de enzimas que procesa Lys-Arg.
También ocurría un procesado parcial en una o ambas secuencias
dibásicas entre cadenas B y A dentro de la proinsulina y otros
precursores de insulina que contienen un péptido separador corto
(que contiene 6 ó más restos aminoácido) en lugar del péptido C. En
contraposición, no se observó procesado en ausencia de péptido
separador en la molécula de precursor de insulina, por ejemplo
B-Arg-Arg-A (donde A
y B son la cadena A y B de proinsulina humana, respectivamente).
Este tipo de precursores de insulina de cadena sencilla se podría
convertir enzimáticamente en insulina mediante tratamiento con
tripsina y carboxipeptidasa B. Diers y col., Drug Biotechnology
Regulations (Scientific Basis and Practices), Chiu and Gueriguian,
Eds., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1991, págs.
167-177, describen el péptido no plegado como un
conductor o prosegmento, a continuación una secuencia
Lys-Arg, la cadena B (aminoácidos
1-29), un puente péptido corto, seguido de la cadena
A (aminoácidos 1-21). En este precursor, el
aminoácido 29 de la cadena B de insulina se conecta al aminoácido 1
de la cadena A mediante un péptido corto de conexión que contiene
un aminoácido básico adyacente a la cadena A. Se produce insulina
humana por medio de transpeptidación seguida de hidrólisis del
enlace éster formado. Siguen varias etapas de cromatografía para
purificación adicional.
La insulina humana es una proteína que posee dos
cadenas de aminoácidos de 51 restos aminoácido en total. Seis
restos cisteína están presentes en las dos cadenas de aminoácidos,
estando en cada caso dos restos cisteína unidos entre sí por la vía
de un enlace disulfuro. Estadísticamente, hay 15 posibilidades de
formar puentes disulfuro dentro de una molécula de insulina humana.
Sin embargo, solamente una de las 15 posibilidades existe en la
insulina humana biológicamente activa con los siguientes puentes
disulfuro: 1)A6-A11;
2)A7-B7; y
3)A20-B19.
La formación de los puentes disulfuro que están
presentes en la insulina humana se efectúa por la ruta de un
producto intermedio, estando los grupos cisteína de la insulina
humana provistos de un grupo protector de azufre, por ejemplo, de
un grupo sulfonato-S
(-S-SO_{3}^{-}) (EP 0.037.255). Además, se ha
usado proinsulina de cerdo en la que están presentes los restos
cisteína como restos tío (-SH) para obtener proinsulina que posee
puentes de cisteína unida correctamente (Biochemistry, 1968,
60:622-629). Obermeier y col. describieron un
proceso para obtener proinsulina que posee puentes de cisteína unida
correctamente de la correspondiente cadena de aminoácidos de
proinsulina en una concentración de 0,05 a 0,3 g por litro en
presencia de mercaptano, agentes caotrópicos auxiliares y resinas
hidrófobas absorbentes (patente de EE.UU. Nº 5.473.049). La etapa
de sulfitolisis oxidativa se elimina en el proceso descrito en la
patente de EE.UU. Nº 5.473.049. Sin embargo, la proteína de
insulina solamente se puede plegar a una concentración baja, que
disminuye grandemente el valor comercial de este proceso. Además,
el uso de gran cantidad de mercaptano y resinas hidrófobas
absorbentes aumenta la complejidad del proceso y los costes de
purificación corriente abajo. A partir de la descripción de la
patente de EE.UU. Nº 5.473.049, no está claro si el beneficio de
eliminar la etapa de sulfitolisis oxidativa contrapesará los
mayores costes de purificación corriente abajo.
La solicitud internacional PCT WO9620724 trata
de la generación de insulina humana. La solicitud internacional PCT
WO9718233 trata de la producción de proteína o polipéptido
biológicamente activo correctamente plegado.
La presente invención se refiere a una proteína
quimérica que comprende, desde el extremo-N al
extremo-C:
- a)
- un primer fragmento peptidilo constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con un dominio de la hormona del crecimiento humano que contiene al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO:2 en los que el porcentaje de identidad se determina sobre una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 de la misma longitud que el primer fragmento peptidilo;
- b)
- un resto Arg, o un resto Lys, o un segundo fragmento peptidilo constituido al menos por 2 aminoácidos en cuyo fragmento peptidilo el resto ácido más C-terminal es un resto Arg o Lys; y
- c)
- un tercer fragmento peptidilo constituido por un fragmento peptidilo precursor de insulina humana que comprende la cadena A y la cadena B de insulina humana, y en el que la cadena A y la cadena B están separadas mediante un resto peptidilo removible de una longitud entre 2 y 34 restos;
y en la que el primer fragmento
peptidilo es capaz de aumentar el rendimiento de la conformación
bioactiva del precursor de insulina formado poniendo en
contacto la proteína recombinante con un agente caotrópico auxiliar
en comparación con el rendimiento de la conformación bioactiva del
precursor de insulina formado poniendo en contacto la misma
proteína recombinante que carece del primer fragmento peptidilo con
el agente
caotrópico.
La invención también se refiere a un proceso
para obtener una proteína quimérica que contiene un primer precursor
de insulina correctamente plegado según la reivindicación 15.
La presente invención también se refiere
adicionalmente a un ensayo para obtener la proteína quimérica de la
reivindicación 1, que comprende: (a) cambiar la secuencia de
aminoácidos del primer fragmento peptidilo de una proteína
quimérica de la reivindicación 1, obtener dicha proteína quimérica
con dichos cambios, poner en contacto dicha proteína quimérica con
dichos cambios con al menos un agente caotrópico auxiliar en un
medio acuoso bajo condiciones y durante un tiempo suficiente tales
que dicha proteína quimérica se pliegue correctamente, y medir el
rendimiento de plegado de dicha proteína quimérica con dichos
cambios; (b) obtener la misma proteína quimérica que se usa en la
etapa (a), pero sin los cambios de secuencia de aminoácidos que se
describen en la etapa (a), poner en contacto la proteína quimérica
sin los cambios de secuencia de aminoácidos que se describen en la
etapa (a) con al menos un agente caotrópico auxiliar en un medio
acuoso bajo las mismas condiciones y durante el mismo tiempo que se
usa en la etapa (a), y medir el rendimiento de plegado de la
proteína quimérica; y (c) comparar el rendimiento de plegado de las
proteínas quiméricas medido en las etapas (a) y (b),
respectivamente, en las que el rendimiento medido en la etapa (a)
que es sustancialmente igual o mayor que el rendimiento medido en
la etapa (b) indica que la secuencia de aminoácidos mejora el
plegado del precursor de insulina.
El alcance de la presente invención se define
por las reivindicaciones. Cualquier materia discutida en este
documento que no caiga dentro de las reivindicaciones se describe
solamente para fines informativos.
Figuras 1A y 1B. Estructura de proinsulina e
insulina madura con puentes disulfuro correctamente formados. 1A
representa la estructura de proinsulina. 1B representa la estructura
de insulina madura con puentes disulfuro correctamente
formados.
Figura 2. Mapa del vector de expresión
(pZRhi-1) de
hGH-mini-proinsulina (SEC ID NO:
6).
Los procesos recombinantes hacen posible
producir, en microorganismos, proinsulina humana, o proinsulina con
una secuencia de aminoácidos y/o longitud de cadena de aminoácidos
que diverge de la de insulina natural. Un problema importante en la
producción de proinsulina humana o sus derivados en microorganismos
tales como E. Coli es la degradación intracelular (Ladisch
and Kohlmann, Biotechnol. Prog., 1992, 2:469-478).
Además, la proinsulina humana o sus derivados producidos de modo
recombinante en microorganismos no poseen puentes de cisteína unida
correctamente (patente de EE.UU. Nº 5.473.049).
Antes de la presente invención, un proceso
conocido para obtener insulina humana recombinante estaba basado en
los siguientes procedimientos: 1) fermentación de los
microorganismos transformados con un vector que expresa una
proteína de fusión que contiene proinsulina humana o sus derivados;
2) desintegración celular; 3) aislamiento de la proteína de fusión;
4) desdoblamiento de la proteína de fusión con bromuro de cianógeno;
5) aislamiento del producto de desdoblamiento que tiene la
secuencia de proinsulina; 6) sulfitolisis oxidativa; 7) formación
de los puentes de cisteína unida correctamente; 8) desalación de la
proinsulina; 9) purificación cromatográfica de la proinsulina que
posee los puentes de cisteína unida correctamente; 9) concentración
de la solución de proinsulina; 10) purificación cromatográfica de
la solución concentrada de proinsulina; 11) desdoblamiento
enzimático de la proinsulina a fin de obtener insulina humana; y 12)
purificación cromatográfica de la insulina humana resultante (EP
0.055.945). Son desventajas de este proceso las numerosas etapas de
procedimiento y las pérdidas en las etapas de purificación, que
conducen a un rendimiento bajo de insulina. De las etapas de
desdoblamiento de la proteína de fusión aislada por vía de bromuro
de cianógeno, sulfitolisis y purificación de la proinsulina, se ha
de esperar una pérdida de proinsulina hasta el 40% (EP 0.055.945).
Por otra parte, el rendimiento de producción de modo recombinante
de insulina, o sus derivados, se puede aumentar significativamente
si el número de las etapas necesarias en el procedimiento se reduce
significativamente.
Un objetivo de la presente invención era
desarrollar un proceso recombinante para obtener insulina humana
con puentes de cisteína unida correctamente con pocas etapas
necesarias de procedimiento, y por lo tanto rendimiento resultante
más alto de insulina humana. Otro objetivo de la presente invención
era desarrollar una proteína quimérica que contiene un precursor de
insulina que se puede usar en el proceso anterior. Todavía otro
objetivo de la presente invención era desarrollar un ensayo para
investigar una secuencia de aminoácidos, que cuando se unan a un
precursor de insulina por la vía de enlace peptidilo, mejorarán el
plegado del precursor de insulina.
Los solicitantes han estudiado las secuencias de
péptidos que no sólo protegerían las secuencias de insulina de la
degradación intracelular por el organismo hospedador, sino que
también, en comparación con el sistema de expresión de insulina
humana entonces existente, poseen las siguientes ventajas: cuando se
une a un precursor de insulina por la vía de un enlace peptidilo,
1) promueve el plegado del precursor de insulina fusionado; 2)
facilita la solubilidad de la proteína de fusión y disminuye las
interacciones intermoleculares entre las proteínas de fusión,
permitiendo así el plegado del precursor de insulina fusionado a una
concentración alta comercialmente significativa; 3) elimina las
etapas de procedimiento de desdoblamiento con bromuro de cianógeno,
sulfitolisis oxidativa y las etapas de purificación relacionadas; y
4) elimina el uso de concentración alta de mercaptano o el uso de
resinas hidrófobas absorbentes.
Los solicitantes han descubierto,
sorprendentemente, que uniendo una secuencia de tipo IMC a un
precursor de insulina por la vía de uno o más residuos de
aminoácidos que se pueden desdoblar se logran los objetivos de la
presente invención. La secuencia de tipo IMC tiene ciertas
características de una secuencia de IMC tales como ayudar al
plegado de la proteína diana, contener un porcentaje más alto de
restos aminoácido cargados que su proteína diana, tener
distribución polarizada de los restos aminoácido cargados y tener
una secuencia que parece que está "hecha a medida" para la
proteína diana. Sin embargo, la secuencia de tipo IMC que se usa en
la presente invención es diferente de una secuencia de IMC en varios
aspectos clave. En primer lugar, la secuencia de tipo IMC es
heterogénea para la proteína diana, es decir no es un propéptido de
la proteína diana. Por ejemplo, si un precursor de insulina es una
proteína diana que se ha de plegar, una secuencia de tipo IMC no es
el precursor de insulina ni una porción de la misma. Además, el
tamaño de la secuencia de tipo IMC es de aproximadamente 20 a
aproximadamente 200 restos aminoácidos.
Adicionalmente, contrariamente a las enseñanzas
en la técnica anterior (Castellanos-Serra y col.,
FEBS Letters, 1996, 378:171-176), los solicitantes
han descubierto, sorprendentemente, que incluir, dentro de la
secuencia de tipo IMC, uno o más restos de aminoácidos que se
pueden desdoblar que son idénticos a uno o más restos aminoácido
que se pueden desdoblar que separan la secuencia de tipo IMC y un
precursor de insulina permite la retirada fragmentada de la
secuencia de tipo IMC después del plegado, simplificando, por lo
tanto, las etapas de purificación corriente abajo.
Para la claridad de la descripción, y no a
manera de limitación, la descripción detallada de la invención se
divide en las subsecciones que siguen.
La presente invención proporciona un ácido
nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido que
codifica la proteína quimérica descrita en la sección 4.2.
En una realización específica, la presente
invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia de nucleótido que codifica la proteína quimérica que tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otra realización específica, la presente
invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia de nucleótido que codifica la proteína quimérica que tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona una molécula de ADN aislado que comprende una
secuencia de nucleótido que codifica la proteína quimérica descrita
en la Sección 4.2.
Adicionalmente se proporciona un ácido nucleico
aislado que comprende una secuencia de nucleótido complementaria a
la secuencia de nucleótido que codifica la proteína quimérica
descrita en la Sección 4.2.
Adicionalmente se proporciona un ácido nucleico
aislado hibridable a la secuencia de nucleótido los fragmentos
peptidilo primero, segundo y tercero del ADN que codifica la
proteína quimérica descrita en la Sección 4.2.
El ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótido que codifica la proteína quimérica descrita en la
Sección 4.2., se puede obtener mediante cualquier método conocido en
la técnica. El ácido nucleico se puede sintetizar por entero
químicamente. Alternativamente, el ácido nucleico que codifica cada
fragmento de la proteína quimérica, es decir, el fragmento
peptidilo primero, segundo o tercero, se puede obtener mediante
clonación molecular o se puede purificar de las células deseadas. El
ácido nucleico que codifica cada fragmento de la proteína quimérica
se puede unir entonces químicamente o enzimáticamente conjuntamente
para formar el ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótido que codifica la proteína quimérica descrita en la
Sección 4.2.
Cualquier célula humana puede servir
potencialmente como fuente de ácido nucleico para el aislamiento de
ácidos nucleicos de hGH. Cualquier célula de mamífero puede
servir potencialmente como fuente de ácido nucleico para el
aislamiento de ácidos nucleicos de insulina. Las secuencias
de ácido nucleico que codifican insulina se pueden aislar de
organismo mamífero, humano, porcino, bovino, felino, aviar, canino,
así como de fuentes adicionales de roedor o primate, etc.
El ADN se puede obtener mediante procedimientos
estándar conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por
ejemplo, una "biblioteca" de ADN), mediante síntesis química,
mediante clonación de ADNc, o mediante clonación de ADN genómico, o
fragmentos del mismo, purificados a partir de las células deseadas.
(Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA
Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino
Unido, Vol I, II). Los clones derivados de ADN genómico pueden
contener regiones de ADN reguladoras e intrones además de las
regiones de codificación, los clones derivados de ADNc contendrán
solamente secuencias de exones. Cualquiera que sea la fuente, el
gen se debería clonar molecularmente en un vector adecuado para
propagación del gen.
En la clonación molecular del gen a partir de
ADNc, se genera ADNc a partir de ARN o ARNm totalmente celular
mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. El gen
también se puede obtener a partir de ADN genómico, donde se generan
fragmentos de ADN (por ejemplo usando enzimas de restricción o
mediante cizalladura mecánica), algunos de los cuales codificarán
el gen deseado. Los fragmentos lineales de ADN se pueden separar
luego según el tamaño mediante técnicas estándar, que incluyen,
pero no se limitan, electroforesis de gel de agarosa y
poliacrilamida y cromatografía de columna.
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótido que codifica la proteína
quimérica descrita en la Sección 4.2., su identidad puede ser
confirmada mediante secuenciación de ácido nucleico (mediante
cualquier método bien conocido en la técnica) y comparación con las
secuencias conocidas. Se puede llevar a cabo análisis de secuencia
de ADN mediante cualesquiera técnicas conocidas en el sector, que
incluyen, pero no se limitan, el método de Maxam y Gilbert (Maxam
and Gilbert, 1980, Meth. Enzymol., 65:499-560), el
método de didesoxi de Sanger (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 74:5463), el uso de T7 ADN polimerasa (Tabor and
Richardson, patente de EE.UU. Nº 4.795.699), uso de un secuenciador
automático de ADN (por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City,
CA) o el método descrito en la publicación PCT WO 97/15690.
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La presente invención proporciona una proteína
quimérica que comprende, desde el extremo-N al
extremo-C:
- a)
- un primer fragmento peptidilo constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con un dominio de la hormona del crecimiento humano que contiene al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 2 en los que el porcentaje de identidad se determina sobre una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 de la misma longitud que el primer fragmento peptidilo;
- b)
- un resto Arg, o un resto Lys, o un segundo fragmento peptidilo constituido al menos por 2 aminoácidos en cuyo fragmento peptidilo el resto aminoácido más C-terminal es un resto Arg o Lys; y
- c)
- un tercer fragmento peptidilo constituido por un fragmento peptidilo precursor de insulina humana que comprende la cadena A y la cadena B de insulina humana, y en el que la cadena A y la cadena B están separadas mediante un resto peptidilo removible de una longitud entre 2 y 34 restos;
y en la que el primer fragmento
peptidilo es capaz de aumentar el rendimiento de la conformación
bioactiva del precursor de insulina formado poniendo en
contacto la proteína recombinante con un agente caotrópico auxiliar
en comparación con el rendimiento de la conformación bioactiva del
precursor de insulina formado poniendo en contacto la misma
proteína recombinante que carece del primer fragmento peptidilo con
el agente
caotrópico.
En otra realización preferida, la presente
invención proporciona la proteína quimérica anteriormente descrita,
en la que el primer fragmento peptidilo es capaz de unirse a un
anticuerpo anti-hGH.
En una realización más preferida, la presente
invención proporciona la proteína quimérica anteriormente descrita,
en la que el primer fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En otra realización más preferida, la presente
invención proporciona la proteína quimérica anteriormente descrita,
en la que el primer fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona la proteína quimérica anteriormente descrita,
en la que el segundo fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En otra realización más preferida, la presente
invención proporciona la proteína quimérica anteriormente descrita,
en la que el precursor de insulina humana está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En aún otra realización más preferida, la
presente invención proporciona la proteína quimérica anteriormente
descrita, en la que el precursor de insulina humana está constituido
por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En la realización más preferida, la presente
invención proporciona una proteína quimérica que está constituida
por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En la otra realización más preferida, la
presente invención proporciona la proteína quimérica que está
constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden obtener proteínas quiméricas descritas
en la Sección 4.2., y derivados, análogos y fragmentos de las
mismas mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye
pero no se limita, métodos de expresión recombinante, purificación
a partir de fuentes naturales, y síntesis química.
Por ejemplo, se pueden obtener las proteínas
quiméricas descritas en la Sección 4.2., mediante técnicas de
expresión de proteína recombinante. Para expresión recombinante, el
gen o porción del mismo que codifica las proteínas quiméricas
descritas en la Sección 4.2., se inserta en un vector de clonación
apropiado para expresión en una célula hospedadora particular. Se
puede usar un gran número de sistemas de
vector-hospedador conocidos en la técnica. Posibles
vectores incluyen, pero no se limitan, plásmidos o virus
modificados, pero el sistema de vector tiene que ser compatible con
la célula hospedadora usada. Vectores de este tipo incluyen, pero no
se limitan, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos
tales como pBR322 ó derivados de plásmidos pUC o el vector
Bluescript (Stratagene). La inserción en un vector de clonación se
puede lograr, por ejemplo, uniendo el fragmento de ADN a un vector
de clonación que tiene términos cohesivos complementarios. Sin
embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para
fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los
extremos de las moléculas de ADN pueden ser modificados
enzimáticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier
sitio que se desee uniendo secuencias de nucleótido (conectores) a
los extremos de ADN, estos conectores unidos pueden comprender
oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que
codifican secuencias de restricción de reconocimiento de
endonucleasa. Se pueden introducir moléculas recombinantes en las
células hospedadoras por vía de transformación, transfección,
infección, electroporación, etc., de manera que se generan muchas
copias de secuencia del gen.
En un método alternativo, se puede identificar y
aislar el gen deseado después de inserción en un vector de
clonación adecuado en una aproximación de "pistola de
inyección". Antes de la inserción en el vector de clonación se
puede hacer un enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo,
mediante fraccionamiento por tamaño.
En realizaciones específicas, la transformación
de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que
incorporan el gen aislado que codifica proteínas quiméricas
descritas en la Sección 4.2., ADNc, o secuencia de ADN sintetizada,
facilita la generación de copias múltiples del gen. Así, el gen se
puede obtener en grandes cantidades haciendo crecer transformantes,
aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y,
cuando es necesario, rescatando el gen insertado del ADN
recombinante aislado.
La secuencia de nucleótido que codifica las
proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2., se puede insertar
en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que
contiene los elementos necesarios para la transcripción y
traducción de la secuencia insertada que codifica la proteína. Se
puede utilizar una diversidad de sistemas
hospedador-vector para expresar la secuencia que
codifica proteína. Estos incluyen, pero no se limitan, sistemas de
células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus de la
vaccinia, adenovirus, etc.), sistemas de células de insectos
infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus), microorganismos
tales como levadura que contiene vectores de levaduras, o bacterias
transformadas con ADN bacteriófago, ADN plásmido, o ADN cósmido.
Los elementos de expresión de vectores varían en sus potencias y
especificidades. Dependiendo del sistema
hospedador-vector utilizado, se puede utilizar uno
cualquiera de un conjunto de elementos de transcripción y
traducción adecuados.
Cualquiera de los métodos previamente descritos
para la inserción de fragmentos de ADN en un vector se puede usar
para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico
constituido por señales de control de transcripción/traducción
apropiadas y las secuencias que codifican proteínas. Estos métodos
pueden incluir ADN recombinante y técnicas sintéticas in
vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética).
La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica
proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2., puede ser
regulada mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de tal
manera que las proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2.,
se expresen en un hospedador transformado con la molécula de ADN
recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas quiméricas
descritas en la Sección 4.2., puede ser controlada mediante
cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica.
Promotores que se pueden usar para controlar la expresión de las
proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2., incluyen, pero no
se limitan, la región promotora temprana de SV40 (Bernoist and
Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor
contenido en la repetición del terminal largo 3' del virus de
sarcoma de Rous (Yamamoto y col., 1980, Cell
22:787-797), el promotor de herpes timidina quinasa
(Wagner y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen
de la metalotioneína (Brinster y col., 1982, Nature
296:29-42); vectores de expresión procarióticos
tales como el promotor de \beta-lactamasa
(Villa-Kamaroff y col., 1978, Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 75:3727-3731), el promotor fac
(DeBoer y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
80:21-25), o promotor Trp E (Hall, Invisible
Frontiers-The Race to Synthesize a Human Gene,
Atlantic Monthly Press, Nueva York, 1987), véase también
"Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific
American, 1980, 242:74-94; elementos promotores de
levaduras u otros hongos tales como promotor Gal 4, el promotor de
ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol
quinasa), promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones
de control de transcripción animal, que exhiben especificidad de
tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos: región de
control de gen elastasa 1 que es activa en células acinares
pancreáticas (Swift y col., 1984, Cell 38:639-646;
Ornitz y col., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology
7:425-515); región de control del gen de insulina
que es activa en células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature
315:115-122), región de control de gen de
inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl y
col., 1984, Cell 38:647-658; Adames y col., 1985,
Nature 318:533-538; Alexander y col., 1987, Mol.
Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control de
virus tumoral mamario de ratón que es activa en células
testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder y col., 1986,
Cell 45:485-495), región de control de gen de
albúmina que es activa en hígado (Pinkert y col., 1987, Genes and
Devel. 1:268-276), región de control de gen de
alfa-fetoproteína que es activa en hígado (Krumlauf
y col., 1985, Mol. Cell. Biol, 5:1639-1648; Hammer y
col., 1987, Science 235:53-58; región de control de
gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el
hígado (Kelsey y col., 1987, Genes and Devel.
1:161-171), región de control de gen de
beta-globina que es activa en células mieloides
(Mogram y col., 1985, Nature 315:338-340; Kollias y
col., 1986, Cell 46:89-94), región de control de gen
de proteína básica de mielina que es activa en células
oligodendrocíticas del cerebro (Readhead y col., 1987, Cell
48:703-712), región de control de gen de cadena 2
de miosina ligera que es activa en músculo esqueletal (Sani, 1985,
Nature 314:283-286), y región de control de gen de
hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo
(Mason y col., 1986, Science 324:1372-1378).
Por ejemplo, se puede usar un vector que
comprende un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que
codifica las proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2, uno o
más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores
seleccionables (por ejemplo, un gen con resistencia a
antibióticos).
Se pueden identificar vectores de expresión que
contienen inserciones de genes que codifican las proteínas
quiméricas descritas en la Sección 4.2., mediante tres
aproximaciones generales: (a) hibridación de ácido nucleico, (b)
presencia o ausencia de funciones de gen "marcador", y (c)
expresión de secuencias insertadas. En la primera aproximación, la
presencia de un gen que codifica las proteínas quiméricas descritas
en la Sección 4.2., insertado en un vector de expresión se puede
detectar mediante hibridación de ácido nucleico usando sondas que
comprenden secuencias que son homólogas con un gen insertado que
codifica las proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2. En
la segunda aproximación, el sistema recombinante vector/hospedador
se puede identificar y seleccionar sobre la base de la presencia o
ausencia de ciertas funciones de gen "marcador" (por ejemplo,
actividad de timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo
de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus,
etc.) causada por la inserción de un gen que codifica las proteínas
quiméricas descritas en la Sección 4.2., en el vector. Por ejemplo,
si el gen que codifica las proteínas quiméricas descritas en la
Sección 4.2., se inserta dentro de la secuencia de gen marcador del
vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen la
inserción que codifica las proteínas quiméricas descritas en la
Sección 4.2., mediante la ausencia de la función de gen marcador.
En la tercera aproximación, se pueden identificar vectores de
expresión recombinantes ensayando el producto de proteínas
quiméricas expresado por el recombinante. Ensayos de este tipo
pueden estar basados, por ejemplo, en las propiedades físicas o
funcionales de las proteínas quiméricas descritas en la Sección
4.2., en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, unión con
anticuerpo anti-hGH, o
anti-insulina.
Una vez que se identifica y se aísla una
molécula de ADN recombinante particular, se pueden usar varios
métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se
establecen un adecuado sistema hospedador y unas condiciones de
crecimiento, se pueden propagar y preparar en cantidad vectores de
expresión recombinantes. Según se ha explicado anteriormente, los
vectores de expresión que se pueden usar incluyen, pero no se
limitan, los siguientes vectores y sus derivados: virus humanos o
animales tales como virus de la vaccinia o adenovirus, virus de
insectos tales como baculovirus, vectores de levaduras, vectores
bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN plásmido y
cósmido, para nombrar solamente unos pocos.
Además, se puede elegir una cepa de células
hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas,
o modifique y procese el producto génico en la manera específica
deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en
presencia de ciertos inductores; así, se puede controlar la
expresión de la proteína quimérica descrita en la Sección 4.2.,
creada mediante ingeniería genética. Asimismo, diferentes células
hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para
el procesado y modificación en traducción y
post-traducción (por ejemplo glicosilación,
fosforilación) de proteínas. Se pueden elegir apropiadas líneas
celulares o sistemas hospedadores para asegurar la modificación y
el procesado deseados de la proteína foránea expresada. Por ejemplo,
se puede usar la expresión en un sistema bacteriano para producir
un producto no glicosilado de proteína nuclear. La expresión en
levadura producirá un producto glicosilado. La expresión en células
de mamífero puede ser usada para asegurar glicosilación
"nativa" de una proteína heteróloga. Asimismo, diferentes
sistemas de expresión vector/hospedador pueden afectar a las
reacciones del proceso en diferentes medidas.
Ambas secuencias de ADNc y genómico pueden ser
clonadas y expresadas.
La proteína quimérica descrita en la Sección
4.2., también puede ser aislada y purificada mediante métodos
estándar que incluyen cromatografía, (por ejemplo cromatografía de
columna de intercambio iónico, de afinidad, y de tamaño),
centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante otra técnica
estándar para la purificación de proteínas. Las propiedades
funcionales se pueden evaluar usando cualquier ensayo adecuado.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la
proteína quimérica descrita en la Sección 4.2., puede ser mutada
in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias
de traducción, iniciación, y/o terminación, o para crear
variaciones en regiones de codificación. Se puede usar cualquier
técnica de mutagénesis conocida en el sector, que incluye, pero no
se limita, mutagénesis in vitro dirigida al sitio (Hutchinson
y col., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), uso de conectores TAB
(Pharmacia), iniciadores PCR que contienen mutación,
etc.
La experimentación implicada en mutagénesis está
constituida principalmente por mutagénesis dirigida al sitio
seguida de prueba fenotípica del producto génico alterado. Algunos
de los protocolos de mutagénesis dirigida al sitio más comúnmente
empleados aprovechan vectores que pueden proporcionar ADN de hebra
sencilla así como de hebra doble, según se necesite. Generalmente,
el protocolo de la mutagénesis con vectores de este tipo es como
sigue. Se sintetiza un iniciador mutagénico, es decir, un iniciador
complementario a la secuencia que se ha de cambiar, pero que está
constituido por una o un pequeño número de bases alteradas,
añadidas, o suprimidas. El iniciador es extendido in vitro
mediante ADN polimerasa y, después de algunas manipulaciones
adicionales, el ahora ADN de doble hebra se transfecta a células
bacterianas. A continuación, mediante una diversidad de métodos, se
identifica el ADN mutado deseado, y se purifica la proteína deseada
de clones que contienen la secuencia mutada. Para secuencias más
largas, a menudo se requieren etapas de clonación adicionales
porque las inserciones largas (más largas que 2 kilobases) son
inestables en esos vectores. Los protocolos son conocidos por los
expertos en la técnica y existen kits ampliamente disponibles para
mutagénesis dirigida al sitio de compañías de suministro de
biotecnología, por ejemplo, de Amersham Life Science, Inc.
(Arlington Heights, IL) y Stratagene Cloning Systems (La Jolla,
CA).
Además, la proteína quimérica descrita en la
Sección 4.2., puede ser sintetizada químicamente. (Véase, por
ejemplo, Clark-Lewis y col., 1991, Biochem.
30:3128-3135 y Merrifield. 1963, J. Amer. Chem. Soc.
85:2149-2156). Por ejemplo, las proteínas
quiméricas descritas en la Sección 4.2., o fragmentos, derivados y
análogos pueden ser sintetizados mediante técnicas de fase sólida,
desdoblados de la resina, y purificados mediante cromatografía
líquida preparativa de alta resolución (por ejemplo, véase
Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.
H. Freeman and Co., N. Y., págs. 50-60). La proteína
quimérica descrita en la Sección 4.2., o fragmento, derivados y
análogos, también pueden ser sintetizados mediante uso de un
sintetizador de péptidos. La composición de los péptidos sintéticos
puede ser confirmada mediante análisis o secuenciación de
aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman;
véase Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular
Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y., págs.
34-49).
Las proteínas quiméricas descritas en la Sección
4.2., pueden ser sintetizadas en su integridad mediante adición
secuencial de restos aminoácidos o alternativamente como
subcomponentes en fragmentos que pueden ser combinados usando
técnicas bien conocidas en el sector, tales como, por ejemplo,
condensación de fragmentos (Shin y col., 1992, Biosci. Biotech.
Biochem. 56:404-408; Nyfeler y col., 1992, Peptides,
Proc. 12th Amer. Pep. Soc., Smith and Rivier (eds.), Leiden, págs.
661-663; y Nokihara y col., 1990, Protein Reseach
Foundation, Yanaihara (ed), Osaka, págs.
315-320).
En una realización menos preferida, las
proteínas quiméricas descritas en la Sección 4.2., pueden ser
obtenidas mediante proteolisis de la proteína seguida de
purificación usando métodos estándar tales como los anteriormente
descritos (por ejemplo purificación por inmunoafinidad).
La presente invención proporciona un proceso
para obtener una proteína quimérica que contiene precursor de
insulina correctamente plegado de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, que comprende poner en contacto una
proteína quimérica que contiene precursor de insulina
incorrectamente plegado de una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 10 con un agente caotrópico auxiliar.
Según se usa en este documento, la expresión
"precursor de insulina humana" se refiere a una molécula que
1) contiene la cadena A y la cadena B de insulina humana, o
análogos, derivados o fragmentos de las mismas, 2) contiene 6
restos cisteína, 3) tiene un resto de conexión removible que se une
a la cadena A y a la cadena B de insulina, y 4) es capaz de unirse
a un anticuerpo anti-insulina humana. Ejemplos de
precursores de insulina humana incluyen, pero no se limitan, los
que se describen en Ladisch and Kohlman, Biotechnol. Prog., 1992,
8:469-478); Thim y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 1986, 83:6766-6770; patente de EE.UU. Nº
5.473.049, patente de EE.UU. Nº 5.457.066, y EP 0.347.781 B1.
La expresión precursor de insulina humana o
proteína quimérica que contiene precursor de insulina
"correctamente plegado" se refiere a una molécula en la que el
precursor de insulina humana tiene la conformación y puentes de
disulfuro según se encuentran en una insulina humana natural,
biológicamente activa, es decir, se forman los puentes de disulfuro
entre a) A-6 y A-11, b)
A-7 y B-7, c) A-20 y
B-19. La expresión precursor de insulina humana o
proteína quimérica que contiene precursor de insulina
"incorrectamente plegado" se refiere a una molécula en la que
el precursor de insulina humana carece de la conformación, puentes
de disulfuro según se encuentran en una insulina humana natural,
biológicamente activa, o ambas.
Agentes caotrópicos auxiliares son compuestos
que rompen enlaces de hidrógeno en solución acuosa. En una
realización específica, la presente invención proporciona un
proceso para obtener la proteína quimérica anteriormente descrita
que contiene precursor de insulina correctamente plegado, en el que
el agente caotrópico auxiliar se selecciona entre el grupo
constituido por hidrocloruro de guanidina, carbonato de etileno,
tiocianato, dimetilsulfóxido y urea. Preferiblemente, el agente
caotrópico auxiliar es urea. Más preferiblemente, la urea está
presente a una concentración de aproximadamente 2,0 a
aproximadamente 8,0 M. Lo más preferiblemente, la urea está
presente a una concentración de aproximadamente 3,0 a
aproximadamente 6,0 M.
En otra realización específica, la presente
invención proporciona un proceso para obtener la proteína quimérica
anteriormente descrita que contiene precursor de insulina
correctamente plegado, en el que la proteína quimérica que contiene
segundo precursor de insulina incorrectamente plegado se pone en
contacto al menos con un agente caotrópico auxiliar en un medio
acuoso a un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 10,5 y a una
concentración de proteína quimérica que contiene segundo precursor
de insulina incorrectamente plegado de aproximadamente 0,05 a
aproximadamente 15,0 g por litro. Preferiblemente, el pH se mantiene
de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,0. También
preferiblemente, la proteína quimérica que contiene segundo
precursor de insulina incorrectamente plegado está presente de
aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5,0 g por litro. Más
preferiblemente, la proteína quimérica que contiene segundo
precursor de insulina incorrectamente plegado está presente de
aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 g por litro.
Los mercaptanos son compuestos que son solubles
en agua y contienen al menos un grupo -SH.
La presente invención proporciona un ensayo para
la investigación de una secuencia de aminoácidos respecto a su
capacidad para mejorar el plegado de un precursor de insulina, que
comprende: (a) cambiar la secuencia de aminoácidos del primer
fragmento peptidilo de una proteína quimérica descrita en la Sección
4.2., obtener dicha proteína quimérica con dichos cambios, poner en
contacto dicha proteína quimérica con dichos cambios al menos con
un agente caotrópico auxiliar en un medio acuoso bajo condiciones y
durante un tiempo suficiente tales que dicha proteína quimérica se
pliegue correctamente, y medir el rendimiento de plegado de dicha
proteína quimérica con dichos cambios; (b) obtener la misma
proteína quimérica que se usa en la etapa (a), pero sin los cambios
de secuencia de aminoácidos que se describen en la etapa (a), poner
en contacto la proteína quimérica sin los cambios de secuencia de
aminoácidos que se describen en la etapa (a) al menos con un agente
caotrópico auxiliar en un medio acuoso bajo las mismas condiciones
y durante el mismo tiempo que se usa en la etapa (a), y medir el
rendimiento de plegado de la proteína quimérica; y (c) comparar el
rendimiento de plegado de las proteínas quiméricas medido en las
etapas (a) y (b), respectivamente, en las que el rendimiento medido
en la etapa (a) que es sustancialmente igual o mayor que el
rendimiento medido en la etapa (b) indica que la secuencia de
aminoácidos mejora el plegado del precursor de insulina.
La secuencia de aminoácidos del primer fragmento
peptidilo de la proteína quimérica descrita en la Sección 4.2., se
puede cambiar mediante cualesquiera técnicas de mutagénesis
conocidas en el sector, preferiblemente mediante técnicas de
mutagénesis descritas en la Sección 4.3.
En una realización preferida del ensayo
anterior, la proteína quimérica está constituida por la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otra realización preferida del ensayo
anterior, la proteína quimérica está constituida por la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
En todavía otra realización preferida del ensayo
anterior, el agente caotrópico auxiliar es urea.
En aún otra realización preferida del ensayo
anterior, el ensayo comprende adicionalmente poner en contacto la
proteína quimérica, en etapa (a) y (b) respectivamente, con una
cantidad de mercaptano, cantidad tal que produce menos de 5
radicales -SH del mercaptano por resto cisteína de la proteína
quimérica. Más preferiblemente, el mercaptano es
2-mercaptoetanol.
En una realización específica, se proporciona el
producto del ensayo anterior.
Se sintetizó químicamente un fragmento de ADN
que codifica hGH-mini-proinsulina
que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
6. Se clonó el fragmento de ADN en un vector de expresión bacteriano
bajo el control de un promotor Trp. El vector de expresión
que contiene hGH-mini-proinsulina se
transformó en cepa PR1 de E. Coli y se cultivaron las
células recombinantes en medio M9-CA en presencia de
oligoelementos. Se recuperaron las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina de los cuerpos
de inclusión y se plegaron en una condición tal que, dentro de las
proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina, se formaron
puentes de disulfuro de modo que se formarían en una proinsulina
humana correctamente plegada, es decir, se formaron puentes de
disulfuro A6-A11, A7-B7,
A20-B19. Se separaron las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina plegadas de
las proteínas de fusión no plegadas mediante ultrafiltración de
100K. Las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina correctamente
plegadas, aisladas fueron digeridas con tripsina para formar
Arg(B31)-insulina humana correctamente
plegada. La Arg(B31)-insulina humana se
purificó mediante cromatografías de intercambio catiónico hasta una
pureza de al menos 90%. La Arg(B31)-insulina
humana purificada fue digerida luego con carboxipeptidasa B para
formar la insulina humana correctamente plegada, que posteriormente
se purificó mediante HPLC de fase inversa. La insulina humana pura
así producida fue caracterizada mediante análisis de secuencia
N-terminal, determinación de peso molecular y
cartografía de péptidos.
Se sintetizó químicamente un fragmento de ADN
que codifica la hGH-mini-proinsulina
constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 según
el procedimiento descrito en Gan y col., Gene, 1989,
79:159-166. En el fragmento de ADN sintetizado se
incluyeron un sitio de 5'Cla I y un sitio de 3'Hind III. En resumen,
un fragmento de 5'Cla I a 3'Kpn I, que corta la secuencia de
nucleótido que codifica los restos aminoácido 51 y 52 de SEQ ID NO:
6, y un fragmento de 5'Kpn I a 3'Hind III fueron sintetizados
químicamente y subclonados en un vector de pUC18, respectivamente.
Posteriormente, el fragmento de ADN que codifica la secuencia
íntegra de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 fue subclonado en un vector
de pATH2 modificado de tal manera que la expresión de la
hGH-mini-proinsulina estaba bajo el
control de un promotor de Trp y una secuencia SD. El vector
resultante, pZRhi-1 (Figura 2) se usó para expresar
la proteína de fusión
hGH-mini-proinsulina.
Los vectores de expresión de proteína de fusión
de hGH-mini-proinsulina se
transformaron en cepas RR1 o K12 W3110 de E. Coli. Las
células de E. Coli transformadas se cultivaron en medio
M9-CA en presencia de oligoelementos. El nivel de
expresión de proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina se determinó en
matraz de agitación así como en fermentador. En ambos casos, se
observó una expresión de alto nivel, que alcanzaba a
20-25% de las proteínas totales de E.
Coli.
Se expresaron las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina como una forma
insoluble denominada "cuerpos de inclusión". Para liberar los
cuerpos de inclusión, las células de E. Coli se desintegraron
mediante un homogeneizador de alta presión a 80.000 kPa. El
detritus de células y las proteínas solubles de E. Coli se
retiraron mediante centrifugación a 10.000 g. Los precipitados de
cuerpos de inclusión que contenían las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina se lavaron 3
veces con agua. Los precipitados de cuerpos de inclusión
resultantes, en los que las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina eran de
aproximadamente 90% de pureza, se usaron como material de partida
para plegado. El cuerpo de inclusión se disolvió en urea 8 M, pH
10,4, a una concentración de proteína de fusión de
hGH-mini-proinsulina de
20-30 mg/ml en presencia de mercaptoetanol 2 a 6
mM. El material insoluble se retiró mediante centrifugación. El
material sobrenadante se diluyó 10 veces mediante urea de baja
concentración para alcanzar una concentración final de urea de 3 a 6
M, pH 9 a 10, y de mercaptoetanol de 0,2 a 0,6 mM. La rutina de
plegado se llevó a cabo a 4ºC y una concentración de urea de 3,2 M,
pH 9,3. El proceso de plegado se monitorizó mediante HPLC de fase
inversa de C4 con gradiente de acetonitrilo de
30-47% en tampón de fosfato al 0,1%. En condiciones
cromatográficas de este tipo, el tiempo de retención de
hGH-mini-proinsulina correctamente
plegada fue de alrededor de 23 min. El plegado se puede terminar en
24 hr. El rendimiento de re-plegado fue
aproximadamente 70%.
La mezcla de plegado se fraccionó mediante
ultrafiltración de 100K. Las proteínas de fusión de
hGH-mini-proinsulina correctamente
plegadas encontradas en las fracciones filtradas se concentraron
mediante un sistema de ultrafiltración de 10K. Se retiró urea con
agua a pH 3,5. El rendimiento de las etapas de ultrafiltración
estuvo por encima de 85%.
Para el desdoblamiento en tríptico, la
concentración de la proteína de fusión de
hGH-mini-proinsulina correctamente
plegada fue de aproximadamente 10-12 mg/ml,
preferiblemente de 10 mg/ml. La relación entre tripsina y la
proteína de fusión de
hGH-mini-proinsulina osciló de
aproximadamente 1:60 a aproximadamente 1:1250, preferiblemente era
1:100. El pH se mantuvo de aproximadamente 10 a aproximadamente 11,
preferiblemente en 10,8. Se dejó que transcurriera el
desdoblamiento a 4ºC de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 hr.,
preferiblemente se llevó a cabo durante aproximadamente 3,5 hr. La
reacción de desdoblamiento se detuvo ajustando el pH a 3,5 con
tampón de fosfato. El análisis por HPLC de fase inversa indicó que
el rendimiento para esta etapa de desdoblamiento fue más de 95%. A
pH por encima de 10, la tripsina actúa sobre los siguientes restos
Arg: el resto Arg entre cadenas B y A de
mini-proinsulina humana, el resto Arg entre el
fragmento de hGH y el fragmento de mini-proinsulina,
los restos Arg dentro del fragmento de hGH. La digestión con
tripsina produjo varias piezas pequeñas del fragmento de hGH, y una
insulina humana con un Arg extra en el extremo-C de
la cadena B, que se denomina
Arg(B31)-insulina humana. El resto
Arg(B22) de insulina humana no se desdobló bajo las
condiciones anteriores, debido presumiblemente al impedimento por
la estructura en tres dimensiones.
La Arg(B31)-insulina
humana se purificó mediante cromatografías de intercambio iónico
usando NaCl como eluyente en presencia de tampón de citrato 10 mM.
La Arg(B31)-insulina humana purificada fue de
más de 90% de pureza.
Se retiró la Arg(B31) en el
extremo-C de
Arg(B31)-insulina humana mediante
carboxipeptidasa B. La concentración de
Arg(B31)-insulina humana correctamente
plegada fue de aproximadamente 10 mg/ml. La relación entre
carboxipeptidasa B y la Arg(B31)-insulina
humana se mantuvo aproximadamente en 1:1000. Se dejó que
transcurriera el desdoblamiento a 37ºC durante aproximadamente 1 hr
en tampón de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. La reacción de
desdoblamiento se detuvo ajustando el pH a 3,5 con tampón de
fosfato. El rendimiento de insulina humana fue más de 99%.
Se cargó insulina humana producida a partir de
la digestión con carboxipeptidasa B a una columna HPLC de fase
inversa de C8 que había sido estabilizada con tampón de fosfato al
0,1%, pH 3,0. Se eluyó la insulina humana con un gradiente de
acetonitrilo de 17% a 35% en tampón de fosfato al 0,1%, pH 3,0. Se
reunieron las fracciones de insulina y se añadió ácido acético para
alcanzar una concentración de 0,125 a 0,2 M, pH 6,0. La insulina
así producida se cristalizó a 4ºC. La pureza de la insulina humana
estuvo por encima de 99%.
Se determinaron los 15 primeros aminoácidos
N-terminales de la insulina humana purificada y de
la insulina humana estándar de la OMS mediante degradación estándar
de Edman. Las secuencias N-terminales de ambas
cadenas A y B de la insulina humana purificada son idénticas a las
de la insulina humana estándar de la OMS.
Se determinó el peso molecular de la insulina
humana purificada y el de la insulina humana estándar de la OMS
mediante análisis de espectrometría de masas de Plataforma VG. Ambas
muestras dieron un M/Z de 5807,7.
Tanto la insulina humana purificada como la
insulina humana estándar de la OMS fueron digeridas con proteasa
V8. Los fragmentos de la digestión fueron analizados mediante HPLC
de fase inversa de C18. Ambas muestras dieron idénticos patrones de
cartografía de péptidos (Véase Thim y col., Genetics and Molecular
Biology of Industrial Microorganisms, Hershberger y col., Ed.
American Society for Microbiology, 1989, págs.
322-328).
La presente invención no se limita en alcance
por el microorganismo depositado o las realizaciones específicas
que se describen en este documento. Antes bien, diversas
modificaciones de la invención además de las que se describen en
este documento serán evidentes para los expertos en la técnica a
partir de la descripción anterior y de las figuras que se
acompañan. Se tiene la intención de que las modificaciones de este
tipo caigan dentro del alcance de las reivindicaciones que se
anexan.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Gan, Z. R.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína quimérica que contiene una secuencia de tipo chaperona intramolecular y su aplicación para la producción de insulina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CLASE DE MEDIO: disquette de 3,5 pulgadas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WordPerfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: Pendiente de asignación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: Presentación simultáneamente con este documento
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO EXPEDIENTE:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Una proteína quimérica que comprende, desde
el extremo-N al extremo-C:
- a)
- un primer fragmento peptidilo constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con un dominio de la hormona del crecimiento humano que contiene al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO:2 en los que el porcentaje de identidad se determina sobre una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 de la misma longitud que el primer fragmento peptidilo;
- b)
- un resto Arg, o un resto Lys, o un segundo fragmento peptidilo constituido al menos por 2 aminoácidos en cuyo fragmento peptidilo el resto ácido más C-terminal es un resto Arg o Lys; y
- c)
- un tercer fragmento peptidilo constituido por un fragmento peptidilo precursor de insulina humana que comprende la cadena A y la cadena B de insulina humana, y en el que la cadena A y la cadena B están separadas mediante un resto peptidilo removible de una longitud entre 2 y 34 restos;
y en la que el primer fragmento
peptidilo es capaz de aumentar el rendimiento de la conformación
bioactiva del precursor de insulina formado poniendo en
contacto la proteína recombinante con un agente caotrópico auxiliar
en comparación con el rendimiento de la conformación bioactiva del
precursor de insulina formado poniendo en contacto la misma
proteína recombinante que carece del primer fragmento peptidilo con
el agente
caotrópico.
2. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el primer fragmento peptidilo es capaz de unirse a un
anticuerpo anti-hGH.
3. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el primer fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 1.
4. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el primer fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 2.
5. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el segundo fragmento peptidilo está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 3.
6. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el precursor de insulina está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 4.
7. La proteína quimérica de la reivindicación 1,
en la que el precursor de insulina humana está constituido por la
secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 5.
8. La proteína quimérica de la reivindicación 1
que está constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO:
6.
9. La proteína quimérica de la reivindicación 1
que está constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO:
7.
10. La proteína quimérica de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en la que el fragmento precursor de
insulina está correctamente plegado.
11. Un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia de nucleótido que codifica la proteína quimérica de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. El ácido nucleico de la reivindicación 11,
en el que dicho ácido nucleico es ADN.
13. Una célula recombinante que contiene el
ácido nucleico de la reivindicación 11.
14. Un procedimiento para producir una proteína
quimérica que comprende hacer crecer una célula recombinante que
contiene el ácido nucleico de la reivindicación 11 de tal manera que
la proteína quimérica codificada se expresa por la célula, y
recuperar la proteína quimérica expresada.
15. Un proceso para obtener una proteína
quimérica que contiene un primer precursor de insulina correctamente
plegado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que
comprende poner en contacto una proteína quimérica que contiene
precursor de insulina incorrectamente plegado de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 con un agente caotrópico auxiliar.
16. El proceso de la reivindicación 16, en el
que el agente caotrópico auxiliar se selecciona entre el grupo
constituido por hidrocloruro de guanidina, carbonato de etileno,
tiocianato, dimetilsulfóxido y urea.
17. Un ensayo para obtener la proteína quimérica
de la reivindicación 1, que comprende: (a) cambiar la secuencia de
aminoácidos del primer fragmento peptidilo de una proteína quimérica
de la reivindicación 1, obtener dicha proteína quimérica con dichos
cambios, poner en contacto dicha proteína quimérica con dichos
cambios con al menos un agente caotrópico auxiliar en un medio
acuoso bajo condiciones y durante un tiempo suficiente, de tal
manera que dicha proteína quimérica se pliegue correctamente, y
medir el rendimiento de plegado de dicha proteína quimérica con
dichos cambios; (b) obtener la misma proteína quimérica que se usa
en la etapa (a), pero sin los cambios de secuencia de aminoácidos
que se describen en la etapa (a), poner en contacto la proteína
quimérica sin los cambios de secuencia de aminoácidos que se
describen en la etapa (a) con al menos un agente caotrópico
auxiliar en un medio acuoso bajo las mismas condiciones y durante el
mismo tiempo que se usa en la etapa (a), y medir el rendimiento de
plegado de la proteína quimérica; y (c) comparar el rendimiento de
plegado de las proteínas quiméricas medido en las etapas (a) y (b),
respectivamente, en las que el rendimiento medido en la etapa (a)
que es sustancialmente igual o mayor que el rendimiento medido en la
etapa (b) indica que la secuencia de aminoácidos mejora el plegado
del precursor de insulina.
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/CN1998/000052 WO1999050302A1 (en) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence and its application to insulin production |
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|---|---|---|---|
| ES98912192T Expired - Lifetime ES2317665T3 (es) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | Proteina quimerica que contiene una secuencia de tipo chaperona intramolecular y su aplicacion a la produccion de insulina. |
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